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DE69635653T2 - Peptide als vektoren zur intrazellulären adressierung von aktiven molekülen - Google Patents

Peptide als vektoren zur intrazellulären adressierung von aktiven molekülen Download PDF

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DE69635653T2
DE69635653T2 DE69635653T DE69635653T DE69635653T2 DE 69635653 T2 DE69635653 T2 DE 69635653T2 DE 69635653 T DE69635653 T DE 69635653T DE 69635653 T DE69635653 T DE 69635653T DE 69635653 T2 DE69635653 T2 DE 69635653T2
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peptide
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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Klasse von Peptiden, die in der Lage sind, Zellmembranen zu durchqueren und in die verschiedenen Abteilungen der Zelle zu gelangen.
  • Das Problem des Eintritts von verschiedenen Substanzen, die über pharmakologische Eigenschaften verfügen, in die lebenden Zellen, und ihres Zugangs zu den verschiedenen intrazellulären Abteilungen, insbesondere die cytoplasmische Abteilung und die nukleare Abteilung, besitzt sowohl in der Forschung als auch in ihrer therapeutischen Anwendung große Bedeutung.
  • Gegenwärtig ist eine begrenzte Anzahl von Mitteln bekannt, um Substanzen wie etwa Polypeptide und die Oligonukleotide in die intrazellulären Abteilungen einzubringen. Von den gegenwärtig vorgeschlagenen Vorgehensweisen sind zu nennen:
    • 1. Die Transfektion von Genen, und die davon abgeleiteten Verfahrensweisen, die es ermöglichen, in vivo oder in vitro die Transfektionsrate zu verbessern, wie etwa Präzipitation mit Calciumphosphat, die Verwendung kationischer Lipide, Elektroporation, Trituration (scrape loading), die Verwendung viraler Vektoren, usw.
    • 2. Die Bindung an Rezeptoren der Zellmembran, wobei diese Rezeptoren in der Folge endocytosiert werden und in der cytoplasmischen Abteilung die gebundenen Moleküle freisetzen. In dieser Kategorie wären der Folatrezeptor, das Diphterietoxin, oder Transkriptionsfaktoren wie das TAT-Protein des HIV-Retrovirus zu nennen. Der Transportmechanismus, der diese Rezeptoren beinhaltet, ist noch nicht gut bekannt, erfordert jedoch in jedem Fall einen Endocytoseschritt.
    • 3. Peptide vom Homöodomäne-Typ. Frühere Arbeiten, die von dem Erfinderteam über die Homöodomäne des Transkriptionsfaktors Antennapedia (AntpHD) durchgeführt wurden, ermöglichten es zu zeigen, daß die Homöodomäne-Peptide die Plasmamembranen mittels eines energieunabhängigen Vorgangs durchqueren, der somit von der Endocytose verschieden ist. Die 3. Helix des Homöodomäne-Peptids besitzt die gleichen Eigenschaften [JOLIOT et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88, S. 1864–1868 (1991); DEROSSI et. al., J. Biol. Chem. 269, 14, S. 10444–10450, (1994)].
  • Diese Eigenschaften wurden genutzt, um Polypeptide und Oligonukleotide, die an die Homöodomäne oder an die Helix 3 gebunden sind [PEREZ et al., J. Cell. Science, 102, S. 712–722, (1992)], mittels genetischer Fusion oder biochemischer Bindung in Zellen zu internalisieren. Dieser Eintritt ist quantitativ, und der Vektor und seine Ladung finden sich in 100% der Zellen wieder; darüber hinaus ist die Internalisierung von dem betreffenden Zelltyp unabhängig.
  • Das kleinste Fragment der Homöodomäne, das in der Lage ist, die Membranen zu durchqueren und als Vektor für andere Peptide oder auch für Oligonukleotide zu dienen, ist ein Peptid mit 16 Aminosäuren (das die Aminosäuren 43 bis 58 der Homöodomäne aufweist und als Peptid 4358 bezeichnet wird) mit der folgenden Sequenz:
    Arg-Gln-Ile-Lys-Ile-Trp-Phe-Gln-Asn-Ng-Arg-Met-Lys-Trp-Lys-Lys
  • Diese Sequenz ist in der beigefügten Sequenzenliste unter der Nummer SEQ ID NO: 1 dargstellt.
