DE69624586T2

DE69624586T2 - Peptidvakzine auf basis von fusionsproteinen mit onkogenanteil

Info

Publication number: DE69624586T2
Application number: DE69624586T
Authority: DE
Inventors: Monica Bocchia; A. Scheinberg; Alessandro Sette
Original assignee: Cytel Corp; Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Cytel Corp; Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1995-05-08
Filing date: 1996-05-08
Publication date: 2003-09-25
Anticipated expiration: 2016-05-09
Also published as: AU5855096A; US6156316A; ES2203703T3; EP0862740A1; ATE227026T1; WO1996035438A1; DE69624586D1; EP0862740B1; EP0862740A4

Description

Die folgenden Standardabkürzungen werden hier für Aminosäuren und Aminosäurereste verwendet.

Stand der Technik

Die meisten menschlichen Leukämien sind mit chromosomalen Anomalien assoziiert, die durch genetische Mutationen oder Translokationen zustande kommen, wodurch neue Hybridgene entstehen können, die in der Lage sind, mutierte oder fusionierte Proteine zu exprimieren. Die codierten abnormen Fusionsproteine sind durch ein die Kopplungsregion enthaltendes Segment gekennzeichnet, das aus einer einmaligen Sequenz von Aminosäuren besteht, die möglicherweise immunogen ist.
Bei der chronisch-myeloischen Leukämie (CML) hat die t(9; 22)-Translokation ein chimäres bcr-abl-Gen zur Folge, das ein 210 kD großes Fusionsprotein codiert. In CML-Zellen können alternativ zwei chimäre P210-bcr-abl-Proteine exprimiert werden, die Produkte entweder des b2a2-Exon-Übergangs oder des b3a2-Exon-Übergangs umfassen. Die Übergangssequenzen stellen einmalige Tumor-spezifische Determinanten dar, nicht nur weil sie einen verknüpften Satz von Aminosäuresequenzen enthalten, die normalerweise nicht auf dem gleichen Protein exprimiert werden, sondern auch weil am exakten Fusionspunkt ein Codon für eine neue Aminosäure vorliegt (1, 2).
Genauso liegt in den Zellen bei der akuten Promyelocyten-Leukämie (APL) eine spezifische chromosomale Translokation vor, wodurch ein 90- bis 110-kD- Protein entsteht, in dem das Produkt des dritten Exons des RAR-Gens, das auf Chromosom 17 liegt, mit dem aminoterminalen Teil eines Zn-Finger-Proteins, PML aus Chromosom 15, fusioniert ist. Alternative Bruchstellen ergeben PML-RAR-A und PML-RAR-B, die sich in den Zellen von 90% der APL-Patienten feststellen lassen (3, 4). Wie bei der CML enthalten die beiden APL-Proteine ein einmaliges Epitop, das aus der Fusionsstelle und außerdem einer neuen Aminosäure besteht.
Für menschliche Melanom-Antigene wurde gezeigt, dass menschliche T- Zellen Tumorassoziierte Antigene erkennen können (5, 6), dies wurde außerdem für eine einzelne Punktmutation in ras nachgewiesen, die zu einer einzelnen Aminosäure-Änderung führt (7). Spezifische Antworten menschlicher CD4-T-Zellen wurden in vitro gegen das in APL-Zellen gefundene PML-RAR-Fusionsprotein (8) und in vivo gegen B-Zell-Lymphom-Immunglobulinidiotypen erzeugt (9).
Die bei der CML und bei der APL gefundenen Protein-Paare bieten sich als offensichtliche Ziele für eine immunologische Vorgehensweise zur Behandlung dieser Leukämien an und dienen außerdem als ein Modell für diese Vorgehensweise in anderen Neoplasmen. Obwohl die bcr-abl- und PML-RAR-Proteine intrazelluläre Proteine sind, könnten die enzymatischen Spaltprodukte dieser Fusionsproteine als kurze Peptide, mit einer Länge von 8 bis 25 Aminosäuren, innerhalb der Spalte von HLA-Molekülen auf der Zelloberfläche präsentiert werden und könnten möglicherweise durch T-Zellen erkannt werden. Diese Peptide werden durch eine intrazelluläre Prozessierung von exogenen und endogenen Proteinen als Teil des Stoffwechselwegs der Antigen-Präsentation hergeleitet (10). Das den Fusionspunkt überspannende Peptid abl-bcr ist durch den Antisense-Strang des bcr-abl-codierenden Gens codiert (J. Diamond et al., Blood 85 (8): 2171-2175, (1995)). Das den Fusionspunkt überspannende Peptid RARa-PML ist durch den Antisense-Strang des PML-RARa codierenden Gens codiert (M. Lafage-Pochitaloff et al., Blood 85 (5): 1169-1174, (1995)).
Die Aminosäuremotive, die für eine spezifische Peptidbindung an HLA- Moleküle der Klasse I verantwortlich sind, wurden für die herkömmlichen HLA-Typen der Klasse I bestimmt, indem die durch Säure eluierten, natürlich prozessierten Peptiden analysiert und Zelllinien verwendet wurden, die in der intrazellulären Peptid- Beladung und Prozessierung defekt waren (11 bis 13). Kürzlich wurde von Sette et al. (14) ein quantitativer molekularer Radiobindungstest für die Analyse der Peptidbindung an gereinigte HLA-Moleküle der Klasse I entwickelt.
Wenn eine Impfstoff-Strategie für die APL und die CML entwickelt werden soll, bestehen die ersten zwei wichtigen Fragen darin, ob onkogene Fusionsproteine geeignete Aminosäuresequenzen und geeignete Ankermotive für die Bindung an Klasse-I-Moleküle enthalten und ob diese Bruchstelle-Peptide mit einer ausreichend hohen Affinität an die Furche von HLA-Molekülen der Klasse 1 binden können; wobei diese Aktivität für die Induktion einer Leukämie-spezifischen Antwort von T-Zellen erforderlich ist. Hier wird die Fähigkeit einer Reihe von synthetischen Peptiden, die den Übergangssequenzen von bcr-abl- und PML-RAR-Proteinen entsprechen, analysiert, an gereinigte menschliche Moleküle der Klasse I zu binden. Für diese Vorgehensweise gab es zwei Gründe: 1) Bruchstelle-überspannende Peptide, die in der Lage sind, an Klasse-I-Moleküle zu binden, könnten mögliche Kandidaten für Antigene für eine aktive Immuntherapie gegen diese Leukämien sein. 2) Die Tatsache, dass einmalige Tumor-spezifische Bruchstelle-Sequenzen nicht im Zusammenhang mit HLA-Molekülen präsentiert werden, würde eine molekulare Erklärung für ein immunologisches Nicht-Ansprechen auf die abnormen intrazellulären Fusionsproteine in leukämischen Zellen bieten.
Cullis et al. (Leukemia 8: 165-170, (1994)) testeten 18 Peptide, die die Übergangssequenzen des b2a2- und des b3a2-Proteins überspannten, auf ihre Fähigkeit, die Expression der Klasse-I-Allele in den zwei menschlichen Zelllinien LBL 721.174 (T2) (HLA-A2, B5) und BM 36.1 (HLA-A1, B35) zu aktivieren. Diese Zellen sind in der intrazellulären Peptid-Beladung von Klasse-I-Molekülen defekt. Keines der bcr-abl- Peptide steigerte im Vergleich zu Allel-spezifischen Kontrollpeptiden die HLA-A2- oder HLA-B35-Allel-Expression. Die Autoren folgerten hieraus, dass keines der CML- Peptide die bekannten Peptid-bindenden Motive für diese Allele zufrieden stellt.
Gambacorti-Passerini et al. waren nicht in der Lage, bei der akuten Promyelocyten-Leukämie (APL) die Erzeugung einer CD8/HLA-Klasse-I-eingeschränkte ("restricted") Antwort auf die Fusionsbruchstelle-Peptide nachzuweisen (Blood 84 (Suppl.), S. 618a, Abstract 2459, (1994)).
Chen et al. berichteten, dass die Immunisierung von Mäusen mit synthetischen Peptiden, die der BCR-ABL-Verknüpfungsregion entsprachen, Peptid- spezifische CD4&spplus;-Klasse-II-Haupthistokompatibilitäts-Komplex-eingeschränkte T- Zellen hervorbrachte (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1468-1472 (1992)). Da sowohl BCR als auch ABL menschliche Proteine sind, sind sie für Mäuse fremde Proteine. Die Immunogenität eines fremden Peptids und sogar eines fremden Bruchstelle- Peptids sagt nicht direkt etwas darüber aus, ob Peptide, die die Verknüpfungsregion von zwei nativen Proteinen überspannen, eine immunogene Antwort stimulieren können.
Mit den hier dargestellten Ergebnissen wurde erstmals gezeigt, dass Bruchstelle-Peptide in der Lage sind, an HLA-Peptide der Klasse I zu binden. Außerdem stimulierten solche Bruchstelle-Peptide die Proliferation von menschlichen cytotoxischen T-Zellen, welche die Fähigkeit besaßen, diejenigen Zellen abzutöten, die die Bruchstelle-Peptide in der Spalte des geeigneten HLA-Moleküls präsentierten.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Fusionspunkt-überspannenden Peptids umfasst, welches in der Lage ist, an ein Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes zu binden und in einem Individuum eine Immunantwort zu induzieren, und die Verwendung des Peptids für die Herstellung eines Arzneimittels zum Induzieren der Bildung und der Proliferation von menschlichen cytotoxischen T-Zellen aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs).
Das Fusionspunkt überspannende Peptid, das in der Lage ist, spezifisch an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitäts-Komplexes zu binden, kann durch ein Verfahren identifiziert werden, das folgendes umfasst: Inkontaktbringen oder Inkubieren des Fusionspunkt-überspannenden Peptids mit dem Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes und einem markierten Standardpeptid, das an das Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes bindet; und Nachweisen (Bestimmen) der Hemmung der Bindung des Standardpeptids an das Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes, wodurch das Fusionspunkt überspannende Peptid identifiziert wird, das in der Lage ist, spezifisch an das Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes zu binden.
Außerdem kann ein Fusionspunkt-überspannendes Peptid, das für menschliche Immunzellen immunogen ist, durch ein Verfahren identifiziert werden, das folgendes umfasst: Inkontaktbringen oder Inkubieren des Fusionspunkt-überspannenden Peptids mit einem Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes und einem markierten Standardpeptid, das an das Molekül des Haupthistokompatibilitäts- Komplexes bindet; und Nachweisen (Bestimmen), dass das Fusionspunkt-überspannende Peptid eine bestimmte Bindungsaffinität für das Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes aufweist, wobei die Konzentration, die die Bindung des Standardpeptids an das Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes um 50% hemmt, etwa 500 nMol oder weniger beträgt, wodurch ein Fusionspunkt-überspannendes Peptid identifiziert wird, das für menschliche Immunzellen immunogen ist.

