Hintergrund der Erfindung
Technisches Gebiet der Erfindung
-
Diese Erfindung betrifft einen oral verabreichten Antikörper mit
neutralisierender Wirksamkeit für das Respiratory-syncytial-
Virus (RSV), Adenovirus, Parainfluenza-Virus oder Influenza-
Virus, und seine Verwendung zur Minderung der Häufigkeit oder
Schwere von RSV- oder anderen Virusinfektionen des oberen und
unteren Respirationstraktes.
Beschreibung des Stands der Technik
-
Das Respiratory-syncytial-Virus ist die Hauptursache für
Pneumonie und Bronchiolitis im Säuglingsalter. Säuglinge im
Alter zwischen zwei und fünf Monaten haben die schwerste
Erkrankung, und es kann eine Einweisung in ein Krankenhaus
erforderlich sein. Mehr als die Hälfte aller Säuglinge werden
mit RSV während ihres ersten Lebensjahres infiziert, und nahezu
alle sind nach einem zweiten Jahr infiziert. Kinder, die
Kindertagesstätten besuchen, neigen dazu, schwerere Infektionen
und in einem früheren Alter zu haben. Wiederholte RSV-
Infektionen sind üblich, auch wenn Wiederholungsepisoden dazu
neigen, weniger schwer zu sein.
-
Während saisonaler Epidemien sind die meisten Säuglinge,
Kinder und Erwachsene dem Risiko einer Infektion oder erneuten
Infektion ausgesetzt. Zusätzlich zu Infektionen bei gesunden
Säuglingen und Kindern umfassen andere Risikogruppen für
ernsthafte RSV-Infektionen Frühgeborene, Kinder im Krankenhaus,
Säuglinge und Kinder mit Herz- oder Lungenerkrankungen,
immungeschwächte Kinder und Erwachsene, und die älteren
Menschen.
-
Symptome einer RSV-Infektion reichen von einer leichten
Erkältung bis zu einer schweren Bronchiolitis und Pneumonie. Das
Respiratory-syncytial-Virus ist auch mit akuter
Mittelohrentzündung in Verbindung gebracht worden, und RSV kann
aus Mittelohrfluid gewonnen werden.
-
Das Respiratory-syncytial-Virus ist ein RNA-Virus, das
Zellfusion (Syncytia) in Gewebekultur hervorrufen kann. Es ist
klassifiziert als ein Pneumovirus innerhalb der Paramyxovirus-
Familie. Das RNA-Genom codiert für mindestens 10 Proteine
einschließlich zweier Matrixproteine in der Virushülle (Ryan,
Sherris' Medical Microbiology, 3. Ed., Appleton and Lange, Seite
458, 1994). Ein Matrixprotein bildet die Innenauskleidung der
Virushülle. Antigene auf der Oberfläche der Hülle sind das G-
Glykoprotein, die mögliche Anlagerungsstelle an
Wirtszellrezeptoren, und das F-Glykoprotein, das Fusion
induziert. G-Glykoprotein-Antikörper können den Virus in vitro
neutralisieren.
-
Eine Infektion mit dem Virus ruft sowohl IgG- als auch IgA-
humorale und sekretorische Antikörperantworten hervor. Die
Immunität ist nicht von Dauer, und wiederholte Infektionen sind
häufig, jedoch neigt die Schwere der Erkrankung dazu, mit
zunehmenden Alter und mit nachfolgender erneuter Infektion
abzunehmen. Für keinen Impfstoff konnte gezeigt werden, dass er
gegen RSV schützen würde, und antivirale Arzneistoffe haben
bisher nur begrenzte Verwendung gehabt. Stillen kann einigen
Schutz gegen RSV-Infektion bieten. RSV-spezifische IgA- und IgG-
Antikörper sind in menschlicher Milch und Vormilch gefunden
worden, und RSV-Neutralisierung kann in Zellkultur erreicht
werden sowohl durch Immunglobulin- als auch Nicht-Immunglobulin-
Komponenten von menschlicher Milch (Laegreid et al.,
"Neutralizing Activity in Human Milk Fractions against
Respiratory Syncytial Virus, Acta Paediatrica Scandinavica,
75: 696-701, 1986).
