DE69634137T2

DE69634137T2 - Protein mit pflanzenschützenden eigenschaften

Info

Publication number: DE69634137T2
Application number: DE69634137T
Authority: DE
Inventors: Vitali G. Odintsovo District Djavakhia; Natalia Batchikova; Timo Korpela; Radii M. Khomutov; Oleg Odintsovo District Moscow region Nikolaev
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1995-08-02
Filing date: 1996-08-02
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2016-08-03
Also published as: ATE286070T1; FI953688L; EP0868431B1; US6528480B1; FI103796B1; AU6659896A; EP0868431A1; DE69634137D1; FI103796B; WO1997005165A1; FI953688A0

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft die Biotechnologie und spezieller den biologischen Schutz von Pflanzen vor Virus- und Pilzinfektionen. Die Erfindung betrifft ein neues Protein, das aus dem Bakterium Bacillus thuringiensis isoliert wurde und das zur biologischen Kontrolle von Pflanzenkrankheiten und ebenso als eine Quelle zur Herstellung transgener Pflanzen mit multipler Resistenz gegen verschiedene Pflanzenviren und phytopathogene Pilze verwendet werden kann.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Vor weniger als 12 Jahren erzeugten Biologen die ersten transgenen Pflanzen. Seither haben Wissenschaftler gentechnische Verfahren bei mehr als 50 Pflanzenarten angewendet. Die Technik hat Forschern geholfen, kritischen Einblick in grundlegende Prozesse zu gewinnen, die die Entwicklung von Pflanzen steuern, und die ersten der auf diese Weise genetisch veränderten Pflanzen sind kommerziell eingeführt worden. Obwohl gentechnische Verfahren komplexer als die herkömmlichen Verfahren zur Pflanzenzucht sind, sind sie genauso sicher. In beiden Verfahren gelangt neue DNA in das Genom der Pflanze und wird stabil beibehalten und exprimiert.
Vor etwa 4 Jahren schloss ein Bericht der National Academy of Sciences der USA, dass „Nutzpflanzen, die durch molekulare und zelluläre Verfahren verändert wurden, keine anderen Risiken aufweisen sollten als jene, die durch klassische genetische Verfahren in ähnlichen Merkmalen verändert wurden." Etwa zur gleichen Zeit ließ das Weiße Haus verlautbaren, dass gentechnisch erzeugte Verfahren keinen zusätzlichen föderalen Regulierungen unterworfen sein sollten, da sie keine ungewöhnlichen Risiken aufweisen.
Eines der vielversprechendsten Merkmale, die Gentransfer-Verfahren bieten, ist Resistenz gegen Krankheiten. Aufsehenerregende Ergebnisse sind bei der Erzeugung von Pflanzen erreicht worden, die gegen Viren resistent sind, eine wichtige Tatsache, denn zur Zeit gibt es keinen direkten Weg, virusinfizierte Pflanzen zu behandeln. Die meisten Infektionen vermindern die Ernte, gelegentlich jedoch erweisen sich einige als katastrophal. Bewährte Anbaupraktiken wie Wechselwirtschaft und Unkrautbekämpfung und Verwendung von Meristemkultur können Viren enthalten, aber nur zum Teil. Insektizide werden gelegentlich verwendet, um die Schädlinge zu kontrollieren, die für die Übertragung von Viren verantwortlich sind, jedoch nur in sehr speziellen und begrenzten Fällen.
Wissenschaftler von Monsanto und anderen Gesellschaften konstruierten einen Vektor, um Phytovirus-Gene in verschiedene Pflanzen einzuführen und zu exprimieren. Die Versuche mit den auf diese Weise veränderten Pflanzen haben gezeigt, dass die Expression der Virusgene Resistenz nur gegen die selben Virusstämme überträgt. Das bedeutet, dass Pflanzen mit einer solch spezifischen Resistenz nur begrenzte praktische Anwendung haben können. Inzwischen haben Forscher jedoch wirksame Toleranz für mehr als ein Dutzend verschiedener Pflanzenviren in einem breiten Bereich von Nutzpflanzenarten erzeugt (Baulcombe, 1994). Aber in jedem dieser Fälle betrifft das Problem der begrenzten Resistenz immer die praktische Verwendbarkeit dieser Pflanzen. Einer der möglichen Wege zur Lösung dieses Problems ist, Gene von Faktoren zu verwenden, die multiple Resistenz der Pflanzen hervorrufen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der Gegenstand der Erfindung ist ein Protein MF2 mit einer neuen Struktur, das Resistenz von Pflanzen gegen Virus- und Pilzinfektionen hervorrufen kann. Die Struktur des Proteins ist in SEQ. ID. NR. 2 dargestellt.
Die Erfindung betrifft auch eine isolierte DNA-Sequenz, die dieses Protein codiert; die DNA hat die in SEQ. ID. NR. 1 dargestellte Sequenz, oder es ist eine DNA-Sequenz, die degenerierte Codons in Bezug auf die vorstehend definierte DNA-Sequenz aufweist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung des Proteins MF2 aus Bakterienzellen, die dieses Protein exprimieren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des Proteins oder von Zusammenstellungen, die dieses enthalten, als ein Pflanzenschutzmittel zur Hervorrufung von Resistenz von Pflanzen gegen virale und Pilz-Phytopathogene.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wir isolierten von einem Mikroorganismus, Bacillus thuringiensis, einen Faktor MF2 in homogener Konsistenz, der in geringer Konzentration multiple Resistenz verschiedener Pflanzen gegen virale Infektionen induziert. Dieser Faktor MF2 ist ein thermostabiles Protein mit geringem Molekulargewicht (7239 Dalton). Dieser Faktor ist offensichtlich ein neues Protein, denn es gelang uns nicht, durch eine vollständig computerisierte Suche in Protein-Datenbanken eine vollständige Homologie zu finden. Das Protein schein hoch homolog zu Kälteschock-Proteinen von Bacillus-Arten (Schröder et al., 1993, Willimsky et al., 1992) und weniger homolog zu Kälteschock-Proteinen von E. coli (Lee et al., 1994) zu sein.
