DE69634782T2

DE69634782T2 - Methoden zur behandlung von vorhandener colitis durch verwendung von antikörper gegen il-12

Info

Publication number: DE69634782T2
Application number: DE69634782T
Authority: DE
Inventors: Warren Strober; Ivan Fuss; Markus Neurath
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1995-10-25
Filing date: 1996-03-29
Publication date: 2006-03-23
Anticipated expiration: 2016-03-30
Also published as: DE69634782D1; EP0862461A1; AU710282B2; AU5378696A; CA2235866A1; JP4148533B2; WO1997015327A1; JP2000502991A; ES2239329T3; JP2008169199A; MX9803253A; US5853697A; ATE296112T1; EP0862461B1; CA2235866C

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Möglichkeit des Behandelns der etablierten Colitis einer entzündlichen Darm-Erkrankung durch Inhibieren der Colitis- induzierenden Effekte des Cytokins Interleukin-12 (IL-12). Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung eines Antikörpers gegen Interleukin-12 zur Verfügung, welche effektiv in der Reduktion des Colitis- induzierenden Effekts von Interleukin 12 ist, für die Herstellung eines medizinischen Produkts zur Behandlung der entzündlichen Antwort auf eine etablierte Colitis in einem Subjekt mit entzündlicher Darm-Krankheit.
Des Weiteren wird ein Verfahren zum Screening nach Substanzen bereitgestellt hinsichtlich ihrer Effektivität in der Reduktion der entzündlichen Antwort auf eine etablierte Colitis. Illustriert wird das Verhindern der entzündlichen Darm-Krankheit in einem Maus-Modell.
STAND DER TECHNIK
Die entzündliche Darm-Krankheit (inflammatory Bowel disease, IBD) schließt die Crohn Krankheit (Crohn's disease, CD) und ulzeröse Colitis (ulcerative colitis, UC) ein, welche idiopathische chronische Erkrankungen sind, welche in ansteigender Häufigkeit in westlichen Populationen auftreten (1, 2). In jüngster Zeit wurden verschiedene Tier- Modelle der chronischen intestinalen Entzündung etabliert, welche wahrscheinlich neue Einblicke in die Pathogenese von IBD geben werden (3). Diese schließen Mäuse ein, welche Transgene von NLA-B27 und β2-Mikroglobulin (4) tragen, sowie Mäuse, in welchen die Gene für Interleukin-2 (IL-2) (5), Interleukin-10 (IL-10) (6) und die α- oder β-Kette des T-Zellen-Rezeptors (7) durch homologe Rekombination inaktiviert worden sind. Darüber hinaus wurde ein Colitis- Modell jüngst etabliert durch adoptiven Transfer von normalen CD45Rbhi T-Zellen von BALG/C-Mäusen zu C. B.-17 SCID-Mäusen, in wel chen die transferierten T-Zellen eine Th1-Cytokin-Antwort manifestierten, assoziiert mit granulomatöser Entzündung. Diese experimentelle Colitis kann verhindert werden durch systemische Verabreichung von Anti-Interferongamma (Anti-IFN-γ) (zwei Dosen) und durch systemische, tägliche Verabreichung von rekombinanten IL-10 (rIL-10), wenn man zur gleichen Zeit die Krankheit induziert, jedoch nicht mit rekombinantem Interleukin-4 (rIL-4) (8). Jedoch die Behandlung von etablierter IBD unter Verwendung dieser Methoden wurde nicht vorgeschlagen. Die Beobachtung, dass Verabreichung von IL-10 ein Produkt der Th2-Zell-Differentiation, jedoch nicht IL-4, welches auch ein Produkt der Th2-Zell-Differentiation ist, die experimentelle Colitis verhindern kann, unterstreicht die Unvorhersagbarkeit der Verabreichung von Cytokinen, um IBD zu verhindern oder behandeln.
IL-12 ist ein jüngst charakterisiertes Cytokin mit einzigartiger Struktur und pleiotropen Effekten (9–12). Es besteht aus zwei Disulfid- verknüpften Untereinheiten, p40 und p35, welche funktionell aktive p40/p35-Heterodimere oder inhibitorische p40-Homodimere ausbilden. IL-12 wird in erster Linie durch Macrophagen/Monocyten zur Verfügung gestellt und kann effizient induziert werden durch intrazelluläre Parasiten, Bakterien und bakterielle Produkte. Funktionelle Untersuchungen haben gezeigt, dass IL-12 zytolytische Aktivität von natürlichen Killer(NK)-Zellen und Macrophagen verstärkt und in Synergismus mit der B7/CD28-Wechselwirkung die Cytokin-Produktion und die Proliferation der aktivierten NK-Zellen und T-Zellen induziert (13). Des Weiteren spielt IL-12 eine entscheidende Rolle in der Th1-T-Zell-Differentiation und induziert naive T-Zellen, um IFN-γ zu erzeugen. Als ein Ergebnis dieser Fähigkeit, T-Zell-Antwort in Richtung des Th1-Phänotyps zu lenken, wurde für IL-12 gezeigt, dass es eine effektive Behandlung etablierter Parasiten-Infektionen in Mäusen darstellt (14, 15), welche eine Th2-T-Zell-Antwort auslösen. Während Antikörper gegen IL-12 als bedeutsam bei der Verhinderung bei experimenteller autoimmuner Enzephalitis gezeigt wurden, einer Erkrankung mediatisiert durch Th1-T-Zellen (16), wurden diese Ergebnisse nicht auf die Behandlung von etablierter autoimmuner Enzephalitis ausgedehnt.
Es wurde gezeigt, dass Antikörper gegen den Tumomekrosisfaktor alpha (TNF-α) in der Behandlung von CD (29) eingesetzt wurden. In dieser unkontrollierten Untersuchung wurden akute Verschlimmerungen von CD abgemildert, jedoch blieben die Patienten Steroid- abhängig und die Krankheits-Invariablität kehrte innerhalb eines Zeitraums einiger Monate wieder.
Die intemationale Patentanmeldung Nr. WO 95/01997 offenbart die Verwendung von Antikörpern gegen Interleukin-1β zur Behandlung von Interleukin-1 mediatisierten entzündlichen Erkrankungen in Menschen. Die internationale Patentanmeldung Nr. WO 95/23865 offenbart die Verwendung von Antikörpern gegen Interleukin-8 für die Behandlung entzündlicher Erkrankungen, wie z.B. entzündlicher Darm- Erkrankung und bakteriellen Pneumonia.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Mittel zur Behandlung für IBD zur Verfügung, welches überraschenderweise effektiver ist als existierende Therapien. Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren ein Verfahren zum Screenen nach Substanzen zur Verfügung, welche effektiv sind in ihrer Fähigkeit, den Colitis- induzierenden Effekt von IL-12 zu inhibieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Verwendung eines Antikörpers auf Interleukin-12, effektiv in der Reduzierung des Colitis- induzierenden Effekts von Interleukin-12, zur Verfügung für die Herstellung eines medizinischen Produktes zur Behandlung der entzündlichen Antwort auf eine etablierte Colitis in einem Subjekt mit entzündlicher Darm-Krankheit.
