DE69635535T2

DE69635535T2 - Verbindendes Protein

Info

Publication number: DE69635535T2
Application number: DE69635535T
Authority: DE
Inventors: Sergio Abrignani
Original assignee: Chiron SRL
Current assignee: GSK Vaccines SRL
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2016-08-31
Also published as: US20010027565A1; AU712540B2; CA2227301C; JP2008079613A; DE69635535D1; JP2007039462A; US6737233B1; DE69629121T2; GB9517926D0; IL123169A; US20040180053A1; NZ316186A; JP4223074B2; EP1321476A2; IL123169A0; JP2000500004A; ATE311408T1; US20060166193A1; EP0852586B1; EP0852586A1

Description

Fachgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die in der Lage sind, das Hüllprotein E2 des Hepatitis-C-Virus (HCV) zu binden, und Verfahren zur Herstellung und Reinigung.
Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung der Proteine in der Therapie und Diagnose und in Arzneimitteln und diagnostischen Kits für solche Verwendungen. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Durchmusterung von mutmaßlichen Molekülen, die mit HCV um die Rezeptorbindung konkurrieren. Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Tiermodel für die HCV-Infektion.
Kurze Beschreibung des Fachgebiets
HCV (früher bekannt als Nicht-A-Nicht-B-Hepatitis – NANBV) ist ein RNA-Virus mit positiver Sense-Orientierung von etwa 10000 Nucleotiden mit einem einzelnen offenen Leserahmen, der ein Polyprotein von etwa 3000 Aminosäuren codiert. Obwohl die Struktur des Virus durch rekombinante DNA-Techniken aufklärt wurde (1, 2), wurde das Virus selbst nicht isoliert und die Funktionen der verschiedenen viralen Proteine, die durch Proteolyse des Polyproteins hergestellt wurden, wurden nur durch die Analogie mit anderen ähnlichen Viren mit einer ähnlichen genomischen Organisation abgeleitet (3).
Die viralen Proteine sind alle in rekombinanter Form, die in einer Vielfalt von Zellen und Zellarten einschließlich Hefe, Bakterien, Insekten- und Säugerzellen exprimiert werden, erhältlich (4, 5).
Von zwei Proteinen, die E1 und E2 (die jeweils den Aminosäuren 192–383 und 384–750 entsprechen) genannt werden, wurde vermutet, dass sie externe Proteine der viralen Hülle sind, die für die Bindung des Virus an die Zielzellen verantwortlich sind (3).
Die HCV-Forschung wird sehr beträchtlich durch den begrenzen Wirtsbereich des Virus eingeschränkt. Das einzige zuverlässige Tiermodel für die HCV-Infektion ist der Schimpanse und es ist nicht möglich HCV in Gewebekultur zu vermehren.
In unserer schwebenden internationalen Patentanmeldung WO 9605513 beschreiben wir ein Verfahren, das die Durchflusszytrometrie verwendet, um Zellen, die den HCV-Rezeptor tragen, zu identifizieren. Wir haben gezeigt, dass es durch die Markierung von Zellen mit dem rekombinanten E2-Hüllprotein möglich ist, Zellen unter Verwendung der Durchflusszytrometrie zu sortieren und solche Zellen, die in der Lage sind das E2-Proein spezifisch zu binden und daher möglicherweise den HCV-Rezeptor tragen, zu isolieren. Unter Verwendung dieser Technik haben wir ein Protein identifiziert, das in der Lage ist, das E2-Hüllprotein von HCV zu binden, und von dem wir glauben, dass es der Rezeptor für HVC ist, wodurch es ermöglicht wird, viele Probleme auf dem Fachgebiet zu lösen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Assay, der ein Protein verwendet, das ein Molekulargewicht von etwa 24 kD besitzt und das in der Lage ist, ein Protein des Hepatitis-C-Virus spezifisch zu binden, oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein Fragment davon, zur Verfügung gestellt, wie in dem Anspruch 1 definiert ist.
Es wird für den Fachmann selbstverständlich sein, dass die Molekulargewichte, die, wie nachfolgend beschrieben wird, unter Verwendung von Elektrophorese gemessen werden, von Natur aus der Interpretation unterworfen sind, da sie relativ zu Standard-Molekulargewichtsmarkern gemessen werden. Im Rahmen dieser Beschreibung ist jedoch der Ausdruck „24 kd" eindeutig, wenn er in diesem Zusammenhang gelesen wird, da nur ein solches Protein durch die nachfolgenden Verfahren, die nachfolgend beschrieben werden, mit dem definierten Kennzeichen der Bindung des Hepatitis-C-Virus erhalten wird.
Eine bedeutende kennzeichnende Eigenschaft des Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung ist seine Fähigkeit, spezifisch an ein HCV-Protein zu binden, vorzugsweise an ein Hüllprotein, besonders das E2-Protein.
Auf der Grundlage dieser Spezifität und anderer Kennzeichen, die nachfolgend beschrieben werden, schließen wir, dass das 24 kd große Protein der Erfindung ein zellulärer Rezeptor für HCV ist.
Wir haben gezeigt, dass das Protein in Menschen unter den Zellarten, die wir getestet haben, allgemein verbreitet ist, was parallel zu der Situation ist, die für viele andere Viren dieser Art (wie z.B. das Vaccina-Virus und das Grippevirus) gefunden wird.
Wir haben gezeigt, dass das Protein in einer Weise artspezifisch ist, die der Artspezifität von HCV selbst gleicht.
Unsere Experimente zeigten, dass das 24 kd große Protein funktionell nicht glycosyliert ist. Die Behandlung mit Glycosidasen hat keinen Einfluss auf die Fähigkeit des 24 kd großen Proteins, an das E2-Protein zu binden, und scheint das Molekulargewicht nicht deutlich zu vermindern. Wir leiten daher ab, dass die Glycosylierung nur auf eine geringe Anzahl von Zuckereinheiten beschränkt ist, wenn das Protein überhaupt glycosyliert ist, und dass es nicht notwendig für die funktionelle Aktivität des Proteins ist.
Unsere Experimente zeigten ebenfalls, dass das Protein ein Transmembranprotein ist, was erneut darauf hinweist, dass es sich um einen zellulären Rezeptor handelt.
Experimente mit Zelllinien, die das Protein überexprimieren, zeigen schließlich, dass solche Zellen zur Aggregation neigen, was darauf hinweist, dass das Protein eine Art von Adhäsionsmolekül sein kann.
Das 24 kd große Protein kann in seiner natürlich vorkommenden Form vorliegen, wenn auch isoliert aus seiner natürlichen Umgebung, oder es kann modifiziert sein, vorrausgesetzt, dass es die funktionellen Eigenschaften von zumindest der Bindung an das E2-Protein von HCV behält. Zum Beispiel kann das 24 kd große Protein chemisch modifiziert sein, um eine oder mehrere chemische Modifikationen in der Aminosäurestruktur einzubringen. Es kann Modifikationen der Aminosäuresequenz einschließen, wobei eine oder mehrere Insertionen, Deletionen oder ersetzte Aminosäuren eingeschlossen sind. Es kann zum Beispiel durch die Entfernung eines funktionellen Anteils der transmembranen Domäne verkürzt sein, um die einfache Herstellung durch rekombinante DNA-Verfahren in einer geeigneten Säuger-Wirtszelle zu erleichtern (6).
Das Protein der vorliegenden Erfindung kann von Zellen isoliert werden, die eine Bindung an ein HCV-Protein wie z.B. das E2-Protein zeigen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird hierin ein Verfahren zur Herstellung eines Proteins gemäß der Erfindung oder einer funktionell äquivalenten Variante oder eines Fragments davon beschrieben, umfassend den Schritt der Kultivierung der Zellen, die eine Bindung an ein HCV-Protein zeigen, und der Reinigung eines Proteins gemäß der Erfindung aus einer Zellzubereitung.
Die Zellen können transformierte oder nicht transformierte Säugerzellen sein und sind geeigneterweise menschliche Zellen.
Die Zellen können unter Verwendung der Fluoreszenz-Durchflusszytometrie oder durch jeden anderen geeigneten Assay auf die Bindung an ein HCV-Protein durchgemustert werden. Die vorliegende Beschreibung stellt zum Beispiel die Informationen zur Verfügung, die notwendig sind, um das 24 kd große Protein oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein Fragment davon herzustellen, welches anschließend selbst dazu verwendet wird, um weitere Zellen, die das Protein tragen, zu untersuchen.
Die Zellherstellung kann eine Zellmembranzubereitung sein, aber sie ist vorzugsweise eine Plasmazellmembranzubereitung.
Vorzugsweise werden die Zellen ausgewählt und cloniert, um eine Überexpression des Proteins der vorliegenden Erfindung zur Verfügung zu stellen.
Wir haben herausgefunden, dass das Protein durch Ammoniumsulfat bei einer Sättigung zwischen 33 und 50% gefällt wird.
Daher wird für die Zellherstellung vorzugsweise ein Reinigungsschritt durch die Ammoniumsulfatfällung, wobei Ammoniumsulfat zwischen 33 und 50% verwendet wird, durchgeführt. Geeigneterweise wird eine erste Fällung bei weiniger als 33% durchgeführt und das gefällte Material wird verworfen, gefolgt von einer Fällung des gewünschten Materials zwischen 33 und 50%, am stärksten bevorzugt 50%.
Vorzugsweise schließt die Reinigung mindestens einen Schritt der hydrophoben Chromatographie ein.
Wir haben ebenfalls herausgefunden, dass das Protein gegenüber einer Aceton-Fällung stabil ist, wodurch es ein noch weiteres Kennzeichen und einen nützlichen Verfahrungsschritt zur Reinigung zur Verfügung stellt.
In einer optimierten Form umfasst das Verfahren der Reinigung besonders bevorzugt die Schritte:

