DE69624701T2

DE69624701T2 - Tiefkühlkonservierung von verschiedenen pflanzenzellen

Info

Publication number: DE69624701T2
Application number: DE69624701T
Authority: DE
Inventors: B. Bare; G. Kadkade; Barbara Schnabel-Preikstas; Bin Yu
Original assignee: Phyton Inc
Current assignee: Phyton Inc
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-06-07
Publication date: 2003-10-16
Anticipated expiration: 2016-06-08
Also published as: KR100763858B1; US6753182B1; WO1996039812A3; EP0830059B1; DK0830059T3; US20030031998A1; NZ312329A; US5965438A; JPH11507380A; US6127181A; GB2316854A; EP0830059A2; PT830059E; AU6383696A; KR19990022412A; ATE227071T1; GB9725211D0; DE69624701D1; JP2008005846A; AU701381B2

Description

Hintergrund der Erfindung

1. Bereich der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für die Tiefkühlkonservierung von Pflanzenzellen und betrifft Verfahren zur Rückgewinnung von Pflanzenzellen, die unter Tiefkühlung konserviert wurden.

2. Beschreibung des Hintergrundes

Die Tiefkühlkonservierung beruht auf der Verringerung und dem anschließenden Anhalten von Stoffwechsel-Funktionen von biologischem Material, das bei ultra-niedrigen Temperaturen gelagert wird. Eine Tiefkühlkonservierung von Pflanzen und Pflanzenzellen über ausgedehnte Zeiträume ohne genetische Veränderung und die anschließende Rückgewinnung normaler Pflanzenzellen mit unveränderten charakteristischen Eigenschaften und unverändertem biosynthetischem Potential hat wichtige Einflüsse auf das Züchten von Pflanzen, die biomedizinische Forschung und das Genetic Engineering. Bei der Temperatur von flüssigem Stickstoff (-196ºC) hören nahezu alle Stoffwechsel- Aktivitäten der Zelle auf, und Zellen können in diesem in der Schwebe gehaltenen, jedoch lebensfähigen Zustand über längere Zeiträume gehalten werden.
Pflanzenzellen werden tiefkühlkonserviert, um Verluste durch Kontamination zu vermeiden, eine genetische Änderung in kontinuierlichen Zellinien zu minimieren und ein Altern und eine Transformation bei begrenzt haltbaren Zellinien zu vermeiden. Traditionelle Verfahren zur Konservierung wünschenswerter charakteristischer Pflanzen- Eigenschaften schließen das Etablieren von Kolonien von Pflanzen im Feld ein, da viele Pflanzen nicht sortengerecht aus Samen gezüchtet werden können. Diese Pflanzen- Aufbewahrungsbereiche im Feld erfordern einen großen Einsatz an Arbeit und Land und bringen hohe Risiken eines Verlustes aufgrund von Wetter, Krankheiten oder anderen Gefährdungen mit sich. Eine Alternative zu einer Pflanzen-Feldkolonie ist die Einrichtung einer In-vitro-Sammlung von Pflanzengewebe unter normalen oder beschränkten Wachstums-Bedingungen. Für eine Langzeit-Lagerung ist eine Elimination des Anlegens von Subkulturen routinemäßig erwünscht, und zwar aufgrund von Problemen mit Mutationen, Kontaminationen, Arbeitskosten und dem Risiko eines vom Menschen hervorgerufenen Irrtums, der mit einer Pflanzenkultur verbunden ist.
Die meisten biologischen Materialien einschließlich Pflanzen können nicht unter Einfrieren in bzw. Auftauen aus Tiefkühl-Temperaturen ohne Mittel und Verfahrensweisen zum Schutz gegen Tiefkühlung überleben. Eine Anzahl von Tiefkühlkonservierungsmitteln besitzen Eigenschaften, die eine Pflanze vor den schädigenden Einwirkungen des Tiefkühl-Frierens schützen können. Der essentielle Vorgang bei einer Tiefkühlkonservierung ist, eine Dehydratation der Zelle und ein Konzentrieren des Cytosols in einer gesteuerten und minimal schädlichen Weise zu bewirken, so daß eine Auskristallisation von Eis im Cytosol beispielsweise während des Abschreckens in flüssigem Stickstoff ausgeschlossen oder minimiert wird.
Bei herkömmlichen Tiefkühlkonservierungs-Verfahren wird eine Zelldehydratation bewirkt durch eine durch das Frieren induzierte Konzentration des suspendierenden Mediums. Nachteilige Wirkungen einer Dehydratation werden gemildert durch die Gegenwart von Mitteln zum Schutz gegen das Einfrieren. Proben, wie beispielsweise Zellen und Organe, werden in einer Lösung äquilibriert, die ein Mittel zum Schutz gegen Kühlung, wie beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO) oder Ethylenglycol enthält. Die Suspension wird abgekühlt und mit einem Eiskristall bei einer Temperatur knapp unterhalb ihres Gefrierpunkts angeimpft. Die Suspension wird erneut mit einer optimalen Rate bis zu einer Zwischen-Temperatur unter dem Nullpunkt, wie beispielsweise bis auf etwa -30ºC und etwa -40ºC, abgekühlt und zum Schluß in flüssigem Stickstoff abgeschreckt.
Zwar ist eine routinemäßige Tiefkühlkonservierung von Mikroorganismen, Zygoten und von Zygoten abgeleiteten Tieren möglich; die Tiefkühlkonservierung von Pflanzen ist jedoch von routinemäßigem Vorgehen noch weit entfernt, und es sind häufig unterschiedliche Vorgehensweisen für individuelle Spezies von Pflanzen erforderlich.
Taxus-Bäume (Eibenbäume) produzieren Taxol, ein Diterpen-Alkanoid, das ursprünglich isoliert wurde aus der Borke der Pazifik-Eibe, Taxus brevifolia (M. C. Wani et al., J. Am. Chem. Soc. 93 (1971), 2325 bis 2327). Experimente haben gezeigt, daß diese Verbindung wirksam die Polymerisation von Mikrotubuli von Säugerzellen ohne unnütze Toxizität inhibiert und damit als solche ein wirksames Antitumor-Mittel ist. Klinische Versuche identifizierten Taxol als extrem wirksam gegen hartnäckige Eierstock-, Brust- und andere Krebskrankheiten. Als solches ist Taxol ein Durchbruch bei der Chemotherapie aufgrund seines ziemlich einzigartigen, jedoch grundlegenden Wirkungsmechanismus, der fundamental verschieden von demjenigen herkömmlicher chemotherapeutischer Mittel ist (L. A. Rowinsky et al., J. Natl. Cancer Instit. 82 (1990), 1247 bis 1259).
Das bisher am meisten entmutigende Problem im Zusammenhang mit Taxol ist der Nachschub. Man braucht drei bis sechs 100 Jahre alte Pazifik-Eiben zur Behandlung eines Patienten, da die mittleren Ausbeuten an Taxol niedrig sind (Witherup et al., 1990). Die Herstellung einer Taxol-Menge, die zur Behandlung und zum Test benötigt wird, erfordert die Zerstörung von Zehntausenden von Eiben. Die Eiben-Population wurde durch Fällen nahezu zum Aussterben gebracht, und da die Zahl der Pazifik-Eiben immer geringer wird, muß sich die medizinische Forschung nach anderen Formen des Nachschubs für Taxol umschauen. Die Nützlichkeit von Taxol wie auch von vielen anderen Verbindungen, die in Pflanzenzellen vermehrt oder geerntet werden können, hat das Interesse am Kultivieren von Taxus-Zellen und anderen Pflanzen-Zellen genährt.
Das Kultivieren von Pflanzenzellen aufgrund ihres biosynthetischen Potentials erbringt spezielle Probleme für die derzeitige Technologie. Ein längeres Kultivieren von Pflanzenzellen führt oft zu einem Verlust des biosynthetischen Potentials, das in den ursprünglichen Isolaten vorhanden war (Dhoot et al., Ann. Bot. 41 (1977), 943 bis 949; Barz et al., Ber. Dtsch. Bot. Ges. 94 (1981), 1 bis 26). Änderungen des Phänotyps treten ebenfalls auf, was das Kultivieren von Zellen weiter verkompliziert. Eine vorgeschlagene Vorgehensweise zum Einfrieren von Pflanzenzellen, insbesondere von Taxus-Zellen ist ein wichtiger Schritt bei der Entwicklung biosynthetischer Verfahren zur Herstellung nützlicher Pflanzen-Alkaloide, wie beispielsweise Taxol.
Steponkus (Advances in Low-Temperature Biology, Band 1, 1992) diskutiert die Tiefkühlkonservierung von Pflanzengeweben durch Vitrifikation ("Glasbildung"). Die Vitrifikation wird als aus fünf Schritten bestehend beschrieben:
(1) Gleichgewicht der Probe in einer Lösung, die eindringende Mittel zum Schutz gegen Tiefgefrieren enthält; dieser Schritt wird als "Beladungsschritt" bezeichnet;
(2) Dehydratation der Probe in einer konzentrierten Lösung, die eine Vitrifikation erlaubt;
(3) Eintauchen der Probe in flüssigen Stickstoff;
(4) Aufwärmen der Probe;
(5) Verdünnen der Vitrifikations-Lösung und Entfernen des gegen ein Gefrieren schützenden Mittels ("cryoprotectant") aus dem Cytosol; dieser Schritt wird als "Entladen" bezeichnet.
Steponkus lehrt, daß der Dehydratationsschritt möglicherweise der am meisten schädliche Schritt des gesamten Vitrifikationsprozesses ist und gibt an, daß eine Dehydratation Membranen destabilisiert.
Reinhoud et al. (Vitrification of Plant Cell Suspensions, Kapitel 12, Seiten 113 bis 119, 1995) beschreiben, daß eine Vitrifikation eine vorteilhafte Verfahrensweise für die Tiefkühlkonservierung von Zellen ist, obwohl Vitrifikationslösungen toxisch zu sein scheinen, und bestimmte Stämme eine sorgfältige Verfahrensweise erfordern, da sie leichter beschädigt werden. Die sorgfältige Verfahrensweise schließt Schritte des Vor- Kultivierens und Schritte der Vorbehandlung ein.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung überwindet die Probleme und Nachteile, die mit den derzeit gängigen Strategien und Vorgehensweisen verbunden sind, und stellt neue Verfahrensweisen für eine Tiefkühlkonservierung und für die Wiedergewinnung lebensfähiger tiefkühlkonservierter Pflanzenzellen bereit.
In einem Aspekt schafft die Erfindung ein Verfahren zum Tiefkühlkonservieren einer Pflanzenzelle, das eine Kombination von Berhandlungsschritten wie folgt umfaßt:
(a) Behandeln der Pflanzenzelle durch Lyophilisieren der Pflanzenzelle, durch Hitzeschock oder durch Vorbehandeln der Pflanzenzelle mit einem Mittel zum Schutz gegen Tiefkühlung und einem Stabilisator, der ein Oxidationsinhibitor ist, einem Fänger für Sauerstoff-Radikale, einem divalenten Kation, einem Ethylen-Inhibitor (einem Inhibitor der Wirkung von Ethylen oder einem Inhibitor der Ethylen-Biosynthese), einer Verbindung, die sich in die Lipid- Doppelschicht der Zelle einlagert (beispielsweise einem Sterol, einem Phospholipid, einem Glycolipid oder einem Glycoprotein) oder einer Kombination daraus;
(b) Vitrifizieren der Pflanzenzelle in einer vitrifizierenden Lösung; und
(c) Einfrieren der vitrifizierten Pflanzenzelle bei einer Tiefkühlkonservierungstemperatur, wie beispielsweise im Bereich von etwa -70ºC bis etwa -200ºC oder weniger.
In einer Klasse von Ausführungsformen umfaßt daher die Behandlung der Pflanzenzelle eine Vorbehandlung mit einem Mittel zum Schutz gegen Tiefkühlung (cryoprotective agent) und einem Stabilisator. Stabilisatoren wie beispielsweise zweiwertige Kationen schützen zum Teil Zellmembranen vor einem Reißen. Bevorzugte Mittel zum Schutz gegen die Tiefkühlung sind gewählt aus DMSO, Propylenglycol, Glycerin, Polyethylenglycol, Ethylenglycol, Butandiol, Formamid, Propandiol, Sorbitol, Mannitol und Mischungen daraus. Bevorzugte Stabilisatoren sind gewählt aus reduziertem Glutathion, Tetramethylharnstoff, Tetramethylthioharnstoff, Dimethylformamid, Mercaptopropionylglycin, Mercaptoethylamin, Selenomethionin, Thioharnstoff, Dimercaptopropanol, Ascorbinsäure, Cystein, Natriumdiethyldithiocarbamat, Natriumthiosulfat, Silberthiosulfat, Propylgallat, Spermin, Spermidin und Kombinationen und Derivaten davon. Der Stabilisator wird in passender Weise verwendet als wäßrige Lösung mit einer Konzentration im Bereich von etwa 1 mm bis etwa 10 mM.
Bei einigen Verfahrensweisen dieser einen Klasse von Ausführungsformen wird die Behandlung durchgeführt bei einer verringerten Temperatur über einen ersten Zeitabschnitt, und das Mittel zum Schutz gegen Tiefkühlung umfaßt ein vitrifizierendes Mittel, wobei der Schritt des Vitrifizierens ein Inkubieren der Pflanzenzellen in der vitrifizierenden Lösung, die eine erhöhte Konzentration des vitrifizierenden Mittels enthält, für einen zweiten Zeitraum umfaßt. Der erste Zeitraum liegt passenderweise in einem Bereich von etwa 1 h bis etwa 7 d, und der zweite Zeitraum liegt passenderweise in einem Bereich von etwa 30 min bis etwa 2 h.
Die Erfindung schließt Verfahrensweisen ein, in denen die Vorbehandlung mit einem gegen das Tiefkühlen schützenden Mittel und mit einem zweiwertigen (divalenten) Kation den Zusatz des zweiwertigen Kations zu der vitrifizierenden Lösung umfaßt. Die Verfahrensweise schließt auch Verfahrensschritte ein, in denen die vitrifizierende Lösung eine Substanz umfaßt, die gewählt ist aus DMSO, Propylenglycol, Glycerin, Polyethylenglycol, Ethylenglycol, Butandiol, Formamid, Propandiol, Sorbitol, Mannitol und Mischungen davon.
Die Erfindung schließt Verfahrensweisen ein, die ein Akklimatisieren der stabilisierten Pflanzenzelle bei einer verringerten Temperatur umfassen, wobei die verringerte Temperatur gegebenenfalls im Bereich von etwa 1ºC bis etwa 15ºC liegt. Bei derartigen Verfahrensweisen kann die Vorbehandlung das Kultivieren der Pflanzenzelle in einem Medium einschließen, das ein Beladungsmittel und die Stabilisatoren umfaßt, und zwar für eine Zeit zwischen etwa 1 h bis etwa 7 d etwa bei Raumtemperatur. In die Erfindung eingeschlossen sind auch Verfahrensweisen, die weiter das Beladen der Pflanzenzelle mit einem Beladungsmittel umfassen, wobei das Beladen und Vitrifizieren im wesentlichen gleichzeitig durchgeführt werden kann. In einer Ausführungsform werden akklimatisierte Zellen mit einem Beladungsmittel beladen, das das gleiche sein kann wie das vitrifizierende Mittel, und die beladenen Zellen werden mit einer Vitrifikationslösung vitrifiziert.
Ein zweiter Aspekt der Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Rückgewinnen tiefkühlkonservierter Pflanzenzellen, das eine Kombination aus Behandlungsschritten wie folgt umfaßt:
(a) Auftauen der tiefkühlkonservierten Pflanzenzellen auf eine Temperatur oberhalb der Gefrier-Situation;
(b) Inkubieren der aufgetauten Pflanzenzellen in einem Wachstumsmedium, das enthält: einen Stabilisator oder ein Mittel zum Schutz gegen Tiefkühlung und einen Stabilisator, wobei der Stabilisator ein Oxidationsinhibitor, ein Fänger für Sauerstoff-Radikale, ein Ethylen-Inhibitor, eine Verbindung, die sich in die Lipid-Doppelschicht der Zelle interkaliert bzw. einlagert (beispielsweise ein Sterol, ein Phospholipid, ein Glycolipid oder ein Glycoprotein), ein zweiwertiges Kation oder eine Mischung daraus ist; und
(c) Gewinnen lebensfähiger Pflanzenzellen.
Das Mittel zum Schutz gegen Tiefkühlung ist in passender Weise ein Zucker und/oder eine Aminosäure und ist vorzugsweise gewählt aus Sorbitol, Mannitol, Sucrose (Rohrzucker), Trehalose, Prolin und Mischungen daraus.
Bevorzugte Gewinnungsverfahren schließen weiter vor Schritt (c) den Schritt des Entfernens des Mittels zum Schutz gegen Tiefkühlung wie beispielsweise durch Verdünnen der Mischung oder Pelletisieren ein. Gegebenenfalls umfaßt der Entfernungsschritt mehrere Schritte des Waschens von osmotisch eingestellten Zellen mit dem Wachstumsmedium, das zurückgehende Konzentrationen des Mittels zum Schutz gegen Tiefkühlung enthält und/oder worin das Mittel zum Schutz gegen Tiefkühlung nach einer gewissen Zeitdauer entfernt wird und eine Inkubation von Pflanzenzellen in einem Wachstumsmedium und in Suspension fortgesetzt wird. Eine weitere Klasse von Verfahrensweisen zur Gewinnung sind diejenigen, in denen der Ethyleninhibitor ist:
(i) ein Ethylen-Biosynthese-Inhibitor, der gegebenenfalls gewählt ist aus Spermidin, Spermin, Catechol, n-Propylgallat, Hydrochinon, Ferulasäure, Alar, Phenylethylamin, Salicylalkohol, Indomethacin und Kombinationen daraus; oder
(ii) ein Inhibitor der Ethylen-Wirkung, wobei der Inhibitor der Ethylen-Wirkung gegebenenfalls ein Silbersalz ist und das Silbersalz gegebenenfalls gewählt ist aus Silberthiosulfat, Silbernitrat, Silberchlorid, Silberacetat, Silberphosphat, Silbersulfat, Silbernitrit und Kombinationen daraus.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist ein Verfahren zum Gewinnen tiefkühlkonservierter Pflanzenzellen in Suspension, das eine Kombination aus Behandlungsschritten wie folgt umfaßt:
(a) Auftauen der tiefkühlkonservierten Pflanzenzellen auf eine Temperatur oberhalb des Gefrierzustands;
(b) Inkubieren der aufgetauten Pflanzenzellen in Suspension; und
(c) Gewinnen lebensfähiger Pflanzenzellen in Suspension.
Die Erfindung schließt ein ein Verfahren zur Herstellung lebensfähiger Pflanzenzellen aus den nach einer Verfahrensweise gemäß der Erfindung tiefkühlkonservierten oder zurückgewonnenen Zellen, worin mehr als etwa 50% der zurückgewonnenen Pflanzenzellen lebensfähig sind und gegebenenfalls, worin mehr als etwa 70% der zurückgewonnenen Pflanzenzellen lebensfähig sind oder mehr als etwa 80% der zurückgewonnenen Pflanzenzellen lebensfähig sind. Die Zellen sind durch das Tiefkühlkonservierungsverfahren nicht signifikant hinsichtlich des Genotyps oder des Phänotyps verändert und weisen einen hohen Anteil an überlebensfähigen Zellen auf.

Beschreibung der Figuren

Es zeigen:
Fig. 1 (A, B und C) schematische Auflistungen verschiedener Vorgehensweisen für eine Tiefkühlkonservierung und Rückgewinnung;
Fig. 2 Biosynthese-Wege der Ethylenproduktion und Punkte einer Inhibierung;
Fig. 3 eine Verfahrensweise für eine Tiefkühlkonservierung von Taxus-Zellen;
Fig. 4 eine Erhöhung der Biomasse in einer Taxus chinensis-Suspensionskultur- Linie K-1;
Fig. 5 Chromatogramme von (A) 6 Monate tiefkühlkonservierten Zellen, im Vergleich mit (B) nicht-tiefkühlkonservierten Zellen;
Fig. 6 Chromatogramme von (A) 6 Monate tiefkühlkonservierten Zellen, im Vergleich mit (B) nicht-tiefkühlkonservierten Zellen;
Fig. 7 eine Southern-Blot-Analyse der genetischen Stabilität von tiefkühlkonservierten Zellen;
Fig. 8 eine PCR-Analyse der genetischen Stabilität tiefkühlkonservierter Zellen.