Das Protein der Erfindung kann zur Lösung von phytopathologischen Problemen verwendet werden. Präparate des thermostabilen Proteins können in virusfreier Meristemkultur-Technik von Pflanzen verwendet werden. Es hat den Anschein, dass die Verwendung dieser ökologisch reinen, nicht-phytotoxischen Substanz wirksam zur Erhaltung virusfreier Clone zahlreicher landwirtschaftlich genutzter Pflanzen sein könnte. Eine Kenntnis der Struktur dieses Proteins eröffnet die Möglichkeit zur Herstellung von Gen-Konstrukten zum Erhalt von transgenen Pflanzen, die resistent gegen virale und andere Krankheiten sind.
Es gibt einige Vorteile für solche transgene Pflanzen. Es ist bekannt, dass transgene Pflanzen, die Teile eines viralen Genoms enthalten, als eine Regel spezifische Resistenz gegen dieses spezielle Virus aufweisen. Der im Rahmen der Erfindung verwendete Mikroorganismus weist keine Verwandtschaft zu phytopathogenen Viren auf, die natürlich vorkommen, und wir zeigten, dass das Protein nicht-spezifische Resistenz von Tabakpflanzen sowohl gegen das Tabak-Mosaik-Virus (TMV) als auch gegen das Kartoffelvirus-X (PVX) induziert.
Zur gleichen Zeit führte die Behandlung von Kartoffelpflanzen mit MF2 zur Induktion von Resistenz gegen die Spättrockenfäule („late blight disease"), Phytophtora infestans. Es wurde auch gezeigt, dass das MF2-Protein Resistenz von Reispflanzen gegen die Reisbräune Pyricularia oryzae induzieren kann.
Die DNA-Sequenz, die das MF2-Protein codiert, kann mit der Hilfe von gewöhnlich verwendeten gentechnischen Verfahren, wie zum Beispiel den von Sambrook et al. (1989) beschrieben, in jeden beliebigen Clonierungs- und/oder Expressionsvektor für jeden beliebigen Organismus cloniert werden, vom Bakterium bis zu höheren Eukaryonten, einschließlich Pflanzen.
Wir clonierten auch das Gen, das dieses Protein codiert, und bestimmten die Sequenz dieses Gens. Wir bestimmten ebenfalls die Aminosäuresequenz vom N-Terminus des Proteins MF2.
Wir haben darüber hinaus das MF2-Gen in E. coli exprimiert. Expression des rekombinanten MF2 in anderen Bakterien kann erreicht werden, indem andere Vektoren und Promotoren, einschließlich derjenigen, die kommerziell zu erwerben sind, verwendet werden, zum Beispiel Plasmide, die von Bakteriophagen stammende tac-, trp-Promotoren P₁, T3, T7 etc. enthalten. Das MF2 kann als Chimären-Protein durch Fusion des MF2-Gens mit einem Gen eines anderen bakteriellen Proteins exprimiert werden.
Zur Expression des rekombinanten MF2 in anderen Organismen müssen geeignete Elemente der genetischen Kontrolle und Proteinsynthese berücksichtigt werden. Zum Beispiel können, um das MF2-Gen in Hefe einzuführen, sowohl Plasmide verwendet werden, die autonom replizieren, als auch integrierende Plasmide, centromere Plasmide etc. Zur direkten Expression des MF2-Gens können Promotoren zahlreicher Hefe-Proteine in den Vektor eingeschlossen sein (saure Phosphatase (PHO₅), Alkoholdehydrogenase (ADH), Glycerinaldehyd-3'-Phosphatdehydrogenase (GAPDH) etc.). Zur Expression des MF2-Gens in Pflanzen können Plasmide wie T_i verschiedener Typen oder R_i verwendet werden. Zu den für diesen Zweck geeigneten Promotoren gehören der Promotor des 35S-RNA-Gens des Blumenkohl-Mosaik-Virus (35S-Promotor) und der 2'-Promotor vom 2'-Gen der T-DNA des T_i-Plasmids.
Die vorliegende Erfindung befasst sich mit einer zuvor unbekannten Proteinstruktur, die dokumentierte Aktivität gegen verschiedene Phytoviren und phytopathogene Pilze aufweist. Die Verwendung des Gens dieses Proteins könnte die Entwicklungszeit für neue Sorten transgener Nutzpflanzen mit andauernder und stabiler multipler Resistenz gegen ökonomisch wichtige phytopathogene Viren und Pilze dramatisch verkürzen.