i) das Herstellen einer Plasmazellmembranzubereitung aus Säugerzellen, ausgewählt für die Überexpression des 24 kd großen Proteins der Erfindung;
ii) das Durchführen einer Ammoniumsulfatfällung bei weniger als 33% Sättigung bei der Zubereitung und das Zurückbehalten des Überstands;
iii) das Durchführen einer Ammoniumsulfatfällung bei 33 bis 50% Sättigung mit dem Überstand und das Zurückbehalten des Präzipitats; und
iv) das Resuspendieren des Präzipitats und das Durchführen einer hydrophoben Chromatographie.

Als eine Alternative zur Reinigung aus Wildtyp-Zelllinien kann das Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein Fragment davon durch jedes geeignetes synthetisches Verfahren einschließlich der chemischen Synthese hergestellt werden. Geeigneterweise wird das Protein oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon durch die Expression eines Gens, welches das Protein codiert, in einer geeigneten Wirtszelle oder einem geeigneten Wirtstier hergestellt.
Eine geeignete lösliche Form des Proteins der Erfindung kann zum Beispiel eine verkürzte Form des Proteins umfassen, von dem die transmembrane Domäne entweder durch einen Schritt der Proteinspaltung oder durch Konstruktion in einer chemischen oder einer rekombinanten DNA-Synthese entfernt wird.
In einer anderen Ausführungsform könnte ein hybrider Partikel, der mindestens ein partikelformendes Protein wie z.B. das Hepatitis B-Oberflächenantigen oder ein partikelformendes Fragment davon in Kombination mit dem Protein der Erfindung oder einer funktionell äquivalenten Variante oder einem funktionell äquivalenten Fragment davon umfasst, als Antagonist zur Bindung von HCV an den zellulären Rezeptor verwendet werden.
Die Fähigkeit eines Proteins der Erfindung oder einer funktionell äquivalenten Variante oder eines funktionell äquivalenten Fragments davon, an HCV zu binden, erlaubt die Verwendung des Proteins oder einer funktionell äquivalenten Variante oder eines funktionell äquivalenten Fragments davon als ein diagnostisches Mittel für die HCV-Infektion, zum Beispiel in einem ELISA oder RIA.
Eine lösliche Form des Proteins könnte zum Beispiel in einer ELISA-Assayform verwendet werden, um die neutralisierenden Antikörper im Serum zu messen.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Analyse für HCV-Antikörper in einer Serumprobe zur Verfügung gestellt, welches den Schritt umfasst, die kompetitive Bindung zwischen Antikörpern in der Probe und einer bekannten Menge eines HCV-Proteins zur Bindung an ein Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon und das Messen der Menge des bekannten HCV-Proteins, das gebunden ist, zu ermöglichen.
Vorzugsweise wird das Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein Fragment davon an einer festen Trägersubstanz immobilisiert und das HCV-Protein, das geeigneterweise das E2-HCV-Hüllprotein sein kann, gegebenenfalls ein rekombinantes E2-Protein, wird markiert, geeigneterweise wird es durch ein Enzym markiert.
In einer Analyse dieser Form führt die kompetitive Bindung zwischen Antikörpern und dem HCV-Protein für die Bindung an das Protein der Erfindung zu einem gebundenen HCV-Protein, welches ein Maß für die Antikörper in der Serumprobe ist, insbesondere von neutralisierenden Antikörpern in der Serumprobe.
Ein deutlicher Vorteil des Assays ist, dass die Messung direkt von neutralisierenden Antikörpern durchgeführt wird (das heißt von solchen, welche die Bindung des HCV-Hüllproteins an einen zellulären Rezeptor beeinflussen). Ein solcher Assay, besonders in der Form eines ELISA-Tests, findet in der klinischen Umgebung und in dem routinemäßigen Durchmustern von Blutproben eine beträchtliche Anwendung.
Weil der Assay den Titer von neutralisierenden Antikörpern misst, bildet der Assay ein einfaches Maß einer mutmaßlichen Impfwirksamkeit, wobei der Titer der neutralisierenden Antikörper mit dem Schutz des Wirts korreliert.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein diagnostisches Kit, welches das Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon umfasst, zur Verfügung gestellt, wie in Anspruch 1 beschrieben wird. Vorzugsweise enthält das Kit ebenfalls mindestens ein HCV-markiertes HCV-Protein, welches gegebenenfalls durch ein Enzym markiert ist.
Das Protein der Erfindung oder eine funktionell äquivalente Variante oder ein funktionell äquivalentes Fragment davon kann verwendet werden, um nach chemischen Verbindungen zu suchen, welche die HCV-Oberflächenstruktur, die für die Bindung an den HCV-Rezeptor verantwortlich ist, nachahmt.
Zur Zeit ist das einzig erhältliche Tiermodel der Schimpanse, der eine geschützte Art ist. Die Experimente an solchen Tieren werfen eine Anzahl von Schwierigkeiten auf, die zusammen zu einer sehr beträchtlichen Ausgabe führen (ein Experiment für ein Jahr mit einem Schimpansen kann 70.000 $ kosten). Im Vergleich dazu wäre ein Mausmodell deutlich akzeptierbarer. Wie nachfolgend beschrieben wird, ist der HCV-Rezeptor, während im Menschen allgemein verbreitet ist und im Schimpansen gefunden wird, leider nicht in anderen Säugern vorhanden. Ein transgener Säuger, zum Beispiel eine Maus, der den HCV-Rezeptor auf der Zelloberfläche trägt, würde von großem Nutzen für die HCV-Forschung und für die Entwicklung von Impfstoffen sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein schematisches Diagramm, das einen Assay beschreibt, in dem die HCV-Rezeptor bindenden Liganden an Rezeptoren auf HCV-Rezeptor-Zielzellen binden und zuerst durch die Bindung von Kaninchen-anti-HCV-Antikörpern und anschließend durch die Bindung eines markierten anti-Kaninchen-IgG-FITC F(ab')-Fragments vor der Zelltrennung mittels einer FACScan-Analyse gemessen werden.
2 ist ein computerhergestelltes Histogramm, das die Ergebnisse einer FACScan-Analyse der Bindung des HCV-Proteins an hämatopoetische Zellen (MOLT-4, Jurkat, K562, Daudi, EBV-B) und Epithelzellen (HeLa, Adenocarcinom und Huh 7) beschreibt, die sich aus der Bindung mit den HCV-Proteinen ergeben (ausgefüllte Kurve unmarkierte Kontrolle, offene Kurve markierte). Die Kurve zeigt die Zellpopulation gegen die Intensität der Fluoreszenz.
3 ist ein computerhergestelltes Histogramm, das die Ergebnisse einer FACScan-Analyse von gereinigter RA, gereinigtem RO, gereinigter RA aus Nabelschnurblut, Pha stim. RA aus Nabelschnurblut, einem KC3-T-Zellclon (TCC) und SAG-S9-TCC zeigt, die auf ihre Bindung an ein rekombinantes HCV-E2-Protein, das in CHO-Zellen exprimiert wird, getestet wurden (ausgefüllte Kurve unmarkierte Kontrolle, offene Kurve markierte). Die Kurve zeigt die Zellpopulation gegen die Intensität der Fluoreszenz.
4 zeigt eine Gruppe von computergenerierten Histogrammen, welche die Ergebnisse einer FACScan-Analyse der Bindung von E2-CHO- an MOLT-4-Zellen mit und ohne Behandlung mit beta-Mercaptoethanol (BSH), ein S-S-Brücken reduzierender Wirkstoff, zeigen (ausgefüllte Kurven unmarkierte Kontrolle, offene Kurven markierte). Die Kurve zeigt die Zellpopulation gegen die Intensität der Fluoreszenz.
5 zeigt eine Gruppe von computergenerierten Histogrammen, welche die Ergebnisse einer FACScan-Analyse der Bindung von E2-CHO- an MOLT-4-Zellen mit und ohne Behandlung mit Endo-H, ein deglycosylierendes Enzym, zeigen (ausgefüllte Kurven unmarkierte Kontrolle, offene Kurven markierte). Die Kurve zeigt die Zellpopulation gegen die Intensität der Fluoreszenz.
6 zeigt einen Western-Blot von Membranen, die von MOLT-4-Zellen hergestellt und in verschiedenen Puffern löslich gemacht wurden (vergl. Spurbeschriftungen auf Seite 22).
7 zeigt einen Western-Blot von Plasmamembran von MOLT-4-Zellen (vergl. Spurbeschriftungen auf Seite 23).
8 zeigt einen Western-Blot von MOLT-4- und PBMC-Membranproteinen (vergl. Spurbeschriftungen auf Seite 23).
9 zeigt einen Western-Blot von Membranproteinen, die mit N-Glycosidase F behandelt wurden, von MOLT-4-Zellen (vergl. Spurbeschriftungen auf Seite 26).
10 zeigt einen Western-Blot von MOLT-4- und COS-7-Membranen, die unter reduzierenden und nicht reduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt wurden (vergl. Spurbeschriftungen auf Seite 27).
11 zeigt einen Western-Blot eines Experiments, das eine Immunpräzipitation eines E2-CHO/mutmaßlicher Rezeptor-Komplexes zeigt (vergl. Spurbeschriftungen auf Seite 30).
12 zeigt einen Western-Blot von Ammoniumsulfat-Fraktionen von MOLT-4-Zellmembranen (vergl. Spuren auf Seite 32)
13 zeigt einen Western-Blot von Proben von einem Experiment einer hydrophoben Chromatographie mit einem Aceton-Fällungsschritt (vergl. Spuren auf Seite 33).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Aufbau der detaillierten Beschreibung ist, wie nachfolgend aufgeführt wird:
1. Allgemeine Beschreibung
Falls es nicht anders beschrieben wird, wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung konventionelle Techniken der Immunologie, der Cytofluorometrie und der Molekularbiologie verwenden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Solche Techniken werden vollständig in der Literatur erklärt (7).
Der Fachmann wird die allgemeinen Verfahren und Techniken der Planung und der Durchführung des Assays verstehen und mit ihnen vertraut sein. Die Erfindung ist hierin ausreichend detailliert beschrieben, so dass ein Fachmann die offenbarten Experimente verstehen und wiederholen kann.
Standardabkürzungen für Viren und Proteine werden in dieser Beschreibung verwendet. Hülle 1 („Envelope 1", E1) und Hülle 2 („Envelope 2", E2) von HCV beziehen sich auf die Proteine und die Fragmente davon, deren Nucleotidsequenz publiziert sind (EP-A-0318216 und EP-A-0388232, vorstehend zitiert). Die Nucleotide der Gene von E1 und E2 und die codierten Proteinen unterscheiden sich in verschiedenen HCV-Isolaten. Darum sind E1 und E2 von jedem HCV-Isolat identifiziert, weil sie in den Aminosäuresequenzen 192–383 beziehungsweise 384–750 eingeschlossen sind.
E1 und E2 wurden durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt, wobei verschiedene Expressionssysteme verwendet wurden (Spaete et al. und Chien et al., vorstehend zitiert).
2. Zelluläre Analyse
2.1. FACS-Analyse von Zellen, die an E2 binden
Ein Experiment wurde mit der Absicht durchgeführt, die Fähigkeit des HCV-Proteins zu messen, an verschiedene Zellarten zu binden, die einen mutmaßlichen HCV-Rezeptor besitzen sollten.
Zellen (10⁵/Vertiefung) von dem menschlichen T-Zell-Lymphom MOLT-4 (im Handel käuflich und erhältlich bei der American Type Culture Collection) wurden in Mikroplatten mit 96 Vertiefungen mit U-förmigen Boden (Costar) durch Zentrifugation bei 200 × g für 5 Minuten bei 4°C pelletiert. 20 Mikroliter des HCV-Proteins (rekombinantes, in CHO exprimiertes E2-Protein), das in PBS in verschiedenen Konzentrationen (von 10 μg/ml bis 0,001 μg/ml) verdünnt wurde, wurden mit dem Pellet der MOLT-4-Zellen gemischt und bei 4°C für 60 Minuten inkubiert. Nicht gebundene HCV-Proteine wurden durch zwei Zentrifugationen in PBS bei 200 × g für 5 Minuten bei 4°C entfernt.
Die Zellen wurden anschließend für 30 Minuten bei 4°C mit verschiedenen Verdünnungen (von 1/10 bis 1/300000) des Serums von Menschen, Schimpansen, Kaninchen oder Mäusen, die entweder mit HCV infiziert waren oder die mit den rekombinanten HCV-Proteinen oder den entsprechenden Prä-Immunseren als Kontrolle immunisiert worden waren, inkubiert.
Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen und für 30 Minuten mit den geeigneten Verdünnungen der Fluorescein-Isothiocyanat-konjugierten Antiseren (entweder menschliches IgG oder Kaninchen-IgG oder Maus-IgG) inkubiert.
Die Zellen wurden anschließend in PBS bei 4°C gewaschen, in 100 μl PBS resuspendiert und die zellgebundene Fluoreszenz wurde mit einem FACScan-Durchflusszytometer (Becton & Dickinson) analysiert. Durch die Verwendung einer Dot-Plot-Darstellung des Vorwärts- und Seitwärts-Streulichts wird mit der Maschine ein Gaten durchgeführt, um lebende einzelne Zellen einzuschließen und Zelltrümmer und Zellklumpen auszuschließen. Eine Gesamtzahl von 5000 Ereignissen wurde gesammelt und die Analyse der Daten wurde unter Verwendung des Lysis II-Software-Programms von Becton & Dickinson durchgeführt. Dieses Programm stellt Histogramme von jeder Zellprobe her und berechnet die mittlere Kanalfluoreszenz der Zellpopulation, die in einer direkten Beziehung zu der Oberflächendichte der mit Fluoreszenz markierten HCV-Proteine steht, die an den Zellen gebunden sind.
Die Werte der mittleren Fluoreszenz (mittlere Kanalanzahl) der Zellen, die mit oder ohne HCV-Proteine und mit Immun- oder mit Prä-Immunseren inkubiert wurden, wurden verglichen. Der Grenzwert für die Positivität wird für jedes Experiment durch die durchflusszytrometrische Analyse von Zellen, an die keine HCV-Proteine gebunden sind und die mit Antiseren gegen HCV-Proteine und dem FITC-markiertem zweiten Antikörper inkubiert wurden, festgelegt. Ein repräsentatives Bindungsexperiment wird in 1 gezeigt, welche die Trennung zeigt, die durch die durchflusszytometrische Analyse erzielt wurde.
Das Experiment wurde ebenfalls mit einer Vielfalt von Zelllinien (zum Beispiel mit anderen hämatopoetische Zellen als MOLT-4 wie z.B. Jurkat, K562, Daudi, EBV-B (eine B-Zelllinie, die mit dem Epstein-Barr-Virus transformiert wurde) und Epithelzellen wie z.B. Hela, Adenocarcinom und Huh 7 durchgeführt, um Zellen zu identifizieren, die fähig sind, HCV-Proteine zu binden, und daher Zellen, die den/die mutmaßlichen Rezeptoren) für HCV besitzen, wobei das vorstehend beschriebene Protokoll verwendet wurde. Man wird es zu schätzen wissen, dass die Wiederholung dieses Experiments für die Ausführung der vorliegenden Erfindung nicht notwendig ist, sondern dazu dient, dass die allgemein verbreitete Natur des mutmaßlichen Rezeptors nachgewiesen wird (die meisten der Zelllinien sind in jedem Fall allgemein erhältlich und wurden tatsächlich von der ATCC erhalten). Die Ergebnisse werden zusammen mit denen für MOLT-4 in 2 gezeigt und zeigen, dass die spezifische Bindung von E2 an Zellen weitverbreitet ist, was darauf hinweist, dass der HCV-Rezeptor allgemein verbreitet ist.
In einer ähnlichen Serie von Experimenten wurden gereinigte RA, gereinigtes RO, gereinigte RA aus Nabelschnurblut, Pha stim. RA aus Nabelschnurblut, KC3- TCC und SAG-S9-TCC auf ihre Bindung an rekombinantes HCV-E2-Protein, das in CHO-Zellen (E2-CHO) exprimiert wird, getestet und man stellte eine Bindung fest, was bestätigte, dass die Bindung an nicht transformierte Zelllinien stattfindet. Die Ergebnisse werden in 3 gezeigt.
2.2. Wirkung von Modifikationen von E2 auf die Bindung
Die Wirkungen der Modifizierung des rekombinanten HCV-Proteins E2, das in CHO-Zellen (E2-CHO) exprimiert wurde, auf die Bindung an MOLT-4-Zellen wurden untersucht, wobei ein reduzierendes Mittel und ein deglycosylierendes Enzym verwendet wurden.
2.2.1. Reduktion von E2
25 μl von E2-CHO-SMC-PC (130 μg/ml) in 20 mM Kaliumphosphat, 0,1 M NaCl, pH-Wert 6,0, wurden auf einen pH-Wert von 8,0 mit 1 M Tris-Base (1 μl Gesamtvolumen) gepuffert und anschließend wurde BSH (Beta-Mercaptoethanol) bis zu einer Endkonzentration von 500 mM zugegeben; die Röhrchen wurden mit Stickstoff durchgespült und man ließ die Reaktion für 100 Minuten bei 37°C ablaufen.
Die vorstehend beschriebenen Proben wurden 1:20 mit RPMI-Medium verdünnt und in einer FACS-Bindungsanalyse mit MOLT-4-Zellen verwendet, wie vorstehend beschrieben wurde. Die Endkonzentration von BSH in der FACS-Analyse betrug 12,5 mM und unter diesen Bedingungen wurden in früheren vorläufigen Experimenten nachgewiesen, dass die Zellen lebend waren (über 90% der Zellen waren bei 50 mM BSH noch lebend).
Die Ergebnisse in 4 zeigen, dass die Bindung von MOLT-4-Zellen an das rekombinante E2 nach der Reduktion mit beta-Mercaptoethanol deutlich vermindert ist, was auf eine Notwendigkeit für eine korrekte E2-Konformation, die durch S-S-Brücken erhalten wird, hinweist.
2.2.2. Deglycosylierung von E2
Zu 25 μl von E2-CHO-SMC-PC (130 μg/ml) in 20 mM Kaliumphosphat, 0,1 M NaCl, pH-Wert 6,0, wurden 30 μl 0,2 M NaH₂PO₄ bis zu einem entgültigem pH-Wert von 5,5 plus SDS bis zu einer Endkonzentration 0,01 % zugegeben. Anschließend wurden 10 μl der Endo-H-Vorratslösung bis zu einer Endkonzentration von 200 mE/ml zugegeben, wobei der pH-Wert konstant gehalten wurde und man beließ die so erhaltene Probe bei 37°C für 20 Stunden. Die Probe wurde anschließend 1:20 mit RPMI verdünnt und in einer FACS-Bindungsanalyse verwendet, wie vorstehend beschrieben wurde.
Die Ergebnisse in 5 zeigen, dass die Bindung von MOLT-4-Zellen an das rekombinante E2 nach der Deglycosylierung mit Endo-H deutlich vermindert ist, was auf eine Notwendigkeit von der Glycosylierung von E2 für die Bindung hinweist.
2.3. Herstellung von monoclonalen Antikörpern
Monoclonale Antikörper wurden unter Verwendung von Standardverfahren und durch die Immunisierung von Mäusen mit dem rekombinanten HCV-E2, das in CHO-Zellen (E2-CHO) hergestellt wurde, hergestellt. Verschiedene Zelllinien, die zu der Bindung an E2-CHO fähig waren, wurden etabliert, sowie Zelllinien, die an E2, das an MOLT-4-Zellen gebunden war, binden konnten, und Zelllinien, welche die Bindung von E2-CHO an MOLT-4-Zellen neutralisieren konnten.
3. Herstellung des 24 kd großen mutmaßlichen Rezeptors
3.1. Herstellung eines 24 kd großen Proteins von MOLT-4-Zellen
