DE69628936T2

DE69628936T2 - Test zur identifikation von inhibitoren der interaktion zwischen p53 und dm2 proteinen

Info

Publication number: DE69628936T2
Application number: DE69628936T
Authority: DE
Inventors: Patrick Chene; Heinz-Kurt Hochkeppel
Original assignee: Cancer Research Technology Ltd
Current assignee: Cancer Research Technology Ltd
Priority date: 1995-09-18
Filing date: 1996-09-10
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2016-09-11
Also published as: WO1997011367A1; AU7127296A; ZA967826B; EP0859956B1; ATE244403T1; EP0859956A1; DE69628936D1; US6492116B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft einen Test zum Testen von Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen den Proteinen p53 und hdm2.
Das Protein, für das das "human double minute 2"-Gen, hdm2, kodiert, bildet sowohl in vitro als auch in vivo einen Komplex mit dem Tumorsuppressorgenprodukt p53. Bei manchen Krebsarten beim Menschen wird hdm2 überexprimiert und bindet einen Großteil des zellulären p53. Die Bildung dieses Komplexes begünstigt Nukleoplasma-Transformation, da das komplexierte p53 die Tumorsuppressoraktivität verliert. Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen p53 und hdm2 verhindern, setzen p53 frei, wodurch seine Tumorunterdrückungsaktivität innerhalb dieser krebsartigen Zellen gefördert wird. Ähnliche Ergebnisse konnten auch bei Tierkrebszellen, z. B. bei Mäusen, erzielt werden. Das Mäuse-Homolog für hdm2 ist mdm2.
Das Dokument WO 93/20238 offenbart die Entdeckung eines menschlichen Gens, das bei menschlichen Tumorzellen genetisch verändert ist. Die genetische Veränderung ist Gen-Amplifizierung und führt zu einer entsprechenden Zunahme der Genprodukte. Die Detektion, dass das Gen mit der Bezeichnung hMDM2 amplifiziert worden ist, oder Detektion der erhöhten Expression von Genprodukten stellt eine Diagnose von Tumorgenese dar. Dadurch bindet sich Human-MDM2-Protein an Human-p53 und ermöglicht es den Zellen, p53-reguliertem Wachstum zu entkommen.
Das Dokument EP-A-0.518.650 offenbart, dass spezifische Sequenzen im menschlichen Genom die Orte starker Bindung von p53-Protein der Wildform sind, nicht aber mutierte Formen des Proteins. Diese Sequenzen werden diagnostisch eingesetzt, um Zellen zu detektieren, in denen die Menge an p53 der Wildform verringert ist. Die Sequenzen können auch eingesetzt werden, um auf Mittel zu screenen, die den Verlust von p53 der Wildform an DNA in Krebszellen ausgleichen.
Um Inhibitoren der p53-hdm2-Wechselwirkung zu suchen, kann ein primärer Bindungstest mit hohem Durchsatz, beispielsweise ELISA, eingesetzt werden, um Verbindungen zu selektieren und ein medizinisches Chemieprogramm in Gang zu setzen. Tests, die für ein solches primäres Screenen der p53-dm2-Bindung eingesetzt werden können, haben jedoch den Nachteil, dass Artefakte auftreten können, d. h. wegen der Artefakt-Ergebnisse aufgrund der chemischen Eigenschaften der getesteten Substanzen falsche positive Reaktion erzielt werden können.
Außerdem können Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen p53 und hdm2 hemmen, auch die p53-spezifische DNA-Bindung verändern, was eine völlig unerwünschte Wirkung ist, da die DNA-Bindung eine Vorbedingung für p53-Tumorsuppressoraktivität ist.
Außerdem können Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen p53 und hdm2 hemmen, auch die p53-spezifische DNA-Bindung verändern, was eine vollkommen unerwünschte Wirkung ist, da die DNA-Bindung eine Vorbedingung für p53-Tumorsuppressoraktivität ist.
Beispielsweise ist p53 empfindlich für mehrere chemische Mittel, die seine Aktivität hemmen. Das Hauptkriterium für die Aktivität von p53 ist die DNA-Bindung, die zeigt, dass das Protein richtig gefaltet und nicht aggregiert oder ungefaltet ist. Verbindungen, die wie Metallchelatbildner p53 fällen, können als echte Inhibitoren der p53-hdm2-Wechselwirkung in einem klassischen Bindungstest betrachtet werden, da das gefällte p53 keine Komplexe bilden kann.