Beschreibung der Figuren

Fig. 1A: Die Aminosäuresequenzen, die um die Bruchstelle des onkogenen Fusionsproteins CML-b3a2 herum liegen. Die einmalige Verbindungsaminosäure ist fett geschrieben. Alle möglichen, aus 11 Aminosäuren bestehenden Sequenzen sind unter der aus 21 Aminosäuren bestehenden Sequenz als Beispiel angegeben.
Fig. 1B: Die Aminosäuresequenzen, die um die Bruchstelle des onkogenen Fusionsproteins CML b2a2 herum liegen. Die einmalige Verbindungsaminosäure ist fett geschrieben.
Fig. 1C: Die Aminosäuresequenzen, die um die Bruchstelle des onkogenen Fusionsproteins PML-RARα-A herum liegen. Die einmalige Verbindungsaminosäure ist fett geschrieben.
Fig. 1D: Die Aminosäuresequenzen, die um die Bruchstelle des onkogenen Fusionsproteins PML-RARα-B herum liegen. Die einmalige Verbindungsaminosäure ist fett geschrieben.
Fig. 2: Spezifische Proliferation menschlicher T-Zellen als Antwort auf die Stimulierung mit dem b3a2-CML-Peptid.
Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) aus einem gesunden Spender wurden, wie früher beschrieben (E. Celis et al., "Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2105-2109, (1994)), mit einem von b3a2-CML hergeleiteten Peptid mit einer Länge von 25 Aminosäuren stimuliert. Nach zwei Stimulationsrunden (Tag 0 und Tag 12) unter Verwendung von bestrahlten (schwarze Balken) oder von Paraformaldehyd-fixierten (graue Balken), mit b3a2-CML gepulsten, autologen PBMC als Quelle Antigen-präsentierender Zellen wurden T-Zellen mit autologen PBMC unter drei verschiedenen Bedingungen inkubiert (Tag 19, Verhältnis von 1 : 1): 1) nicht gepulst, 2) gepulst mit dem b3a2-CML-Peptid oder 3) gepulst mit einem Kontrollpeptid (CDR2) mit einer Länge von 17 Aminosäuren, wie in der Figur dargestellt. Nach 72 Stunden Kultur wurde die spezifische Proliferation durch den Einbau von ³H-Thymidin gemessen. Die Ergebnisse zeigen eine spezifische Proliferation von T-Zellen, die mit den b3a2-CML-Peptid-gepulsten, autologen PBMC als Antigen-präsentierende Zellen inkubiert wurden. Keine Proliferation wurde festgestellt, wenn kein Peptid zu den APCs zugegeben wurde oder wenn die APCs mit dem Kontrollpeptid gepulst wurden.
Fig. 3: CML-b3a2-spezifische T-Zellen: Cytotoxizität gegen b3a2-gepulste Ziele.
Periphere mononukleäre Blutzellen aus einem HLA-A3-Spender wurden, wie früher beschrieben (E. Celis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2105-2109, (1994)), mit dem b3a2-CML-Peptid oder einem von HIV stammenden Kontrollpeptid stimuliert. Für dieses Kontrollpeptid wurde früher gezeigt, dass es an HLA-A3- Moleküle der Klasse I bindet und in in-vitro-Tests Peptid-spezifische cytotoxische T- Lymphocyten induziert. Kurz gesagt wurden die Zellen nach zwei Stimulationsrunden mit Peptiden (am Tag 0 und am Tag 12) mit &sup5;¹Cr-markierten autologen EBV- transformierten Zellen inkubiert (am Tag 19, vier Stunden), die vorher mit dem b3a2- CML-Peptid oder mit dem HIV-A3-Kontrollpeptid gepulst worden waren. Der Prozentsatz der spezifischen Cytotoxizität wurde bestimmt, indem die prozentuale spezifische &sup5;¹Cr-Freisetzung wie folgt berechnet wurde: [(cpm der Testprobe - cpm der spontanen &sup5;¹Cr-Freisetzung)/(cpm der maximalen &sup5;¹Cr-Freisetzung - cpm der spontanen &sup5;¹Cr-Freisetzung)] · 100. Die spontane Freisetzung von &sup5;¹Cr wurde bestimmt, indem die Ziele alleine, in Abwesenheit der Effektoren inkubiert wurden, und die maximale &sup5;¹Cr-Freisetzung wurde erhalten, indem die Ziele mit 2% SDS inkubiert wurden. Die Ergebnisse zeigen den Prozentsatz des spezifischen Abtötens von mit b3a2-CML-Peptid (schwarze Balken) oder mit Kontrollpeptid (graue Balken) gepulsten Zielen durch Effektorzellen, die vorher mit b3a2-CML oder mit dem Kontrollpeptid stimuliert worden waren, wobei zwei verschiedene E:T-Verhältnissen eingesetzt wurden.
Fig. 4: Sequenzen von CML- und Kontrollpeptiden.
Fig. 5: HLA-Typen der untersuchten Spender.
Fig. 6A bis C: Peptid-spezifische Cytotoxizität von HLA-A3-Spender-T- Zellen gegen Peptid-beladene, HLA-übereinstimmende ("HLA matched") CML- RWLEU4-Zellen.
Die Spenderzellen wurden mit CML-A3 und CML-A3/A11-Peptiden stimuliert und die Lyse von Peptid-beladenen RWLEU4-Zellen sechs Stunden in einem &sup5;¹Cr- Freisetzungs-Test zugelassen, wie in Material und Methoden beschrieben. Für jede Gruppe von Zielzellen ist der Mittelwert ± SD dargestellt. Das auf die Zielzellen geladene Peptid ist für den Spender Nr. 3 in dem kleinen Schaubild in der Figur angegeben (Fig. 6A). Für die Spender Nr. 7 (Fig. 6B) und 4 (Fig. 6C) sind die geladenen Peptide auf der X-Achse dargestellt.
Fig. 7A und B: Peptid-spezifische Cytotoxizität von HLA-A3, A2-Spender- T-Zellen gegen Peptid-beladene Ziele.
Fig. 7A: Die Spenderzellen wurden mit CML-A3- und CML-A3/A11-Peptiden stimuliert und die Lyse von Peptid-beladenen RWLEU4-Zellen sechs Stunden in einem &sup5;¹Cr-Freisetzungstest zugelassen, wie in Material und Methoden beschrieben.
Fig. 7B: Die Spenderzellen wurden mit FLU-A2-Peptid stimuliert und die Lyse von Peptid-beladenen autologen PBMC in einem &sup5;¹Cr-Freisetzungstest wie beschrieben zugelassen. Für jede Gruppe von Zielzellen ist der Mittelwert ± SD dargestellt. Die geladenen Peptide sind auf der x-Achse angegeben.
Fig. 8: CML-A3/A11-Peptid-spezifische Lyse gegen Peptid-gepulste PMBC.
Fig. 9A bis C: CML-b3a2-25-Peptid-spezifische T-Zellen-Proliferation in drei HLA-DR11-Spendern.
Spender-T-Zellen wurden mit dem b3a2-25-Peptid stimuliert und in einem ³H- Thymidin-Einbautest zu Peptid-beladenen, bestrahlten, autologen APCs für 72 Stunden zugegeben, wie in Material und Methoden für die zweite Reihe von Experimenten beschrieben. Für jede Gruppe von T-Zellen ist der Mittelwert ± SD angegeben. Für die Spender Nr. 1 und Nr. 7 (Fig. 9A bzw. B) sind die auf die APCs geladenen Peptide auf der x-Achse angegeben; das Verhältnis von Responderzellen zu APCs (T:APC) ist im Kasten angegeben. Für Spender Nr. 2 (Fig. 9C) sind die Verhältnisse von Responderzellen zu APCs auf der x-Achse bezeichnet; die spezifische Proliferation ist als Stimulationsindex ausgedrückt [SI = cpm (Mittelwert) von jeder Gruppe/cpm (Mittelwert) von APCs ohne ein zugegebenes Peptid]; das auf die APCs geladene Peptid ist im Kasten angegeben.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, die ein Fusionspunkt-überspannendes Peptid umfasst, das in der Lage ist, spezifisch an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitäts-Komplexes zu binden, das durch ein Verfahren identifiziert werden kann, welches folgendes umfasst: Inkontaktbringen oder Inkubieren des Fusionspunkt-überspannenden Peptids mit dem Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes und einem markierten Standardpeptid, das an das Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes bindet; und Bestimmen der Hemmung der Bindung des Standardpeptids an das Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes, wodurch das Fusionspunkt überspannende Peptid identifiziert wird, das in der Lage ist, spezifisch an das Molekül des Haupthistokompatibilitäts- Komplexes zu binden.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Fusionspunkt überspannende Peptid ein onkogenes Fusionspunkt-überspannendes Peptid, das mit einer Krebserkrankung assoziiert ist. Translationen sind bei vielen Krebserkrankungen üblich, wie z. B. Leukämie (z. B. chronisch-myeloische Leukämie, akute Promyelocyten- Leukämie und gemischte Leukämie), Krebserkrankungen des hämatopoetischen Systems, kolorektales Karzinom, Leberzellenkrebs, lymphoides Neoplasma, Lymphom, lymphoproliferatives Syndrom und ein Tumor. Andere Krebserkrankungen sind dem Fachmann bekannt. Vgl. z. B. Jeffrey Cossman, Molecular Genetics in Cancer Diagnosis (Elsevier, 1990, New York), und F. Mitelman, Catalog of Chromosome Aberrations in Cancer (Liss, New York, 1988). Translokationen treten auch bei anderen Leiden auf, z. B. kommen c-myc-Translokationen beim Burkitt-Lymphom vor, und außerdem im Zusammenhang mit AIDS. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid mit der chronisch-myeloischen Leukämie (CML) assoziiert. Peptide, die mit der CML assoziiert sind, umfassen bcr-abl und abl-bcr. Demgemäß weisen die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthaltenen Peptide verschiedene Längen auf, die den Fusionspunkt der bcr-abl- und abl-bcr-Proteine überspannen. In einer anderen Ausführungsform ist das Peptid mit der akuten Promyelocyten- Leukämie assoziiert. Peptide, die mit der akuten Promyelocyten-Leukämie assoziiert sind, umfassen PML-RAR und RAR-PML. Demgemäß weisen die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthaltenen Peptide verschiedene Längen auf, die den Fusionspunkt der PML-RAR- (einschließlich PML-RARa-) und RAR-PML- (einschließlich RARa-PML-) Peptide überspannen.
Das den Fusionspunkt überspannende Peptid, das in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthalten ist, ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus ATGFKQSSK (SEQ ID NO: 28); GFKQSSKAL (SEQ ID NO: 30); KQSSKALQR (SEQ ID NO: 32); und HSATGFKQSSK (SEQ ID NO: 2) besteht.
In einer Ausführungsform ist das Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitäts-Komplexes ein HLA-Molekül der Klasse I oder ein HLA-Molekül der Klasse II. Spezifische Beispiele für HLA-Moleküle der Klasse I zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf HLA-A1, HLA-A2.1, HLA-A3.2, HLA-A11, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B8 und HLA-B27. Es ist bevorzugt, dass das HLA-Molekül der Klasse I aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: HLA-A3.2, HLA-A11 und HLA-B8. In einer Ausführungsform besitzt das den Fusionspunkt überspannende Peptid ein Bindungsmotiv für das HLA-Molekül der Klasse I oder für das HLA-Molekül der Klasse II.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Standardpeptid mit einer radioaktiven Markierung markiert. Der Fachmann kennt viele geeignete radioaktive Markierungen, z. B. Iod-125.
In einer Ausführungsform beträgt die Konzentration des Fusionspunkt- überspannenden Peptids, die die Bindung des Standardpeptids um 50% hemmt, etwa 500 nMol oder weniger. Die "Affinität" oder "Bindungsaffinität" des Fusionspunkt-überspannenden Peptids ist als der IC&sub5;&sub0;-Wert definiert, der erforderlich ist, um die Bindung des Standardpeptids für jedes MHC-Molekül zu hemmen. In einer noch spezifischeren Ausführungsform liegt die Hemmkonzentration bei etwa 100 nMol oder weniger. In einer weiteren Ausführungsform beträgt die Hemmkonzentration mindestens etwa 5 nMol. Somit stellt die vorliegende Erfindung auch das vorstehend beschriebene Verfahren bereit, in dem die Hemmkonzentration (Affinität) zwischen etwa 5 nMol und etwa 500 nMol liegt.
Zusätzlich zu ihrer Verwendung in Impfstoffen und anderen therapeutischen in-vivo- und ex-vivo-Anwendungen können die Fusionspunkt-überspannenden Peptide der vorliegenden Erfindung auch eingesetzt werden, um das Vorliegen des geeigneten MHC-Moleküls in einer Probe nachzuweisen und um die Menge des MHC- Moleküls quantitativ zu bestimmen. Genauso können die MHC-bindenden Peptide der vorliegenden Erfindung in kompetitiven Bindungsexperimenten verwendet werden, um andere Peptide mit einer Bindungsaffinität für MHC-Moleküle zu identifizieren, und zwar im Wesentlichen genauso, wie die "Standardpeptide" in Beispiel 1 eingesetzt wurden, um die Bindungsaffinität der hier beschriebenen Bruchstelle-Peptide zu identifizieren.
Das den Fusionspunkt überspannende Peptid, das für Immunzellen immunogen ist, kann durch ein Verfahren identifiziert werden, das folgendes umfasst: Inkontaktbringen oder Inkubieren des Fusionspunkt-überspannenden Peptids mit einem Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes und einem markierten Standardpeptid, das an das Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes bindet; und Nachweisen (Bestimmen), dass das Fusionspunkt überspannende Peptid eine Bindungsaffinität für das Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes besitzt, wobei die Konzentration, die die Bindung des Standardpeptids an das Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes um 50% hemmt, etwa 500 nMol oder weniger beträgt, wodurch ein Fusionspunkt-überspannendes Peptid identifiziert wird, das für Immunzellen immunogen ist. Vorzugsweise sind die Immunzellen menschliche Immunzellen, z. B. menschliche T-Zellen.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Identifizieren eines Fusionspunkt-überspannenden Peptids, das für Immunzellen immunogen ist, das Inkubieren des Fusionspunkt-überspannenden Peptids, das eine Affinität von 500 nMol oder weniger aufweist, mit den menschlichen Immunzellen; und Feststellen der Induktion der menschlichen Immunzellen. Dieser Schritt kann an einem beliebigen Punkt in dem vorstehend beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Andererseits ist das Inkubieren des Fusionspunkt-überspannenden Peptids, das eine Affinität von 500 nMol oder weniger aufweist, mit den menschlichen Immunzellen; und das Feststellen der Induktion der menschlichen Immunzellen selbst ein vollständiges Verfahren zum Identifizieren eines Fusionspunkt-überspannenden Peptids, das für Immunzellen immunogen ist.
In einer Ausführungsform sind die menschlichen Immunzellen T-Zellen, und die Induktion ist eine Induktion von cytotoxischen T-Lympocyten. In einer Ausführungsform ist das Fusionspunkt überspannende Peptid ein onkogenes Fusionspunkt- überspannendes Peptid, das mit einer Krebserkrankung assoziiert ist. Z. B. kann das Peptid mit Leukämie, einer Krebserkrankung des hämatopoetischen Systems und einem Tumor und außerdem mit anderen Leiden assoziiert sein, die dem Fachmann bekannt sind. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Leukämie die chronisch- myeloische Leukämie.
Das Fusionspunkt überspannende Peptid, das in der Zusammensetzung der Erfindung enthalten ist, ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus ATGFKQSSK (SEQ ID NO: 28); GFKQSSKAL (SEQ ID NO: 30); KQSSKALQR (SEQ ID NO: 32); und HSATGFKQSSK (SEQ ID NO: 2) besteht.