Auch zur Verfügung gestellt wird ein Verfahren zum Screenen einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivität bei der Reduktion der entzündlichen Antwort auf eine etablierte Colitis, umfassend das Erhalten eines Tieres mit einer etablierten Colitis, das Verabreichen der Substanz an das Tier und das Assaying des Tieres für einen Effekt auf Interleukin-12, welche in der Reduktion der entzündlichen Antwort resultiert, wobei die Reduktion der entzündlichen Antwort dadurch anzeigt, dass die Interleukin-12 Aktivität inhibiert wird.
Des Weiteren stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zum Screenen nach einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivität beim Vorbeugen gegen entzündli che Darm-Erkrankung, umfassend das Verabreichen der Substanz an ein Tier, welches empfänglich ist für Colitis; das Unterziehen des Tieres unter eine Behandlung, welche eine Colitis induzieren wird; das Assaying des Tieres für eine Entwicklung der Colitis; wobei das nicht-Auftreten der Entwicklung einer Colitis die Inhibition des Colitis induzierenden Effekts von Interleukin-12 anzeigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Ergebnisse der histologischen Einstufung von Darmschnitten von Kontroll BALB/c-Mäusen, behandelt mit Ethanol (offene Balken) und von Mäusen, behandelt mit TNBS (gefüllte Balken). Darmproben wurden genommen zu angegebenen Zeitpunkten nach Verabreichung von TNBS oder Ethanol und die Größenordnung der Entzündungs-Veränderungen in den Darmproben wurde analysiert auf HE-angefärbten Darmquerschnitten. Die Daten wurden gepoolt aus drei unabhängigen Experimenten in jeder Gruppe.
2 zeigt die Ergebnisse der histologischen Einstufung der Darmschnitte von BALB/c-Mäusen, behandelt mit TNBS und Antikörpern gegen IL-12 (offene Balken) und von Mäusen, behandelt mit TNBS und Rattenkontroll-IgG (ausgefüllte Balken). Darmproben wurden zur angegebenen Zeitpunkten nach Verabreichung von TNBS oder Ethanol genommen und die Größenordnung der Entzündungsveränderungen in den Därmen wurde analysiert auf HE- gefärbten Darmquerschnitten. Die Daten wurden gepoolt von drei unabhängigen Experimenten in jeder Gruppe.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung kann leichter verstanden werden per Verweis auf die folgende detaillierte Beschreibung von spezifischen Ausführungsformen sowie die Beispiele, welche hierin enthalten sind.
Diese Erfindung stellt eine Verwendung eines Antikörpers auf Interleukin-12 effektiv bei der Reduktion des Colitis- induzierenden Effekts von Interleukin-12 zur Herstellung ei nes medizinalen Produkts zur Verfügung zur Behandlung der entzündlichen Antwort einer etablierten Colitis in einem Subjekt mit entzündlicher Darm-Erkrankung.
Jedes Tier, welches der Colitis ausgesetzt ist, kann durch dieses Verfahren behandelt werden, obwohl Menschen die primären therapeutischen Ziele sind. Wie hier verwendet, bezieht sich eine "etablierte Colitis" auf einen Zustand des Darms, charakterisiert durch einen Zustand der Entzündung, in welchem ein oder mehrere der folgenden histologischen Charakteristika nachweisbar sind: Leukozyten-Infiltration; Verdickung der Darmwand; transmurale Infiltrationen; Verlust der Becherzellen; Ulcerationen; Granulomas; und Fibrose. Klinische Symptome können einschließen, sind jedoch nicht limitiert auf, Diarrhöe, rektalen Prolaps, Gewichtsverlust, Abdominal-Schmerz, Dehydration und Splenomegalie.
Antikörper gegen IL-12 können aus irgendeiner Quelle sein. Jedoch, um die Immunogenizität der Immunoglobuline selbst zu reduzieren, sind die Antikörper vorzugsweise von menschlichem Ursprung oder sind Antikörper, erzeugt in anderen Spezies und "humanisiert" zur Verabreichung in Menschen, wie dies in Beispiel VI beschrieben wird. Fragmente von Antikörpern, welche IL-12 bindende Aktivität beibehalten, wie auch Fragmente von IL-12, welche IL-12 bindende Aktivität (beispielsweise Homodimer-Formation) aufrechterhalten und die Colitis- induzierenden Effekte von IL-12 reduzieren, sind innerhalb der Bedeutung des Begriffs "Antikörper" eingeschlossen. Solche Antikörper und Fragmente können durch Techniken erzeugt werden, die im Stand der Technik bekannt sind, und auf ihre Spezifität und Aktivität gemäß der Verfahren dargestellt in den hier beigefügten Beispielen gescreent werden. Beispielsweise können allgemeine Verfahren zum Erzeugen von Antikörpern bei Harlow and Lane (23) gefunden werden.
In der vorliegenden Erfindung können die Antikörper gegen IL-12 oral oder parental verabreicht werden in einem pharmazeutisch akzeptablen Carrier für menschliche Subjekte. Geeignete Carrier zur Anwendung in der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf pyrogenfreie Salzlösungen. Zur parenteralen Verabreichung der Antikörper wird eine sterile Lösung oder Suspension in Salzlösung hergestellt, welche Additiva enthält, wie z.B. Ethyloleat oder Isopropylmyristat, und diese kann injiziert werden, beispielsweise in subkutane oder intramuskuläre Gewebe.
Alternativ können die Antikörper mikroverkapselt sein, entweder mit einem natürlichen oder einem synthetischen Polymer, in Mikropartikel von 4–8 μm Durchmesser, welche auf intestinale Lymphoid-Gewebe zielen und eine verzögerte Freisetzung der Antikörper für bis zu vier Wochen (22, 28) erzeugen.
Für die Behandlung von Menschen würden Antikörper gegen IL-12 in löslicher Form typischerweise in einer einzelnen Dosis zwischen 10 mg und 20 mg/kg an Körpergewicht verabreicht werden. Alternativ kann man dem Patienten 10 mg bis 20 mg/kg an Körpergewicht wöchentlich geben, bis die Colitis-Symptome abklingen.
Zur oralen Verabreichung können 500 mg bis 1000 mg P. O. verabreicht werden. Für die parenterale Verabreichung können 10 mg bis 20 mg/kg an Körpergewicht verabreicht werden, als eine einzelne oder wöchentliche intravenöse Injektion. Jedoch das Alter, Gewicht und der Zustand der meisten Individuen muss beim Bestimmen einer schlussendlichen Dosis berücksichtigt werden. Für die Verabreichung von Antikörpern gegen IL-12 in spezieller Form können 500 mg bis 1000 mg wie beschrieben für verzögerte Freisetzung über einen vier- bis achtwöchigen Zeitraum mikroverkapselt werden. Der Fachmann auf dem Gebiet wird realisieren, dass Dosierungen am Besten durch den behandelnden Arzt optimiert werden und Verfahren zum Bestimmen von Dosierungen werden beispielsweise beschrieben in Remington's Pharmaceutical Sciences (24).