Das 24 kd große Protein wurde von MOLT-4-Zellen durch eine Membranreinigung und durch eine Plasmamembranreinigung gereinigt, wobei das zuletzt genannte Verfahren die bessere Ausbeute des Proteins ergab.
3.1.1. Membranreinigung
Man ließ Molt-4-Zellen bei 37°C, 5% CO₂ in RPMI-Medium, das mit 25 mM Hepes gepuffert war, in Wachstumsmedium, das Fötales Kälberserum (FCS – Endkonzentration 5%), 1 mM Glutamin, 100 μg/ml Kanamycin, MEM-Vitamine (Gibco), 1 mM Natriumpyruvat, nicht essentielle MEM-Aminosäuren (Gibco), 5 × 10^–5 M β-Mercaptoethanol enthielt, wachsen.
Die Zellen wurden geerntet, nachdem sie eine Dichte von 750.000–1.000.000 Zellen pro ml erreicht hatten.
Das Wachstumsmedium, das die Zellen enthielt, wurde bei 300 g für 10 Minuten zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Die pelletierten Zellen wurden dreimal in PBS-Puffer gewaschen (resuspendiert und erneut zentrifugiert).
Das Zellpellet wurde in einer hypotonen Lösung mit 1 ml der hypotonen Lösung pro 100 × 10⁶ Zellen resuspendiert.
Die hypotone Lösung enthielt Tris (10 mM), NaCl (10 mM), CaCl₂ (0,2 mM), MgCl₂ (1,5 mM), PMSF (1,0 mM), Aprotinin (2,0 μg/ml), Pepstatin (0,7 μg/ml) und Leupeptin (0,5 μg/ml).
Man beließ die Zellen bei 4°C unter leichtem Schütteln für 20 Minuten und brach sie anschließend mit 25 Stößen mit einem Potter-Handhomogenisator auf.
Die Membranen wurden nach einer sequentiellen Zentrifugation des Überstands bei 100 g für 7 Minuten, 3500 g für 10 Minuten und 40.000 g für 60 Minuten gewonnen. Das Pellet, das von dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten wurde, wurde in einem geeigneten Puffer gelöst.
Der Puffer, der zum Lösen des 40.000 g-Membranpellets verwendet wurde, enthielt 1 % Triton X-100 in PBS-Puffer, pH-Wert 7,4, 8 mM Chaps in PBS-Puffer, pH-Wert 7,4, und 4 M Harnstoff in Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,4.
Alle Puffer, die zur Löslichmachung der Membran verwendet wurden, enthielten Protease-Inhibitoren mit Konzentrationen, die vorstehend für die hypotone Lösung beschrieben wurden, und wurden mit einem Verhältnis von 200 μl Puffer pro 5 × 10⁸ Zellen verwendet.
Das löslich gemachte Material wurde bei 100.000 g für 60 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde für die weitere Verwendung nach der Abschätzung des Proteingehalts durch das BCA-Verfahren aufgehoben.
Das erhaltene Material wurde anschließend verwendet, um die Analysen durchzuführen, die nachstehend beschrieben werden.
3.1.2. Plasmamembranreinigung
Das Verfahren zur Plasmamembranreinigung basierte auf Morre' D.J. et al. (8).
Man ließ Molt-4-Zellen bei 37°C, 5% CO₂ in RPMI, das mit 25 mM Hepes gepuffert war, in einem Wachstumsmedium, das Fötales Kälberserum (FCS – Endkonzentration 5%), 1 mM Glutamin, 100 μl/ml Kanamycin, MEM-Vitamine (Gibco), 1 mM Natriumpyruvat, nicht essentielle MEM-Aminosäuren (Gibco), 5 × 10⁵ M β-Mercaptoethanol enthielt, wachsen.
Die Zellen wurden aus dem Kulturmedium pelletiert und dreimal mit PBS gewaschen.
Die pelletierten Zellen wurden in 0,2 mM EDTA, 1 mM NaHCO₃ in einem Verhältnis zwischen Puffer und Zellen von 2 ml pro 10⁸ Zellen resuspendiert, wobei der Puffer die nachfolgenden Protease-Inhibitoren enthielt: PMSF (1,0 mM), Aprotinin (2,0 μg/ml), Pepstatin (0,7 μg/ml), Leupeptin (0,5 μg/ml).
Die resuspendierten Zellen wurden mit einem Polytron-Homogenisator aufgebrochen, wobei eine S25 N10 G-Sonde für 40 Sekunden bei 9500 UpM verwendet wurde. Das Aufbrechen der Zellen wurde durch ein optisches Mikroskop überprüft. Das Homogenat wurde bei 300 g zentrifugiert und der so erhaltene Überstand wurde erneut bei 23.500 g für 60 Minuten zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde in 0,2 M Kaliumphosphat, pH-Wert 7,2, der Protease-Inhibitoren enthielt, in den Verhältnissen, die vorstehend beschrieben wurden, resuspendiert. Das Puffervolumen betrug 1 ml pro 5 × 10⁸ Zellen.
Die Membransuspension wurde über das nachfolgende Zwei-Phasen-System unterteilt:
20% (Gew./Gew.) T500 Dextran 13,2 g
40% (Gew./Gew.) PEG 3350 6,6 g
0,2 KP, pH-Wert 7,2 0,8 ml
Membran-Susp. 5,0 g
Destilliertes Wasser bis zu 35 g
Die Probe wurde auf 4°C gekühlt und die Röhrchen wurden 30- bis 40-mal umgedreht, wobei die Temperatur konstant gehalten wurde. Die Probe wurde anschließend auf einem Ausschwing-Becherrotor bei 150–200 g für 5 Minuten bei 4°C zentrifugiert. Die obere Phase wurde entfernt und fünffach mit 1 mM Natriumbicarbonat, das Protease-Inhibitoren enthielt, verdünnt. Die Membranen wurden durch Zentrifugation bei 30.000 g für 30 Minuten gesammelt.
Das Pellet wurde in einem geeigneten Puffer gelöst und bei 100.000 g für 60 Minuten zentrifugiert, um das ungelöste Material zu entfernen.
Das so erhaltene Material wurde für Analysen verwendet, die nachfolgend beschrieben werden.
3.2. Überexpremierende MOLT-4-Zellen
Eine weitere Zelllinie, die zur Überexpression der charakteristischen Bindungsfähigkeit für E2 fähig war, wurde durch die Auswahl und durch das erneute Clonieren von MOLT-4-Zellen, die stark an E2 binden, hergestellt. Die so erhaltene Zelllinie zeigte eine deutlich höhere Bindungsaffinität für E2 als der Wildtypstamm.
4. Charakterisierung des Rezeptors
4.1. Protokoll des Western-Blots
Die nachfolgenden Experimente zeigen die Bindung von E2 an ein gereinigtes 24 kd großes Protein in einem Western-Blot von Proteinen von MOLT-4-Zellen, die von Membranen und von Plasmamembranen gereinigt worden waren und von peripheren mononucleären Blutzellen (PBNC).
Wenn es nicht anders angezeigt wird, wurden alle SDS-PAGE-Experimente gemäß Laemmli et al. (9) durchgeführt, wobei die Proben der löslich gemachten Membranen unter nichtreduzierenden Bedingungen und ohne Kochen vor jeder elektrophoretischen Auftrennung untersucht wurden.
Nach dem elektrophoretischen Transfer (Western-Blot) in einem Puffer, der 25 mM Tris, 192 mM Glycin, 20% Methanol enthielt, bei einem konstanten elektrischen Feld von 10 Volt/cm wurden die geblotteten Transferträger für 2 Stunden in einem PBS-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4, der 0,05% Tween 20 und 10% fettarmes Milchpulver enthielt, bei Raumtemperatur gesättigt. Nach dem Waschen für 1 × 15 Minuten und 2 × 5 Minuten in PBS, 0,05% Tween 20, das 1 % fettarmes Milchpulver enthielt, wurden die Transferträger über Nacht mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein, das in PBS-Puffer, der 0,05% Tween 20, 1 % Milch, 0,02% Natriumazid enthielt, gelöst wurde, bei einer Konzentration von 1–2 μg/ml inkubiert.
Transferträger für die Negativkontrolle (geblottet mit den gleichen Proben) wurden für den gleichen Zeitraum in dem gleichen Puffer ohne dem E2-CHO-Protein inkubiert.
Um rekombinantes E2-CHO-Protein, das an den Transferträgern gebunden war, zu detektieren, wurden diese mit dem Kulturüberstand eines Hybridoms mit dem Namen 291A2 (ein monoclonaler Antikörper, der Epitope erkennt, die auf E2 exponiert sind, wenn es an seinem mutmaßlichen Rezeptor gebunden ist) mit einer Verdünnung von 1:500 in PBS, Tween 0,05%, Milch 1% für 2 Stunden inkubiert.
Nach diesem Schritt wurden die Transferträger 1 × 15 Minuten und 2 × 5 Minuten mit einer Lösung von PBS, Tween 0,05%, Milch 1 % gewaschen. Die Transferträger wurden anschließend für 1 Stunde mit einem spezifischen, polyclonalen, mit Biotin konjugiertem Ziege-anti-Maus-Immunglobulin-Antikörper von einer kommerziellen Quelle (Pharmingen, San Diego, CA, USA) mit einer Verdünnung von 1:2000 in der PBS/Tween/Milch-Lösung, die vorstehend erwähnt wurde, inkubiert. Nach diesem Schritt wurden die Transferträger 1 × 15 Minuten und 2 × 5 Minuten mit PBS/Tween/Milch gewaschen. Schließlich wurden die Transferträger für 1 Stunde mit Extravidin^®-Peroxidase (Sigma Immunochemicals Co., St Louis, MO, USA) mit einer Verdünnung von 1:2500 in PBS/Tween/Milch inkubiert. Die Transferträger wurden anschließend 1 × 15 Minuten und 4 × 5 Minuten mit einem PBS-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4, der 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen. Die Chemilumineszenzfärbung wurde unter Verwendung von ECL^TM Nachweisreagenzien für Western-Blot-Verfahren (Amersham, UK) durchgeführt.
4.1.1. Membranproteine
Eine Membranherstellung wurde durchgeführt, wie vorstehend beschrieben wurde.
Die Membranpellets, die von der 40.000 g-Zentrifugation erhalten wurden, wurden in Puffern gelöst, die nachfolgend beschrieben werden, und bei 100.000 g zentrifugiert, um das nichtgelöste Material zu entfernen. Die Pellets wurden erneut mit 1 % Triton X-100 in PBS, pH-Wert 7,4 extrahiert.
Nach der SDS-PAGE (15 μg/Spur und dem Blot-Verfahren wurden die Transferträger mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein inkubiert, wie vorstehend beschrieben wurde.