  • Der Mechanismus, durch den dieses Peptid in die lebenden Zellen eindringen konnte, war Gegenstand verschiedener Untersuchungen, und es wurde bislang angenommen, daß seine α-Helix-Struktur für die Internalisierung zwingend nötig war. Das Erfinderteam hat bereits früher gezeigt, daß bestimmte Substitutionen oder Löschungen in der Peptidsequenz, welche die Struktur des Peptids modifizierten, die Aktivität des Peptids beeinträchtigten. Beispielsweise ein Peptid, bei dem die 2 Trp (48 und 56) durch zwei Phe ersetzt sind, oder ein Peptid, das die Aminosäuren 41 bis 55 der Homöodomäne aufweist, werden nicht internalisiert (DEROSSI et al., 1994, vorgenannte Veröffentlichung). Ein anderes Team [BRUGIDOU et al., Biophys. Biochem. Res. Com., 214:2, S. 685–693, (1995)] hat die Internalisierung von Peptiden beobachtet, welche zu dem Peptid 43–58 analoge Strukturen darstellen; zu diesem Zweck konstruierten sie ausgehend von einem Peptid 43–58 (von dem Peptid 43–58 der Homöodomäne Antp insofern verschieden, als die 2 Isoleucine in den Positionen 45 und 47 durch Valine ersetzt sind), Varianten vom Typ retro-inverso. Die retro-inverso-Varianten, die es ermöglichen, die dreidimensionale Struktur von natürlichen Peptiden zu imitieren, bestehen aus den Aminosäuren der Serie D (anstelle der Aminosäuren der Serie L der natürlichen Peptide), die gemäß einer Sequenz verkettet sind, die zu derjenigen des zu reproduzierenden Peptids umgekehrt sind.
  • Die Erfinder haben nunmehr versucht, die minimalen Charakteristika der Aminosäurensequenzen zu definieren, die in der Lage sind, als Vektor für die Internalisierung und Adressierung von Polypeptiden und Oligonukleotiden zu dienen, und haben hierzu mehrere Peptide synthetisiert, indem sie bestimmte Reste spezifisch modifizierten.
  • Die vorliegende Erfindung hat ein Peptid zum Gegenstand, das in der Lage ist, in eine lebende Zelle einzudringen, und durch eine der folgenden Sequenzen (I) oder (Ia) definiert ist:
    NH2 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16 (I) X16-X15-X14-X13-X12-X11-X10-X9-X8-X7-X6-X5-X4-X3-X2-X1 (Ia)
  • COOH, wobei X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16 jeweils für eine α-Aminosäure stehen, und das Peptid dadurch gekennzeichnet ist, daß:
    • – es 6 oder 7 hydrophobe Aminosäuren aufweist;
    • – X6 für Tryptophan steht;
    • – X3, X7 und X14 für hydrophobe Aminosäuren stehen;
    • – X1, X2, X4 und X9 für nicht-hydrophobe Aminosäuren stehen;
    • – X15 und X16 für Arginin oder Lysin stehen; mit Ausnahme der folgenden Peptide:
    • – des Peptids, dessen Sequenz in der beigefügten Sequenzenliste unter der Nr. SEQ ID NO: 1 dargestellt ist;
    • – der Peptide, bei denen X3 und X5 jeweils für einen Valinrest stehen.
  • Gemäß einer bevorzugten Ausführungsweise eines erfindungsgemäßen Peptids weist dieses 6 hydrophobe Aminosäuren und 10 nicht-hydrophobe Aminosäuren auf.
  • Die hydrophoben Aminosäuren sind Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin.
  • Die nicht-hydrophoben Aminosäuren können polare (Glycin, Serine, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin, Glutamin), saure (Asparagin- oder Glutaminsäure) oder basische (Lysin, Arginin oder Histidin) Aminosäuren, oder eine Assoziation von Aminosäuren dieser drei Kategorien sein.
  • Die Verkettung von polaren oder geladenen nicht-hydrophoben Aminosäuren und von hydrophoben Aminosäuren verleiht den erfindungsgemäßen Peptiden einen amphiphilen Charakter, der gemäß den von den Erfindern durchgeführten Experimenten für ihre Eigenschaften wesentlich erscheint. Diese Experimente ermöglichten es des weiteren, weitere wesentliche Merkmale für die intrazelluläre Translozierung zu klären, und zu zeigen, daß:
    • – die intrazelluläre Translozierung keinen spezifischen Rezeptor erfordert und somit alle Zelltypen betreffen kann;
    • – die α-Helix-Struktur bei der Translozierung nicht von Bedeutung ist (jedoch ohne Zweifel eine Rolle bei der Adressierung in den Zellkern spielt);
    • – die amphiphilen Eigenschaften des Peptids, sowie das Vorhandensein eines Trp-Restes wiederum für die Translozierung wichtig zu sein scheinen.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsweise eines Peptids gemäß der Erfindung steht X14 für Tryptophan oder Isoleucin.