Geeignete Träger zur oralen Verabreichung von Antikörpern gegen IL-12 schließen eine oder mehrere Substanzen ein, welche auch als geschmacksgebende Wirksubstanzen agieren können, als Gleitmittel, suspendierende Wirksubstanzen oder als Schutzhilfsmittel. Geeignete feste Carrier schließen Calciumphosphat, Calciumcarbonat, Magnesiumstearat, Zucker, Stärke, Gelatine, Cellulose, Carboxylpolymethylen oder Cyclodextrane ein. Geeignete flüssige Carrier können Wasser sein, pharmazeutisch akzeptable Öle oder eine Mischung von beiden. Die Flüssigkeit kann auch andere geeignete pharmazeutische Zusätze, wie z.B. Puffer, Konservierungsmittel, geschmacksverstärkende Agenzien, Viskositäts- oder Osmoregulatoren, Stabilisatoren oder suspendierende Agenzien enthalten. Beispiele geeigneter flüssiger Träger schließen Wasser, mit oder ohne verschiedene Additiva, einschließend Carboxypolymethylen als ein pH-reguliertes Gel ein. Die Antikörper können enthalten sein in enterisch gecoateten Kapseln, welche Antikörper in den Darm abgeben, um Magenkollaps zu verhindern.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung, zum Screenen einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivtät bei der Reduktion des Colitis induzierenden Effekts von IL-12, umfassend das Erhalten eines Tieres mit einer etablierten Colitis; das Verabreichen der Substanz an ein Tier; und das Assaying des Tieres für einen Effekt auf IL-12, welcher in einer Reduktion der entzündlichen Antwort der Colitis resultiert, wobei ein Maß der Reduktion der entzündlichen Antwort vorzugsweise größer als das Maß der Reduktion, resultierend von der Verabreichung von Antikörpern gegen IFN-γ, TNF-α oder anderen Cytokinen, oder von der Verabreichung von Cytokinen selbst, eine effektive Substanz anzeigt. Eine Substanz, welche effektiv ist bei der Reduktion der entzündlichen Antwort auf eine etablierte Colitis ist eine, welche die histologischen und klinischen Manifestationen reduziert oder zurückbildet, wie dies oben beschrieben wird.
Die Fähigkeit einer Substanz, den Colitis induzierenden Effekt von IL-12 zu reduzieren, kann, wie oben dargestellt, bestimmt werden durch Auswerten der histologischen und klinischen Manifestationen des Tieres mit Colitis vor und nach Verabreichung der Substanz von Interesse und Quantifizieren des Maßes der Reduktion der Entzündung. Falls das Maß der Reduktion der Entzündungs-Antwort, induziert durch IL-12, gemessen in einem Tier nach Verabreichung der Substanz, größer ist als das Maß der Reduktion der entzündlichen Antwort, induziert durch IL-12, gemessen in einem Tier nach Verabreichung der Antikörper gegen IFN-γ, TNF-α oder andere Cytokine oder durch die Verabreichung von Cytokinen selbst, wird die Substanz als effektiv beim Reduzieren der entzündlichen Antwort einer etablierten Colitis eingestuft.
Das Tier, in welchem die Colitis erzeugt wird, kann jegliches Säugetier sein und kann einschließen, ist jedoch nicht limitiert auf Maus, Ratte, Meerschweinchen, Hamster, Kaninchen, Katze, Hund, Ziege, Affe und Schimpanse. Die Colitis kann erzeugt werden in einem Tier durch irgendein Verfahren, das im Stand der Technik bekannt ist. Beispielsweise kann die Colitis erzeugt werden durch Einbringen eines Hapten-Reagenzes in den Darm des Tieres in einer effektiven Menge. Das Hapten-Reagenz kann sein, ist jedoch nicht limitiert auf 2,4,6-Trinitrobenzen-Sulfonsäure, 2,4-Dinitrochlorobenzen und andere Trinitrophenylamino-Verbindungen.
Um die Effizienz der Anti-IL-12-Behandlung in Menschen mit IBD auszuwerten, können die folgenden Untersuchungen durchgeführt werden. Patienten mit aktiver Entzündung des Darmes und/oder des terminalen Ileums, welche nicht auf die Standardprednisontherapie (parenteral oder oral) angesprungen haben, können für die Kontrolle der IBD ausgewählt werden. Die Wirksubstanzeffizienz kann überwacht werden über Colonoskopie. Patienten können randomisiert auf zwei unterschiedliche Protokolle sein. In einem Protokoll können die Subjekte nach ursprünglicher Steroiddosierung eingestellt bleiben und in dem zweiten Protokoll können die Subjekte in ihrer Steroiddosierung allmählich abgesetzt worden sein, nachdem sie Anti-IL-12-Therapie empfangen haben.
Die Behandlung kann entweder aus einer einzelnen Dosis von 10 mg bis 20 mg/kg an Körpergewicht von Antikörpern gegen IL-12 per Infusion über einen zwei Stunden Zeitraum oder einer wöchentlichen Dosierung von 10 mg bis 20 mg/kg an Körpergewicht an Antikörpern auf IL-12 per Infusion, jedes Mal über eine zwei Stunden-Periode, bis die Symptome der Colitis abklingen, bestehen. Der Blutdruck, Puls und die Temperatur des Subjekts kann vor und in 30 Minuten-Intervallen während der zweistündigen Infusions-Periode überwacht werden. Man kann die Subjekte einer Laborauswertung unterziehen, bestehend aus einer vollständigen Blutzählung (complete blood count, CBC) mit differentieller Blutplättchenzählung, SMA-18-Chemieprofil, Erythrocyten-Sedimentationsrate (ESR) und einem C-reaktiven Proteinassay bei 1) der Zeit der Anti-IL-12 Infusion; 2) 24 Stunden nach Infusion; 3) 72 Stunden nach Infusion; 4) zwei Wochen nach der letzten Infusion; 5) vier Wochen nach der letzten Infusion; 6) sechs Wochen nach der letzten Infusion; und 7) acht Wochen nach der letzten Infusion.
Man kann die Subjekte routinemäßig einer Colonoskopie unter Videoüberwachung unterziehen zur Zeit der Infusion der Anti-IL-12 und wiederum nach zwei, vier, sechs und acht Wochen nach der letzten Infusion.
Des Weiteren können Serum-Proben der Subjekte geassayt werden durch ELISA auf IFN-γ-Spiegel, um die Wirksubstanzeffizienz zu überwachen. Auch Gewebsbiopsie- Proben, erhalten während der Colonoskopie, können kultiviert werden und auf ihre IFN-γ-Spiegel geassayt werden.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung zum Screenen einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivität beim Verhindern der entzündlichen Darm-Erkrankung, umfassend das Verabreichen der Substanz an ein Tier, welches empfänglich ist für Colitis; das Unterziehen des Tieres unter eine Behandlung, welche Colitis induzieren wird; das Assaying des Tieres auf die Entwicklung einer Colitis; und das Vergleichen der Effektivität der Substanz beim Verhindern der Entwicklung einer Colitis, vorzugsweise mit der Effektivität von Antikörpern gegen Interferongamma oder Tumomekrosisfaktor- alpha bei der Verhinderung der Entwicklung einer Colitis, wobei eine Substanz, die mehr effektiv ist im Verhindern der Entwicklung einer Colitis, als ein Antikörper gegen Interferon-gamma oder Tumornekrosisfaktor- alpha eine effektive Substanz anzeigt.
Substanzen, welche sich als effektiv beim Verhindern von IBD herausgestellt haben, wie z.B. Antikörper gegen IL-12, können verabreicht werden an ein Subjekt, um die Entwicklung von Colitis, gemäß den Protokollen der hier beschriebenen Verabreichung, zu verhindern.