Beschreibung der Erfindung

Wie in der vorliegenden Beschreibung ausgeführt und breit beschrieben, ist die vorliegende Erfindung gerichtet auf Verfahrensweisen für die Tiefkühlkonservierung von Pflanzenzellen, Verfahrensweisen für die Rückgewinnung tiefkühlkonservierter Pflanzenzellen und ein Verfahren zur Herstellung lebensfähiger Pflanzenzellen, die erfolgreich nach einer Tiefkühlkonservierung zurückgewonnen wurden.
Pflanzenzellen sind zunehmend nützlich für die Herstellung von rekombinanten Protein- Produkten oder einzigartigen Produkten und chemischen Mitteln, die für Pflanzen oder für die enzymatischen Stoffwechsel-Wege von Pflanzenzellen spezifisch sind. Pflanzenzellen, wie beispielsweise Callus-Kulturen, können in kontinuierlichem Zustand durch wiederholtes Unter-Kultivieren gehalten werden. Doch führt die Bildung von Unterkulturen häufig zu einer erhöhten Ploidität, einem erhöhten Risiko einer Kontamination, einer Akkumulation spontaner Mutationen, einem Rückgang und Verlust von morphogenetischem Potential, einer Reduktion der Biosynthese-Kapazität für die Produkt-Bildung, einer Reversion selektierter Linien zu Wild-Typen, einem Altern und einer Transformation unbegrenzter Zellinien und einer unbeabsichtigten Selektion ungewünschter Phänotype. Jeder dieser Faktoren kann sehr stark die Ausbeutung von Zellkultur-Systemen für eine kommerzielle Herstellung wertvoller Verbindungen verhindern.
Zwar wurden kultivierte Zellen von Tiergewebe routinemäßig viele Jahre lang tiefgekühlt; ähnliche Tiefkühlkonservierungs-Techniken für Pflanzenzellen haben sich jedoch als viel schwieriger erwiesen. Pflanzenzellen und - insbesondere - Pflanzenzellen in Kultur zeigen einen Bereich von Heterogenität in bezug auf Wachstumsrate, Verdopplungszeit, mitotischem Index, Zellsynchronie, Verhältnis von Kern zu Cytoplasma und Ausmaß der Vakuolenbildung. In irgendeiner gegebenen Kultur vorhandene Zellen zeigen auch eine große Bandbreite physiologischer und morphologischer Variationen. Weiter erfordern Pflanzenzell-Suspensionen und damit verbundene Zellkulturen unterschiedliche Vorgehensweisen für eine Tiefkühlkonservierung. Außerdem kann dann, wenn dies nicht richtig durchgeführt wird, eine Tiefkühlkonservierung eine große Zahl von Mutationen induzieren, was mit dem Verfahren versucht werden soll, zu verhindern.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß durch Anwendung einer Reihe von Schritten und speziellen Mitteln Pflanzenzellen der meisten Genus und Spezies tiefkühlkonserviert und erfolgreich zurückgewonnen werden können. Diese Verfahrensweisen beruhren auf den Beobachtungen, daß eine erfolgreiche Tiefkühlkonservierung von Pflanzenzellen das Entfernen erheblicher Mengen an Wasser aus den Zellen einschließt und daß unter passenden Bedingungen - signifikante Mengen an Wasser entfernt werden können, ohne ernsthaft die Lebensfähigkeit der Zellen zu beeinträchtigen. Die entwickelten Vorgehensweisen für eine Tiefkühlkonservierung sind in hohem Maße erfolgreich beim Lagern, Erhalten und Rückgewinnen lebensfähiger Zellen in einer routinemäßigen und reproduzierbaren Weise. Diese Vorgehensweisen können beim Betrieb von Routineeinheiten zur Schaffung von Keim-Plasma-Lagerungs- und Zellbank-Management- Systemen etabliert werden. Außerdem können Zellen vollständig in flüssiger Suspension zurückgewonnen werden, was eine Verfahrensweise ist, von der man früher annahm, daß sie bei Pflanzen-Kulturen nicht möglich ist. Produkte, die von tiefkühlkonservierten Zellen gewonnen werden, unterscheiden sich nicht signifikant von denen der ursprünglichen oder Eltern-Zelle, da es kaum - wenn überhaupt - eine Verschiebung hinsichtlich Phänotyp oder Genotyp gibt, insbesondere im Hinblick auf Wachstum und Lebensfähigkeit, Produkt-Bildung und Zellen-Biomasse-Proliferation. Varianzen werden von beobachtbaren oder quantifizierbaren Veränderungen der Phänotyps oder der Morphologie bestimmt. Diese Veränderungen werden signifikant, wenn sie den Phänotyp- Parameter um mehr als einen geringen Grad senken.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist gerichtet auf Verfahrensweisen für die Tiefkühlkonservierung von Pflanzenzellen. Diese Verfahrensweisen sind überraschenderweise reproduzierbar und anwendbar auf viele Arten von Pflanzenzellen. Als solche sind sie merklich nützlich für die Herstellung von Materialien, die verwaltungsbedingte oder tätigkeitsbedingte Standards der Reproduzierbarkeit erfordern.
Das grundlegende Verfahren schließt das Entfernen erheblicher Mengen an Wasser aus der Zelle durch eine Kombination der Schritte (a) Behandlung der Pflanzenzelle durch Lyophilisierung, Hitzeschock oder durch Vorbehandeln mit einem Mittel zum Schutz gegen Tiefkühlung und einem speziellen Stabilisator; (b) Vitrifikation (die in mehreren Schritten oder auf einmal erfolgen kann); und (c) Einfrieren ein. Der Stabilisator ist eine Verbindung oder mehrere Verbindungen aus der Gruppe Oxidationsinhibitor, Fänger für Sauerstoff-Radikale, divalentes Kation, Ethyleninhibitor und Verbindung, die sich in die Lipid-Doppelschicht der Zelle einlagert bzw. interkaliert. Gegebenenfalls schließt das Verfahren Schritte des Kalt-Akklimatisierens, schrittweisen oder in einer einzigen Dosis erfolgenden Beladens und des Auftauens ein. Eine große Vielzahl von Kombinationen dieser Schritte ist möglich, und jeder Schritt ist nicht notwendigerweise für die erfolgreiche Tiefkühlkonservierung und Rückgewinnung lebensfähiger Pflanzenzellen erforderlich, für die die charakteristischen Eigenschaften und Wachstumseigenschaften beibehalten werden, die sie gewünscht machten. Einige der möglichen Kombinationen verschiedener Ausführungsformen der Schritte sind schematisch in den Fig. 1A, 1B und 1C abgebildet, obwohl es sich versteht, daß diese Variationen nur beispielhaft sind. Jeder Typ Pflanze (z. B. Klasse, Ordnung, Familie, Genus, Spezies, Subspezies oder Varietät) hat höchstwahrscheinlich seinen eigenen Satz bevorzugter Bedingungen, mit denen eine Maximierung der Rückgewinnung aus der Tiefkühlkonservierung möglich ist. Von den ausgewählten Variationen, die in der vorliegenden Beschreibung offenbart werden, können leicht optimale Parameter für eine Tiefkühlkonservierung bestimmt werden.
Nahezu jede beliebige Pflanzenzelle kann unter Verwendung dieser Verfahrensschritte erfolgreich tiefkühlkonserviert und zurückgewonnen werden, einschließlich der Gymnospermen (Nacktsamer) und der Angiospermen (Bedecktsamer). Spezielle Typen von Nacksamern, die tiefkühlkonserviert werden können, schließen Spezies der folgenden Arten ein: Abies (Tannen), Cypressus (Zypressen), Ginkgo (Frauenhaar-Baum), Juniperus (Wachholder), Picea (Fichte), Pinus (Kiefer), Pseudotsuga (Douglasie), Sequoia, Taxus (Eibe) Tsuga (Schierlingstanne) oder Zamia (Zikade). Einige der noch nützlicheren Spezies von Taxus schließen ein: T. baccata, T. brevifolia, T. canadensis, T. chinensis, T. cuspidata, T. floridana, T. globosa, T. Media, T. nucifera und T. wallichiana. Angiospermen (Bedecksamer), die präserviert werden können, schließen Monocotyledonen-Pflanzenzellen und Dicotyledonen-Pflanzenzellen ein. Monocotyledonen- Pflanzenzellen schließen eine Vielzahl von Spezies der folgenden Arten ein: Avena (Hafer), Cocos (Kokosnuß), Dioscorea (Yams-Wurzel), Hordeum (Gerste), Musa (Banane), Oryza (Reis), Saccharum (Zuckerrohr), Sorghum (Sorghum), Triticum (Weizen) und Zea (Mais). Dicotyledonen-Pflanzen schließen ein Spezies der Arten Achyrocline, Atropa, Brassica (Senf), Berberis, Sophora, Legume, Lupinus, Capsicum, Catharanthus, Conospermum, Datura, Daucus (Karotte), Digitalis, Echinacea, Eschscholtzia, Glycine (Sojabohne), Gossypium (Baumwolle), Hyoscyamus, Lycopersicum (Tomate), Malus (Apfel), Medicago (Alfalfa), Nicotiana, Panax, Pisum (Erbse), Rauvolfia, Ruta, Solanum (Kartoffel) und Trichosanthes.
Pflanzenzellen können frisch geerntete Proben vom Acker sein, wie beispielsweise frischgewachsene Nadeln, Blätter, Wurzeln, Borke, Stämme, Rhizomen, Callus-Zellen, Protoplasten, Zellsuspensionen, Organe oder Organsysteme, Meristeme wie beispielsweise Spitzen-Meristeme, Samen oder Embryos. Allgemein zeigen Zellen mit niedriger Zahl von Passagen und Primärkulturen eine größere End-Lebensfähigkeit in Kultur oder bei Rückgewinnung bei der Tiefkühlkonservierung. Alternativ dazu können Probenzellen erhalten werden aus etablierten in-vitro-Kulturen. Kulturen können bereits vor langer Zeit aufgesetzt oder erst vor kurzer Zeit an in-vitro-Bedingungen angepaßt worden sein, beispielsweise Bedingungen spezieller Temperaturen, besonders leichter Licht- Intensitäten oder spezieller Wachstums- oder Erhaltungsmedien. Solche Zellen können als Suspensionszellen oder durch Wachstum auf einem halbfesten Nährmedium gehalten werden.
Suspensionskulturen können abgeleitet sein von Callus-Kulturen von Taxus-Spezies oder aus aufgetauten, tiefkühlkonservierten Zellen von Taxus-Spezies. Primär-Zellinien mit niedriger Passagen-Zahl sind sehr wertvoll für die Konservierung, da diese Kulturen einzigartige charakteristische Eigenschaften zeigen können, die bei längerer Zeit in Kultur verlorengehen. Viele dieser Zellinien exprimieren Diterpenoide wie beispielsweise das Diterpen-Alkaloid Taxan, das hinsichtlich der Ester-Seitenkette modifizierte Taxan, Taxol (Molekulargewicht 853) und eine Vielzahl anderer Modifikationen von Taxan (Baccatin oder 10-Deacetylbaccatin).
Taxus-Zellen für eine Kultur können erhalten werden von jedem beliebigen Pflanzenmaterial. Sammlungen können im Bereich von Nordamerika wie auch von anderen Kontinenten erfolgen. Gewebe aus irgendeinem Teil der Pflanze einschließlich Borke, Cambium, Nadeln, Stengel, Samen, Zapfen und Wurzeln können gewählt und für eine Zellkultur angepaßt werden. Naden und meristematische Bereiche von Pflanzen, insbesondere ein bis drei Monate alte, frisch gewachsene Nadeln, werden zum Initiieren von Zellkulturen bevorzugt. Beispielsweise wird ausgewähltes Pflanzengewebe oberflächensterilisiert durch Eintauchen in vier Liter einer 10%-igen Bleiche-Lösung mit 20 Minuten vorher zugesetzten 10 Tropfen von Tween®. Von Pflanzen stammende Gewebeteile werden in Stücke sehr kleiner Größe geschnitten und kultiviert.
Taxus-Kulturen zeigen typischerweise eine große Variabilität hinsichtlich Wachstumsmorphologie, Produktivität, Produktprofilen und anderen charakteristischen Eigenschaften. Da individuelle Zellinien hinsichtlich ihrer Präferenzen für Bestandteile des Wachstumsmediums unterschiedlich sind, können viele verschiedene Wachstumsmedien für eine Induktion und Proliferation der Zellkultur verwendet werden. Methoden des Sterilisierens, Initiierens des Callus-Wachstums und des Suspensionswachstums sowie geeignete Nährmedien sind Fachleuten in diesem technischen Bereich wohlbekannt.
Taxus-Suspensionskulturen sind schneller Wachstumsraten und hoher Zelldichten fähig. Anfangs-Kulturen verschiedener Taxus-Spezies werden durch Übertragung in geeignete Medien unterkultiviert, die beispielsweise Makro- und Mikro-Nährstoffe, organische Salze und Wachstumshormone enthalten. Flüssig-Kulturen werden Luft ausgesetzt und vorzugsweise bewegt, um das Medium zu belüften, oder Luft kann in das Medium in Blasenform eingeleitet werden. Kulturen werden bei einer Temperatur von etwa 20ºC und bei einem pH-Wert im Bereich von etwa 3 bis etwa 7 und vorzugsweise in einem Bereich zwischen etwa 4 und etwa 6 gehalten. Solche Kulturen können geerntet werden durch Entfernen des Wachstumsmediums, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation. Zellen mit der höchsten Lebensfähigkeit sind diejenigen in der frühen Lag- Phase (Verzögerungsphase) oder der frühen Wachstumsphase der Zellteilung oder solche Zellen, die kürzlich den Schritt einer Zell-Teilung oder Mitose durchschritten haben. Allgemein sind 4 bis 10 Tage alte Zell-Suspensionen von Taxus-Spezies in einem Wachstumsmedium, vorzugsweise 5 bis 8 Tage alte Zeilsuspensionen in einem Wachstumsmedium und noch mehr bevorzugt 6 bis 7 Tage alte Zellsuspensionen einer Taxus- Spezies in einem Wachstumsmedium zur Verwendung geeignet.
Jeder der grundlegenden Schritte der Tiefkühlkonservierung wird nachfolgend im einzelnen beschrieben.

Vorbehandlung

Einem Schritt der Tiefkühlkonservierung zu unterwerfende Pflanzenzellen können mit Mitteln vorbehandelt werden, die die Lebensfähigkeit der Zelle erhöhen, indem sie schädliche Substanzen, die von den Zellen während des Wachstums oder während des Zell-Tods abgeschieden werden, aus dem Kulturmedium entfernen. Diese Mittel, die in der vorliegenden Beschreibung und in den Patentansprüchen als "Stabilisatoren" bezeichnet werden, schließen Substanzen ein, die natürlich vorkommen oder künstlich hergestellt werden, und sie können direkt in das Kulturmedium eingeleitet werden. Stabilisatoren schließen Oxidationsinhibitoren oder Radikalfänger-Chemikalien ein, die sehr schädliche Wirkungen neutralisieren, die der Gegenwart von aktiven Sauerstoff- Spezies und anderen freien Radikalen zugeschrieben werden. Solche Substanzen sind in der Lage, Zellmembranen zu schädigen, und zwar sowohl Innenmembranen als auch Außenmembranen, so daß eine Tiefkühlkonservierung und Rückgewinnung ernsthaft gefährdet werden. Wenn diese Substanzen nicht entfernt oder in anderer Weise unwirksam gemacht werden, sind ihre Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit über die Zeit kumulativ, was in starkem Maße die praktische Lebensdauer beschränkt. Darüber hinaus werden dann, wenn Zellen sterben oder strapaziert werden, weitere schädliche Substanzen freigesetzt, was die Gefahr einer Schädigung oder des Tods benachbarter Zellen erhöht.
Nützliche Stabilisatoren schließen solche Chemikalien und chemischen Verbindungen ein, die hochgradig reaktive und schädigende Moleküle wie beispielsweise Sauerstoff- Radikale sequestrieren. Spezielle Beispiele dieser Radikalfänger und Oxidationsinhibitoren schließen ein: reduziertes Glutathion, 1,1,3,3-Tetramethylharnstoff, 1,1,3,3- Tetramethyl-2-thioharnstoff, Natriumthiosulfat, Silberthiosulfat, Betain, N,N- Dimethylformamid, N-(2-Mercaptopropionyl)glycin, β-Mercaptoethylamin, Selenomethionin, Thioharnstoff, Propylgallat, Dimercaptopropanol, Ascorbinsäure, Cystein, Natriumdiethyldithiocarbamat, Spermin, Spermidin, Ferulasäure, Sesamol, Resorcinol, MDL-71,897, Cadaverin, Putrescin, 1,3- und 1,2-Diaminopropan, Deoxyglucose, Urinsäure, Salicylsäure, 3- und 4-Amino-1,2,4-triazol, Benzoesäure, Hydroxylamin und Kombinationen und Derivate solcher Mittel.
Eine weitere Gruppe von Stabilisatoren schließt Mittel ein, die eine Ethylen- Biosynthese und/oder eine Wirkung von Ethylen behindern oder im wesentlichen verhindern. Bestimmte dieser Verbindungen haben auch Radikalfänger-Eigenschaften. Die Wirkungen von Ethylen-Inhibitoren sind erheblich, wenn die Expression oder Wirkung von Ethylen ausreichend beeinflußt wird, so daß die Zell-Rückgewinnung in dem Tiefkühlkonservierungs-Verfahren verbessert wird. Es ist wohlbekannt, daß viele Pflanzenzellen Ethylen ausstoßen, wenn sie strapaziert werden. Ethylen schädigt Zellen und führt zum Zelltod. Das Verhindern entweder der Bildung von Ethylen oder der Wirkung von Ethylen erhöht weiter die Lebensfähigkeit der Zelle und verbessert die Zell- Rückgewinnung aus dem Tiefkühlkonservierungsprozeß.
Wie in Fig. 2 gezeigt, gibt es eine große Zahl von Wegen in der Biosynthese von Ethylen und eine gleichermaßen große Zahl von Inhibitoren. Beispielsweise können Biosynthese-Wege inhibiert werden bei der Umwandlung von S-Adenosylmethionin (SAM) (ACC-Synthase + SAM → ACC), bei Aminocyclopropancarbonsäure (ACC) (ACC + ACC-Oxidase → Ethylen) und bei Ethylen (Ethylen + Ethylenoxidase → CO&sub2;). Eine Zahl von Biosynthese-Inhibitoren, die in diesen Verfahren gemäß der Erfindung verwendet werden können, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1 Inhibitoren der Ethylen-Biosynthese
Es gibt auch eine große Zahl von Inhibitoren der Wirkung von Ethylen. Einige dieser Verbindungen sind in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Inhibitoren der Wirkung von Ethylen