Die Ergebnisse werden in 6 gezeigt.

Spur	Beschreibung
1A	4 M Harnstoff in 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,2
2A	Pellet der Probe von Spur 1A, in 1 % Triton X-100 in PBS, pH-Wert 7,4, löslich gemacht
3A	1 % Triton X-100 in PBS, pH-Wert 7,4
4A	Pellet der Probe von Spur 3A, in 1 % Triton X-100 in PBS, pH-Wert 7,4, löslich gemacht
5A	0,01 % Triton X-100 in PBS, pH-Wert 7,4
6A	Pellet der Probe von Spur 5A, in 1 % Triton X-100 in PBS, pH-Wert 7,4, löslich gemacht

1B bis 6B sind Negativkontrollen für die entsprechenden Proben in den Spuren 1A bis 6A.
Die Proteinbande bei 24 kd ist deutlich sichtbar.
4.1.2. Plasmamembranproteine
Eine Plasmamembranzubereitung wurde hergestellt, wie vorstehend beschrieben wurde.
Die Plasmamembranen wurden in PBS, pH-Wert 7,4, das 1 % Triton X-100 enthielt, löslich gemacht und einer SDS-PAGE nach Laemmli unterzogen. Der Transferträger wurde mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein inkubiert.
Die Ergebnisse werden in 7 gezeigt.