-
Okamato et al., (Acta Paediatrica Scandinavica Supplement,
351: 137-143, 1989) berichten, dass Immunität, die von einem
Säugling entweder durch die Plazenta oder durch Stillen erworben
wurde, das Risiko einer Erkrankung des unteren
Respirationstraktes verringert. Der Schwerpunkt des Berichts von
Okamato et al. liegt auf der Rolle maternaler Antikörper, die in
Brustmilch übertragen werden, und der möglichen Rolle von
Brustmilch bei der Modulierung einer Immunantwort eines
Säuglings auf RSV. Der Schwerpunkt der vorliegenden Erfindung
liegt auf einem Verfahren zur Herstellung passiver Immunität,
indem neutralisierende Antikörper zu einem Produkt hinzugegeben
werden, das oral als Nahrung aufgenommen werden wird. Oral
aufgenommen, wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Substanz,
die von dem Wirt geschluckt wird.
-
Vorhergehende Behandlungen von Infektionen durch RSV haben
sich gestützt auf entweder parenterale Verabreichung oder
Verabreichung als Aerosol von Mitteln wie monoklonalen
Antikörper oder virentötenden Arzneistoffen wie Ribavirin. Die
vorliegende Erfindung offenbart die orale Verabreichung eines
Antikörpers mit RSV-neutralisierender Wirksamkeit.
-
Prince et al. (US-Patent Nr. 4.800.078) lehren ein
Verfahren für die topische Applikation von Antikörpern für RSV
in den unteren Respirationstrakt, vorzugsweise durch
Verabreichung von Immunglobulinen als Kleinpartikelaerosol. Die
Immunglobuline können auch auf dem intravenösen Weg verabreicht
werden.
-
In US-Patent Nr 5.290.540, offenbaren Prince et al. die
topische Verabreichung in Form von Kleinpartikelaerosol von
sowohl einem entzündungshemmenden Mittel als auch einem
antiinfektiösen Mittel in der Behandlung von Pneumonie, die
durch Bakterien oder Viren einschließlich RSV verursacht wurde.
-
CA 2.040.770 von Young et al. offenbart ein Verfahren zur
Behandlung respiratorischer Viren einschließlich RSV durch
Verabreichung eines neutralisierenden oder nicht
neutralisierenden monoklonalen Antikörpers gegen ein
Fusionsprotein von RSV (das F-Glykoprotein). Die Behandlung mit
monklonalem Antikörper unter Verwendung des Verfahrens von Young
et al. kann topisch sein und intranasal verabreicht, oder durch
Einatmen eines Aerosols, oder systemisch durch intramuskuläre
Verabreichung erfolgen. Die vorliegende Erfindung offenbart im
Gegensatz dazu eine oral verabreichte Behandlung.
-
WO 92/01473 offenbart die Behandlung einer viralen
Erkrankung des unteren Respirationstraktes unter Verwendung des
Kleinpartikelaerosolverfahrens, um neutralisierende und/oder
therapeutische monoklonale Antikörper für spezifische antigene
Virusoberflächenstellen zu verabreichen.
-
WO 92/19244 lehrt die Kombination eines antiinfektiösen
Mittels wie humanes Immunglobin G oder eines Antibiotikums,
vereinigt mit einem entzündungshemmenden Mittel oder
Kortikosteroid, die in den Respirationstrakt in Form eines
Kleinpartikelaerosols verabreicht wird.
-
WO 94/17105 offenbart human-murine chimäre Antikörper mit
hochspezifischer neutralisierender Wirksamkeit gegen RSV,
vorzugsweise gegen das RSV-F-Antigen.
-
Das japanische Patent JP. A. 6345668 betrifft eine
Zusammensetzung, die Antikörper umfasst, die durch Immunisieren
eines Wirtstiers mit einem Mikroorganismus als Antigen erhalten
werden. Dieses Dokument offenbart die Verwendung einer
infektionshemmenden Zusammensetzung als ein Behandlungsmittel,
wobei die bevorzugten Mikroorganismen Bakterien, Mykoplasma oder
Virus sind, und die Zusammensetzung wird vorzugsweise, unter
anderen Erkrankungen, bei respiratorischer Infektion angewendet.