Der Anbau transgener Pflanzen, die mit dem dieses Protein codierenden Gen konstruiert wurden, könnte die sehr aufwändige, arbeitsintensive Meristemkultur ablösen, und er könnte in einigen Fällen den Einsatz von chemischen Insektiziden gegen Virus übertragende Schädlinge und chemischen Fungiziden gegen phytopathogene Pilze ersetzen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung und Reinigung des Proteins MF2 aus Bakterienzellen, die dieses Protein exprimieren; dieses Verfahren umschließt

(a) Extraktion der Bakterienzellen mit einer geeigneten Pufferlösung durch Erhitzen auf eine erhöhte Temperatur, bevorzugt in einem kochenden Wasserbad, um den Hauptteil der temperaturempfindlichen Substanzen aus dem Extraktionsmedium zu entfernen,
(b) Fällung des rohen Polypeptids bei niedriger Temperatur mit einem geeigneten Fällungsmittel, um organische Substanzen mit geringerem Molekulargewicht aus der Proteinfraktion zu entfernen,
(c) Fraktionierung einer Suspension des Niederschlags durch eine chromatographische Anionen-Austauschsäule und Sammlung von Fraktionen mit antiviraler oder antifungaler Aktivität,
(d) Durchführung von PAGE-Elektrophorese mit Proteinfraktionen mit antiviraler oder antimykotischer Aktivität und
(e) Gewinnung des aus dem Gel eluierten Proteins.

In dem Erhitzungsschritt werden die Bakterienzellen wie etwa Bacillus thuringiensis bevorzugt mit einer Kaliumphosphat-Pufferlösung bei pH-Wert 7,4, die EDTA, PMSF (Phenylmethylsulphonylfluorid), ME (beta-Mercaptoethanol) und Triton X-100 (Polyoxyethylenether) enthält, extrahiert. Die Fällung wird bevorzugt bei einer Temperatur von 2 bis 6°C mit gekühltem Chloroform und/oder Propanol und/oder Ammoniumsulfat-Lösung durchgeführt.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung des Proteins MF2 oder einer Zusammenstellung, die sowohl dieses Protein MF2 als auch Transport- und Hilfsstoffe, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, enthält, als ein Pflanzenschutzmittel. Wir haben Pflanzenschutz-Aktivität besonders bei Tabakpflanzen gegen Tabak-Mosaik-Virus und Kartoffelvirus-X nachgewiesen. Wir haben ebenso Schutzaktivität bei Kartoffelpflanzen gegen Pytophtora infestans und bei Reispflanzen gegen Pyricularia oryzae nachgewiesen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
In den Abbildungen zeigen
1 die antivirale Aktivität des aus Bacillus thuringiensis isolierten Proteinfaktors,
2 die Reinigung des antiviralen Faktors auf DEAE-Sepharose,
3 und 4 Proteinbanden aus analytischer PAGE-Elektrophorese mit Triton X-100,
5 Proteinbanden aus analytischer SDS-PAGE-Elektrophorese und
6 die Nucleotid- und Aminosäuresequenzen des MF2-Proteins aus Bacillus thuringiensis.
In den folgenden Untersuchungen wurde der Bacillus thuringiensis-Stamm VNPB-17-3 (Gesamtrussische Mikrobiologische Sammlung) verwendet, welcher einer der Bakterienstämme ist, die aus den Blättern von Kartoffelpflanzen auf einem Feld eines Hofes im Odintsovo-Bezirk der Moskauer Region isoliert wurde.
Kultur- und morphologische Eigenschaften des Stammes VNPB-17-3: die Zellen sind stäbchenförmig (1,0–1,2 × 3–5 nm), in der Mehrheit beweglich, die Flagellen typischerweise lateral. Hitzebeständige Endosporen werden ausgebildet; nicht mehr als eine in einer Sporangiumzelle. Gram-positiv. Sporen haben elliptische Form, Dominante Position von Sporen ist zentral. Produkte bei Aktivität mit Glucose (aber nicht Arabinose, Xylose oder Mannit, wenn Glucose durch diese Stoffe ersetzt wird) sind: Säure bei Kultivierung auf dem nachstehenden Kulturmedium (Gramm pro Liter): (NH₄)₂HPO₄, 1,0; KCl, 0,2; MgSO₄ × 7H₂O, 0,2; Hefe-Extrakt, 0,2; Agar, 15; Bromcresol-Violett, 0.008; Glucose (Zugabe nach Sterilisation), 5; verwendet als Schrägagarröhrchen. Ein anderes Produkt bei Aktivität mit Glucose ist Acetoin bei Kultivierung auf dem nachstehenden Kulturmedium (Gram pro Liter): Protease-Pepton, 7; Glucose, 5; NaCl, 5. Optimale Temperatur für das Wachstum beträgt 30°C, das Minimum beträgt 10°C und das Maximum 45°C. Optimaler pH-Wert ist 7,0. Das Bakterium kann atmosphärischen Stickstoff fixieren. Das Bakterium ist ein Katalase-positiver Organismus. Tyrosin konnte von diesem Stamm nicht abgebaut werden. Daten von morphologischer, Kultur-, physiologischer und biochemischer Analyse erlaubten uns, darauf zu schließen, dass der isolierte Bakterienstamm zur Art Bacillus thuringiensis gehört (The shorter Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 1980; de Baijac & Bonnefoi, 1967; Krieg A., 1968).
Antivirale Aktivität eines gekochten Extraktes des Stammes VNPB-17-3 von B. thuringiensis.
Beispiel 1: Herstellung eines gekochten Extraktes des Proteins aus B. thuringiensis
Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation bei 6.000 UpM über 20 min (Sorvall-RC28S-Zentrifuge, Rotor GS-3) gesammelt und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Material wurde in 100 ml 50 mM Kaliumphosphat-Pufferlösung, pH-Wert 7,4, die 4 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% beta-Mercaptoethanol (ME) und 0,1% Triton X-100 enthielt, resuspendiert. Die Bakterienzellen wurden durch Erhitzen in einem kochenden Wasserbad über 20 min aufgebrochen und mit 6000 UpM für 20 min zentrifugiert.