Die vorliegende Erfindung wir spezieller beschrieben in den folgenden Beispielen, welche allein als illustrativ gedacht sind, da verschiedenen Modifikationen und Variationen dort den Fachleuten auf dem Gebiet offensichtlich sein werden.
BEISPIELE
Beispiel 1. Materialien, Antikörper und Zellen
Reagenzien und monoklonale Antikörper. Unkonjugierte und biotinylierte monoklonale Ratten Anti-Maus-IL2 (Klone JES6-1A12/JES6-5H4), IL-4 (BVD4-1D11/BVD6-24G2), IL-10 (JESS-2A5/SXC-1) und IFN-γ (R4-6A2/XMG1,2), Antikörper und rekombinantes Maus-IL-2 (spezifische Aktivität: 2,5 × 10⁸ Biological Response Modifiers Program (BRMP) Einheiten/mg), IL-4 (1 × 10⁷ Einheiten/mg pa CTLL.2,4 Assay), IL-10 (5 × 10⁵ Einheiten/mg) und IFN-γ (1 × 10^? Einheiten/ mg) wurden käuflich von Pharmingen bzw. Genzyme Corp, (Cambridge, MA) erworben. Aufgereinigte Hamster Anti-Maus CD3ε-(Klon 145-2C11) und Hamster Anti-Maus CD 28-(Klon 37.51) Antikörper wurden von Pharmingen erhalten.
Zellisolierung und Aufreinigung von Lamina Propria CD4-T-Zellen (LP-Zellen). LP-Zellen wurden isoliert von frisch erhaltenen Darmproben unter Verwendung einer Modifikation einer Technik, beschrieben von van der Heijden und Stok (17). Nach Entfernung der Peyer Patches wurde der Darm gewaschen in Hanks Balanced Salzlösung-Calcium- und Magnesium- frei (HBSS-CMF), in 0,5 cm Stücke zerteilt und zweimal mit HBSS inkubiert, enthaltend Dinatriumethylendiamintetraacetat (EDTA) (0,37 mg/ml) und Dithiothreitol (DTT) (145 mg ml) bei 37°C für 15 Min Das Gewebe wurde in RPMI-1640 Medium (Whittaker, Walkersville, MD), enthaltend Collagenase D (400 μl ml) und DNase l (0,1 mg/ml) (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) in einen Schüttel-Inkubator bei 37°C verdaut. LP-Zellen wurden dann geschichtet auf einem 40%–100% Percoll-Gradienten (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und Lymphocyt-angereicherte Populationen wurden aus den Zellen an der 40–100% Grenzfläche isoliert. Angereicherte CD4+ T-Zell-Populationen wurden erhalten durch negative Auswahl unter Verwendung von Maus DC4+ T-Zellisolations-Säulen (ISOCELL^®, Pierce Co., Rockford, IL). Die resultierenden Zellen bestanden bei Analyse per Durchfluss-Cytometrie (FACScan; Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) aus mehr als 85% CD4+-Zellen.
Zellkultur von LP-Zellen. Zellkulturen von LP-Zellen wurden durchgeführt in vollständigem Medium, bestehend aus RPMI-1640 Medium, angereichert mit 3 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES Puffer, 10 μg/ml Gentamycin (Whittaker), 100 U/ml jeweils von Penicillin und Streptomycin (Whittaker), 0,05 mM 2-Mercaptoethanol (2 ME) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) und 10% FCS.
Isolierung von Milz CD+-T-Zellen. Die Milz wurde in allen Fällen aseptisch entfernt und nachfolgend mit Collagenase (400 U/ml) und DNase 1 (12,5 μg/ml) bei 37°C für 15 Minuten verdaut. Nach Filtrations-Fraktionierung wurde die resultierende Splenocyten-Suspension an roten Blutzellen (RBC) verarmt durch hypotonische Lyse mit Ammoniumchlorid-Tris (ACK) Lysispuffer (B & B Scott, W. Warwick, RI). Zellen gesammelt aus der 70%/90%-Schicht einer Percoll-Gradient-Zentrifugation wurden weiterer negativer Selektion unter Verwendung von Maus CD4+ T-Zellisolations-Säulen unterzogen. Wie jedoch die fluoreszenzaktivierte Zell-Sortier-Analyse (FACS) ausgewertet wurde, enthielt die resultierende Zellpopulation mehr als 25% CD4+ Zellen.
Zellkultur von Milz CD4+ T-Zellen. 10⁵ Milz DC4+ T-Zellen wurden in 1 ml an vollständigem Medium kultiviert. Kultur-Überstände wurden nach 48 Stunden entfernt und hinsichtlich Cytokin-Konzentration wie oben beschrieben untersucht.
Beispiel II. Behandlung von Mäusen mit Anti-IL-12 Antikörpern
Behandlung mit Anti-IL-12 Antikörpern. Die Hybridoma Zelllinie (C17.8), welche neutralisierende Ratten Anti-Maus IL-12 Antikörper produzierte (G. Trinchieri, The Wistar Institute, Philadelphia, PA (20, 21) wurde verwendet, um Ascites-Flüssigkeit in Nacktmäusen gemäß Standardverfahren zu erzeugen und die Antikörper wurden aufgereinigt unter Verwendung von E-Z-SEP-Aufreinigungskits (Middlesex Sciences, Inc, Foxborough, MA). Rattenkontrollen IgG wurde erhalten von Jackson Immuno Research (West Grove, PA). Ein mg entweder von Ratten-Anti-Maus-IL-12 Antikörpern oder Rattenkontroll-IgG wurden intraperitonial in Mäusen verabreicht, welche mit TNBS zu verschiedenen Zeitpunkten vorbehandelt worden waren.
Beispiel III. Induktion und Auswertung der Colitis
Induktion von Colitis. Spezifische pathogenfreie 2–4 Monate alte weibliche BALB/ c oder SJL/J Mäuse wurden erhalten vom National Cancer Institute (NCl, Bethesda, MD) und im Gebäude 10A der Tierstallung am National Institutes of Health gehalten. Die Mäuse wurden leicht anästhesiert mit Metofan (Methoxyfluran; Pitman-Moore, Mundelein IL). Ein 3,5 F Katheter wurde in den Dann insertiert, bis die Spitze 4 cm nahe am Anus war. Um Colitis zu induzieren, wurden 0,5 mg des Hapten-Reagenz 2,4,6-Trinitrobenzen-Sulfonsäure (TNBS; Sigma, St. Louis, MO) in 50% Ethanol (um die Darm-Epithel-Barriere zu durchdringen) langsam in das Lumen des Darmes über den Katheter, welcher auf eine 1 ml Spritze passte, verabreicht. Im Kontrollexperimenten empfingen die Mäuse 50% Ethanol allein unter Verwendung der gleichen Technik wie oben beschrieben. Das gesamte Injektions-Volumen war 100 μl in beiden Gruppen, was erlaubte, dass TNBS oder Ethanol den gesamten Darm einschließend Caecum und Appendix erreichte. Die Tiere wurden in vertikaler Position für 30 Sekunden gehalten und kehrten dann in ihre Käfige zurück.