Silbersalze Benzylisothiocyanat
8-Hydroxychinolinsulfat 8-Hydroxychinolincitrat
2,5-Norbornadien N-Ethoxycarbonyl-2-ethoxy-1,2- dihydrochinolin
Trans-Cycloocten 7-Brom-5-chlor-8-hydroxychinolin
cis-Propenylphosphonsäure Diazocyclopentadien
Methylcyclopropan 2-Methylcyclopropancarbonsäure
Methylcyclopropancarboxylat Cyclooctadien
Cyclooctodin Chlormethylcyclopropan
Es ist seit 1976 bekannt, daß Silber-Ionen als hochwirksame Anti-Ethylen-Mittel in verschiedenen Pflanzen und zur Verbesserung der Langlebigkeit von Pflanzengeweben und Zellkulturen wirken. Beispielsweise kann die Langlebigkeit von geschnittenen Nelken durch Vorbehandlung mit Silber-Salzen erhöht werden. Aufgrund der relativen Immobilität des Silber-Ions wird eine Basal-Behandlung des Stamms als weniger wirksam angesehen, als eine direkte Sprüh-Behandlung der Blüten. Die geringe Mobilität eines Silber-Ions - so wurde gefunden - erhöht sich bei Verbergen des Metalls in einem anionischen Komplex wie beispielsweise Silberthiosulfat. Weder beeinflußt Thiosulfat allein die Ethylen-Biosynthese, noch inhibiert es die Wirkung von Ethylen.
Eine durch Silber-Ionen vermittelte Ethylen-Inhibierung könnte auf der Basis erklärt werden, daß Silber anstelle von Kupfer an derselben Rezeptor-Stelle gesetzt wird. Es wird auch vorgeschlagen, daß Kupfer das Metall ist, das in enzymatische Reaktionen involviert ist, die mit der Biosynthese oder der Wirkung von Ethylen in Verbindung stehen. Die Ähnlichkeit der Größe von Silber und Kupfer, derselbe Oxidationszustand und das Vermögen beider Metalle zur Bildung von Komplexen mit Ethylen verleihen dieser Vorstellung Glaubwürdigkeit.
Silber-Salze einschließlich Silberthiosulfat inhibieren die Wirkung von Ethylen in Pflanzen und Pflanzenzell-Kulturen, obwohl Silber eine bemerkenswerte stimulierende Wirkung auf dessen Synthese hat. Die stimulierende Wirkung von Silber-Ionen (aktive Komponente von Silberthiosulfat) sowohl auf ACC (Aminocyclopropancarbonsäure) als auch auf die Ethylen-Biosynthese legt eine verstärkte Umwandlung von ACC in Ethylen aufgrund der erhöhten Aktivität von ACC-Oxidase nahe. Einige der Silber- Salze, die eine Wirkung von Ethylen inhibieren, sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3 Ausgewählte Silber-Salze
Stabilisatoren werden vorzugsweise mit Pflanzenzellen vor dem Einfrieren inkubiert, obwohl ihre Gegenwart während des Einfrier-Prozesses, der Rückgewinnung, dem Auftauen und dem erneuten Wachstum auch wünschenswert sein kann. Beispielsweise kann es mehr wünschenswert sein, Inhibitoren der Ethylen-Biosynthese und Inhibitoren der Ethylen-Wirkung in dem Kulturmedium während des Auftauens und während des erneuten Wachstums zu haben. Die Schritte des Inkubierens können für eine Zeit von Stunden oder Tagen durchgeführt werden, da die Mittel selbst allgemein nicht schädlich für die Zellen sind und sogar deren Lebensfähigkeit erhöhen können. Einige der empfindlicheren Pflanzenzell-Linien können längere Behandlungszeiten erfordern, während andere kürzere Behandlungszeiten bevorzugen. Die exakte Zeitdauer des Inkubierens kann leicht empirisch bestimmt werden. Vorzugsweise werden Pflanzenzellen in Wachstumsmedium mit dem Stabilisator oder einer Kombination aus Stabilisatoren für eine Zeit von etwa 1 bis etwa 10 Tagen kultiviert, noch mehr bevorzugt für eine Zeit von etwa 1 bis etwa 7 Tagen und noch mehr bevorzugt für eine Zeit von etwa 3 Tagen. Diese Zeitdauer ist typischerweise ausreichend zum Eliminieren schädlicher Substanzen in dem Medium oder wenigstens zu deren Reduzierung auf Konzentrationen, die nicht mehr schädlich für die Zellen sind.
Eine Vorbehandlung kann auch einfach den Zusatz von Membran-Stabilisatoren wie beispielsweise von Verbindungen, die sich in die Lipid-Doppelschicht einlagern (z. B. Sterolen, Phospholipiden, Glycolipiden, Glycoproteinen), oder von divalenten Kationen in die Zellkultur, die Beladungslösung und/oder die Vitrifikationslösung einschließen. Divalente Kationen stabilisieren Wärmeschock- und Membran-Proteine und verringern auch die elektrostatische Abstoßung zwischen Zellmembranen und anderen Membranen. Magnesium, Mangan und Calcium sind bevorzugte Kationen der Wahl als preiswerte und leicht verfügbare divalente Kationen in Form von beispielsweise CaCl&sub2;, MnCl&sub2; und MgCl&sub2;. Natrium ist weniger bevorzugt aufgrund seiner Toxizität bei Konzentrationen oberhalb von Spuren-Konzentrationen. Bevorzugte Konzentrationen liegen im Bereich von etwa 1 mM bis etwa 30 mM und noch mehr bevorzugt im Bereich von etwa 5 mM bis etwa 20 mM und noch weiter bevorzugt bei etwa 10 mM oder 15 mM. Außerdem reduziert die Gegenwart divalenter Kationen in dem Medium die Einfrier- Temperaturen und ermöglicht den schnelleren Durchgang von Zellen durch den Gefrierpunkt. Die Temperatur sowohl einer intercellularen als auch einer intracellularen Eiskristall-Bildung wird sowohl beim Frieren als auch während des Auftauens erniedrigt. Die Gegenwart dieser Mittel während des Auftauens und in der Kultur nach dem Auftauen kann auch wichtig sein.
Die Schritte des Inkubierens können in flüssigen oder halbflüssigen Medien wie beispielsweise Wachstumsmedium, Medium, das einen Metabolismus und die Zell- Proliferation fördert, oder in Erhaltungsmedium, d. h. einem Medium, das einen ausgewogenen Zustand der Konzentration von Salzen und Nährstoffen bereitstellt, ohne notwendigerweise das Zellwachstum zu fördern, durchgeführt werden. Da die Zellen für eine Tiefkühlkonservierung vorbereitet werden, ist es manchmal wünschenswert, in einem Aufrechterhaltungsmedium zu inkubieren (d. h. einem unter dem optimalen Punkt oder für ein langsames Wachstum geeigneten Kulturmedium, z. B. einem Medium mit einem Viertel der Salz-Konzentration des normalen Wachstumsmediums), um Stoffwechsel-Prozesse der Zellen zu verlangsamen.
Eine Vorbehandlung kann durchgeführt werden durch Vorkultivieren von Zellen bei Raumtemperatur oder bei Temperaturen, bei denen Pflanzenzellen typischerweise kultiviert werden. Vorzugsweise wird ein Vorkultivieren durchgeführt, etwa bei Raumtemperatur (20ºC), und zwar aus Gründen der Einfachheit der Handhabung und da die meisten Pflanzenzellen bei Raumtemperatur recht stabil sind. Stabilisatoren können dem Medium direkt zugesetzt und - soweit erforderlich - während des Vorbehandlungsprozesses nachgefüllt werden. Stabilisator-Konzentrationen sind typisch für spezielle Stabilisatoren, werden jedoch allgemein angewandt im Bereich zwischen etwa 1 uM bis etwa 1 mM oder vorzugsweise in einem Bereich zwischen etwa 10 uM bis etwa 100 uM, obwohl größere oder geringere Mengen eines oder mehrerer stabilisierender Mittel nicht ungewöhnlich sind.
Schritte der Vorbehandlung können auch ein Inkubieren von Zellen in Gegenwart eines oder mehrerer osmotischer Mittel einschließen. Beispiele nützlicher osmotischer Mittel schließen Zucker, wie beispielsweise Saccharide und Saccharid-Derivate, Aminosäuren oder Iminosäuren wie beispielsweise Prolin und Prolin-Derivate oder Kombinationen dieser Mittel ein. Einige der nützlicheren Zucker und Zucker-Derivate sind Fructose, Glucose, Maltose, Mannitol, Sorbitol, Sucrose und Trehalose. Osmotische Mittel werden in einer Konzentration verwendet, die Zellen für ein anschließendes Beladen, Lyophilisieren und/oder eine Vitrifikation vorbereitet. Konzentrationen können stark zwischen den verschiedenen Mitteln schwanken, liegen jedoch allgemein im Bereich zwischen etwa 50 mM und etwa 2 M. Diese Konzentrationen können erreicht werden durch Zusatz kleiner Mengen dieser Mittel auf kontinuierlicher Basis oder in kleinen Schritten über die Zeit (schrittweise), bis eine gewünschte Konzentration erreicht ist. Vorzugsweise ist die Konzentration osmotischer Mittel in den Medien im Bereich zwischen etwa 0,1 M und etwa 0,8 M und noch mehr bevorzugt im Bereich zwischen etwa 0,2 M und etwa 0,6 M. Alternativ dazu wird das osmotische Mittel in Form einer wäßrigen Lösung mit einer Konzentration zwischen etwa 1% und etwa 10% verwendet, bezogen auf das Gewicht.

Kaltakklimatisierung

Während der Vorbehandlung oder eine gewisse Zeit danach können die Zellen, die tiefkühlkonserviert werden sollen, an eine Temperatur akklimatisiert werden, die im Verhältnis der Kultivierungstemperaturen erniedrigt ist, jedoch über der Gefriertemperatur liegt. Dies bereitet die Zellen für den Tiefkühlkonservierungsprozeß vor, indem der celluläre Stoffwechsel signifikant verlangsamt wird und der Schock schneller Temperaturübergänge durch einige der kritischeren Temperaturänderungen verringert wird. Kritische Temperaturbereiche sind diejenigen Bereiche, bei denen das höchste Risiko einer Zell-Schädigung besteht, beispielsweise um die kritischen Temperaturen der Eiskristall-Bildung. Wie Fachleuten mit üblichem Sachverstand in diesem technischen Bereich bekannt ist, schwanken diese Temperaturen etwas in Abhängigkeit von der Zusammensetzung der Lösung. Bei Wasser, der Haupt-Komponente der meisten Zellkultur-Medien tritt eine Eiskristall-Bildung und Rückbildung bei etwa 0ºC bis etwa -50ºC auf.
Eine Akklimatisierung führt zur Akkumulierung endogener gelöster Stoffe, die das Ausmaß der Zell-Dehydratation bei einem gegebenen osmotischen Potential verringert, und trägt zur Stabilisierung von Proteinen und Membranen während einer extremen Dehydratation bei. Außerdem gibt es eine synergistische Wechselwirkung zwischen Kalt-Adaption und den vitrifizierenden Mitteln, und dies führt zu Veränderungen der Flüssigkeitskonformation der Zellmembranen, die die Toleranz sowohl gegenüber osmotischen Ausschlüssen als auch gegenüber Dehydratation erhöhen.
Eine Akklimatisierung kann schrittweise oder graduell durchgeführt werden. Die Schritte können in sinkenden Inkrementen von etwa 0,5ºC bis etwa 10ºC für eine Zeitdauer durchgeführt werden, die ausreichend dafür ist, den Zellen eine Akklimatisierung an die niedrigere Temperatur zu ermöglichen, ohne einen Schaden hervorzurufen. Der Temperaturgradient - gleich ob graduell oder schrittweise - ist so angelegt, daß erreicht wird, daß die Zellen so schnell wie möglich ihre Gefrierpunkte passieren. Die Zellen können graduell - entweder schrittweise oder kontinuierlich - oder schnell auf die vernngerte Temperatur akklimatisiert werden. Verfahrensweisen für die Akklimatisierung sind Fachleuten mit üblichem Sachverstand in diesem technischen Bereich wohlbekannt und schließen im Handel erhältliche Akklimatoren ein. Eine graduelle Akklimatisierung umfaßt das Vernngern der Inkubationstemperaturen um etwa 1ºC pro Stunde, bis die Zieltemperatur erreicht ist. Eine graduelle Akklimatisierung ist am meisten nützlich für solche Zellen, die als höchst empfindlich und schwierig für eine Tiefkühlkonservierung angesehen werden. Eine schrittweise Akklimatisierung umfaßt das Plazieren der Zellen in einer Umgebung verringerter Temperatur für eine Zeitdauer und weiter in einer Umgebung weiter verringerter Temperatur für eine weitere Zeitdauer. Diese Schritte werden wiederholt, wenn dies erforderlich ist.
In Suspension gehaltene Zellen können in der späten Lag-Phase (Verzögerungsphase) oder in der frühen Zellteilungs-Phase sein, um die größten Überlebensraten beim Einfrieren und Auftauen zu erreichen. Zellen außerhalb dieser Phasen zeigen höhere Grade der Vakuolenbildung und -differenzierung und sind größer, was das Risiko von Schädigungen beim Einfrieren erhöht und die Überlebensraten beim Einfrieren und Auftauen erniedrigt.

Beladen

Das Beladen schließt die Äquilibrierung von Zellen in einer Lösung eines oder mehrerer Mittel zum Schutz gegen das Einfrieren ein. Mittel, die während des Beladens verwendet werden, können als "Beladungsmittel" bezeichnet werden. Nützliche Beladungsmittel können ein oder mehrere dehydratisierende Mittel, permeierende und nicht- permeierende Mittel und osmotische Mittel einschließen. Geeignete Mittel zum Beladen schließen Mittel ein, die eine Zell-Dehydratation bei Eingabe in eine Zellsuspension induzieren. Sowohl permeierende Mittel wie beispielsweise DMSO und Ethylenglycol und eine Kombination aus permeierenden und nicht-permeierenden osmotischen Mitteln wie beispielsweise Fructose, Sucrose oder Glucose und Sorbitol, Mannitol oder Glycerin können verwendet werden. Dieser Schritt erhöht die Konzentration an gelösten Stoffen im Cytosol durch Einführen moderater Konzentrationsmengen an Mitteln zum Schutz gegen das Einfrieren, und zwar allgemein bei Konzentrationen zwischen etwa 5 M und etwa 2 M oder zwischen etwa 5% und etwa 20% in das Cytosol, bezogen auf das Gewicht. Um die Zeit zu minimieren, die für eine Äquilibrierung erforderlich ist, wird das Beladen üblicherweise bei einer Temperatur um Raumtemperatur durchgeführt, obwohl optimale Temperatur-Bedingungen und andere Bedingungen für das Beladen vorzugsweise mit Bedingungen zusammenpassen, wie beispielsweise mit der Art des Mediums, mit den Licht-Intensitäten und den Sauerstoff-Konzentrationen, bei denen eine Zellkultur lebensfähig gehalten wird.
In dem Beladungsschritt können einzelne Mittel zum Schutz gegen das Einfrieren oder Kombinationen verschiedener Mittel zum Schutz gegen das Einfrieren direkt in das Inkubationsmedium gegeben werden, und zwar entweder kontinuierlich oder schrittweise. Ein schrittweises Beladen ist manchmal erwünscht, um das Eindringen von Beladungsmittel in die Zellen zu erleichtern, da dies etwas sanfter geschieht als das Beladen in einer einzigen Dosis. Zeitinkremente oder -intervalle zwischen den Zugabeschritten bei schrittweiser Beladung können im Bereich von Minuten bis Stunden oder darüber liegen, liegen jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa einer bis etwa zehn Minuten, bevorzugter im Bereich von etwa einer bis etwa fünf Minuten und noch weiter bevorzugt im Bereich von Intervallen von etwa einer bis etwa zwei Minuten. Die Zahl der Zugabeschritte beim Vorgehen mit schrittweiser Beladung ist typischerweise so, wie es praktisch ist, und kann im Bereich von einigen wenigen Zugabeschritten bis zu einer großen Vielzahl von Zugabeschritten liegen. Vorzugsweise gibt es weniger als etwa zwanzig Zugabeschritte, noch mehr bevorzugt weniger als etwa zehn Zugabeschritte und noch mehr bevorzugt etwa fünf Zugabeschritte. Intervall-Zeiten und Zahlen der Intervalle lassen sich leicht durch Fachleute mit üblichem Sachverstand in diesem technischen Bereich für einen bestimmten Zelltyp und ein bestimmtes Beladungsmittel bestimmen. Zellen können in einer Lösung inkubiert werden, die das Beladungsmittel oder die Beladungsmittel (bei kontinuierlich oder schrittweise steigenden Mengen des Beladungsmittels) enthalten, um intracelluläre und/oder extracelluläre Konzentrationen des Mittels zu äquilibrieren. Die Inkubationszeiten liegen im Bereich von Minuten bis Stunden, je nachdem, wie dies praktisch ist. Die Schutzwirkung des Beladens schließen das teilweise Entfernen einer kleinen, jedoch signifikanten Menge Wasser aus der Zelle ein. Dies präpariert die Zelle für eine anschließende Vitrifikation und/oder Lyophilisation durch Minimieren des Schocks eines plötzlichen intracellulären Wasserverlustes.
Nach dem Beladen kann das Wachstumsmedium, das das Mittel zum Schutz gegen das Einfrieren enthält, entfernt werden, oder dann, wenn das nachfolgend zu verwendende Mittel (Vitrifizierungsmittel) dasselbe oder ein ähnliches Mittel ist, kann das Beladungsmittel weiter zugegen sein, und seine Konzentration kann für den Schritt der Vitrifikation einfach erhöht werden.