Jedoch betrifft dieses Dokument ein Virus wie das humane
Rotavirus, und es offenbart nicht die Möglichkeit oder
Machbarkeit, irgendeine ihrer Lehren auf RSV anzuwenden. Des
weiteren betrifft D1 die Produktion der Zusammensetzung, wie sie
in verarbeiteten Lebensmitteln, wie Getränken oder kalten
Süßigkeiten enthalten ist, d. h. verarbeiteten Lebensmitteln, die
keine Hitzeanwendung für Pasteurisierungszwecke erforderlich
machen.
-
US 5.066.491 betrifft ein Verfahren zur
Krankheitsbehandlung unter Verwendung einer immunologisch
wirksamen Molkefraktion zur Behandlung einer respiratorischen
Erkrankung bei Rindern beruhend auf der Behandlung durch und
Verabreichung von Kuhmilch. Die Offenbarung dieses Dokumentes
betrifft verschiedene Viren, aber RSV ist in der Liste der
Viren, mit denen sich die Autoren von US 5.066.491 befassten,
nicht vorhanden.
-
Die Bezugnahmen auf den Stand der Technik offenbaren die
Verabreichung einer Virus-neutralisierenden Verbindung entweder
topisch durch Inhalation eines Kleinpartikelaerosols, oder
parenteral durch intravenöse oder intramuskuläre Injektion.
Füttern einer nicht-absorbierten RSV-neutralisierenden
Verbindung, um die Häufigkeit und Schwere einer RSV-Infektion zu
verhindern oder herabzusetzen, sind in den Bezugnahmen auf den
Stand der Technik nicht offenbart oder gezeigt worden. Dieses
Konzept, wie es in der vorliegenden Erfindung gezeigt wird,
hängt von der Fähigkeit eines RSV-neutralisierenden Antikörpers
ab, die Virusbelastung von mukosalen Oberflächen des
Nasopharynx, Oropharynx und Hypopharynx herabzusetzen, und
dadurch die Ausbreitung eines infektiösen Virus von der Nase auf
die Lunge zu verhindern oder zu verringern, wenn der Antikörper
geschluckt wird. Verabreichung eines RSV-neutralisierenden
Antikörpers in einem flüssigen Produkt ist besonders vorteilhaft
wegen der Leichtigkeit der Verabreichung.
Beschreibung der Erfindung
-
Die Erfindung ist ein oral verabreichtes flüssiges Produkt,
das eine respiratorische Virus-neutralisierende Verbindung
enthält, welche ein RSV-neutralisierender Antikörper ist,
welcher einem Nahrungsprodukt zugesetzt wird. Die Erfindung ist
auch ein Verfahren zur Verabreichung einer wirksamen
Konzentration des respiratorischen Virus-neutralisierenden
Antikörpers, indem er einem flüssigen Produkt zugesetzt wird.
Wie hier und in den Ansprüchen verwendet, wird unter einem
respiratorisch neutralisierenden Antikörper verstanden, dass
damit ein Antikörper von einer Säugetierquelle wie einem Mensch
oder Rind gemeint ist, der ein respiratorisches Virus
neutralisieren kann. In einer Ausführungsform der Erfindung wird
der respiratorische Virus-neutralisierende Antikörper zu einem
Nahrungsprodukt für Säuglinge, wie einer Säuglingsformulierung,
hinzugegeben, und wird dem Säugling während des ersten
Lebensjahres gefüttert. Die Säuglingsformulierung könnte ein
Pulver sein zum Auslösen in Wasser, eine sofort-fütterbare
Flüssigkeit oder eine konzentrierte Flüssigkeit. Respiratorische
Viren, auf welche die Erfindung anwendbar ist, schließen
Respiratory-syncytial-Virus, Adenovirus, Parainfluenza-Virus und
Influenza-Virus ein.