Skalierung der histologischen Veränderungen. Gewebe wurden entfernt zu verschiedenen Zeitpunkten und in Paraffin eingebettet. Paraffin-Schnitte wurden gemacht und mit Haematoxylin und Eosin angefärbt. Der Grad der Entzündung der mikroskopischen Querschnitte des Darmes wurde semiquantitativ von 0 bis 4 klassifiziert [0 – keine Anzeichen einer Entzündung, der Darm ist nicht zu unterscheiden von demjenigen eines normalen Darms; 1 – sehr geringer Grad an Leucozyten-Infiltration (1–10% des Bereichs, infiltriert mit Leucozyten); 2 – geringer Grad an Leucozyten-Infiltration (11–25% des Bereichs mit Leucozyten infiltriert); 3 – hoher Grad von Leucozyten-Infiltration (26–50% des Bereichs mit Leucozyten infiltriert), hohe Gefäß-Dichte, Ausdickung der Darm- Wand; 4 – transmurale Leucozyten-Infiltration (> 50% des Bereichs infiltriert mit Leucozyten), Verlust von Becher-Zellen, hoher Gefäß-Dichte, Verdickung der Darmwand]. Die Klassifizierung wurde in Blindversuchen durch den gleichen Pathologen durchgeführt.
Morphometrische Auswertung der Darmwanddicke. Drei oder mehr Tiere einer jeden Behandlungs-Gruppe wurden zufällig zu verschiedenen Zeitpunkten ausgewählt und Darmproben wurden entfernt und in Paraffin eingebettet. Die Dicke der Darmwand wurde beschrieben für Querschnitte durch Messen des Abstandes der serosalen Oberfläche zur luminalen Oberfläche in 2 mm Intervallen entlang der gesamten Länge eines jeden Schnitts durch ein kalibriertes Okular unter Verwendung eines Olympus Vanox S1 Mikroskops.
Immunohistochemie. Proben wurden unter optimale Schneide-Temperatur(OCT)-Adaption auf Trockeneis gegeben, und 7 μm Cryo-Schnitte wurden geschnitten gemäß Standardverfahren. Schnitte wurden dann luftgetrocknet und in kaltem Aceton für 2 Min bei Raumtemperatur fixiert. Die Proben wurden rehydratisiert in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) für 15 Min, blockiert mit 5% fötalem Kälberserum (FCS) in PBS für 20 Min und mit Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC)-konjugiertem Ratten-Anti-Maus-CD4-Antikörper (1:100 Verdünnung; Pharmingen, San Diego, CA) für 45 Min in einer dunklen feuchten Kammer inkubiert. Die Schnitte wurden dann für 15 Min in PBS gewaschen, montiert und mit einem Fluoreszenzmikroskop bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm analysiert.
Quantifikation von CD4+ T-Lymphozyten wurde durchgeführt mit Cryostatschnitten für zumindest drei Proben für jeden Zeitpunkt und jede Behandlungsgruppe durch Untersuchen von zehn zufällig ausgewählten Hochkraftfeldern (high power fields, HPF). Unter diesen experimentellen Bedingungen (400-fach Vergrößerung) repräsentierte ein HPF 0,25 mm².
Intrarektale Verabreichung von 2,4,6-Trinitrobenzen-Sulfonsäure induziert eine chronische Granulomatos-Colitis in BALB/c und SJL/Mäusen. BALB/c- und SJL/J-Mäuse, welche einer intrarektalen Verabreichung von TNBS in 50% Ethanol ausgesetzt worden waren, entwickelten PanColitis mit schwerer Diarrhöe und rektalem Prolaps zusammen mit einer extensiven Verschmutzungskrankheit. Das Maximum der klinischen Erkrankung trat bei drei Wochen auf und klinische Anzeichen der Colitis ließen nach üblicherweise zwei Monaten nach. Kontrollmäuse, behandelt mit 50% Ethanol allein, zeigten keine Entwicklung einer Verschmutzungskrankheit und schienen gesund zu sein.
Die Darmproben von TNBS-behandelten BALB/c-Mäusen, entfernt sieben Tage nach Verabreichung von TNBS, zeigten merkliche Hyperemia und Entzündung, wohingegen die Darmproben von Kontroll-Mäusen, behandelt mit 50% Ethanol allein, keine makroskopischen Anzeichen einer Entzündung zeigten. Darüber hinaus zeigten TNBS-behandelte Mäuse Splenomegalie.
Histologische Analyse während der ersten Tage nach Induktion von Colitis zeigte Infiltrationen von neutrophilen Granulozyten in den Darm. Am Tag 7 wurde eine transmurale Entzündung, welche den gesamten Darm betraf (jedoch nicht den Blinddarm), gefunden. Die Colitis wurde hauptsächlich charakterisiert durch Lymphozyten-Einwachsungen, welche assoziiert waren mit Verdickung der Darmwand, Ulceration, Verlust von Becher-Zellen und dem Vorliegen von Granuloma. Immunohistochemisches Anfärben zeigte, dass am Tag 7 CD4+ T-Zellen erhöht im Darm von TNBS-behandelten Mäusen vorlagen im Vergleich zu Kontrollmäusen. Die Unterschiede in der entzündlichen Aktivität wurden des Weiteren bestätigt durch histologische Klassifikation der Darmschnitte (1). Wie durch morphometrische Analyse des Darms ausgewertet wurde, lagen die Maxima der Darmwanddicke und die Zahl der CD4+ T-Lymphozyten (Tabelle 1) der Erkrankungsintensität üblicherweise zwischen zwei und vier Wochen nach Verabreichung von TNBS. Zu späteren Stadien trat eine Reduktion in der Anzahl der Granulozyten auf, jedoch blieben intramurale Lymphoid-Aggregate bestehen und einsetzende Fibrosis wurde festgestellt. Diese histologischen Anzeichen der Entzündung wurden immer noch zwei Wochen nach TNBS-Behandlung nachgewiesen, traten jedoch nicht in mit Ethanol behandelten Mäusen auf.
Histologisch zeigten die Milzproben von TNBS-behandelten Mäusen einen Zuwachs in der Größe der roten Blutzellen und der periarteriolären lymphoiden Schichten am Tag 7, wenn dies mit Milzproben von Kontrollmäusen verglichen wurde. Fluoreszenz-aktivierte Zell-Sortier-Analyse (FACS) von Milz-Lymphozyten förderte eine zweifache Vergrößerung in der Prozentzahl der CD4+ und CD8+ T-Zellen in TNBS-behandelten Mäusen zutage im Vergleich mit Kontroll-Ethanol-behandelten Mäusen und normalen BALB/c-Mäusen, zusammen mit einer Reduktion in den B220+ B-Zellen.
Frühverabreichung der Antikörper gegen IL-12 unterdrückt Colitis und beseitigt die Verschmutzungserkrankung in TNBS-behandelten Mäusen. Zur Bestimmung, ob Antikörper gegen IL-12 die Erkrankungs-Aktivitäten beeinträchtigen, wurden die Mäuse fünf und neun Tage nach Induktion der Colitis systemisch mit Anti-IL-12 oder Kontrollratten-IgG behandelt. Wenn die Mäuse mit Anti-IL-12 behandelt wurden, wurde eine signifikante Verbesserung der Verschmutzungskrankheit offensichtlich. Anti-IL-12-behandelte Mäuse wurden aktiver und verloren das Erscheinungsbild des gesträubten Fells im Vergleich mit unbehandelten Mäusen oder Mäusen, denen Kontrollratten-IgG verabreicht worden war. Darüber hinaus erhielten Mäuse, denen Anti-IL-12 verabreicht worden war, üblicherweise ihr ursprüngliches Körpergewicht zurück, wohingegen Kontroll-IgG-behandelte Mäuse weiter an Gewicht verloren. Schließlich brachte die Brutto-Inspektion des Darms am Tag 12 eine Reduktion der entzündlichen Aktivität in Tieren zutage, denen Anti-IL-12 verabreicht worden war.
