DE69636147T2

DE69636147T2 - Verfahren zur herstellung von phosphorothioat-oligomeren

Info

Publication number: DE69636147T2
Application number: DE69636147T
Authority: DE
Inventors: George Ile Cadieux JUST; Zhili Montreal XIN; Eric Montreal MARSAULT; Yi Montreal JIN; Jianchao Montreal WANG
Original assignee: McGill University
Current assignee: McGill University
Priority date: 1995-10-20
Filing date: 1996-10-18
Publication date: 2007-07-05
Anticipated expiration: 2016-10-19
Also published as: JPH11511480A; US6031092A; US20040097722A9; WO1997014710A1; US5734041A; JP2001192395A; AU7327596A; EP0904275A1; US6596857B1; ATE326476T1; US5945521A; EP0904275B1; DE69636147D1; US20030229219A1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von diastereomerisch angereicherten Phosphorothioat-verknüpften Oligonucleotiden und Zwischenstufen, die bei ihrer Herstellung geeignet sind. Die Erfindung betrifft auch sequenzspezifische Phosphorothioat-Oligonucleotide mit chiralen Phosphorverknüpfungen und eine neue chemische Synthese für diese und andere Oligonucleotide.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es ist hinreichend bekannt, dass die meisten der körperlichen Zustände in mehrzelligen Organismen, einschließlich der meisten Krankheitszustände, durch Proteine ausgelöst werden. Solche Proteine, die entweder direkt oder über ihre enzymatische oder andere Funktionen wirken, tragen zu einem Hauptanteil zu vielen Krankheiten und zu den regulatorischen Funktionen in Tieren und im Menschen bei. Die klassischen Therapeutika haben sich in der Regel auf die Wechselwirkungen mit solchen Proteinen in Bemühungen zur Moderierung ihrer krankheitsverursachenden oder krankheitspotenzierenden Funktionen konzentriert. Bei neueren therapeutischen Wegen ist die Modulation der tatsächlichen Produktion solcher Proteine erwünscht. Durch Beeinflussen in die Produktion von Proteinen könnte die maximale therapeutische Wirkung mit möglichst wenigen Nebenwirkungen erhalten werden. Es ist das allgemeine Ziel solcher therapeutischer Wege, die Genexpression zu beeinflussen oder anderweitig zu modellieren, die zur unerwünschten Proteinbildung führen würde.
Ein Verfahren zur Hemmung der spezifischen Genexpression besteht in der Verwendung von Oligonucleotiden. Oligonucleotide, die komplementär sind zu einer speziellen Messenger-RNA-(mRNA)-Zielsequenz werden verwendet. Mehrere Oligonucleotide befinden derzeit in der klinischen Erprobung für eine solche Anwendung.
Die Transkriptionsfaktoren wechselwirken mit doppelsträngiger DNA während der Regulation der Transkription. Oligonucleotide können als kompetitive Inhibitoren der Transkriptionsfaktoren unter Modulation der Wirkung der Transkriptionsfaktoren dienen. Mehrere neuere Berichte beschreiben solche Wechselwirkungen (siehe Bielinska, et. al., Science 1990, 250, 997-1000; und Wu, et al., Gene 1990, 89, 203-209.) Oligonucleotide haben auch Anwendung in diagnostischen Test gefunden. Solche diagnostischen Tests können unter Verwendung von biologischen Fluiden, Geweben, intakten Zellen oder isolierten Zellkomponenten durchgeführt werden. Hinsichtlich der obigen Genexpressionshemmung kann die diagnostische Verwendung Vorteil aus einer Oligonucleotid-Fähigkeit zur Hybridisierung mit einem komplementären Strang von Nucleinsäure ziehen. Die Hybridisierung ist das sequenzspezifische Wasserstoffbinden von Oligonucleotiden über Watson-Crick- und/oder Hoogsteen-Basenpaare an RNA oder DNA. Es wird gesagt, dass die Basen solcher Basenpaare komplementär zueinander sind.
Oligonucleotide werden auch als Forschungsreagentien breit eingesetzt. Sie sind für das Verständnis der Funktion von vielen anderen biologischen Molekülen sowie bei der Herstellung von solchen anderen biologischen Molekülen geeignet. Eine besondere Anwendung, die Verwendung von Oligonucleotiden als Primer bei den Reaktionen, die mit der Polymerasekettenreaktion (PCR) zusammenhängen, war der Meilenstein für die Entwicklung eines immer größer werdenden kommerziellen Geschäftes. Die Verwendung von solchen PCR-Reaktionen ist anscheinend "explodiert", da zunehmend Verwendung von diesem sehr bedeutenden biologischen Werkzeug gemacht wird. Die Verwendungen der PCR haben sich in viele Bereiche ausgedehnt zusätzlich zu denjenigen, die von seinen Nobelpreisträger-Erfindern in Erwägung gezogen wurden. Beispiele für solche neue Bereiche umfassen Forensik, Paläontologie, Entwicklungsstudien und genetische Beratung, um nur einige zu nennen. Primer werden für jede dieser Anwendungen benötigt. Oligonucleotide, sowohl natürlich als auch synthetisch, dienen als Primer.
Oligonucleotide werden auch in anderen Laborverfahren verwendet. Eine Anzahl von diesen Verwendungen sind in allgemeinen Laborhandbüchern beschrieben, wie Molecular Cloning, A Laboraton Manual, 2. Ausgabe, J. Sambrook, et al., Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; und Current Protocols In Molecular Biology, F. M. Ausubel, et. al., Hrsg., Current Publications, 1993. Solche Anwendungen umfassen synthetische Oligonucleotidsonden, das Screening von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern und Oligonucleotiden, DNA-Sequenzierung, In-Vitro-Amplifikation von DNA durch die Polymerasekettenreaktion und ortsgerichtete Mutagenese von klonierter DNA aus dem zweiten Band von Molecular Cloning, A Laboratory Manual, ibid., und DNA-Protein-Wechselwirkungen und die Polymerasekettenreaktion aus Band 2 von Current Protocols In Molecular Biology, ibid.
Um die Anwender von Oligonucleotiden zu beliefern, enthalten viele Fachzeitschriften nun Anzeigen entweder für Oligonucleotidvorläufer oder für anwenderspezifisch synthetisierte Oligonucleotide. Dies wurde zu einer bedeutenden kommerziellen Anwendung von Oligonucleotiden. Oligonucleotide können so synthetisiert werden, dass sie Eigenschaften aufweisen, die auf die gewünschte Anwendung zugeschnitten sind. Somit wurde bereits eine Anzahl von chemischen Modifikationen in Oligonucleotide eingebaut, um ihre Brauchbarkeit in der Diagnose, als Forschungsreagentien und als therapeutische Einheiten zu erhöhen. Diese Modifikationen sind beispielsweise dazu ausgelegt, das Binden an einen Ziel-Nucleinsäurestrang zu verstärken, die Identifizierung des Oligonucleotids oder eines Oligonucleotid-Zielkomplexes zu unterstützen, die Zellpenetrierung zu steigern, Stabilität gegen Nucleasen und andere Enzyme bereitzustellen, die die Struktur oder Aktivität der Oligonucleotide beeinflussen oder abbauen, zur Bereitstellung einer Unterbrechungsweise (Terminationsereignis) nach dem sequenzspezifischen Binden an ein Ziel oder zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften der Oligonucleotide.
Da sie als Diastereomere existieren, führen Phosphorothioat, Methylphosphonat, Phosphotriester, Phosphoramidat und andere Phosphor-Oligonucleotide, die unter Anwendung bekannter automatisierter Techniken synthetisiert worden sind, zu Gemischen von Rp- und Sp-Diastereomeren an den einzelnen Phosphorothioat-, Methylphosphonat, Phosphortriester-, Phosphoramidat- oder den anderen Phosphorverknüpfungen. Somit besitzt ein 15-mer-Oligonucleotid, das 14 asymmetrische Verknüpfungen enthält, 2¹⁴, das heißt 16.384 mögliche Stereoisomere. Es ist möglich, dass Oligomere mit diastereomerisch angereicherten Verknüpfungen Vorteile besitzen könnten bei der Hybridisierung an eine Ziel-mRNA oder -DNA. Demnach besteht Bedarf an solchen Oligomeren.
Miller, P.S., McParland, K.B., Jayaraman, K. und Ts'o, P.O.P (1981), Biochemistry, 20:1874, fanden, dass kleine Di-, Tri- und Tetramethylphosphonat und Phosphotriester-Oligonucleotide an unmodifizierte Stränge mit größerer Affinität als natürliche Phosphodiester-Oligonucleotide binden. Gleichermaßen wurde eine erhöhte Hybridisierung für kleine Phosphotriester- und Phosphoramidat-Oligonucleotide festgestellt; Koole, L.H., van Genderen, M.H.P., Reiners, R.G. und Buck, H.M. (1987), Proc. K. Ned. Adad. Wet., 90:41; Letsinger, R.L., Bach, S.A., und Eadie, J.S. (1986), Nucleic Acids Res., 14:3487; und Jager, A., Levy, M.J. und Hecht, S.M. (1988), Biochemistry, 27:7237. Die Wirkungen der Diastereomere von undefinierter Stereochemie auf die Hybridisierung werden noch komplexer, wenn die Kettenlänge zunimmt.
Bryant, F.R. und Benkovic, S.J. (1979), Biochemistry, 18:2825 studierten die Wirkungen von Diesterase auf die ATP-Diastereomeren. Die veröffentlichte Patentanmeldung PCT/US88/03634 offenbart Dimere und Trimere von 2',5'-verknüpften diastereomeren Adenosineinheiten. Niewiarowski, W., Lesnikowski, Z.J., Wilk, A., Guga, P., Okruszek, A., Uznanski, B. und Stec, W. (1987), Acta Biochimica Polonia, 34:217, synthetisierten Dimere von Thymidin mit einem hohen diastereomeren Überschuss ebenso wie Fujii, M., Ozaki, K., Sekine, M., und Hata, T. (1987), Tetrahedron, 43:3395.
Eine Studie der Konformationen einer Serie von 1,3,2-Oxazaphosphorinanen wurde von Y. Huang et al., J. Org. Chem. (1995) 60, 4767-4773, beschrieben.
Verschiedene 1,3,2-Oxazaphosphorinane wurden von E.E. Nifantyev et al., J. Organomet. Chem. (1987) 336 (1-2), 237-247, und von I.A. Nuretdinov et al., Chem. Abs. 90, 177623q, besprochen.
Stec, W.J., Zon, G. und Uznanski, B. (1985), J. Chromatography, 326:263, haben die Synthese von bestimmten Gemischen von Phosphorothioaten oder Methylphosphonat-Oligonucleotiden beschrieben und haben sie durch Chromatographie getrennt. Allerdings waren sie nur in der Lage, die Diastereomeren von bestimmten kleinen Oligomeren mit einer begrenzten Anzahl von diastereomerisch reinen Phosphorverknüpfungen aufzutrennen.
In einem vorläufigen Bericht von J.W. Stec, Oligonucleofide as antisense inhibitors of gene expression: Therapeutic implications, Meeting Abstracts, 18. bis 21. Juni 1989, stellte J.W. Stec fest, dass ein nichtsequenzspezifisches Thymidin-Homopolymer-Octamer – d.h. ein (dT)₈-mer, mit "all-except-one"-Rp-Konfiguration-Methylphosphonatverknüpfungen – mit einem 15-mer-Deoxyadenosin-Homopolymer – d. h. einem d(A)₁₅-mer – ein thermodynamisch stabileres Hybrid bildete als ein ähnliches Thymidin-Homopolymer mit "all-except-one"-S-Konfiguration-Methylphosphonatverknüpfungen. Das Hybrid zwischen dem "all-except-one"-Rp-(dT)-₈-mer und dem d(A)₁₅-mer besaß eine Tm von 38 °C, während die Tm des "all-except-one"-Sp (dT)₈-mers und des d(A)₁₅-mers <0 °C betrug. Es wurde berichtet, dass das Hybrid zwischen einem (dT)₈-mer mit natürlichen Phosphodiesterverknüpfungen, d. h. Octathymidylinsäure, und dem d(A)₁₅-mer eine Tm von 14 °C aufweist. Die "all-except-one"-Thymidin-Homopolymer-Octamere wurde aus zwei tetrameren Thymidinmethylphosphonateinheiten mit hohem diastereomerem Überschuss, die über eine natürliche Phosphodiesterverknüfpung verknüpft waren, gebildet.
Im Allgemeinen sind sechs oder mehr Nucleotideinheiten notwendig, dass ein Oligonucleotid bei Anwendungen, die eine Hybridisierung einschließen, optimal eingesetzt wird. Es ist oft bevorzugt, zur besten Leistung noch mehr Nucleosideinheiten zu haben, oft so viele wie 10 bis 30. Da es bisher nicht möglich war, mehr als zwei oder drei benachbarte Phosphorverknüpfungen stereochemisch aufzulösen, wurden die Wirkungen einer induzierten Chiralität in den Phosphorverknüpfungen von chemisch synthetisierten Oligonucleotiden nicht hinreichend bewertet. Dies beruht darauf, dass mit einigen eingeschränkten Ausnahmen die sequenzspezifischen Phosporothioat-, Methylphosphonat-, Phosphotriester- oder Phosphoramidat-Oligonucleotide, die unter Anwendung bekannter automatisierter Synthesetechniken erhalten wurden, Gemische ohne diastereomeren Überschuss waren.
Einige Aspekte der Anwendung von enzymatischen Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden mit chiralen Phosphorverknüpfungen wurden bereits untersucht. Burgers, P.M.J. und Eckstein, F. (1979), J. Biological Chemistry, 254:6889; und Gupta, A., DeBrosse, C. und Benkovic, S.J. (1982) J. Bio. Chem., 256:7689, synthetisierten enzymatisch diastereomerisch reine Polydeoxyadenylinsäure mit Phosphorothioat-Verknüpfungen. Brody, R.S. und Frey, P.S. (1981), Biochemistry, 20:1245; Eckstein, F. und Jovin, T.M. (1983), Biochemistry, 2:4546; Brody, R.S., Adler, S., Modrich, P., Stec, W.J., Leznikowski, Z.J. und Frey, P.A. (1982) Biochemistry, 21: 2570-2572; und Romaniuk, P.J. und Eckstein, F. (1982) J. Biol. Chem., 257:7684-7688, synthetisierten alle enzymatisch Poly-TpA- und Poly-ApT-Phosphorothioate, während Burgers, P.M.J. und Eckstein, F. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4798-4800, enzymatisch Poly-UpA-Phosphorothioate synthetisierte. Cruse, W.B.T., Salisbury, T., Brown, T., Cosstick, R., Eckstein, F. und Kennard, O. (1986), J. Mol. Biol., 192:891, verknüpften drei diastereomere Rp-GpC-Phosphorothioatdimere über natürliche Phosphodiesterbindungen zu einem Hexamer. Unlängst synthetisierten Ueda, T., Tohda, H., Chikazuni, N., Eckstein, R. und Watanabe, K. (1991) Nucleic Acids Research, 19:547, enzymatisch RNAs mit mehreren Hundert bis Zehntausend Nucleotiden, die Rp-Verknüpfungen von hohem diastereomerem Überschuss umfassten. Die enzymatische Synthese ist allerdings in sofern von Nachteil, als sie von geeigneten Polymerasen abhängt, die zur Verfügung stehen können oder nicht, insbesondere für modifizierte Nucleosidvorläufer.
Wie in der Übersicht von W. J. Stec und A. Wiek (1994), Angew. Chem. Int. engl. Ausg. 33:709, angegeben, war das Oxathiaphospholan-Verfahren bei der Herstellung von Phosphorothioaten mit definierter Stereochemie erfolgreich. Allerdings leidet es an Nachteilen, wie die nicht triviale Herstellung von diastereomerisch reinem Oxathiaphospholan, und der Schwierigkeit, zufrieden stellend reine Oligomere, die länger sind als 12-Mere, zu synthetisieren und zu isolieren.
Es wäre darum ein großer Vorteil, Nucleotide mit Phosphorverknüpfungen mit kontrollierter Stereochemie bereitzustellen.
AUFGABEN DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der Erfindung sequenzspezifische Oligonucleotide mit chiral reinen Phosphorothioat-Verknüpfungen mit hohem diastereomerem Überschuss bereitzustellen.
Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung von Phosphor-verknüpften Oligonucleotiden mit im Wesentlichen all-Rp- oder all-Sp-Verknüpfungen.
Eine weitere Aufgabe besteht in der Bereitstellung von Forschungs- und diagnostischen Materialien zum Testen von körperlichen Zuständen in Tieren, insbesondere von Krankheitszuständen.
Wieder eine andere Aufgabe ist die Bereitstellung neuer Verfahren zur Synthese sequenzspezifischer Oligonucleotide mit chiral reinen Phosphorothioat-Verknüpfungen und von brauchbaren Zwischenstufen dafür.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt stereoselektive Verfahren zur Herstellung sequenzspezifischer Oligonucleotide mit chiralen Phosphorverknüpfungen bereit. Bei bestimmten bevorzugten Ausführungsformen umfassen diese Verfahren die folgenden Schritte:

– Umsetzen eines ersten Synthons der Formel I:
wobei Q unabhängig O oder S ist; R¹ eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist; R² eine chirale Hilfsgruppe der Formel -C(R⁸)R³-C(R¹⁶)R⁵-CHR⁶-NHR⁷ ist; R³ Wasserstoff, Alkyl, Cyanomethyl, Monohalogenmethyl, Dihalogenmethyl, Trihalogenmethyl, -CH₂R₄, -CH₂Si(R⁴)₃ oder -CH₂-SO_kR⁴, wobei k 0, 1 oder 2 ist, ist; R⁴ unabhängig Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen, -N(R₇₀)-C(=O)-R₇₁, -S-C(=O)-R₇₀ oder -O-C(=O)-O-N(R₇₀)(R₇₁) ist; R₇₀ und R₇₁ jeweils unabhängig Alkyl, α-Halogen-substituiertes Alkyl, Aralkyl, α-Halogen-substituiertes Aralkyl oder Aryl, substituiert mit bis zu drei elektronenziehenden Gruppen, sind; R⁵ H, -CN, -Si(R⁴)₃, SO_kR⁴ oder Halogen ist; oder R⁸ und R¹⁶ jeweils H sind und R³ und R⁵ zusammen eine der Strukturen
bilden, wobei: R¹⁰ und R¹¹ H, Alkyl mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen, -CH₂C(=O)OR²², -CH₂CN, -CH₂Si(CH₃)₃ oder o- oder p-C₆H₄-R²¹ sind; R²¹ Wasserstoff, -O-C(=O)CH₃, Alkoxy mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen, -NO₂ oder -N(R²²)2 ist; R²² unabhängig H oder Alkyl mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen ist; p 1 oder 2 ist; Z¹ und Z² unabhängig Halogen, CN, -Si(CH₃)₃ oder -C(=O)OR²² sind; R³⁰ Wasserstoff, -O-C(=O)CH₃, Alkoxy mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen oder -O-Si(R₄)₃ ist; R⁶ H, Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist; oder R⁵ und R⁶ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden; R⁷ Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist; oder R⁶ und R⁷ zusammen eine der Strukturen
bilden, wobei V, T und Z unabhängig CH oder N sind; R₄₁, R₄₂, R₄₃ und R₄₄ jeweils unabhängig H oder eine elektronegative Gruppe sind; R⁸ H oder Methyl ist; R¹⁶ H, Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist; B eine Nucleobase ist; und n eine ganze Zahl von 0 bis 50 ist;
– mit einem zweiten Synthon der Formel II:
wobei R⁹ eine Hydroxyl-Schutzgruppe oder ein Linker ist, der an einen festen Träger gebunden ist; und m eine ganze Zahl von 0 bis 50 ist; für eine Dauer und unter Reaktionsbedingungen, die zur Bildung eines dritten Synthons der Formel III wirksam sind:
und
– Zusammenbringen des dritten Synthons mit einem Sulfurierungsmittel unter Bildung eines Oligomers der Formel IV:
wobei D die Phosphorothioat-Verknüpfung mit der Formel
ist.

Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die Phosphorothioat-Verknüpfung diastereomerisch angereichert. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen liegen etwa 75 % der Phosphorothioat-Verknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form vor. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen liegen etwa 85 % der Phosphorothioat-Verknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form vor. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen liegen etwa 95 % der Phosphorothioat-Verknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form vor. Besonders bevorzugt liegt die Phosphorothioat-Verknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form, im Wesentlichen frei von anderen stereoisomeren Formen, vor.
Vorzugsweise liegt das erste Synthon in einer einzigen stereoisomeren Form vor, die im Wesentlichen von anderen stereoisomeren Formen frei ist.
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen ist n 0. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen werden die R¹-Gruppen später entfernt, um neue zweite Synthone zur iterativen Synthese zu ergeben, und nach Abschluss der iterativen Synthese werden die chiralen Hilfsgruppen entfernt. Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Verfahren enthält das Oligomer der Formel IV eine Vielzahl von Phosphorothioat-Verknüpfungen.
Vorzugsweise werden das erste und das zweite Synthon bei einer Temperatur von etwa –20 °C bis etwa 40 °C umgesetzt, wobei etwa –15 °C bis etwa 0 °C stärker bevorzugt sind.
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen wird das erste Synthon gebildet durch Umsetzung einer Verbindung der Formel V:
mit einem Azaphospholan der Formel VIa:
wobei R³-R⁸ wie vorstehend definiert sind; und X Halogen, Dialkylamino, Imidazol, Triazol oder substituiertes Phenoxy ist, wobei die Substituenten elektronenziehend, vorzugsweise Halogen oder Nitro, sind.
Bei einigen Ausführungsformen wird das vorstehend beschriebene Azaphospholan durch Umsetzung eines Reagens der Formel HO-C(R⁸)R³-C(R¹⁶)R⁵-CHR⁶-NHR⁷ und eines Phosphortrihalogenids, Phosphortri(dialkylamids), Phosphortriphenoxids oder Phosphortriimidazolids hergestellt.
Bei stärker bevorzugten Ausführungsformen wird das erste Synthon durch Umsetzung einer Verbindung der Formel VII:
und eines γ-Aminoalkohols der Formel HO-C(R⁸)R³-C(R¹⁶)R⁵-CHR⁶-NHR⁷ gebildet. Vorzugsweise ist X Chlor, Dialkylamino oder Diphenoxy, und die Umsetzung ist stereoselektiv. Es ist besonders bevorzugt, dass das erste Synthon in einer einzigen stereoisomeren Form, im Wesentlichen frei von anderen stereoisomeren Formen, vorliegt.
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen wird die Reaktion des ersten und des zweiten Synthons in Gegenwart eines Katalysators durchgeführt, wobei der Katalysator vorzugsweise eine der Formeln VIII oder IX aufweist:
wobei:
R¹² und R¹³ unabhängig Wasserstoff, Halogen, Cyano, Nitro, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, substituiertes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, eine Estergruppe sind oder R¹² und R¹³ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen substituierten oder unsubstituierten Phenylring bilden, wobei die Substituenten elektronenziehend sind, und
R¹⁴ Wasserstoff, Halogen, Cyano, Nitro, Thio, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, substituiertes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, Norbornyl, substituiertes Norbornyl, Aryl, substituiertes Aryl, wobei die Substituenten elektronenziehend sind, ist oder die Formel aufweist:
wobei L eine Schutzgruppe ist.
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen ist R¹⁴ Halogen oder Nitro, vorzugsweise Brom, und R¹² und R¹³ sind jeweils Halogen oder jeweils Cyano, wobei Cyano besonders bevorzugt ist.
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen besitzt R¹⁴ eine der Formeln:
wobei R¹⁵ H, Methyl, Trialkylsilyl oder Acetyl ist.
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen für das Verfahren ist R³ Cyanomethyl oder -CH₂-So_kR⁴, wobei k 0, 1 oder 2 ist und R⁷ Niederalkyl oder Aralkyl ist.
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen besitzt das erste Synthon eine der Formeln Xa, XIa, XIIa, XIIIa oder XXa:

wobei W die folgende Formel aufweist:
und R¹-R¹⁶, V, T und Z wie zuvor definiert sind.
Weitere bevorzugte erste Synthone besitzen die Formel Xb oder Xc:
Stärker bevorzugte erste Synthone besitzen die Formel XVIIa oder XVIIIa:
Besonders bevorzugte erste Synthone besitzen die Formel XIVa:
Besonders bevorzugte erste Synthone besitzen die Formel XVa oder XVIa:
Bei bevorzugten Ausführungsformen für die erfindungsgemäßen Verfahren werden die R¹-Gruppen von den Oligomeren entfernt, wobei somit neue zweite Synthone zur weiteren iterativen Synthese erzeugt werden.
Ebenfalls erfindungsgemäß bereitgestellt werden Phosphorothioat-Oligomere, die durch das Verfahren nach Anspruch 1 hergestellt werden, und Azaphospholane mit der Formel VIb:
Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung liegen 75 % der Azaphospholane mit der Formel VIb in einer einzigen stereoisomeren Form vor, wobei 85 % stärker bevorzugt sind und 95 % besonders bevorzugt sind. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen liegen die Azaphospholane mit der Formel VIb in einer einzigen stereoisomeren Form vor, im Wesentlichen frei von anderen stereoisomeren Formen.
Bei bevorzugten Ausführungsformen besitzt das Azaphospholan eine der Formeln Xb, XIb, XIIb, XIIIb, Xd, Xe oder XXb:
Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen besitzt das Azaphospholan die Formel XVIIb oder XVIIIb:
Bei einigen besonders bevorzugten Ausführungsformen besitzt das Azaphospholan die Formel XIVb:
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen besitzt das Azaphospholan die Formel XVb oder XVIb:
Erfindungsgemäß bereitgestellt werden auch oligomere Verbindungen, die eine Phosphit-Verknüpfung mit der Formel XXX umfassen:
Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung liegen 75 % der Phosphit-Verknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form vor, wobei 85 % stärker und 95 % besonders bevorzugt sind. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen liegt die Phosphit-Verknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form, im Wesentlichen frei von anderen stereoisomeren Formen, vor.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Synthese von Phosphorothioatverbindungen mit diastereomerisch angereicherten Phosphorothioat-Verknüpfungen und Zwischenstufen, die bei ihrer Herstellung geeignet sind.
Bei einem Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Herstellung von Phosphorothioat-Verknüpfungen bereit, umfassend die Schritte des Umsetzens eines ersten Synthons der Formel I:
wobei
Q unabhängig O oder S ist;
R¹ eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist;
R² eine chirale Hilfsgruppe der Formel -C(R⁸)R³-C(R¹⁶)R⁵-CHR⁶-NHR⁷ ist;
R³ Wasserstoff, Alkyl, Cyanomethyl, Monohalogenmethyl, Dihalogenmethyl, Trihalogenmethyl, -CH₂R₄, -CH₂Si(R⁴)₃ oder -CH₂-SO_kR⁴, wobei k 0, 1 oder 2 ist, ist;
R⁴ unabhängig Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen, -N(R₇₀)-C(=O)-R₇₁, -S-C(=O)-R₇₀ oder -O-C(=O)-O-N(R₇₀)(R₇₁) ist;
R₇₀ und R₇₁ jeweils unabhängig Alkyl, α-Halogen-substituiertes Alkyl, Aralkyl, α-Halogen-substituiertes Aralkyl oder Aryl, substituiert mit bis zu drei elektronenziehenden Gruppen, sind;
R⁵ H, -CN, -Si(R⁴)₃, SO_kR⁴ oder Halogen ist;
oder R⁸ und R¹⁶ jeweils H sind und R³ und R⁵ zusammen eine der Strukturen
bilden,
wobei:
R¹⁰ und R¹¹ H, Alkyl mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen, -CH₂C(=O)OR²², -CH₂CN, -CH₂Si(CH₃)₃ oder o- oder p-C₆H₄-R²¹ sind;
R²¹ Wasserstoff, -O-C(=O)CH₃, Alkoxy mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen, -NO₂ oder -N(R²²)₂ ist;
R²² unabhängig H oder Alkyl mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatomen ist;
p 1 oder 2 ist;
Z¹ und Z² unabhängig Halogen, CN, -Si(CH₃)₃ oder -C(=O)OR²² sind;
R³⁰ Wasserstoff, -O-C(=O)CH₃, Alkoxy mit 1 bis etwa 10 Kohlenstoffen oder -O-Si(R₄)₃ ist;
R⁶ H, Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist;
oder R⁵ und R⁶ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden;
R⁷ Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist;
oder R⁶ und R⁷ zusammen eine der Strukturen
bilden, wobei V, T und Z unabhängig CH oder N sind;
R₄₁, R₄₂, R₄₃ und R₄₄ jeweils unabhängig H oder eine elektronegative Gruppe sind;
R⁸ H oder Methyl ist;
R¹⁶ H, Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist;
B eine Nucleobase ist; und
n eine ganze Zahl von 0 bis 50 ist;

– mit einem zweiten Synthon der Formel II:
wobei R⁹ eine Hydroxyl-Schutzgruppe oder ein Linker ist, der an einen festen Träger gebunden ist; und m eine ganze Zahl von 0 bis 50 ist; für eine Dauer und unter Reaktionsbedingungen, die zur Bildung eines dritten Synthons der Formel III wirksam sind:
und
– Zusammenbringen des dritten Synthons mit einem Sulfurierungsmittel unter Bildung eines Oligomers der Formel IV:
wobei D die Phosphorothioat-Verknüpfung mit der Formel
ist.

Erfindungsgemäß sind die ersten Synthone cyclische Phosphoramidite mit der allgemeinen Formel VIc:
wobei W, R³, R⁵-R⁸ und R¹⁶ wie zuvor definiert sind.
Die Umsetzung von erstem und zweitem Synthon wird in Gegenwart eines Katalysators durchgeführt. Die Strukturen des ersten Synthons und des Katalysators werden so gewählt, dass die Öffnung des cyclischen O-P-N-Phosphoramidit-(Azaphospholan)-Rings durch stereoselektives Spalten der intracyclischen P-N-Bindung des Azaphospholans unter Erhalt eines dritten Synthons abläuft, das am Phosphor diastereomerisch angereichert ist. Demnach sind bei bevorzugten Ausführungsformen für die erfindungsgemäßen Verfahren erste Synthone diastereomerisch angereichert und stärker bevorzugt in einer einzigen stereochemischen Form, im Wesentlichen frei von anderen stereochemischen Formen. Für das erste Synthon und den Katalysator ist es auch vorteilhaft, Substituentengruppen zu tragen, die von relativ großer Größe sind (das heißt voluminöse Gruppen), um die richtige Orientierung der Reaktanten zu unterstützen, um die gewünschte Stereoselektivität zu erreichen. Wie hier verwendet, besitzt der Begriff stereoselektiv seine normale Bedeutung als Verfahren, wobei ein Stereoisomer hergestellt oder schneller zerstört wird als ein anderes, was zu einem Überwiegen des favorisierten Stereoisomers führt.
Bei bevorzugten Ausführungsformen besitzen die Katalysatoren eine der Formeln VIII oder IX:
wobei R¹²-R¹⁴ wie zuvor definiert sind.
Erfindungsgemäß wurde gefunden, dass Imidazolkatalysatoren mit elektronenziehenden Substituenten zusätzlich zu Substituenten von relativ großer Größe bei der Herstellung von stereochemisch angereicherten Produkten besonders vorteilhaft sind. Obgleich nicht gewünscht ist, an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, wird angenommen, dass der Katalysator zuerst den Azaphospholanstickstoff protoniert und dabei eine gute Abgangsgruppe erzeugt, die durch den Katalysator oder seine konjugierte Base verdrängt wird. Sodann wird das mit dem Phosphor verknüpfte Imidazol oder Tetrazol entweder durch das 3'-Hydroxyl der nucleosidischen Spezies verdrängt, was zu einem Phosphittriester von hoher stereochemischer Reinheit führt, oder von dem Katalysator verdrängt, was zu einer Epimerisierung führt.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass Katalysatoren, die eine nennenswerte Azidität aufweisen (das heißt die pKa-Werte von etwa 2 bis 4 besitzen) und die relativ groß sind, die Neigung zur Epimerisierung am Phosphor beheben können und zur stereoselektiven Addition des freien 5'-Hydroxyls der zu addierenden nucleosidischen Spezies führen. Somit sind die bevorzugten Substituenten für die Gruppen R¹³, R¹⁴ und R¹⁵ diejenigen, die elektronenziehend sind (und die darum die Acidität erhöhen) und von einer Größe sind, die ausreicht, um die Stereoselektivität beizubehalten. Allerdings wird davon ausgegangen, dass es nicht notwendig ist, dass alle drei Gruppen R₆, R₇ und R₈ sehr voluminös sind, so lange die Gesamtgröße des Katalysators ausreicht, um die gewünschte Stereoselektivität zu ergeben. Die bevorzugten R¹²- und R¹³-Gruppen sind unabhängig Wasserstoff, Halogen, Cyano, Nitro, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, substituiertes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, eine Estergruppe, oder R¹² und R¹³ bilden zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen substituierten oder unsubstituierten Phenylring, wo die Substituenten elektronenziehend sind. Bevorzugte R¹⁴-Gruppen umfassen Wasserstoff, Halogen, Cyano, Nitro, Thio, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, substituiertes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, Norbornyl, substituiertes Norbornyl, Aryl, substituiertes Aryl, wobei die Substituenten elektronenziehend sind, oder es weist die Formel auf:
wobei L eine Schutzgruppe ist. Bei bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist der Katalysator 2,4,5-Tribromimidazol, Dibromcyanoimidazol oder Dicyanobromimidazol. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen ist der Katalysator 4,5-Dicyano-2-bromimidazol.
DE 23 17 453 offenbart substituierte Imidazole, einschließlich von 2-Brom-4,5-dicyanoimidazol.
Erfindungsgemäß wurde festgestellt, dass Dicyanoimidazol-, Bromimidazol- und Tribromimidazolkatalysatoren, die erfindungsgemäß beschrieben wurden, als Substituenten für Tetrazolkatalysatoren bei Festphasen-Oligonucleotidsynthese-Standardvorschriften geeignet sind. Solche Syntheseverfahren sind aus der Technik gut bekannt und in der Literatur ausgiebig beschrieben. Siehe beispielsweise Caruthers US-Patentschriften Nrn. 4,415,732; 4,458,066; 4,500,707; 4,668,777; 4,973,679 und 5,132,418; und Koster US-Patentschriften Nrn. 4,725,677 und Re. 34,069, und Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, Eckstein, F., IRL Press, New York (1991). Die Verwendung der erfindungsgemäßen Katalysatoren bei diesen Syntheseverfahren stellt nennenswerte Vorteile gegenüber Tetrazolkatalysatoren bereit, einschließlich beispielsweise wesentlich niedrigerer Kosten.
Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen besitzt R¹⁴ eine der Formeln:
wobei R¹⁵ H, Methyl, Trimethylsilyl oder Acetyl ist.
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen bilden R⁶ und R⁷ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen heterocyclischen (d. h. Imidazol, Triazol oder Tetrazol) Ring, der die Funktion des Katalysators ausführt. Bevorzugte erste Synthone, die den Katalysator darin einschließen, besitzen die allgemeine Formel Xa oder XIIIa:
wobei V, T und Z jeweils unabhängig N oder CH sind. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen umfassen die ersten Synthone Imidazolringe und besitzen die Formel Xb oder Xc:
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Imidazolteile des ersten Synthons weiter substituiert, beispielsweise dadurch, dass sie einen daran kondensierten Phenylring aufweisen, der vorzugsweise eine oder mehrere elektronegative Gruppen trägt. Somit weisen bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform die ersten Synthone die Formel XIa auf:
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen umfassen die ersten Synthone andere relativ große Substituentengruppen, die das stereoselektive Öffnen des Azaphospholanrings erleichtern. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen die ersten Synthone die Formel XIIa und insbesondere die Formel XVIIa oder XVIIIa auf:

wobei R¹⁰ und R¹¹ wie zuvor definiert sind.
Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen weisen die ersten Synthone die Formel XVb oder XVIb auf:
Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen wird das erste Synthon durch Umsetzung einer Verbindung der Formel V:
mit einem Azaphospholan der Formel VIa:
wobei R³-R⁸ wie vorstehend definiert sind; und X Halogen, vorzugsweise Chlor, Dialkylamino, Imidazol, Triazol oder substituiertes Phenoxy ist, wobei die Substituenten elektronenziehend sind und vorzugsweise Halogen oder Nitrit sind, erhalten.
Bei stärker bevorzugten Ausführungsformen wird das erste Synthon durch Umsetzung einer Verbindung der Formel VII:
und eines γ-Aminoalkohols der Formel HO-C(R⁸)R³-C(R¹⁶)R⁵-CHR⁶-NHR⁷, wobei X und R¹-R¹⁶ wie zuvor definiert sind, erhalten.
R₂ ist eine chirale Hilfsgruppe, die die Formel -C(R⁸)R³-C(R¹⁶)R⁵-CHR⁶-NHR⁷ aufweist und die als Folge der Öffnung des cyclischen Phosphitrings gebildet wird. Die chirale Hilfsgruppe funktioniert als Schutzgruppe für die Phosphorverknüpfung während des Verlaufs der Synthese von oligomeren Phosphorothioaten. Demnach ist es zulässig, dass chirale Hilfsgruppen an der wachsenden Kette verbleiben und am Ende des iterativen Syntheseablaufs entfernt werden. Die Entfernung chiraler Hilfsgruppen kann zweckmäßigerweise bei einer einzigen Behandlung nach Abschluss der iterativen Synthese durch Behandlung entweder mit Säure-Reagentien oder durch Basen-katalysierte β-Eliminierung erreicht werden. Geeignete Säure-Reagentien umfassen organische α-Halogensäuren, wie beispielsweise 70 Trifluoressigsäure. Geeignete Reagentien zur Entfernung chiraler Hilfsgruppen durch β-Eliminierung umfassen Ammoniak und Fluoridionen. Die Entfernung der chiralen Hilfsgruppen über β-Eliminierung sollte besonders vorteilhaft sein, wo erste Synthone die Formel XXa oder XIa aufweisen, insbesondere wo mindestens eines von R₄₁, R₄₂, R₄₂ und R₄₄ eine elektronegative Gruppe ist oder wo R³ -CH₂R₄ ist, R⁴ unabhängig -N(R₇₀)-C(=O)-R₇₁, -S-C(=O)-R₇₀ oder -O-C(=O)-O-N(R₇₀)(R₇₁) ist.
Nach Umsetzung der ersten und zweiten Synthone unter Bildung eines dritten Synthons wird das dritte Synthon unter Bildung einer Phosphorothioat-Verknüpfung der Formel:
sulfuriert.
Die Sulfurierung kann durch jedes der mehreren aus der Technik bekannten Sulfurierungsmittel, die zur Umwandlung von Phosphiten in Phosphorothioate geeignet sind, erreicht werden. Geeignete Sulfurierungsmittel umfassen das Beaucage-Reagens, beschrieben z. B. in Iyer, R.P.; Egan, W.; Regan, J.B.; Beaucage, S.L., 3H-1,2-Benzodithiole-3-one I,1-Dioxide as an Improved Sulfurizing Reagent in the Solid-Phase Synthesis of Oligodeoxyribonucleoside Phosphorothioates, Journal of American Chemical Society, 1990, 112, 1253-1254, und Iyer, R.P.; Phillips, L.R.; Egan, W.; Regan J.B.; Beaucage, S.L., The Automated Synthesis of Sulfur-Containing Oligodeoxyribonucleotides Using 3H-2-Benzodithiol-3-one 1,1-Dioxide as a Sulfur-Transfer Reagent, Journal of Organic Chemistry, 1990, 55, 4693-4699. Das Tetraethylthiuramdisulfid kann ebenfalls verwendet werden, wie beschrieben bei Vu, H.; Hirschbein, B.L., Internucleotide Phosphite Sulfurization With Tetraethylthiuram Disulfide, Phosphorothioate Oligonucleotide Synthesis Via Phosphoramidite Chemistry, Tetrahedron Letters, 1991, 32, 3005-3007. Weitere geeignete Reagentien für diesen Schritt sind Dibenzoyltetrasulfid, Rao, M.V.; Reese, C.B.; Zhengyun, Z., Dibenzoyl Tetrasulphide – A Rapid Sulphur Transfer Agent in the Synthesis of Phosphorthioate Analogues of Oligonucleotide, Tetrahedron Letters, 1992, 33, 4839-4842; Di(phenylacetyl)disulfid, Kamer, R.C.R.; Roelen, H.C.P.F.; van den Eist, H.; van der Marel, G.A.; van Boom, J.H., An Efficient Approach Toward the Synthesis of Phosphorothioate Diesters Va the Schonberg Reaction, Tetrahedron Letters, 1989, 30, 6757-6760; Schwefel und Schwefel in Kombination mit Liganden, wie Triaryl-, Trialkyl- oder Triaralkyl- oder Trialkarylphosphine.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch zur Herstellung von Analogen von Phosphorothioaten, einschließlich von Phosphoroselenoaten und Phosphoroboronaten, verwendet werden. Beispielsweise können Phosphoroselenoate durch die erfindungsgemäßen Verfahren unter Verwendung von Kaliumselenocyanat anstelle der vorstehend beschriebenen Sulfurierungsmittel hergestellt werden. Phosphoroboronate können durch entsprechende Übernahme der aus der Technik bekannten Oxidationsmittel hergestellt werden. Siehe beispielsweise Antisense Research und Applications, Crooke, S.T. und Lebleu, B., Hrsg., CRC Press, Boca Raton, Florida (1993).
R₉ und R₁ können jeweils eine Hydroxylschutzgruppe sein. Schutzgruppen sind per se als chemische funktionelle Gruppen bekannt, die selektiv an Funktionalitäten, wie Hydroxylgruppen und Carboxylgruppen, angehängt und davon entfernt werden können. Diese Gruppen sind in einer chemischen Verbindung vorhanden, um eine solche Funktionalität gegenüber chemischen Reaktionsbedingungen, denen die Verbindung ausgesetzt ist, inert zu machen. Die tert-Butyldimethylsilyl-(TBDMS)-Gruppe ist für Schutzgruppen repräsentativ, die zum Schutz der Hydroxylfunktionalität geeignet sind. Eine bevorzugte Schutzgruppe für R¹ ist die Dimethoxytritylgruppe. Weitere repräsentative Gruppen können gefunden werden bei Greene, T.W. und Wuts, P.G.M., "Protective Groups in Organic Synthesis" 2. Ausg., Wiley & Sons, 1991. Typischerweise werden die Schutzgruppen am Ende der iterativen Synthese entfernt.
R₉ kann alternativ ein an einen festen Träger gebundener Linker sein. Feste Träger sind Substrate, die in der Lage sind, als feste Phase bei den Festphasensynthesemethoden zu dienen, wie diejenigen, die beschrieben sind bei Caruthers US-Patentschriften Nrn. 4,415,732; 4,458,066; 4,500,707; 4,668,777; 4,973,679 und 5,132,418; und Koster US-Patentschriften Nrn. 4,725,677 und Re. 34,069. Linker sind aus der Technik als kurze Moleküle bekannt, die zum Verknüpfen eines festen Trägers mit funktionellen Gruppen (z. B. Hydroxylgruppen) von Synthon-Ausgangsmolekülen bei Festphasensynthesetechniken dienen. Geeignete Linker sind in Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach, Ekstein, F., Hrsg., IRL Press, N.Y, 1991 offenbart.
Erfindungsgemäße Alkylgruppen umfassen geradkettige, verzweigte und cyclische Kohlenstoff- und Wasserstoff-enthaltende Gruppen, wie Methyl-, Isopropyl- und Cyclohexylgruppen. Bevorzugte Alkylgruppen besitzen 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatome.
Erfindungsgemäße Aralkylgruppen umfassen sowohl Alkyl- als auch Arylteile, obwohl der Verknüpfungspunkt für solche Gruppen über einen Alkylteil davon erfolgt. Benzylgruppen stellen ein Beispiel für eine Aralkylgruppe bereit. Alkarylgruppen umfassen sowohl Alkyl- als auch Arylteile und sind über ihre Arylteile verknüpft. Der Begriff Aryl soll monocyclische und polycyclische aromatische Gruppen bezeichnen, einschließlich beispielsweise Phenyl-, Naphthyl-, Xylyl-, Pyrrol- und Furylgruppen. Obwohl Arylgruppen (z. B. Imidazogruppen) so wenig wie 3 Kohlenstoffatome einschließen können, besitzen bevorzugte Arylgruppen 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt 6 bis etwa 10 Kohlenstoffatome. Die Alkyl-, Alkaryl- und Arylgruppen können substituierte Gruppierungen (d. h. z. B. sie tragen Halogene und Hydroxygruppen) oder unsubstituierte Gruppierungen sein. Bei einigen bevorzugten Ausführungsformen trägt die Alkyl- oder Aralkylgruppe elektronenziehende Substituenten, vorzugsweise Halogenatome, an einem ihrer α-Kohlenstoffe. Beispiele für α-Halogen- substituierte Alkylgruppen umfassen Mono-, Di- und Trihalogenmethylgruppen. Beispiele für α-Halogen-substituierte Aralkylgruppen umfassen α-Halogenbenzylgruppen.
Bestimmte Substituentengruppen von erfindungsgemäßen Verbindungen tragen elektronenziehende Gruppen. Wie hier verwendet, besitzt der Begriff "elektronenziehend" seine normale Bedeutung als chemische Funktionalität, die elektronisch oder induktiv den Abzug von Elektronendichte aus der Gruppierung herbeiführt, an die die elektronenziehenden Gruppen gebunden sind. Repräsentative elektronenziehende Gruppen umfassen Nitrogruppen, Halogene, Cyanogruppen, Carboxylgruppen und substituierte Carboxygruppen, wie Ester- und Amidogruppen. Weitere elektronenziehende Gruppen werden den Fachleuten an Hand der vorliegenden Offenbarung klar.
Substituent B ist eine Nucleobase. Der Begriff Nucleobase, wie hier verwendet, soll natürlich vorkommende Nucleobasen (das heißt heterocyclische Basen, die in natürlich vorkommenden Nucleinsäuren auftreten) und ihre nicht natürlich vorkommenden Analoge einschließen. Somit umfassen erfindungsgemäße Nucleobasen natürlich vorkommende Basen Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T), Cytosin (C) und Uracil (U), sowohl in ihrem ungeschützten Zustand als auch, wenn sie schützende oder maskierende Gruppen tragen. Beispiele für Nucleobasen-Analoge umfassen N⁴,N⁴-Ethanocytosin, 7-Deazaxanthosin, 7-Deazaguanosin, 8-Oxo-N⁶-methyladenin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouracil, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Inosin, N⁶-Isopentyladenin, 1-Methyladenin, 2-Methylguanin, 5-Methylcytosin, N⁶-Methyladenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, 5-Methoxyuracil, Pseudouracil, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-(1-Propinyl)-4-thiouracil, 5-(1-Propinyl)-2-thiouracil, 5-(1-Propinyl)-2-thiocytosin, 2-Thiocytosin und 2,6-Diaminopurin. Weitere geeignete Basen-Analoge, beispielsweise die Pyrimidin-Analoge 6-Azacytosin, 6-Azathymidin und 5-Trifluormethyluracil, können bei Cook, D.P., et al., internationale Veröffentlichung Nr. 92/02258, hier durch Bezugnahme eingeschlossen, gefunden werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind vorzugsweise bis zu 50 Nucleobasen lang, wobei 10 bis 30 Nucleobasen stärker und 15 bis 25 Nucleobasen besonders bevorzugt sind.
Bei bevorzugten Ausführungsformen ist die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Phosphorothioat-Verknüpfung diastereomerisch angereichert. Der Begriff "diastereomerisch angereichert" bezeichnet das Überwiegen von einer stereochemischen Form gegenüber der anderen. Bei bevorzugten Ausführungsformen liegt die Phosphorothioat-Verknüpfung zu 75 % in einer einzigen stereochemischen Form vor. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen liegt die Phosphorothioat-Verknüpfung zu 85 % in einer einzigen stereochemischen Form vor, wobei 90 % stärker und 95 % besonders bevorzugt sind. Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen ist die Phosphorothioat-Verknüpfung eine einzige stereochemische Form, im Wesentlichen frei von anderen stereochemischen Formen.
Vorzugsweise wird nach der Sulfurierung das Phosphorothioat als nächstes in ein neues erstes Synthon übergeführt. Dies wird zunächst durch die Entfernung der 5'-Hydroxylschutzgruppe R₁ unter Bedingungen erreicht, die notwendigerweise von der chemischen Identität der speziellen R₁-Gruppe abhängen. Nach Entfernung der Schutzgruppe kann der ungeschützte 5'-Alkohol als neues zweites Synthon bei dem iterativen Verfahren eingesetzt werden. Bibliotheken von dimeren und höheren Synthonen können hergestellt und zur Erleichterung der iterativen Synthese von gewünschten Nucleobase-Sequenzen aufbewahrt werden.
Ebenfalls erfindungsgemäß bereitgestellt werden Azaphospholane der Formel VIb:
wobei Y X oder W ist, wobei X Halogen, Dialkylamino, Imidazol oder substituiertes Phenoxy ist, wobei die Substituenten elektronenziehend sind und W die Formel:
aufweist, wobei die konstituierenden Glieder wie zuvor definiert sind. Vorzugsweise sind die Azaphospholane der Formel VIb diastereomerisch angereichert. Insbesondere ist es zweckmäßig, eine definierte Stereochemie um das Phosphoratom vorliegen zu haben, um beim stereoselektiven Öffnen des Azaphospholanrings diastereomerisch angereicherte Produkte zu ergeben.
Bei bevorzugten Ausführungsformen besitzen die erfindungsgemäßen Verbindungen eine der Formeln Xb, XIb, XIIb, XIIIb oder XXb:

wobei R³-R¹⁶, Y, V, T, Z, Z₁, Z₂ und p wie zuvor definiert sind.
Besonders bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verbindungen besitzen die Formel XIVb, Xd, Xe, XVIIb, XVIIIb, XVb oder XVIb:
Wie hier verwendet, bedeutet der Begriff "Kontaktieren" die direkte oder indirekte Herbeiführung einer gegenseitigen Anordnung von zu kontaktierenden Gruppierungen derart, dass die Gruppierungen miteinander in physikalischen Kontakt kommen. Kontaktieren umfasst somit physikalische Vorgänge, wie das Vorlegen der Gruppierungen zusammen in einem Behälter. Der Begriff "Umsetzen", wie hier verwendet, bedeutet die direkte oder indirekte Herbeiführung einer gemeinsamen Anordnung der umzusetzenden Gruppierungen derart, dass sich die Gruppierungen chemisch kombinieren oder umwandeln.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird in Gegenwart eines Lösungsmittels, beispielsweise Chloroform oder Acetonitril, durchgeführt. Weitere zur Verwendung bei dem vorliegenden Verfahren geeignete Lösungsmittel werden den Fachleuten beim Durchlesen der vorliegenden Offenbarung leicht klar.
Im Allgemeinen ist es bevorzugt, dass das Molverhältnis des Katalysators zu dem ersten Synthon-Ausgangsmaterial etwa 1 bis etwa 50, vorzugsweise etwa 2,5 bis etwa 10, beträgt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in jedem beliebigen Gefäß durchgeführt werden, das ein wirksames Kontaktieren zwischen dem ersten und dem zweiten Synthon und dem Katalysator bereitstellt. Das verwendete Reaktionsgefäß sollte gegenüber den Komponenten des Reaktionsgemisches resistent sein. Für diesen Zweck sind glasausgekleidete Gefäße geeignet. Weitere Gefäßmaterialien sind den Fachleuten bekannt.
Die Reagentien für das vorliegende Verfahren können in jeder beliebigen Reihenfolge zugesetzt werden. Das Verfahren wird vorzugsweise unter einer Inertatmosphäre durchgeführt und sollte in einer trockenen Atmosphäre durchgeführt werden. Jedes geeignete Inertgas kann eingesetzt werden, wie Stickstoff, Helium und Argon (Ar).
Vorzugsweise wird das Verfahren bei Temperaturen im Bereich zwischen etwa –20 °C und etwa 40 °C durchgeführt, wobei Temperaturen im Bereich von etwa –15 °C bis etwa 0 °C stärker bevorzugt sind.
Die Reaktionszeit beträgt im Allgemeinen etwa 1 Minute bis etwa 2 Stunden, wobei Reaktionszeiten von etwa 1 Minute bis etwa 10 Minuten bevorzugt sind.
Das Produkt kann durch eines von mehreren den Fachleuten bekannten Verfahren gewonnen werden. Vorzugsweise werden die Produkte durch Chromatographie gewonnen. Eine zusätzliche Trennung der Isomeren kann durch aus der Technik bekannte Verfahren, einschließlich von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, erreicht werden.
Wenn R⁹ ein fester Träger ist, wird die Reinigung nach Entfernung des Oligonucleotids von dem festen Träger unter Anwendung von aus der Technik bekannten Verfahren durchgeführt.
Die Erfindung wird weiter anhand der folgenden Beispiele erläutert. Diese Beispiele sind nur erläuternd und sollen den Umfang der beigefügten Ansprüche nicht einschränken.
Beispiele:
Allgemeine Verfahren.
Die Schmelzpunkte (Fp.) wurden unter Verwendung eines Electrothermal MP Gerätes bestimmt und sind unkorrigiert. Die optischen Rotationsmessungen wurden in den angegebenen Lösungsmitteln unter Verwendung eines Jasco^® DIP-140 Digitalpolarimeters durchgeführt. Die Massenspektren (CI oder EI) wurden auf einem HP 5980A Quadrupol-Massenspektrometer im direkten Einspritzmodus erhalten.
Die NMR-Spektren wurden auf JEOL 270-, Varian XL200-, XL300- oder Unity 500-Spektrometern aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen sind in δ in ppm angegeben. Die Zuordnungen der Protonenspektren beruhen auf COSY-Experimenten. Die restlichen Protonensignale von Deuteriochloroform (δ 7,24 ppm), Methanol (δ 3,30 ppm) und Acetonitril (δ 1,93 ppm) wurden als Referenz in diesen Lösungsmitteln verwendet. Die Multiplizitäten sind unter Verwendung der folgenden Abkürzungen angegeben: s: Singulett; d: Dublett; t: Triplett; q: Quatrtett; m: Multiplett. Die ³¹P-NMR-Spektren wurden entweder auf einem Varian XL200-, XL300- oder Unity 500-Instrument erhalten, und die chemischen Verschiebungen sind bezüglich wässriger Phosphorsäure angegeben. Die Peak-Zuordnungen der ¹³C-NMR-Spektren wurden in einigen Fällen mit Hilfe von APT-, HMQC- oder HETCOR^®-Experimenten durchgeführt. Die ³¹P-NMR-Spektren wurden auf einem Jeol CFP 270 und Varian UNITY^® 500 bei 68,7 MHz, 125,7 MHz unter Verwendung eines externen Standards von 85 % H₃PO₄ aufgezeichnet.
Das Fast-Atom-Bombardement (FAB-MS) wurde auf einem KRATOS MS 25RFA-Spektrometer im direkten Einspritzmodus erhalten. Hoch auflösende FAB-Massenspektren der Schlüsselverbindungen wurden auf einem ZAB 2F HS-Spektrometer im direkten Einspritzmodus (Biomedical Spectrometry Unit) erhalten.
Tetrahydrofuran (THF) wurde über Natriumbenzophenonketyl destilliert. Dichlormethan wurde über P₂O₅ destilliert. Triethylamin und Acetonitril wurden über CaH₂ destilliert. N,N-Dimethylformamid wurde durch Schütteln mit KOH getrocknet und anschließend destilliert. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde unter Verwendung von Kieselgel-60-F₂₅₄-Platten mit Aluminiumrückseite (0,2 mm Dicke) durchgeführt und durch UV und/oder durch Eintauchen in eine Lösung von Ammoniummolybat (2,5 g) und Cersulfat (1 g) in 10 % (Vol./Vol.) wässriger Schwefelsäure (100 ml) und anschließendes Erhitzen sichtbar gemacht. Für die Säulenchromatographie wurde Kieselgel 60 (Merck 230-400 mesh)-Kieselgel eingesetzt. Herstellungsbeispiel 1 3R-Hydroxy-N-iso-propylbutanoamid (10)
Eine 2 M Lösung von Trimethylaluminium in Hexan (50 ml, 100 mmol) wurde langsam bei Raumtemperatur einer Lösung von 8,5 ml (100 mmol) Isopropylamin in 100 ml Dichlormethan unter Stickstoff zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten gerührt und dann auf 0 °C abgekühlt, bevor 6,6 g (50 mmol) Ethyl-3R-hydroxybutanoat zugesetzt wurden. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur bis zur Beendigung gerührt, vorsichtig mit verdünnter HCl gestoppt und mit Chloroform extrahiert. Der organische Extrakt wurde über MgSO₄ getrocknet und konzentriert, um 7 g N-Isopropyl-3R-hydroxybutanoamid zu ergeben. Nach Umkristallisation wurden 5,5 g reines Amid 10 erhalten (Ausbeute 76 %): Fp. 62 °C; ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 6,41 (m, 1H, NH), 4,35 (b, 1H, OH), 3,78-4,15 (m, 2H, MeCH, Me₂CH), 2,08-2,32 (m, 2H, CH₂), 1,12 (d, J=6,3 Hz, 3H, Me), 1,07 (d, J=6,6 Hz, 6H, NCHMe₂); ¹³C NMR (50 MHz, CDCl₃) δ 171,5 (C=O), 64,7 (CHOH), 43,8 (NHCH), 41,0 (CH₂), 22,7 (Me), 22,4 (NCHMe₂); MS(EI) m/e 145 ([M⁺], 25 %), 130 (27), 112 (4), 101 (6), 86 (34), 69 (8), 58 (22), 44 (100); HRMS(EI) m/e ber. für C₇H₁₅O₂N [M⁺]: 145,1103, gefunden 145,1109. Herstellungsbeispiel 2 2R-Hydroxy-4-(N-Isopropyl)aminobutan (11)
Einer Lösung von 32 ml 1 M Boran (32 mmol) in THF wurden unter Stickstoff 2,32 g (16 mmol) 3R-Hydroxy-N-iso-propyl-butylbutanoamid 10 in 20 ml THF bei 0 °C zugesetzt. Anschließend wurde die Lösung bis zum Rückfluss erhitzt und dort 1 Stunde gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und 1 N HCl wurde langsam zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen. THF wurde in vacuo entfernt, und die wässrige Lösung wurde mit festem NaOH gesättigt und sodann dreimal mit insgesamt 300 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigte Chloroformphase wurde getrocknet, filtriert und destilliert, um 1,4 g 3-(N-Isopropylamino)butan-2-ol 11 als klare farblose Flüssigkeit (Ausbeute 67 %) zu ergeben: ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 3,80-3,96 (m, 1H, CHOH), 2,86-2,98 (m, 1H, MeCH), 2,56-2,75 (m, 2H, NCH₂), 1,24-1,60 (m, 2H, CH₂), 1,08 (d, J=6,1 Hz, 3H, Me), 0,98 (d, J=6,2 Hz, 6H, Me₂); ¹³C-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 69,5 (OCH), 48,6 (NHCH₂), 46,0 (NHCH), 37,2 (CH₂), 23,5, 22,9, 22,5; MS(EI) m/e 131 ([M⁺], 10 %), 116 (81), 98 (35), 72 (100), 58 (30), 56 (45), 44 (37); HRMS(EI) m/e berechnet für C₇H₁₇ON [M⁺]: 131,1310, gefunden 131,1311; [a]_D ²⁰=32,5° (c=0,21, Chloroform). Herstellungsbeispiel 3 2R-Hydroxy-4-(N-tert-butyl)aminobutan (31)
Einer Lösung von 26,4 ml 1 M (26,4 mmol) Boran in THF wurden unter Stickstoff 2,1 g (13,2 mmol) 3R-Hydroxy-N-tert-butylbutanoamid in 20 ml THF bei 0 °C zugesetzt. Anschließend wurde die Lösung bis zum Rückfluss erhitzt und 1 Stunde gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, und 1 N HCl wurde zum Stoppen der Reaktion langsam zugesetzt. THF wurde in vacuo entfernt, und die wässrige Lösung wurde mit festem NaOH gesättigt und sodann dreimal mit insgesamt 250 ml Diethylether extrahiert. Die vereinigte organische Phase wurde getrocknet, filtriert und destilliert, um 398 mg 2R-Hydroxy-4-(N-tert-butyl)aminobutan 31 als klare farblose Flüssigkeit (Ausbeute 20,1 %) zu ergeben: ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 3,80-3,92 (m, 1H, CHOH), 3,40-3,80 (b, 2H, OH, NH), 2,50-2,90 (m, 2H, NCH₂), 1,28-1,61 (m, 2H, CH₂), 1,07 (d, 3H, Me), 1,03 (s, 9H, Me₃). Herstellungsbeispiel 4 5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)thymidin (1)
Einer Lösung von 2,42 g (10 mmol) Thymidin in 15 ml DMF wurden 1,7 g (25 mmol) Imidazol und 1,6 g (10,6 mmol) tert-Butyldimethylsilylchlorid zugesetzt. Die Lösung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das DMF in vacuo entfernt, und der Rückstand wurde in 150 ml Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen und die organische Schicht über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels wurde der Feststoff aus Ethylacetat/Pentan umkristallisiert, um 2,5 g reines 5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)thymidin 1 (70 % Ausbeute) zu erhalten: Fp. 193-194 °C; ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 9,0 (s, 1H, NH), 7,50 (s, 1H, H-6), 6,36 (dd, J=5,8, 8,1 Hz, 1H, H-1'), 4,44 (m, 1H, H-3'), 4,03 (m, 1H, H-4'), 3,85 (m, 2H, H-5'), 2,66 (d, J=3,8 Hz, 1H, OH), 2,35 (m, 1H, H-2'), 2,07 (m, 1H, H-2'), 1,89 (s, 3H, C=CMe), 0,89 (s, 9H, CMe₃), 0,09 (s, 6H, SiMe₂); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 163,8 (C-4), 150,4 (C-2), 135,4 (C-6), 110,9 (C-5), 87,2 (C-4'), 85,0 (C-1'), 72,6 (C-3'), 63,6 (C-5'), 41,1 (C-2'), 25,9 (SiCMe₃), 18,3 (SiCMe₃), 12,5 (C=CMe), –5,4 (SiMe₂), –5,5 (SiMe₂). Herstellungsbeispiel 5 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)thymidin (16)
Triethylamin (10 ml) in 200 ml THF wurde unter Stickstoff und unter Rühren in ein festes Gemisch von 6,8 g (28,0 mmol) Thymidin und 10,2 g (28,6 mmol) 4,4'-Dimethoxytritylchlorid injiziert. Die Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abschluss der Reaktion wurden 10 ml Methanol zugesetzt, um den DMTrCl-Überschuss zu verbrauchen. Das Gemisch wurde 5 Minuten gerührt und das Lösungsmittel durch Rotationsverdampfen entfernt. Der Rückstand wurde in 250 ml Ethylacetat gelöst, und die Lösung wurde mit gesättigtem NaHCO₃ gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Der Feststoff wurde aus Ethylacetat/Hexan umkristallisiert, um 13,0 g 5'-geschütztes Thymidin 16 (85,6 %) zu erhalten: Fp. 124-126 °C; ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 8,97 (s, 1H, NH), 7,60 (m, 1H, H-6), 6,72-7,42 (m, 13H, Ph), 6,42 (m, 1H, H-1'), 4,56 (m, 1H, H-3'), 4,05 (m, 1H, H-4'), 3,78 (s, 6H, OMe₂), 3,41 (m, 2H, H-5'), 2,62 (m, 1H, OH), 2,46 (m, 2H, H-2'), 1,46 (s, 3H, Me); ¹³C-NMR (50 MHz, CDCl₃) δ 163,0 (C-4), 157,6, 149,8 (C-2), 143,5, 135,0 (C-6), 134,7, 134,6, 129,4, 127,4, 127,3, 126,5, 112,8, 110,9(C-5), 86,7 (C-4'), 86,2, 84,7 (C-1'), 72,5 (C-3'), 63,8 (C-5'), 55,5 (OCH_S), 41,3 (C-2'), 12,5 (CH₃). Herstellungsbeispiel 6 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3'-O-(tert-butyldimethylsilyl)thymidin (17)
Einer Lösung von 13,0 g (23,9 mmol) 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)thymidin 16 in 50 ml DMF wurden 3,0 g (44 mmol) Imidazol und 3,6 g (23,9 mmol) tert-Butyldimethylsilylchlorid zugesetzt. Die Lösung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das DMF in vacuo entfernt und der Rückstand in 300 ml Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit Wasser gewaschen, und die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet. Nach Konzentrieren der Lösung und Umkristallisieren aus Ethylacetat/Hexan wurde das feste Produkt 5'-O-(4,4'-Dimethoxy)-3'-(tert-butyldimethylsilyl)thymidin 17 direkt für die nächste Reaktion verwendet. Herstellungsbeispiel 7 3'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)thymidin (18)
Eine Lösung von 5 g (7,6 mmol) 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-3'-O-(tert-butyldimethylsilyl)thymidin 17 in 100 ml 80 % aq. Essigsäure wurde gerührt, bis die Entfernung der Dimethoxytritylgruppe abgeschlossen war.
Anschließend wurde gesättigtes Na₂CO₃ zugesetzt, um den pH-Wert der Lösung auf 6-7 einzustellen. Anschließend wurde die Lösung mit Ethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde getrocknet das Gemisch über eine Kieselgelsäule (CH₂Cl₂:MeOH=20:1) chromatographiert, um 2,5 g 3'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)thymidin 18 (92,6 %) zu ergeben: Fp. 93-95 °C (Lit. 83-84 °C); H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 9,18 (s, 1H, NH), 7,36 (b, 1H, H-6), 6,12 (t, J=6,8 Hz, 1H, H-1'), 4,44-4,48 (m, 1H, H-3'), 3,69-3,91 (m, 3H, H-4', H-5'), 2,87 (m, 1H, OH), 2,15-2,35 (m, 2H, H-2'), 1,87 (s, 3H, C=CMe), 0,86 (s, 9H, CMe₃), 0,05 (s, 6H, SiMe₂); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 163,9 (C-4), 150,4 (C-2), 137,1 (C-6), 110,9 (C-5), 87,6 (C-4'), 86,8 (C-1'), 71,5 (C-3'), 61,9 (C-5'), 40,4 (C-2'), 25,7 (SiCMe₃), 17,9 (SiCMe), 12,5 (C=CMe), –4,7 (SiMe₂), –4,9 (SiMe₂). Beispiel 8 2-Chlor-3-iso-propyl-6R-methyl-1-oxa-3-aza-2-phosphacyclohexan (12)
Einer Lösung von 2,2 ml (3,45 g, 25 mmol) Phosphortrichlorid in 30 ml Dichlormethan wurden eine Lösung von 2.89 g (22 mmol) 2R-Hydroxy-4-(N-iso-propyl)aminobutan 11 und 5,0 g (6,9 ml, 50 mmol) Triethylamin in 20 ml Dichlormethan unter kräftigem Rühren unter Stickstoff bei 0 °C zugesetzt. Das Rühren wurde 0,5 h bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Lösungsmittel wurde durch Eindampfen unter reduziertem Druck entfernt und der Rückstand mit Diethylether (3x50 ml) extrahiert. Die Destillation ergab 2,9 g von Produkt 12 (74,4 % Ausbeute): ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 4,48-4,68 (m, 1H, OCH), 3,40-3,61 (m, 1H, NCH), 3,15-3,38 (m, 1H, NCH₂), 2,80-2,96 (m, 1H, NCH₂), 1,71-1,85 (m, 2H, CH₂), 1,25 (d, J=6,4 Hz, 3H, Me), 1,13 (dd, 6H, Me₂); ¹³C-NMR (50 MHz, CDCl₃) δ 69,5 (d, J=4,3 Hz, OCMe), 49,6 (d, J=34 Hz, NCMe₂), 37,4 (d, J=5,5 Hz, NCH₂), 33,4 (CH₂), 22,2 (d, J=4,3 Hz, Me), 21,1 (d, J=13,3 Hz, Me₂), 19,2 (d, J=5,0 Hz, Me₂); ³¹P-NMR (81 MHz, CDCl₃) δ 160,6. Beispiel 9 Phosphoramidit (13a)
Einer Lösung von 215 mg (1,1 mmol) 2-Chlor-3-isopropyl-6R-methyl-1-oxa-3-aza-2-phosphacyclohexan 12 in 40 ml CH₂Cl₂ wurde eine Lösung von 356 mg (1,0 mmol) 5-O-(tert-Butyldimethylsilyl)thymidin und 0,154 ml Triethylamin (111 mg, 1,1 mmol) in 20 ml CH₂Cl₂ unter kräftigem Rühren unter Stickstoff bei 0 °C zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis TLC anzeigte, dass die Reaktion vollständig abgelaufen war. Das Reaktionsgemisch wurde in 150 ml Ethylacetat übergeführt, welches zuvor mit einer gesättigten NaHCO₃-Lösung gewaschen wurde. Sodann wurde gesättigtes NaHCO₃ zugesetzt, um die Lösung zu waschen. Die abgetrennte organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels durch Eindampfen unter reduziertem Druck bildete sich ein weißer Schaum (quantitative Ausbeute). Gemäß ³¹P-NMR-Spektrum wurden zwei Komponenten in einem Verhältnis von 1:3 (135,0 ppm:133,6 ppm) festgestellt. Das Reaktionsgemisch in CDCl₃ wurde anschließend etwa 4 Stunden unter Rückfluss erhitzt, um ein Verhältnis von bis zu 1:12 (135,0 ppm:133,6 ppm) zu erhalten. Nach Chromatographie über eine Kieselgelsäule (Hexan:Ethylacetat:Triethylamin=5:3:2) wurde die schnell eluierende Komponente (133,6 ppm) als reines Diastereomer abgetrennt: ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,50 (m, 1H, H-6), 6,36 (dd, J=8,5, 5,8 Hz, 1H, H- 1'), 4,56 (m, 1H, H-3'), 4,30 (m, 1H, HCMe), 4,04 (m, 1H, H-4'), 3,75-3,90 (m, 2H, H-5'), 3,39 (hept, J=6,3 Hz, 1H, NCH), 3,24 (m, 1H, NCH₂), 2,72 (m, 1H, NCH₂), 2,35 (m, 1H, H-2'), 2,06 (m, 1H, H-2'), 1,89 (d, J=0,9 Hz, 3H, CH₃), 1,64 (m, 2H, CH₂), 1,16 (d, J=6,4 Hz, 3H, OCHMe), 1,08 (dd, J=2,0 Hz, 6,3Hz, 6H, NCMe₂), 0,89 (s, 9H, SiCMe₃), 0,09 (d, J=1,5 Hz, 6H, SiMe₂); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 163,9 (C-4), 150,5 (C-2), 135,3 (C-6), 110,9 (C-5), 86,5 (d, J=2,8 Hz, C-4'), 84,8 (C-1'), 73,3 (d, J=19,2 Hz, C-3'), 66,0 (d, J=2,7 Hz, OCH), 63,2 (C-5'), 49,2 (d, J=34,8 Hz, NCH), 40,4 (d, J=4,6 Hz, C-2'), 36,6 (d, J=5,5 Hz, NCH₂), 34,6 (CH₂), 25,9 (SiCMe₃), 22,9 (d, J=4,6 Hz, OCMe), 21,8 (d, J=10 Hz, NCMe₂), 21,0 (d, J=4,6 Hz, NCMe₂), 18,3 (SiCMe₃), 12,5 (C=CMe), –5,5 (SiMe₂), –5,4 (SiMe₂); ³¹P-NMR (81 MHz, CDCl₃) δ 133,6; MS (Cl, NH₃) m/e 516 ([M+H⁺], 37 %), 390 (21), 339 (92), 178 (100), 160 (55); HRMS (Cl, NH₃) m/e berechnet für C₂₃H₄₃N₃O₆PSi [M+H⁺]: 516,2659, gefunden 516,2664. Beispiel 10 Phosphoramidit (13b)
Einer Lösung von 215 mg (1,1 mmol) 2-Chlor-3-isopropyl-6R-methyl-1-oxa-3-aza-2-phosphocyclohexan 12 in 40 ml CH₂Cl₂ wurde langsam eine Lösung von 356 mg (1,0 mmol) 5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)thymidin 1 und 0,154 ml Triethylamin (111 mg, 1,1 mmol) in 20 ml CH₂Cl₂ unter kräftigem Rühren unter Stickstoff bei –78 °C zugesetzt. Das Gemisch wurde bei –78 °C gerührt, bis TLC angab, dass die Reaktion vollständig abgelaufen war. Das Reaktionsgemisch wurde schnell in 150 ml Ethylacetat übergeführt, welches zuvor mit einer kalten gesättigen NaHCO₃-Lösung gewaschen wurde. Sodann wurde zum Waschen der Lösung kaltes gesättigtes NaHCO₃ zugesetzt. Die abgetrennte organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter reduziertem Druck bei 0 °C wurde ein weißer Schaum (quantitative Ausbeute) gebildet. Gemäß ³¹P-NMR-Spektrum wurden zwei Komponenten in einem Verhältnis von 5:1 (135,1 ppm:133,6 ppm) festgestellt. Das Reaktionsgemisch in CDCl₃ wurde sofort über eine Kieselgelsäule (Hexane:Ethylacetat:Triethylamin=5:3:2) chromatographiert, und die langsam eluierende Komponente (135,1 ppm) wurde als angereichertes Diastereomer (92 % rein) abgetrennt: ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,48 (m, 1H, H-6), 6,32-6,35 (dd, J=5,4, 7,8 Hz, 1H, H-1'), 4,55-4,60 (m, 1H, H-3'), 4,02-4,10 (m, 1H, OCH), 4,00 (m, 1H, H-4'), 3,74-3,89 (m, 2H, H-5'), 3,36-3,45 (m, 1H, NCH), 3,09-3,14 (m, 1H, NCH₂), 2,85-2,93 (m, 1H, NCH₂), 2,40-2,44 (m, 1H, H-2'), 2,12-2,21 (m, 1H, CH₂), 2,00-2,06 (m, 1H, H-2'), 1,88 (s, 3H, C=CCH₃), 1,81-1,86 (m, 1H, CH₂), 1,28 (d, J=6,3 Hz, 3H, OCMe), 1,11 (dd, J=6,3, 11,7 Hz, 6H, NCMe₂), 0,89 (s, 9H, Me₃), 0,08 (d, J=2,0 Hz, 6H, SiMe₂); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 163,7 (C-4), 150,2 (C-2), 135,5 (C-6), 110,8 (C-5), 87,0 (d, J=6,4 Hz, C-4'), 84,8 (d, J=5,5 Hz, C-1'), 72,8 (d, J=19,2 Hz, OCHMe), 70,3 (d, 7,3, C-3'), 63,1 (C-5'), 49,5 (d, J=39,4 Hz, NCHMe₂), 40,1 (d, J=1,8 Hz, C-2'), 36,9 (d, J=5,5 Hz, NCH₂), 31,5 (d, J=7,3 Hz, CH₂), 25,9 (SiCMe₃), 23,3 (OCMe), 21,7 (d, J=11,0 Hz, NCHMe₂), 21,1 (d, J=5,5 Hz, NCHMe₂), 18,4 (SiCMe₃), 12,5 (C=CMe), –5,4 (SiMe₂), –5,5 (SiMe₂); ³¹P-NMR (81 MHz, CDCl₃) δ 135.1 Beispiel 11 Phosphoramidit (14)
Einer Lösung von 0,2 ml (315 mg, 2,3 mmol) Phosphortrichlorid in 10 ml Dichlormethan wurde eine Lösung von 320 mg (2,2 mmol) Butanol 31 und 0,7 ml Triethylamin in 5 ml Dichlormethan unter kräftigem Rühren für 0,5 h unter Stickstoff bei 0 °C und sodann bei Raumtemperatur zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde durch Eindampfen unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mit Diethylether (2x40 ml) extrahiert. Nach Entfernen des Ethers wurden 512 mg Ölrückstand erhalten. Anschließend wurden 209 mg (1,0 mmol) dieses Ölrückstands in 10 ml Dichlormethan gelöst, eine Lösung von 200 mg (0,56 mmol) 5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)thymidin 1 und 0,16 ml Triethylamin (1,1 mmol) in 10 ml CH₂Cl₂ wurde unter kräftigem Rühren unter Stickstoff bei Raumtemperatur zugesetzt. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur gerührt, bis TLC anzeigt, dass die Reaktion vollständig abgelaufen war. Das Reaktionsgemisch wurde in 100 ml Ethylacetat übergeführt, das zuvor mit gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen wurde. Zum Waschen der Lösung wurden gesättigtes NaHCO₃ und sodann Wasser zugesetzt. Die abgetrennte organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels durch Eindampfen unter reduziertem Druck wird ein weißer Schaum gebildet (quantitative Ausbeute). Gemäß ³¹P-NMR-Spektrum wurden zwei Komponenten in einem Verhältnis von 1:5 (132,4 ppm:130,8 ppm) festgestellt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch etwa 4 Stunden unter Rückfluss in C₆D₆ erhitzt, um ein Verhältnis von 1:9 (d 137,8 ppm:136,1 ppm in Benzol) zu erhalten. Beispiel 12 Phosphoramidit (15)
Einer Lösung von 6,30 g (4,0 ml, 46 mmol) Phosphortrichlorid in 100 ml Dichlormethan wurde eine Lösung von 6,61 g (40 mmol) (1R,2S)-Ephedrin und 10,1 g (14 ml, 100 mmol) Triethylamin in 50 ml Dichlormethan unter kräftigem Rühren für 0,5 h unter Stickstoff bei 0 °C und sodann bei Raumtemperatur, zugesetzt. Das Lösungsmittel wurde durch Eindampfen unter reduziertem Druck entfernt, und der Rückstand wurde mit Diethylether (3x100 ml) extrahiert. Nach Entfernen des Ethers wurden 9,3 g Ölrückstand erhalten. Anschließend wurden 345 mg (1,5 mmol) dieses Ölrückstands in 40 ml Dichlormethan gelöst, eine Lösung von 356 mg (1,0 mmol) 5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)thymidin 1 und 0,154 ml Triethylamin (111 mg, 1,1 mmol) in 20 ml CH₂Cl₂ wurde unter kräftigem Rühren unter Stickstoff bei –78 °C zugesetzt. Das Gemisch wurde bei –78 °C gerührt, bis TLC anzeigte, dass die Reaktion vollständig abgelaufen war. Das Reaktionsgemisch wurde schnell in 150 ml Ethylacetat übergeführt, das zuvor mit kalter gesättigter NaHCO₃-Lösung gewaschen wurde. Zum Waschen der Lösung wurde kalte gesättigte NaHCO₃-Lösung zugesetzt. Die abgetrennte organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernung des Lösungsmittels durch Eindampfen unter reduziertem Druck bei 0 °C bildete sich ein weißer Schaum (quantitative Ausbeute). Gemäß ³¹P-NMR-Spektrum wurden zwei Komponenten in einem Verhältnis von 1:2 (147,3 ppm: 141,6 ppm) festgestellt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch etwa 4 Stunden unter Rückfluss in CDCl₃ erhitzt, um ein Verhältnis von bis zu 1:5 (151,5 ppm:143,5 ppm) zu erhalten. Nach Chromatographie über eine Kieselgelsäule (Hexan:Ethylacetat:Triethylamin=5:3:2) wurde die langsam eluierende Komponente (143,5 ppm) als reines Diastereomer abgetrennt: ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,23-7,50 (m, 5H, Ph), 6,35 (m, 1H, H-1'), 5,60 (d, J=6,8 Hz, 1H, PhCH), 4,71-4,75 (m, 1H, H-5'), 4,01-4,02 (m, 1H, H-4'), 3,78-3,87 (m, 2H, H-5'), 3,52-3,58 (m, 1H, MeCH), 2,64 (d, J=12,2 Hz, 3H, NMe), 2,31-2,36 (m, 1H, H-2'), 2,05-2,11 (m, 1H, H-2'), 1,90 (s, 3H, C=CMe), 0,90 (s, 9H, CMe₃), 0,60 (d, J=6,4 Hz, 3H, CHMe), 0,09 (s, 6H, SiMe₂); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 163,9 (C-4), 150,5 (C-2), 137,9 (Ph), 135,3 (C-6), 128,1 (Ph), 127,7 (Ph), 126,7 (Ph), 111,0 (C-5), 86,7 (d, J=1,8 Hz, C-4'), 84,7 (OCPh), 84,6 (d, J=9,2 Hz, C-1'), 73,1 (d, J=18,3 Hz, C-3'), 63,0 (C-5'), 57,5 (d, J=5,6 Hz, NCMe), 40,6 (d, J=5,5 Hz, C-2'), 28,8 (d, J=17,4, NCH₃), 25,9 (SiCMe₃), 18,3 (SiCMe₃), 14,6 (d, J=3,7 Hz, NCHMe), 12,5 (C=CMe), –5,4 (SiMe₂), –5,5 (SiMe₂); ³¹P-NMR (81 MHz, CD₃CN) δ 143,5 Beispiel 13 Phosphittriester (20a) aus Phosphoramidit 13a mit MeOH
Diasteriomerisch reines Phosphoramidit 13a (10 mg, schnell eluierende Komponente) in 0,5 ml CDCl₃ wurde in einem 5-mm-NMR-Röhrchen vorgelegt, und sodann wurden 50 μl trockenes MeOH (großer Überschuss) über eine Spritze und anschließend 1 mg Dicyanoimidazol zugesetzt. Die Umsetzung wurde durch ³¹P-NMR aufgezeichnet, bis die Umsetzung vollständig abgelaufen war. Die Phosphittriester bildeten sich in einem Verhältnis von 10:1 (139,4 ppm:138,8 ppm) und wurden über eine Kieselgelsäule gereinigt: ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,48 (s, 1H, H-6), 6,35 (dd, J=5,4, 8,8 Hz, 1H, H-1'), 4,78-4,82 (m, 1H, H-3'), 4,24-4,33 (m, 1H, OCH), 4,10 (d, J=2,4 Hz, 1H, H-4'), 3,76-3,89 (m, 2H, H-5'), 3,50 (d, J=10,7 Hz, 3H, CH₃), 2,78 (m, 1H, NCH), 2,65 (m, 2H, NCH₂), 2,40 (m, 1H, H-2'), 2,04 (m, 1H, H-2'), 1,89 (d, J=1,0 Hz, 3H, C=C-CH₃), 1,64-1,78 (m, 2H, OCHCH₂), 1,25 (d, J=6,4 Hz, 3H, OCHCH₃), 1,03 (d, J=6,3 Hz, 6H, NCHMe₂), 0,91 (s, 9H, SiCMe₃), 0,10 (d, J=2,0 Hz, 6H, SiMe₂); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 163,5 (C-4), 150,1 (C-2), 135,3 (C-6), 110,9 (C-5), 86,5 (d, J=2,7 Hz, C-4'), 84,8 (C-1'), 72,1 (d, J=8,2 Hz, C-3'), 69,5 (OCH), 63,0 (C-5'), 49,2 (d, J=9,2 Hz, OCH₃), 48,8 (Me₂CNH), 40,3 (d, J=3,7 Hz, C-2'), 38,7 (d, J=4,6 Hz, CH₂), 25,9 (SiCMe₃), 22,9 (d, J=3,7 Hz, NCHMe₂). 18,3 (SiCMe₃), 12,5 (C=CMe), –5,4 (SiMe₂); ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 139,4. Beispiel 14 Phosphittriester (20b) aus Phosphoramidit 13b mit Methanol
Diastereomerisch angereichertes (75 %) Phosphoramidit 13b (10 mg, langsam eluierende Komponente) in 0,5 ml CDCl₃ wurde in einem 5-mm-NMR-Röhrchen vorgelegt, und sodann wurden 50 μl trockenes MeOH (großer Überschuss) über eine Spritze und anschließend 1 mg Dichlorimidazol zugesetzt. Die Reaktion wurde durch ³¹P-NMR aufgezeichnet, bis die Umsetzung vollständig abgelaufen war. Die in einem Verhältnis von 1:2 (139,4 ppm:138,8 ppm) gebildeten Phosphittriester wurden über eine Kieselgelsäule gereinigt. ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,48 (s, 1H, H-6), 6,34 (m, 1H, H-1'), 4,78-4,82 (m, 1H, H-3'), 4,25-4,33 (m, 1H, OCH), 4,11 (d, J=2,4 Hz, 1H, H-4'), 3,77-3,89 (m, 2H, H-5'), 3,49 (d, J=10,3 Hz, 3H, CH₃), 2,76 (m, 1H, NCH), 2,64 (m, 2H, NCH₂), 2,39 (m, 1H, H-2'), 2,05 (m, 1H, H-2'), 1,90 (s, 3H, C=C-CH₃), 1,65-1,78 (m, 2H, OCCH₂), 1,26 (d, J=6,4 Hz, 3H, OCHCH₃), 1,04 (d, J=6,4 Hz, 6H, NCHMe₂), 0,91 (s, 9H, SiCMe₃), 0,10 (d, J=2,0 Hz, 6H, SiMe₂); ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 138,8. Beispiel 15 Phosphittriester (32) aus Phosphoramidit 13a mit n-Butanol
Diasteriomerisch reines Phosphoramidit 13a (10 mg, schnell eluierende Komponente) in 0,5 ml CDCl₃ wurde in einem 5-mm-NMR-Röhrchen vorgelegt, und anschließend wurden 50 μl trockenes n-Butanol (großer Überschuss) über eine Spritze gefolgt von 1 mg Dicyanoimidazol zugesetzt. Die Reaktion wurde durch ³¹P-NMR aufgezeichnet, bis die Umsetzung vollständig abgelaufen war. Die in einem Verhältnis von 7:1 (138,9 ppm:138,5 ppm) gebildeten Phospittriester wurden über eine Kieselgelsäule gereinigt. ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,49 (d, J=1,5 Hz, 1H, H-6), 6,35 (dd, J=5,5, 8,8 Hz, 1H, H-1'), 4,83 (m, 1H, H-3'), 4,24-4,31 (m, 1H, OCH), 4,11 (d, J=2,0 Hz, 1H, H-4'), 3,71-3,89 (m, 4H, 2H-5', OCH₂), 2,78 (m, 1H, NCH), 2,66 (m, 2H, NCH₂), 2,39 (m, 1H, H-2'), 2,02 (m, 1H, H-2'), 1,89 (s, 3H, C=C-CH₃), 1,63-1,77 (m, 2H, OCMeCH₂), 1,57 (m, 2H, CH₂), 1,36 (m, 2H, CH₂), 1,24 (d, J=6,3 Hz, 3H, OCHCH₃), 1,04 (d, J=6,3 Hz, 6H, NCHMe₂), 0,91 (s, 9H, SiCMe₃), 0,10 (d, J=2,0 Hz, 6H, SiMe₂); ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 138,9. Beispiel 16 Phosphittriester (33a) aus Phosphoramidit 7a mit Methanol
Diastereomerisch reines Phosphoramidit 7a (10 mg, schnell eluierende Komponente) in 0,5 ml CDCl₃ wurde in einem 5-mm-NMR-Röhrchen vorgelegt, und anschließend wurden 50 μl trockenes Methanol (großer Überschuss) über eine Spritze, gefolgt von 1 mg 4,5-Dicyano-2-bromimidazol zugesetzt. Die Umsetzung wurde durch ³¹P-NMR aufgezeichnet, bis die Umsetzung vollständig abgelaufen war. Der Phosphittriester bestand aus nur einem Diastereomer (139,1 ppm) und wurde über eine Kieselgelsäule gereinigt. ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,48 (s, 1H, H-6), 6,34 (dd, J=5,4, 8,8 Hz, 1H, H-1'), 4,78 (m, 1H, H-3'), 4,09 (m, 1H, H-4'), 3,76-3,89 (m, 4H, 2H-5', OCH₂), 3,50 (d, J=10,2 Hz, 3H, OCH₃), 2,80 (m, 1H, NCHMe₂), 2,67 (t, J=6,8 Hz, 2H, NHCH₂), 2,39 (m, 1H, H-2'), 2,05 (m, 1H, H-2'), 1,90 (s, 3H, C=C-CH₃), 1,78 (m, 2H, OCHCH₂), 1,03 (d, J=6,3 Hz, 6H, NCHMe₂), 0,91 (s, 9H, SiCMe₃), 0,10 (s, 6H, SiMe₂); ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 139,1; MS(CI) m/e: 534 ([M+H⁺], 100 %), 502 (14,4), 376 (13,6), 339 (74,6), 281 (20,4), 164 (59,8). Beispiel 17 Phosphittriester (33b) aus Phosphoramidit 7b mit Methanol
Diastereomerisch angereichertes (92 %) Phosphoramidit 7b (10 mg, langsam eluierende Komponente) in 0,5 ml CDCl₃ wurde in einem 5-mm-NMR-Röhrchen vorgelegt, und anschließend wurden 50 μl trockenes Methanol (großer Überschuss) über eine Spritze, gefolgt von 1 mg Dicyanobromimidazol zugesetzt. Die Reaktion wurde durch ³¹P-NMR aufgezeichnet, bis die Umsetzung vollständig abgelaufen war. Der diastereomerisch angereicherte Phosphittriester 33b (92 %) in einem Verhältnis von 1:11 (139,2 ppm:138,8 ppm) wurde über eine Kieselgelsäule gereinigt. ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 138,8. Beispiel 18 Thiophosphonat (44)
Diastereomerisch reines 13a (100 mg, schnell eluierende Komponente) wurde in 5 ml CDCl₃ gelöst, und anschließend wurden 0,5 ml MeOH über eine Spritze, gefolgt von 5 mg 2-Brom-4,5-dicyanoimidazol zugesetzt. Die Reaktion wurde durch ³¹P-NMR aufgezeichnet, bis die Umsetzung vollständig abgelaufen war, wobei fast nur 1 Diastereomer des Phosphittriesters 20a (139,4 ppm) festgestellt wurde, und sodann wurden 10 mg Schwefel zugesetzt. Die Sulfurierung war innerhalb von 5 Minuten abgeschlossen. Nach Chromatographie (Ethylacetat:Triethylamine=1:1) wurde das sulfurierte Produkt 24 in einer öligen Form erhalten. ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,50 (d, J=1,4 Hz, 1H, H-6), 6,36 (dd, J=5,4, 9,3 Hz, 1H, H-1'), 5,08 (m, 1H, H-3'), 4,63-4,72 (m, 1H, OCH), 4,25 (m, 1H, H-4'), 3,88 (m, 2H, H-5'), 3,73 (d, J=13,7 Hz, 3H, OCH₃), 2,77 (m, 1H, NCHMe₂), 2,67 (t, J=6,4 Hz, 2H, NCH₂), 2,48 (m, 1H, H-2'), 2,09 (m, 1H, H-2'), 1,90 (d, J=1,5 Hz, 3H, C=C-CH₃), 1,70-1,86 (m, 2H, OCCH₂), 1,32 (d, J=5,9 Hz, 3H, OCHCH₃), 1,04 (dd, J=2,9, 5,9 Hz, 6H, NCHMe₂), 0,92 (s, 9H, SiCMe₃), 0,12 (s, 6H, SiMe₂); ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 67,5. Beispiel 19 2-Brom-4,5-dicyanoimidazol (21)
Zu 1,18 g (10 mmol) 4,5-Dicyanoimidazol und 25 ml 0,1 M NaOH wurden 1,8 ml Br₂ (35 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und sodann mit verdünnter HCl angesäuert. Der Feststoff wurde abfiltriert, mit Wasser gespült und aus Wasser umkristallisiert, um 1,5 g Dicyanobromimidazol 21 (Ausbeute 76,4 %) zu ergeben: Fp. 147-149 °C (Lit. 141-143 °C); Rf=0,65 (Ethylacetat:Methanol=4:1); MS(EI): 198([M+2], 96 %), 196 ([M⁺], 100 %), 171 (28,5), 169 (29,2), 117 (27,4), 91 (19,0), 64 (20,6), 53 (22,4), 38 (18,8). Beispiel 20 Synthese von (S)-Methyl-3-(5-imidazolyl)-2-hydroxypropionat-(3)-hydrochlorid
(L)-Histidin (3,103 g, 20 mmol) wurde zunächst in 30 ml 1 N Chlorwasserstoffsäurelösung gelöst. Die Lösung wurde auf 0 °C abgekühlt, anschließend wurde während eines Zeitraums von 1 Stunde eine Lösung von Natriumnitrit (2,070 g, 30 mmol) in 10 ml destilliertem Wasser zugetropft. Die Lösung wurde über Nacht bei 0 °C gerührt, anschließend unter Erhitzen in vacuo zur Trockene eingedampft. Dem festen Rückstand wurden 20 ml destilliertes Wasser zugesetzt, das Gemisch wurde noch einmal mit Toluol eingedampft, um den Wasserrest so weit wie möglich azeotrop zu entfernen. Nach Trocknen der Verbindung im Hochvakuum über Nacht und ohne Isolieren der intermediären Säure wurde das Gemisch in 50 ml trockenem Methanol gelöst und unter Ar gerührt. Diese Lösung wurde auf 0 °C abgekühlt, und ein Strom von gasförmigem Chlorwasserstoff wurde durch das Gemisch hindurchgeblasen. Nach 1,5 Stunden zeigte TLC das Verschwinden der Säure, und die Reaktion wurde gestoppt. Das Gemisch wurde in vacuo unter Erhitzen eingedampft, um einen klebrigen gelben Rückstand zu ergeben, der aus einem Gemisch von Ethanol und Wasser kristallisiert werden konnte, um 3,10 g (2).HCl zu ergeben. Fp. 139-142 °C, [α]_D –21° (c 1,9, Methanol, 25 °C) (Lit. –22°) ¹H-NMR (200 MHz, CD₃OD) δ 8,90 (s, 1H, NCHN); 7,30 (s, 1H, NCHC); 4,40 (dd, ABX, ³J_Ha-Hx=5,40 Hz, ³J_Hb-Hx=5,00 Hz, CHOH); 3,72 (s, 3H, OCH₃); 2,85-3,10 (ABX, 2H, ²J_Hb-Hx =13,75 Hz, ³J_Hb-Hx=5,0 Hz, ³J_Hb-Hx=5,4Hz, CH₂); ¹³C-NMR (nicht entkoppelt) (125 MHz, D₂O) δ 175,3 (s, CO); 134,2 (d, NCHN); 129,7 (s, CH₂CN); 117,6 (d, CCHN); 69,9 (d, CHOH); 53,6 (q, CH₃); 29,5 (t, CH₂); M.S. (M+1)⁺ 171. Beispiel 21 Synthese von Imidazo-oxazaphospholidin (4)
Die Verbindung (3) (0,236 g, 1,39 mmol) wurde in sehr sorgfältig getrockneten Glasgeräten vorgelegt, über Nacht in vacuo getrocknet und anschließend unter eine Ar-Atmosphäre verbracht. Die Verbindung wurde in 5 ml trockenem Ether suspendiert, anschließend wurde Triethylamin (0,20 ml, 3,15 mmol) zugesetzt. Die Suspension wurde auf 0 °C abgekühlt und unter Ar gerührt. Anschließend wurde Methyldichlorphosphit (0,15 ml, 1,58 mmol) schnell über eine Spritze in das Gemisch eingebracht. Sobald das Phosphit eingebracht war, wurde ein dicker weißer Niederschlag festgestellt, der der Bildung von Triethylammoniumchlorid entsprach. Nach 15 Minuten, sowie nach 2 bis 4 Stunden, zeigte ³¹P-NMR mehrere Signale zwischen 176 und 120 ppm. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur zeigte ³¹P-NMR ein einziges Signal bei 143,5 ppm. Die Verbindung zersetzte sich bei versuchter Handhabung (Verdünnung in trockenem Ether, Filtration unter einer Ar-Atmosphäre, Konzentrieren durch Eindampfen des Ethers), wie durch ³¹P-NMR durch mehrere Peaks bei 5-20 ppm, die sehr wahrscheinlich H-Phosphonatderivaten entsprechen, angegeben. Das Verändern der Reaktionsbedingungen brachte keinerlei Verbesserung.
Darum konnte Verbindung (4) nicht weiter gereinigt und analysiert werden. Beispiel 22 Synthese von 1-Tritylimidazol (5)
Einer Lösung von Tritylchlorid (5,58 g, 20,0 mmol,) in trockenem Methylenchlorid (100 ml), abgekühlt auf 0 °C und gerührt unter Ar, wurde während 1,5 Stunden einer Lösung von Imidazol (1,36 g, 20,0 mmol) und Triethylamin (2,7 ml, 20 mmol) in 50 ml trockenem Methylenchlorid zugetropft. Am Ende der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und bei dieser Temperatur über Nacht unter Ar gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit 20 ml einer 10%igen Ammoniumchloridlösung und sodann mit 20 ml destilliertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und in vacuo eingedampft, um quantitativ einen weißen Feststoff zu erhalten.