Daher ist weiteres Testen der Auswirkung der Substanz auf die p53-DNA-Bindung wichtig, da Verbindungen, die die p53-DNA-Bindung hemmen, keine guten Kandidaten für therapeutische Zwecke sind. Jedoch ist es bei einem Test mit hohem Durchsatz nicht möglich zu testen, ob eine Verbindung, die die p53-hdm2-Wechselwirkung hemmt, die p53-spezifische DNA-Bindung verhindert oder die p53-Ausbildung stört, so dass p53 die gewünschte biologische Funktion nicht mehr erfüllen kann.
Um diese beiden Probleme zu vermeiden und ein Chemieprogramm auf Basis von Leitverbindungen mit höherer Relevanz zu beginnen, ist der Einsatz eines guten Bestätigungstests entscheidend.
Ein Bestätigungstest gemäß vorliegender Erfindung könnte beispielsweise eine Gelshift-Analyse sein. Ein Gelshift eines p53-DNA-Komplexes in einem Agarosegel nach der Inkubation mit Adenovirus E1B-Protein wird von Yew et al. [Genes & Dev. 8, 190–202 (1994)] beschrieben.
Von Wang et al. [PNAS 91, 2230–2234 (1994)] wird die Detektion der Bindung von HB-Virus X-Protein an p53 durch Messen der Hemmung von p53-DNA-Bindung beschrieben. Jedoch beschreibt keine der Veröffentlichungen nach dem Stand der Technik einen Test, bei dem die DNA-Bindungseigenschaft von p53 beibehalten wird, wenn p53 mit einem dm2-Protein komplexiert wird.
Bisher sind alle In-vitro-Tests, die in der Literatur für die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen p43 und hdm2 beschrieben worden sind, Immunfüllungstests zum Testen der Bindung von hdm2 an p53 (Leng et al., Oncogene 10, 1275 (1995)]. Keiner dieser Tests zeigt gleichzeitig, dass sich hdm2 an p53 bindet und seine spezifische DNA-Bindung nicht stört.
Gemäß vorliegender Erfindung wurde überraschenderweise festgestellt, dass p53-DNA-Bindung nach der Komplexbildung mit hdm2 beibehalten wird und dass es möglich ist, in ein und demselben zuverlässigen Test die Wirkung einer Substanz auf p53-hdm2-und p53-DNA-Bindung gleichzeitig zu messen.
Ziel der Erfindung
Es ist ein Ziel der Erfindung, ein zuverlässiges Testverfahren für Verbindungen bereitzustellen, die die Bildung von Komplexen zwischen hdm2 und p53 hemmen, die aber die Bindung von DNA an p53 nicht hemmen oder die p53-Konformation stören, so dass p53 seine gewünschte biologische Funktion nicht mehr erfüllen kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Test, der die Identifizierung von Verbindungen ermöglicht, die die Bildung von Komplexen zwischen einem Produkt des dm2-Gens, beispielsweise menschlichem hdm2 oder Mäuse-mdm2, und p53, aber nicht zwischen p53 und DNA hemmen. Sowohl die Komplexbildung von markierter DNA, C-terminal verkürztem p53 und dm2 als auch die Herauslösung von dm2 aus dem markierten DNA-p53-Komplex durch einen Inhibitor der p53-dm2-Wechselwirkung kann durch ein Gelshift-Analyseverfahren detektiert werden. Dieser Test ermöglicht die Selektion von Verbindungen, die abgesehen von ihrer Hemmeigenschaft die p53-spezifische DNA-Bindung nicht verändern und die p53-Konformation nicht stören, die für die DNA-Bindung oder Bildung von aktivem Tetramer erforderlich sind.