Histologische Untersuchungen zeigen signifikant weniger entzündliche Zellen in den Darmproben von Anti-IL-12-behandelten Mäusen. In den meisten Fällen klang bei Anti-IL-12-Behandlung die TNBS-induzierte Entzündung vollständig ab und stellte das normale histologische Erscheinungsbild des Darms wieder her. Dies wurde bestätigt durch histologisches Klassifizieren von Darmschnitten. Gepoolte Daten von drei unabhängigen Experimenten zeigten signifikante Reduktion in der entzündlichen Aktivität nach Anti-IL-12-Behandlung (2).
Beispiel IV. Cytokin-Assays
ELISA. Um Cytokin-Produktion zu messen, werden 24-Well-Platten (Costar, Cambridge, MA) mit 10 μg/ml murinen Anti-CD3ε-Antikörpern in Carbonatpuffer (pH 9,6) über Nacht bei 4°C gecoatet. 10⁵ LP-T-Zellen wurden in 1 ml vollständigem Medium in vorgecoateten oder ungecoateten Wells kultiviert und 1 μg/ml löslichem Anti-CD28 Antikörper wurde zu den Anti-CD3ε gecoateten Wells hinzugegeben. Kultur-Überstände wurden nach 48 Stunden entfernt und auf die Cytokin-Konzentration geassayt. Cytokin-Konzentrationen wurden bestimmt durch spezifischen ELISA, entsprechend den Empfehlungen des Herstellers (Pharmingen) unter Verwendung von Immulon-496-Well-Mikrotiter-Platten (Dynatech Laboratories Inc., Chantilly, VA). Optische Dichten wurden gemessen auf einem Dynatech MR 5000 ELISA-Lesegerät bei einer Wellenlänge von 490 nm.
Stimulierte LP-Zellen von TNBS-behandelten Mäusen sekretieren Th1-Cytokine. Um die Cytokin-Produktion durch Infiltrieren von LP-Zellen in den jeweiligen Darm der TNBS-behandelten Mäuse zu untersuchen, wurde diese Zellpopulation aufgereinigt aus Darm-Gewebsproben 7 Tagen nach der Induktion der Colitis und das Cytokinmuster dieser Zellen wurde verglichen mit demjenigen von LP-Zellen, erhalten aus Darm-Gewebsproben von Kontroll-Ethanol-behandelten Mäusen. Zellen wurden kultiviert für zwei Tage und Kulturüberstände wurden analysiert auf Konzentrationen von Th1 (IL-2, IFN-γ) und Th2 (IL-4, IL-10)-Cytokinen durch spezifischen ELISA. Eine zehnfache Erhöhung in der spontanen IFN-γ-Produktion durch LP-Zellen wurde in TNBS-behandelten Mäusen gefunden. Des Weiteren erzeugten LP-Zellen von TNBS-behandelten Mäusen, stimuliert mit Anti-CD3 und Anti-CD28 20- bis 50- mal höhere Spiegel an IL-2 und IFN-γ als LP-Zellen von Kontrollmäusen. Ähnlich wurde ein Anstieg in der spontanen (4,5 U vs. 1,8 U) und induzierten (46 U vs. 16,8 U nach Stimulation mit Anti-CD3 und Anti-CD28) IFN-γ-Produktion durch Milz CD4+ T-Zellen in den TNBS-behandelten Tieren verglichen mit den Ethanol-Kontrollgruppen zu diesem Zeitpunkt gefunden.
Im Gegensatz zu diesen oben dargestellten Ergebnissen war die Sekretion von IL-4 unstimulierten LP-Zellen von TNBS-behandelten Mäusen identisch im Vergleich zu LP-Zellen von Ethanol- behandelten Kontrollmäusen. In stimulierten LP-Zellen von TNBS-behandelten Mäusen war die durchschnittliche Sekretion von IL-4 reduziert um ungefähr das fünffache im Vergleich mit Ethanol- behandelten Kontrollmäusen. Schließlich war die Sekretion von IL-10 durch stimulierte und unstimulierte LP-Zellen ähnlich in TNBS- und Ethanol- behandelten Mäusen.
In situ rerverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). In situ RTPCR für IFN-γ mRNA-Expression oder durchgeführt wie zuvor beschrieben (18). Cryoschnitte wurden auf geladenen Glasträgern platziert, so geschnitten, dass sie in 0,5 ml Eppendorf-Tuben passten. Proben wurden fixiert in 10% Formaldehyd über Nacht bei 4°C, dreimal mit PBS gewaschen und viermal in autoklaviertem dH₂O für 5 Min. Die Schnitte wurden permeabilisiert mit 2 mg/ml Trypsinogen (Sigma) in 0,01 N HCl für 15 Min bei 25°C, gefolgt von Neutralisation mit Puffer A (0,1 M Tris HCl (pH 7,5), 0,1 M NaCl). Zur DNA-Degradation wurden die Schnitte inkubiert in RQ1 Rnase-freier DNase (8U/100 ml: erhalten von Promega, Madison, WI) in Puffer B, enthaltend 40 mM Tris HCl (pH 7,9), 10 mM NaCl, 6 mM MgCl₂ und 0,1 mM CaCl₂ bei 37°C für 12 Min und bei 75°C für 10 Min. Als nächstes wurden die Schnitte für 60 Min bei 50°C in einem Perkin Elmer Thermocycler in 100 μl der folgenden Reaktionsmischung inkubiert: 10 mM Tris HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl₂, 25 μM dATP, 25 μM dTTP, 25 μMdCTP, 25 μM dGTP (Pharmacia, Piscataway, NJ), 100 nM von jeweils IFN-γ-Primer (Sense: 5'-GACAATCAGGCCATCAGCAACAAC-3' (SEQ ID NO: 1); Antisense-Primer: 5'-TCCTGAGGCTGGATTCCGGCAACA-3' (SEQ ID NO: 2), 10 mM DTT, 75 U RNasin und 400 U M-MLV reverse Transkriptase (Gibco BRL, Gaithersburg, MD). Die Träger wurden fünfmal jeweils mit Natriumcitrat-Puffer gewaschen (3 M NaCl, 0,3 M Na₃Citrat, pH 7,0, 2 × SSC) und zweimal in dH₂O.