  • Die intrazellulären Penetrationseigenschaften der erfindungsgemäßen Peptide sind denjenigen der Helix 3 eines Homöodomäne-Peptids vergleichbar und ermöglichen deren Verwendung als Vektor für die Internalisierung und intrazelluläre Adressierung, um Moleküle, die eine Wirkung auf die Zellfunktionen ausüben, insbesondere andere Peptide oder Nukleotidsequenzen, in lebende Zellen einzuschleusen.
  • Um eine spezifischere cytoplasmische Adressierung des aktiven Moleküls, das eingebracht werden soll, zu erhalten, wird bevorzugt ein erfindungsgemäßes Peptid verwendet, bei dem zumindest eine der Aminosäuren in Position X3, X7 und X14 ein Prolin ist.
  • Für die Anwendung der vorliegenden Erfindung ist das zu transportierende Polypeptid oder Oligonukleotid ein erfindungsgemäßes Peptid.
  • Die Produkte der Fusion eines erfindungsgemäßen Peptids mit einer weiteren Peptidsequenz oder mit einer Oligonukleotidsequenz können durch verschiedene Mittel erhalten werden, die an sich bekannt sind. Im Falle eines Polypeptids können beispielsweise die klassischen Verfahrensweisen der Genetik oder der Peptidsynthese angewendet werden. Im Falle eines Oligonukleotids wird beispielsweise die von LEMAITRE et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 648–652, (1987)] beschriebene Technik oder die von MATSUEDA et al. [Chemistry Letters, S. 951–952, (1978) and Int. J. of Peptide and Protein Research, S. 107–112 (1986)] verwendet.
  • Ein besseres Verständnis der vorliegenden Erfindung ergibt sich unter Zuhilfenahme der nachfolgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf ein Beispiel, das die Eigenschaften von verschiedenen erfindungsgemäßen Peptiden zeigt.
  • Es sollte jedoch verstanden sein, daß dieses Beispiel einzig zur Veranschaulichung des Gegenstandes der Erfindung gegeben wird und diesen keineswegs einschränkt.
  • BEISPIEL
  • 10 Peptide, deren Sequenzen in der beigefügten Sequenzenliste unter den Nummern SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 10 dargestellt sind, wurden synthetisiert. Alle diese Peptide wurden des weiteren an ihrem N-terminalen Ende mit einem Aminopentan-Arm und einem Biotin versehen, die es ermöglichen, ihre Internalisierung zu verfolgen; die solcherart modifizierten Peptide sind in den nachfolgenden Tabellen I und II dargestellt.
  • Figure 00060001
  • Figure 00070001
  • Legende von Tabelle I
    • 43–58: Peptid 3. Helix
    • 41–55: Kontrolle: nicht-internalisiertes Peptid (s. DEROSSI et al., 1994)
    • 58–43: umgekehrte Sequenz
    • 43–58D: Peptid 3. Helix (43–58), bestehend aus Aminosäuren der Serie D
    • Pro50: Peptid 43–58 mit einem Prolin in 50 (anstelle von Gln)
    • 3Pro: Peptid 43–58 mit 3 Prolinen in Positionen 45, 50 und 55 anstelle der Reste Ile,Gln bzw. Lys.
  • Legende von Tabelle II
    • Met-Arg: Peptid 43–58 mit Met in 52(anstelle von Arg) und Arg in 54 (anstelle von Met)
    • 7Arg: Alle Lysine des Peptids 43–58, mit Ausnahme desjenigen in 45, sind durch Arg ersetzt
    • W/R: Peptid 43–58 stark modifiziert, besteht im wesentlichen aus einer Abfolge von Trp und Arg
    • L/R: Peptid W/R mit des Leu anstelle der Trp.
  • Der Eintritt dieser verschiedenen Peptide in Zellen in Kultur wurde unter den gleichen Bedingungen und unter Anwendung der gleichen Protokolle wie den von DEROSSI et al. beschriebenen (1994, vorgenannte Veröffentlichung) untersucht.
  • Der Eintritt der Peptide in die Nervenzellen oder in Fibroblasten in Kultur wurde bei 4 und 37°C untersucht.
  • Der Eintritt der Peptide von Tabelle I wurde mittels konfokaler Mikroskopie, Elektrophoresegel und ELISA untersucht.