Vitrifikation

Einem Verfahren der Tiefkühlkonservierung zu unterwerfende Zellen werden im Anschluß an eine Vorbehandlung, ein Beladen und/oder eine Lyophilisierung vitrifiziert. Es gibt einige Vorteile der Vitrifikations-Verfahren. Indem man einer Bildung von Eiskristallen im System vorbeugt, wird die Notwendigkeit zum Optimieren des komplexen Satzes von Variablen eliminiert, die zur Eisbildung führen. Weiter können die Proben direkt in flüssigem Stickstoff eingetaucht werden, und das Verfahren erfordert nicht extensive Anlagen, wie sie für ein gesteuertes Kühlen erforderlich sind. Das Vitrifikationsverfahren bietet auch das größte Potential zur Entwicklung von Tiefkühlkonservierungs-Verfahren für komplexe Gewebe und Organe, die aus einigen verschiedenen Typen von Zellen bestehen.
Vitrifikationsverfahren schließen eine graduelle oder schrittweise osmotische Dehydratisierung der Zellen oder Proben vor dem Abschrecken im flüssigen Stickstoff ein. Im Vitrifikationsverfahren wird eine Zell-Dehydratation bewirkt durch direkten Kontakt mit konzentrierten Lösungen vor einem Abkühlen in flüssigem Stickstoff. Der Kontakt kann graduell bei kontinuierlich steigenden Mengen der den Zellen zugegebenen Vitrifikationslösung sein, oder er kann schrittweise sein, wobei steigende Mengen über einen festgesetzten Zeitraum zugesetzt werden. Zeit-Inkremente oder -intervalle zwischen den Zugabeschritten bei einer schrittweisen Vitrifikation können im Bereich von Minuten bis Stunden oder mehr liegen, liegen jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa ein bis etwa zehn Minuten, bevorzugter im Bereich von etwa ein bis etwa fünf Minuten und noch mehr bevorzugt im Bereich von etwa ein bis etwa zwei Minuten. Die Zahl der Zugabeschritte bei einem schrittweisen Vitrifikationsverfahren ist typischerweise so, wie es praktisch ist, und kann im Bereich von einigen wenigen bis zu einer großen Vielzahl von Zugabeschritten liegen. Vorzugsweise gibt es weniger als etwa zwanzig Zugabeschritte, noch mehr bevorzugt weniger als etwa zehn Zugabeschritte und noch mehr bevorzugt etwa fünf Zugabeschritte. Intervall-Zeiträume und die Zahl der Intervalle kann leicht von einem Fachmann mit üblichem Sachverstand in diesem technischen Bereich für einen speziellen Typ von Zellen und ein spezielles Vitrifikationsmittel bestimmt werden. Die Zellen werden in einer Lösung inkubiert, die das Vitrifikationsmittel oder die Vitrifikationsmittel enthält (bei kontinuierlich oder schrittweise steigenden Mengen), wodurch die intracellulären und/oder extracellulären Konzentrationen des Mittels wie gewünscht äquilibriert werden.
Inkubationszeiten schwanken im Bereich von Minuten bis Stunden, je nach praktischer Notwendigkeit. Unter idealen Bedingungen können die Zellen oder Organe mit extrem schnellen Raten abgekühlt werden, ohne daß eine intercelluläre oder intracelluläre Eisbildung auftritt. Als Ergebnis können alle Faktoren, die eine Eisbildung beeinflussen, aus dem Weg geräumt werden, und es gibt einige praktische Vorteile der Vitrifikationsverfahren im Vergleich zu konventionellen Verfahren der Tiefkühlkonservierung. Eine Vitrifikation bietet das größere Potential zum Entwickeln von Verfahren zur Tiefkühlkonservierung bei komplexen Geweben und Organen. Durch Maßnahmen zur Vorbeugung einer signifikanten Eisbildung im System ist das Vitrifikationsverfahren in der praktischen Durchführung komplexer als konventionelle Verfahrensweisen zur Tiefkühlkonservierung. Weiter erlaubt die Vitrifikation die Anwendung ultraschneller Abkühlraten zur Umgehung von Problemen der Kühlungsempfindlichkeit einiger Proben. Es ist keine spezialisierte oder teure Ausrüstung für gesteuerte Abkühlraten erforderlich.
Die Vitrifikation ist ein kryogenes Verfahren, in dem ein hochkonzentriertes Cytosol unter Bildung eines festen, metastabilen Glases ohne wesentliche Kristallisation supergekühlt wird. Die Hauptschwierigkeit bei der Tiefkühlkonservierung irgendeiner Zelle ist die Bildung intracellulärer Eiskristalle sowohl während des Einfrierens als auch während des Auftauens. Eine exzessive Bildung von Eiskristallen führt zum Zelltod aufgrund eines Reißens von Zellmembranen und -organellen. Eine Verfahrensweise zum Verhindern der Bildung von Eiskristallen ist, die Zellen schnell einzufrieren, so daß die gebildeten Eiskristalle nicht groß genug sind, um eine signifikante Schädigung zu bewirken. Wenn eine Zelle mit geringem Wassergehalt schnell eingefroren wird, vitrifiziert sie. Eine Vitrifikation durch schnelles Einfrieren ist nicht möglich mit Zellen wie beispielsweise Pflanzenzellen, die einen hohen Wassergehalt enthalten. Um Zellen mit hohem Wassergehalt zu vitrifizieren, ist der Zusatz von Mitteln zur Erniedrigung des Einfrierpunkts und von Inhibitoren der Eiskristall-Bildung zusätzlich zu einem schnellen Einfrieren zur Vitrifikation erforderlich. Eine richtig vitrifizierte Zelle bildet eine transparente gefrorene amorphe feste Substanz aus, die aus Eiskristallen besteht, die zu klein sind, um Licht zu brechen. Wenn man sich eine vitrifizierte Zelle auf etwa -40ºC erwärmen läßt, kann sie devitrifizieren. Bei der Devitrifikation vergrößern sich Eiskristalle und vereinigen sich in einem Verfahren, das allgemein schädlich für das Überleben der Zelle ist. Vitrifikationslösungen verstärken die Vitrifikation von Zellen beim Einfrieren oder verzögern eine Devitrifikation beim Auftauen.
Die meisten Lösungen für eine Tiefkühlkonservierung können das jeweilige Material in ein Glas-Material oder glasartiges Material überführen, vorausgesetzt, die Abkühlraten sind ausreichend schnell, um die Nukleierung und das Wachstum von Eiskristallen zu verhindern, wobei die kritische Abkühlrate von der Konzentration gelöster Substanzen abhängig ist. In ähnlicher Weise kann die Vitrifikation der Zellen bewirkt werden, wenn das Cytosol ausreichend konzentriert ist. In Verfahrensweisen zur Tiefkühlkonservierung wird dies durch Dehydratisieren der Zellen in extrem konzentrierten Lösungen vor dem Abschrecken in flüssigem Stickstoff erreicht. Bei der Verfahrensweise zur Tiefkühlkonservierung wird das Cytosol auf einen Wert konzentriert, wie er für eine Vitrifikation erforderlich ist, indem man die Proben in eine konzentrierte Lösung eines Mittels zum Schutz bei der Tiefkühlkonservierung, wie beispielsweise das Vitrifikationsmittel, legt. Konzentrationen, wie beispielsweise etwa 4 M bis etwa 10 M oder zwischen etwa 25% und etwa 60%, bezogen auf das Gewicht, sind bevorzugt. Dies bewirkt eine extreme Dehydratation der Zellproben. Lösungen mit einer Konzentration über 7 M entfernen typischerweise mehr als etwa 90% des osmotisch aktiven Wassers aus den Zellen. Jedoch können präzise Konzentrationen für jedes Mittel empirisch bestimmt werden. Vitrifikationsmittel, die verwendet werden können, schließen DMSO, Propylenglycol, Glyzerin, Polyethylenglycol, Ethylenglycol, Butandiol, Formamid, Propandiol und Mischungen dieser Substanzen ein.
Geeignete Vitrifikationslösungen schließen ein Kulturmedium mit DMSO (1 bis 50%), Propylenglycol (etwa 5 bis 25%), Glyzerin (etwa 0 bis 50%), PEG-8000 (etwa 5 bis 20%), Ethylenglycol (etwa 10 bis 75%), Ethylenglycol/Sorbitol (etwa 60/20 Gew.-% bis etwa 10/60 Gew.-%) und Ethylenglycol/Sorbitol (etwa 40/30 Gew.-%) ein. Ethylenglycol/Sorbitol ist bevorzugt und kann in Konzentrationen von beispielsweise 50/30%, 45/35%, 40/40%, 40/30%, 30/50% und vorzugsweise 30/40% verwendet werden. Solche Vitrifikationslösungen können bei Temperaturen im Bereich von etwa 1ºC bis etwa 8ºC und vorzugsweise bei einer Temperatur im Bereich von 2ºC bis 6ºC und noch mehr bevorzugt bei etwa 4ºC verwendet werden.
Um die schädlichen Konsequenzen eines Kontakts mit Vitrifikationslösungen zu minimieren, kann eine Dehydratation bei etwa 0ºC bis etwa 4ºC durchgeführt werden, wobei die Zeit des Kontakts so kurz wie möglich ist. Unter diesen Bedingungen gibt es keinen merklichen Einfluß einer weiteren Tiefkühlkonservierung auf die Proben wegen der Differenz des Permeabilitätskoeffizienten für Wasser und gelöste Stoffe. Als Ergebnis bleiben die Proben zusammengezogen, und der Anstieg der Cytosol-Konzentration, der für eine Vitrifikation erforderlich ist, wird durch Dehydratation erreicht. Jedoch ist ein Gleichgewicht (bzw. eine Beladung) der Zellen mit gegen das Tiefgefrieren schützenden Mitteln nicht immer für eine erfolgreiche Vitrifikation von Pflanzenzellen oder -organen erforderlich. Beispielsweise läßt sich in einigen Fällen mit einem Vorkultivieren mit Beladungsmitteln derselbe Zweck wie im Beladungsschritt erreichen.
In den Beispielen, in denen ein Beladen erforderlich ist, dient dies vornehmlich dazu, eine durch eine Dehydratation induzierte Destabilisierung von Zellmembranen und möglicherweise von Proteinen zu verhindern. Jedoch kann es bei Fehlen eines Beladungsschritts eine geringere Rate des Überlebens von Zellen im Anschluß an die Dehydratation und an Schritte des Abkühlens/Aufwärmens geben. So begünstigt das Vorhandensein von Ethylenglycol oder anderen gegen das Tiefkühlen schützenden Mitteln (cryoprotectants) während des Beladungsschritts nicht nur eine Vitrifikation der Zellen während des Abkühlens, sondern schützt auch Zellen gegen Schädigung während des Dehydratationsschritts.

Lyophilisierung

Die Lyophilisierung ist gerichtet auf ein Reduzieren des Wassergehalts der Zellen vor der Tiefkühlkonservierung durch Vakuumverdampfung. Eine Lyophilisierung entfernt etwa 60% des Wassers aus den Zellen und kann in Kombination mit einer Vitrifizierung bis zu etwa 95% entfernen. Die Vakuumverdampfung schließt das Einbringen der Zellen in eine Umgebung mit verringertem Luftdruck ein. In Abhängigkeit von der gewünschten Wasserentfernungs-Rate kann der verringerte Umgebungsdruck bei einer Durchführung bei Temperaturen im Bereich zwischen etwa -30ºC und -50ºC bei 100 Torr, 1 Torr, 0,01 Torr oder weniger liegen. Unter Bedingungen eines verringerten Drucks wird die Rate der Wasserverdampfung erhöht, so daß bis zu 65% des Wassers in einer Zelle über Nacht entfernt werden können. Bei optimalen Bedingungen kann eine Entfernung des Wassers in wenigen Stunden oder weniger bewirkt werden. Ein Wärmeverlust während der Verdampfung hält die Zellen in gekühltem Zustand. Durch sorgfältige Anpassung des Vakuum-Werts können die Zellen bei einer Kaltakklimatisierungstemperatur während des Vakuum-Verdampfungsprozesses gehalten werden. Obwohl ein starkes Vakuum eine schnelle Entfernung des Wassers ermöglicht, setzt es die Zellen der Gefahr des Einfrierens aus. Das Einfrieren kann gesteuert werden, indem man Wärme auf die Zellen aufbringt, und zwar entweder direkt oder durch Anpassung des Vakuum-Niveaus. Wenn die Zellen anfänglich in eine Verdampfungskammer gestellt werden, kann ein hohes Vakuum aufgebracht werden, da die Restwärme in den Zellen ein Frieren verhindert. In dem Maße, in dem die Dehydratation fortschreitet und die Temperatur der Zellen abfällt, kann das Vakuum verringert werden, oder Wärme kann aufgebracht werden, um ein Frieren zu verhindern. Die halbtrockenen Zellen können eine Tendenz dazu haben, in der Verdampfungskammer umherzufliegen. Diese Tendenz ist besonders hoch am Ende der Behandlung, wenn man einen Luftstrom in die Kammer zurückströmen läßt. Wenn der Luftstrom auf die halb-trockenen Zellen trifft, kann dies dazu führen, daß die Zellen auffliegen, und dies kann dazu führen, daß sich die Proben gegenseitig kontaminieren. Um ein solches Bersten zu verhindern, kann der Schritt des Kühlens unter Verdampfen des Wassers in einer Vakuum-Zentrifuge durchgeführt werden, in der die Zellen durch Zentrifugalkräfte während des Trocknens in ein Rohr eingeschlossen sind. Die in dem Prozeß entfernte Wassermenge kann periodisch überwacht werden, indem man Proben zur Trockengewichts-Messung der Zellen zieht. Wenn die gewünschte Wassermenge entfernt ist, kann eine Vitrifikationslösung direkt den halb-trockenen Zellen für eine Zeit bis zum Zeitpunkt direkt vor dem Einfrieren in flüssigem Stickstoff zugesetzt werden.

Einfrieren

Pflanzenzellen, die vorbehandelt wurden, beladen wurden, vitrifiziert wurden und/oder lyophilisiert wurden, werden durch Einfrieren auf Tiefkühl-Konservierungs- Temperaturen konserviert. Der Einfrierschritt sollte ausreichend schnell sein, um die Bildung großer Eiskristalle zu verhindern, die schädlich für ein Überleben der Zelle sind. Die Zellen können direkt eingefroren werden, d. h. können direkt in Kontakt mit einem Mittel gebracht werden, das sich bereits bei der Temperatur des Tiefkühlkonservierungsschritts befindet. Direkte Verfahrensweisen schließen ein Auftropfen, Aufsprühen, Injizieren oder Gießen der Zellen direkt in ein bei kryogener Temperatur befindliches Fluid wie beispielsweise flüssigen Stickstoff oder flüssiges Helium ein. Beispielsweise werden in einer Klasse von Verfahren vitrifizierte und lyophilisierte Pflanzenzellen gefroren und bei der Tiefkühlkonservierungs-Temperatur gelagert, indem man die Zellen in flüssigem Stickstoff abschreckt. Zellen können auch direkt mit einem gekühlten Feststoff wie beispielsweise einem auf die Temperatur von flüssigem Stickstoff gefrorenen Stahlblock in Kontakt gebracht werden. Das kryogene Fluid kann auch direkt auf einen Behälter mit Zellen gegossen werden. Das direkte Verfahren schließt auch das In-Kontakt-Bringen von Zellen mit Gasen einschließlich Luft bei kryogener Temperatur ein. Ein bei kryogener Temperatur befindlicher Gasstrom aus Stickstoff oder Helium kann direkt über eine Zellsuspension geblasen oder in eine Zellsuspension in Einzelblasen eingeleitet werden.
Indirekte Verfahrensweisen schließen das Eingeben der Zellen in einen Behälter und das In-Kontakt-Bringen des Behälters mit einem Feststoff, einer Flüssigkeit oder einem Gas bei kryogenen Temperaturen ein. Passende Behälter schließen beispielsweise Kunststoff-Fläschchen, Glasfläschchen oder Ampullen ein, die dafür vorgesehen sind, kryogenen Temperaturen standzuhalten. Behälter für indirekte Einfrier-Verfahren müssen nicht zwingend undurchlässig für Luft oder Flüssigkeiten sein. Beispielsweise ist auch ein Plastiksack oder eine Aluminiumfolie geeignet. Weiter ist es nicht unbedingt erforderlich, daß der Behälter kryogenen Temperaturen standhalten kann. Es kann auch ein Plastik-Fläschchen, das bricht, jedoch im wesentlichen unter kryogenen Temperaturen intakt bleibt, verwendet werden. Zellen können auch dadurch eingefroren werden, daß man eine Probe der Zellen auf eine Seite einer Metallfolie bringt, während man die andere Seite der Folie mit einem Gas, einem Feststoff oder einer Flüssigkeit bei kryogener Temperatur in Kontakt bringt. Der Schritt des Einfrierens sollte ausreichend schnell sein, um eine Bildung von Eiskristallen zu verhindern. Die Einfrier-Zeit sollte um 5 min oder 4 min. 3 min. 2 min oder 1 min oder weniger liegen, die kritische Einfrier-Zeit sollte unter dem Bezugsrahmen einer einzelnen Zelle gemessen werden. Beispielsweise kann es 10 Minuten dauern, um eine große Zellprobe in flüssigen Stickstoff zu schütten, jedoch wird die einzelne Zelle durch dieses Verfahren schnell eingefroren.

Auftauen

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist gerichtet auf Verfahrensweisen zum Auftauen tiefkühlkonservierter Zellen. Ein passendes Vorgehen beim Auftauen und der Rückgewinnung ist essentiell für das Überleben von Zellen und für die Rückgewinnung von Zellen in einem Zustand, der im wesentlichen derselbe ist wie der Zustand, in dem sie ursprünglich eingefroren wurden. Da die Temperatur der tiefkühlkonservierten Zellen während des Auftauens erhöht wird, verfestigen sich kleine Eiskristalle und wachsen in einem "Devitrifikation" genannten Prozeß. Große intracelluläre Eiskristalle sind allgemein schädlich für das Überleben von Zellen. Um eine Devitrifikation zu verhindern, sollten tiefkühlkonservierte Zellen so schnell wie möglich aufgetaut werden. Die Erwärmungsrate kann wenigstens etwa 30ºC pro Minute bis 60ºC pro Minute sein. Noch schnellere Erwärmungsraten von 90ºC pro Minute, 140ºC bis 200ºC pro Minute oder mehr können ebenfalls angewendet werden. Zwar ist ein schnelles Erwärmen erwünscht, jedoch haben Pflanzenzellen ein reduziertes Vermögen, Inkubationstemperaturen signifikant oberhalb von Raumtemperatur zu überleben. Um ein Überhitzen zu vermeiden, sollte die Zelltemperatur sorgfältig überwacht werden. Jedes Erwärmungsverfahren kann angewendet werden, einschließlich Leitung, Konvektion, Strahlung, elektromagnetische Strahlungen oder Kombinationen daraus. Verfahren unter Leitung schließen ein Eintauchen in Wasserbäder, ein Anordnen in Heizblöcken oder ein direktes Anordnen in offener Flamme ein. Konvektionsverfahren schließen die Verwendung eines Heizlüfters oder eines Ofens ein. Strahlungsverfahren schließen beispielsweise Heizlampen oder Öfen wie beispielsweise Konvektionsöfen oder Strahlungsöfen ein. Elektromagnetische Strahlung schließt die Verwendung von Mikrowellenöfen und ähnlichen Vorrichtungen ein. Einige Vorrichtungen können ein Erhitzen durch eine Kombination von Verfahrensweisen bewirken. Beispielsweise heizt ein Ofen durch Konvektion und durch Strahlung. Das Erwärmen sollte beendet werden, sobald die Zellen und die umgebenden Lösungen in flüssiger Form vorliegen, was oberhalb von 0ºC sein sollte. Tiefkühlkonservierte Zellen werden oft in Gegenwart eines oder mehrerer Mittel gefroren, die den Gefrierpunkt senken. Wenn diese Mittel zugegen sind, können sich die gefrorenen Zellen bei einer Temperatur unterhalb von 0ºC verflüssigen, beispielsweise bei etwa -10ºC, -20ºC, -30ºC oder -40ºC. Ein Auftauen der tiefkühlkonservierten Zellen kann an einem dieser Temperaturpunkte oder bei einer Temperatur oberhalb von 0ºC beendet werden.