Die Umkristallisation aus Methylenchlorid/Hexanen ergab 5,60 g von (5) (Ausbeute=90 % nach Umkristallisation). Fp. 214 °C; ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 7,43 (m, 1H, NCHN), 7,3-7,4 (m, 9H, 3xC₆H₅), 7,1-7,2 (m, 6H, 3xC₆H₅), 7,0 (m, 1H, Ph₃CNCH=CH), 6,81 (m, 1H, Ph₃CNCH=CH); ¹³C-NMR (50 MHz, CDCl₃) δ 142,3, 139,0, 129,6, 128,2, 128,3, 121,6. Beispiel 23 Synthese von (S)-1-(2-(1-Triphenylmethyl)-imidazolyl)-propan-2-ol (S)-6
Einer Lösung von N-Tritylimidazol (1,55 g, 5 mmol) in frisch destilliertem THF (50 ml), abgekühlt auf –78 °C und gerührt unter trockenem Ar, wurde eine 2,5 M Lösung von n-Butyllithium in Pentan (2,4 ml, 6 mmol) zugesetzt. Die Zugabe dauerte 30 Minuten, und die erhaltene tiefrote Lösung wurde auf 0 °C aufwärmen gelassen, 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt und sodann wieder auf –78 °C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurde (S)-Propylenoxid (0,35g, 6 mmol) zugetropft. Nach 30 Minuten wurde die Lösung auf 0 °C aufwärmen gelassen und bei dieser Temperatur 12 Stunden gerührt, bis TLC anzeigte, dass die Umsetzung nicht weiter abläuft. Die Lösung wurde in 50 ml gesättigte NH₄Cl-Lösung gegossen, und das resultierende Gemisch wurde mit CH₂Cl₂ extrahiert. Nach Flashchromatographie (Hexan:Aceton:Triethylamin 78:21:1) wurden 1,44 g des reinen Produkts in einer Ausbeute von 78 % gesammelt. Fp. 201 °C; ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) 6 7,20-7,40 (m, 9H, 3xC₆H₅), 7,10-7,18 (m, 6H, 3xC₆H₅), 6,90 (d, 1H, ³J_H-H =1,2; CHNCPh₃), 6,71 (d, 1H, ³J_H-H=1,2; CH=CHNCPh₃), 5,83 (b, 1H, OH), 3,40-3,60 (m, 1H, CHCH₃), 1,78-2,05 (ABX, 2H, ³J_Hb-Hx=3,2 Hz, ³J_Ha-Hx=8,5 Hz, ²J_Ha-Hb=16,2 Hz, CH₂), 0,81 (d, ³J_H-H=6,0 Hz, 3H, CH₃); ¹³C-NMR (50 MHz, CDCl₃) δ 149,2, 142,1, 129,6, 127,9, 127,7, 124,7, 121,0 (NCCN), 74,6, 65,0 (CHOH), 38,1 (CH₂), 22,3 (CH₃). Beispiel 24 Synthese von (S)-1-(2-Imidazolyl)-propan-2-ol (S)-(7)
Eine Lösung von N-Tritylimidazolylpropanol (S)-(6) (2,39 g, 6,51 mmol) in 80 ml Methanol, die 4,3 ml Eisessig (5 %) enthielt, wurde etwa 12 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Danach zeigte TLC das Verschwinden der Ausgangsmaterialien. Das Gemisch wurde in vacuo konzentriert, und ein weißer Niederschlag trat bei Zugabe von 50 ml kaltem destilliertem Wasser auf. Das Gemisch wurde tiefgekühlt, anschließend filtriert, und der weiße Niederschlag wurde mit kaltem destilliertem Wasser (10 ml) gewaschen. Anschließend wurde das Filtrat zweimal eingedampft, und das zurückbleibende gelbe Öl wurde wieder in 50 ml trockenem Methanol gelöst und über das schwach basische Anionenaustauscherharz (Hydroxidform) IRA-68 gegeben. Anschließend wurde die Lösung eingedampft, um einen festen Rückstand zu erhalten, der aus einem Gemisch von Methanol und Ethylacetat umkristallisiert werden konnte. Ausbeute 0,80 g, 98 % reines (S)-(7). Fp. 119-121 °C; ¹H-NMR (200 MHz, CD₃OD) δ 6,96 (s, 2H, NCHCHN); 3,96 (m, 1H, CHCH₃); 2,4-2,65 (ABX, ³J_Ha-Hx=6,3 Hz, ³J_Hb-Hx=6,7 Hz, ³J_Ha-Hx =14,5 Hz, CH₂); 0,87 (d, 3H, ³J_H-H=6,3Hz, CH₃); ¹³C-NMR (50 MHz, CD₃OD) δ 145,8 (s, CH₂CNH); 121,2 (d, NCH=CHNH); 67,1 (d, CHOH); 38,4 (t, CH₂); 23,1 (q, CH₃); MS (CI): [M+1]⁺·127. Beispiel 25 Synthese von 1-Methoxy-3-methyl-imidazo-[2,1-e]-(3,4-dihydro)-oxaza-phosphorin (8)
In einem zuvor in vacuo getrockneten und unter Ar befindlichen NMR-Röhrchen wurden 23,0 mg (0,20 mmol) (S)-(2-Imidazolyl)-propan-2-ol (S)-(7) vorgelegt, anschließend wurde das Röhrchen mit einem Septum verschlossen und mit Ar gespült. CDCl₃ (0,7 ml) und anschließend 127 μl (1,0 mmol) Triethylamin wurden sodann eingeleitet. Der Alkohol löste sich nicht, und diese Suspension wurde auf 0 °C abgekühlt, während das Röhrchen geschüttelt wurde. Bei dieser Temperatur wurden 18,9 μl (0,20 mmol) Methyldichlorphosphit über eine Spritze in das Innere des Röhrchens eingebracht. Beim Schütteln löste sich der Alkohol sofort auf, und es wurde eine exotherme Reaktion festgestellt. Nach etwa 1 Stunde ergab ³¹P-NMR die Gegenwart von mehreren Peaks um 120-140 ppm. Nach etwa 3 Stunden wurde gemäß ³¹P-NMR ein einziges Produkt (8) beobachtet, wie durch seine chemische Verschiebung bei 118,8 ppm belegt. Es erfolgte keine weitere Charakterisierung dieser Verbindung, da sämtliche Versuche, sie zu isolieren, nicht erfolgreich waren und zur Hydrolyse dieser extrem wasserempfindlichen bicyclischen Struktur, sehr wahrscheinlich zu dem entsprechenden N-Phosphonat, führten. Beispiel 26 Synthese von 1-Ethoxy-3-methyl-imidazo-[2,1-e]-(3,4-dihydro)-oxaza-phosphorin (9)
In einem zuvor in vacuo getrocknetes und unter Ar befindliches NMR-Röhrchen wurden 18,9 mg (0,15 mmol) (S)-(2-Imidazolyl)-propan-2-ol (S)-(7) vorgelegt. Das Röhrchen wurde sodann mit einem Septum verschlossen und mit Ar gespült. Anschließend wurden 0,7 ml CDCl₃, gefolgt von 105 μl (0,75 mmol) Triethylamin eingebracht. Der Alkohol löste sich nicht, und die Suspension wurde unter Schütteln des Röhrchens auf 0 °C abgekühlt. Bei dieser Temperatur wurden 17,2 μl (0,15 mmol) Ethyldichlorphosphit über eine Spritze in das NMR-Röhrchen eingebracht. Beim Schütteln löste sich der Alkohol sofort auf, und es wurde eine exotherme Reaktion festgestellt. Nach etwa 2 Stunden wurde gemäß ³¹P-NMR ein einziges Produkt festgestellt, wie durch seine chemische Verschiebung bei 118,2 ppm belegt. Nach etwa 1 Stunde wurde die Gegenwart von anderen Produkten um 120-140 ppm festgestellt, wovon eines (121,1 ppm) wahrscheinlich das andere Diastereomer ist. Es erfolgte keine weitere Charakterisierung dieser Verbindung. Beispiel 27 Synthese von Thiophosphatethyl-(S)-1-(2-imidazolyl)-prop-2-yl-isopropylester (22)
In einem NMR-Röhrchen wurden zu einer Suspension von 18,9,mg (0,15 mmol) (S)-1-(2-Imidazolyl)-propan-2-ol (S)-(7) in 0,7 ml trockenem deuteriertem Chlorform und 0,21 ml Triethylamin (1,5 mmol), geschüttelt bei Raumtemperatur unter Ar, über eine Spritze 17,2 μl (0,15 mmol) Ethyldichlorphosphit eingeleitet. Das Reaktionsgemisch wurde bei Raumtemperatur geschüttelt, und das chirale Imidazolylpropanol löste sich während eines exothermen Vorgangs sofort auf. Zu diesem Zeitpunkt zeigte ³¹P-NMR die Bildung von mehreren Produkten, wovon eines ein Signal bei 118,3 ppm und eines ein Signal bei 120,5 ppm aufwies (vermutete Diastereomere). Nach 1 Stunde und regelmäßigem Schütteln des NMR-Röhrchens zeigte ³¹P-NMR nur einen Peak bei 118,3 ppm an. In diesem Stadium wurden 20 μl (0,45 mmol) Isopropanol eingeleitet, und das Röhrchen wurde wiederum geschüttelt. ³¹P-NMR zeigte nach 20 Minuten die Gegenwart eines einzigen Peaks bei 140,6 ppm, was anzeigte, dass die Verschiebung der Imidazolgruppierung ein einziges Diastereomer (19) entstehen ließ. Anschließend wurden 32 mg Schwefel (1 mmol) eingebracht, und das ³¹P-NMR wurde wiederum aufgezeichnet. Das Spektrum zeigte einen einzigen Peak bei 64,8 ppm an. Das Produkt (22) wurde sodann in vacuo konzentriert und durch Flashchromatographie (Ethylacetat/Hexane/Triethylamin 79/20/1) gereinigt. ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) 6,96 (s, 2H, NCH=CH-N); 4,83-4,97 (m, 1H, P-O-CH-CH₃); 4,58-4,75 (dh, 1H, ³J_H-H=6,2 Hz, ³J_H-P=9,6 Hz, OCH (CH₃)₂); 3,96-4,12 (m, 2H, P-O-CH₂CH₃); 2,98-3,20 (2xABX, 2H, ²J_Ha-H=15,5Hz, ³J_Ha-Hx=6,23 Hz, ³J_Hb-Hx=4,6 Hz,⁴J_H-P=1,5 Hz, CH₂CHCH₃); 1,21-1,34 (m, 12H, CH(CH₃) + CH(CH₃)₂ + CH₂CH₃) ¹³C-NMR (50 MHz, CDCl₃) 144,00 (s, N-C=N); 121,70 (s, N-C=C-N); 74,90 (d, ²J_C-P=6,1 Hz, P-O-CH-(CH₃)CH₂); 73,80 (d, ²J_C-P=5,7 Hz, P-O-CH₂-CH₃); 64,25 (d, 2J_C-P=5,8 Hz, P-O-CH(CH₃)₂); 35,95 (s, P-O-CH(CH₃)CH₂-); 23,40 (s, P-O-CH(CH₃)₂); 21,06 (s, P-O-CH(CH₃)CH₂-); 15,83 (s, P-O-CH₂-CH₃) ³¹P-NMR (81 MHz, CDCl₃) δ 64,8 ppm M.S.(CI), [M+1]⁺ 293. Beispiel 28 Synthese von Thiophosphatethyl-(S)-1-(2-imidazolyl)-prop-2-yl-5'-tert-butyldimethylsilylthymidinylester (19)
Einer Suspension von (S)-Imidazolylpropanol (S)-(7) (0,30 mmol, 37,8 mg) in 2 ml trockenem Dichlormethan und Triethylamin (1,5 mmol, 0,21 ml), abgekühlt auf 0 °C und gerührt unter Ar, wurde langsam Ethyldichlorphosphit (0,30 mmol, 35 μl) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde sodann auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen, die festen Ausgangsmaterialien gelöst, und nach etwa 2 Stunden zeigte ³¹P-NMR die Gegenwart eines einzigen Peaks bei 118,3 ppm an. Zu diesem Zeitpunkt wurde das Gemisch wiederum auf 0 °C abgekühlt, und bei dieser Temperatur wurde ein Gemisch von 5'-tBDMS-Thymidin (1) (0,30 mmol, 106 mg) in 1,5 ml trockenem Methylenchlorid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde erneut auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen. ³¹P-NMR zeigte nach 30 Minuten eine vollständige Umwandlung des Peaks bei 118,3 ppm in einem einzigen Peak bei 141,2 ppm, der (23) zugeordnet wurde. Sodann wurde nach etwa 30 Minuten elementarer Schwefel, S₈ (0,9 mmol, 29 mg), zugesetzt. ³¹P-NMR zeigte die Umwandlung des zuvor gebildeten Produkts in ein einziges Produkt (24) mit einem Peak bei 66,3 ppm an. Das Eindampfen des Reaktionsgemisches und die anschließende Flashchromatographie (Ethylacetat/Triethylamin 80/20) lieferten das Thioat (24) als klebrigen Feststoff (127 mg, 72 %). ¹H-NMR (300 MHz, CD₂Cl₂) δ 7,48 (d, 1H, ⁴J_H-H =1,3Hz, C=CH); 6,94 (s, 2H, NCH=CHN); 6,25 (dd, 1H, ³J_H-H=5,1 Hz, ³J_H-H =9,2Hz, NCHO); 4,84-5,05 (m, 2H, POCH(CH₃)CH₂ + POCHCH₂O); 4,15-4,24 (m, 1H, SiOCH₂CHO); 3,96-4,14 (dq, 2H, ³J_H-P=9,4 Hz, ³J_H-H=7,0 Hz, POCH₂CH₃); 3,76-3,92 (ABX, 2H, ²J_Ha-Hb=11,5 Hz, ³J_Hb-Hx=2,5 Hz, ³J_Ha-Hx=2,4 Hz, SiOCH₂CHO); 2,98-3,08 (dd, 2H, ³J_H-H=5,8 Hz, ⁴J_H-P=1,1 Hz, POCH(CH₃)CH₂-Im); 1,98-2,08 (m, 2H, POCHCH₂CHN); 1,88 (s, 3H, CH=CCH₃); 1,39 (d, 3H, ³J_H-H=6,2 Hz, POCH(CH₃)); 1,28 (dt, 3H, ³J_H-H=7,0 Hz, ⁴J_H-P=0,9 Hz, POCH₂CH₃); 0,91 (s, 9H, SiC(CH₃)₃); 0,12 (s, 6H, Si(CH₃) 2).
¹³C-NMR (121 MHz, CD₂Cl₂, entkoppelt von ¹H) δ 164,1 (s, NCOC(CH₃)); 151,1 (s, NCON); 144,2 (s, NC=N); 135,5 (s, NC=C(CH₃)C=O); 132,4 (s, NC=CN); 186,1 (s, 11,5 (C(CH₃)CO); 86,1 (s, SiOCH₂CHO); 86,0 (s, NCHO); 79,9 (d, ²J_C-P=4,4 Hz, POCH(CH₃)); 76,2 (d, ²J_C-P=5,7 Hz, POCH₂CH₃); 65,0 (d, ²J_C-P=5,6 Hz, POCHCHO); 63,8 (s, SiOCH₂); 39,4 (s, POCHCH₂CHN); 36,6 (POCH(CH₃)CH₂); 26,1 (SiC(CH₃)₃); 21,3 (POCH(CH₃)); 18,6 (SiC(CH₃)₃); 16,0 (s, POCH₂CH₃); 12,7 (s, C=CCH₃); –5,4 (d, Si(CH₃)₂); MS (CI) (M+1)⁺·589. Beispiel 29 1,2-O-3,5-O-Dicyclopentyliden-D-xylofuranose (25)
Einer Lösung von Trimethylorthoformiat (5 mmol, 547 μl) und p-Toluolsulfonsäure (0,2 mmol, 38 mg) in Dioxan (10 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0 °C wurde Cyclopentanon (40 mmol, 3,5 ml) zugetropft. Die Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und D-Xylose (2 mmol, 300 mg) wurde unter fortgesetztem Rühren über Nacht zugesetzt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit Triethylamin neutralisiert. Das Eindampfen des Lösungsmittels lieferte einen gelben sirupösen Rückstand. Eine Lösung des sirupösen Rückstands in Chloroform (20 ml) wurde mit Wasser (20 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit Chloroform (3x15 ml) extrahiert. Die vereinigten Chloroformschichten wurden getrocknet (MgSO₄). Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde das Gemisch über eine Kieselgelsäule chromatographiert (Hexan:Ethylacetat=5:1), um 340 mg weißem Feststoff zu erhalten (60 %).
¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 5,99(δ, J=3,80 Hz, 1H, H-1), 4,45 (d, J=3,81 Hz, 1H, H-2), 4,24 (d, J=2,15 Hz, 1H, H-3), 4,14-3,46 (m, 3H, H-4, 2xH-5), 1,98-1,55 (m, 16H, Cyclopentyliden-Protonen); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 121,23 (C-IOCOC-2), 109,24 (C-3OCOC-5), 105,08 (C-1), 84,49 (C-2), 74,25 (C-4), 71,83 (C-3), 61,50 (C-5), 39,52, 36,82, 36,19, 29,74, 24,09, 23,49, 22,80, 22,37 (Cyclopentyliden-Kohlenstoffe); MS (CI) m/e: 283(M+H⁺). Beispiel 30 1,2-O-Cyclopentyliden-D-xylofuranose (26)
Die 1,2-O-3,5-O-Dicyclopentyliden-D-xylofuranose (25) (1 mmol, 282 mg) wurde in Essigsäure-Wasser (2:1) (14 ml) bei Raumtemperatur gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden gerührt, gefolgt von TLC. Das Lösungsmittel wurde im Hochvakuum eingedampft und dreimal zusammen mit Methanol eingedampft und in vacuo über Nacht getrocknet, um 196 mg weißen Feststoff (91 %) zu ergeben. ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 5,94 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-1), 4,44 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-2), 4,32 (d, J=2,44 Hz, 1H, H-3), 4,18 (m, 1H, H-4), 4,10-4,02 (m, 2H, 2xH-5), 1,96-1,61 (m, 8H, Cyclopentyliden-Protonen); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 121,41 (OCO), 104,53 (C-1), 85,59 (C-2), 78,76 (C-3), 76,83 (C-4), 61,07(C-5), 36,84, 36,19 (CH₂CCH₂), 23,47, 22,80 (CH₂CH₂CCH₂CH₂); MS (CI): m/e 217(M+H⁺). Beispiel 31 1,2-O-Cyclopentyliden-5'-O-tosyl-D-xylofuranose (27)
Einer Lösung von 1,2-O-Cyclopentyliden-D-xylofuranose (26) (0,81 mmol, 176 mg) in trockenem Pyridin (6 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0 °C wurde p-Toluolsulfonylchlorid (1,12 Äq., 173 mg) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden bei 0 °C gerührt. Anschließend wurden 5 ml Wasser zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen, und das Lösungsmittel wurde im Hochvakuum eingedampft, und zweimal zusammen mit Toluol eingedampft. Das Gemisch wurde in Chloroform gelöst, dreimal mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels lieferte 259 mg (27) als weißen Feststoff (86 %). ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃) δ 7,80-7,32 (AA'BB', 4H, Ph), 5,84 (d, J=3,63 Hz, 1H, H-1), 4,44 (d, J=3,7 Hz, 1H, H-2), 4,42-4,29 (m, 3H, H-3, 2xH-5), 4,27-4,09 (m, 1H, H-4), 2,44 (s, 3H, CH₃), 1,89-1,61 (m, 8H, Cyclopentyliden-Protonen); ¹³C-NMR (270 MHz, CDCl₃) 145,34, 132,30, 130,06, 128,08 (aromatisch), 121,86 (OCO), 104,80 (C-1), 85,15 (C-2), 77,73 (C-3), 74,41 (C-4), 66,21 (C-5), 37,02, 36,44 (CH₂CCH₂), 23,54, 22,98 (CH₂CH₂CCH₂CH₂), 21,73 (CH₃); MS (CI): m/e 371 (M+H⁺). Beispiel 32 1,2-O-Dicyclopentyliden-5'-isopropylamin-D-xylofuranose (28)
Eine Lösung von 1,2-O-Cyclopentyliden-5'-tosyl-D-xylofuranose (27) (7,1 mmol, 2,64 g) in Isopropylamin (15 ml) wurde über Nacht bei 55 °C in einer Druckflasche gerührt. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt, und der verbleibende gelbe Sirup wurde mit Chloroform aufgenommen und mit einer gesättigten Lösung von Natriumbicarbonat und sodann mit Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet, das Lösungsmittel wurde eingedampft und der Rückstand über Kieselgel (Ethylacetat-3 % Triethylamin) chromatographiert, um 1,33 g (28) als weißen Feststoff (73 %) zu ergeben. Fp. 44-45 °C; [α]_D ²⁰=31,06 (C=2, CHCl₃);
¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8,0 (bs, NH) 5,90 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-1), 4,38 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-2), 4,27 (d, J=2,44 Hz, 1H, H-3), 4,20 (d, J=2,93 Hz, 1H, H-4), 3,36-2,92 (ABX, 2H, 2xH-5), 2,74-2,70 (Heptett, 1H, NCH), 1,95-1,63 (m, 8H, Cyclopentyliden-Protonen), 1,04-1,03 (dd, 6H, Me₂CH); ¹³C-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 121,06 (OCO), 104,82 (C-1) 86,14 (C-2), 78,30 (C-3), 77,07 (C-4), 48,64 (NCH), 45,90 (C-5), 36,85, 36,32 (CH₂CCH₂), 23,51, 22,84 (CH₂CH₂CCH₂CH₂), 22,64 (CH₃CHN), 22,34 (CH₃CHN); MS (CI): m/e 258 ([M+H⁺], 100 %); HRMS(EI) m/e berechnet für C₁₃H₂₃NO₄) [M⁺]: 257,16270, gefunden 257,1630. Beispiel 33 Chlorphosphoramidit (29)
In ein sehr sorgfältig getrocknetes NMR-Röhrchen wurden 9,6 μl (0,11 mmol) Phosphortrichlorid über eine Spritze und anschließend 0,25 ml CDCl₃ zugefügt. Das NMR-Röhrchen wurde auf 0 °C abgekühlt, und eine Lösung der 1,2-O-Dicyclopentyliden-5'-isopropylamino-D-xylofuranose 28 (25,7 mg, 0,1 mmol) und Triethylamin (27,8 μl, 0,22 mmol) in CDCl₃ (0,35 ml) wurden unter einer Stickstoffatmosphäre unter Schütteln des NMR-Röhrchens zugesetzt. Eine exotherme Reaktion wurde festgestellt. Anschließend wurde das NMR-Röhrchen auf –78 °C abgekühlt, evakuiert und luftdicht verschlossen. Das luftdicht verschlossene NMR-Röhrchen wurde auf 40 °C erwärmt, und die Reaktion wurde durch ³¹P-NMR verfolgt, bis im ³¹P-NMR-Spektrum ein einziger Peak festgestellt wurde. Das Produkt wurde nicht isoliert und direkt im folgenden Schritt weiter verwendet. ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 5,75 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-1), 4,51 (t, J=2,44 Hz, J=2,93 Hz, H-3), 4,37 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-2), 4,19-4,17 (m, 1H, H-4), 3,42-3,34 (Heptett, 1H, NCH) 3,33-3,00 (ABX, 2H, 2xH-5), 1,81-1,51 (m, 8H, Cyclopentyliden-Protonen), 1,05 (d, J=6,84 Hz, 6H, Me₂CH); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 121,48 (OCO), 104,26 (C-1), 83,86, 83,83 (d, J=3,66 Hz, C-2), 73,04, 72,99 (d, J=6,41 Hz, C-3), 72,35 (C-4), 50,42, 50,13 (d, J=35,72 Hz, C-5), 36,95, 36,91 (d, J=5,50 Hz, NCH), 36,62, 35,91(CH₂CCH₂), 23,22, 22,50 (CH₂CH₂CCH₂CH₂), 20,89, 20,79 (d, J=12,82 Hz, CH₃CHN), 19,64, 19,60 (d, J=5,50 Hz, CH₃CHN); ³¹P-NMR (202 MHz, CDCl₃) δ 148,42 Beispiel 34 5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-thymidin-3'-O-phosphoramidit (30)
Zu dem gleichen NMR-Röhrchen aus Beispiel 29 wurde langsam bei 0 °C eine Lösung von 5'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)-thymidin (35,6 mg, 0,1 mmol) in 0,45 ml CDCl₃ und Triethylamin (14 μl, 0,11 mmol) unter einer Stickstoffatmosphäre gegeben. Anschließend wurde das NMR-Röhrchen auf –78 °C abgekühlt, evakuiert und luftdicht verschlossen. Das verschlossene NMR-Röhrchen wurde auf 50 °C erhitzt, und die Reaktion wurde durch ³¹P-NMR verfolgt, bis ein einziger Peak, der einem neuen Produkt entsprach, in dem ³¹P-NMR-Spektrum festgestellt wurde. Die Lösung wurde in einen Kolben gegossen und mit Ethylacetat (vorgewaschen mit einer gesättigen Lösung von Natriumbicarbonat) aufgenommen und mit einer gesättigten Lösung von Natriumbicarbonat gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet, das Lösungsmittel wurde entfernt, um einen weißen Schaum in quantitativer Ausbeute zu liefern. Das Rohprodukt wurde über eine Kieselgelsäule flashchromatographiert (Hexan-Ethylacetat-Triethylamin =5:3:2). Fp. 68-70 °C; [α]_D ²⁰=62,9° (c=0,5, CHCl₃) ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,98 (bs, 1H, NH), 7,46 (d, J=1,00 Hz, 1H, H-6), 6,34-6,31 (dd, J=5,86 Hz, J=8,30 Hz, 1H, H-1'), 5,88 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-1''), 4,56-4,53 (m, 1H, H-3'), 4,41 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-2''), 4,35 (m, 1H, H-3''), 4,17 (d, J=1,95 Hz, 1H, H-4''), 4,05 (d, J=1,95 Hz, 1H, H-4'), 3,89-3,76 (ABX, 2H, 2xH-5'), 3,45-3,39 (m, 2H, H-5'', NCH), 3,03-2,99 (m, 1H, H-5''), 2,37-2,34 (m, 1H, H-2'), 2,09-2,05 (m, 1H, H-2'), 1,88 (d, J=1,47 Hz, 3H, MeC=C), 1,95-1,61 (m, 8H, Cyclopentyliden-Protonen), 1,11-1,00 (m, 6H, Me₂CH), 0,92 (s, 9H, t-BuSi), 0,09 (d, J=1,47 Hz, 6H, Me₂Si); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 163,77 (C-4), 150,35(C-2), 135,17 (C-6), 121,42 (OCO), 110,96 (C-5), 104,59 (C-1''), 86,38, 86,36 (d, J=2,75 Hz, C-4'), 84,76 (C-1'), 84,74 (C-2''), 73,78, 73,63(d, J=19,23 Hz, C-3'), 73,07, 73,05 (d, J=1,83, C-4''), 71,83, 71,80 (d, J=3,66 Hz, C-3''), 63,17(C-5'), 50,09, 49,80 (d, J=36,63 Hz, NCH), 40,27, 40,23 (d, J=4,58 Hz, C-2'), 36,89, 36,20 (CH₂CCH2), 36,11, 36,08 (d, J=3,21 Hz, C-5''), 25,91 (SiCMe₃), 23,44, 22,76 (CH₂CH₂CCH₂CH₂), 22,02, 21,95 (d, J=9,16 Hz, CH₃CHN), 21,69, 21,64 (d, J=6,41 Hz, CH₃CHN), 18,31 (SiCMe₃), 12,51 (CH₃C=C), –5,41, –5,48 (d, J=9,16 Hz, Me₂Si); ³¹P-NMR (81 MHz, CDCl₃) δ 130,14; MS (CI): m/e 642([M+H⁺], 78 %); EI m/e [M⁺] 641, HRMS(EI) m/e berechnet für C₂₈H₄₅N₃O₉PSi [M⁺-CH₃] 626,26625, gefunden 626,26670, und berechnet C₂₅H₃₉N₃O₉PSi [M⁺-C₄H₉]: 584,21930, gefunden 584,2190, HRMS FAB (Glycerin) m/e berechnet für C₂₉H₄₉N₃O₉PSi [MH⁺] 642, 2975; gefunden 642,2973. Beispiel 35 Geschütztes Phosphorothioatdinucleotid (34)
In einem trockenen NMR-Röhrchen wurden Phosphoramidit 30 (15 mg, 0,0234 mmol), 3'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)thymidin (10 mg, 1,2 Äq.) und 4,5- Dicyano-2-bromimidazol 21 (9,17 mg, 2,0 Äq.) vorgelegt. Dann wurde das NMR-Röhrchen in vacuo über Nacht getrocknet. In das NMR-Röhrchen wurde unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0 °C trockenes Acetonitril (0,6 ml) injiziert. Der Feststoff löste sich sofort auf. Die Reaktion wurde auf Raumtemperatur gebracht und durch ³¹P-NMR verfolgt. Innerhalb von 5 Minunten verschwand der dem Phosphoramidit entsprechende Peak, und zwei neue Peaks (143,76 ppm, 142,55 ppm=6:1) wurden gebildet. Das reine ³¹P-NMR-Spektrum legte die Verwendung dieses Produkts direkt bei der folgenden Sulfurierung ohne Isolierung nahe. Dieser Lösung wurde Beaucage-Reagens (5,6 mg, 1,2 Äq.) in 140 μl Acetonitril (0,2M) zugesetzt. Sofort zeigte das ³¹P-NMR zwei weitere Peaks (68,43 ppm, 68,23 ppm=1:6), während die dem Ausgangsmaterial entsprechenden Peaks verschwanden. Die Lösung in dem NMR-Röhrchen wurde in einen Kolben übergeführt. Anschließend wurde das Gemisch wieder in Ethylacetat aufgelöst, mit gesättigtem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels ergab 22 mg eines weißen Feststoffs 34 (91 %). Das Produkt wurde anschließend durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule (Ethylacetat:Methanol=95:5) gereinigt. ¹H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δ 7,45(s, 1H, ³H-6), 7,42 (s, 1H, ⁵H-6), 6,19-6,15 (m, 2H, ⁵H-1', ³H-1'), 5,86, 5,85 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-1''), 5,05-5,04 (m, 1H, ⁵H-3'), 4,78-4,77(m, 1H, H-3''), 4,60, 4,59 (d, J=3,42 Hz, 1H, H-2''), 4,38-4,36 (m, 1H, H-4''), 4,26-4,13 (m, 4H, ³H-3', 2x³H-5', ⁵H-4'), 3,93, 3,91 (m, 1H, ³H-4'), 3,81-3,73 (m, 2H, 2x⁵H-5'), 2,66-2,52 (m, 3H, NCH, 2xH-5''), 2,43-2,40 (m, 1H, ⁵H-2'), 2,31-2,22 (m, 2H, 2x³H-2'), 2,09-2,07(m, 1H, ⁵H-2'), 1,78 (s, 3H, ³CH₃C=C), 1,76 (s, 3H, ⁵CH₃C=C), 1,62-1,56 (m, 8H, Cyclopentyliden-Protonen), 0,94-0,89 (m, 6H, Me₂CHN), 0,86 (s, 9H, ³t-BuSi), 0,85 (s, 9H, 5t-BuSi), 0,069 (s, 6H, Me₂Si), 0,065 (s, 6H, Me₂Si); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 163,97, 163,66 (⁵C-4, ³C-4), 150,39, 150,04 (⁵C-2, ³C-2), 135,58, 134,49 (⁵C-6, ³C-6), 121,77 (OCO), 111,26, 111,04 (⁵C-5, ³C-5), 104,00 (C-1''), 85,59, 85,56 (d, J=6,41 Hz, ⁵C-4'), 85,48 (³C-1'), 84,69 84,61, 84,39 (⁵C-1', ³C-4'), 83,47 (C-2''), 80,85, 80,64 (d, C-3''), 80,69, 80,66 (d, ⁵C-3'), 79,03, 78,97 (d, ³C-3'), 71,49 (C-4''), 67,66, 67,52 (d, J=4,58 Hz, ³C-5'), 63,47 (⁵C-5'), 48,93 (NCH), 45,23 (C-5''), 40,37 (³C-2'), 39,14, 39,09 (d, J=6,41 Hz, ⁵C-2'), 37,06, 36,16 (CH₂CCH₂), 25,88, 25,60 (⁵SiCMe₃, ³SiCMe₃), 23,52, 22,85 (CH₂CH₂CCH₂CH₂), 22,65, 22,39 (NCHMe₂), 18,28, 17,81 (⁵SiCMe₃, ³SiCMe₃), 12,51, 12,46 (⁵C=CCH₃, ³C=CCH₃), –4,66, –4,83, –5,40, –5,46 (⁵SiMe₂, ³SiMe₂); ³¹P-NMR (202 MHz, CDCl₃) δ 68,43, 68,23 (1:6) MS (FAB): m/e 1030 (M+H⁺).
(II). 4,5-Dicyano-2-bromimidazol 21 (7,6 mg, 2,5 Äq.), Phosphoramidit 30 (10 mg, 0,0156 mmol) und 3'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)thymidin (6,7 mg, 1,2 Äq.) wurden einem trockenen NMR-Röhrchen zugesetzt. Das NMR-Röhrchen wurde über Nacht unter Vakuum getrocknet, und trocknes CDCl₃ (0,5 ml) wurde bei 0 °C unter einer Ar-atmosphäre in das NMR-Röhrchen injiziert. Die Reaktion wurde durch ³¹P-NMR verfolgt, bis die Umsetzung vollständig abgelaufen war. Das ³¹P-NMR-Spektrum zeigte, dass der dem Phosphoramidit bei 130 ppm entsprechende Peak verschwunden war und dass zwei neue Peaks bei 142,634, 141,880 ppm in einem Verhältnis von 40:1 auftauchten. MS(FAB) [M+H+]: berechnet für C₄₅H₇₆N₅PO₁₄Si₂ Phosphittriester 998, gefunden 998,4.
Beaucage-Reagens (3,8 mg, 1,2 Äq.) wurde der Lösung direkt zugesetzt. Das ³¹P-NMR (202 MHz, CDCl₃, 0 °C) zeigte sofort zwei weitere Peaks bei 67,831 und 67,514 ppm im gleichen Verhältnis, während die Peaks, die dem Phosphittriester entsprachen, verschwanden. Die Lösung in dem NMR-Röhrchen wurde in einen Kolben übergeführt, das Lösungsmittel wurde eingedampft, und das Produkt wurde sodann durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule (Ethylacetat:Hexan:Triethylamin=60:35:5) unter Erhalt nur des einen Isomeren gereinigt. ³¹P-NMR (202 MHz, CDCl₃, Raumtemperatur) δ 68,291.
(III). Praktisch identische Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Umsetzung bei –15 °C 7 Stunden in CDCl₃ durchgeführt wurde, außer dass das Verhältnis der Isomeren ca. 68:1 betrug. MS FAB (Nitrobenzylalkohol): m/e [MH⁺] 1030 HRMS FAB CsI m/e berechnete für C₄₅N₇₇N₅O₁₄PSSi₂ [MH⁺], 1030,4464; gefunden 1030,4460. Beispiel 36 Phosphorothioatdinucleotid (35)
Geschütztes Phosphorothioatdinucleotid 34 (14 mg, 0,0136 mmol) aus Beispiel 35 wurde in 1 ml 70 % TFA-H₂O bei 0 °C unter Rühren gelöst, und anschließend wurde die Reaktion bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde durch TLC verfolgt, bis der dem Ausgangsmaterial entsprechende Fleck verschwunden war. Das Eindampfen des Lösungsmittels und das dreimalige Eindampfen zusammen mit Methanol lieferten einen weißen Feststoff. Das Rohprodukt wurde über eine präparative TLC-Platte (0,5 mm) (CH₂Cl₂:MeOH=5:1) gereinigt, um 7,2 mg eines weißen Feststoffs (35) (94 %) zu ergeben.
¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) δ 7,87 (s, 1H, ³H-6), 7,85 (s, 1H, ⁵H-6), 6,36-6,33 (dd, J=6,35 Hz, J=7,81 Hz, 1H, ⁵H-1'), 6,30-6,27 (dd, J=6,35 Hz, J=7,33 Hz ³H-1'), 5,06-5,03 (m, 1H, ⁵H-3') 4,53-5,52 (m, 1H, ³H-3'), 4,21-4,06 (m, 4H, ⁵H-4', 2x³H-5', ³H-4'), 3,84-3,80 (m, 2H, 2x⁵H-5'), 2,50-2,46 (m, 1H, ⁵H-2'), 2,31-2,24 (m, 2H, 2x³H-2'), 2,21-2,17 (m, 1H, ⁵H-2'), 1,96 (s, 3H, ³CH₃C=C), 1,87 (s, 3H, ⁵CH₃C=C); ³¹P-NMR (202 MHz, CD₃OD) δ 58,64:58,57 (6:1) MS (FAB): m/e 563 (M+H⁺). Beispiel 37 1,2-O-3,5-O-Dicyclopentyliden-L-xylofuranose (36)
Einer Lösung von Trimethylorthoformiat (68 mmol, 7,5 ml) und p-Toluolsulfonsäure (2 mmol, 380 mg) in Dioxan (45 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0 °C wurde Cyclopentanon (500 mmol, 45 ml) zugetropft. Diese Lösung wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, und L-Xylose (20 mmol, 3,0 g) wurde unter fortgesetztem Rühren über Nacht zugesetzt. Anschließend wurde das Reaktionsgemisch mit Triethylamin neutralisiert. Das Eindampfen des Lösungsmittels lieferte einen gelben sirupösen Rückstand. Eine Lösung des sirupösen Rückstands in Chloroform (50 ml) wurde mit Wasser (50 ml) gewaschen. Die wässrige Schicht wurde mit Chloroform (3x20 ml) extrahiert, und die vereinigten Chloroformschichten wurden über (MgSO₄) getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde das Gemisch über eine Kieselgelsäule (Hexan:Ethylacetat=5:1) chromatographiert, um 3,5 g weißen Feststoff 36 (62 %) zu ergeben. ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 5,96 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-1), 4,42 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-2), 4,21 (d, J=1,95 Hz, 1H, H-3), 4,09-3,98 (m, 3H, H-4, 2xH-5), 1,97-1,57 (m, 16H, Cyclopentyliden-Protonen); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 121,20 (C-1OCOC-2), 109,20 (C-3OCOC-5), 105,05 (C-1), 84,46 (C-2), 74,22 (C-4), 71,80 (C-3), 61,47 (C-5), 39,49, 36,80, 36,16, 29,71, 24,07, 23,47, 22,77, 22,34 (Cyclopentyliden-Kohlenstoffe); MS (CI) m/e: 283 (M+H⁺). Beispiel 38 1,2-O-Cyclopentyliden-L-xylofuranose (37)
1,2-O-3,5-O-Dicyclopentyliden-L-xylofuranose (36) (10 mmol, 2,82 g) wurde bei Raumtemperatur in Essigsäure-Wasser (2:1) (60 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 7 Stunden gerührt. Die Reaktion wurde durch TLC verfolgt. Das Lösungsmittel wurde im Hochvakuum eingedampft, dreimal zusammen mit Methanol eingedampft und in vacuo über Nacht getrocknet, um 2,16 g weißen Feststoff 37 (100 %) zu ergeben. ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 5,92 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-1), 4,42 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-2), 4,30 (d, J=2,93 Hz, 1H, H-3), 4,17-4,14 (m, 1H, H-4), 4,07-3,97 (m, 2H, 2xH-5), 1,96-1,60 (m, 8H, Cyclopentyliden-Protonen); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 121,42 (OCO), 104,52 (C-1), 85,56 (C-2), 78,81 (C-3), 76,77 (C-4), 61,01 (C-5), 36,84, 36,19 (CH₂CCH₂), 23,47, 22,79 (CH₂CH₂CCH₂CH₂); MS (CI): m/e 217(M+H⁺). Beispiel 39 1,2-O-Cyclopentyliden-5'-O-tosyl-L-xylofuranose (38)
Einer Lösung von 1,2-O-Cyclopentyliden-L-xylofuranose (37) (9,4 mmol, 2,03 g) in trockenem Pyridin (25 ml) unter einer Stickstoffatmosphäre bei 0 °C wurde p-Toluolsulfonylchlorid (1,2 Äq., 2,15 g) zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 12 Stunden bei 0°C gerührt. Anschließend wurden 10 ml Wasser zugesetzt, um die Reaktion zu stoppen, und das Lösungsmittel wurde unter Hochvakuum und zweimal zusammen mit Toluol eingedampft. Das Gemisch wurde in Chloroform gelöst, dreimal mit Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Die Entfernung des Lösungsmittels lieferte 2,96 g von 38 als weißen Feststoff (85 %). ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,78-7,32 (AA'BB', 4H, Ph), 5,83 (d, J=3,42 Hz, 1H, H-1), 4,42 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-2), 4,42-4,24 (m, 3H, H-3, 2xH-5), 4,16-4,08 (m, 1H, H-4), 2,42 (s, 3H, CH₃), 1,90-1,63 (m, 8H, Cyclopentyliden-Protonen); ¹³C-NMR (270 MHz, CDCl₃) δ 145,25, 130,26, 130,09, 130,01, 129,96 (aromatisch), 121,71 (OCO), 104,69 (C-1), 85,04 (C-2), 77,67 (C-4), 74,25 (C-3), 66,39 (C-5), 36,89, 36,30 (CH₂CCH₂), 23,42, 22,85 (CH₂CH₂CCH₂CH₂), 21,63 (CH₃); MS (CI): m/e 371 (M+H⁺). Beispiel 40 1,2-O-Dicyclopentyliden-5'-isopropylamin-L-xylofuranose (39)
Eine Lösung von 1,2-O-Cyclopentyliden-5'-tosyl-L-xylofuranose (38) (7,0 mmol, 2,6 g) in Isopropylamin (15 ml) wurde über Nacht in einer Druckflasche bei 55 °C gerührt. Das Lösungsmittel wurde am Rotationsverdampfer entfernt, und der zurückbleibende gelbe Sirup wurde mit Chloroform aufgenommen und mit einer gesättigten Lösung von Natriumbicarbonat und mit Salzlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet, das Lösungsmittel wurde eingedampft und der Rückstand über Kieselgel (Ethylacetat-3 % Triethylamin) flashchromatographiert, um 1,30 g weißen Feststoff 39 (72 %) zu liefern. Fp. 39-41 °C; [α]_D ²⁰=–31,37 (c=2, CHCl₃); ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8,0 (bs, NH), 5,88 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-1), 4,37 (d, J=3,91 Hz, 1H, H-2), 4,25 (d, J=2,93 Hz, 1H, H-3), 4,19 (m, 1H, H-4), 3,34-2,91 (ABX, 2H, 2xH-5), 2,73- 2,71 (Heptett, 1H, NCH), 1,92-1,61 (m, 8H, Cyclopentyliden-Protonen), 1,03-1,01 (dd, J=2,44 Hz, J=6,35 Hz, 6H, Me₂CH); ¹³C-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 121,00 (OCO), 104,75 (C-1), 86,06 (C-2), 78,20 (C-3), 77,00 (C-4), 48,62 (NCH), 45,82 (C-5), 36,78, 36,25 (CH₂CCH₂), 23,46, 22,78 (CH₂CH₂CCH₂CH₂), 22,57 (CH₃CHN), 22,27 (CH₃CHN); MS (CI): m/e 258 ([M+H⁺]; 100 %); HRMS(EI) m/e berechnet für C₁₃H₂₃NO₄ [M⁺]: 257, 16270, gefunden 257, 16250. Beispiel 41 Chlorphosphoramidit (40)
In ein sorgfältig getrocknetes NMR-Röhrchen wurden 9,6 μl (0,11 mmol) Phosphortrichlorid über eine Spritze zugesetzt, ebenso wurden anschließend 0,25 ml CDCl₃ zugesetzt. Dieses NMR-Röhrchen wurde auf 0°C abgekühlt, und eine Lösung der 1,2-O-Dicyclopentyliden-5'-isopropylamin-L-xylofuranose (17) (25,7 mg, 0,1 mmol) und Triethylamin (27,8 μl, 0,22 mmol) in CDCl₃ (0,35 ml) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre unter Schütteln des NMR-Röhrchens zugesetzt. Es wurde eine exotherme Reaktion festgestellt. Das NMR-Röhrchen wurde anschließend auf –78 °C abgekühlt, evakuiert und luftdicht verschlossen. Das luftdicht verschlossene NMR-Röhrchen wurde auf 40 °C erwärmt, und die Reaktion durch ³¹P-NMR verfolgt, bis in dem ³¹P-NMR-Spektrum ein einziger Peak festgestellt wurde. Das Produkt wurde nicht isoliert und direkt im folgenden Schritt verwendet. ³¹P-NMR (300 MHz, CDCl₃) δ 148,75. Beispiel 42 5'-O-(tert-Butyl-dimethylsilyl)-thymidin-3'-O-phosphoramidit (41)
Dem gleichen NMR-Röhrchen des vorhergehenden Beispiels 41 wurde eine Lösung von 5'-O-(tert-Butyl-dimethylsilyl)-thymidin (35,6 mg, 0,1 mmol) in 0,45 ml CDCl₃ und Triethylamin (14 μl, 0,11 mmol) langsam bei 0 °C unter einer Stickstoffatmosphäre zugesetzt. Anschließend wurde das NMR-Röhrchen auf –78 °C abgekühlt, evakuiert und lufdicht verschlossen. Das luftdicht verschlossene NMR-Röhrchen wurde auf 50 °C erhitzt, und die Reaktion wurde durch ³¹P-NMR verfolgt, bis ein einziger Peak, der einem neuen Produkt entsprach, in dem ³¹P-NMR-Spektrum festgestellt wurde. Die Lösung wurde in einen Kolben gegossen und mit Ethylacetat (zuvor mit einer gesättigten Lösung von Natriumbicarbonat gewaschen) aufgenommen und mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel entfernt, um einen weißen Schaum in quantitativer Ausbeute zu liefern. Das Rohprodukt wurde über eine Kieselgelsäule (Hexan-Ethylacetat-Triethylamin=5:3:2) chromatographiert, um weiße Kristalle (41) zu liefern. Fp. 99-101 °C; [α]_D ²⁰ –72,0 ° (c=0,5, CHCl₃) ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 8,77 (bs, 1H, NH), 7,46 (s, 1H, H-6), 6,33-6,30 (dd, J=5,86 Hz, J=7,81 Hz, 1H, H-1'), 5,88(d, J=3,91 Hz, 1H, H-1''), 4,56-4,53 (m, 1H, H-3'), 4,43 (d, J=3,42 Hz, 1H, H-2''), 4,35 (m, 1H, H-3''), 4,18 (d, J=1,95 Hz, 1H, H-4''), 4,05 (m, 1H, H-4'), 3,90-3,76 (ABX, 2H, 2xH-5'), 3,45-3,42 (m, 2H, H-5'', NCH), 3,03-2,99 (m, 1H, H-5''), 2,38-2,35 (m, 1H, H-2'), 2,12-2,06 (m, 1H, H-2'), 1,89(s, 3H, MeC=C), 1,96-1,62 (m, 8H, Cyclopentyliden-Protonen), 1,11-1,08 (m, 6H, Me₂CH), 0,90 (s, 9H, t-BuSi), 0,09, (d, J=1,95 Hz, 6H, Me₂Si); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 163,74 (C-4), 150,31 (C-2), 135,18 (C-6), 121,44 (OCO), 110,93 (C-5), 104,59 (C-1''), 86,61, 86,57 (d, J=5,49Hz, C-4'), 84,75, 84,73 (d, J=2,75 Hz, C-1'), 84,70 (C-2''), 73,07, 73,05 (d, J=1,83 Hz, C-3'), 73,03, 72,89 (d, J=17,4, C-4''), 71,82, 71,78 (d, J=4,58 Hz, C-3''), 62,98 (C-5'), 50,05, 49,76 (d, J=36,63 Hz, NCH), 39,94, 39,92 (d, J=2,75 Hz, C-2'), 36,86, 36,19 (CH₂CCH₂), 36,11, 36,08 (d, J=3,06 Hz, C-5''), 25,92 (SiCMe₃), 23,45, 22,76 (CH₂CH₂CCH₂CH₂), 21,99, 21,91 (d, J=9,16 Hz, CH₃CHN), 21,69, 21,64 (d, J=6,41 Hz, CH₃CHN), 18,35 (SiCMe₃), 12,52 (CH3C=C), –5,39, –5,45 (d, J=9,16 Hz, Me₂Si); ³¹P-NMR (81 MHz, CDCl₃) δ 129,34; MS (CI): m/e 642 (M+H⁺). EI: m/e 641 [M+], MS FAB (Nitrobenzylalkohol): m/e [MH⁺] 642, HRMS FAB (Glycerin) m/e berechnet für C₂₉H₄₉N₃O₉ PSi [MH⁺] 642,2975; gefunden 642,2973. Beispiel 43 Geschütztes Phosphorothioatdinucleotid (42)