Alle weiteren Schritte der Reinigung wurden bei niedriger Temperatur (2-6°C) durchgeführt. Der Überstand wurde mit einer Volumeneinheit kaltem Chloroform behandelt und mit 3.000 UpM für 20 min und dann für 15 min bei 20.000 Upm zentrifugiert (Sorvall-RC28S-Zentrifuge, Rotor F26/50). Der Niederschlag wurde entfernt, und das Material wurde mit 5 Volumeneinheiten kaltem Propanol behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht bei –20°C gelagert und dann für 15 min mit 20000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde lyophilisiert.
Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung bestimmter Verfahren zur Durchführung unserer Erfindung. In diesen Untersuchungen wurde ein gekochter Extrakt des Stammes VNPB-17-3 von B. thuringiensis verwendet. Dieses Präparat wurde durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten.
Beispiel 2. Die schützenden Eigenschaften von MF2 vor dem Tabak-Mosaik-Virus (TMV) auf Tabakpflanzen.
Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum Var. Virginia und Nicotiana glutinosa) wurden bis zu einem Stadium von sechs Blättern (etwa 3 Wochen) in Töpfen mit Erde in einer Klimakammer bei RF (relativer Luftfeuchte) von 60% und einer Temperatur von 24°C bei Hell- und Dunkelperioden (jeweils 12 h) gezogen. Blätter von Tabakpflanzen wurden unter Verwendung von Karborund als einem Schleifmittel mit einem Pinsel beimpft. Jede Hälfte eines Tabakblattes von 3 Wochen alten Pflanzen wurde (mit Karborund) mit 0,3 ml des gekochten Extraktes von B. thuringiensis eingerieben (50 g/ml des lyophilisierten Extraktes in 10 mM K-Phosphat-Pufferlösung, pH-Wert 7,0, 4 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Dithiothreit). Die andere Seite des gleichen Blattes wurde mit Pufferlösung eingerieben (Kontrolle). Zwei Tage später wurden beide Seiten des gleichen Blattes mit einer Suspension des Tabak-Mosaik-Virus eingerieben (200 g/ml, in 10 mM K-Phosphat-Pufferlösung, pH-Wert 7,0, 0,3 ml/Blatthälfte). Typische Symptome der Krankheitsentwicklung (linker Teil des Blattes) und antivirale Aktivität des isolierten MF2-Faktors (rechter Teil) werden in 1 dargestellt.
Das Ausmaß der infektiösen Beschädigung auf jeder Blatthälfte wurde nach 3 Tagen erfasst. Entwicklung der Erkrankung (%) wurde als ein Verhältnis der Anzahl der Beschädigungen bei Test und Kontrolle gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle I dargestellt. Der gekochte Extrakt von B. thuringiensis hat schützende Wirkung für Tabakpflanzen vor TMV-Infektion gezeigt.
Tabelle I. Antivirale Aktivität des gekochten Bakterienextraktes (MF2) von B. thuringiensis Anzahl der Schädigungen bei: mit MF2 behandelte Blatthälften/unbehandelte Blatthälften
Beispiel 3. Schützende Eigenschaften von MF2 gegen das Kartoffelvirus-X (PVX) auf Tabakpflanzen
Vier 3 Wochen alte Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum, Sorten Xanthy und Virginia) wurden für jede Pflanzensorte verwendet. Das dritte und vierte Blatt der Pflanzen (von der Spitze aus gezählt) wurden mit 0,5 ml MF2-Extrakt (50 μg/ml lyophilisierter Extrakt-Niederschlag wurden in 10 mM KH₂PO₄-Pufferlösung, pH-Wert 7,0 gelöst) eingerieben. Vier Kontrollpflanzen jeder Varietät wurden mit der selben Pufferlösung ohne den Extrakt behandelt. Nach einem Tag wurden alle Pflanzen mit dem Kartoffelvirus-X (PVX) geimpft. PVX wurde als ein Blattextrakt von voll PVX-infizierten Kartoffeln, bei –70°C tiefgekühlt gelagert, verwendet.
Zwei Wochen nach der Impfung wurde PVX in allen behandelten Blättern unter Verwendung der enzymverbundenen Standard Immunadsorptionsuntersuchung (ELISA) untersucht. Die ELISA-Untersuchungen wurden mit Hilfe eines PVX-ELISA-Kits (Gesamtrussisches Kartoffelforschungsinstitut, Malakhova, Region Moskau) durchgeführt. Die Absorptionen wurden unter Verwendung von 0,1% Blattsaft nach Standard-Untersuchungsverfahren gemessen. Die Ergebnisse dieser Versuche werden in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigten einen hohen Grad an Schutzaktivität von MF2 gegen PVX auf Tabakpflanzen.
Tabelle 2. Antivirale Aktivität von MF2 gegen PVX auf Tabakpflanzen
Isolierung und Reinigung von MF2 aus Bacillus thuringiensis
Beispiel 4. Aufbruch von Bakterienzellen und Fraktionierung mit organischen Lösungsmitteln
Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation bei 6000 UpM für 20 min (Sorvall-RC28S-Zentrifuge, Rotor GS-3) gesammelt und zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Das Material wurde in 100 ml 50 mM Kaliumphosphat-Pufferlösung, pH-Wert 7,4, die 4 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% beta-Mercaptoethanol (ME) und 0,1% Triton X-100 enthielt, resuspendiert. Die Bakterienzellen wurden durch Erhitzen in einem kochenden Wasserbad über 20 min aufgebrochen und zentrifugiert, wie vorstehend beschrieben. Alle weiteren Schritte der Reinigung wurden bei niedriger Temperatur (2–6°C) durchgeführt. Der Überstand wurde mit einer Volumeneinheit kaltem Chloroform behandelt und zuerst mit 3.000 UpM für 20 min und dann für 15 min bei 20.000 Upm zentrifugiert (Sorvall-RC28S-Zentrifuge, Rotor F26/50). Der Niederschlag wurde entfernt, und das Material wurde mit 5 Volumeneinheiten kaltem Propanol behandelt. Das Gemisch wurde über Nacht bei –20°C gelagert und dann für 15 min mit 20000 UpM zentrifugiert.