In einer Ausführungsform ist das Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitäts-Komplexes ein HLA-Molekül der Klasse I oder ein HLA-Molekül der Klasse II. Spezifische Beispiele von HLA-Molekülen der Klasse I zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf HLA-A1, HLA-A2.1, HLA-A3.2, HLA-A11, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B8 und HLA-B27. Es ist bevorzugt, dass das HLA-Molekül der Klasse I aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: HLA-A3.2, HLA-A11 und HLA-B8. Geeignete HLA-Moleküle der Klasse II umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf ein HLA-DR-Molekül, z. B. HLA-DR11. In einer Ausführungsform besitzt das Fusionspunkt-überspannende Peptid ein Bindungsmotiv für das HLA-Molekül der Klasse I oder für das HLA-Molekül der Klasse II.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Standardpeptid mit einer radioaktiven Markierung markiert. Der Fachmann kennt viele geeignete radioaktive Markierungen, z. B. Iod-125.
In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt die Hemmkonzentration oder Bindungsaffinität etwa 100 nMol oder weniger. In einer Ausführungsform liegt die Hemmkonzentration zwischen etwa 5 nMol und etwa 500 nMol.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum Induzieren menschlicher cytotoxischer T-Zellen bereit, wobei das Verfahren das Inkontaktbringen einer menschlichen T-Zelle mit einem Fusionspunkt-überspannenden Peptid umfasst, das in der Lage ist, spezifisch an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitäts-Komplexes zu binden. In einer Ausführungsform ist die menschliche T-Zelle CD8&spplus;, CD4&spplus; oder CD8&spplus;CD4&spplus;.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Fusionspunkt- überspannende Peptid ein Fusionspunkt-überspannendes Peptid, das mit einer Krebserkrankung assoziiert ist, z. B. einer Leukämie, einer Krebserkrankung des hämatopoetischen Systems und einem Tumor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid mit der chronisch-myeloischen Leukämie assoziiert.
Das Fusionspunkt überspannende Peptid, das in der erfindungsgemäßen Zusammensetzung enthalten ist, ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus ATGFKQSSK (SEO ID NO: 28); GFKQSSKAL (SEQ ID NO: 30); KQSSKALQR (SEQ ID NO: 32); und HSATGFKQSSK (SEQ ID NO: 2) besteht.
In einer Ausführungsform ist das Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitäts-Komplexes ein HLA-Molekül der Klasse I oder ein HLA-Molekül der Klasse II. Spezifische Beispiele für HLA-Molekül der Klasse I zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf HLA-A1, HLA-A2.1, HLA- A3.2, HLA-A11, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B8 und HLA-B27. Es ist bevorzugt, dass das HLA-Molekül der Klasse I aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: HLA- A3.2, HLA-A11 und HLA-B8. Geeignete HLA-Moleküle der Klasse II umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf ein HLA-DR-Molekül, z. B. HLA-DR11. In einer Ausführungsform besitzt das Fusionspunkt überspannende Peptid ein Bindungsmotiv für das HLA-Molekül der Klasse I oder für das HLA-Molekül der Klasse II.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Standardpeptid mit einer radioaktiven Markierung markiert. Der Fachmann kennt viele geeignete radioaktive Markierungen, z. B. Iod-125.
In einer Ausführungsform beträgt die Konzentration des Fusionspunkt- überspannenden Peptids, die die Bindung des Standardpeptids um 50% hemmt, etwa 500 nMol oder weniger. Die "Affinität" oder "Bindungsaffinität" des Fusionspunkt-überspannenden Peptids ist als der ICS-Wert definiert, der erforderlich ist, um die Bindung des Standardpeptids für jedes MHC-Molekül zu hemmen. In einer noch spezifischeren Ausführungsform beträgt die Hemmkonzentration etwa 100 nMol oder weniger. In einer Ausführungsform liegt die Hemmkonzentration zwischen etwa 5 nMol und etwa 500 nMol.
Antigene Bruchstelle-Peptide können eingesetzt werden, um CTL ex vivo zu induzieren. Die resultierenden CTL können zur Behandlung des Leidens verwendet werden, das mit einem Fusionsprotein assoziiert ist, z. B. chronische Infektionen (virale oder bakterielle) oder Tumoren in Patienten, die nicht auf andere herkömmliche Therapieformen ansprechen oder die keine Reaktion auf eine Behandlung mit einem Peptidimpfstoff zeigen. Ex-vivo-CTL-Antworten auf ein bestimmtes Pathogen (infektiöses Agens oder Tumorantigen) werden induziert, indem die CTL-Vorläuferzellen (CTLp) des Patienten in einer Gewebekultur zusammen mit einer Quelle von Antigen-präsentierenden Zellen (APC) und dem geeigneten immunogenen Peptid inkubiert werden. Nach einer geeigneten Inkubationszeit (typischerweise eine bis vier Wochen), in der die CTLp aktiviert werden, reifen und sich zu Effektor-CTL expandieren, werden die Zellen in den Patienten zurück infundiert, wo sie dann ihre spezifische Zielzelle zerstören (typischerweise eine infizierte Zelle oder eine Tumorzelle).
Diese Erfindung stellt ein Arzneimittel bereit, das eine therapeutisch wirksame Menge eines Fusionspunkt-überspannenden Peptids enthält, das in der Lage ist, an ein Molekül des Haupthistokompatibilitäts-Komplexes zu binden und in einem Individuum eine Immunantwort zu induzieren.
In einer Ausführungsform dieses Verfahrens ist das Fusionspunkt-überspannende Peptid ein onkogenes Fusionspunkt-überspannendes Peptid, das mit einer Krebserkrankung assoziiert ist, z. B. einer Leukämie, einer Krebserkrankung des hämatopoetischen Systems und einem Tumor. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid mit der chronisch-myeloischen Leukämie assoziiert.
Das Fusionspunkt überspannende Peptid, das in der Zusammensetzung der Erfindung enthalten ist, ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus ATGFKQSSK (SEQ ID NO: 28); GFKQSSKAL (SEQ ID NO: 30); KQSSKALQR (SEQ ID NO: 32); und HSATGFKQSSK (SEQ ID NO: 2) besteht.
In einer Ausführungsform ist das Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitäts-Komplexes ein HLA-Molekül der Klasse I oder ein HLA-Molekül der Klasse II. Spezifische Beispiele von HLA-Molekülen der Klasse I zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf HLA-A1, HLA-A2.1, HLA-A3.2, HLA-A11, HLA-A24, HLA-B7, HLA-B8 und HLA-B27. Es ist bevorzugt, dass das HLA-Molekül der Klasse I aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus: HLA-A3.2, HLA-A11 und HLA-B8. Geeignete HLA-Moleküle der Klasse II umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf ein HLA-DR-Molekül, z. B. HLA-DR11. In einer Ausführungsform besitzt das Fusionspunkt überspannende Peptid ein Bindungsmotiv für das HLA-Molekül der Klasse I oder für das HLA-Molekül der Klasse II.
In einer Ausführungsform enthält das Arzneimittel außerdem einen pharmazeutisch verträglichen Träger, ein Adjuvans oder beides. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Adjuvans QS21.
Das Arzneimittel kann für die Verabreichung durch eine von vielen verschiedenen Techniken formuliert werden, die dem Fachmann bekannt sind. Z. B. stellt die vorliegende Erfindung Arzneimittel bereit, die parenteral, intravenös, subkutan, intradermal, in die Schleimhaut, topisch, oral oder durch Inhalation verabreicht werden können.
Das Arzneimittel kann in einem Verfahren zur Induktion einer Immunantwort bei einem Individuum eingesetzt werden, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge des Arzneimittels an ein Individuum. In spezifischen Ausführungsformen ist die Immunantwort eine CD8/HLA-Klasse-I-Immunantwort oder eine CD8/HLA-Klasse-II-Immunantwort. In einer Ausführungsform ist das Individuum ein Säuger, z. B. eine Maus, Ratte, Kaninchen, Hamster, Meerschweinchen, Pferd, Kuh, Schaf, Ziege, Schwein, Katze, Hund, Affe, Affe der Ordnung Primates oder Mensch. Vorzugsweise ist das Individuum ein Mensch.
Das Arzneimittel kann in einem Verfahren zum Immunisieren eines Individuums gegen ein Leiden verwendet werden, das mit einem Fusionsprotein assoziiert ist, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Menge des Arzneimittels. In einer Ausführungsform ist das Individuum ein Säuger, z. B. eine Maus, Ratte, Kaninchen, Hamster, Meerschweinchen, Pferd, Kuh, Schaf, Ziege, Katze, Schwein, Hund, Affe, Affe der Ordnung Primates oder Mensch. Vorzugsweise ist das Individuum ein Mensch.
Die hier verwendeten Begriffe "Immunisieren" und "Immunisierung" umfassen sowohl die vollständige als auch eine teilweise Immunisierung. Demgemäß wird in einer Ausführungsform dieses Verfahrens das Individuum teilweise immun gegen das Leiden. In einer anderen Ausführungsform wird das Individuum vollständig immun gegen das Leiden.
Ein Impfstoff kann hergestellt werden, indem das Peptid mit einem geeigneten Adjuvans kombiniert wird (Allison et al., "Adjuvant formulations and their mode of action", Semin. Immun. 2: 369, (1990)). Adjuvantien, wie inkomplettes Freundsches Adjuvans, Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, QS21, BCG oder Alaun, sind Stoffe, die dem Fachmann bekannt sind. Wahrscheinlich sind mehrere Injektionen (zwei bis zehn) erforderlich, um eine angemessene Reaktion zu erhalten.
In einer Ausführungsform ist das Leiden eine Krebserkrankung, z. B. eine Leukämie, eine Krebserkrankung des hämatopoetischen Systems und ein Tumor. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Individuum gegen die chronisch-myeloische Leukämie immunisiert.
Das hier angesprochene Verfahren zur Immunisierung kann bei einem Individuum durchgeführt werden, das noch nicht an der Krankheit leidet. In einem solchen Fall ist das Individuum vorzugsweise ein Patient, bei dem das Risiko besteht, dass er an diesem Leiden erkrankt. Das Risiko kann aufgrund der Familiengeschichte, eines genetischen Screenings, von Risikofaktoren des Verhaltens, Risikofaktoren der Umgebung und von anderen relevanten Überlegungen bestimmt werden, die der Fachmann kennt. Andererseits kann das Verfahren zur Immunisierung auch bei einem Individuum durchgeführt werden, das an der Krankheit leidet und in dem die Krankheit bereit ausgebrochen ist, oder bei einem Individuum, bei dem das Leiden in Remission ist.
Das Peptid kann an das Individuum in Verbindung mit seinem eigenen Träger oder als ein Homopolymer oder ein Heteropolymer aus aktiven Peptideinheiten verabreicht werden. Ein solches Polymer hat den Vorteil, dass die immunologische Reaktion stärker ausfällt, und außerdem besitzt ein solches Polymer, wenn zum Herstellen des Polymers unterschiedliche Peptide verwendet werden, die weitere Fähigkeit, Antikörper und/oder CTLs zu induzieren, die mit verschiedenen antigenen Determinanten der Krankheit, z. B. des Virus oder der Tumorzellen, reagieren. Geeignete Träger sind dem Fachmann bekannt und umfassen z. B. Thyroglobulin, Albumine, wie menschliches Serumalbumin, Tetanustoxoid, Polyaminosäuren, wie Poly(Lysin:Glutaminsäure), Influenza-, Hepatitis-B-Virus-Kernprotein, rekombinanter Hepatitis-B-Virus-Impfstoff und dergleichen. Außerdem können die Impfstoffe ein physiologisch tolerierbares (verträgliches) Verdünnungsmittel, wie Wasser, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung, und ferner typischerweise ein Adjuvans enthalten. Und die CTL-Antworten können geprimt werden, indem die erfindungsgemäßen Peptide an Lipide, wie P3CSS, konjugiert werden. Bei der Immunisierung mit einer Peptidzusammensetzung, wie hier beschrieben, durch eine Injektion, ein Aerosol, über eine orale, transdermale oder eine andere Route, reagiert das Immunsystem des Wirts auf den Impfstoff, indem es eine große Menge von CTLs produziert, die für das gewünschte Antigen spezifisch sind, und der Wirt wird zumindest teilweise immun gegen eine spätere Infektion, oder er wird gegenüber der Entwicklung einer chronischen Infektion resistent.
Die genauen Mengen hängen vom Gesundheitszustand und vom Gewicht des Patienten, vom Verabreichungsweg, von der Art der Formulierung usw. ab, sie liegen jedoch im allgemeinen für einen 70 kg schweren Patienten im Bereich von etwa 1,0 ug bis etwa 5000 ug, häufiger von etwa 10 ug bis etwa 500 ug pro 70 kg Körpergewicht.
Eine andere Vorgehensweise, die zum Impfen verfügbar ist, umfasst das Einführen der genetischen Sequenz, die die Peptide codiert, in einen geeigneten Vektor (Tindle, R. W., et al., Virology 200: 54 (1994)) oder als eine nackte DNA (Nabel et al., PNAS-USA 90: 11307, (1990)), die mittels einer Genkanone verabreicht wird, um eine Reaktion zu induzieren, und die Verwendung eines Trägers. Z. B. können die Peptide der vorliegenden Erfindung durch attenuierte virale Wirte, wie Vaccinia oder Geflügelpocken, exprimiert werden. Hierbei wird das Vaccinia-Virus als Vektor eingesetzt, wodurch Nucleotidsequenzen exprimiert werden, die die Peptide der Erfindung codieren. Nach Einführung in einen akut oder chronisch infizierten Wirt oder in einen nicht-infizierten Wirt exprimiert das rekombinante Vaccinia-Virus das immunogene Fusionspunkt überspannende Peptid und induziert dadurch eine CTL-Antwort des Wirts. Vaccinia-Vektoren und Verfahren, die für Immunisierungsprotokolle geeignet sind, sind z. B. im US-Patent Nr. 4 722 848 beschrieben. Ein weiterer Vektor ist BCG (Bacille Calmette Guerin). BCG-Vektoren sind in Stover et al. (Nature 351: 456-460, (1991)) beschrieben. Für den Fachmann ist aus der hier dargestellten Beschreibung ein großes Spektrum von anderen Vektoren ersichtlich, die für die therapeutische Verabreichung der erfindungsgemäßen Peptiden oder für die Immunisierung mit den erfindungsgemäßen Peptiden eingesetzt werden können, z. B. Salmonella typhi- Vektoren und dergleichen.
Die folgenden experimentellen Einzelheiten dienen dem besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung. Jedoch ist es für den Fachmann ersichtlich, dass die beschriebenen spezifischen Verfahren und Ergebnisse lediglich der Erläuterung der Erfindung dienen, die in den nachstehenden Patentansprüchen vollständiger beschrieben wird.