Spur Beschreibung

1A Plasmamembranen, 10 μg Gesamtproteingehalt

2A Plasmamembranen, 5 μg Gesamtproteingehalt
1B und 2B sind Negativkontrollen für die entsprechenden Proben in den Spuren 1A und 2A.
Die Proteinbande bei 24 kd ist deutlich sichtbar.
4.1.3. Western-Blot von PBMC-Zellen
Um zu ermitteln, ob das 24 kd große Protein in normalen Zellen identifiziert werden kann, wurde eine Probe von peripheren mononucleären Blutzellen gereinigt, wobei das Verfahren verwendet wurde, das vorstehend beschrieben wurde, und einem Western-Blot-Verfahren unterzogen, wie vorstehend beschrieben wurde.
Die Ergebnisse werden in 8 gezeigt.

Spur Beschreibung

1/2 Membranprotein von MOLT-4-Zellen

3 Membranprotein von PBMC (22 μg/ml)

4 Membranprotein von PBMC (44 μg/ml)
Die Spuren der Negativkontrollen sind als „-E2-CHO" markiert.
4.2. Zelloberflächenexpression des Rezeptors
Unter der Verwendung des Protokolls, das vorstehend beschrieben wurde, wurden verschiedene Zellarten, wobei FACScan und Western-Blot-Verfahren verwendet wurden, auf das Vorliegen des 24 kd großen mutmaßlichen HCV-Rezeptorproteins untersucht.
Die Ergebnisse werden nachfolgend dargestellt:
Diese Ergebnisse zeigen, dass die Artenverteilung des 24 kd großen Proteins mit der Verteilung der Anfälligkeit für die HCV-Infektion übereinstimmt.
4.3. Wirkung von Enzymen auf die Bindung an das 24 kd große Protein
4.3.1. Durchflusszytometrie
Die biochemische Natur der Zelloberflächenkomponente (Rezeptor), welche die Bindung des E2-CHO-Hüllproteins an MOLT-4-Zellen vermittelt, wurde untersucht. Eine Vorbehandlung der MOLT-4-Zellen mit V. cholerae-Neuraminidase, die eine α-2,3-Spezifität besitzt, vermindert nicht die E2-CHO-Bindung.
Die proteinartige Natur des Rezeptors wurde gezeigt, wenn die Zellen, die mit Proteasen vorbehandelt wurden, ihre Bindungsfähigkeit für E2-CHO verloren, während die Behandlung von Zellen mit Phospholipase keinen Einfluss auf die Bindung hatte, was darauf hinweist, dass die zellulären Bindungsproteine nicht über einen Glycosylphosphatilylinosit-Anker verbunden waren. Die E2-Bindungsstelle auf MOLT-4-Zellen war empfindlich gegen alle Proteasen, die verwendet wurden, wobei sowohl Serin-Proteasen wie z.B. Trypsin als auch eine Thiol-Protease wie z.B. Papain eingeschlossen wurde.
Die Ergebnisse der proteolytischen Behandlung zeigten die Beteiligung von Membranproteinen bei der Bindung des Hüllproteins und waren, wie nachfolgend dargestellt wird:
Die Zellen (10⁶ ml^–1) wurden für 60 min bei 37°C in RPMI 1640/Hepes-Medium plus den Enzymen, die vorstehend angezeigt sind, inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert, in frischem Medium resuspendiert und mit E2-CHO-Protein (3 μg/ml) inkubiert. Ein gereinigter monoclonaler anti-E2-CHO-Antikörper (1,5 μg/ml) wurde für den zweiten Schritt verwendet. Ein gereinigter Phycoerythrin-markierter Kaninchenanti-Maus-Antikörper (5 μg/ml) wurde als ein Reagens für den dritten Schritt verwendet. Eine Gesamtzahl von 5000 Zellen pro Probe wurde mit einem FACScan-Durchflusszytometer ausgewertet.
Die Enzyme wurden in einer Konzentration verwendet, welche die Lebensfähigkeit der Zellen nicht beeinflusste, wie durch einen Propidiumjodid-Ausschluss während der FACS-Analyse gemessen wurde.
Die Fluoreszenz wurde als willkürliche Einheiten (Kanalanzahl) auf einer logarhitmischen Skala aufgezeichnet und die mittleren Intensitäten wurden bestimmt. Die Daten von individuellen Experimenten wurden mit Bezug auf die Fluoreszenz der ungefärbten Kontrollproben normalisiert und die Werte wurden als Prozente der Fluoreszenzintensitäten in den gefärbten Kontrollproben ausgedrückt.
4.3.2. Western-Blot von MOLT-4/N-Glycosidase F
Die Behandlung mit Peptid-N-Glycosidase F wurde durchgeführt, wobei die Membranproteine (50 μg) über Nacht bei 37°C in Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4, 25 mM EDTA plus Enzym (50 E/ml) inkubiert wurden und anschließend eine 12% SDS-PAGE durchgeführt wurde.
Um die Aktivität des Enzyms N-Glycosidase F (PNGase F) zu zeigen, wurde als Kontrolle gp120-Polypeptid in dem gleichen Experiment verwendet (die Daten werden nicht gezeigt).
Die Ergebnisse werden in 9 gezeigt.

Spur Beschreibung

1 +/ve-Kontrolle

2 behandelte und gekochte Membran

3 unbehandelte und gekochte Membran

4 behandelte Membran

5 unbehandelte Membran
Diese Ergebnisse zeigen, dass durch die Behandlung von Membranherstellungen von MOLT-4-Zellen mit Peptid-N-Glycosidase F, das alle N-gebundenen Glycane hydrolysiert, die E2-CHO-Bindung nicht verloren geht.
4.4. Wirkung einer reduzierenden Bedingung auf die Bindung
Ein Western-Blot von MOLT-4- und COS-7-Membranen, die hergestellt wurden, wie vorstehend beschrieben wurde, wurde unter reduzierenden und nichtreduzierenden Bedingungen elektrophoretisch aufgetrennt, um die Notwendigkeit oder keine Notwendigkeit von Disulfidbrücken in dem 24 kd großen Protein durch das Messen der Bindung von E2-CHO an den Transferträger zu etablieren.
Die Transferträger wurden mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein inkubiert, wie vorstehend beschrieben wurde.

Die Ergebnisse werden in 10 gezeigt.

Spur	Beschreibung
1A	COS-7-Membranen in nicht reduzierendem SDS-Laemmli-Puffer
2A	MOLT-4-Membranen in nicht reduzierendem SDS-Laemmli-Puffer
3A	COS-7-Membranen in SDS-Laemmli-Puffer, der 5% β-SH enthielt
4A	MOLT-4-Membranen in SDS-Laemmli-Puffer, der 5% β-SH enthielt