Die Erfindung betrifft weiters ein Testset zum Testen der Wirkung einer Substanz auf die Bindung eine dm2-Proteins an p53, umfassend (a) ein p53 oder funktionelles Äquivalent davon, das DNA-Bindungs-, Oligomerisations- und hdm2-Bindungseigenschaften aufweist, (b) ein hdm2 oder funktionelles Äquivalent davon, das die p53-Bindungsdomäne aufweist, und (c) eine DNA-Sequenz, die sich spezifisch an die p53-Bindungsdomäne bindet.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Testverfahren für eine Substanz, die die Bildung eines Komplexes zwischen p53 und einem Produkt des dm2-Gens, beispielsweise menschlichem (h-) dm2 oder Mäuse- (m-) dm2, hemmt, während sie die Bildung eines Komplexes zwischen p53 und DNA nicht hemmt. Das Verfahren umfasst das Messen der Komplexbildung in einem Gemisch aus p53, dm2 und an p53 bindender DNA in Gegenwart und Abwesenheit einer zu testenden Substanz. In Gegenwart der gewünschten Eigenschaft der getesteten Substanz wird ein Komplex zwischen p53 und DNA ge bildet ("Doppelkomplex"), während in Abwesenheit der gewünschten Eigenschaft entweder ein Komplex zwischen p53, DNA und dm2 ("Dreifachkomplex"; wenn keine Hemmaktivität vorliegt) oder kein Komplex (wenn die getestete Verbindung sowohl die dm2-p53- als auch die p53-DNA-Komplexbildung hemmt oder wenn die getestete Substanz die p53-Ausbildung zerstört, so dass es sich um keine DNA-Bindung mehr handelt). Während sich jedes Verfahren, mit dem es möglich ist, zwischen den verschiedenen Zuständen (Dreifachkomplex, Doppelkomplex, kein Komplex) zu unterscheiden, dazu eignet, den erfindungsgemäßen Test durchzuführen, ist der durchgeführte Test bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung eine Gelshift-Analyse.
So umfasst das Testsystem im Wesentlichen ein p53, ein dm2 und DNA. Während die Verwendung der menschlichen Proteine oder aktiver Varianten davon am meisten bevorzugt wird, ist die Erfindung nicht auf die Verwendung der menschlichen Proteine beschränkt. Es können auch die entsprechenden Proteine von anderen Spezies, beispielsweise von der Maus, verwendet werden. Es wird jedoch vorgezogen, dass das im Test verwendete p53- und dm2-Protein von derselben Spezies stammen.
Zur Durchführung der vorliegenden Erfindung muss p53-Protein verendet werden, das sich sowohl an DNA als auch dm2 binden kann.
p53 gemäß vorliegender Erfindung kann eine rekombinante Form von p53 oder aus dem Ursprungsorganismus gereinigt sein. Es ist jedoch nicht erforderlich, ein p53 voller Länge zu verwenden, um die vorliegende Erfindung durchzuführen. Demgemäß ist mit der hierin verwendeten p53-Form auch jegliche geeignete Variante oder jegliches geeignete Fragment von p53, vorzugsweise von menschlichem p53, gemeint. Die Merkmale einer solchen geeigneten Variante oder eines Fragments gehen aus der nachfolgenden Beschreibung klar hervor.
Zur DNA-Bindung muss p53 in der Lage sein, Tetramerkomplexe zu bilden. Folglich müssen für die DNA-Bindung sowohl die aktive p53-DNA-Bindungsdomäne (z. B. die Reste 102–292 von p53) als auch eine p53-funktionelle Oligomerisationsdomäne (z. B. die Reste 325–356 von p53) in der gemäß vorliegender Erfindung verwendeten p53-Form vorhanden sein. Um die DNA-Bindungseigenschaften von p53 zu verbessern, kann das Protein durch Wechselwirkung mit einem spezifischen Antikörper (beispielsweise dem nach dem Stand der Technik bekannten monoklonalen Antikörper Pab421, der sich an den Aminosäureabschnitt zwischen Aminosäure 372 und 380 des menschlichen p53 bindet), Phosphorylierung durch Kinasen (Casein-Kinase II, die Ser392 von menschlichem p53 phosphoryliert, oder Protein-Kinase C, die Ser 370 und Ser 375 von menschlichem p53 phosphoryliert) oder, was eher bevorzugt wird, durch Verkürzung seines C-Terminus (Deletion von maximal 38 Aminosäuren des C-Terminus der natürlichen p53-Sequenz) aktiviert werden. Ein Beispiel für Letzteres ist p53D30, d. h. natürliches p53, dem die C-terminalen 30 Aminosäuren fehlen, wie in den nachstehenden Beispielen verwendet (Seq.-ID Nr. 1 und 2).