I: In ein trockenes NMR-Röhrchen wurden Phosophoramidit 41 (15 mg, 0,0234 mmol), 3'-O-(tert-Butyldimethylsilyl)thymidin (10 mg, 1,2 Äq.) und 4,5-Dicyano-2-bromimidazol 21 (9,17 mg, 2,0 Äq.) zugesetzt. Das NMR-Röhrchen wurde über Nacht im Vakuum getrocknet. Trockenes Acetonitril (0,6 ml) wurde unter einer Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur in das NMR-Röhrchen injiziert. Der Feststoff löste sich sofort. Die Reaktion wurde durch ³¹P-NMR verfolgt. Innerhalb von 5 Minuten verschwand der dem Phosphoramidit entsprechende Peak. Dieser Lösung wurde Beaucage-Reagens (5,6 mg, 1,2 Äq.) in 140 μl Acetonitril (0,2 M) zugesetzt. Die dem Ausgangsmaterial entsprechenden Peaks verschwanden. Die Lösung in dem NMR-Röhrchen wurde in einen Kolben übergeführt und das Lösungsmittel eingedampft. Anschließend wurde das Gemisch wieder in Ethylacetat aufgenommen, mit gesättigtem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen und über MgSO₄ getrocknet. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde das Produkt durch Chromatographie über eine Kieselgelsäule (Ethylacetat:Methanol=95:5) gereinigt, um 42 in einem diastereomeren Verhältnis von 7:1 (69,12, 68,91 ppm) zu liefern. ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7,46 (s, 1H, ³H-6), 7,27 (s, 1H, ⁵H-6), 6,34-6,10 (m, 2H, ⁵H-1', ³H-1'), 5,86, 5,87 (d, J=3,42Hz, 1H, H-1''), 5,17-5,14 (m, 1H, ⁵H-3'), 4,83-4,81 (d, J=10,25 Hz, 1H, H-3''), 4,56, 4,55(d, J=3,91 Hz, 1H, H-2''), 4,38 (m, 2H, ³H-3', H-4''), 4,25-4,21 (m, 3H, 2x³H-5', ⁵H-4'), 3,98 (m, 1H, ³H-4'), 3,91-3,85(m, 2H, 2x⁵H-5'), 2,85, 2,84 (d, J=6,35 Hz, 1H, 2xH-5''), 2,81 (m, 1H, NCH), 2,52-2,47 (dd, 2H, ⁵H-2'), 2,25-2,23 (m, 2H, 2x³H-2'), 2,08-2,02 (m, 1H, ⁵H-2'), 1,91 (s, 3H, ⁵CH₃C=C), 1,89 (s, 3H, ³CH₃C=C), 1,92-1,65(m, 8H, Cyclopentyliden-Protonen), 1,05, 1,04 (d, J=5,86 Hz, 6H, Me₂CHN), 0,90 (s, 9H, ³t-BuSi), 0,86 (s, 9H, ⁵t-BuSi), 0,11 (s, 6H, Me₂Si), 0,05 (s, 6H, Me₂Si); ¹³C-NMR (125 MHz, CDCl₃) δ 163,80, 163,59 (⁵C-4, ³C-4), 150,33, 150,15 (⁵C-2, ³C-2), 136,13, 134,64 (⁵C-6, ³C-6), 122,03 (OCO), 111,43, 111,11 (⁵C-5, ³C-5), 104,28 (C-1''), 86,29 (³C-1'), 85,95, 85,90 (d, J=6,41 Hz, ⁵C-4'), 84,80 84,72, 84,69 (⁵C-1', ³C-4'), 83,59 (C-2''), 80,85, 80,81 (d, J=4,58 Hz, C-3''), 80,69, 80,66 (d, J=4,58 Hz, ⁵C-3'), 79,03, 78,97 (d, J=8,24 Hz, ³C-3'), 71,30 (C-4''), 67,38, 67,34 (d, J=5,50 Hz, ³C-5'), 63,37 (⁵C-5'), 48,91 (NCH), 45,18 (C-5''), 40,35 (³C-2'), 39,12, 39,09 (d, J=3,66 Hz, ⁵C-2'), 37,14, 36,23 (CH₂CCH₂), 25,88, 25,65 (⁵SiCMe₃, ³SiCMe₃), 23,55, 22,89 (CH₂CH₂CCH₂CH₂), 22,80, 22,55 (NCHMe₂), 18,28, 17,86 (⁵SiCMe₃, ³SiCMe₃), 12,52, 12,49 (⁵C=CCH₃, ³C=CCH₃), –4,66, –4,83, –5,40, –5,46 (⁵SiMe₂, ³SiMe₂); ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 69,12, 68,91 (7:1); MS (FAB): m/e (M+H⁺).