1B bis 4B sind Negativkontrollen für die entsprechenden Proben in den Spuren 1A bis 4A.
5. Optimierung der Reinigung
5.1. Immunpräzipitation
Die Solubilisierung von Membranproteinen
Eine Membranherstellung von 400 Millionen MOLT-4-Zellen (Unterklon A2A6) wurde mit 200 μl PBS-Puffer, pH-Wert 7,4, der CHAPS 7,5 mM und die nachfolgenden Protease-Inhibitoren in μl/ml enthielt, behandelt: PMSF 35, Aprotinin 2, Pepstatin 0,7, Leupeptin 0,5. Nach der Behandlung mit dem vorstehenden Puffer wurde die so erhaltene Suspension bei 100.000 g für 1 Stunde zentrifugiert und mit dem klaren Überstand wurden Immunpräzipitationsexperimente durchgeführt. Die endgültige Proteinkonzentration, die auf dem BCA-Protein-Assay (Pierce, USA) basiert, betrug 2,7 mg/ml.
Inkubation mit dem rekombinanten E2-Hüll-Protein
200 μl der Membranproteinlösung (2,7 mg/ml) in PBS-CHAPS wurden zu 15 μl der von CHO hergestellten E2-Lösung (Charge P4) zugegeben. Die Ausgangskonzentration des E2-Proteins betrug 130 μl/ml und die endgültige Konzentration in der Proteinmembranlösung betrug 9,75 μg/ml.
Das Gemisch wurde über Nacht unter Rühren bei 4°C gehalten.
Inkubation mit Kaninchen-anti-E2-Antiserum
Die so erhaltene Lösung wurde in zwei Anteile von 100 μl aufgeteilt und jeder wurde mit 5 μl des Präimmun- und des Postimmun-Antiserums von einem Kaninchen (R #1), das zuvor mit dem E2-Protein immunisiert wurde, gemischt. Die Endverdünnung des Antiserums betrug 1:20. Die Inkubation wurde für 1 Stunde bei 4°C durchgeführt.
Zugabe von Protein-A-Sepharose CL-4B
Ein Protein-A-Sepharose CL-4B-Harz (Pharmacia, Schweden) wurde ausgiebig mit PBS, das 7,5 mM CHAPS mit einem pH-Wert von 7,4 enthielt, gewaschen und 30 μl der kompakten Aufschlämmung (die Kapazität der Matrix beträgt 20 mg menschliches Ig pro ml der Aufschlämmung) wurden zu jeder 100 μl-Probe, die von dem vorherigen Schritt erhalten wurde, zugegeben. Die Inkubation wurde unter Rühren für 1 Stunde bei 4°C durchgeführt.
Die Proben wurden zentrifugiert, um das Harz zu pelletieren, und der Überstand wurde entfernt, mit Laemmli-Puffer (ohne einem reduzierenden Wirkstoff) gemischt und für eine SDS-PAGE aufbewahrt. Das Harz-Pellet wurde zweimal mit 500 μl PBS-CHAPS gewaschen (jede Waschung 10 min bei 4°C) und das Pellet wurde anschließend mit 50 μl Laemmli-Puffer, der 5 M Harnstoff enthielt, behandelt. Der so erhaltene Überstand wurde für eine SDS-PAGE verwendet.
SDS-PAGE und Immunblot
Die Proben von den vorstehend beschriebenen Schritten, dabei handelt es sich um den Überstand, der Material sowohl von Präimmun- als auch Postimmun-Antiseren enthält, das nicht von der Protein-A-Matrix absorbiert wurde (SN), und Material, das von der Protein-A-Matrix desorbiert wurde (ProtA), wurden auf einem SDS-PAGE-Gel in einem nicht reduzierenden Puffer und ohne Erhitzen geladen. Nach der Elektrophorese wurden die Gele unter Verwendung von Nitrocellulose-Papier in 20% Methanol-Tris-Glycin-Puffer einem elektrischen Transfer und anschließend einer Immunfärbung unterzogen, wie vorstehend beschrieben wurde. Die Inkubation mit dem E2-Protein wurde über Nacht durchgeführt, wobei E2-SMC-PC mit 1,73 μg/ml in PBS, 0,05% Tween 20, 1 % Milch verwendet wurde.
Die Proben, die auf SDS-PAGE-Gel geladen wurden, waren:

A) Überstand (Material, das nicht durch Prot-A zurückgehalten wurde) von Präimmun-Antiserum,
B) Prot-A desorbiertes Material von Präimmun-Antiserum,
C) Überstand von Postimmun-Antiserum und
D) Prot-A desorbiertes Material von Postimmun-Antiserum.

Drei Reihen dieser Proben wurden auf ein Gel geladen, eine wurde direkt auf dem Gel gefärbt, bei den anderen zwei wurde eine Immunfärbung durchgeführt, eine wurde mit E2, das andere als Negativkontrolle inkubiert.
Der Transferträger aus Nitrocellulose wurde mit dem rekombinanten E2-CHO SMC-PC-Protein mit 1,73 μg/ml inkubiert, gefolgt von dem Überstand einer 291A2-Hybridomkultur (die einen monoclonalen Antikörper enthielt, der Epitope erkannte, die auf E2 exponiert werden, wenn er an seinen mutmaßlichen Rezeptor gebunden ist), biotinyliertem polyclonalem anti-Maus-Ig-Antikörper und Peroxidase markiertem Extravidin^TM (Sigma Immunochemicals, USA). Bei der Chemilumineszenzfärbung, die mit ECL-Luminol (Amersham, GB) erhalten wurde, betrug die Expositionszeit 1 Minute.

Die Ergebnisse werden in 11 gezeigt.

Spur	Beschreibung
1A	Molekulargewichtsstandard
2A	leer
3A	Probe, die mit Prä-Immunserum von Kaninchen inkubiert wurde, - Überstand
4A	Probe, die mit Prä-Immunserum von Kaninchen inkubiert wurde, - Protein-A gebunden
5A	Probe, die mit Post-Immunserum von Kaninchen inkubiert wurde, - Überstand
6A	Probe, die mit Post-Immunserum von Kaninchen inkubiert wurde, - Protein-A gebunden

Die Negativkontrollen, die auf der Nitrocellulosemembran verwendet wurden, wurden mit Überstand von einer 291A2-Hybridomkultur inkubiert, gefolgt von biotinylierten polyclonalen Anti-Maus-Ig-Antikörpern und Peroxidase markiertem Streptavidin. 1B bis 4B entsprechen 3A bis 6A.
5.2. Fraktionierung mittels Ammoniumsulfat
Die Membranen wurden hergestellt, wie in dem Protokoll für Membranherstellung von MOLT-4-Zellen beschrieben wurde, und wurden in PBS-Puffer, pH-Wert 7,4, der 8 mM CHAPS enthielt, löslich gemacht. Die Proteinkonzentration, die auf der Basis einer BCA-Analyse geschätzt wurde, lag in einem Bereich von 1,8 bis 2,5 mg/ml.
Die löslich gemachten Membranen wurden mit einer mit Ammoniumsulfat (AS) gesättigten Lösung in einem Volumen gemischt, das ausreichend war, um eine 25% Sättigung von Ammoniumsulfat zu erhalten (das heißt, die Endkonzentration von AS beträgt 25% von der gesättigten Ausgangslösung). Man ließ die Probe in schmelzendem Eis für 2 Stunden stehen und zentrifugierte sie anschließend bei 15800 g für 30 Minuten.
Der Überstand wurde mit einer AS gesättigten Lösung bis zu einer Endsättigung von 50% gemischt. Man ließ die Probe für 2 Stunden auf schmelzendem Eis stehen und filterte sie anschließend auf einer Spin-X^TM Zentrifugenfiltereinheit (Costar, Cambridge, MA, USA) für 15 Minuten bei 4°C.
Die Präzipitate, die vorstehend erhalten wurden, wurden in geeigneten Puffern gelöst und wurden für eine weitere Behandlung verwendet.
Die Pellets wurden in PBS, pH-Wert 7,4, das 10 M Harnstoff enthielt, erneut gelöst und wurden für ein Laemmli-SDS-PAGE verwendet. Die Volumina der AS-Fraktionen wurden in einer solchen Weise geladen, dass die Menge des mutmaßlichen Rezeptors in den unterschiedlichen Proben vergleichbar sein sollte.
Der Transferträger wurde mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein inkubiert, wie vorstehend beschrieben wurde.
Die Ergebnisse werden in 12 gezeigt und zeigen, dass die Fällung von p24 in dem Bereich von 33 bis 50% der Sättigung erfolgt.