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann ein p53-DNA-Komplex zur Untersuchung von Inhibitoren von dm2-p53-Wechselwirkung auch unter Verwendung von DNA-Elementen mit Bindung mit hoher Affinität (wie die in Kern et al., Science 252, 1708 (1991), und Halazonetis et al., EMBO J. 12, 1021 (1993), beschriebenen RGC- bzw. BC-Sequenzen) erhalten werden.
p53 kann direkt aus verschiedenen Quellen (beispielsweise aus Bakterien-, Baculovirusoder Säugetierzellen) gereinigt werden.
Um Komplexe mit hdm2 bilden zu können, enthält ein menschliches p53, das zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung geeignet ist, die Reste 1 bis 52, mehr bevorzugt die Reste 18 bis 23, noch mehr bevorzugt die Reste 19, 22 und 23, der natürlichen p53-Sequenz.
Die Konzentration von p53, die gemäß vorliegender Erfindung bevorzugt eingesetzt wird, hängt von der im Test verwendeten Menge an dm2 ab. Normalerweise wird ein fünffacher Überschuss an dm2-Protein eingesetzt. Ein sehr klares Signal bei der Detektion radioaktiver Markierungen wird mit etwa 50 bis 100 ng p53D30 erhalten. Es ist jedoch auch möglich, größere Mengen zu verwenden, wenn es möglich ist, in der Testanalyse zu tolerieren, dass einige der Proteine gefällt werden.
Ein dm2-Protein zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung kann entweder die Form voller Länge oder eine verkürzte Form oder ein beliebiges Hybridprotein sein, das die minimale p53-Bindungdomäne von dm2 enthält. Mit dm2 ist im Kontext der vorliegenden Erfindung bevorzugt ein dm2 von derselben Spezies gemeint, von dem das im Test verwendete p53 stammt. Insbesondere, wenn menschliches p53 verwendet wird, wird ein menschliches dm2 (hdm2) oder ein Analog davon, das die minimale p53-Bindungsdomäne enthält, verwendet, und wenn Mäuse-p53 verwendet wird, wird ein Mäuse-dm2 (mdm2) oder ein Analog davon verwendet, das die minimale p53-Bindungsdomäne enthält. Für hdm2 wurde bisher die Region von Rest 1 bis Rest 102 der natürlichen Sequenz als minimale p53-Bindungsdomäne identifiziert. Beispielsweise kann gemäß einer Ausführungsform der Erfindung ein Fusionsprotein, das aus den N-terminalen 18 Aminosäuren von hdm2 (die die p53-Bindungsdomäne umfassen) und Glutathion-S-Transferase voller Länge von Schistosoma japonicum besteht, wie in den Beispielen hergestellt (hierin als G-M-Fusionsprotein bezeichnet), für den Test verwendet werden. Das Fusionsprotein ist durch Expression der DNA, die für die N-terminalen 188 Aminosäuren von hdm2 (Seq.-ID Nr. 3 und 4) kodiert, im Expressionsvektor pGEX-2T (Pharmacia) erhältlich.
Beim DNA-Element des Testsystems kann es sich um jedes DNA-Fragment handeln, das sich spezifisch an p53 bindet, z. B. eines, das ein degeneriertes oder nicht degeneriertes p53-Bindungselement enthält. Es kann sich um ein synthetisches Oligonucleotid, ein aus lebenden Organismen isoliertes DNA-Fragment oder ein in ein Plasmid eingefügtes DNA-Element handeln.
Das optimale Verhältnis zwischen p53 und hdm2 kann auch In Abhängigkeit von der Reinheit und spezifischen Bindungsaktivität der verwendeten Proteine variieren und sollte daher für jede verwendete Proteinvariante bestimmt werden.
Für den Fall, dass eine Gelshift-Analyse durchgeführt wird, sollte das DNA-Element so beschaffen sein, dass eine DNA-Bande detektiert werden kann, die im Gel die Lage ändert, wenn die DNA zur Detektion mit p53 inkubiert wird. Zur Detektion kann das DNA-Element entweder strahlenmarkiert oder möglicherweise nach einem nicht radioaktiven Verfahren markiert sein.
Um ein zufrieden stellendes Detektionssignal zu erhalten, sollte p53 mit DNA gesättigt sein. Beispielsweise beträgt die K_D von p53 voller Länge, das mit Antikörper Pag421 aktiviert wurde, etwa 5 × 10^–10 M.
Für 50 ng des in den Beispielen verwendeten p53D30 sollten 0,1 bis 0,5 pMol DNA ausreichen.