Beispiel 5. Anionenaustausch-Chromatographie
Der Niederschlag wurde in 250 ml 20 mM Triethanolamin-Pufferlösung, pH-Wert 7,5, die 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Dithiothreit enthielt, suspendiert und auf eine Säule gegeben (Durchflussrate 3 ml/min), die zuvor mit DEAB-Sepharose Fast Flow-Gel (20 ml) beladen und mit der selben Pufferlösung äquilibriert worden war. Die Elution wurde mit einem über 50 min linear ansteigenden Salzgradienten aus 0,3 M NaCl (0–100%, Durchflussrate 5 ml/min, Fraktionsvolumen – 2,4 ml) durchgeführt und bei 280 nm (0,1 AU) nachgewiesen. Die Ergebnisse der Anionenaustausch-Chromatographie auf DEAE-Sepharose werden in 2 dargestellt. Fraktionen mit antiviraler Aktivität (Peaks II, III und IV) wurden gesammelt, gemischt, vakuumgetrocknet, wiederum mit 5 Volumeneinheiten Ethanol ausgefällt, zweimal mit 70% Ethanol gewaschen und in der nächsten Reinigung mit präparativer PAGE verwendet.
Beispiel 6. Präparative PAGE
Ein Mini-Protein II-Elektrophorese-System ("Bio-Rad") wurde verwendet, 17,5% Acrylamid-Gel (Dicke 1,6 mm) und das Laemmli-Pufferlösungssystem, das Detergentien – SDS oder Triton X-100 oder das chaotrope Agens 8 M Harnstoff – enthielt. Die Laufbedingungen waren 200 Volt mit konstanter Spannungseinstellung, und die Laufzeit betrug etwa 1 h in einem kalten Raum. Nach der Elektrophorese wurde der Kontrollstreifen des Gels ausgeschnitten und mit 0,1% Coomassie-Blau R-250 in 50% Methanol angefärbt. Nach Entfärbung mit 10% Ethanol und 5% Essigsäure, um den Hintergrund zu entfernen, wurden die Proteinbanden aus dem ungefärbtem Gel ausgeschnitten, mit 50 mM Kaliumphosphat-Pufferlösung, pH-Wert 7,5, mit 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1% ME, 0,1% Detergenz (SDS oder Triton X-100) homogenisiert und über Nacht in einem kalten Raum unter Schütteln inkubiert. Die Proben wurden eingedampft, zweimal mit 70% Ethanol gewaschen, in 10 mM Kaliumphosphat-Pufferlösung, pH-Wert 7,5, die 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Dithiothreit enthielt, resuspendiert und auf ihre antivirale Aktivität untersucht.
Ein wirksamere Trennung der Proteinbanden wurde erreicht, wenn PAGE mit SDS oder 8 M Harnstoff verwendet wurde, in diesen Fällen verlor das Material jedoch seine antivirale Aktivität. Auch die Färbung des Gels mit Coomassie-Blau zerstörte die Aktivität. Daher wurde die nicht so wirksame, aber nicht denaturierende PAGE mit Triton X-100 ohne Anfärbung für die Suche nach bioaktiven Proteinbanden verwendet. Nach der Elution wurde ein Teil des Materials auf antivirale Aktivität, ein anderer mit analytischer PAGE auf Homogenität untersucht.
Beispiel 7. Analytische PAGE mit SDS und Triton X-100
Ein Mini-Protein II-Elektrophorese-System („Bio-Rad") und das Laemmli-Pufferlösungssystem wurden verwendet. Die Durchlaufbedingungen waren wie jene für die präparative PAGE. Im Fall von SDS wurde ein stufenweiser Gradient von Acrylamidgel-Konzentrationen von 5, 12,5 15 und 17% verwendet. Dieses Verfahren wurde auch für den Nachweis des antiviralen Faktors in verschiedenen Stufen der Isolierung und zur Bestimmung seines Molekulargewichtes verwendet. Diese Ergebnisse werden in den 3, 4, und 5 dargestellt. Die aktive Probe B (3) wurde eingedampft und zur Sequenzanalyse verwendet.
In 3 wurden Proteinbanden, die aus der präparativen PAGE eluiert worden waren, auf 17,5% PAGE mit Triton X-100 analysiert. F kennzeichnet die anfänglich bioaktive Fraktion nach DEAE-Sepharose (2), A bis E die aus der präparativen PAGE eluierten Proteinbanden. B, C und F sind Banden mit antiviraler Aktivität, und A, D und E sind inaktive Banden. Das Symbol AVF kennzeichnet den antiviralen Faktor MF2.
In 4 wurden Protein-Spitzen analysiert, die aus der DEAE-Sepharose-Säule eluiert worden waren. F kennzeichnet die anfängliche bioaktive Fraktion nach DEAE-Sepharose. D kennzeichnet Peak I, A Peak II, B Peak III und C Peak IV. A, B und C sind Peaks mit antiviraler Aktivität, D ist inaktiv.