Spur Beschreibung

1A Startmembranen

2A 20% AS-Fraktion

3A 33% AS-Fraktion

4A 43% AS-Fraktion

5A 50% AS-Fraktion

6A 60% AS-Fraktion
5.3. Hydrophobe Chromatographie
1,5 ml der löslich gemachten Membranen von MOLT-4-Zellen (Proteinkonzentration 2,5 mg/ml) wurden bei einer Sättigung von 25% Ammoniumsulfat vorfraktioniert und der Überstand von diesem Schritt wurde auf eine Sättigung von AS von 50% gebracht. Das so erhaltene Präzipitat wurde in 200 μl PBS, das Ammoniumsulfat mit einer Sättigung von 25% enthielt, resuspendiert. Das ungelöste Material wurde durch Zentrifugation bei 15800 g für 30 Minuten pelletiert.
Der so erhaltene Überstand wurde mit 200 μl Phenyl-Sepharose-Matrix (Pharmacia, Uppsala, Schweden), die zuvor in PBS, pH-Wert 7,2, das AS mit einer Sättigung von 25% enthielt, äquilibriert wurde, für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert.
Das ungebundene Material wurde durch Filterung auf Spin-X^TM-Zentrifugenfiltereinheiten (Costar, USA) gewonnen.
Die Matrix der Phenyl-Sepharose wurde zweimal mit 100 μl PBS, 25% Sättigung von AS, und einmal mit 300 ml des gleichen Puffers gewaschen. Die Matrix wurde anschließend mit PBS, pH-Wert 7,4, (200 μl) eluiert und anschließend mit PBS, pH-Wert 7,4, das 20% MeOH enthielt, gewaschen. Zum Schluss wurde die Matrix mit 40 μl eines nichtreduzierenden Laemmli-Puffers behandelt.
Die Proben, die Ammoniumsulfat enthielten (das heißt, das ungebundene Material und das aus der Waschung), wurden gegen 8 M Harnstoff in PBS, pH-Wert 7,4, dialysiert.
Mit allen Proben wurde eine SDS-PAGE-Analyse und ein Western-Blot durchgeführt.
5.4. Aceton-Fällung
50 μl der Membranen von MOLT-4-Zellen, die in 8 mM CHAPS in PBS, pH-Wert 7,4 löslich gemacht wurden, wurden mit 200 μl Aceton gemischt.
Die Probe wurde bei 15800 g für 15 Minuten zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das so erhaltene Präzipitat wurde in nicht reduzierendem Laemmli-Probenpuffer gelöst und für SDS-PAGE und Western-Blot verwendet. Die Transferträger wurden mit dem rekombinanten E2-CHO-Protein inkubiert, wie vorstehend beschrieben wurde.

Die Ergebnisse der kombinierten Experimente der HIC- und der Aceton-Fällung werden in 13 gezeigt.

Spur	Beschreibung
1A	Startmembranen (Gesamtproteingehalt 16 μl)
2A	Material, das nicht an der Matrix gebunden war
3A	Waschfraktion
4A	Material, das mit PBS, pH-Wert 7,4, eluiert wurde
5A	Material, das mit PBS, pH-Wert 7,4, das 20% Methanol enthielt, eluiert wurde
6A	Material, das mit Laemmli-Puffer eluiert wurde
7A	Membranen, die in Triton 1 %, PBS, pH-Wert 7,4, (Gesamtprotein 26 μg) eluiert wurden
8A	Aceton-Präzipitat von Probe 7A

Die Proben von 1B bis 8B entsprechen den Proben von 1A bis 8A.
Diese Experimente zeigen, dass Ammoniumsulfat gefälltes Material unter geeigneten Bedingungen wieder gelöst werden kann und für eine hydrophobe Interaktionschromatographie verwendet werden kann. Das mutmaßliche 24 kd große HCV-Rezeptorprotein bindet an Phenyl-Sepharose und kann von dieser Matrix gewonnen werden.
Der Membranextrakt kann mit Aceton ohne Verlust der Bindungskapazität des mutmaßlichen HCV-Rezeptors gefällt werden.
6. Seguenzierung und Clonierung
6.1. Aminosäuresequenz
Die Aminosäuresequenz des 24 kd großen Proteins kann entweder durch die Ableitung der clonierten DNA oder durch Mikrosequenzierung des Proteins, das durch eines der Verfahren hergestellt wurde, die vorstehend beschrieben wurden, ermittelt werden. Basierend auf dem Molekulargewicht des Proteins (und dem Wissen, dass es, falls es glycosyliert ist, nur zu einem geringen Ausmaß glycosyliert ist) wird erwartet, dass das Protein etwa 210–230 Aminosäuren besitzen wird (wobei der Durchschnitt von 110 Daltons pro Aminosäure angenommen wird).
6.2. Clonierung und Seguenzierung der DNA-Sequenz
Die DNA-Sequenz des 24 kd großen Proteins kann durch eine von einer Anzahl von Techniken bestimmt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, wie z.B. die λgt11-„Schrotschuß"-Clonierung, wobei eine DNA-Bibliothek hergestellt wird, geeigneterweise von einer überexprimierenden Zelllinie (vergl. vorstehend), und Fragmente von DNA werden in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle exprimiert, wobei die Produkte unter Verwendung von Antikörpern gegen das 24 kd große Protein oder durch die Bindung an das rekombinante E2-CHO abgesucht werden.
Sobald sie identifiziert ist, kann die DNA, die das 24 kd große Protein codiert, verwendet werden, um große Mengen des Proteins herzustellen, das sich, als Ergebnis seiner Bindung an HCV, als nützlich in einem Assay auf HCV-Infektion oder für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer HCV-Infektion erweisen kann.
In einer anderen Ausführungsform kann die DNA verwendet werden, um transgene Tiere herzustellen, die das 24 kd große Protein tragen, was anschließend als Tiermodel für die HCV-Infektion dienen kann.
Referenzen

1. Europäische Patentanmeldung EP-A-0318216
2. Europäische Patentanmeldung EP-A-0388232
3. Choo et al., PNAS USA (1991), 88, 2451–2455
4. Chien DY et al., PNAS USA (1992), 89, 10011–10015
5. Spaete RR et al., Virology (1992), 188, 819–830
6. Gething et al., Nature [benötigt vollständige Referenz]
7. „Flow Cytometry" in Methods of Cell Biology (1990), Bd. 33, Academic Press, San Diego
8. Morre' DJ et al., Methods Enzymol. (1994), 228, 448–450
9. Laemmli et al., Nature (1970), 27, 680

Claims

Assay für HCV-Antikörper in einer Serumprobe, wobei eines der folgenden Proteine diagnostisch verwendet wird: (i) ein Transmembran-Protein, das in der Lage ist, spezifisch an das E2-Protein des Hepatitis-C-Virus zu binden mit einem Molekulargewicht von etwa 24 kD, wie bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese auf einem 12%-igen Acrylamidgel, und erhältlich ist durch ein Verfahren umfassend die Schritte: (a) Herstellen einer Plasmazellzubereitung aus Säugerzellen, ausgewählt für die Überexpression des Transmembran-Proteins; (b) Durchführen einer Ammoniumsulfatfällung bei weniger als 33% Sättigung mit der Zubereitung und Zurückbehalten des Überstands; (c) Durchführen einer Ammoniumsulfatfällung bei einer Sättigung zwischen 33 und 50% mit dem Überstand und Zurückbehalten des Proteins; und d) Resuspendieren des Präzipitats und Durchführen einer hydrophoben Wechselwirkungschromatographie; (ii) eine Variante des in (i) beschriebenen Proteins, das chemisch modifiziert wurde, um ein oder mehrere chemische Modifikationen in die Aminosäurestruktur einzuführen, oder das modifiziert wurde, um Modifikationen der Aminosäuresequenz einzuführen, die ein oder mehrere Insertionen, Deletionen oder ersetzte Aminosäuren betreffen, wobei diese Variante die Fähigkeit aufweist, spezifisch an das E2-Protein des Hepatitis-C-Virus zu binden, und die ein Molekulargewicht von etwa 24 kD hat, wie bestimmt durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese auf einem 12%-igen Acrylamidgel; (iii) eine lösliche Variante eines in (i) oder (ii) beschriebenen Proteins.
Assay nach Anspruch 1, wobei der Assay die folgenden Schritte umfasst: (a) Ermöglichen der kompetitiven Bindung zwischen Antikörpern in der Probe und einer bekannten Menge eines HCV-Proteins zur Bindung an das in Anspruch 1 ausgeführte Protein; und (b) Messen der Menge des bekannten HCV-Proteins, das an die HCV-Antikörper oder durch das in Anspruch 1 ausgeführte Protein gebunden ist; wobei das Vorliegen von HCV-Antikörpern in der Serumprobe zur Messung einer geringeren Menge des bekannten HCV-Proteins führt, das durch das Protein wie in Anspruch 1 ausgeführt, gebunden ist.
Diagnostisches Kit, umfassend ein Protein wie in Anspruch 1 ausgeführt.
Assay gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die lösliche Variante unglycosyliert ist.
Diagnostisches Kit gemäß Anspruch 3, wobei die lösliche Variante unglycosyliert ist.