Verfahren nach dem Auftauen

Ein Verdünnen der Vitrifikationslösung und ein Entfernen des Tiefkühlkonservierungsmittels von den Zellen, das als "Entladen" bezeichnet wird, sollte so bald wie möglich und so schnell wie möglich im Anschluß an ein Auftauen der tiefkühlkonservierten Zellprobe durchgeführt werden. Aufgrund der hohen intracellulären Konzentrationen an Tiefkühlkonservierungsmittel ist es bevorzugt, die Verdünnung des suspendierenden Mediums zu bewirken, wobei man eine osmotische Expansion minimiert. Daher wird ein Verdünnen des suspendierenden Mediums und ein Abfließen des Tiefkühlkonservierungsmittels von der speziellen Probe üblicherweise durchgeführt durch Verdünnen in einem hypertonischen Medium oder durch eine schrittweise Verdünnung.
Aufgetaute Zellen können graduell an Wachstumsbedingungen akklimatisiert werden, um ein Überleben von Zellen zu maximieren. Die Vitrifikationsmittel können cytotoxisch, cytostatisch oder mutagen sein und sollten von den aufgetauten Zellen mit einer Geschwindigkeit entfernt werden, die die Zellen nicht schädigt. Eine Zahl von Verfahrensweisen des Entfernens kann angewendet werden, wie beispielsweise ein Resuspendieren und Zentrifugieren, eine Dialyse, ein Waschen in Serie, eine Bioremediation und eine Neutralisation mit Chemikalien oder elektromagnetische Strahlung. Das schnelle Entfernen einiger Vitrifikationslösungen und osmotischer Mittel kann den Streß und den Tod von Zellen verstärken, und daher kann es erforderlich sein, daß der Entfernungsschritt graduell verläuft. Die Entfernungsraten können gesteuert werden durch Waschen in Serie mit Lösungen, die weniger osmotische Mittel oder Vitrifikationsmittel enthalten. Ein weiteres Verfahren zum Reduzieren der Entfernungsrate schließt eine Dialyse mit weniger durchlässigen Membranen, ein Waschen in Serie auf halbfesten oder flüssigen Medien, die geringere und weiter geringere Konzentrationen an Vitrifikationsmitteln enthalten, ein. Andere Verfahrensweisen schließen graduelle Verdünnungen, Dialyse, Bioremediation, Neutralisation und katalytischen Abbau des cryogenen Mittels ein.
Die Behandlungsschritte des Auftauens und Behandelns nach dem Auftauen können durchgeführt werden in Gegenwart von Stabilisatoren, um ein Überleben zu sichern und genetische und celluläre Schädigungen zu minimieren. Der Stabilisator ist ein Oxidationsinhibitor, ein Sauerstoff-Radikalfänger, ein Ethylen-Inhibitor, ein divalentes Kation (z. B. Calcium, Magnesium oder Mangan) oder eine Mischung davon und reduziert, eliminiert oder neutralisiert schädigende Mittel, die aus der Tiefkühlkonservierung resultieren. Solche schädigenden Mittel schließen ein: freie Radikale, Oxidationsmittel und Ethylen. Einige dieser Mittel haben mehrere Eigenschaften und sind sehr nützlich in dieser Hinsicht. Das Überleben und die Raten eines erneuten Wachstums steigen überraschenderweise mit der Zugabe von Stabilisatoren während des Auftauens und der Schritte nach dem Auftauen. Besonders bevorzugte Stabilisatoren werden gewählt aus reduziertem Glutathion, Tetramethylharnstoff, Tetramethylthioharnstoff, Dimethylformamid, Mercaptopropionylglycin, Mercaptoethylamin, Selenomethionin, Thioharnstoff, Dimercaptopropanol, Natriumthiosulfat, Silberthiosulfat, Ascorbinsäure, Cystein, Natriumdiethyldithiocarbamat, Spermin, Spermidin, Propylgallat und Kombinationen und Derivaten davon.
Zellen können erneut in geeigneten Medien gezüchtet werden, nachdem Konzentrationsmengen osmotischer Mittel oder Vitrifikationsmittel auf einen annehmbaren Wert reduziert wurden. Eine Verfahrensweise der erneuten Züchtung schließt das Einbringen der aufgetauten Zellen in halbfeste Wachstumsmedien wie beispielsweise Agar-Platten ein, bis ein Callus gebildet ist. Zellen können von dem Callus gewonnen und in Flüssigkultur gezüchtet werden. Alternativ dazu können Callus-Zellen induziert werden, um so Reiser und Wurzeln wachsen zu lassen, indem man sie in halbfeste Medien gibt, die die geeigneten Hormone enthalten. Callus-Zellen mit Reisern und Wurzeln können graduell dafür akklimatisiert werden, auf sterilem Boden in einem Gewächshaus zu wachsen, bis sich eine Pflanze entwickelt. Die Gewächshaus-Pflanze kann dafür akklimatisiert werden, außerhalb eines Gewächshauses in ihrer natürlichen Umgebung zu wachsen.
Alternativ dazu kann eine Zelle aufgetaut und erneut gezüchtet werden ohne die Verwendung halbfester Medien. Mit anderen Worten: Nach Entfernen von osmotischen Mitteln und Vitrifikationsmitteln können die Zellen direkt in flüssige Medien für eine erneute Zucht gegeben werden. So schließt die Erfindung Verfahrensweisen zum Gewinnen von Pflanzenzellen in Suspension ein, in denen aufgetaute Pflanzenzellen in flüssiger Suspension inkubiert werden und lebensfähige Zellen in flüssigen Medien gewonnen werden, und zwar ohne die Notwendigkeit einer festen oder halb festen Kultur.
Der Einschluß einer oder mehrere der oben offenbarten Variationen kann die Wiedergewinnung von Zellen nach der Tiefkühlkonservierung für eine Vielzahl von Zelltypen wesentlich verbessern. Diese Verfahrensweisen verhindern Probleme, die mit Toxizität aufgrund von gegen das Frieren schützenden Mitteln, einem Aufbau von Ethylen, der Wirkung von Ethylen auf spezielle Targets einschließlich der Membran-assoziierten Rezeptoren, der Instabilität von Membranen und dem Leckwerden von Membranen verbunden sind. Von den oben offenbarten Verfahrensweisen wurden spezielle Kombinationen von Schritten als optimal für bestimmte Zelltypen identifiziert. Beispielsweise reagieren Tomaten-, Kartoffel- und Tabak-Zellen sehr gut auf Tiefkühlkonservieren bei Anwendung der schrittweisen Beladung und/oder Vitrifikation mit divalenten Kationen (Protokolle 10, 12, 13, 14).
Eine Verfahrensweise zum Implementieren einer Tiefkühlkonservierung von Pflanzenzellen, beispielsweise von Taxol-produzierenden Taxus-Zellen, wird schematisch in Fig. 3 wiedergegeben. Kurz gesagt ist Calluszell-Wachstumsmasse aus einem Primärisolat oder aus einer Zellkultur angepaßt für ein Kultivieren in einem flüssigen Wachstumsmedium. Nachdem sich die Zellen an eine Flüssigkultur angepaßt haben, werden sie auf ein Vorbehandlungs-Wachstumsmedium übertragen, das ein osmotisches Mittel und einen Stabilisator enthält, und zwar für eine Zeit von 24 bis 72 h. Vorkultivierte Zellen werden anschließend durch Inkubation der Vorbehandlungs-Kultur bei 4ºC für 1 bis 4 h kalt-akklimatisiert. Nach der Kalt-Akklimatisierung werden die Zellen in ein Zentrifugenglas übertragen und einer schwachen Zentrifugierung unterzogen, die die Zellen ohne Schädigung in einem Pellet sammelt. Die überstehende Flüssigkeit, die die Vorbehandlungsmedien mit osmotischen Mitteln und dem Stabilisator enthält, wird von dem Zell-Pellet abgesaugt und verworfen. Eine vorgekühlte Lösung, die einen Stabilisator und ein Vitrifikationsmittel enthält, wird dem Zell-Pellet zugesetzt, und die Zellen werden vorsichtig resuspendiert. Nach 3 Minuten Behandlung mit der Vitrifikationslösung werden die Zellen in einen Archiv-Tieftemperatur-Speicher gegeben, und zwar durch Eintauchen des die Zellen enthaltenden Glasfläschchens in flüssigem Stickstoff. Tiefkühlkonservierte Zellen werden in flüssigem Stickstoff für eine Zeit von etwa 30 min bis vielen Jahren gelagert. Um die Zellen wiederzubeleben, wird das die tiefkühlkonservierten Zellen enthaltende Glasfläschchen schnell von flüssigem Stickstoff in ein Wasserbad bei 40ºC überführt. Das Glas wird aus dem 40ºC warmen Bad entfernt, wenn der Inhalt verflüssigt ist. Eine aliquote Teilmenge der aufgetauten Zellen wird im Hinblick auf die unmittelbare Lebensfähigkeit durch Farbstoffausschluß-Analyse untersucht. Die übrigen Zellen werden mit einer Reihe von kalten Wachstumsmedien gewaschen, die einen Stabilisator und fortschreitend niedrigere Konzentrationen an osmotischen Mitteln enthalten. Nachdem ausreichende Mengen von osmotischen und Vitrifikations-Mitteln von den Zellen im Rahmen einer Reihe von Wasch-Schritten entfernt wurde, werden die Zellen direkt in eine Flüssigkultur überführt. Alternativ dazu werden Zellen auf ein Plattierpapier gegeben und auf eine Reihe von halb festen Medien mit einem darin enthaltenen Stabilisator und zurückgehenden Mengen an osmotischen und Vitrifikationsmitteln übertragen. Dieses reihenweise Plattieren wird fortgesetzt, bis sich die Zellen an ein Wachstum auf halb festem Medium in Abwesenheit osmotischer und vitrifizierend wirkender Lösungen angepaßt haben. Andere Verfahrensweisen der Zell- Tiefkühlkonservierung sind in den Fig. 1A, 1B und 1C offenbart. Wie aus dieser schematischen Wiedergabe ersichtlich ist, ist eine Anzahl von Variationen bevorzugt. Beispielsweise wird in Schritt 1 Zellen-Biomasse in flüssigem Medium vorkultiviert, das osmotische Mittel (Sucrose, Sorbitol oder Mannitol mit Konzentrationsbereichen von 0,06 M bis 0,80 M) enthält, und zwar für eine Zeit von 1 bis 6 Tagen in flüssigem Medium. In Schritt 2 wird das Beladen schrittweise durchgeführt. Vorkultivierte Zellen- Biomasse wird mit bei Tiefkühlkonservierung schützenden (cryoprotectants) Mitteln (20% einer Vitrifikationslösung (V2N) beladen, die Ethylenglycol/Sorbitol in einer Konzentration von 40/30 Gew.-% in Nähr-Kulturmedium enthält, oder in 20% einer Vitrifikationslösung (VS3), die 30% (w/v) Glyzerin, 15% (w/v) Ethylenglycol und 15% (w/v) Dimethylsulfoxid in einem Nähr-Kulturmedium oder in 0,4 M Sucrose- Lösung (pH = 5,6 bis 5,8) enthält. Die Zell-Biomasse in der Flüssigkeit wird vorsichtig gemischt und auf Eis oder in einem Kühlmittel bei 0ºC bis 4ºC für 5 Minuten inkubiert. Unmittelbar nach diesem Schritt wird die Konzentration an vor Einwirkung der Tiefkühlkonservierung schützenden Mitteln in Flüssigkeit schrittweise dadurch erhöht, daß man die fünffache Menge gekühlter 100%-iger Vitrifikationslösung (V2N oder VS3) in einminütigen Intervallen zusetzt, bis die Endkonzentration an Vitrifikationslösung bei 65% erreicht ist. Die Gesamtzeit, die für diesen Beladungsschritt und die Inkubierung bei 0ºC bis 4ºC angewendet wird, beträgt zehn Minuten. Die Mischung (Zellen-Biomasse und Vitrifikationslösung) wird zentrifugiert für eine Zeit bis zu 5 min (1 bis 5 min), und zwar bei 1000-facher Erdbeschleunigung (100 · g) und der Überstand wird verworfen.
Alternativ dazu kann in Schritt 2 das Laden in einem einzigen Schritt durchgeführt werden. Vorgezüchtete Zell-Biomasse wird mit Mitteln zum Schutz gegen das Tiefkühlen beladen (65% einer Vitrifikations-Lösung - V2N mit einem Gehalt an Ethylenglycol/Sorbitol in einer Konzentration von 40/30 Gew.-% in einem Nährkultur-Medium oder 65% einer Vitrifikations-Lösung - VN3 mit einem Gehalt an 30% (w/v) Glyzerin, 15% (w/v) Ethylenglycol und 15% (w/v) DMSO in einem Nährkultur-Medium oder in 0,4 M Sucrose-Lösung (pH 5,6-5,8)). Die Zell-Biomasse in der Mittel zum Schutz gegen das Tiefkühlen enthaltenden Flüssigkeit wird vorsichtig gemischt und auf Eis inkubiert oder bei 0ºC bis 4ºC für eine Zeit von 10 min gefroren.
Alternativ dazu kann das Beladen schrittweise oder in einem Schritt mit Mitteln zum Schutz gegen das Tiefgefrieren durchgeführt werden, die einen oder mehrere Membranstabilisator(en) enthalten. Alle biologischen Membranen haben eine gemeinsame Gesamt-Struktur. Sie sind Anordnungen aus Lipid- und Protein-Molekülen, die durch nicht-kovalente Wechselwirkungen zusammengehalten werden. Lipide sind als Doppelschicht angeordnet, die die Grundstruktur der Membran darstellt und als für den Durchfluß der meisten wasserlöslichen Moleküle relativ undurchlässige Barriere dient. Protein-Moleküle liegen innerhalb der Lipid-Doppelschicht und modulieren die verschiedenen Funktionen der Membran. Einige vollbringen einen Transport spezieller Moleküle in die Zelle hinein oder aus dieser heraus, wie beispielsweise Kanal-Proteine wie z. B. passive Kanal-Proteine, Träger-Proteine und Proteine, die in einen aktiven Transport involviert sind. Andere sind Enzyme, die mit der Membran in Verbindung stehende Reaktionen katalysieren, und noch andere dienen als strukturelle Verbindungen zwischen dem Zytoskelett der Zelle und der extracellulären Matrix und/oder als Rezeptoren zur Aufnahme hindurchreichender chemischer Signale aus der Umgebung der Zelle.
Bestimmte Pflanzen-Spezies und Zell-Linien widersetzen sich früher etablierten Vorgehensweisen der Tiefkühlkonservierung, und zwar teilweise aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegenüber dem Typ und der Konzentration von Mitteln zum Schutz beim Tiefgefrieren. Es gibt wenigstens zwei potentielle Gründe einer Membran-Destabilisierung, und zwar die chemische Toxizität der Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren, die bei den Schritten des Beladens und Dehydratisierens verwendet werden, und eine extreme Dehydratation, die aus dem Kontakt mit den konzentrierten Lösungen (z. B. zur Vitrifikation) resultiert. Andere Faktoren wie beispielsweise die Eisbildung während des Abkühlens oder Erwärmens und das mechanische Zerreißen von Zellen aufgrund des Brechens des Glases können auch zu einer Destabilisierung von Membranen beitragen.
Eine starke Dehydratation, die von dem Kontakt mit konzentrierten Lösungen von Mitteln zum Schutz beim Tiefgefrieren resultiert, kann strukturelle Übergänge in eine unterschiedliche Anordnung biologischer Moleküle einschließlich Lipiden, Proteinen und Nukleinsäuren hervorrufen. Unter diesen Bedingungen gibt es verschiedene Veränderungen in der Ultrastruktur der Plasmamembran und anderer Zellmembranen. Diese Änderungen schließen die Bildung spezieller Domänen in der Plasmamembran ein, die zur Entfernung von Wasser führen, das mit den hydrophilen Bereichen der Proteine und Lipid-Komponenten der Membranen assoziiert ist. Alternativ dazu kann auch eine Destabilisierung dadurch eintreten, daß man Pflanzen-Zellmembranen mit einer durchlässigmachenden Verbindung zum Schutz gegen das Tiefgefrieren in Kontakt bringt, d. h. mit einer Verbindung, die ein Kanal-Protein innerhalb einer Pflanzen-Zellmembran fluidisiert. Ein schrittweises Beladen und/oder eine schrittweise Vitrifikation kann eine Membran-Destabilisierung minimieren, wie sie von einer starken Dehydratation resultiert. Andere in Verbindung mit wesentlichen Änderungen des Zeilvolumens, der Permeabilität der Plasmamembran usw. in Zusammenhang stehende Merkmale können durch ein schrittweises Beladen ebenfalls minimiert werden.
Eine Wärmeschock-Behandlung stabilisiert Membranen und Proteine ebenfalls. Eine Wärmeschock-Behandlung nach dem Vorzüchten von Zell-Biomasse mit osmotischen Mitteln geschieht nicht notwendigerweise vor dem Beladen von Zellen mit Mitteln zum Schutz gegen das Tiefgefrieren. Jedoch ist eine Wärmeschock-Behandlung erforderlich, wenn die Zell-Biomasse nicht mit osmotischen Mitteln vorbehandelt wurde. Weiter ist es wichtig, Zellen mit einer vitrifizierenden Lösung (Mitteln zum Schutz gegen das Tiefgefrieren) zu behandeln, die ein divalentes Kation enthält (CaCl&sub2;, MnCl&sub2; oder MgCl&sub2;; in einer Konzentration von 5 mM bis 20 mM; siehe beispielsweise Verfahrensweisen 11 und 12). Eine Wärmeschock-Behandlung folgt normalerweise nach dem Vorzüchten von Zell-Biomasse. Dies führt zu einer Neigung zur Verbesserung des Überlebens von Zellen nach der Tiefkühlkonservierung um etwa 20% bis etwa 40%. Diese Verfahrensweise schließt das Inkubieren von Zellen oder Zell-Biomasse (entweder vorgezüchtet oder nicht-vorgezüchtet) in einem Wasserbad-Schüttler bei etwa 37ºC für eine Zeit bis zu etwa 4 h ein. Nach dieser Behandlung werden die Zellen in flüssigem Medium (mit oder ohne osmotisches Mittel) auf Raumtemperatur gebracht (23ºC bis 25ºC), und zwar für eine Zeit bis zu 4 h, bevor sie für eine Behandlung zum Schutz gegen das Tiefgefrieren (Beladungsschritt) verwendet werden.
Es ist bekannt, daß eine Wärmeschock-Behandlung eine de novo-Synthese bestimmter Proteine (Wärmeschock-Proteine) induziert, von denen angenommen wird, daß sie in eine Adaption an Streß involviert sind. Mit Wärmeschock behandelte Zellen, die nicht mit einem osmotischen Mittel vorkultiviert werden, überleben ein Einfrieren nicht. Der Wärmeschock induziert Toleranz gegenüber dem Kontakt mit niedrigen Temperaturen, in dem abrupt die Konzentration osmotischer Stoffe in den Zellen erhöht wird, die aus einem Einfrieren durch die Bildung von Wärmeschock-Proteinen resultieren, die Proteine und Membranen stabilisieren. Die Wärmeschock-Behandlung wird durchgeführt durch Kultivieren der Zellen in einem Wasserbad bei einer Temperatur zwischen etwa 31ºC und etwa 45ºC, vorzugsweise zwischen etwa 33ºC und etwa 40ºC und noch mehr bevorzugt bei etwa 37ºC. Das Kultivieren wird durchgeführt für eine Zeit im Bereich von wenigen Minuten bis wenigen Stunden, vorzugsweise von etwa 1 h bis etwa 6 h und noch mehr bevorzugt von etwa 2 h bis etwa 4 h.
Zweiwertige Kationen wie beispielsweise CaCl&sub2;, MnCl&sub2; oder MgCl&sub2; können auch in eine vitrifizierende Lösung vor dem Kontakt der Zellen mit LN&sub2;-Temperaturen eingeschlossen werden. Zweiwertige Kationen, die in die vitrifizierenden Lösungen eingeschlossen werden, scheinen Pflanzenzell-Membranen und Wärmeschock-Proteine zu stabilisieren. Zweiwertige Kationen stabilisieren Zellmembranen, indem sie die elektrostatische Abstoßung zwischen ionischen Zentren an der Membran reduzieren. Weiter können zweiwertige Kationen auch eine Eis-Nukleierung während des Einfrierens und Auftauens verhindern. Andere Verbindungen wie beispielsweise Sterole, Phospholipide, Glycolipide oder Glycoproteine, die sich in die Lipid-Doppelschicht von Membranen einlagern, können ebenfalls wirksam Pflanzenzell-Membranen stabilisieren. Diese Verbindungen können an die Stelle zweiwertiger Kationen bei der Stabilisierung von Pflanzenzell-Membranen und/oder Wärmeschock-Proteinen gesetzt werden.
Die Verfahrensweise zum schrittweise Beladen vorkultivierter oder nicht-vorkultivierter Zell-Biomasse (mit oder ohne Wärmeschock-Behandlung bei 37ºC für eine Zeit bis zu 4 h) mit Mitteln zum Schutz gegen das Tiefgefrieren ist dieselbe wie diejenige, wie sie oben beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß die vitrifizierenden Lösungen (V2N oder VS3) die divalenten Kationen zur Membran-Stabilisierung (z. B. CaCl&sub2;, MnCl&sub2;, MgCl&sub2;) in einer Konzentration enthalten, die im Bereich von 5 mM bis 20 mM liegt.
In Schritt 3 kann der Vitrifikationsschritt schrittweise erfolgen. Zellen oder Zell- Biomasse, die so erhalten wurden, werden nach dem Beladen und Zentrifugieren weiter mit einer Vitrifikationslösung (V2N oder VS3) schrittweise behandelt. Dieser Schritt schließt üblicherweise die Übertragung der Zell-Biomasse nach dem Zentrifugieren in ein gekühltes Tiefkühl-Probenglas und die anschließende Zugabe einer konzentrierten 100%-Vitrifikationslösung in Intervallen von 1 min während der dreiminütigen Inkubationsperiode bei 0ºC ein. Am Ende der Inkubationsperiode werden die Inhaltsstoffe (Zellen + vitrifizierende Lösung) in einem Tiefkühl-Probenglas vorsichtig gemischt, bevor man sie in LN&sub2; eintaucht. Alternativ dazu kann die Vitrifikation in einem einzigen Schritt durchgeführt werden. So erhaltene Zellen oder Zell-Biomasse werden nach dem Beladen und Zentrifugieren weiter mit einer Vitrifikationslösung (100%) behandelt. Dieser Schritt schließt üblicherweise die Übertragung von Zell-Biomasse nach dem Zentrifugieren in ein gekühltes Tiefkühl-Probenglas und die Zugabe einer konzentrierten (100%) vitrifizierenden Lösung ein. Die Inhaltsstoffe in dem Tiefkühl-Probenglas werden vorsichtig gemischt und werden für 3 min bei 0ºC inkubiert, bevor man sie in LN&sub2; eintaucht. Alternativ dazu kann eine Vitrifikation schrittweise oder in einem Schritt mit Mitteln zum Schutz gegen das Tiefgefrieren durchgeführt werden, die ein zweiwertiges Kation wie beispielsweise CaCl&sub2; oder MgCl&sub2; enthalten.
Die Verfahrensweise zur Vitrifikation von beladener Zell-Biomasse mit Mitteln zum Schutz gegen das Tiefgefrieren ist die gleiche wie oben beschrieben, mit der Ausnahme, daß die konzentrierte vitrifizierende Lösung (V2N oder VS3) die divalenten Kationen zur Membranstabilisierung (CaCl&sub2; oder MgCl&sub2;) in einer Konzentration enthält, die im Bereich von etwa 5 mM bis etwa 20 mM lag.
Das Einfrieren von Zellen erfolgt allgemein schnell in Tiefkühl-Probengläsern in LN&sub2; oder die schnelle Überführung von Tiefkühl-Probengläsern, die Zellen in einer Vitrifikationslösung enthalten, in ein Lagerungsgefäß, das flüssigen Stickstoff (LN&sub2;) enthält.
Ein Auftauen schließt ein schnelles Erwärmen (z. B. in etwa 20 s bis etwa 45 s) von Tiefkühl-Probengläsern, die gefrorene Zell-Biomasse oder Zellen enthalten, in einem Wasserbad ein, dessen Temperatur auf 40ºC oder 60ºC festgesetzt ist. Die Behandlung nach dem Auftauen schließt die unmittelbare Übertragung von verflüssigter Zell- Biomasse in Tiefkühl-Probengläsern in ein steriles Zentrifugenröhrchen ein, das flüssiges Nährmedium mit einem osmotischen Mittel (Sucrose, Sorbitol oder Mannitol; Konzentrationsbereich: 1 M bis 2 M) und einen Ethylen-Inhibitor oder Ethylen- Wirkungsinhibitor enthält (Silberthiosulfat; Konzentrationsbereich von etwa 5 uM bis etwa 20 uM). Die Inhaltsstoffe werden vorsichtig gemischt und auf einem Schüttler (120 Upm) für eine Zeit von 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Diesem Schritt folgt eine Zentrifugation und Überführung der in einem Pellet vorliegenden Zellen auf zwei Schichten sterilen Filterpapiers, das auf einem Blotting-Papier liegt (um ein Entfernen überschüssiger Feuchtigkeit von den Zellen oder der Zell-Biomasse zu unterstützen). Die Zellen oder Zell-Biomasse wurde(n) 2 min inkubiert. Nach dieser Inkubationsperiode wird das obere Filterpapier mit den Zellen schrittweise auf festes Nährmedium überführt, das ein osmotisches Mittel in einer abgesenkten Konzentration von 0,8 M bis 0,1 M Sucrose enthält (um die osmotische Einstellung der Zellen zustandezubringen). Bei jedem Schritt werden Zellen auf einem Filterpapier für eine Zeit von ¹/&sub2; h bis 1 h inkubiert und am Ende auf ein normales festes Nährmedium ohne die Gegenwart irgendeines weiteren osmotischen Mittels überführt. Dieser Schritt (ohne irgendein weiteres osmotisches Mittel in einem normalen Nährmedium) des Inkubierens wird nach 24 h andauernder Inkubation im Dunkeln bei 25ºC wiederholt.
Alternativ dazu können nach dem Auftauen die in Form eines Pellets beim Auftauen vorliegenden Zellen schnell mit einem flüssigen Medium gewaschen werden, das ein osmotisches Mittel enthält (Sucrose, Sorbitol oder Mannitol; Konzentrationsbereich: 1 M bis 2 M). Dies erfolgt üblicherweise durch Inkubation der Zell-Biomasse für 2 bis 5 min in einem flüssigen Nährmedium, das ein osmotisches Mittel enthält, und Zentrifugieren bei 100 · g für 1 bis 3 min. Dieser Schritt wird noch einmal vor dem Inkubieren der Zell-Biomasse 30 min in einem flüssigen Nährmedium wiederholt, das ein osmotisches Mittel und einen Ethylen-Inhibitor oder einen Inhibitor der Ethylen-Wirkung enthält (Silberthiosulfat in einer Konzentration von 5 uM bis 20 uM).
Ein erneutes Callus-Wachstum ist üblicherweise nach einer Woche sichtbar. Wenn sich das Wachstum der neuen Zell-Biomasse verstärkt, werden Callus-Zellen von dem Filterpapier entfernt und direkt auf ein normales festes Nährmedium übertragen. Nachdem ausreichendes Wachstum (üblicherweise zwei bis drei Wochen) stattgefunden hat, wird eine Zell-Suspension in flüssigem Medium von etabliertem Callus initiiert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist gerichtet auf Pflanzenzellen, die durch die oben beschriebenen Verfahrensweisen tiefkühlkonserviert wurden. Die Zellen können von jeder beliebigen Art oder Spezies sein oder von solcher Art sein, auf die die Tiefkühlkonservierungs-Verfahren angewendet werden können. Tiefkühlkonservierte Zellen können bei Temperaturen gehalten werden, die für eine Tieftemperatur-Lagerung passend sind. Vorzugsweise werden Zellen in flüssigem Stickstoff (etwa -196ºC), flüssigem Argon, flüssigem Helium oder flüssigem Wasserstoff gehalten. Diese Temperaturen sind am meisten passend für eine Langzeit-Lagerung von Zellen, und weiter können Temperaturschwankungen minimiert werden. Die Langzeit-Lagerung kann für Monate und vorzugsweise für viele Jahre erfolgen, und zwar ohne signifikanten Verlust der Lebensfähigkeit von Zellen bei deren Rückgewinnung. Da sich die Erfindung auch auf effiziente Verfahren zum Rückgewinnen tiefkühlkonservierter Zellen bezieht, können relativ große Teilmengen von Zellproben ohne Verlust der gesamten Probe verloren werden. Zellen oder Pflanzen können von solchen Zellen fortgepflanzt werden, die verbleiben. Die Kurzzeit-Lagerung bzw. die Lagerung für weniger als ein paar Monate, kann auch bei solchen Fällen erwünscht sein, bei denen Lagertemperaturen von -150ºC, -100ºC oder sogar -50ºC angewendet werden. Trockeneis (Kohlendioxid) und handelsübliche Gefriergeräte können verwendet werden, um solche Temperaturen aufrechtzuerhalten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist gerichtet auf Pflanzen und Pflanzenzellen, die durch die oben beschriebenen Tiefkühlkonservierungs-Rückgewinnungs- Verfahren wiederbelebt wurden. Diese Zellen können auch Zellen jeder beliebigen Art oder Spezies sein, wie sie in der vorliegenden Beschreibung offenbart wird, oder können Zellen einer Art oder Spezies sein, auf die die Verfahrensweisen der Rückgewinnung aus dem Tiefkühlzustand angewendet wurden. Die Zellen können die Original- Zellen sein, die tiefkühlkonserviert wurden, oder können Zellen sein, die aus solchen Zellen fortgepflanzt wurden. Eine Pflanze - im Unterschied zu einer homogenen Zellkultur - ist eine unterschiedliche Ansammlung von miteinander in Verbindung stehenden Zellen, die miteinander verbundene Funktionen enthalten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist gerichtet auf Verfahrensweisen und Kits zum Transport und zum Auftauen tiefkühlkonservierter Zellen. Nach diesem Verfahren tiefkühlkonservierte Zellen können in einem zentralen Depot für anschließende Wiedergewinnung gelagert werden. Zur erhöhten Sicherheit gegen zufälligen Verlust kann jede gefrorene Zell-Linie an einer Anzahl von Stellen gelagert werden. Während der Wiedergewinnung kann ein Tiefkühl-Probenglas, das die tiefkühlkonservierten Zellen enthält, in einem geeigneten Behälter an den Empfänger gesandt werden. Geeignete Behälter sind solche, bei denen eine Tiefkühlkonservierungs-Temperatur während des Versands aufrechterhalten werden kann. Alle Zellen können bei Temperaturen versandt werden, die ausreichend niedrig für eine Langzeit-Lagerung sind, und zwar mit tragbaren Tiefkühlkonservierungsmitteln wie beispielsweise flüssigem Stickstoff. Zellen, die für ein unmittelbares Auftauen bestimmt sind, können in Trockeneis versandt werden, um die Kosten zu verringern. Ein Kit zum Wiedergewinnen von Zellen aus einem Depot kann ein Probenglas mit tiefkühlkonservierten Zellen, ausreichenden Medien mit passenden Konzentrationen osmotischer Mittel, Vitrifikationslösungen und Stabilisatoren für Reihenwaschungen einschließen. Alternativ dazu können die Zellen mit einer Mehrzahl halbfester Wachstumsmedien, die einen Stabilisator und zurückgehende Mengen an osmotischen Lösungen und Vitrifikationslösungen umfassen, anstelle der Waschlösung oder zusammen mit der Waschlösung versandt werden. Nach dem Auftauen werden die Zellen entweder gewaschen und unmittelbar verwendet, oder sie können auf die halbfesten Medien gebracht werden und dort schrittweise die Vitrifikationsmittel und osmotischen Mittel entfernt werden. Das Transport-Kit kann weiter Reagenzien für einen Überlebensfähigkeitstest nach dem Auftauen und eine Referenz- DNA-Probe zum Vergleich mit der DNA von den aufgetauten Zellen einschließen, um deren genetische Stabilität zu bestimmen.
Die folgenden Experimente werden zum Veranschaulichen der Ausführungsformen der Erfindung angeboten und sollten nicht als den Umfang der Erfindung beschränkend angesehen werden.