Experimentelle Einzelheiten

Erste Reihe von Experimenten (Beispiele 1 bis 4)

Beispiel 1: Spezifische Bindung von onkogenen Leukämie-Fusionsprotein-Peptiden an HLA-Moleküle der Klasse I

Material und Methoden

Peptide: Eine Reihe von Peptiden mit einer Länge von 8 bis 11 Aminosäuren, die die b3a2- und b2a2-Übergangsregionen von bcr-abl und den A- und B-Typ von PML-RAR überspannen, wurden aufgrund der veröffentlichten Aminosäuresequenzen (2, 4) durch Chiron/Mimotopes synthetisiert. Standardpeptide, von denen bekannt ist, dass sie wirksam an HLA-A1, A2.1, A3.2, A11, A24, B7, B8, B27 binden, wurden synthetisiert und mit ¹²&sup5;I markiert, durch Cytel, San Diego, CA, wie beschrieben (14, 15). Durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) wurde festgestellt, dass die Reinheit des Peptids über 90% lag.
Reinigung von HLA-Molekülen der Klasse I: Die Reinigung von HLA-Molekülen der Klasse I erfolgte gemäß dem Verfahren, das kürzlich von Sette et al. beschrieben wurde (14, 15). Kurz gesagt wurden nach der Herstellung von Detergenslysierten Extrakten aus EBV-Zelllinien, die für den jeweiligen in der Studie verwendeten HLA-Typ homozygot waren, die HLA-Moleküle durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Die HLA-Moleküle wurden eingeengt, und durch SDS-Polyacrylamid-Gel- Elektrophorese wurde bestimmt, dass die Reinheit über 90% lag.
MHC-Bindungstest: Die Peptidbindung an gereinigte MHC-Moleküle der Klasse I wurde wie beschrieben gemessen (14, 15). Kurz gesagt beruht der Test auf der Hemmung der Bindung des vorstehend beschriebenen radiomarkierten Standardpeptids an Detergens-solubilisierte gereinigte MHC-Moleküle. In dem Hemmtest wurden HLA-Konzentrationen (etwa 10 nM) verwendet, die 15% gebundenes Standardpeptid ergaben. Serielle Verdünnungen des CML- oder APL-Bruchstelle-überspannenden Peptids (30 uM bis 1 nM) wurden zusammen mit 5 nM des radiomarkierten Standardpeptids und des übereinstimmenden, geeigneten HLA-Moleküls inkubiert. Anschließend wurde der Prozentsatz der MHC-gebundenen Radioaktivität durch Gelfiltration bestimmt und die Hemmung berechnet.

Ergebnisse

Analyse von HLA-Motiven der Klasse I: CML: Insgesamt wurden 76 mögliche Peptidsequenzen, die 8, 9, 10 oder 11 Aminosäuren der b2a2- und b3a2- Übergangsregionen von bcr-abl-Proteinen überspannen, auf Motive analysiert, die die Fähigkeit besitzen, an die häufigsten HLA-A-Moleküle der Klasse I (A1, A2.1, A3.2, A11, A24) und HLA-B-Moleküle zu binden, in denen Ankermotive bekannt sind (B7, B8 und B27) (16 bis 22). Diese HLA-Typen zählen zu den in der Bevölkerung der Vereinigten Staaten hauptsächlich exprimierten Typen. Die Sequenzen aller Peptide mit einer Länge von elf Aminosäuren sind dargestellt, die die b3a2-Bruchstelle umfassen (Fig. 1A). Außerdem wurden bei der Analyse auf die MHC-Bindung die Serien von Peptiden mit einer Länge von 8, 9 und 10 Aminosäuren eingesetzt. Ferner ist die Sequenz der b2a2-Bruchstelle dargestellt (Fig. 1B). Allein aufgrund ihrer Sequenzen wurde bei 21 bcr-abl-Peptiden (10 für die b2a2-Bruchstelle und 11 für die b3a2-Bruchstelle) mit einer Länge von 8, 9 oder 10 Aminosäuren vorausgesagt, dass sie die Fähigkeit besitzen, eines oder mehrere Moleküle der Klasse I zu binden (Tabelle 1). Tabelle 1: Bindungsaffinitäten von CML-Peptiden an HLA-Moleküle der Klasse I
Ein Gedankenstrich bedeutet, dass der Wert größer als 30 uM war.
APL: Außerdem wurden die 76 Peptide mit geeigneten Längen untersucht, welche die PML-RAR-A- und B-Fusionsregionen überspannen. Die Sequenzen in der Umgebung der zwei Bruchstellen sind dargestellt (Fig. 1 C, D). Die Peptide mit einer Länge von 8, 9, 10 und 11 Aminosäuren wurden auf das Vorliegen von spezifischen HLA-Ankermotiven der Klasse I analysiert. Zwei Peptide aus der PML-RAR-A- und zwei aus der PML-RAR-B-Bruchstelle wurden aufgrund des Vorliegens von spezifischen Motiven als möglicherweise geeignet angesehen für die Klasse-I-Bindung (Tabelle 2). Tabelle 2: Bindungsaffinitäten von APL-Peptiden an HLA-Moleküle der Klasse I
Ein Gedankenstrich bedeutet, dass der Wert größer als 50 uM war.
Peptidsynthese und MHC-Bindunpstest: CML: Die CML-Peptide mit geeigneten Motiven wurden synthetisiert und auf die Bindung an gereinigte HLA-Moleküle getestet. Unter den elf b3a2-Peptiden, die auf HLA-Motive ausgewählt wurden, zeigten sechs signifikante Bindungsaffinitäten für sowohl HLA-A3.2 als auch A11 (Tabelle 1). Diese zwei Klasse-I-Moleküle haben viele Ähnlichkeiten in der Struktur und weisen ähnliche Bindungsmotive auf (19). Das Peptid ATGFKQSSK (SEQ ID NO: 28) band mit einer hohen Affinität (< 100 nM zum Erreichen einer Hemmung von 50%) an HLA-A11 und mit einer mittleren Affinität (wobei 100 bis 500 nM für eine Hemmung von 50% erforderlich waren) an HLA-A3.2. Im Gegensatz dazu zeigte das Peptid KQSSKALQR (SEQ ID NO: 32) eine hohe Affinität für die Bindung an HLA-A3.2 (43 nM für eine Hemmung von 50%), und es wies eine mittlere Affinität für HLA-A11 auf (273 nM). Für ein drittes Peptid HSATGFKQSSK (SEQ ID NO: 2) wurde gefunden, dass es mit einer mittleren Affinität sowohl an A3.2 als auch an A11 band (400 nM bzw. 125 nM für eine Hemmung von 50%). Die restlichen drei Peptide banden an A3.2 oder A11 sehr viel schwächer (> 500 nM bis < 6 uM, um eine Hemmung von 50% zu erreichen). Außerdem banden zwei b3a2-Peptide an HLA-B8 mit einer mittleren (GFKQSSKAL (SEQ ID NO: 30), 190 nM) oder einer niedrigen Affinität.
Keines der zehn Peptide, die zur b2a2-Bruchstelle gehörten, zeigten eine hohe oder mittlere relative Bindungsaffinität (< 500 nM Affinität) für eines der im Bindungstest verwendeten, gereinigten HLA-Moleküle der Klasse I. Zwei Peptide zeigten eine niedrige Affinität für HLA-A11 bzw. B8.
APL: Vier APL-Sequenzen, die Motive mit der Möglichkeit für eine HLA- Bindung an HLA-A2.1 enthielten, wurden synthetisiert und wie beschrieben getestet. Keines dieser Peptide zeigte in den kompetitiven Tests eine nennenswerte Bindungsaffinität für HLA-A2.1 (> 50 uM für eine Hemmung von 50%) (Tabelle 2).

Diskussion

Unter allen 76 möglichen Peptiden, die die Bruchstellen der CML-Fusionsproteine überspannen, waren 21 Peptidsequenzen mit möglicherweise HLA- bindenden Motiven; vier Peptide, die alle von der b3a2-Bruchstelle von bcr-abl stammten, banden mit einer mittleren und hohen Affinität an gereinigte HLA-A3.2-, A11- und B8-Moleküle. Dies ist das erste Mal, dass gezeigt wurde, dass die Bruchstelle-Peptide, die aus einem Leukämie-Onkogen stammen, in der Lage sind, an HLA-Moleküle der Klasse I zu binden, dies bietet die Grundlage für einen therapeutischen Impfstoff.
Die von der bcr-abl- und PML-RAR-Bruchstelle stammenden Peptide sind ein ideales Modellsystem, um eine aktive spezifische Immuntherapie von Krebs zu erforschen. Diese Peptide stellen aufgrund der neuen Sequenz der Übergangsregionen mögliche Antigene dar. Zweitens werden die Sequenzen nur in Zellen gefunden, die zum Leukämie-Clon gehören. Da beide Fusionsproteine an den leukämogenen Ereignissen in dieser bestimmten Leukämie beteiligt sind, ist es wahrscheinlich, dass Antigen-negative clonogene Zellen selten sind; somit ist ein Entkommen durch einen Verlust des Proteins (Antigens) nicht wahrscheinlich. Schließlich ist es nicht wahrscheinlich, dass die Entwicklung einer aktiven Antwort, die für das Antigen spezifisch ist, schädlich ist, da das Ziel nur auf den Leukämiezellen vorliegt.
Aufgrund ihrer intrazellulären Lage können diese Fusionsproteine über den Stoffwechselweg der HLA-Moleküle der Klasse I prozessiert und auf der Zelloberfläche präsentiert werden, so dass sie dann für cytotoxische CD8-Zellen zugänglich sein können. Das Screening dieser Peptide auf HLA-Ankermotive der Klasse I und ihr Testen auf eine wirksame HLA-Bindung stellt einen ersten Schritt dar, der erforderlich ist, um ihren Wert als mögliche Antigene zu beurteilen. Experiment 2 (nachstehend) erläutert die Fähigkeit von HLA-bindenden Peptiden, Klasse-I- eingeschränkte CD8-Zellen zu induzieren.
Die in Beispiel 2 gezeigten Ergebnisse stützen die Hypothese, dass die Peptide, die an HLA mit einer mittleren bis hohen Affinität binden, diejenigen sind, die in der Lage sind, nach der natürlichen Prozessierung und der Präsentation auf der Zelloberfläche innerhalb der Spalte des geeigneten HLA die T-Zellen zu stimulieren. Wie wichtig diese Peptide mit einer mittleren bis hohen Affinität für eine wirksame Stimulierung von T-Zellen sind, wird durch weitere Beweise erhärtet: 1) Natürlich prozessierte Peptide, die auf der Oberfläche von lebenden Zellen gebunden an HLA- Moleküle gefunden werden, haben typischerweise eine Affinität in dem hier für die CML--Peptide beschriebenen Bereich (19). 2) Nur Peptide, die an HLA mit Affinitäten in diesem Bereich binden, waren in der Lage, in in-vitro- und in-vivo-Modellen eine cytotoxische Antwort zu induzieren (24, 25). 3) Für Peptide aus dem intrazellulären Protein MAGE in Melanomen, identifiziert durch Motive wie vorstehend beschrieben, wurde gefunden, dass sie im Zusammenhang mit geeigneten HLA-Molekülen natürlich exprimiert werden (26).
Es ist von beachtlichem Interesse, dass für die APL oder das CML- Fusionspeptid b2a2 keine möglichen Peptid-Antigene gefunden wurden. Dies legt nahe, dass spezifische CD8-Antworten, eingeschränkt durch die untersuchten HLA- Typen, in Patienten mit APL oder in den Patienten mit CML und der b2a2-Bruchstelle unwahrscheinlich sind. Gambacorti-Passerini et al. (8) haben jedoch gezeigt, dass cytotoxische CD4-Zellen gegen längere, von APL stammende Fusionspeptide in vitro erzeugt werden können. Aus diesem Grund sollte eine spezifische Immunität noch über Klasse-II-Antworten möglich sein. Außerdem stellen die hier gezeigten Ergebnisse eine Möglichkeit bereit, wie andere HLA-A-, B- und C-Typen der Klasse I identifiziert werden können, die in der Lage sind, spezifische, von APL oder CML stammende Peptide zu präsentieren.
Kürzliche Studien an Patienten mit CML, die nach einer allogenen Knochenmarktransplantation einen Rückfall erlitten hatten, zeigten, dass durch die Infusion von Spender-T-Zellen wieder dauerhafte vollständige Antworten induziert werden können. Diese Beobachtung macht deutlich, dass eine Immunreaktion gegen die CML erfolgen kann (27).