Für die Gelshift-Analyse kann das Gel ein Agrosegel oder vorzugsweise ein natives Polyacrylamidgel sein, vorzugsweise ein solches, das 4 bis 5% Acrylamid aufweist.
Beim Puffer kann es sich um jeden beliebigen Puffer handeln, in dem p43 für spezifische DNA-Bindung aktiv ist, da der Komplex p53-DNA weniger stabil ist als der p53-hdm2-Komplex. Bevorzugte Puffer sind HEPES in einer Konzentration von 20 bis 50 mM oder gepufferte Tris-Lösung in einer Konzentration von 10 bis 50 mM.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der pH des Puffers 7,1 bis 8,0. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist im Puffer ein Salz enthalten. Wenn ein Salz verwendet wird, sollte es vorzugsweise 40 bis 100 mM KCl oder 50 bis 175 mM NaCl sein. Darüber hinaus kann der Puffer gegebenenfalls eine Substanz enthalten, die aus Glycerin (bis zu 20%), DTT (bis zu 0,5 mM), MgCl₂ (z. B. etwa 6 mM), ZnSO₄ (z. B. etwa 0,1 mM); ZnOAc (z. B. etwa 0,1 mM), Detergens NP40 (bis zu 0,1%), Triton X-100 (bis zu 0,1%), Rinderserumalbumin (bis zu 1 mg/min), EDTA (bis zu 1 mM) und einer Kompetitor-DNA, z. B. Poly-dl-dC, Poly-dA-dT oder Lachssperma-DNA, beispielsweise in einer Konzentration von 25 bis 100 μg/ml, ausgewählt wird.
Die Erfindung betrifft weiters ein Testset zum Testen der Wirkung einer Substanz auf die Bindung eines dm2-Proteins an p53, wobei das Testset im Wesentlichen (a) ein p53 oder funktionelles Äquivalent davon, das DNA-Bindungs-, Oligomerisations- und hdm2-Bindungseigenschaften aufweist, (b) ein hdm2 oder funktionelles Äquivalent davon, das die p53-Bindungsdomäne aufweist, und (c) eine DNA-Sequenz umfasst, die sich spezifisch an die p53-Bindungsdomäne bindet. Die bevorzugten Bestandteile des Testsets sind die oben angeführten. Das Testset enthält gegebenenfalls Anleitungen für seine Verwendung.
Die folgenden Beispiele sind veranschaulichend, sollten jedoch nicht als Einschränkung der vorliegenden Erfindung aufgefasst werden.
Beispiele
A) Materialien
Molekularbiologiereaktanden wurden von Promega angekauft, mit Ausnahme von Pfu-Polymerase, das von Stratagene erhalten wurde, des pGEX-2T-Vektors von Pharmacia Biotech und des pET-3a-Vektors von Novagen. Immunologische Mittel wurden von Oncogene Science erstanden. Polydesoxyinosin-desoxycytidylsäure wurde von Sigma erhalten, und [³³P]γ-Adenosintriphosphat (ATP) von Amersham. Die synthetischen Oligonucleotide werden in einer gereinigten und entsalzten Form von Microsynth angekauft. Alle anderen Chemikalien stammen von Merck.
B) Molekularbiologie
Die DNA-Region des hdm2-Gens, die für die ersten 188 Aminosäuren des Proteins kodiert, wird durch "Polymerase Chain Reaction"- (PCR-) Amplifizierung des hdm2-Gens erhalten. Die für PCR verwendeten Oligonucleotide wird so konstruiert, dass eine Bam-HI-Restriktionsstelle am 5'-Ende des Gens und eine EcoRl-Restriktionsstelle an seinem 3'-Ende eingeführt wird (siehe hdm2-Primer I und II mit Seq.-ID-Nr. 8 bzw. 9). Die mit BamHl und EcoRl verdauten PCR-Fragmente werden mit einem Bahl/EcoRl-gespaltenen pGEX-2T-Vektor ligiert. Der resultierende Vektor umfasst ein Fusionsgen, das aus der Sequenz voller Länge von Glutathion-S-Transferase von S. japonicum, einer Linkersequenz und den N-terminalen 188 Aminosäuren von hdm2, in der 5'→3'-Reihenfolge besteht. Das komplette Gen wird an beiden Strängen sequenziert, und das rekombinante Plasmid wird in E.coli-Stamm BL21 (Novagen) eingeführt.