5 stellt eine analytische SDS-PAGE dar. Ein stufenweiser Gradient der Acrylamidgel-Konzentrationen von 5, 12,5 15 und 17% wurde verwendet. I bis IV sind Proteinpeaks, die aus DEAE-Sepharose eluiert worden sind, A ist Carboanhydrase (MG 29.000), B ist Cytochrom C (MG 12.400), C ist die aktive Fraktion aus der DEAE-Sepharose-Säule, D bis E sind Proteinbanden, die aus der präparativen PAGE eluiert worden sind. II, IV, C und E sind Banden mit antiviraler Aktivität, I und D sind inaktive Banden.
Tabelle 3. Antivirale Aktivität in verschiedenen Stufen der MF2-Reinigung
Dies ist die minimale aktive Proteinkonzentration. Die Ausgangsmenge an Protein, die aus dem Gel eluiert worden war (etwa 10 μg), wurde durch das Bredfordsche Verfahren (1976) bestimmt, und sie wurde dann mehrere Male verdünnt.
Schlussfolgerung
Wir isolierten aus dem Bakterium B. thuringiensis einen Faktor, der Tabakpflanzen vor TMV-Infektion schützen kann. Dieser Faktor hat Proteinnatur und ein Molekulargewicht von etwa 8.000. Er ist ein thermostabiles Peptid, verliert aber in einem Rohextrakt sehr schnell seine Aktivität (2 h bei Zimmertemperatur), was das Ergebnis von Protease-Aktivität sein kann. Diese Vermutung wurde durch den Anstieg antiviraler Aktivität während der Reinigung bestätigt (vgl. Tabelle 3). MF2 verlor seine antivirale Aktivität nach Behandlung mit SDS oder Harnstoff. Es konnte gefolgert werden, dass die antivirale Aktivität dieses Proteins von seiner Struktur abhängig ist.
Schützende Eigenschaften von MF2-Präparaten vor Pilzerkrankungen
Beispiel 8. Aktivität von MF2 gegen Brandbefall
Pilz
Ein natürliches Isolat H-5-3 von Pyricularia oryzae Cav., Reisbrand verursachendes Agens, wurde verwendet. Der Pilz wurde bei 28°C auf Agar-Minimalkulturmedium kultiviert, das 3 mg/ml Casein-Hydrolysat enthielt. Sporen (Konidien) von der 10 Tage alten Kultur wurden mit destilliertem Wasser ausgewaschen (4°C). Myzel-Verunreinigungen wurden durch Filtration durch Miracloth (Calbiochem-Behring Corp.) und zwei Lagen eines Edelstahlnetzes (Porengröße 50 μm) entfernt. Die Sporensuspension wurde durch doppelte Zentrifugation für 15 min mit 7000 × g gewaschen und in destilliertem Wasser resuspendiert. Die Sporenkonzentration wurde in einem Hämocytometer unter einem Mikroskop ausgezählt.
Pflanzen
Es wurde Reis Oryza sativa L., Var. Sha-tiao-tsao, verwendet, die für den vorstehend genannten Pilzstamm anfällig ist. Die Pflanzen wurden bis zu einem Stadium von vier Blättern (für etwa 13–15 Tage) in Töpfen (10 Pflanzen pro Topf) in Erde in einer Klimakammer mit RF 95% bei den Temperaturen von 30°C beziehungsweise 23°C während der hellen beziehungsweise dunklen Perioden (jeweils 12 h) gezogen. Die Lichtquelle (20 kLux) bestand aus einer 10 kW-Xenon-Lampe (DKsT-10000) mit einem Wasserfilter.
Beimpfung und Beurteilung der Erkrankung
Die Reispflanzen wurden mit einer Sporensuspension (100.000 Sporen pro ml, 5 ml Suspension für einen Topf) besprüht. Die behandelten Pflanzen wurden über 18–24 h in einer feuchten Kammer im Dunkeln bei 23°C inkubiert und dann in der Klimakammer unter Licht gestellt. Die Krankheitssymptome wurden nach 10 Tagen überprüft. Um die Lebensfähigkeit des Impfstoffs zu untersuchen, wurden Tropfen der Sporensuspension über 15 h in einer Multi-Mikrotiterplatte im Dunkeln bei 23°C inkubiert. Die Keimung der Sporen wurde daraufhin ausgezählt.
Behandlung mit MF2-Präparaten
Pufferlösungen mit MF2-Präparaten wurden dem Impfstoff zugegeben (die Endkonzentration betrug 50 μg des lyophilisierten Extraktes pro ml Sporensuspension). Die Kontrollproben enthielten die gleiche Menge an Pufferlösung.
Keine der MF2-Präparate hemmte in den verwendeten Konzentrationen die Keimung der Sporen von P. oryzae in Wasser. Auf der anderen Seite schützte die Zugabe der Präparate zum Impfstoff die Reispflanzen vor Reisbrand in einem signifikanten Ausmaß (Tabelle 4). Tabelle 4. Aktivität von MF2-Präparaten aus B. thuringiensis gegen Brandbefall

mit
R – Entwicklung der Erkrankung (%)
a – Anzahl der infizierten Pflanzen
b – Typ der Infektion
N – Gesamtzahl der Pflanzen
3 – höchster Typ der Infektion
Beispiel 9. Schützende Aktivität von MF2-Präparaten gegen Spättrockenfäule an Kartoffeln
Die Testpflanzen (Kartoffel, Sorte Lorkh) waren fünf Wochen alt. Vier Blättchen des fünften (von der Spitze gezählt) vollgeöffneten Blattes wurden für jede Variante ausgeschnitten und mit MF2-Extrakt behandelt, der einer Sporensuspension von Phytophtora infestans zugegeben worden war (10³ Sporen/ml). Die Endkonzentration von MF2 im Gemisch betrug 50 μg des lyophilisierten Extraktes pro ml Suspension.