Beispiele

Beispiel 1

Callus-Initiierung und Proliferation

Taxus-Nadeln wurden von Wildpflanzen und kultivierten Pflanzen gewonnen. Das Pflanzenmaterial wurde in einer verdünnten Seifenlösung gewaschen, extensiv mit destilliertem Wasser gespült und an der Oberfläche in einer chlorhaltigen Lösung (1% Hypochlorit, pH 7) 10 min lang sterilisiert. Unter sterilen Bedingungen wurde das Material dreimal mit sterilem destilliertem Wasser gespült. Die Nadeln wurden in einer 1%-igen Polyvinylpyrrolidon-Lösung (PVP-Lösung) mit 100 mg/l Ascorbinsäure geschnitten. Die Nadeln wurden mit dem geschnittenen Ende in ein halbfestes Medium E gebracht und bei 24ºC ± 1ºC in der Dunkelheit inkubiert. Kulturen wurden täglich überwacht, und solche mit Zeichen von Kontamination durch Mikroorganismen wurden verworfen. Erhebliche Callus-Bildung wurde beobachtet, und der Callus wurde von der früheren Pflanze zum Zeitpunkt von 20 Tagen getrennt und auf den verschiedenen Medien zur Callus-Proliferation angeordnet, wie sie in Tabelle 4 aufgelistet sind. Calli von Taxus chinensis wurden auf das Medium D (Tabelle 4) übertragen. Diese Verfahrensweise führte zu einer Callus-Induktion in über 90% der früheren Pflanzen. Dieselbe Verfahrensweise wurde erfolgreich verwendet, um Kulturen von T. brevifolia, T. canadensis, T. cuspidata, T. baccata, T. globosa, T. floridana, T. wallichiana, T. media und T. chinensis zu initiieren. Calli, die von der früheren Pflanze entfernt wurden, wurden bei 24ºC in der Dunkelheit kultiviert. Gesunde Teile des Callus wurden alle 10 Tage auf frisches Medium übertragen. Die bevorzugten Medien für das Wachstum und das Halten der Pflanzen gemäß der Erfindung sind nachfolgend aufgelistet. Tabelle 4 Chemische Zusammensetzung verschiedener Wachstumsmedien

Beispiel 2

Initiierung der Suspension und Wachstum suspendierter Zellen

Ein Gramm Callus-Material wurde aseptisch in einen 125-ml-Erlenmeyer-Kolben inokuliert, der 25 ml eines flüssigen Mediums (Tabelle 4) enthielt. Der Kolben wurde mit einer Siliconschaum-Kappe bedeckt und auf einen Kreisel-Schüttler bei 120 Upm bei 24ºC in der Dunkelheit gestellt. Suspensionskulturen bildeten sich in etwa 3 bis 10 Tagen. Ein Austausch des Mediums wurde dadurch initiiert, daß man den Kolbeninhalt durch einen Buchner-Trichter saugfiltrierte, der ein Miracloth-Filter enthielt, und die gesamte Bio-Masse in frischem Medium resuspendierte. 1 bis 2 g Zellen wurden in einen 125-ml-Kolben übertragen, der 25 ml frisches Medium enthielt, und zwar wöchentlich. Typische Wachstumsraten und Zelldichten, die in Suspensionskulturen beispielhafter Spezies erhalten wurden, sind in Tabelle 5 aufgelistet. Tabelle 5 Wachstumsprofil von Taxus-Zellen
Die Erhöhung der Menge an Biomasse (Frisch- und Trocken-Gewicht) mit der Zeit für die T. chinensis-Zell-Linie K-1 wurde in Fig. 4 aufgetragen. Die maximale Wachstumsrate wurde bestimmt durch Messen der Steigung bei den Punkten der schnellsten Erhöhung der Menge an Biomasse. Zellkulturen von T. chinensis mit einer maximalen Verdopplungszeit von 2,5 Tagen haben eine Wachstumsrate, die signifikant höher ist als Wachstumsraten, über die bisher bei Suspensionskulturen von Taxus-Spezies berichtet wurde. Typische Taxus-Kulturen haben Verdopplungszeiten von etwa 7 bis 12 Tagen.
Das Kultivieren von Zellen bei hoher Dichte maximiert die Produktivität des Zellkultur- Prozesses. Während frühere Kulturen von T. brevifolia eine Zelldichte von weniger als 1 g Trockengewicht pro Liter hatten (Christian et al., 1991), können Suspensionskulturen von T. chinensis Dichten bis zu 8 bis 20 g Trockengewicht pro Liter nach 18 Tagen des Wachstums erreichen. Die Zell-Überlebensfähigkeit wurde bestimmt durch Färben mit 0,05% Fluoresceindiacetat (FDA) in Aceton (J. M. Widholm, Stain Technol. 47 (1972), 189-194) und anschließendes Zählen der Zahl von grünen Fluorescein-Zellen bei Anregung mit blauem Licht in einem Fluoreszenz-Mikroskop. Die Zell- Lebensfähigkeit war höher als 90% im Bereich der Wachstumsphase.

Beispiel 3

Lebensfähigkeit von Taxus-Zellen nach Vorkultivieren mit Mannitol

Sechs bis 7 Tage alte Suspensionskulturen von Taxus-Zellen wurden gewonnen und in frischem Wachstumsmedium resuspendiert, das 0,16 M Mannitol, 0,22 M Mannitol, 0,33 M Mannitol oder 0,44 M Mannitol enthielt.
Nach 3 Tagen des Inkubierens in einem Wachstumsmedium mit Mannitol wurden die Zellen 3 h lang bei 4ºC kalt-akklimatisiert. Die akklimatisierten Zellen wurden gewonnen und in 4 ml Tiefkühl-Probenröhrchen überführt, die eine kalte vitrifizierende Lösung von 40/30 Gew.-% Ethylenglycol/Sorbitol im Medium enthielten. Die Röhrchen wurden bei 4ºC 3 min lang inkubiert und durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gefroren. Die Röhren wurden in flüssigem Stickstoff für wenigstens 10 min belassen, bevor sie in den Auftau-Experimenten verwendet wurden.
Probenröhrchen mit gefrorenen Zellen wurden aus der Lagerung in flüssigem Stickstoff entfernt und bei 40ºC bewegt, bis die Inhaltsstoffe verflüssigt waren (1 bis 2 min). Die verflüssigten Zellen wurden dann 5 bis 6 mal mit sterilem Medium gewaschen, das 1 M Sorbitol enthielt, 3 mal mit Medium gewaschen, das 0,5 M Sorbitol enthielt, 3 mal mit Medien gewaschen, das 0,1 M Sorbitol enthielt, und 3 mal mit sorbitolfreiem Medium gewaschen. Das Waschen wurde durchgeführt durch Resuspendieren der Zellen in dem Waschmedium, Zentrifugieren bei 50 · g für 2 min und Absaugen des Waschmediums von dem Zellpellet. Die Zell-Lebensfähigkeit wurde unmittelbar nach dem Auftauen bestimmt. Eine Zusammenfassung der zahlreichen Experimente ist nachfolgend aufgelistet. Tabelle 6 Lebensfähigkeit von mit Mannitol vorbehandelten Zellen nach dem Auftauen

Beispiel 4

Lebensfähigkeit von Taxus-Zellen nach Vorkultivieren mit Sorbitol

Gefrorene Taxus-Zellen wurden aufgetaut und in frischem Wachstumsmedium suspendiert, das Sorbitol in Konzentrationen von 0,15 M, 0,22 M, 0,33 M, 0,44 M und 0,80 M Sorbitol enthielt. Die Zell-Lebensfähigkeit wurde unmittelbar nach dem Auftauen bestimmt. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse von den vielen Versuchen ist nachfolgend aufgelistet. Tabelle 7 Lebensfähigkeit von mit Sorbitol vorbehandelten Zellen nach dem Auftauen

Beispiel 5

Lebensfähigkeit von Taxus-Zellen nach Vorkultivieren mit Sucrose

Zellen aus sechs bis sieben Tage alten Zeilsuspensionen in Wachstumsmedium wurden gewonnen, und die Zell-Biomasse wurde in frischem Wachstumsmedium resuspendiert, das 0,06 M, 0,12 M, 0,15 M, 0,29 M und 0,58 M Sucrose enthielt. Die Zellen wurden tiefkühlkonserviert, gefroren, aufgetaut und osmotisch entsprechend angepaßt. Die Zell- Lebensfähigkeit wurde unmittelbar nach dem Auftauen bestimmt. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse aus mehreren Experimenten ist in Tabelle 8 zusammengefaßt. Tabelle 8 Lebensfähigkeit von mit Sucrose vorbehandelten Zellen nach dem Auftauen

Beispiel 6

Wirkung von osmotischen Mitteln auf das Überleben von Taxus-Zellen

Verschiedene osmotische Mittel in Wachstumsmedium wurden bewertet und so ihre Wirkung auf das Überleben von Zellen der Spezies Taxus bestimmt, die mit den Mitteln vorkultiviert worden waren, und zwar nach der Vorkultivierungs-Periode und nach dem Auftauen der mit einem Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren versehenen und gefrorenen Suspensionen von Taxus-Zellen. Zellen aus drei Tage alten Zellkultur- Suspensionen wurden in einem Wachstumsmedium vorkultiviert, das verschiedene osmotische Mittel enthielt, und zwar vor dem Zusatz eines Mittels zum Schutz beim Tiefgefrieren. Mit einem Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren versehene Zellen wurden gefroren und in flüssigem Stickstoff für mindestens eine Stunde gelagert. Lebensfähigkeits-Tests wurden am Ende der Vorkultivierungs-Periode (Kontrollwert) und unmittelbar nach dem Auftauen der mit einem Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren versehenen und gefrorenen Zellen durchgeführt.
Zellkulturen, die mit Mannitol im Wachstumsmedium vorbehandelt worden waren, zeigten den höchsten Prozentwert der Lebensfähigkeit beim Auftauen nach Versehen mit einem Mittel zum Tiefkonservieren und Einfrieren, verglichen mit der Lebensfähigkeit, die bei Verwendung anderer osmotischer Mittel beobachtet wurde. Tabelle 9 Wirkungen eines osmotischen Mittels auf die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen

Beispiel 7

Wirkung osmotischer Mittel und Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren auf die Lebensfähigkeit von Taxus-Zellen

Zellen von Taxus-Suspensionskulturen (KS1A) wurden gewonnen und mit verschiedenen osmotischen Mitteln im Medium vorkultiviert. Getestete osmotische Mittel schließen ein: Trehalose, Prolin, Sorbitol (0,15 M bis 0,8 M), Sucrose (2 bis 20%) und Mannitol (0,16 M). Die Lebensfähigkeit wurde für jede Zell-Suspension am Ende der Vorkultivierungsperiode und unmittelbar nach dem Auftauen bewertet. Das erneute Wachstum wurde nach der Einstellung des osmotischen Mittels nach dem Auftauen bewertet. Die verwendeten Vitrifikationslösungen waren Ethylenglycol/Sorbitol/Pectin und Ethylenglycol/Sorbitol in Konzentrationen von 40/30 Gew.-% im Kulturmedium. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 zusammengefaßt. Der höchste Prozentwert der Lebensfähigkeit und das stärkste Neu-Wachstum wurden beobachtet, wenn Mannitol zum Vorkultivieren verwendet worden war und Ethylenglycol/Sorbitol als Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren in der Vitrifikationslösung verwendet worden waren. Tabelle 10 Wirkungen osmotischer Mittel und Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren auf die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen

Beispiel 8

Wirkung der Länge des Vorkultivierens auf das Überleben

Taxus-Zellen wurden aus der Zellkultur gewonnen, und die Biomasse wurde in Wachstumsmedium resuspendiert, das Mannitol in einer Konzentration von 3% enthielt, und zwar für einen Tag oder drei Tage bei Raumtemperatur. Beladene Zellen wurden bei 4ºC 3 h lang inkubiert und in 4 ml-Tiefkühl-Probenröhrchen überführt, die kalte vitrifizierende Lösung enthielten, die 40/30 Gew.-% Ethylenglycol/Sorbitol in Kulturmedium enthielt. Die Gläschen wurden bei 4ºC 3 min inkubiert und durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gefroren. Die in den Röhrchen enthaltenen Zellen wurden in flüssigen Stickstoff für wenigstens 10 min gehalten.
Tiefkühlkonservierte Zellen wurden aufgetaut, und ihre Lebensfähigkeit wurde durch das FDA-Verfahren und durch das Trypan-Blau-Färbeverfahren bestimmt. Mit Mannitol drei Tage lang vorkultivierte Zellen zeigten eine signifikant höhere Verfügbarkeit nach dem Auftauen als Zellen, die nicht in einem Medium vorkultiviert worden waren, das Mannitol enthielt. Tabelle 11 Wirkung der Vorkultivierungszeit auf die Lebensfähigkeit

Beispiel 9

Auswirkungen von Ethylenglycol/Sorbitol auf die Lebensfähigkeit aufgetauter Taxus-Zellen

Sechs bis sieben Tage alte Zell-Suspensionen der Taxus-Spezies-Zellinie KS1A wurden mit 3% Mannitol drei Tage lang bei Raumtemperatur vorbehandelt. Beladene Zellen wurden an die Kälte akklimatisiert, indem man die Kolben bei 4ºC 3 h lang inkubierte. Kalte akklimatisierte Zellen wurden in 4 ml umfassende Tiefkühl-Probenröhrchen überführt, und jedem der Röhrchen wurde kalte Vitrifikations-Lösung zugesetzt und eingemischt. Nach einer Vitrifikation für 3 min bei 4ºC wurden die Zellen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gefroren. Die Probengläser wurden in flüssigem Stickstoff für eine Zeit von wenigstens 10 min gehalten.
Tiefkühlkonservierte Zellen wurden aufgetaut, indem man die Probengläschen von flüssigem Stickstoff überführte, und wurden in einem 40ºC warmen Wasserbad 1 bis 2 min lang bewegt. Die Lebensfähigkeit nach dem Auftauen wurde durch einen FDA- Färbetest bestimmt.
Es wurden zehn Versuche, mit denen Zell-Suspensionen der Taxus-Spezies-Zell-Linie KS1A bewertet wurden, mit verschiedenen Konzentrationen Ethylenglycol/Sorbitol durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengestellt. Zell-Suspensionen, die in der Vitrifikationslösung gefroren worden waren, die Ethylengycol/Sorbitol in einer Konzentration von 40/30 Gew.-% enthielt, zeigten den höchsten Prozentwert der Lebensfähigkeit nach dem Auftauen sowie das kräftigste Wachstum, verglichen mit Zellen, die unter Verwendung anderer Konzentrationen an Ethylenglycol/Sorbitol vitrifiziert worden waren. Tabelle 12 Wirkungen der Vitrifikationslösung auf die Rückgewinnung