Glutathion-s-Transferase-Protein (für Kontrollversuche) wurde von E.coli-Stamm BL21 (Novagen), transformiert mit pGEX-2T-Plasmid erhalten.
Das menschliche p53-Gen der Wildform wird als Templat für PCR eingesetzt, um das Genfragment zu erhalten, das für die Reste 1 bis 362 der 392 Aminosäuren von natürlichem p53 (p43D30) kodiert. Die für PCR verwendeten Oligonucleotide werden so konstruiert, dass eine Ndel-Restriktionsstelle am 5'-Ende und eine BamHl-Stelle am 3'-Ende eingeführt wird (siehe p53D30 Primer I und II mit Seq.-ID Nr. 10 bzw. 11).
Die mit NdeI und BamHl verdauten PCR-Fragmente werden mit einem Ndel/BamHl-gespaltenen pET-3a-Plasmid ligiert. Das vollständige Gen wird sequenziert, und das Expressionsplasmid wird in E.coli-Stamm BL21(DE3)pLysS (Novagen) eingeführt.
C) Proteinexpression
Für die Proteinexpression werden Bakterienkulturen mit einer 100fach verdünnten Übernacht-Kultur geimpft und in Luria-Broth-Medium in Gegenwart von 100 μg Ampicillin/ml bei 37°C bis zu einer O. D.₆₀₀ von 0,8 gezüchtet. Die Kulturen werden dann auf Eis auf Raumtemperatur abgekühlt, mit 1 mM Isopropyl-D-thiogalactopyranosid induziert und weitere 4 h lang bei 27°C gezüchtet. Die Zellen werden dann durch Zentrifugieren geerntet und die Pellets in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70°C gelagert.
D) Reinigung des hdm2-Fusionsproteins und des Glutathion-S-Transferase-Proteins Die Zellpellets, die das Glutathion-S-Transferase-Fusionsprotein von hdm2 (in der Folge als "G-M" bezeichnet) enthalten, werden in eiskaltem Puffer A (0,5 M NaCI, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 1,8 mM KH₂PO₄, 1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 10 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) – pH = 7,3) resuspendiert und mit einer French-Press bei 1.000 psi lysiert. Nach dem Zentrifugieren wird die lösliche Fraktion auf eine Glutathion-Sepharose 4B-Säule (Pharmacia Biotech) geladen, die bei 4°C mit Puffer A voräquilibriert wurde. Das G-M-Fusionsprotein wird dann mit Puffer B (50 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris-HCl), 10 M reduziertem Glutathion, 0,5 M NaCI, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 mM 2-Mercaptoethanol – pH = 8,0) eluiert. Die das Protein enthaltenden Fraktionen werden durch SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese) identifiziert, gepoolt und auf einer Sephadex-G25-Säule (Pharmacia Biotech) entsalzt, die bei 4°C mit Puffer C (50 mM Tris.HCl, 50 mM NaCl, 20 Vol.-% Glycerin, 10 mM 2-Mercaptoethanol, 0,1 Vol.-% Triton X-100 – pH = 7,6) voräquilibriert wurde. Die Proteinlösung wurde auf eine Mono Q-Säule (Pharmacia Biotech), voräquilibriert mit Puffer C bei 4°C, geladen, und das Fusionsprotein wird mit einem linearen Gradienten von Puffer C eluiert, der 1 M NaCI enthält. Die das gereinigte G-M-Protein enthaltenden Fraktionen werden gepoolt, auf 1 mg/ ml eingeengt (Centricon 30 – Amicon), in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei – –70°C gelagert.
Das Glutathion-S-Transferase-Protein (in der Folge mit "G" bezeichnet) wird nach dem gleichen Verfahren gereinigt, mit der Ausnahme, dass die Reinigung nach der Glutathion Sepharose 48-Säue abgebrochen wird, da das nach diesem Schritt erhaltene Material hohe Reinheit aufweist.