Beispiel 2

Spezifische Proliferation von menschlichen T-Zellen als Antwort auf die Stimulation mit dem b3a2-CML-Peptid

Menschliche Zellen erkennen immunologisch Bruchstelle-Peptide und proliferieren als Antwort darauf. Periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) aus einem gesunden Spender wurden, wie früher beschrieben (E. Celis et al., "Induction of antitumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2105-2109, (1994)), mit einem von b3a2-CML stammenden Peptid mit einer Länge von 25 Aminosäuren, IVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEP (SEQ ID NO: 34), stimuliert. Nach zwei Stimulationsrunden (am Tag 0 und am Tag 12) unter Verwendung von bestrahlten (schwarze Balken) oder Paraformaldehyd-fixierten (graue Balken), b3a2-CML-gepulsten, autologen PBMC als Quelle Antigen-präsentierender Zellen wurden T-Zehlen mit autologen PBMC unter drei verschiedenen Bedingungen inkubiert (am Tag 19, Verhältnis von 1 : 1): 1) nicht gepulst, 2) gepulst mit dem b3a2-CML-Peptid oder 3) gepulst mit einem Kontrollpeptid (CDR2) mit einer Länge von 17 Aminosäuren, wie in der Figur dargestellt. Nach 72 Stunden Kultur wurde die spezifische Proliferation durch den Einbau von ³H-Thymidin gemessen. Die Ergebnisse zeigen eine spezifische Proliferation von T-Zellen, die mit den b3a2-CML-Peptid-gepulsten autologen PBMC als Antigen-präsentierende Zellen inkubiert wurden. Keine Proliferation wurde festgestellt, wenn kein Peptid zu den APCs zugegeben wurde oder wenn die APCs mit dem Kontrollpeptid gepulst wurden (vgl. Fig. 2).
Peptide, die an HLA mit einer mittleren bis hohen Affinität binden, sind diejenigen, die in der Lage sind, nach der natürlichen Prozessierung und der Zelloberflächen-Präsentation innerhalb der Spalte des geeigneten HLA die T-Zellen zu stimulieren. Wie wichtig diese Peptide mit einer mittleren bis hohen Affinität für eine wirksame Stimulierung von T-Zellen sind, wird durch weitere Beweise erhärtet (15-23): 1) Natürlich prozessierte Peptide, die auf der Oberfläche von lebenden Zellen gebunden an HLA-Moleküle gefunden werden, haben typischerweise eine Affinität in dem hier für die CML-Peptide beschriebenen Bereich. 2) Nur Peptide, die an HLA mit Affinitäten in diesem Bereich binden, waren in der Lage, in in-vitro- und in-vivo-Modellen eine cytotoxische Antwort zu induzieren. 3) Für Peptide aus dem intrazellulären Protein MAGE in Melanomen, identifiziert durch Motive wie vorstehend beschrieben, wurde gefunden, dass sie im Zusammenhang mit geeigneten HLA- Molekülen natürlich exprimiert werden (26).

Beispiel 3

CML-b3a2-spezifische T-Zellen: Cytotoxizität gegen b3a2-gepulste Ziele

Effektorzellen, die durch die Bruchstelle-Peptide wie in Beispiel 3 beschrieben stimuliert wurden, töten Zielzellen ab, die das Bruchstelle-Peptid präsentieren, das in der Spalte von HLA-Molekülen präsentiert wird.
Periphere mononukleäre Blutzellen aus einem HLA-A3-Spender wurden, wie früher beschrieben (E. Celis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2105-2109, (1994)), mit dem b3a2-CML-Peptid KQSSKALQR (SEQ ID NO: 32) oder einem von HIV stammenden Kontrollpeptid stimuliert. Für dieses Kontrollpeptid wurde schon früher gezeigt, dass es an HLA-A3-Moleküle der Klasse I bindet und in in-vitro-Tests Peptid-spezifische cytotoxische T-Lymphocyten induziert. Kurz gesagt wurden die Zellen nach zwei Stimulationsrunden mit Peptiden (am Tag 0 und am Tag 12) mit &sup5;¹Cr-markierten, autologen, EBV-transformierten Zellen inkubiert (am Tag 19, vier Stunden), die vorher mit dem b3a2-CML-Peptid oder mit dem HIV-A3-Kontrollpeptid gepulst worden waren. Der Prozentsatz der spezifischen Cytotoxizität wurde bestimmt, indem die prozentuale spezifische &sup5;¹Cr-Freisetzung wie folgt berechnet wurde: [(cpm der Testprobe - cpm der spontanen &sup5;¹Cr-Freisetzung)/(cpm der maximalen &sup5;¹Cr-Freisetzung - cpm der spontanen &sup5;¹Cr-Freisetzung)] · 100. Die spontane &sup5;¹'Cr-Freisetzung wurde bestimmt, indem die Ziele alleine, in Abwesenheit der Effektoren, inkubiert wurden, und die maximale &sup5;¹Cr-Freisetzung wurde erhalten, indem die Ziele mit 2% SDS inkubiert wurden. Die Ergebnisse zeigen den Prozentsatz des spezifischen Abtötens von mit b3a2-CML-Peptid (schwarze Balken) oder mit Kontrollpeptid (graue Balken) gepulsten Zielen durch Effektorzellen, die vorher mit dem b3a2-CML-Peptid oder mit dem Kontrollpeptid bei zwei verschiedenen E:T-Verhältnissen stimuliert worden waren (vgl. Fig. 3).

Beispiel 4

Impfung von Patienten, die an einer chronisch-myeloischen Leukämie leiden, mit Tumor-spezifischen Bruchstelle-Peptiden

Adjuvans

Der häufigste Grund für die schwache Antwort des Wirts auf die meisten Tumorantigene besteht darin, dass Tumorantigene einfach schwache Immunogene sind, hauptsächlich weil sie Autoantigene sind und möglicherweise immunologisch toleriert werden. Während die klassische immunologische Toleranz durch das Ausmerzen von autoreaktiven B- und T-Zellen während der frühen Entwicklung zustande kommt, ist es klar, dass viele B- und T-Zellen, die in der Lage sind, gegen Autoantigene in Tumoren zu reagieren, in Patienten mit Myelom vorliegen, obwohl sie selten eine Autoimmunität induzieren. Die Mechanismen, mit denen sich dieses Phänomen erklären lässt, umfassen eine unwirksame Antigenpräsentation, eine Anergie peripherer B- und T-Zellen und die Unfähigkeit der Tumorzelle, ein "zweites Signal" zu induzieren, das erforderlich ist, um die T-Zellen wirksam zu aktivieren.
Die Immunisierung gegen CML-Peptide erfolgt unter Verwendung des immunologischen Adjuvans QS-21. Impfstoffe, die verschiedene Proteinantigene plus QS-21 enthalten, wurden beschrieben, wobei sie cytotoxische. T-Zellen gegen Zielzellen induzieren, die diese Antigene exprimieren (24 bis 27).
QS-21 ist ein Immunadjuvans, das entwickelt wurde, um Immunantworten zu boostern. QS-21 ist ein Kohlenhydrat, das aus der Rinde des südamerikanischen Baums Quillaja saponaria Molina extrahiert wird. Für eine Reihe von Saponinen wurden die Monosaccharid-Zusammensetzung, das Molekulargewicht, die Adjuvans- Wirkung und die Toxizität beschrieben. QS-21 wurde aufgrund seiner Adjuvans- Eignung und seiner fehlenden Toxizität ausgewählt. Als sicher und relativ untoxisch hat es sich in der Dosierung erwiesen, die vorgeschlagen wurde und die hochwirksam war beim Steigern der Immunogenität eines FeLV-Untereinheit-Impfstoffs in Katzen und eines rekombinanten HIV-1-Impfstoffs in Rhesus-Affen (25, 26). Außerdem wurde von Impfstoffen, die verschiedene Proteine plus QS-21 enthielten, berichtet, dass sie cytotoxische T-Zellen gegen Ziele induzieren, die diese Antigene exprimieren (26).

Arzneimittel

CML-Peptide der Klasse I: Die vier Peptide mit einer Länge von 9 und 11 Aminosäuren wurden durch F-MOC-Festphasensynthese synthetisiert und durch HPLC gereinigt. Die Reinheit wurde durch Aminosäuresequenzanalyse durch Massenspektrometrie ermittelt. Die Sequenz wurde durch Massenspektrometrie bestätigt.
CML-Peptide der Klasse II: Ein einzelnes Peptid mit einer Länge von 25 Aminosäuren wurde auf F-MOC-Festphasensynthese synthetisiert und durch HPLC gereinigt. Die Reinheit wurde durch Aminosäuresequenzanalyse durch Massenspektrometrie ermittelt. Die Sequenz wurde durch Massenspektrometrie bestätigt.
Die Aminosäuresequenzen sind wie folgt:
1. ATGFKQSSK (SEQ ID NO: 28);
2. KQSSKALQR (SEQ ID NO: 32);
3. HSATGFKQSSK (SEQ ID NO: 2);
4. GFKQSSKAL (SEQ ID NO: 30); und
5. IVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEP (SEQ ID NO: 34).

Herstellen des Impfstoffs und Testen

Der Endotoxingehalt wurde durch den Limulus-Test ermittelt, wobei gezeigt wurde, dass er unter 0,3 U/ml lag. Die Sterilität wurde dadurch bestätigt, dass auf Agarplatten kein Bakterienwachstum erfolgte. Mykoplasma-Tests waren negativ. Außerdem wurde die allgemeine Sicherheit in Mäusen und Meerschweinchen bestätigt.
Herstellung des Impfstoffs: 10 ug, 30 pg, 100 ug oder 300 ug jedes Peptids (50, 150, 500, 1500 Gesamtpeptid) werden mit 100 ug QS-21 in 0,5 ml PBS (Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung, pH 7,4) gemischt und in Gläschen gefüllt. Der Impfstoff wird eingefroren unter -20ºC gelagert. QS-21 ist ein Produkt der Cambridge Biotech Corporation, Worcester, MA, und wird unter IND. verwendet. Behandlung Tabelle 3
* Die genetischen Verfahren und PCR werden durchgeführt, wenn sich der Patient in der klinischen Remission befindet

Behandlung

Fünf Impfungen werden über einen Zeitraum von zehn Wochen verabreicht. Die erste Gruppe von Patienten erhält 50 ug Peptid pro Dosis, die anschließenden Gruppen erhalten 150, 500 bzw. 1500 ug Peptid pro Dosis. (Da es sich um fünf Peptide handelt, beträgt die Gesamtdosis jedes Peptids pro Injektion 10 ug bei der ersten Dosierung usw..) Alle Impfungen werden subkutan verabreicht, wobei die Impfung jeweils abwechselnd in die verschiedenen Extremitäten injiziert wird. In keiner Gruppe gab es einen Zwischenfall. Die Patienten werden nach der Impfung zwei Stunden beobachtet. Zwei Wochen nach der letzten Impfung werden die Patienten erneut untersucht.

Dosiserhöhungs-Schema

Die dosisbeschränkende Toxizität (DLT) ist als eine Grad-4-Toxizität definiert. Wenn bei den ersten drei Patienten, die eine bestimmte Dosierung erhalten, kein Fall von DLT festgestellt wird, wird die Dosis für die folgende Gruppe von drei Patienten erhöht. Wenn bei den drei Patienten bei einer bestimmten Dosierung ein Fall von DLT auftritt, werden drei weitere Patienten mit dieser Dosierung behandelt. Wenn bei einer Dosierung zwei Fälle von DLT festgestellt werden, wird die Dosiserhöhung gestoppt. Die MTD ist als die höchste Dosierung definiert, bei der nicht mehr als ein Fall von DLT auftritt. Am Ende der Erhöhungsstudie können weitere Patienten mit NLA-A3, A11 oder B8 auch noch mit der MTD-Dosierung behandelt werden (oder mit der maximalen Dosierung, sofern MTD nicht erreicht wird), bis insgesamt 14 Patienten mit einem dieser HLA-Typen mit diesen Dosierungen getestet wurden. Am Ende der Erhöhung werden keine Patienten ohne diese HLA-Typen aufgenommen. Wenn die Gruppe der Patienten bei dieser Dosierung zu irgendeinem Zeitpunkt eine Inzidenz von DLT von mehr als 30% zeigt, werden keine weiteren Patienten behandelt. Dies dient der Sicherheit des Impfstoffs, auf diese Weise kann die MTD besser definiert werden, und ein Maß für die mögliche Aktivität des Impfstoffs kann bei den Patienten ermittelt werden, die mit größter Wahrscheinlichkeit darauf ansprechen. Bei vier möglichen Dosierungen nehmen an diesem Dosiserhöhungs- Schema mindestens zwei Patienten und höchstens 36 Patienten teil. Aufgrund der Verbreitung der relevanten HLA-Typen und der zu erwartenden nicht-vorliegenden Toxizität kann man davon ausgehen, dass 25 Patienten an der Studie teilnehmen.