  • Der Eintritt der Peptide von Tabelle II wurde nur mittels konfokaler Mikroskopie untersucht; die Abwesenheit von Lysin in diesen Peptiden erschwert nämlich die Fixierungen sehr stark und erfordert daher eine schnelle Beobachtung, die mit Übertragungen auf Filter oder ELISA-Tests (mehrfache Waschungen) nicht vereinbar ist.
  • 1) Internalisierung der Peptide 43–58, 58–43, D43–58, Pro50 und 3Pro bei 37°C und bei 4°C
  • Embryonale Kortikalzellen E15 (1,1.10 Zellen/ml) wurden während 2 h bei 37°C oder bei 4°C mit den Peptiden 43–58, 58–43, D43–58, Pro50 und 3Pro bei einer Konzentration von 44 μM auf eine Menge 1X, oder ohne Peptid (Vertiefung C) inkubiert.
  • Das Vorhandensein der Peptide im Inkubationsmedium und in den Zellen nach deren Waschung mit Trypsin wurde auf Elektrophoresegel SDS-PAGE 12–22% und durch Elektrotransfer analysiert.
  • Die Ergebnisse sind in den 1A, 1B (37°C) und 2 (4°C) veranschaulicht.
  • Legende von 1:
    • A: Autoradiogramm der Zellextrakte nach Darstellung durch Biolumineszenz (LUMINOL®, AMERSHAM).
    • B: Autoradiogramm der Inkubationsmedien nach Darstellung durch Biolumineszenz.
  • Legende von 2:
    • Die SP-Vertiefung entspricht der Ablagerung auf dem Gel von 1 μl der Substanz P.
    • Alle Peptide von Tabelle 1, ausgenommen 41–55, werden bei 4 und 37°C internalisiert und in den Zellen wiedergewonnen.
    • Das Peptid 43–58 wird bei 37°C zersetzt (ca. 50%), aber nicht bei 4°C.
  • 2) Zelluläre Lokalisierung der Peptide 43–58, 51–55, 5843, D43–58, Pro50 und 3Pro bei 37°C und 4°C.
  • Die Kortex- und Striatum E15-Zellen werden auf Glasplättchen in einer Dichte von 25.000 Zellen/cm2 während 2 Tagen kultiviert. Die Peptide werden sämtlich mit einer endgültigen Konzentration von 20 μM zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 2 h bei 37°C werden die Zellen gewaschen, fixiert, und das Vorhandensein von Biotin wird durch fluoreszentes Streptavidin dargestellt. Die mittels konfokaler Mikroskopie beobachteten Sektionen sind in den 3 (37°C) und 4 (4°C) wiedergegeben. Die Zellen, welche das Peptid aufgenommen haben, erscheinen auf schwarzem Grund fluoreszierend.
  • Legende von Fig.3
    Figure 00100001
  • Legende von Fig.4
    Figure 00100002
  • Das Vorhandensein von Prolinen (Pro50 oder 3Pro) behindert die Internalisierung nicht, scheint jedoch die Adressierung in den Zellkern zu beeinträchtigen. Der Eintritt der untersuchten Peptide wird auch in den Fibroblasten beobachtet (nicht gezeigt).
  • 3) Kolorimetrisches Assay der Internalisierung der Peptide 43–58, 51–55, 58–43, D43–58, Pro50 und 3Pro bei 37°C und 4°C.
  • Kortex- und Striatum E15 (B)- oder E16 (A)-Zellen wurden (1,1.106 Zellen/ml) mit den Peptiden in einer Konzentration von 17 μM (A) oder 44 μM (B) für die Mengen 1X, oder ohne Peptide (9) inkubiert. Die Zellen wurden mit NaCl 0,5 M (A) oder Trypsin (B) gewaschen. Sie werden auf ELISA-Platten kultiviert, fixiert, und eine Darstellung der biotinylierten Peptide wird unter Verwendung eines eingefärbten Substrates von alkaliner Phosphatase gekoppelt mit Streptavidin (PNPP) durchgeführt.
  • Die Ergebnisse sind in den 5A und 5B dargestellt.
  • Legende der Fig.5A und Fig.5B:
    Figure 00110001
  • 4) Internalisierung der Peptide Met-Arg, W/R und L/R bei 37°C
  • Kortex- und Striatum E15-Zellen werden auf Glasplättchen mit einer Dichte von 25.000 Zellen/cm2 während 2 Tagen kultiviert. Die Peptide wurden mit einer endgültigen Konzentration von 20 μM für das Peptid 43–58 und 2 μM für die anderen zugegeben, und die Zellen wurden 2 h lang bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, fixiert, und das Biotin der Peptide mit Streptavidin FITC dargestellt. Die Resultate sind in der 6 veranschaulicht.