Das Polymerasekettenreaktions(PCR)-Verfahren wurde durchgeführt in situ entweder für sense- oder antisense-geprimte cDNA in 100 ml der folgenden Reaktionsmischung: 25 μM von jeweils den Nukleotiden dATP, dCTP, dGTP und 23,7 μM dTTP, 1,25 μM Digoxigenin-11-dUTP; erhalten von Boehringer Mannheim) und 10 nM von IFN-γ Primern. Nach Denaturierung der Proben für 4 Min bei 95°C wurde Thermocycling durchgeführt für fünf Zyklen (94°C für 70 Sek., 62°C für 1 Min, 72°C für 1 Min); die letztendliche Extension wurde für 10 Min bei 72°C durchgeführt. Die Proben wurden dann in SSC-Lösungen gewaschen (2 × SSC, 1 × SSC, 0,5 × SCC; je 5 mal) und Immunodetektion wurde durchgeführt unter Verwendung von DIG-Nukleinsäure-Nachweiskits (Boehringer Mannheim). Schnitte wurden dehydratisiert in hochreinem Ethanol, platziert in Xylen und montiert auf Deckgläschen.
Elispot Assay für IFN-γ. 10⁵ LP-Zellen wurden inkubiert für einen Tag in Anti-CD3ε-gecoateten 24 Well-Platten und 1 μg/ml löslicher Anti-CD28-Antikörper wurde hinzu gegeben. Die Zellen wurden inkubiert in 24 Well-Platten, welche gecoatet waren mit Ratten-Anti-Maus-IFN-γ (Pharmingen). Nach 12 Stunden wurden die Platten in PBS/TWEEN^® gewaschen und biotinyliertes Ratten-Anti-Maus-IFN-γ (Pharmigen) (2 μg/ ml) wurde hinzu gegeben. Die Platten wurden inkubiert über Nacht bei 4°C. Nach Waschen in PBS/TWEEN^® wurde Streptavidin/alkalische Phosphatase (1:1000 Verdünnung, erhalten von Zymed) für 30 Min bei 37°C hinzu gegeben. Die Platten wurden erneut in PBS/TWEEN^® gewaschen und das alkalische Phosphatase(AP)-Substrat (Promega, Madison, WT), zusammen mit 1% Agarosegel, wurde zugegeben. Die Farbreaktion ließ man für 24 Std. laufen, bevor die Spots fotografiert wurden.
In situ Polymerasekettenreaktions-Untersuchungen zeigen erhöhte IFN-γ mRNA-Expression in den Darmproben von TNBS-behandelten BALB/c-Mäusen. Um zu bestimmen, ob der beobachtete Anstieg in IFN-γ-Produktion auch auf der mRNA-Ebene beobachtet wurde, wurde die mRNA-Expression von IFN-γ im Darm von TNBS-behandelten Mäusen durch in situ-PCR-Untersuchungen ausgewertet. Ethanolkontrollbehandelte Tiere zeigten keine signifikante Expression von IFN-γ mRNA am Tag 7. In den TNBS-behandelten Tieren wurde jedoch eine drastische Hochregulation von IFN-γ mRNA-Expression zum selben Zeitpunkt beobachtet. Hohe Färbe-Intensität wurde speziell in den Subepithel-Gebieten beobachtet.
IFN-γ-produktion durch stimulierte LP-Zellen wird beseitigt in TNBS-behandelten Mäusen, denen Anti-IL-12 verabreicht wird. Eine Analyse der IFN-γ-Produktion durch LP-Zellen in Anti-IL-12-behandelten Tieren brachte ein Abklingen der IFN-γ- Produktion in TNBS-behandelten Mäusen zutage, denen Anti-IL-12 verabreicht worden war, und zwar im Vergleich mit Ratten-IgG-behandelten Mäusen, was darauf hindeutet, dass die Anti-IL-12-Behandlung agieren kann durch Einflussnahme auf die Th1- ähnliche Antwort von lokalen CD4+ T-Zellen. Darüber hinaus zeigten Elispot-Assays für die IFN-γ-Sekretion durch LP-Zellen eine drastische Reduktion in der durchschnittlichen Zahl an Elispots in den Anti-IL-12-behandelten Gruppen im Vergleich zu den Ratten-Kontroll-IgG-behandelten Gruppen. Die Größe der Elispots war jedoch ähnlich in beiden Gruppen, was darauf hindeutet, dass die Reduktion in der IFN-γ-Sekretion durch LP-Zellen von Anti-IL-12-behandelten Mäusen hauptsächlich aufgrund der Reduktion in der Anzahl von IFN-γ-sekretierenden Zellen begründet war.
Späte Verabreichung von Antikörpern gegen IL-12 beseitigte die Verschmutzungserkrankung in Mäusen mit TNBS-induzierter Colitis. Um zu bestimmen, ob Anti-IL-12-Behandlung effektiv während später Phasen der Erkrankung sein würde, wenn die Colitis vollständig etabliert war, wurde die Verabreichung von Anti-II-12 oder Kontroll-Ratten-IgG am Tag 20 begonnen und am Tag 24 und 28 wiederholt. Ein signifikanter Anstieg im durchschnittlichen Gewicht der Mäuse wurde nach Anti-IL-12-Behandlung gefunden, jedoch nicht nach Ratten-Kontroll-IgG-Behandlung. Des Weiteren trat ein Abklingen der IFN-γ-Sekretion beobachtbar auf, wenn LP-Zellen von solchen Mäusen mit Anti-CD3 und Anti-CD28 stimuliert wurden, und zwar in denjenigen Mäusen, denen Anti-IL-12 verabreicht wurde, jedoch nicht in denjenigen, denen Ratten-Kontroll-IgG verabreicht wurde.
Beispiel V. Behandlung von Menschen mit Anti-IL-12-Antikörpern
Verabreichung von Antikörpern gegen IL-12 an ein menschliches Subjekt mit der Diagnose einer etablierten Colitis. Um den Colitis- induzierenden Effekt von IL-12 in einem menschlichen Subjekt zu inhibieren, können 10 mg bis 20 mg/kg an Körpergewicht von Antikörpern gegen IL-12 als eine Einzeldosis über einen zweistündigen Zeitraum verabreicht werden oder als wöchentliche Infusionen, verabreicht über einen zweistündigen Zeitraum, bis die Symptome der Colitis, wie z.B. Abdominalschmerz, Diarrhöe, Dehydration oder andere allgemeine Symptome von IBD abklingen. Zur oralen Verabreichung können 500 bis 1000 mg an Antikörpern gegen IL-12 verabreicht werden, P. O. in einer Einzeldosis oder in wöchentlichen Dosen, bis die Symptome der Colitis wie oben beschrieben abklingen.
Beispiel VI. Humanisierte Antikörper
Die Produktion von humansierten Mausantikörpern gegen IL-12. Nagetier- monoklonale oder polyklonale Antikörper können modifiziert werden, gemäß den Protokollen, dargestellt bei Junghans et al. (25), Brown et al. (26) und Kettleborough et al (27). Genauer gesagt können Nagetier-Antikörper modifiziert werden zur menschlichen Verabreichung durch Konstruieren mit Hilfe von rekombinanten DNA-Protokollen, die jedem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, eines chimeren Nagetier- menschlichen Antikörpers bestehend aus Nagetier- variablen Regionen und menschlichen schweren und leichten Ketten-konstanten Regionen. Ein anderer Ansatz des Humanisierens von Nagetier-Antikörpern ist die Verpflanzung von Nagetier komplementär-bestimmenden Regionen (complementarity determining regions, CDRs) von den Nagetier variablen Regionen in menschliche variable Regionen. Unter Verwendung eines dieser Ansätze können Nagetier- Antikörper humanisiert zur Verabreichung an menschliche Subjekte werden.