Beispiel 10

Wirkungen der Mittel zum Schutz gegen Tiefgefrieren auf das Überleben von Taxus-Zellen bei Lagerung bei -196ºC

Kultivierte Taxus-Zellen wurden gewonnen und erneut in frischem Wachstumsmedium für drei Tage suspendiert, das 3% Mannitol enthielt. Die Zellen wurden 3 h an die Kälte akklimatisiert und in Tiefkühl-Probengläschen überführt, die eine Vitrifikationslösung enthielten. Die Zell-Suspensionen wurden durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gefroren. Bei der Temperatur des flüssigen Stickstoffs gefrorene Zellen wurden aufgetaut, indem man die Tiefkühl-Probengläser in einem bei 40ºC gehaltenen Wasserbad für die Zeit von 1 bis 2 min bewegte. Zellen, die mit Ethylenglycol als Mittel zum Schutz gegen das Tiefkühlen gefroren worden waren, zeigten die höchste Lebensfähigkeit. Tabelle 13 Wirkungen der Mittel zum Schutz für das Tiefgefrieren auf die Lebensfähigkeit

Beispiel 11

Lebensfähigkeit von Taxus-Zellen als Funktion des Verhältnisses Biomasse zu Vitrifikationslösung

Sechs bis sieben Tage alte Zell-Suspensionen der Taxus-Spezies-Zell-Line KS1A wurden gewonnen und erneut in frischem Medium suspendiert, das 3% Mannitol enthielt; die Zellen wurden drei Tage lang bei Raumtemperatur inkubiert. Im Anschluß an ein Akklimatisieren an die Kälte bei 4ºC für 3 h wurden die Zellen in 4 ml enthaltende Tiefkühl-Probengläser überführt, die 40/30 Gew.-% Ethylenglycol/Sorbitol in Kulturmedium enthielten. Die Gläschen wurden bei 4ºC 3 min lang inkubiert und durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff gefroren. Die Probengläser wurden in flüssigem Stickstoff für eine Zeit von wenigstens 10 min gehalten, bevor sie aufgetaut wurden.
Die höchste prozentuale Lebensfähigkeit wurde beobachtet, wenn das Verhältnis Zell- Biomasse/Vitrifikationslösung 167 mg/ml betrug. Eine akzeptable Lebensfähigkeit wurde auch erreicht, wenn das Verhältnis Zell-Biomasse zu Vitrifikationslösung 143, 200 und 250 mg/ml betrug. Tabelle 14 Auswirkungen der Menge an Zell-Biomasse auf die Lebensfähigkeit

Beispiel 12

Wirkungen verschiedener Verfahrensschritte auf die Lebensfähigkeit von Taxus-Zellen

Verschiedene Verfahrensschritte wurden bewertet, um die Schritte zu bestimmen, die zu der höchsten prozentualen Lebensfähigkeit nach dem Auftauen führen. Die Zellen wurden tiefkühlkonserviert mit und ohne Mittel zum Schutz bei Tiefgefrieren, mit und ohne osmotische Vorbehandlungen, mit und ohne Behandlung in der Kälte und mit und ohne Vitrifikation.
In dem ersten Versuch wurden sechs bis sieben Tage alte Taxus-Zellkulturen mit und ohne Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren eingefroren. In dem zweiten Versuch wurden Zellen mit und ohne Behandlung mit einer 40/30 Gew.-% Ethylenglycol/Sorbitol enthaltenden Vitrifikationslösung gefroren. In dem dritten Versuch wurden Zellen vitrifiziert und gefroren mit und ohne eine Vorbehandlung, die eine über drei Tage verlaufende Inkubation in einem Wachstumsmedium umfaßte, das 3% Mannitol enthielt. In dem vierten Versuch wurden Zellen vorbehandelt und vitrifiziert und gefroren mit und ohne Akklimatisation an die Kälte.
Bei jedem Versuch wurden Lebensfähigkeits-Tests unmittelbar nach dem Auftauen durchgeführt. Zellen, die mit einem Wachstumsmedium drei Tage lang bei Raumtemperatur vorbehandelt worden waren, das 3% Mannitol enthielt, gefolgt von einer 2- bis 4- stündigen Kaltbehandlung vor dem Zusatz des Mittels zum Schutz beim Tiefgefrieren, zeigten die höchste prozentuale Lebensfähigkeit. Eine brauchbare Lebensfähigkeit wurde auch beobachtet bei Zellen, die drei Tage lang in einem Medium vorbehandelt worden waren, das 3% Mannitol enthielt, und die einer Behandlung zum Schutz beim Tiefgefrieren ohne vorangehende Kaltbehandlung unterworfen worden waren, sowie bei Zellen, die in Wachstumsmedium drei Tage lang vorbehandelt worden waren und in einem Mannitol enthaltenden Medium 24 h vorbehandelt worden waren, gefolgt von einer 2- bis 4-stündigen Kaltbehandlung vor der Behandlung zum Schutz beim Tiefgefrieren. Tabelle 15 Lebensfähigkeit von Zellen, die aus flüssigem Stickstoff wiedergewonnen wurden
Zellen wurden erneut in Lebensfähigkeitstests unter Verwendung der angegebenen Schritte getestet, wobei die Tests nach den Verfahrensweisen durchgeführt wurden, die in den Beispielen beschrieben sind. Tabelle 16 Lebensfähigkeit von Zellen, die aus flüssigem Stickstoff wiedergewonnen wurden

Beispiel 13

Lebensfähigkeit von Zellen und Wachstum vor und nach der Tiefkühlkonservierung

Die folgenden Taxus-Spezies-Zell-Linien wurden bewertet, um die Lebensfähigkeit der Zellen und das erneute Wachstum nach der Tiefkühlkonservierung zu bestimmen: KS1A; KEIR; 647; 1224; 12-6; 12-14; und 12-20.
Sechs bis sieben Tage alte Zell-Suspensionen jeder Zell-Linie wurden gewonnen, und die Biomasse wurde in frischem Wachstumsmedium resuspendiert, das 3% Mannitol enthielt. Die Zellen wurden 3 Tage lang bei Raumtemperatur inkubiert, und danach wurden beladene Zell-Suspensionen bei 4ºC 3 h lang inkubiert. An die Kälte akklimatisierte Zellen wurden in 4 ml umfassende Tiefkühl-Probengläser überführt, die eine kalte Vitrifikationslösung aus Ethylenglycol/Sorbitol in einer Menge von 40/30 Gew.-% enthielten. Die Vitrifikationslösung und die Zellen wurden vorsichtig gemischt, und die Probengläschen wurden bei 40ºC 3 min lang inkubiert. Danach wurden die Zellsuspensionen durch Eintauchen in flüssigen Stickstoff für die Zeit von wenigstens 10 min gefroren.
Nach dem Frieren wurden die Zellen aufgetaut, indem man die gefrorenen Probengläser von flüssigem Stickstoff in ein bei 40ºC gehaltenes Wasserbad für die Zeit von 1 bis 2 min überführte. Die Lebensfähigkeit der Zelle nach dem Auftauen wurde bestimmt durch FDA-Färbetest. Die Zellen wurden 5 bis 6 mal mit kaltem sterilem 1 M Sorbitol enthaltendem Medium gewaschen und in einem frischen 1 M-Medium resuspendiert.
Die Zell-Suspensionen, die frei von toxischen Mitteln zum Schutz beim Tiefgefrieren waren, wurden anschließend jeweils getrennt voneinander unter Verwendung eines Buchner-Trichters und eines Whatmann 541-Filterpapiers unter sterilen Bedingungen filtriert. Für jede Zell-Suspension wurde das Filter mit Zellen auf ein halbfestes Wachstumsmedium aufgelegt, das 0,5 M Sorbitol enthielt, und wurde 30 min bei Raumtemperatur äquilibriert. Zellen enthaltendes Papier wurde auf festes Wachstumsmedium überführt, das 0,1 M Sorbitol enthielt, und wurde 24 h lang inkubiert. Das Papier mit Zellen wurde auf halb festes Wachstumsmedium ohne Sorbitol überführt und 24 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Zellen enthaltende Filter wurde dann erneut auf frisches halbfestes Wachstumsmedium ohne Sorbitol überführt und bei Raumtemperatur für weitere 24 h inkubiert. Ein Wachstum von Callus-Zellen auf dem halb festen Nährmedium war nach etwa 2 bis 3 Wochen evident. Danach wurden Zell- Suspensionen in flüssigem Wachstumsmedium für den Callus initiiert.
Wie aus der nachfolgenden Tabelle 17 ersichtlich ist, zeigten alle bewerteten Zell- Linien eine akzeptable Lebensfähigkeit und ein akzeptables Wachstum nach der Wiedergewinnung beim Auftauen. Tabelle 17 Auswirkungen der Vorkultivierungs-Bedingungen auf die Lebensfähigkeit

Beispiel 14

Wachstum und Produktbildung von Taxus-Zellen nach Tiefkühlkonservierung

Sechs bis sieben Tage alte Zell-Suspensionen der Taxus-Zell-Linie KS1A wurden tiefkühlkonserviert und aufgetaut. Die Zellen wurden mit 3% Mannitol in einem Wachstumsmedium 3 Tage lang vorkultiviert, und 40/30 Gew.-% Ethylenglycol/Sorbitol wurde als Kombination von Mitteln zum Schutz beim Tiefkühlen verwendet. Die Wachstumsverdopplungszeit und die Produktbildung wurden vor und nach dem Gefrieren und Auftauen bewertet. Die Produkt-Ausbeute wurde nach 5 Tagen des Wachstums in Suspension überwacht. Der Gehalt an Kern-DNA in den Zellen wurde durch Fließ- Cytometrie überwacht, und es wurde gefunden, daß er etwa 22,7 pg/Nucleus vor und 22,9 pg/Nucleus nach der Tiefkühlkonservierung betrug. Die Tiefkühlkonservierung beeinträchtigte also die Produktbildung nicht. Tabelle 18 Wachstum und Produktbildung bei Taxus vor und nach LN&sub2;

Beispiel 15

Wachstum und Produktbildung in Taxus-Zellen nach der Tiefkühlkonservierung

Zell-Linien der Taxus-Spezies wurden tiefkühlkonserviert und danach aufgetaut und einer Einstellung der osmotischen Parameter nach dem Auftauen unterworfen. Wachstum und Produkt-Bildung wurden nach Etablieren von Zell-Suspensionen in flüssiger Kultur bestimmt. Das Wachstum spiegelt die mittlere Verdopplungszeit der Zell- Suspensionen (in Tagen) wieder, nachdem sie in Wachstumsmedium etabliert wurden. Die Produktbildung wurde nach 14 Tagen des Wachstums in Suspension bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 19 aufgelistet. Tabelle 19 Taxol-Produktion von Zellen, die nach Tiefkühlkonservierung wiedergewonnen wurden
Fig. 15 veranschaulicht Chromatogramme der extracellulären Fraktion am Tag 20 von der Zell-Linie 1224 der Spezies Taxus, worin (A) für die Kontroll-Zeilsuspension steht, die nicht tiefkühlkonserviert wurde, und (B) für die Zell-Suspension steht, die nach Tiefkühlkonservierung, Einfrieren, Lagern für 6 Monate und Auftauen sowie Einstellung der osmotischen Parameter nach dem Auftauen regeneriert wurde. Peak 1 steht für 10-Deacetylbaccatin; Peak 2 steht für 9-Dihydrobaccatin III; Peak 3 steht für Baccatin III; Peak 4 steht für 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III; Peak 5 steht für Taxol; Peak 6 steht für 2-Benzoyl-2-deacetylbaccatin; und Peak 7 steht für 2-Benzoyl-2-deacetyl-1- hydroxybaccatin I.
Fig. 6 veranschaulicht Chromatogramme der extracellulären Fraktion am Tag 20 von der Zell-Linie 203 der Spezies Taxus, worin (A) für die Kontroll-Zell-Suspension steht, die nicht tiefkühlkonserviert wurde, und (B) für die Zell-Suspension steht, die nach Tiefkühlkonservierung, Einfrieren, Lagerung für drei Monate und Auftauen und Einstellung der osmotischen Parameter nach dem Auftauen regeneriert wurde. Peak 1 steht für 10-Deacetylbaccatin; Peak 2 steht für 9-Dihydrobaccatin III; Peak 3 steht für Baccatin III; Peak 4 steht für 9-Dihydro-13-acetylbaccatin III; Peak 5 steht für Taxol; und Peak 6 steht für 2-Benzoyl-2-deacetylbaccatin. Wie aus den Fig. 5 und 6 ersichtlich ist, ist das Profil der Produktbildung im wesentlichen dasselbe in der Kontroll-Zell- Suspension und der regenerierten Zell-Suspension.

Beispiel 16

Genetische Stabilität von tiefkühlkonservierten und nicht-tiefkühlkonservierten Zellen

Zell-Linien wurden etabliert von einem einzigen Baum von Taxus chinensis var. mairer. Eine von diesen etablierten Zell-Linien wurde kultiviert, für ein Jahr tiefkühlkonserviert und aufgetaut. Eine genetische Analyse wurde an Zellen von dem ursprünglichen Baum und an tiefkühlkonservierten Zellen durchgeführt und so bestimmt, ob die Tiefkühlkonservierung die genetische Stabilität der Zellen beeinflußt hat. Kurz gesagt, wurden 10 ug der gesamten DNS von jeder Zell-Linie gewonnen und mit einem vierfachen Überschuß der Verdauungsmenge an Restriktionsendonuklease behandelt, und die Fragmente wurden der Größe nach mittels Agarosegel-Elektrophorese fraktioniert. Die der Größe nach fraktionierte DNS wurde auf einen festen Nitrocellulose-Träger übertragen und mit einer radio-markierten Nukleinsäure-Markierungssonde (Jeffrey's 33,6 Minisatellite-Markierungssonde) hybridisiert. Diese hinsichtlich des Bereichs hypervariable Sonde zeigt verschiedene Banden-Muster von DNS von 4 getrennten Bäumen in den Spuren 1 bis 4 von Fig. 7. Im Gegensatz dazu war das anfängliche Isolat (Spur A), für 1 Jahr kultivierte Zellen (Spur B) und für ein 1 Jahr tiefkühlkonservierte Zellen (Spur C) ein Jahr später genetisch identisch bei Zellen, die von demselben Baum isoliert worden waren (Spuren D und E). Die Tiefkühlkonservierung führte nicht zu irgendeiner durch diese Analyse nachweisbaren Mutation.

Beispiel 17

Stabilität von tiefkühlkonservierten Taxus-Zellen

Um zu bestimmen, ob die Länge der Tiefkühlkonservierung irgendeine Auswirkung auf die genetische Stabilität hat, wurden Taxus-Zell-Linien 1224 für eine Zeit von 1 h bis 6 Monaten eingefroren und im Hinblick auf ihre genetische Stabilität analysiert. DNS wurde von lebensfähigen Kulturen extrahiert, die nach Auftauen und Re-Etablieren von diesen tiefkühlkonservierten Zellen gewonnen worden waren. Ein 3,1 kb großer polymorpher Bereich des Genoms, der ribosomale codierende und nicht-codierende DNS des Kerns enthielt, wurde durch Polymerase-Kettenreaktion vervielfältigt und mit der Endonuklease DpnII verdaut. Die verdaute DNS wurde unter Anwendung von Gelelektrophorese der Größe nach sortiert und nach Anfärben mit Ethidiumbromid visualisiert. Die Ergebnisse der Analyse sind in Fig. 8 gezeigt. Die ursprüngliche Zell-Linie und eine nicht-tiefkühlkonservierte Zell-Linie wurden in den Spuren C bzw. D analysiert. Die zwei nicht miteinander verwandten Zell-Linien, die von nicht miteinander verwandten Bäumen gewonnen worden waren, zeigen ein unterschiedliches Verdauungsmuster. Im Gegensatz dazu wurde keine genetische Mutation an Zellen entdeckt, die für eine Stunde (Spur E), einen Tag (Spur F), eine Woche (Spur G), einen Monat (Spur H) oder 6 Monate (Spuren I und J) tiefkühlkonserviert worden waren. Das Bandenmuster dieser tiefkühlkonservierten und nicht-tiefkühlkonservierten Zellen war in allen Fällen identisch (Spuren C bis J).

Beispiel 18

Tiefkühlkonservierung von Tomaten-Zell-Linien

Für eine erfolgreiche Tiefkühlkonservierung von Tomaten-Zell-Linien wurden diesen Beladungs- und Vitrifikations-Lösungen nach und nach schrittweise zugesetzt, um einen osmotischen Schock zu verringern. Die Beladungs- und Vitrifikations-Lösungen umfaßten 30% (w/v) Glycerin, 15% (w/v) Ethylenglykol und 15% (w/v) Dimethylsulfoxid. Ohne schrittweise Zugabe wuchsen die Zellen nicht schnell nach der Wiedergewinnungs-Periode nach dem Auftauen. Die Wirkung der Lebensfähigkeit nach dem Auftauen und das erneute Wachstum nach dem Gewinnen wurden untersucht, und die Ergebnisse sind in Tabelle 20 gezeigt. Tabelle 20 Wirkungen der Bedingungen des Vorkultivierens auf die Lebensfähigkeit und das Wachstum nach der Rückgewinnung bei einer Tomaten-Zell-Linie
(-) = kein erneutes Wachstum von Callus nach der Gewinnung
(+) = leichtes Wachstum von Callus nach der Gewinnung
(++) = mäßiges Wachstum von Callus nach der Gewinnung
(+++) = kräftiges Wachstum von Callus nach der Gewinnung
Die höchsten Werte der Lebensfähigkeit (Überleben von Zellen) wurden erhalten, wenn die Zellen drei Tage lang in flüssigem Nährmedium vorkultiviert wurden, das 0,5 M Sucrose oder 0,3 M Sorbitol enthielt, und zwar ein Wert von 65% bzw. 70%. Diese Bedingungen der Vorkultivierung unterstützten auch ein kräftiges Wachstum von Zellen im Anschluß an ein Auftauen von Zellsuspensionen. Eine erfolgreiche Tiefkühlkonservierung hing auch von der Zeit der Vorkultivierung und der Konzentration des osmotischen Mittels ab. Eine Verlängerung der Zeitdauer der Vorkultivierung auf zehn Tage und eine Erhöhung der Konzentrationen an osmotischen Mitteln auf mehr als 0,8 M erhöhte die Lebensfähigkeit der Zellen nicht. Ohne Vorkultivierung überlebten die Zellen LN&sub2;-Temperaturen ebenfalls nicht, und zwar sowohl bei Verfahrensweisen des Ladens und Zusatzes einer Vitrifikationslösung in einem Schritt als auch bei Verfahrensweisen des schrittweisen Beladens und Zusetzens einer Vitrifikationslösung.
Die Lebensfähigkeit und das erneute Wachstum nach der Rückgewinnung wurde weiter verstärkt, indem man vorkultivierte Zellen einer Hitzeschock-Behandlung für bis zu 4 h aussetzte und indem man zweiwertige Kationen (CaCl&sub2;, MgCl&sub2;) zusetzte. Dieser Weg wurde auch erfolgreich bei der Tiefkühlkonservierung von Zell-Linien angewendet, die von Spezies von Lupinus, Sophora, Conospermum, Nicotiana und Solanum abgeleitet waren, sowie von den widerspenstigen Zell-Linien, die von verschiedenen Taxus- Spezies abgeleitet waren, wie beispielsweise Taxus chinensis. In vielen Beispielen war ein erneutes Wachstum von Zell-Linien dieser Pflanzen-Spezies makroskopisch 3 bis 4 Tage nach dem Pflanzen sichtbar, verglichen mit 6 bis 10 Tagen bei Anwendung von in einem Schritt ablaufenden Verfahrensweisen des Beladens und der Vitrifikation. Ein Waschen der Zell-Biomasse nach dem Auftauen mit flüssigem Medium, das Inhibitoren der Ethylen-Wirkung und Ethylen-Biosynthese-Inhibitoren enthielt, verbesserte weiter die Qualität der gewonnenen Zell-Linien. Raten der Überlebensfähigkeit von 90% wurden folgerichtig erhalten, und schnellere Wachstumsraten wurden beobachtet, nachdem Zell-Suspensionen von diesen Zell-Linien gebildet worden waren.