  • Legende von Fig.6:
    Figure 00110002
  • Es wird eine Internalisierung und eine cytoplasmische und nukleare Adressierung von Met-Arg, 7Arg, und W/R beobachtet. Dennoch wird das Peptid L/R in einer Fraktion anscheinend vom vesikulären Typ, wahrscheinlich mit endocytischem Charakter, vorgefunden.
  • SCHLUSSFOLGERUNG
  • Die Ergebnisse, die mit den Peptiden von Tabelle I erhalten wurden, gestatten den Schluß, daß:
    • – die Internalisierung keinen Rezeptor erfordert, da die Peptide 58–43 und 43–58D internalisiert werden. Das erstere hat nun aber eine Sequenz, die von der des anfänglichen Peptids verschieden ist (auch wenn seine allgemeine ampiphile Helixstruktur bewahrt bleibt), und das Peptid mit Aminosäuren der Serie D braucht nicht mit einem natürlichen Rezeptor wechselzuwirken, der aus Aminosäuren der Serie L zusammengesetzt ist;
    • – die α-Helixstruktur nicht erforderlich ist, da die Einbringung eines Prolins und α fortiori von 3 die Helizität zerstört. Es wird dennoch festgestellt, daß die Zugabe der Proline die nukleare Adressierung beeinträchtigen kann.
  • Hinsichtlich der Peptide von Tabelle II läßt sich aus den erhaltenen Ergebnissen schlußfolgern, daß:
    • – Amphiphilizität ist für die Internalisierung nötig, aber nicht ausreichend, in dem Maße, in dem L/R nicht die Eigenschaften von W/R besitzt
    • – das Vorhandensein und die Position der Trp-Reste sind von Bedeutung.
  • Die Erfinder haben des weiteren die Internalisierung der Homöodomäne des Homöoproteins Engrailed aufgezeigt, das den Trp-Rest in 56 nicht aufweist (und der durch einen Ile-Rest ersetzt ist), aber den in 48 bewahrt hat; daraus läßt sich schließen, daß einzig das Trp 48 für die Translozierung von Bedeutung ist.
  • SEQUENZENLISTE
    Figure 00120001
  • Figure 00130001
  • Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001

Claims (7)

  1. Peptid, das in der Lage ist, in eine lebende Zelle einzudringen, und durch eine der folgenden Sequenzen (I) oder (Ia) definiert ist: NH2-X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-COOH (I) NH2-X16-X15-X14-X13-X12-X11-X10-X9-X8-X7-X6-X5-X4-X3-X2-X1-COOH (Ia)wobei X1, X2, X3, X4, X5, X6, X7, X8, X9, X10, X11, X12, X13, X14, X15, X16 jeweils für eine α-Aminosäure stehen, und das Peptid dadurch gekennzeichnet ist, daß: – es 6 oder 7 hydrophobe Aminosäuren aufweist; – X6 für Tryptophan steht; – X3, X7 und X14 für hydrophobe Aminosäuren stehen; – X1, X2, X4 und X9 für nicht-hydrophobe Aminosäuren stehen; – X15 und X16 für Arginin oder Lysin stehen; mit Ausnahme der folgenden Peptide: – des Peptids, dessen Sequenz in der beigefügten Sequenzenliste unter der Nr. SEQ ID NO: 1 dargestellt ist; – der Peptide, bei denen X3 und X5 jeweils für einen Valinrest stehen.
  2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es 6 hydrophobe Aminosäuren und 10 nicht-hydrophobe Aminosäuren aufweist.
  3. Peptid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß X14 für Tryptophan oder Isoleucin steht.
  4. Verwendung eines Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 3 für die Einbringung eines Moleküls in lebende Zellen, auf deren Zellfunktionen es einwirkt.
  5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das auf die Zellfunktionen einwirkende Molekül ein Peptid ist.
  6. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das auf die Zellfunktionen einwirkende Molekül eine Nukleotidsequenz ist.
  7. Verwendung nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Peptid der Formel I verwendet wird, bei dem mindestens eine der Aminosäuren in Position X3, X7 und X14 ein Prolin ist.
DE69635653T 1995-10-05 1996-10-04 Peptide als vektoren zur intrazellulären adressierung von aktiven molekülen Expired - Lifetime DE69635653T2 (de)

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JP (1) JP4002608B2 (de)
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