Beispiel VII. Verfahren zum Screenen nach Substanzen in einem Tiermodell
Screening nach einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivität bei der Reduktion der entzündlichen Antwort einer etablierten Colitis. Um zu bestimmen, ob eine Substanz effizient in der Reduktion der entzündlichen Antwort einer etablierten Colitis durch Zurückdrängen des Colitis induzierenden Effekts durch IL-12 ist, kann ein Tiermodell für etablierte Colitis präpariert werden, gemäß dem Protokoll dargestellt im Beispiel III oben. Eine Menge der Substanz von Interesse kann dann dem Tier parenteral in einem Dosier-Plan verabreicht werden, bestehend aus 1 mg in einer Einzeldosis oder einem wöchentlichen Plan von 1 mg zweimal in der Woche. Zu bestimmten Zeitpunkten nach Verabreichung der Substanz an das Tier kann die Menge der Reduktion der entzündlichen Antwort gemäß dem Protokollen dargestellt in Beispiel III oben bestimmt werden. Antikörper gegen IFN-γ und Antikörper gegen TFN-α können auch Tieren verabreicht werden, in welchen Colitis etabliert worden ist, in einem Therapie-Plan besteht aus 1 mg in einer Einzeldosis oder einer wöchentlichen Verabreichung von 1 mg zweimal in der Woche. Zu bestimmten Zeitpunkten nach Verabreichung des Anti-IFN-γ oder TNF- α kann die Menge der Reduktion der entzündlichen Antwort bestimmt werden, gemäß dem Protokoll, dargestellt in Beispiel III oben. Eine Substanz, welche die entzündliche Antwort der Colitis in einem größeren Grad reduziert als das Ausmaß der Reduktion der Entzündung, induziert durch Anti-IFN-γ-oder Anti-TNF-α-Verabreichung, wird als effektive Substanz in Behandlung einer etablierten Colitis betrachtet.
Screening einer Substanz hinsichtlich ihrer Effektivität beim Vorbeugen von IBD. Um zu bestimmen, ob eine Substanz effizient in der Vorbeugung von IBD ist, kann die Substanz an ein Tier empfänglich für Colitis verabreicht werden, und das Tier kann dann einer Behandlung unterzogen werden, welche Colitis induzieren wird (beispielsweise durch Behandlung mit einem Hapten-Reagenz, wie in den Beispielen hier beschrieben). Eine Menge der Substanz von Interesse kann an das Tier parenteral in einem Dosierplan verabreicht werden, bestehend aus 1 mg von einer Einzeldosis oder einer wöchentlichen Dosis von 1 mg, zweimal in der Woche. Zu angegebenen Zeitpunkten nach Verabreichung der Substanz an das Tier und Behandlung des Tiers, um Colitis zu induzieren, kann die Entwicklung der entzündlichen Antwort bestimmt werden, gemäß den Protokollen dargestellt in Beispiel III oben. Antikörper gegen IFN-γ und Antikörper gegen TFN-α können auch den Tieren verabreicht werden, welche empfänglich gegen Colitis sind, und zwar in einem Dosierplan, bestehend aus 1 mg von einer Einzeldosis oder einer wöchentlichen Verabreichung von 1 mg, zweimal in der Woche. Zu bestimmten Zeitpunkten nach Verabreichung der Anti-IFN-γ oder TNF-α und der Behandlung des Tieres, um Colitis zu induzieren, kann die Entwicklung einer entzündlichen Antwort bestimmt werden, gemäß dem Protokollen dargestellt in Beispiel III oben. Eine Substanz, die der entzündliche Antwort in einem größeren Ausmaß vorbeugt als der Grad der Prävention der Entzündung, induziert durch Anti-IFN-γ- oder Anti-TNF-α-Verabreichung, wird als effektive Substanz zum Vorbeugen von IBD betrachtet.
Obwohl der vorliegende Prozess unter Verweis auf spezifische Details bestimmter Ausführungsformen davon beschrieben worden war, ist nicht beabsichtigt, das solche Details als Einschränkungen für den Umfang der Erfindung betrachtet werden, außer in dem Maße, als sie in den beigefügten Ansprüchen enthalten sind.
Tabelle 1. Auswertung der Darmwanddicke und der Zahl der CD4+ T-Lymphozyten pro Hochkraftfeld (high power field, HPF) in den Darmproben von TNBS- und Ethanol- behandelten BALB/c-Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach Behandlung. Die Darmwanddicke wird in μm ausgedrückt ± Standardabweichung. Die Werte der CD4+ T-Lymphozyten, wie dargestellt, werden als positive Zellen pro HPF ± Standardabweichung ausgedrückt.
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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verwendung eines Antikörpers für Interleukin-12 effektiv in der Reduzierung des Kolitis-induzierenden Effektes von Interleukin-12 für die Herstellung eines medizinischen Produktes zur Behandlung der entzündlichen Antwort einer etablierten Kolitis in einem Subjekt mit entzündlicher Darmerkrankung.
Verwendung von Anspruch 1, worin das Subjekt ein Mensch ist.
Ein Verfahren zum Screenen einer Substanz effektiv in der Unterdrückung des Kolitis-induzierenden Effekts von Interleukin-12 umfassend: (a) Erhalten eines Tieres, welches etablierte Kolitis hat; (b) Verabreichen der Substanz an das Tier; und (c) Untersuchen des Tieres hinsichtlich der Reduktion der entzündlichen Antwort der Kolitis, wobei eine Reduktion in der entzündlichen Antwort der Kolitis eine effektive Substanz anzeigt.
Das Verfahren von Anspruch 3, worin das Tier eine etablierte Kolitis aufweist, erzeugt durch das Einbringen einer effektiven Menge eines Haptenreagenzes in den Dickdarm des Tieres.
Das Verfahren von Anspruch 4, wobei das Haptenreagenz 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure ist.
Das Verfahren von irgendeinem der Ansprüche 3 bis 5, worin das Tier eine Maus ist.
Ein Verfahren zum Screenen einer Substanz, die effektiv im Verhindern der Entwicklung einer Kolitis ist durch Unterdrückung des Kolitis-induzierenden Effektes von Interleukin-12, umfassend: (a) Verabreichen der Substanz an ein Tier, das empfänglich für Kolitis ist; (b) Unterziehen des Tieres einer Behandlung, welche Kolitis-induzierend ist; (c) Untersuchen des Tieres hinsichtlich der Entwicklung einer Kolitis, wobei das Fehlen der Entwicklung einer Kolitis die Unterdrückung des Kolitis-induzierenden Effektes von Interleukin-12 anzeigt.
Das Verfahren von Anspruch 7, worin das Tier eine Maus ist.
Das Verfahren der Ansprüche 7 oder 8, wobei die Behandlung, welche eine Kolitis induzieren wird, die Einfuhr einer effektiven Menge eines Haptenreagenzes in den Dickdarm des Tieres darstellt.
Das Verfahren von Anspruch 9, worin das Haptenreagenz 2,4,6-Trinitrobenzol Sulfonsäure ist.
Ein Antikörper für Interleukin-12 effektiv in der Reduktion des Kolitis-induzierten Effekts von Interleukin-12 zur Verwendung in der Behandlung der entzündlichen Antwort einer etablierten Kolitis in einem Subjekt.