Risiken

Theoretisch sind Autoimmun- oder Überempfindlichkeitsreaktionen gegen Komponenten des Impfstoffs oder gegen Haut-Testantigene möglich. Man geht davon aus, dass die Expression der vollständigen Peptidsequenz nur auf Leukämiezellen beschränkt ist. Aus diesem Grund ist zu erwarten, dass Autoimmunreaktionen unwahrscheinlich sind. Die bei dieser QS-21-Dosis zu erwartende Toxizität umfasst eine schwache lokale Entzündung an den Injektionsstellen und gelegentliches Fieber.
Kriterien für die Toxizität: Die Toxizität wird gemäß den herkömmlichen Toxizitätskriterien eingeteilt, die durch das Nationale Krebsinstitut erstellt wurden.

Bewertung der Patienten

Innerhalb der zwei Wochen der Studie werden beim Patienten eine Röntgenaufnahme der Brust, eine vollständige ärztliche Untersuchung, ein Screening-Profil, CBC ("complete blood cell count", kompletter Blutstatus) mit Differentialblutbild, Knochenmarkaspirate für Morphologie, sowie Elektrolyte durchgeführt. Vor Beginn der Studie müssen cytogenetisch Untersuchungen und PCR für den bcr/abl-Bruchstelle-Typ erfolgt sein und die Ergebnisse vorliegen. Ein CBC wird zum Zeitpunkt der ersten Impfung durchgeführt. Eine vollständige HLA- Typisierung für HLA-A, B, DR muss vor Beginn des Phase-II-Abschnitts der Studie vorliegen.
Serologische Antwort: Peripheres Blut (10 ml) wird unmittelbar vor der ersten und der vierten Impfung (6 Wochen), und dann zwei Wochen nach der letzten Impfung (12 Wochen) entnommen. Die Seren der Patienten werden durch ELISA auf Antikörper gegen CML-Peptide und verwandte Antigene getestet. Patienten mit Titern, bei denen durch ELISA gezeigt wurde, dass sie spezifisch mit CML reagieren, werden als serologische Responder angesehen. Wenn die Serologie positiv ist, kann einen, drei und sechs Monate nach der letzten Impfung eine 10-ml-Probe entnommen werden.
Lymphocyten-Antwort: Peripheres Blut (bis zu 150 ml) wird vor der Behandlung und während der Behandlung nach sechs und zwölf Wochen entnommen, wie in der Tabelle 3 angegeben. Wenn eine Reaktivität der T-Zellen induziert wurde, kann eine weitere Probe sechs bis zehn Wochen nach der letzten Impfung entnommen werden, um die Dauer dieser Reaktivität zu bestimmen. Die peripheren Blutlymphocyten (PBLs) werden auf Proliferation, Cytotoxizität und Vorläufer-Häufigkeit getestet.
Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ (DTH): Die DTH gegen die Peptide (10 ug pro Testdosis) wird einzeln vor der ersten Impfung und nach sechs und zwölf Wochen gemessen. Kontroll-DHT-Tests umfassen auch Mumps und Trichophyton.
Klinischer Verlauf: Die Patienten werden zum Zeitpunkt jeder Impfung und zwei Wochen nach der letzten Impfung untersucht. Das Screeningprofil, CBC und Differentialblutbild werden jeweils zum Zeitpunkt der zweiten und der vierten Impfung und zwei Wochen nach der sechsten Impfung durchgeführt. Die cytogenetischen Untersuchungen und PCR-Analysen auf die Bruchstellen erfolgen an Patienten in vollständiger hämatologischer Remission nach zwölf Wochen oder am Ende der Studie. Sofern negativ, danach wie klinisch indiziert. Bei Patienten in hämatologischer Remission wurde ein Knochenmarkaspirat nach zwölf Wochen oder am Ende der Studie und danach wie klinisch indiziert entnommen.

Zweite Reihe von Experimenten

Material und Methoden

Peptidsynthese: Die Aminosäuresequenzen von CML-b3a2-hergeleiteten Peptiden und Kontrollpeptiden sind in Fig. 4 dargestellt. Die Reinheit der Peptide wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) bestimmt und betrug mehr als 90%.
Zelllinien: Die von CML stammende Zelllinie RWLEU4 (HLA-A3, A30, B27, B35) wurde als Ziel für die HLA-A3-übereinstimmenden Peptid-spezifischen CTLs verwendet. Diese Zelllinie ist durch ein b2a2-Bruchstelle-bcr-abl-Fusionsprotein gekennzeichnet. Außerdem werden CTL-Experimente unter Verwendung von autologen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) als Ziele durchgeführt.
Hervorbringen von Peotid-spezifischen T-Zellen-Antworten aus menschlichen PBMCs: PBMCs aus sieben gesunden Spendern wurden in vitro mit den geeigneten HLA-bindenden, CML-b3a2-Bruchstelle-hergeleiteten Peptiden und mit dem längeren b3a2-25-Mer-Peptid stimuliert, wobei ein Protokoll verwendet wurde, das nach Celis et al. (10) hergeleitet wurde. Kurz gesagt wurden frisch isolierte PBMC mit säurebehandelten, Peptid-beladenen, bestrahlten, autologen Antigen- präsentierenden Zellen (APCs) stimuliert, in Gegenwart eines rekombinanten menschlichen Interleukin-2 (rhIL-2, 5 bis 20 IU/ml; Hoffman-La Roche, Nutley, NJ), eines rekombinanten menschlichen IL-7 (IL-7, 20 ng/ml; Genzyme, Cambridge, MA) und eines 5% hitzeinaktivierten menschlichen AB-Serums (Sigma, St. Louis, MO). Nach 12 Tagen in Kultur wurde eine zweite Stimulation durchgeführt. Diese APCs waren Peptid-beladene, autologe PBMC, die vorher 14 Tage in vitro in Gegenwart von 200 ng/ml eines rh-Granulocyten-Makrophagenkolonie-stimlierenden Faktors (GM-CSF, Immunex, Seattle, WA) gezüchtet worden waren. Zum Peptid-Pulsen der APCs wurde jedes, von b3a2 stammende Peptid mit einer Endkonzentration von 50 ug/ml während der ersten Stimulation und mit 15 ug/ml während der zweiten Stimulation zugegeben. Nach insgesamt 19 Tagen in Kultur wurden die Peptid- stimulierten T-Zellen geerntet und auf eine Peptid-spezifische Cytotoxizität und Proliferation wie nachstehend beschrieben getestet.
CTL-Cytotoxizitäts-Test: Die von CML stammende RWLEU4-Zelllinie, autologe PBMC- oder allogene PBMC-Ziele wurden mit 100 uCi/10&sup6; Zellen von &sup5;¹Cr eine Stunde markiert, gewaschen und danach mit dem geeigneten HLA- übereinstimmenden CML-Peptid oder mit Kontrollpeptiden (20 ug/ml) zwei Stunden gepulst. Die Zielzellen wurden mit den Effektoren bei verschiedenen Verhältnissen von Effektor zu Ziel (E:T-Verhältnissen) gemischt: Nach sechs Stunden Inkubation bei 37ºC wurde die spezifische Cytotoxizität bestimmt, indem der Prozentsatz der spezifischen Freisetzung von &sup5;¹Cr wie folgt berechnet wurde: [(cpm der Testprobe - cpm der spontanen &sup5;¹Cr-Freisetzung)/(cpm der maximalen &sup5;¹Cr-Freisetzung - cpm der spontanen &sup5;¹Cr-Freisetzung)). Die spontane Freisetzung wurde bestimmt, indem die Ziele alleine mit Medien inkubiert wurden, und die maximale &sup5;¹Cr-Freisetzung wurde erhalten, indem die Ziele mit 2% Natriumdodecylsulfat (SDS) inkubiert wurden.
Lymphocyten-Proliferationstest: Die mit dem b3a2-25-Peptid stimulierten Lymphocyten wurden als Responder verwendet. Als Quelle von APCs wurden autologe PBMC, die entweder nicht gepulst oder mit dem b3a2-25-Peptid oder mit Kontrollpeptiden gepulst waren, zusammen mit den Respondern in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden bei verschiedenen Verhältnissen von Responderzellen zu APC plattiert. Nach 72 Stunden in Kultur wurden die Zellen mit 0,5 uCi/Vertiefung von ³H-Thymidin fünf Stunden inkubiert und geerntet. Anschließend wurde der Einbau von 3H-Thymidin anhand eines Betazählers gemessen.

Ergebnisse

Induktion von primären CTL-Antworten auf die von b3a2 hergeleiteten Peptide:

Bei vier b3a2-Bruchstelle-hergeleiteten Peptiden wurde früher gezeigt, dass sie in der Lage sind, an menschliche HLA-Moleküle der Klasse I zu binden (Fig. 4) (8). Bei drei Peptiden wurden Bindungseigenschaften an sowohl HLA-A3- als auch A11- Moleküle gezeigt, weshalb sie als CML-A3 (Bindung an HLA-A3 mit höherer Affinität), als CML-A11 (Bindung an HLA-A11 mit höherer Affinität) und als CML-A3/A11 (Bindung an sowohl HLA-A3- als auch A11-Moleküle mit mittlerer Affinität) identifiziert wurden. Das vierte Peptid, CML-B8, zeigte eine mittlere Bindungsaffinität für HLA-B8.
Die PBMC aus sieben normalen Freiwilligen (Fig. 5, Spender Nr. 3 bis 9) wurden mit autologen APCs stimuliert, die mit geeigneten HLA-bindenden b3a2- hergeleiteten Peptiden gepulst worden waren, und auf eine Peptid-spezifische Cytotoxizität getestet. Die HLA-A3-PBMC wurden mit den beiden CML-A3-, CML- A3/A11-Peptiden oder mit A2-Kontrollpeptiden gepulst; HLA-A11-PBMC wurden sowohl mit CML-A11- als auch mit CML-A3/A11-Peptiden gepulst. HLA-B8-PBMC wurden nur mit HLA-B8-Peptiden gepulst. Als nächstes wurden die PBMC gegen HLA-übereinstimmende oder nicht-übereinstimmende Ziele getestet. Die Ziele wurden mit A3-, A3/A11-, A11-, B8- oder A2-bindenden Peptiden beladen. Bei vier von vier HLA-A3-Spendern wurden die CML-A3/A11-Peptid-spezifischen CTLs induziert und eine spezifische Lyse von CML-A3/A11-Peptid-gepulsten HLA-A3- übereinstimmenden RWLEU4-Zellen festgestellt (Fig. 6A bis C und 7A). Keine spezifische Abtötung wurde festgestellt, wenn die Ziele nicht mit Peptiden gepulst wurden oder wenn sie mit irrelevanten Peptiden gepulst wurden, wie einem HLA-A2- bindenden, vom Influenza-Virus stammenden Peptid. In diesem System wurde RWLEU4 als Zielzelllinie verwendet, da sie von einem Patienten mit CML stammt, jedoch nicht die b3a2-Bruchstelle enthält.
Bei einem von vier getesteten HLA-A3-Spendern wurden auch CMt-A3-Peptid-spezifische CTLs festgestellt, die in der Lage waren, Peptid-gepulste RWLEU4- Zellen abzutöten (Fig. 7A).
Nicht nur CML-Zelllinien wurden eingesetzt, sondern als Alternative hierzu wurde die Cytotoxizität auch gegenüber frischen Zellen untersucht. Bei einem von drei HLA-A3-Spendern war das CML-A3/A11-Peptid auch in der Lage, ein hochspezifisches Abtöten von allogenen, HLA-übereinstimmenden, Peptid-gepulsten PBMC zu induzieren, wohingegen kein Abtöten festgestellt wurde, wenn allogene, nicht-übereinstimmende PBMC mit diesem Peptid gepulst wurden (Fig. 8). Bei einem anderen HLA-A3-Spender wurde ein signifikantes spezifisches Abtöten von autologen, CML-A3/A11-gepulsten PBMC festgestellt, jedoch war auch ein gewisses Abtöten von Zielzellen zu sehen, die mit einem nicht-verwandten Peptid beladen waren.
Um das unspezifische Abtöten von Zielzellen, die mit CML-A3 oder CML- A3/A11 gepulst waren, auszuschließen, wurden PBMC aus dem Spender Nr. 9 (HLA- A3, A2), aus denen CML-spezifische CTLs induziert wurden, getrennt mit dem HLA- A2-bindenden FLU-A2-Peptid stimuliert. In diesen PBMC wurden A2-spezifische CTLs induziert, die nur die mit FLU-A2-Peptid beladenen autologen PBMC lysierten und nicht die mit CML-A3- oder CML-A3/A11-Peptid beladenen PBMC (Fig. 7B). Somit kann das Abtöten nicht durch ein unspezifisches Lectin oder durch einen Brückeneffekt vermittelt werden.
Bei zwei HLA-A11- und zwei HLA-B8-Spendern, die getestet wurden, wurden nach der Stimulierung ihrer PBMC mit CML-A11-, CML-A3/A11- bzw. CML-B8- Peptiden keine Peptid-spezifischen CTLs induziert.
Induktion einer primären T-Zellen-Proliferation auf von b3a2 stammende Peptide: Um die Fähigkeit eines von P210-CML-b3a2 stammenden Peptids zu untersuchen, durch MHC-Moleküle der Klasse II präsentiert zu werden, wurde ein längeres Peptid (identifiziert als b3a2-25, Sequenz in Fig. 4 dargestellt), das die b3a2-Bruchstelle umfasst, eingesetzt, um in sieben gesunden Spendern eine spezifische T-Zellen-Proliferation zu stimulieren (Fig. 5, Spender Nr. 1 bis 7). Bei drei von sieben Spendern zeigten die mit dem b3a2-25-Peptid sensibilisierten T- Zellen eine spezifische Proliferation gegen Peptid-gepulste autologe PBMC als Quelle von APCs (Fig. 9A bis C). Keine spezifische Proliferation wurde festgestellt, wenn die autologen APCs nicht mit Peptiden gepulst wurden oder wenn sie mit nicht- verwandten Peptiden, wie mRASp21 oder CDR2, gepulst wurden. Alle Responder exprimierten das HLA-Klasse-II-Molekül DR11; das andere DR-Molekül auf zwei dieser Spender (DR1 bzw. DR8) war auch auf anderen Spendern enthalten, die nicht proliferierten. Somit legen diese Ergebnisse nahe, dass das b3a2-25-Peptid ein Bindungsmotiv für das DR11-Molekül enthält.
Um die Möglichkeit auszuschließen, dass das b3a2-Peptid eine unspezifische mitogene Proliferation induziert, wurden PBMC aus dem Spender Nr. 2 getrennt mit einem b2a2-17-Mer-Peptid stimuliert und gegen autologe APCs getestest, die ohne Peptide vorlagen oder die mit b2a2-17-, b3a2-25- oder mRasp21-Peptiden gepulst waren. Eine spezifische Proliferation wurde nur dann festgestellt (Stimulationsindex 1,8 bis 2,5 bei T : APC von 1 : 2), wenn die mit dem b2a2-17-Peptid sensibilisierten T- Zellen gegen b2a2-gepulste APCs getestet wurden; keine spezifische Proliferation wurde durch APCs induziert, die ohne Peptide vorlagen oder die mit b3a2-25 oder mit mRasp21 gepulst waren.