Beispiel 19

Einfluß der Behandlung mit Ethylen-Inhibitor nach dem Auftauen

Zell-Biomasse in Tiefkühl-Probengläsern wurde durch schnelles Erwärmen für 20 s bis 45 s in einem Wasserbad aufgetaut, dessen Temperatur auf 40ºC bis 60ºC festgesetzt worden war. Unmittelbar nach diesem Schritt wurde die verflüssigte Zellen-Biomasse in Tiefkühl-Probengläsern in eine sterile Zentrifuge überführt, die flüssiges Nährmedium mit einem osmotischen Mittel (Sucrose, Sorbitol oder Mannitol) in Konzentrationen, die im Bereich von 1 bis 2 mM lagen, und einen Ethyleninhibitor bei Konzentrationen enthielt, die im Bereich von 2 um bis 20 um lagen. Die Inhaltsstoffe würden leicht gemischt und auf einem Schüttler (Geschwindigkeit festgesetzt auf 120 Upm) 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Diesem Schritt folgte ein Schritt des Zentrifugierens und Übertragens der Zellen in einem Pellet auf zwei Schichten sterilen Filterpapiers, das auf einem Blotting-Papier angeordnet war (um die Entfernung überschüssiger Feuchtigkeit von den Zellen oder der Zell-Biomasse zu unterstützen). Die Zellen oder die Zell- Biomasse wurden für etwa 2 min inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde das obere Filterpapier mit Zellen anschließend auf ein festes Nährmedium übertragen, das ein osmotisches Mittel in sinkender Konzentration enthielt, die im Bereich von 0,8 M bis 0,1 M Sucrose lag (um eine osmotische Einstellung der Zelle zustande zu bringen). In jedem Schritt wurden Zellen auf einem Filterpapier für eine Zeit von ¹/&sub2; h bis 1 h inkubiert und letztlich auf ein normales festes Nährmedium ohne das Vorhandensein irgendeines zusätzlichen osmotischen Mittels überführt. Dieser Schritt wurde zweimal während der Zeit von 24 h wiederholt. Dem folgte die Inkubierung der Zell-Biomasse im Dunkeln bei 25ºC für 2 bis 3 Wochen, wobei einmal pro Woche Übertragungen durchgeführt wurden. Sobald sich das Wachstum der neuen Zell-Biomasse verstärkte, wurden Callus-Zellen von dem Filterpapier entfernt und direkt auf ein normales festes Nährmedium übertragen. Nachdem ausreichendes Wachstum stattgefunden hatte, wurde eine Zellsuspension in flüssigem Medium von dem etablierten Callus initiiert. Beobachtungen der Lebensfähigkeit von Zellen wurden zu verschiedenen Zeiten nach dem Auftauen gemacht, jedoch wurde die wichtigste Beobachtung allgemein aufgezeichnet. Zellen auf einem Filterpapier wurden auf ein normales festes Medium ohne das Vorhandensein irgendeines zusätzlichen osmotischen Mittels übertragen. Die Zellwachstumsrate nach der Gewinnung wurde während der ersten drei Wochen des Inkubierens der gesamten Biomasse auf einem Filter im Dunkeln bei 25ºC beobachtet.
Eine alternative Vorgehensweise, die mit dem Nach-Auftauen von Zellen oder Zell- Biomasse zusammenhing, war ebenfalls nützlich. Diese Verfahrensweise schloß anfangs das schnelle Waschen der Zellen mit einem flüssigen Medium ein, das ein osmotisches Mittel (Sucrose, Sorbitol oder Mannitol) enthielt, und zwar in einer Konzentration, die im Bereich zwischen 1 und 2 M lag, und zwar ohne Ethyleninhibitor. Dies erfolgte durch Inkubation von Zell-Biomasse für 2 bis 5 min in flüssigem Nährmedium, das ein osmotisches Mittel enthielt, und Zentrifugieren bei 100 g für die Zeit von 1 bis 3 min. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt, um toxische Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren von der Vitrifikationslösung zu entfernen, und dem folgte eine Inkubation von Zell-Biomasse für 30 min in flüssigem Nährmedium, das ein osmotisches Mittel und einen Ethyleninhibitor enthielt (Konzentrationsbereich: 2 bis 30 uM).
Ethyleninhibitoren sind Substanzen, die in die Ethylen-Produktion, den Ethylen- Metabolismus oder die Ethylen-Wirkung eingreifen. Sie können weiter klassifiziert werden als Antagonisten der Ethylen-Biosynthese und Antagonisten der Ethylen- Wirkung. Agonisten der Ethylen-Biosynthese sind Verbindungen, die in den Biosynthese-Weg zu Ethylen eingreifen. Beispiele von Enzymen im Bereich dieses Biosynthese- Wegs, die inhibiert werden, schließen ACC-Synthase, ACC-Oxidase und Ethylen- Oxidase ein. Beispiele von Antagonisten der Ethylen-Biosynthese schließen α- Aminoisobuttersäure, Acetylsalicylsäure, Methoxyvinylglycin, Aminooxyessigsäure und dergleichen ein. Beispiele von Antagonisten der Ethylen-Wirkung schließen Silber enthaltende Verbindungen, Silber-Komplexe oder Silber-Ionen, Kohlendioxid, 1- Methylcyclopropen, 2,5-Norbornadien, trans-Cycloocten, cis-Buten, Diazocyclopentadien und dergleichen ein. Geeignete Silbersalze schließen Silbernitrat, Silberthiosulfat, Silberphosphat, Silberbenzoat, Silbersulfat, das Silbersalz von Toluolsulfonsäure, Silberchlorid, Silberoxid, Silberacetat, Silberpentafluorpropionat, Silbercyanat, das Silbersalz von Milchsäure, Silberhexafluorpropionat, Silberhexafluorphosphat, Silbernitrit und das Tri-Silber-Salz von Citronensäure ein. Veranschaulichende Beispiele der Verstärkung der Taxan-Biosynthese durch eine Vielzahl von Silbersalzen sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt.
Die experimentellen Bedingungen bestanden aus einem flüssigen Nährmedium, das 1,25 M eines osmotischen Mittels und die passende Konzentration an SLTS enthielt. Das osmotische Mittel war Sucrose, Sorbitol oder Mannitol. Die Bedingungen des Kontrollversuchs bestanden aus einem flüssigen Nährmedium, das 1,25 M eines osmotischen Mittels enthielt, jedoch kein SLTS. Die Ergebnisse sind in Tabelle 21 gezeigt und geben das Ausmaß des Wachstums von Callus-Zellen und die prozentuale Gewinnungsrate an. Tabelle 21 Einfluß der Behandlung (nach dem Auftauen) mit einem Ethyleninhibitor - Silberthiosulfat (SLTS) - auf die Lebensfähigkeit und das Wachstum von Zellen nach der Gewinnung
(+) = moderates Wachstum nach der Gewinnung mit sichtbarem Zellwachstum in zwei Wochen
(++) = kräftiges Wachstum nach der Gewinnung mit sichtbarem Zellwachstum in 6 bis 10 Tagen
(+++) = kräftiges Zellwachstum nach der Gewinnung mit sichtbarem Zellwachstum in 3 bis 4 Tagen
Die Behandlung von Zellen nach dem Auftauen mit flüssigem Medium, das einen Ethyleninhibitor enthielt, verbesserte folglich die Lebensfähigkeit und Wachstumsrate von gewonnenen Zell-Linien. Silberthiosulfat in Konzentrationen, die im Bereich von 4 uM bis 10 uM lagen, war besser wirksam als Konzentrationen von 2 uM und 20 uM zur Verstärkung der Wachstumsraten von gewonnenen Zell-Linien. Es wurden Lebensfähigkeitswerte bis zu 90% erhalten, abhängig von der verwendeten Zell-Linie. Nach dem Auftauen verwendetes flüssiges Zellmedium, das SLTS in Konzentrationen von 8 uM und 10 uM enthielt, förderte das Zellwachstum viel kräftiger, und ein Zellwachstum war 3 bis 4 Tage nach Verpflanzen der Zellen auf ein Nährmedium frei von osmotischem Mittel und Ethyleninhibitor makroskopisch sichtbar.

Claims

1. Verfahren zur Tiefkühlkonservierung einer Pflanzenzelle, umfassend eine Kombination von Behandlungsschritten wie folgt:

(a) Behandlung der Pflanzenzelle durch Lyophilisieren der Pflanzenzelle, mittels Wärmeschock oder durch Vorbehandeln der Pflanzenzelle mit einem Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren und einem Stabilisator, der ein Oxidationsinhibitor, ein Fänger für Sauerstoffradikale, ein zweiwertiges Kation, ein Ethyleninhibitor, eine Verbindung, die sich in die Lipid-Doppelschicht der Zelle interkaliert (beispielsweise ein Sterol, ein Phospholipid, ein Glycolipid oder ein Glycoprotein) oder eine Kombination daraus ist;

(b) Vitrifizieren der Pflanzenzelle in einer vitrifizierenden Lösung; und

(c) Frieren der vitrifizierten Pflanzenzelle bei einer Tiefkühlkonservierungs- Temperatur.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin

(i) die Behandlung eine Vorbehandlung mit einem Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren und einem Stabilisator umfaßt und das Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren eine Substanz umfaßt, die gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus DMSO, Propylenglycol, Glycerin, Polyethylenglycol, Ethylenglycol, Butandiol, Formamid, Propandiol, Sorbitol, Mannitol und Mischungen daraus; oder

(ii) die vitrifizierende Lösung eine Substanz umfaßt, die aus der genannten Gruppe gewählt ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Behandlung die Vorbehandlung mit einem Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren und einem Stabilisator umfaßt, der gewählt ist aus reduziertem Glutathion, Tetramethylharnstoff, Tetramethylthioharnstoff, Dimethylformamid, Mercaptopropionylglycin, Mercaptoethylamin, Selenomethionin, Thioharnstoff, Dimercaptopropanol, Ascorbinsäure, Cystein, Natriumdiethyldithiocarbamat, Natriumthiosulfat, Silberthiosulfat, Propylgallat, Spermin, Spermidin und Kombinationen und Derivaten davon.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Behandlung eine Vorbehandlung mit einem Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren und einem Stabilisator oder das Verfahren nach Anspruch 3 umfaßt, worin der Stabilisator als wäßrige Lösung mit einer Konzentration im Bereich von etwa 1 uM bis 10 mM verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin die Behandlung eine Vorbehandlung mit einem Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren und einem Stabilisator oder das Verfahren von Anspruch 3 oder Anspruch 4 umfaßt, worin die Behandlung durchgeführt wird bei einer verringerten Temperatur für einen ersten Zeitabschnitt und das Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren ein vitrifizierendes Mittel umfaßt und worin der Schritt des Vitrifizierens das Inkubieren der Pflanzenzelle in der vitrifizierenden Lösung umfaßt, die eine erhöhte Konzentration des vitrifizierenden Mittels enthält, für einen zweiten Zeitabschnitt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der erste Zeitabschnitt im Bereich von etwa 1 h bis etwa 7 Tagen liegt und/oder der zweite Zeitabschnitt im Bereich von etwa 30 min bis etwa 2 h liegt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, worin den Schritten der Lyophilisation oder des Wärmeschocks ein Schritt des Kultivierens der Zelle mit einem osmotischen Mittel vorausgeht, wobei das osmotische Mittel gegebenenfalls Fructose, Glucose, Maltose, Mannitol, Sorbitol, Sucrose, Trehalose und/oder Prolin umfaßt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, welches weiter das Beladen der Pflanzenzelle mit einem Beladungsmittel umfaßt, bevor diese gefroren wird.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Beladen und Vitrifizieren im wesentlichen gleichzeitig durchgeführt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 4 bis 9, worin die Vorbehandlung mit einem Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren und einem zweiwertigen Kation den Zusatz des zweiwertigen Kations zu der vitrifizierenden Lösung einschließt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, welches weiter den Schritt des Akklimatisierens der stabilisierten Pflanzenzelle an eine verringerte Temperatur umfaßt, wobei die verringerte Temperatur gegebenenfalls im Bereich von etwa 1ºC bis etwa 15ºC liegt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, worin die Vorbehandlung das Kultivieren der Pflanzenzelle in einem Medium, das ein Beladungsmittel und den Stabilisator enthält, für eine Zeit zwischen etwa 1 h und etwa 7 Tagen bei etwa Raumtemperatur einschließt.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 8, 9 oder 12 oder nach den Ansprüchen 10 oder 11, wenn diese von Anspruch 8 oder 9 abhängig sind, worin das Beladungsmittel ein Zucker, eine Aminosäure oder eine Kombination daraus ist, wobei der Zucker gegebenenfalls einen oder mehrere Zucker umfaßt, die gewählt sind aus Fructose, Glucose, Maltose, Mannitol, Sorbitol, Sucrose, Trehalose und Derivaten davon.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin das Beladen und/oder das Vitrifizieren durchgeführt wird/werden (i) in einem einzigen Schritt; oder (ii) in einer Mehrzahl von Schritten, wobei die Mehrzahl von Schritten gegebenenfalls das fünfmalige Zusetzen eines Mittels zum Schutz beim Tiefgefrieren zu der Pflanzenzelle in Intervallen von einer Minute umfaßt.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, worin die Pflanzenzelle eine Nacktsamer-Zelle ist oder eine Bedecktsamerzelle ist, die eine Monocotyledonen- Pflanzenzelle oder eine Dicotyledonen-Pflanzenzelle ist, wobei die Monocotyledonen-Pflanzenzelle gegebenenfalls gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Zellen der Spezies der Genus Avena, Cocos, Dioscorea, Hordeum, Musa, Oryza, Saccharum, Sorghum, Triticum und Zea.

16. Verfahren nach Anspruch 15, worin die Dicotyledonen-Pflanzenzelle gewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus Zellen der Spezies der Genus Achyrocline, Atropa, Brassica, Berberis, Capsicum, Catharanthus, Conospermum, Datura, Daucus, Digitalis, Echinacea, Eschscholtzia, Glycine, Gossypium, Hyoscyamus, Legume, Lupinus, Lycopersicum, Malus, Medicago, Nicotiana, Panax, Pisum, Rauvolfia, Ruta, Solanum, Sophora und Trichosanthes und der Nacktsamer eine Spezies aus der Gruppe Abies, Cypressus, Ginkgo, Juniperus, Picea, Pinus, Pseudotsuga, Sequoia, Taxus, Tsuga oder Zamia ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, worin die Taxus-Spezies ist: T. baccata, T. brevifolia, T. canadensis, T. chinensis, T. cuspidata, T. floridana, T. globosa, T. media, T. nucifera oder T. wallichiana.

18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, worin die Pflanzenzelle erhalten wird aus neu gewachsenen Nadeln, Borke, Blättern, Stengeln, Wurzeln, Rhizomen, Callus-Zellen, Protoplasten, Zell-Suspensionen, Meristemen, Samen oder Embryos.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, worin mehr als etwa 50% der durch das Verfahren tiefkühlkonservierten Pflanzenzellen in lebensfähigem Zustand gewonnen werden können und worin gegebenenfalls mehr als 70% oder mehr als 80% derartiger Pflanzenzellen in einem lebensfähigen Zustand gewonnen werden können.

20. Verfahren nach Anspruch 19, worin die Zellen durch die Tiefkühlkonservierung nicht signifikant genetische oder phänotypisch verändert werden.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder Anspruch 20, worin die Pflanzenzellen der Taxus- Spezies angehören, wobei die Taxus-Zellen gegebenenfalls ein Diterpenoid exprimieren, insbesondere Taxol.

22. Verfahren nach Anspruch 21, worin die Expression des Diterpenoids durch die Tiefkühlkonservierung nicht signifikant verändert wird.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, welches das Bilden einer Keimzellbank der tiefkühlkonservierten Pflanzenzellen umfaßt, wobei mehr als etwa 50% der Pflanzenzellen in einem lebensfähigen Zustand gewonnen werden können und gegebenenfalls mehr als 70% oder mehr als 80% der Pflanzenzellen in lebensfähigem Zustand gewonnen werden können.

24. Verfahren zum Gewinnen tiefkühlkonservierter Pflanzenzellen, umfassend eine Kombination aus Verfahrensschritten wie folgt:

(a) Auftauen der tiefkühlkonservierten Pflanzenzellen auf eine Temperatur oberhalb des Gefrierpunkts;

(b) Inkubieren der aufgetauten Pflanzenzellen in einem Wachstumsmedium, das einen Stabilisator oder ein Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren und einen Stabilisator enthält, wobei der Stabilisator ein Oxidationsinhibitor, ein Fänger für Sauerstoff-Radikale, ein Ethylen-Inhibitor, eine Verbindung, die sich in die Lipid-Doppelschicht der Zelle interkaliert (beispielsweise ein Sterol, ein Phospholipid, ein Glycolipid oder ein Glycoprotein), ein divalentes Kation oder eine Mischung daraus ist; und

(c) Gewinnen lebensfähiger Pflanzenzellen.

25. Verfahren nach Anspruch 24, worin das Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren ist

(i) ein Zucker, eine Aminosäure oder eine Mischung daraus; oder

(ii) gewählt ist aus Sorbitol, Mannitol, Sucrose, Trehalose, Prolin und Mischungen daraus.

26. Verfahren nach Anspruch 24 oder Anspruch 25, welches weiter vor Schritt (c) den Schritt des Entfernens des Mittels zum Schutz beim Tiefgefrieren einschließt und gegebenenfalls, worin der Schritt des Entfernens mehrere Schritte des Waschens osmotisch eingestellter Zellen mit dem Wachstumsmedium umfaßt, das sinkende Konzentrationen des Mittels zum Schutz beim Tiefgefrieren enthält, und/oder worin das Mittel zum Schutz beim Tiefgefrieren entfernt wird nach einer bestimmten Zeitdauer und die Inkubation von Pflanzenzellen in Wachstumsmedium und in Suspension fortgesetzt wird.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, worin der Ethylen-Inhibitor ist

(i) ein Ethylen-Biosynthese-Inhibitor, der gegebenenfalls gewählt ist aus Spermidin, Spermin, Katechol, n-Propylgallat, Hydrochinon, Ferulasäure, Alar, Phenylethylamin, Salicylalkohol, Indomethacin und Kombinationen daraus, oder

(ii) ein Inhibitor der Ethylen-Wirkung, wobei der Inhibitor der Ethylen-Wirkung gegebenenfalls ein Silbersalz ist und das Silbersalz gegebenenfalls gewählt ist aus Silberthiosulfat, Silbernitrat, Silberchlorid, Silberacetat, Silberphosphat, Silbersulfat, Silbernitrit und Kombinationen daraus.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, worin das zweiwertige Kation Calcium, Magnesium oder Mangan ist.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 28, worin der Stabilisator gewählt ist aus reduziertem Glutathion, Tetramethylharnstoff, Tetramethylthioharnstoff, Dimethylformamid, Mercaptopropionylglycin, Mercaptoethylamin, Selenomethionin, Thioharnstoff, Dimercaptopropanol, Natriumthiosulfat, Silberthiosulfat, Ascorbinsäure, Cystein, Natriumdiethyldithiocarbamat, Spermin, Spermidin, Propylgallat und Kombinationen und Derivaten davon.

30. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, worin das Inkubieren und Gewinnen in einem flüssigen Medium durchgeführt werden.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, worin das Inkubieren auf einem halb-festen Medium durchgeführt wird.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, worin die aufgetauten Pflanzenzellen in Suspension inkubiert werden und die lebensfähigen Pflanzenzellen in Suspension gewonnen werden.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 32, worin die gewonnenen Pflanzenzellen auf ein halb-festes Medium überführt werden.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 33, worin die gewonnenen lebensfähigen Pflanzenzellen ein Diterpenoid exprimieren und die Diterpenoid-Expression durch eine Tiefkühlkonservierung nicht signifikant verändert wird und/oder worin mehr als etwa 50% der gewonnenen Pflanzenzellen lebensfähig sind und gegebenenfalls worin mehr als etwa 70% der gewonnenen Pflanzenzellen lebensfähig sind oder mehr als etwa 80% der gewonnenen Pflanzenzellen lebensfähig sind.

35. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 34, welches weiter den Schritt des Tiefkühlkonservierens der Pflanzenzellen nach dem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18 umfaßt.

36. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 35, worin von den gewonnenen Pflanzenzellen mehr als etwa 50% lebensfähig sind und gegebenenfalls von diesen mehr als etwa 70% lebensfähig sind oder von diesen mehr als etwa 80% lebensfähig sind.

37. Verfahren nach Anspruch 36, worin die Pflanzenzellen Zellen einer Spezies von Taxus sind und/oder in Suspension vorliegen.

38. Verfahren zur Herstellung eines Pflanzen-Produktes, umfassend:

(A) Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 18 und Gewinnen einer lebensfähigen Pflanzenzelle; oder Durchführen des Verfahrens nach einem der Ansprüche 24 bis 35;

(B) Fortpflanzen der Zellen oder Pflanzen aus der resultierenden lebensfähigen Zelle; und

(C) Gewinnen eines Pflanzenproduktes, das von dem fortgepflanzten Material erzeugt wird.

39. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 38 zur Herstellung eines Diterpenoids, worin das Diterpenoid gegebenenfalls Taxol ist, für chemotherapeutische Zwecke.