Bei der Kontrollvariante wurden Kartoffelblätter mit einer Sporensuspension von Ph. infestans mit der selben Konzentration beimpft. Statt des MF2-Extraktes wurde die gleiche Menge an Pufferlösung zu dieser Suspension zugegeben.
Der Impfstoff (0,5 ml pro Blättchen) wurde auf die Blattoberfläche gesprüht. Nach der Impfung wurden die Blätter für 2–3 Tage in eine feuchte Kammer bei 18–20°C gestellt.
Die Intensität der Durchdringung wurde bestimmt, indem das Ausmaß der Schädigung pro cm² Blattoberfläche berechnet wurde. Die Ergebnisse dieser Versuche werden in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5. Ausmaß der Schädigung pro cm² Blattoberfläche an isolierten Kartoffelblättern, die mit MF2 behandelt wurden
m ± (P = 0,95)
Die Ergebnisse der Tabelle 5 zeigen eine hohe schützende Aktivität des MF2-Extraktes vor Spättrockenfäule an Kartoffeln. Da keine hemmende Wirkung von MF2 (in den verwendeten Konzentrationen) auf die Keimung der Sporen festgestellt wurde, scheint die schützende Aktivität Mechanismen von induzierter Resistenz zu betreffen.
Beispiel 10. Sequenzierung des N-Terminus von MF2
Die Salze der reinsten Fraktion der MF2-Proteinprobe wurden unter Verwendung einer Pro Spin-Patrone (Applied Biosystems) nach den Anweisungen des Herstellers entfernt.
NH₂-terminale Aminosäure-Sequenzanalyse wurde mit einem Proteinsequenziergerät von Applied Biosystems, Modell 477A, durchgeführt, der mit einem online-Aminosäure-Analysator von Applied Biosystems, Modell 120A PTH ausgestattet war. Es wurden Standard-Kreislaufparameter verwendet. Die Aminosäuresequenz des N-Terminus von MF2 wird in Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6. N-terminate Sequenz des MF2-Proteins
Beispiel 11. Clonierung und Sequenzierung des MF2-Gens aus B. thuringiensis
Nach der N-terminalen Aminosäuresequenz wurde das degenerierte Oligonucleotid
synthetisiert. Chromosomale DNA mit hohem Molekulargewicht wurde aus B. thuringiensis-Zellen isoliert und mit 8 Restriktasen (BamHI, EcoRI, HindIII, SalI, SacI, PstI, SphI und NdeI) gespalten, getrennt und in Paaren. Die Restriktionsprodukte wurden nach ihren Molekulargewichten durch Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf eine HybondN-Membran durch ein Plot-Verfahren übertragen. Das synthetische Oligonucleotid wurde mit T4-Polynucleotid-Kinase und [³²P]ATP markiert und als die radioaktive Sonde in Southern-Hybridisierungsuntersuchungen verwendet. Auf den Röntgenfilmen erschien lediglich eine positive Bande pro Restriktion. Basierend auf den Molekulargewichten der positiv hybridisierten Fragmente wurde die Restriktionskarte des chromosomalen Gens von MF2 erstellt. PstI-Spaltung von chromosomaler DNA wurde auf 65% gering gelierende Agarose aufgetragen, und nach der Elektrophorese wurden DNA-Fragmente mit etwa 5,6 kBp aus dem Gel isoliert. Sie wurden wiederum mit HindIII und BamHI gespalten, auf 0,8% gering gelierendes Agarosegel aufgetragen, und nach der Elektrophorese wurden DNA-Fragmente mit etwa 1,6–1,7 kBp isoliert. Sie wurden in den mit HindIII und BamHI gespaltenen Vektor pUC18 ligiert. Geeignete E. coli-Zellen (Stamm XL1-blue) wurden mit diesem Ligierungsgemisch transformiert und auf LB-Platten gezüchtet, die Ampicillin (50 mg/l) enthielten. Die Kolonien wurden auf eine HybondN-Membran übertragen und dem Kolonie-Hybridisierungsverfahren unterworfen, wobei das radioaktive Oligonucleotid als Sonde diente. Etwa 70% der Kolonien zeigten eine positive Hybridisierung.
Plasmid-DNA eines positiven Clons wurde isoliert und zur Sequenzierung der Insertion verwendet. Die DNA-Sequenz, die den N-terminus des antiviralen Proteins codiert, schien nahe der HindIII-Stelle zu liegen. Ein offener Leserahmen mit 198 Bp, mit ATG beginnend und mit TAA endend, wurde gefunden. Nach der DNA-Codierungsregion besteht das antivirale Protein aus 66 Aminosäureresten (6). Das berechnete Molekulargewicht beträgt 7239 D, der berechnete isoelektrische Punkt liegt bei 4,43, und die molare Absorptivität beträgt 5690.
In diesem Beispiel wird die Einführung des MF2-Gens von B. thuringiensis in den Clonierungsvektor von E. coli beschrieben.
Unter Verwendung von synthetischen Oligonucleotiden oder natürlichen Restriktionsstellen kann das Gen unter der Kontrolle von Regulationselementen von Transkription und Translation, die für den betreffenden Organismus spezifisch sind, nach Sambrook et al. (1989) eingefügt werden.