Diskussion

Die vorstehend dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die von der bcr-abl- b3a2-Bruchstelle hergeleiteten Peptide, für die früher gefunden wurde, dass sie in der Lage sind, an HLA-Moleküle der Klasse I zu binden, in der Lage waren, Peptid- spezifische, Klasse-I-eingeschränkte, cytotoxische T-Zellen in vier von sieben getesteten HLA-übereinstimmenden gesunden Spendern zu induzieren. Außerdem war ein längeres von b3a2 stammendes Peptid, b3a2-25, in der Lage, in drei von sieben untersuchten Spendern eine Peptid-spezifische T-Zellen-Proliferation zu induzieren. Die Peptid-spezifische Proliferation kann Klasse-II-HLA-DR11- eingeschränkt sein, da die Stimulation in drei von drei HLA-DR11-Spendern und in keinem von vier Nicht-HLA-DR11-Spendern festgestellt wurde. Diese Experimente sind der Beweise für eine menschliche cytolytische Immunantwort gegen die vom CML-bcr-abl-Onkogen hergeleiteten Peptide und sprechen für den Nutzen von Impfstoffen für diese Krankheit, die auf einem Fusionspunkt-überspannenden Peptid basieren.
Da das bcr-abl-Fusionsprotein unter physiologischen Bedingungen intrazellulär vorliegt, ist es nicht wahrscheinlich, dass bei der Therapie eine humorale Vorgehensweise unter Verwendung monoclonaler Antikörper erfolgreich ist; dagegen ist eine auf T-Zellen basierende Strategie erfolgversprechend. Klinische Tests, bei denen Infusionen von T-Zellen eingesetzt werden, um CML-Zellen in den Knochenmark-Transplantaten (BMT) zu eliminieren, zeigen die Eignung einer solchen Vorgehensweise, wenn alloreaktive T-Zellen verwendet werden (11). Die von bcr-abl stammenden Peptide können als echte Tumor-spezifische Antigene angesehen werden, sowohl aufgrund der neuen Aminosäuresequenz an den Übergangsregionen als auch aufgrund ihrer ausschließlichen Expression in Zellen, die zum leukämischen Clon gehören. Da außerdem diese Fusionsproteine direkt an den leukämogenen Ereignissen beteiligt sind, ist es unwahrscheinlich, dass Fusionsprotein-negative CML-Zellen übersehen werden.
Die von der CML stammenden Fusionsproteine sind Teil des intrazellulären Proteinpools, der verfügbar ist, um prozessiert zu werden und in Form von kurzen Peptiden auf der Zelloberfläche präsentiert zu werden, und zwar über den Stoffwechselweg der HLA-Moleküle der Klasse I. In diesem Weg werden die Peptide zugänglich gemacht für cytotoxische CD8&spplus;-Zellen (3). Präsentierte Peptide der Klasse I werden nicht nachdem Zufall aus den ursprünglichen Proteinen hergeleitet, vielmehr müssen sie spezifische Aminosäuresequenzen enthalten, die als "Ankermotive" für die Bindung des Peptids an die Spalte eines bestimmten MHC- Moleküls dienen (12). Die Demonstration, dass bcr-abl-Fusionspunkt-Peptide an HLA-Moleküle der Klasse I binden, war ein erster Schritt, der erforderlich war, um ihre Eignung als mögliche Tumorantigene beurteilen zu können (8). Die vorstehend präsentierten Ergebnisse, die zeigen, dass mindestens zwei dieser kurzen Peptide auch in einem primären in-vitro-Cytotoxizitätstest immunogen sind, weshalb sie in der Lage sind, in Menschen eine cytotoxische T-Zellen-Antwort zu induzieren, machen den Nutzen einer Impfstoff-Strategie für die CML deutlich.
Der direkte Beweis für b3a2-Peptide auf der Oberfläche von CML-Zellen lässt sich durch eine massenspektrometrische Analyse von endogenen Peptiden erbringen, eluiert aus dem geeigneten HLA-Molekül der Klasse I in CML-Zellen mit der b3a2-Bruchstelle (13).
Die vorstehend dargestellten Ergebnisse zeigen, dass ein längeres, von der b3a2-Bruchstelle hergeleitetes Peptid, b3a2-25, in drei normalen Spendern, denen das HLA-DR11-Molekül gemeinsam war, eine spezifische T-Zellen-Proliferation induzierte. Die b3a2-25-Sequenz enthält über der Bruchstelle ein HLA-DR-Motiv (14). Auch die Tatsache, dass die b3a2-Fusionssequenz Ankermotive der Klasse II enthält, die in der Lage sind, eine T-Zellen-Proliferation auszulösen, hat eine wichtige Bedeutung für eine aktive spezifische Immuntherapie der CML. In vivo werden CML- Fusionsproteine möglicherweise als Folge des Absterbens von Zellen freigesetzt; nach dem Aufnehmen durch lokale APCs können die Proteine prozessiert und auf der Zelloberfläche im Zusammenhang mit einem HLA-Molekül der Klasse II (HLA- DR) präsentiert werden. Die resultierende Peptid-spezifische CD4-"Hilfe" ist möglicherweise wichtig für das Hervorbringen einer lang anhaltenden und starken cytotoxischen CD8-Antwort. Außerdem wurden cytotoxische CD4-Antworten auch schon gegen andere Leukämiezellen festgestellt (15).

Referenzen

Referenzen für den Stand der Technik und Beispiel 1 der ersten Reihe von Experimenten

1. Kurzrock, R., J. U. Gutterman und M. Talpaz. The molecular genetics of the Philadelphia chromosome-positive leukemia. N. Engl. J. Med. 319: 990, 1988;
2. Grosveld, G., T. Verwoerd, T. von Agthoven, A. de Klein, K. L. Ramachandran, N. Heisterkamp, K-.Stam und J. Groffen. The chronic myelocytic cell line K562 contains a breakpoint in bcr and produces a chimeric bcr-abl chimeric transcript. Mol. Cell. Biol. 6: 607, 1986;
3. Rowley, J. D., H. M. Golamb und C. Doigherty. 15/17 translocation, a consistent chromosomal 15 change in acute promyelocytic leukemia. Lancet 1: 549, 1977;
4. De The', H., C. Chomienne, M. Lanotte, L. Degos und A. Dejean. The t(15; 17) translocation of acute promyelocytic leukemia fuses the retinoic acid receptor alpha gene to a novel transcribed locus. Nature 347: 558, 1990;
5. Van der Bruggen, P., C. Traversari, P. Chomez, C. Lurquin, E. De Plaen, B. Van den Eynde, A. Knuth und T. Boon. A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254: 1643, 1991;
6. Traversari, C., P. Van der Bruggen, I. F. Lenscher, C. Lurquin, P. Chomez, A. Van Pel, E. De Piean, A. Amar-Cortesec und T. Boon. A nonapeptide encoded by human gene MAGE-1 is recognized on HLA-A1 by cytolytic T lymphocytes directed against tumpr antigen MZ2-E. J. Exp. Med. 176: 1453, 1992;
7. Jung, S., und H. J. Schiusener. Human T lymphocytes recognize a peptide of single point-mutated, oncogenic ras proteins. J. Exp. Med. 173: 273, 1991;
8. Gambacorti-Passerini C., F. Grignani, F. Arienti, P. P. Pandolfi, P. G. Pellicci und G. Parmiani. Human CD4 lymphocytes specifically recognize a peptide representing the fusion region of the hybrid protein pml/RARalpha present in acute promyelocytic leukemia cells. Blood 5: 1369, 1993;
9. Kwak, L. W., M. J. Campbell, B. S. Czerwinski, S. Hart, R. A. Miller und R. Levy. Induction of immune responses in patients with S-cell lymphoma against the surface-immunoglobulin idiotype expressed by their tumors. N. Engl. J. Med. 327: 1209, 1992;
10. Braciale, T. J., und V. L. Braciale. Antigens presentation: Structural themes and functional variations. Immunol. Today 12: 124, 1991;
11. Falk, K., O. Rotzschke, S. Stevanovic, G. Jung und H. G. Rammansee. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self peptides eluted from MCH molecules. Nature 351: 290, 1991;
12. Hoskin, N. A., und M. J. Bevan. Defective presentation of endogenous antigen by a cell line expressing class I molecules. Science 248: 367, 1990;
13. Stuber, G., S. Modrow, P. Houglund, L. Franksson, J. Elvin, H. Wolf, K. Karre und G. Klein. Assessment of major histocompatibility complex class I interaction with Epstein-Barr virus and human immunodeficiency virus peptides by elevation of membrane H-2 and HLA in peptide loading-deficient cells. Eur. J. Immunol. 22: 2697, 1992;
14. Ruppert J., J. Sidney, E. Celis, R. T. Kubo, H. M. Grey und A. Seife. Prominent role of secondary residues in peptide binding to HLA-A2.1 molecules. Cell 74: 929, 1993;
16. Engelhard, V. H.. Structure of peptides associated with MHC class I molecules. Curr. Opin. Immunol. 6: 13, 1994;
17. Elliott T., M. Smith, P. Driscoll und A. McMichael. Peptide selection by class I molecules of the major histocompatibility complex. Curr. Biol. 3: 854, 1993;
18. Engelhard, V. H., Structure of peptides associated with class I and class II MHC molecules. Annu. Rev. Immunol. 12: 181, 1994;
19. Kubo, R. T., A. Seife, H. M. Grey, E. Appella, K. Sakaguchi, N. Z. Zhu, D. Arnott., N. Sherman, J. Shabanowitz, H. Michel, W. M. Bodnar, T. A. Davis und D. F. Hunt. Definition of specific peptide motifs for four major HLA-A alleles. J. Immunol. 152: 3913, 1994;
20. Hunt, D. F., R. A. Henderson, J. Shabanowitz, K. Sakaguchi, H. Michel, N. Servilir, A. L. Cox, E. Appella und V. H Engelhard. Characterization of peptides bound to the class I molecule HLA A2.1 by mass spectrometry. Science 255: 1261, 1992;
21. Jardetzky, T. S., W. S. Lane, R. A. Robinson, D. R. Madden und D. C. Wiley. Identification of self peptides bound to purified HLA B27. Nature 353: 326, 1991;
22. Huczko, E. L., W. M. Bodnar, D. Benjamin, K. Sakaguchi, N. Z. Zhu, J. Shabanowitz, R. A. Henderson, E. Appella, D. F. Hunt und V. H. Engelhard. Characteristics of endogenous peptides eluted from the class I MHC molecule HLA-B7 determined by mass spectrometry and computer modeling. J. Immunol. 151: 2572, 1993;
23. Cullis, J. O., A. J. Barret, J. M. Goldman und R. I. Lechler. Binding of BCR/ABL junctional peptides to major histocompatibility complex (MHC) class I molecules: Studies in antigen-processing defective cell lines. Leukemia 8: 165, 1994;
24. Kawakami, Y., S. Eliyahu, K. Sakaguchi, P. F. Robbins, L. Rivoltini, J. R. Yanelli, E. Appella und S. A. Rosenberg. Identification of the immunodominant peptides of the MART-1 human melanoma antigen recognized by the majority of HLA-A2 restricted tumor infiltrating lymphocytes. J. Exp. Med. 180: 347, 1994;
26. Celis, E., V. Tsai, C. Crimi, R. DeMars, P. A. Wentworth, R. W. Chesnut, H. M. Grey, A. Seite und M. S. Horacio. Induction of anti-tumor cytotoxic T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2105, 1994;
27. Antin, J. H.. Graft-versus-leukemia: no longer an epiphenomenon. Blood 82: 2273, 1993.