E) Reinigung von p53D30-Protein
Die das p53D30-Protein enthaltenden Zellpellets werden in eiskaltem Puffer D (50 mM 4-(2-Hydroxyethyl)piperazinethansulfonsäure (Hepes.NaOH), 10 Vol.-% Glycerin, 0,1 mM EDTA, 0,1 Vol.-% Triton X-100, 5 mM 1,4-Dithio-DL-threitol (DTT), 1 mM PMSF – pH = 7,6) resuspendiert und mit einer French-Press bei 1.000 psi lysiert. Nach dem Zentrifugieren wird die lösliche Fraktionen auf eine HiTrap-Heparin-Säule (Pharmacia Biotech) geladen, die mit Puffer D bei 4°C voräquilibriert wurde. Die Säule wird zunächst mit Puffer D gewaschen, der 22% Puffer E (50 mM Hepes.NaOH, 1 M KCl, 10 Vol.-% Glycerin – pH = 7,6) enthält, und p53D30 wird mit einem linearen Gradienten zu 100% Puffer E eluiert. Die p53D30 enthaltenden Fraktionen werden gepoolt und auf eine HiTrap-Metallchelatierungssäule (Pharmacia Biotech) geladen, die mit Nickel beladen und bei 4°C mit Puffer F (50 mM Hepes.NaOH, 0,5 M KCl, 10 Vol.-% Glycerin – pH = 7,6) voräquilibriert wurde. Nach dem Waschen der Säule mit Puffer F, der 20 Puffer G (50 mM Hepes.NaON, 0,5 M KCl, 10 Vol.-% Glycerin, 0,1 M Imidazol – pH = 7,6) enthält, wird p53D30 mit 45% Puffer G eluiert. 50 mM 2-Mercaptoethanol und 1 mM ZnCl₂ werden der Lösung zugegeben, und das Protein wird bei 4°C gegen 50 mM Hepes.NaOH, 0,5 M KCl, 20 Vol.-% Glycerin, 50 mM 2-Mercaptoethanol, 1 mM ZnCl₂ – pH = 7,6 dialysiert. p53D30 wird auf 1 mg/ml eingeengt (Amicon Membran mit einem Cutoff von 30 kDa), in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70°C gelagert.
F) Proteinanalyse
Die Reinheit des Proteinpräparats wird durch Gelscanning (Schimadzu CS-930) auf SDS-PAGE (Laemmli, U. K., Nature 227, 680–385 (1970)), gefärbt mit Coomassieblau, bewertet. Die Proteinkonzentration wird nach M. B. Bradfors, Anal. Biochem. 72, 248–254 (1976), bestimmt.
G) Proteinsynthese
Peptid A (Ac-SQETFSDLWKL), wie in Seq.-ID Nr. 5 gezeigt, wird auf einem automatisierten Peptid-Snythesizer Milligen 9050 (kontinuierlich) durch Festphasen-Peptidsyn these unter Einsatz der Fluorenylmethoxycarbonyl- (Fmoc-) Strategie auf Fmoc-MBHA-PAL-PEG-Amidharz zusammengestellt. Der Seitenkettenschutz von α-FMoc-Aminosäuren ist folgender: Asp (O-tert-Butyloxycarbonyl), Gln (Trt), Glu (O-tert-Butyloxycarbonyl), Lys (Butyloxycarbonyl), Ser (tert-Butyl), Trp (Butyloxycarbonyl), Thr (tert-Butyl). Die α-Fmoc-Aminosäuren (3 Äquivalente) werden unter Einsatz der jeweiligen Trichlorphenylester eingebaut. Jedem Kopplungsschritt folgt ein Enden-Verkappungsschritt (Ac₂O/ Pyridin in Dimethylformamid). Nach dem Abschluss der Ketten-Assemblierung wird das getrocknete Peptidharz mit 76 Vol.-% Trifluoressigsäure (TFA) /20 Vol.-% EDT / 4 Vol.-Wasser bei 30°C behandelt, um das Peptid vom Harz abzuspalten und die Blockierung des Seitenketten-Schutzes aufzuheben. Nach 3-stündiger Inkubation wird das Harz abfiltriert und das Peptid in kaltem (0°C) t-Butylmethylether gefällt. Das rohe Peptid wird durch Zentrifugation gesammelt und durch präparative Umkehrphasen-Mitteldruck-Flüssigchromatographie unter Einsatz einer Vydac-C₁₈-Säule (Acetonitri1-Wasser-Gradient, der 0,1 Vol.-% TFA enthält) gereinigt, was das Endprodukt ergibt. Die Reinheit und die korrekte Masse des Peptids werden durch analytische Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigchromatographie, FABMS und Matrix-unterstützte Laser-Desorptionsionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie verifiziert.