Experimentelles Protokoll
-
Studien werden durchgeführt werden, um den Einfluss der
Fütterung neutralisierender Antikörper auf durch humanes
Respiratory-syncytial-Virus (HRSV) induzierte pulmonale
Infektion bei Tieren zu bestimmen. Ziele der Studien umfassen
die Identifikation eines Tiermodells zur nasalen Herausforderung
mit HRSV, um den Einfluss der diätischen Fütterung auf eine
HRSV-pulmonale Infektion zu beurteilen; und zur Bestimmung, ob
Fütterung von HRSV-neutralisierendem Antikörper und/oder anderer
neutralisierender Verbindungen eine pulmonale Infektion in dem
Tier im Anschluss an die nasale Herausforderung mit HRSV
verhindern oder lindern kann. Ein positives Ergebnis bei einem
Tiermodell wird schließlich eine klinische Evaluierung eines
flüssigen Produktes erlauben, das mit einer HRSV-
neutralisierenden Verbindung verstärkt ist.
Tiere und Kost
-
Dreißig Tage alte Inzuchtbaumwollratten
(Sigmodon fulviventer), die frei sind von Serum-
neutralisierendem Antikörper gegen humanes Respiratory-
syncytial-Virus (HRSV), werden verwendet werden. Die Ratten sind
mit einer Basalflüssignahrung, die aus Säuglingsformulierung
besteht, zwei Tage lang zu füttern, bevor die Experimente
beginnen. Ein Tag vor der intranasalen Impfung von Virus werden
die experimentellen Diäten bereitgestellt. Nahrungsaufnahme und
Körpergewichtsänderung sind täglich zu überwachen. Nach
Abschluss der Studie werden alle Ratten durch Ersticken mit
Kohlendioxid getötet, und Nasen- und Lungengewebe wird für die
Analyse entfernt werden.
Virus
-
Das Virus, das zu verwenden ist, ist humanes
Respiratory-syncytial-Virus Subgruppe A2 (HRSV/Lang). Das Virus
wird hergestellt werden durch Infizieren von Monolayern von HEp-
2-Zellen, welche wachsen werden, bis die Monolayer ungefähr 9%
Synzytienbildung zeigen. Das Medium von den Monolayern wird
gesammelt, gepoolt und durch Zentrifugation bei 450 · g geklärt
werden. Die geklärte Überstandsflüssigkeit wird durch ein
0,45-uM-Filter hindurchgelassen werden. Dieser Überstand wird humnes
Respiratory-syncytial-Virus (HRSV) enthalten mit einer
Konzentration von 10&sup6; PFU/ml, wie durch Plaqueassay bestimmt.
Antikörper
-
Polyklonale HRSV-Antikörper (HRSVIG),
kommerziell erhalten (Sandoz, East Hanover, NJ), werden in
Flüssignahrungen mit verschiedenen Konzentrationen eingelagert
werden und die In vitro-neutralisierende Wirksamkeit der
experimentellen Nahrungen, ergänzt mit HRSVIG, wird durch
Plaquereduktionsassay bestimmt werden.
Virustitration
-
Ausstriche von Oropharynx werden täglich
vor 8 Uhr morgens vom zweiten Tag der Virusimpfung an bis zum
Ende des Experimentes genommen werden. HRSV-Antigen in allen
Ausstrichen wird bestimmt werden. Nach dem Tod wird Nasen- und
Lungengewebe in 10 Teilen (Gewicht/Volumen) Hanks Balanced Salt
Solution, ergänzt mit 0/218 M Sucrose, 4,4 mM Glutamat, 3,8 mM
KH&sub2;PO&sub4;, 3,2 mM KH&sub2;O&sub4;, homogenisiert werden. Die resultierende
Suspension wird verwendet werden, um Virustiter durch
Plaqueassay auf Hep-2-Zellmonolayern zu bestimmen.
Histopathologische Untersuchung
-
Formalin-fixiertes
Nasengewebe und Lungen werden in Paraffin eingebettet, in
koronale Abschnitte zerteilt, mit Hämatoxylin-Eosin mit
Periodsäure-Schiff(PAS)-Reagenz angefärbt und unter einem
Lichtmikroskop untersucht werden. Scheiben werden hergestellt
werden von einem Pathologen, für den die Probennummern während
der mikroskopischen Untersuchung unbekannt sein werden.
Histopathologie der Lunge, angefärbt durch PAS, wird bewertet
von 0-2,0, 2,1-6,0, 6,1-10,0, 10,1-12, wie durch Piedra et al.
definiert ("Mechanism of lung injury in cotton rats immunized
with formalin-inactivated respiratory syncytial virus", Vaccine,
7: 34-38, 1989).