Referenzen für die Beispiele 2 und 4 der ersten Reihe von Experimenten

1. Rowley, J. D.: A new consistent chromosomal abnormality in chronic myelogenous leukemia, identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining. Nature 243: 290, 1973;
2. De Klein, A., Geurts van Kessel, A., Grosveld, G., Bartram, C. R., Hagemeijer, A., Boostma, D., Spurr, N. K., Heisterkamp, N., Grotten, J., Stephenson, J. R.: A cellular oncogene is translocated to the Philadelphia chromosome in chronic myelocytic leukemia. Nature 300: 765, 1982;
3. Heisterkamp, N., Stephenson, J. R., Groffen, J., Hansen, P. F., De Klein, A., Bartram, C. R., Grosveld, G.: Localization of the c-abl oncogene adjacent to a translocation breakpoint in chronic myelocytic leukemia. Nature 306: 239, 1983;
4. Shtivelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Canaani, E.: Fused transcript of abl and bcr genes in chronic myelogenous leukemia. Nature 315: 550, 1985;
5. Grosveld, G., Verwoerd, T., Van Agthoven, T., De Klein, A., Ramachandran, K. L., Heisterkamp, N., Stam, K., Groffen, J.: The chronic myelocytic cell line K562 contains a breakpoint in bcr and produces a chimeric bcr-abl chimeric transcript. Mol. Cell. Biol. 6: 607, 1986;
6. Ben-Neriah, Y., Daley, G. Q., Mes-Massan, A. M., Wirte, O. N., Baltimore, D.: The chronic myelogenous leukemia-specific P210 protein is the product of the bcr/abl hybrid gene. Science 233: 212, 1986;
7. Kloetzer, W., Kurzrock, R., Smith, L., Talpaz, M., Spiller, M., Gutterman, J., Arlinghaus, R.: The human cellular abl gene product in the chronic myelogenous leukemia cell line K562 has associafied tyrosine protein kinase activity. Virology 1-40: 230, 1985;
8. Shitvelman, E., Lifshitz, B., Gale, R. P., Roe, B. A., Canaani, E.: Alternative splicing of RNAs transcribed from the human abl gene and from the bcr-abl fused gene. Cell 47: 277, 1986;
9. Van Denderen, J., Hermans, A., Meeuwsen, T., Troelstra, C., Zegers, N., Boersma, W., Grosveld, G., Van Ewijk, W.: Antibody recognition of the tumor specific bcr-abl joining region in chronic myeloid leukemia. J. Exp. Med. 169: 87, 1989;
10. Dhut, S., Chaplin, T., Young, B. D.: BCR-ABL and BCR proteins: Biochemical characterization and localization. Leukemia 4: 745, 1990;
11. Chen, W., Peace, D. J., Rovira, D. K., Sheng-guo, Y., Cheever, M. A.: T- cell immunity to the joining region of p210 bcr-abl protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1468, 1992;
12. Gambacorti-Passerini, C., Grignani, F., Arienti, F., Pandolfi, P. P., Pellicci, P. G., Parmiani, G.: Human CD4 lymphocytes specifically recognize a peptide representing the fusion region of the hybrid protein pml/RAR alpha present in acute promyelocytic leukemia cells. Blood 5: 1369, 1993;
13. Jung, S., und H. J. Schiusener. Human T lymphocytes recognize a peptide of single point-mutated, oncogenic ras proteins. J. Exp. Med. 173: 273, 1991;
14. Vgl. Beispiel 1;
15. Kubo, R. T., A. Sette, H. M. Grey, E. Appella, K. Sakaguchi, N. Z. Zhu, D. Arnott. N. Sherman, J. Shabanowitz, H. Michel, W. M. Bodnar, T. A. Davis und D. F. Hunt. Definition of specific peptide motifs for four major HLA-A alleles. J. Immunol. 152: 3913, 1994;
18. Kawakami, Y., S. Eliyahu, K. Sakaguchi, P. F. Robbins, L. Rivoltini, J. R. Yanelli, E. Appella und S. A. Rosenberg. Identification of the immunodominant peptides of the MART-1 human melanoma antigen recognized by the majority of HLA-A2 restricted tumor infiltrating lymphocytes. J. Exp. Med. 180: 347, 1994;
19. Engelhard, V. H.. Structure of peptides associated with MHC class I molecules. Curr. Opin. Immunol. 6: 13, 1994;
20. Elliott, T., M. Smith, P. Driscoll und A. McMichael. Peptide selection by class I molecules of the major histocompatibility complex. Curr. Biol. 3: 854, 1993;
21. Engelhard, V. H.. Structure of peptides associated with class I and class II MHC molecules. Annu. Rev. Immunol. 12: 181, 1994;
22. Hunt, D. F., R. A. Henderson, J. Shabanowitz, K. Sakaguchi, H. Michel, N. Servilir, A. L. Cox, E. Appella und V. H Engelhard. Characterization of peptides bound to the class I molecule HLA A2.1 by mass spectrometry. Science 255: 1261, 1992;
23. Jardetzky, T. S., W. S. Lane, R. A. Robinson, D. R. Madden und D. C. Wiley. Identification of self peptides bound to purified HLA 827. Nature 353: 326, 1991;
24. Kensil, C. R., Pate, I. U., Lennick, M., Marciani, D.. Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex. J. Immunol. 146: 431, 1991;
25. Marciani, D. J., Kensil, C. R., Beltz, G. A., Hung, C., Cronier, J., Auberg, A.. Genetically engineered subunit vaccine against feline leukemia virus: Protective immune response in cats. Vaccine 9: 89,1991;
26. Newman, M. J., Munroe, K. J., Anderson, C. A., Murpha, C. I., Panicali, D. L., Seals, J. R., Wu, J.-Y., Wyand, M. S., Kensil, C. R.. Induction of antigen-specific killer T lymphocyte responses using subunit SIVmac251 gag and env vaccines containing QS-21 saponin adjuvant. Aids Research and Human Retroviruses 10: 853, 1994;
27. Livingston, P. O., Adluri, S., Helling, F., Yao, T.-J., Kensil, C. R., Newman, M. J., Marciani, D.. Phase 1 trial of immunological adjuvant QS-21 with a GM2 ganglioside-keyhole limpet haemocyanin conjugate vaccine in patients with malignant melanoma. Vaccine 12: 14, 1994.

Referenzen für die zweite Reihe von Experimenten

1. Kurzrock, R., Gutterman, J. U., Talpaz, M.: The molecular genetics of the Philadelphia chromosome-positive leukemias. N. Engl. J. Med. 39: 990, 1988;
2. Grosveld, G., Verwoerd, T. I., Van Agthoven, T., De Klein, A., Ramachandran, K. L., Heisterkamp, N., Stam, K., Groffen, J.: The chronic myelocytic leukemia cell line K562 contains a breakpoint in bcr and produces a chimeric bcr-abl chimeric transcript. Mol. Cell Biol. 6: 607, 1986;
3. Braciale, T. J., Braciale, V. L.: Antigens presentation: Structural themes and functional variations. Immunol. Today 12: 124, 1991;
4. Van der Bruggen, P., Traversari, C., Chomez, P., Lurquin, C., De Plaen, E., Van der Eynde, B., Knuth, A., Boon, T.: A gene encoding an antigen recognized by cytolytic T lymphocytes on a human melanoma. Science 254: 1643, 1991;
5. Traversari, C. I., Van der Bruggen, P. I., Lenscher, I. F., Lurquin, C., Chomez, P., Van Pel, A., De Plaen, E., Amar- Cortesec, A., Boon, T.: A nonapeptide encoded by human gene MAGE-1 is recognized on HLA-A1 by cytolytic T lymphocytes directed against tumor antigen MZ2-E. J. Exp. Med. 176: 1453, 1992;
6. Qin, H., Chen, W., Takahashi, M., Disi, M. L., Byrd, D. R., HcCahill, L., Bertram, K. A., Fenton, R. G., Peace, D. J., Cheever, H. A.: CD4+ T-cell immunity to mutated ras protein in pancreatic and colon cancer patients. Cancer Res. 55: 2984, 1995;
7. Chen, W., Peace, D. J., Rovira, D. K., Sheng-guo, Y., Cheever, H. A.: T-cell immunity to the joining region of p210 bcr-abl protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1468, 1992;
8. Bocchia, M., Wentworth, P. A., Southwood, S., Sidney, J., HcGraw, K., Scheinberg, D. A., Sette, A.: Specific binding of leukemia oncogene fusion protein peptides to HLA class I molecules. Blood 85: 2680, 1995;
9. Morrison, J., Elvin, J., Latron, F., Gotch, F., Moots, R., Strominger, J. L., McMichael, A.: Identification of the nonamer peptide from influenza A matrix protein and the role of pockets of HLA-A2 in its recognition by cytotoxic T lymphocytes. Eur. J. Immunol. 22: 903, 1992;
10. Celis, E., Tsai, V., Crimi, C., DeMars, R., Wentworth, P. A., Chesnut, R. W., Grey, H. M., Sette, H. M.: Induction of antitumor cytotoxicity T lymphocytes in normal humans using primary cultures and synthetic peptide epitopes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2105, 1994;
11. Mackinnon, S., Papadopoulos, E. B., Carabasi, M. H., Reich, L., Collins, N. H., Boulad, F., Castro-Malaspina, H., Childs, B. H., Gillio, A. P., Kernan, N. A., Small, T. N., Young, J. W., O'Reilly, R. J.: Adoptive immunotherapy evaluating doses of donor leukocytes for relapse of chronic myeloid leukemia after bone marrow transplantation: Separation of graft-verus-leukemia responses from graft-versus-disease. Blood 86: 1261, 1995;
12. Fall, K., Rotzchke, O., Stevanic, S., Jung, G., Rammansee, H. G.: Allelespecific motifs revealed by sequencing of self peptides eluted from MHC molecules. Nature 351: 290, 1991;
13. Hunt, D. F., Henderson, R. A., Shabanowitz, J., Sakaguchi, K., Michel, H., Servilir, N., Cox, A. L., Appella, E., Engelhard, V. H.: Characterization of peptides bound to the class I molecule HLA A2.1 by mass spectrometry. Science 255: 1261, 1992;
14. Hammer, J., Valsasnini, P., Tolba, K., Bolin, D., Higelin, J., Takacs, B., Senigaglia, F.: Promiscuous and allele-specific anchors in HLA-DR-binding peptides. Cell 74: 197, 1993;
15. Gambacorti-Passerini, C., Grignani, F., Arienti, F., Pandolfi, P. P., Pellicci, P. G., Parmiani, G.: Human CD4 lymphocytes specifically recognize a peptide representing the fusion region of the hybrid protein pml/RARα present in acute promyelocytic leukemia cells. Blood 81: 1369, 1993.

Claims

1. Zusammensetzung, umfassend ein Peptid aus Aminosäuren, wobei dessen Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Sequenzen:

(1) ATGFKQSSK (SEQ ID NO: 28);

(2) KQSSKALQR (SEQ ID NO: 32);

(3) HSATGFKQSSK (SEQ ID NO: 2);

(4) GFKQSSKAL (SEQ ID NO: 30); und

(5) IVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEP (SEQ ID NO: 34).

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, umfassend einen Träger und eine Menge des Peptids, die wirksam ist zur Induzierung der Bildung und Proliferation von menschlichen cytotoxischen T-Zellen aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) in einem Patienten.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen CD8&spplus;-Zellen sind.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen CD4&spplus;-Zellen sind.

5. Verwendung eines Peptids aus Aminosäuren, wobei dessen Aminosäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den folgenden Sequenzen:

(1) ATGFKQSSK (SEQ ID NO: 28);

(2) KQSSKALQR (SEQ ID NO: 32);

(3) HSATGFKQSSK (SEQ ID NO: 2);

(4) GFKOSSKAL (SEQ ID NO: 30); und

(5) IVHSATGFKQSSKALQRPVASDFEP (SEQ ID NO: 34)

zur Herstellung eines Arzneimittels zur Induzierung der Bildung und Proliferation von menschlichen cytotoxischen T-Zellen aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs).

6. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen CD8&spplus;-Zellen sind.

7. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen CD4&spplus;-Zellen sind.