Um die Peptid A-Konzentration in Lösung zu bestimmen, wird das Peptid in 50 mM Tris.HCl – pH = 7,6 gelöst und 10 min lang bei 37°C inkubiert. Die Lösung wird ausgiebig durchmischt und 15 min lang auf Eis inkubiert. Die unlösliche Fraktion wird durch Zentrifugieren mit 13.000 U/min für 10 min entfernt, und die Peptidkonzentration wird durch Spektralphotometrie bei 280 nm unter Einsatz eines Molekülextinktionskoeffizienten von 5.690 bestimmt.
H) Gelshift-Analyse
Die Oligonucleotide I und II (Seq.-ID-Nr. 6 bzw. 7), die die 20-mer-p53-Konsens-DNA-Bindungsstelle und HindIII-kompatible Enden umfassen, werden hybridisiert und mit [³³]γ-ATP 5'-endmarkiert, wie von T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook (1989), Mo lecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, USA, beschrieben.
Ein 20 μl-Reaktionsvolumen, das 50 mM tris.HCl, 50 mM NaCI, 5 Vol.-% Glycerin, 0,1 Vol.-% Triton X-100, 10 mM DTT und 50 μg/ml Polydesoxyinosin-desoxycytidylsäure – pH = 7,6 (Bindungspuffer) enthält, wird 30 min lang bei 22°C in Gegenwart der angegebenen Mengen an p53D30, an strahlenmarkierten Oligonucleotiden und der genannten monoklonalen Antikörper inkubiert. Die Reaktionen werden auf ein natives 4%iges Polyacrylamidgel geladen, das 0,5 × Tris.HCl – Borsäure – pH = 8,0, enthält, das zuvor einer Elektrophorese bei 200 V für 45 min bei 4°C unterzogen worden war. Elektrophorese wird bei 200 V für 90 bis 120 min bei 4°C fortgesetzt. Die Gele werden getrocknet, bevor sie mit Röntgenfilm (Amersham-Hyperfilm-MP) belichtet werden.
Um den ternären p53D30-G-M-DNA-Komplex zu bilden, werden beide Proteine und die strahlenmarkierte DNA in Bindungspuffer 30 min lang bei 22°C inkubiert, und das Gel wird wie zuvor beschrieben bearbeitet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Testen der Wirkung einer Substanz auf die Bindung eines dm2-Proteins an p53, dadurch gekennzeichnet, dass Komplexbildung in einem Gemisch untersucht wird, das (a) ein p53 oder ein funktionelles Äquivalent davon, das spezifische DNA-Bindungs-, Oligomerisations- und dm2-Bindungseigenschaften aufweist, (b) ein dm2 oder ein funktionelles Äquivalent davon, das die p53-Bindungsdomäne aufweist, (c) eine DNA-Sequenz, die sich spezifisch an die spezifische DNA-Bindungsdomäne von p53 bindet, und (d) die zu testende Substanz umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Komplexbildung mittels Gelshift-Analyse getestet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Human-p53 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das verwendete p53 p53D30 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass hdm2 verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das funktionelle Äquivalent ein verkürztes dm2 mit p53-Bindungseigenschaften ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das funktionelle Äquivalent ein Protein ist, dass die N-terminalen 188 Aminosäuren von hdm2 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das funktionelle Äquivalent ein Fusionsprotein ist, das Glutathion-S-Transferase von S. japonicum und die Nterminalen 188 Aminosäuren von hdm2 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin gleichzeitig die Bindung von hdm2 an p53 und die Bindung von p53 an DNA getestet werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das weiters den Schritt der Unterscheidung zwischen Folgenden umfasst: (i) der Bildung eines Doppelkomplexes aus (a) und (c); (ii) der Bildung eines Dreifachkomplexes aus (a), (b) und (c); und (iii) der Nicht-Bildung eines Komplexes zwischen (a) und (c).
Verfahren nach Anspruch 10, das weiters den Schritt des Identifizierens einer Substanz umfasst, die die Bildung des Doppelkomplexes von (i) ermöglicht.
Testset zum Testen der Wirkung einer Substanz auf die Bindung eines dm2-Proteins an p53, umfassend (a) ein p53 oder funktionelles Äquivalent davon, das DNA-Bindungs-, Oligomerisations- und hdm2-Bindungseigenschaften aufweist, (b) ein hdm2 oder funktionelles Äquivalent davon, das die p53-Bindungsdomäne aufweist, und (c) eine DNA-Sequenz, die sich spezifisch an die p53-Bindungsdomäne bindet.