Statistische Analyse
-
Einschwänziges X² wird verwendet
werden, um Verhältnisse der Messungen zwischen unabhängigen
Gruppen zu vergleichen. Varianzanalyse wird verwendet werden, um
Virustiter und Schwere der Lungenerkrankung zu vergleichen.
Beispiel
Studie zur Untersuchung der Dosis-Wirkungs-
Beziehung zwischen diätetischem humanen Respiratory-syncytial-
Virus-Immunglobulin (HRSVIG) und humaner Respiratory-syncytial-
Virus(HRSV)-Infektion
-
Piazza et al. ("Immunotherapy of respiratory syncytial
virus infection in cotton rats (Sigmodon fulviventer) using IgG
in a small-partide aerosol", Journal of Infectious Disease
166: 1422-1424, 1992) haben gezeigt, dass HRSVIG bei 5 mg/100 ml
Lösung, verabreicht 15 Minuten lang in einem
Kleinpartikelaerosol drei Tage nach intranasaler Impfung von
Baumwollratten mit HRSV, den Virustiter um das 50-fache
reduziert. Die vorliegende Studie ist ausgelegt, um zu
bestimmen, ob die orale Verabreichung von HRSVIG eine pulmonare
Infektion ähnlich verringern kann. Dies wird vorgenommen werden,
indem ein Anti-RSV-IgG in eine flüssige Nahrung mit
verschiedenen Konzentrationen eingelagert wird, wonach die in
vitro-neutralisierende Wirksamkeit der experimentellen Nahrungen
bestimmt werden wird mit dem Plasquereduktionsassay, wie
beschrieben durch Prince et al. ("The pathogenesis of
respiratory syncytial virus infection in cotton rats", American
Journal of Pathology 93: 771-792, 1978).
-
Für die Studie werden 70 Ratten in 7 Behandlungsgruppen
eingeteilt. Behandlungsgruppe 1 wird 10 Ratten umfassen und wird
als eine Negativkontrolle dienen. Sie werden mit der
Basalflüssignahrung gefüttert und mit 0,1 ml Überstand von HEp-
2-Zellkulturmedium beimpft, das keine Zellen oder HRSV enthält.
Zehn Ratten in jeder Behandlungsgruppe 2, 3, 4 und 5 werden mit
der Basalflüssignahrung gefüttert, die ergänzt ist mit HRSVIG
mit jeweils 0, 0,5, 5 und 10 mg/100 ml. Angenommen, dass jede
Ratte 100 ml Flüssignahrung zu sich nimmt, sollte die erwartete
Tagesdosis für Ratten in jeder Gruppe 0, 0,5, 5 und 10 mg HRSVIG
sein. Ratten in Behandlungsgruppe 6 und 7 werden mit der
Basalflüssignahrung gefüttert, die angereichert ist mit anderen
Mitteln, die auf anti-respiratorische Virus-Eigenschaften zu
untersuchen sind. Einen Tag nach Konsum der experimentellen
Diäten werden die Ratten in den Behandlungsgruppen 2-7
intranasal beimpft mit HRSV/Lang unter Verwendung von 0,1 ml
Virussuspension, die HRSV mit 10³ PFU/ml enthält (plaque forming
units = Plaque-bildende Einheiten). Alle Ratten werden weiter
ihre zugeordneten Diäten konsumieren bis Beendigung der Studie.
Vier Tage nachdem sie mit dem Virus herausgefordert wurden,
werden alle Ratten getötet und Nasengewebe und Lungen werden für
die nachfolgende Analyse entfernt.
-
Eine wirksame Konzentration des respiratorischen Virus-
neutralisierenden Antikörpers kann zu einem flüssigen Produkt
hinzugegeben werden. In einer spezifischen Ausführungsform der
Erfindung ist das flüssige Produkt eine Säuglingsformulierung,
die einem Säugling während des ersten Lebensjahres gefüttert
werden kann, in dem Zeitraum, wenn der Säugling am anfälligsten
für eine RSV-Infektion ist. Säuglingsnahrungsformulierungen
könnten in Pulverform für die Rekonstitution in Wasser, in einer
sofort-fütterbaren flüssigen Form oder einer konzentrierten
flüssigen Form sein.