Beispiel 12. Expression des MF2-Gens in E. coli
Expression des MF2-Gens in E. coli wurde wie folgt erreicht. Plasmid-DNA, die das MF2-Gen als einen Teil des 1,6–1,7 kBp großen Fragmentes von B. thuringiensis enthielt (in Beispiel 11 beschrieben), wurde mit den Restriktasen HindIII und Sau3AI gespalten. Um das MF2-Gen unter der Kontrolle des lac-Promotors von E. coli einzufügen, wurde das HindIII-Sau3AI-Fragment aus etwa 600 Bp, das das MF2-Gen enthielt, aus 1% gering gelierendem Agarosegel isoliert und in den mit HindIII und BamHI gespaltenen Vektor pUC19 ligiert. Kompetente E. coli-Zellen (Stamm XL1-blue) wurden mit diesem Ligationsgemisch transformiert und wurden auf LB-Agar, der Ampicillin (50 mg/l) enthielt, gezüchtet. Das erhaltene Plasmid wurde als pBTR-31 bezeichnet.
Die XL1-blue-Zellen von E. coli, die pBTR-31 beherbergten, wurden über Nacht bei 37°C in LB-Kulturmedien mit Ampicillin (70 mg/l) gezüchtet. Aufbruch der Zellen und partielle Fraktionierung der löslichen Zellproteine wurde, wie in Beispiel 4 beschrieben, durchgeführt. Das erhaltenen Proteinpräparat wurde mit Hilfe von 17,5% PAGE, die Triton X-100 enthielt, wie in Beispiel 7 beschrieben, analysiert. Die Proteinbande war entschlüsselt und stimmte mit authentischem MF2 in Molekularmasse und elektrophoretischen Eigenschaften überein.
Das durch analytische PAGE-Elektrophorese entschlüsselte Protein wurde präparativ isoliert, wie in Beispiel 6 beschrieben, und auf antivirale (TMV) Aktivität auf Blättern von Tabakpflanzen untersucht, wie in Beispiel 2 beschrieben. Die in Tabelle 7 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass rekombinanter MF2 schützende Wirkung für Tabakpflanzen vor TMV-Infektion hat, die mit den Eigenschaften von nativem MF2 aus B. thuringiensis vergleichbar ist.
Tabelle 7. Antivirale Aktivität von rekombinantem MF2 auf Tabakpflanzen (Sorte Xanthy) Anzahl der Schädigungen auf mit MF2 behandelten Blatthälften/unbehandelten Blatthälften
Literatur

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Claims

Isolierte DNA-Sequenz, wobei die DNA-Sequenz (a) eine DNA-Sequenz ist, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die das Protein MF2 codiert, das die in SEQ ID Nr. 2 angegebene Aminosäuresequenz aufweist, (b) die in SEQ ID Nr. 1 angegebene DNA-Sequenz ist, oder (c) eine DNA-Sequenz ist, die in Bezug auf die DNA-Sequenz gemäß (b) degenierte Codons aufweist.
MF2-Protein, das die in SEQ ID Nr. 2 angegebene Aminosäuresequenz aufweist, an sich oder als Teil eines beliebigen größeren Proteins.
Verfahren zur Isolierung und Reinigung des wie in Anspruch 2 definierten Proteins MF2 aus Bacillus thuringiensis-Zellen, die das Protein exprimieren, wobei das Verfahren umfasst: (a) Extrahieren der Bacillus thuringiensis-Zellen mit einem Kalium-Phosphat-Puffer, pH-Wert 7,4, der EDTA, PMSF, Mercaptoethanol und Triton-X-100 enthält, unter Erhitzen auf eine erhöhte Temperatur in einem kochenden Wasserbad, um den Hauptanteil an temperatursensitiven Substanzen aus dem Extraktionsmedium zu entfernen, (b) Ausfällen des rohen Proteins bei ungefähr 2 bis 6°C mit gekühlter Chloroform- und/oder Propanol- und/oder Ammoniumsulfatlösung, um organische Verbindungen mit einem niedrigen Molekulargewicht aus der Proteinfraktion zu entfernen, (c) Fraktionieren einer Suspension des Präzipitats durch eine Anionenaustauschchromatographiesäule und Sammeln von Fraktionen mit antiviraler oder antimykotischer Aktivität, (d) Durchführen einer PAGE-Elektrophorese mit den Proteinfraktionen mit antiviraler oder antimykotischer Aktivität, und (e) Gewinnen des vom Gel eluierten Proteins.
Vektor, umfassend die DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1.
Pflanzenschutzmittel, umfassend das MF2-Protein wie in Anspruch 2 definiert.
Verwendung des wie in Anspruch 2 definierten Proteins als Pflanzenschutzmittel.
Verwendung des wie in Anspruch 2 definierten Proteins zur virusfreien Meristemkultur von Pflanzen.
Verwendung gemäß Anspruch 6, um Tabakpflanzen Schutz gegen das Tabak-Mosaik-Virus oder das Kartoffelvirus-X zu verleihen.
Verwendung gemäß Anspruch 6, um Kartoffelpflanzen Schutz gegen die durch Phytophtora infestans verursachte Braunfäule an Kartoffeln zu verleihen.
Verwendung gemäß Anspruch 6, um Reispflanzen Schutz gegen die durch Pyricularia oryzae verursachte Reisbräune zu verleihen.
Verfahren zur Induktion von Pflanzenresistenz gegen virale oder pilzliche Phytopathogene, umfassend das Aufbringen einer die Pflanzen schützenden Menge eines Pflanzenschutzmittels gemäß Anspruch 5 auf die Pflanzen.