Das geschützte, aus Beispiel 43-I erhaltene Phosphorothioatdinucleotid 42 (15mg, 0,014 mmol) wurde bei 0 °C unter Rühren in 1 ml 70 % TFA-H₂O gelöst, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur ablaufen gelassen. Die Reaktion wurde durch TLC verfolgt, bis der dem Ausgangsmaterial entsprechende Fleck verschwand. Eindampfen des Lösungsmittels und dreimaliges Eindampfen zusammen mit Methanol lieferte einen weißen Feststoff. Das Rohprodukt wurde auf einer präparativen TLC-Platte (0,5 mm) (CH₂Cl₂:MeOH=5:1) gereinigt, um 43 als weißen Feststoff zu ergeben. ¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) δ 7,91 (s, 1H, ³H-6), 7,86 (s, 1H, ⁵H-6), 6,36-6,33 (dd, J=6,35 Hz, J=7,81 Hz, 1H, ⁵H-1'), 6,29-6,26 (dd, J=5,86 Hz, J=7,81 Hz, ³H-1'), 5,08-5,05 (m, 1H, ⁵H3') 4,52-5,51 (m, 1H, ³H-3'), 4,21 (m, 1H, ⁵H-4'), 4,14-4,11(m, 2H, 2x³H-5'), 4,04 (m, 1H, ³H-4'), 3,86-3,79 (m, 2H, 2x⁵H-5'), 2,48-2,44 (m, 1H, ³H-2'), 2,31-2,24 (m, 2H, 2x⁵H-2'), 2,23-2,16 (m, 1H, ³H-2'), 1,97 (s, 3H, ³CH₃C=C), 1,87 (s, 3H, ⁵CH₃C=C); ³¹P-NMR (121 MHz, CDCl₃) δ 59,14:59,08 (1:7); MS (FAB): m/e (M+H⁺). Beispiel 45 Synthese von γ-Aminoalkohol 44 (Schema 1)
Schema 1
Die Synthese von Aminoalkohol 44 ist in Schema 1 nachstehend gezeigt: Ausgehend von dem L-Mannon-γ-lacton 51 werden beide Diole durch Umwandlung in ihre Acetonide nach Standardverfahren unter Verwendung von Aceton mit para-Toluolsulfonsäure als Katalysator geschützt, um das Bisacetonidlacton 52 zu ergeben.
Anschließend wird das Bisacetonid in Gegenwart von Samariumiodid in einem Gemisch von THF und Ethylenchloridglycol bei Raumtemperatur nach dem von Christian Girard, Dissertation, Universität von Montreal, 1995, beschriebenen Verfahren umgesetzt. Diese Umsetzung läuft in hoher Ausbeute und hoher Regioselektivität ab und beeinflusst das Acetonid an der α-Position zu dem Ester und ergibt β-Hydroxyester 53.
Der nächste Schritt ist eine klassische säurekatalysierte Entschützung des Acetonids, um das Triolprodukt 54 zu ergeben. Anschließend wird die Diolfunktion des Triol durch Natriumperiodat auf Aluminiumoxid in Methanol gespalten. Das intermediäre Aldehyd erfährt eine reduktive Aminierung in Gegenwart von Isopropylamin und Natriumcyanoborhydrid, um den γ-Aminoalkohol 55 zu ergeben, der als Hydrochloridsalz isoliert und stabilisiert wird. Siehe Robert Hambalek, Dissertation, McGill University, 1992.
Der γ-Aminoalkohol 55 wird anschließend als chiraler Vorläufer für die stereokontrollierte Synthese eines P-chiralen Phosphorothioatdimers eingesetzt, das durch basenkatalysierte β-Eliminierung entschützt werden kann. Ein Beispiel dieses Typs von Eliminierung wird bei Takahata et al., J. Org. Chem. 1995, 60, 5628-5633, gefunden.
Herstellung von Indol-enthaltenden chiralen Hilfsverbindungen
Beispiel 46
Herstellung von (S)-I-(Indol-2-yl)-propan-2-ol
(S)-1-(Indol-2-yl)-propan-2-ol wurde nach dem folgenden Schema hergestellt:

i) a. SOCl₂, CCl₄, 60 °C, b. NaIO₄, RuCl₃·3H₂O, CH₃CN/H₂O, 25 °C, 98 %.
ii) 1-Phenylsulfonylindol, n-BuLi, –78 °C –25 °C, über Nacht, dann Zugabe von 20 % H₂SO₄ und 3 Stunden Rühren, 87 %.
iii) KOH, CH₃OH/H₂O (3:1), Rückfluss, 100 %.

Einer Lösung von Indol (2,4 g, 20mol) in trockenem THF (20 ml) unter Ar bei –78 °C wurde über eine Spritze während 10 Minuten n-Butyllithium (1,6M in Hexanen; 14 ml) zugetropft. Das Kühlbad wurde entfernt, und die Lösung wurde 1 Stunde unter Aufwärmen auf 0 °C gerührt. Das resultierende Indolanion fiel als sehr feiner weißer Feststoff in einer trüben farblosen Lösung aus. Nach dem Wiederabkühlen der Suspension auf –78 °C wurde über eine Spritze während 20 Minuten Benzolsulfonylchlorid (2,8 ml, 22 mmol) zugesetzt, wobei die Temperatur unter –60°C gehalten wurde. Das resultierende farblose Gemisch wurde langsam auf Raumtemperatur über Nacht aufwärmen gelassen, in 2 % wässriges Natriumbicarbonat (30 ml) gegossen und mit Ethylacetat (2x25 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 2 % wässrigem Natriumbicarbonat (30 ml) und Wasser (2,25 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Erhalt eines hellen bernsteinfarbenen Öls eingedampft, welches beim Verreiben mit 2:1 Hexan:Ether (15 ml) kristallisierte. Nach Stehen in der Kälte (–20 °C) für mehrere Stunden wurde das Produkt durch Filtration gesammelt, mit Hexan gewaschen und im Vakuum getrocknet, um reines 1-Phenylsulfonylindol (60) als weiße Kristalle (4,8 g, 90,6 %) bereitzustellen.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): δ 7,16-7,98 (m, 9H, C₆H₅, C₆H₄), 7,63 (d, ³J=3,7, 1H, NCH), 6,71 (d, ³J=3,7, 1H, NCHCH), ¹³C-NMR (67,9 MHz, CDCl₃): δ 138,3, 134,9, 133,8, 130,8, 129,3, 126,8, 126,3, 124,7, 123,4, 121,5, 113,6, 109,3. Fp. 73,0-73,5 °C. Beispiel 46B Cyclisches (S)-1,2-Propandiolsulfat (61)
Ein mit Rückflusskühler und CaCl₂-Trockenrohr darauf ausgestatteter 100-ml-Zweihalsrundkolben, der an eine HCl-Falle angeschlossen war und mit einem Gummiseptum, wurde mit (S)-1,2-Propandiol (2,3 g, 40 mmol) und CCl₄ (20 ml) beschickt. Dem Kolben wurde Thionylchlorid (4 ml, 54,8 mmol) über eine Spritze zugesetzt, und die resultierende Lösung wurde 30 Minuten unter Rückfluss erhitzt. Anschließend wurde die Lösung mit einem Eis-Wasser-Bad abgekühlt und mit CH₃CN (20 ml) verdünnt. RuCl₃·3H₂O (7,8 mg, 0,03 mmol) und NaIO₄ (12 g, 56 mmol) und anschließend Wasser (40 ml) wurden zugesetzt. Das resultierende Gemisch wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das Gemisch mit Ethylacetat (150 ml) verdünnt, und die beiden Phasen wurden getrennt. Die organische Schicht wurde mit Wasser (30 ml), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (2x20 ml) und Salzlösung (20 ml) gewaschen. Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wurde die Lösung über ein kleines Silicagelkissen filtriert, um die braune Farbe zu beseitigen. Anschließend wurde das Filtrat konzentriert, um cyclisches (S)-1,2-Propandiolsulfat (61) als farblose Flüssigkeit (4,0 g, 98 %) zu liefern. ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): δ 5,10 (ddq, ³J_CH2-H=8,2 Hz, 6,0 Hz, ³J_CH3-H=6,2 Hz, 1H, CH), 4,72 (dd, ²J=8,7 Hz, ³J=6,0 Hz, 1H, CHH'), 4,28 (dd, ²J=8,7 Hz, ³J=8,2 Hz, 1H, CHH'), 1,55 (d, 3J=6,2 Hz, 3H, CH₃). ¹³C-NMR (67,9 MHz, CDCl₃): δ 80,0, 74,3, 17,7. Beispiel 46C (S)-2-Indolylisopropanol (62)
Einer Lösung von 1-Phenylsulfonyl-indol (2,57 g, 10 mmol) in trockenem THF (30 ml) unter Ar bei –78 °C wurde über eine Spritze während 10 Minuten eine Lösung von 1,6 M Butyllithium (6,25 ml, 10 mmol) zugetropft. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden unter –70 °C gerührt und sodann langsam während 1 Stunde auf 5 °C aufwärmen gelassen. Die Lösung wurde auf –78 °C abgekühlt und sodann über eine Spritze mit einer Lösung von cyclischem (S)-1,2-Propandiolsulfat (1,5 g, 10,8 mmol) in trockenem THF (10 ml) behandelt. Das Gemisch wurde langsam auf Raumtemperatur über Nacht aufwärmen gelassen, in 20 % Schwefelsäure (100 ml) gegossen und 3 Stunden gerührt. Die Lösung wurde mit Ethylacetat (3x50 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit H₂O (2x100 ml), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (2x100 ml) und Salzlösung (2x100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer eingedampft, um ein helles bernsteinfarbenes Öl zu ergeben. Das Öl wurde in Ether:Hexan (1:1) kristallisiert, um (S)-1-Phenylsulfonyl-2-indolylisopropanol als weiße Kristalle (2,85 g, 90 %) zu ergeben. ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): δ 7,17-8,16 (m, 9H, C₆H₅, C₆H₄), 6,51 (d, ⁴J=0,76, 1H, NCCH), 4,26 (m, 1H, CHO), 3,25, 3,01 (m, 2H, CHH'), 1,91 (s, br, 1H, OH), 1,30 (d, ³J=6,2 Hz, 3H, CH₃), ¹³C-NMR (67,9 MHz, CDCl₃): δ 138,8, 138,5, 137,4, 133,8, 129,7, 129,3, 126,3, 124,4, 123,9, 120,5, 115,1, 111,6, 67,2, 39,1, 23,1. Fp,: 88-89 °C.
Die Abspaltung der Phenylsulfonyl-Schutzgruppe wurde durch Kaliumhydroxid erreicht. 2,85 g (S)-1-Phenylsulfonyl-2-indolylisopropanol wurden in 50 ml Methanol/Wasser (3:1), enthaltend 1,5 g KOH, gelöst. Die Lösung wurde 5 Stunden unter Rückfluss erhitzt und mit Ethylacetat (2x50 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit H₂O (2x100 ml) und Salzlösung (2x100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um reines (S)-2-Indolylisopropanol (1,65 g, 95 %) als helles bernsteinfarbenes Öl zu ergeben. ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): δ 8,51 (s, 1H, NH), 7,58-7,05 (m, 4H, C₆H₄), 6,28 (m, 1H, NCCH), 4,10 (m, 1H, CHO), 2,93, 2,76 (m, 2H, CHH'), 2,06 (s, br, 1H, OH), 1,25 (d, ³J=6,2 Hz, 3H, CH₃). ¹³C-NMR (67,9 MHz, CDCl₃): δ 136,6, 136,2, 128,9, 121,3, 119,9, 119,7, 110,7, 100,9, 68,0, 37,5, 23,3. Beispiel 47 Herstellung von Indoloxazaphosphorin
^3'TOH5-O'-tBDMS-Thymidin
In einem sorgfältig getrockneten 25 ml Rundkolben wurden 10 ml trockenes CH₃CN vorgelegt, mit Ar gespült und mit einem Septum luftdicht verschlossen. PCl₃ (100 μl, 1,15 mmol) wurde über eine Spritze in den Kolben eingebracht. Anschließend wurde der Kolben auf 0 °C abgekühlt, und eine Lösung von (S)-2-Indolisopropanol (200 mg, 1,15 mmol) in CH₃CN (0,35 ml), enthaltend Triethylamin (525 μl, 3,8 mmol), wurde über eine Spritze in den Kolben eingebracht. Sobald (S)-2-Indolisopropanol eingebracht war, wurde ein dicker weißer Niederschlag festgestellt, entsprechend der Bildung von Triethylammoniumchlorid. Nach 30 Minuten Rühren bei 0 °C wurde das Reaktionsgemisch auf 60 °C erwärmt. Das Aufwärmen wurde fortgesetzt, bis ³¹P-NMR einen Hauptpeak bei δ 144 ppm zeigte (nach etwa 1 Tag). Der Kolben wurde wieder auf 0 °C abgekühlt, und eine Lösung von 5'-O-tBDMS-Thymidin (410 mg, 1,15 mmol) in CH₂Cl₂ (0,4 ml) wurde zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 0 °C gerührt. Das Triethylammoniumchlorid wurde abfiltriert und mit CH₂Cl₂ (2x10 ml) gewaschen. Das Filtrat wurde konzentriert und durch Kieselgelchromatographie (CH₂Cl₂/CH₃CN 1:10) gereinigt, um Indoloxazaphosphorin (346 mg, 54 %) als weißen Feststoff zu ergeben. Zwei Diastereoisomere von Indoloxazaphosphorin (64A und 64B) in dem Verhältnis von 9:1 wurden erhalten, abgelesen aus ³¹P-NMR. Die folgenden NMR-Spektren wurden der Hauptkomponente zugeordnet: ³¹P-NMR (202,3 MHz, CDCl₃): δ 121,56 (12,4 %), 120,67 (87,6 %), ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃, zugeordnet durch COSY): δ 8,81 (br s, 1H, NH), 7,39 (s, 1H, H-6), 7,54, 7,17 (m, 4H, C₆H₄), 6,36 (dd, 1H, ³J=9,0 Hz, ³J=5,5 Hz, H-1'), 6,33 (s, 1H, C=CH-Ph), 4,72 (m, 1H, H-3'), 4,41 (m, 1H, CHOP), 3,94 (m, 1H, H-4'), 3,58 (m, 1H, H-5'), 3,06-3,10 (m, 3H, H-5'', CH₂), 2,36 (m, 1H, H-2'), 1,97 (m, 1H, H-2''), 1,87 (s, 3H, CH₃C-5), 1,48 (d, 3H, ³J=5,5 Hz, CH₃), 0,84 (s, 9H, SiC(CH₃)₃), –0,05 (d, 6H, Si(CH₃)₂). ¹³C-NMR (67,9 MHz, CDCl₃): δ 163,7 (C-4), 150,3 (C-2), 137,6, 129,8, 122,2, 121,5, 120,4, 111,1 (C₆H₄), 136,4 (CCHPh), 135,2 (C-6), 110,6 (C-5), 103,2 (CCHPh), 86,2 (C-4'), 86,1 (CHOP), 84,8 (C-1'), 73,7 (C-3'), 71,5 (C-5'), 62,9 (C-2'), 26,0 (CH₂), 25,9 (SiC(CH₃)₃), 23,0 (SiC(CH₃)₃), 18,3 (CH₃), 12,6 (CH₃C-5), –5,54, –5,77 (CH₃SiCH₃). HRMS (FAB, M+H): berechnet 560,234578, gefunden 560,234590). Fp. 80-82 °C.
Herstellung des Dinucleotidphosphorothioattriesters
Die Dinucleotidphosphorothioattriester-Verbindungen wurden nach dem folgenden Schema hergestellt:

i) PCl₃, CH₃CN/Et₃N, 0 °C – 60 °C.
ii) T^3'OH
iii) T^5'OH, DBU
iv) Beaucage-Reagens

Äquimolare Acetonitrillösungen von 62 und von PCl₃ wurden bei 0 °C unter Argon reagieren gelassen, und die Umsetzung wurde durch ³¹P-NMR verfolgt. Nach einigen Minuten wurde das vollkommene Verschwinden des Peaks, entsprechend PCl₃ bei 221 ppm, festgestellt, und mehrere Peaks traten um 140-150 ppm auf. Das Gemisch wurde bis auf 60 °C erwärmt. Das Erwärmen wurde fortgesetzt (etwa 10 Stunden), bis ³¹P-NMR einen Hauptpeak bei 144 ppm zeigte, was die Bildung von Phosphorochloridit 63 anzeigte, wovon angenommen wird, dass es als ein schnell äquilibrierendes Gemisch von 63ax und 63eq existiert, in dem 63ax überwiegt. Das Gemisch wurde auf 0 °C abgekühlt, und eine Lösung von 5'-O-tBDMS-Thymidin in CH₂Cl₂ wurde zugesetzt. Innerhalb von 0,5 h wurden zwei Peaks festgestellt, ein Hauptpeak bei 120,47 ppm und ein Nebenpeak bei 120,36 ppm, entsprechend der Bildung der beiden Diastereoisomere 64eq und 64ax. Das Verhältnis der beiden Diastereoisomere von 3 wurde durch die Temperatur beeinflusst, bei der 5'-O-tBDMS-Thymidin zugesetzt wurde. Bei 20-60 °C betrug das Verhältnis 7:1, bei niedrigerer Temperatur (0-78 °C) nahm das Verhältnis auf 9:1 zu.
Das Kuppeln von 64ax und 64eq mit 3'-O-tBDPS-Thymidin erfolgte in Gegenwart von 1,8-Diazabicyclo[5,4,0]undec-7-en (DBU). Das Hauptdiastereoisomer 64eq reagierte viel schneller mit 3'-OtBDPS-Thymidin als das axial substituierte Nebenisomer 64ax. Unter Verwendung von 1 Äq. DBU und 1 Äq. 3'-OtBDPS-Thymidin wurden nach 5 Stunden bei 50°C 95 % von 64eq in den Phosphittriester 65 übergeführt, während 64ax fast nicht reagierte, wie durch ³¹P-NMR bestimmt. Nach Filtration über eine kurze Kieselgelsäule, um DBU zu entfernen, wurde der Triester 65 mit Beaucage-Reagens behandelt, um ein 73:1-Gemisch der Phosphorothioate 66 zu ergeben, wobei angenommen wird, dass das Hauptisomer die Rp-Konfiguration aufweist, ³¹P-NMR 66,76 ppm (Hauptpeak) und 66,59 ppm. Die chirale Hilfsverbindung 1 konnte nicht mit 28 % Ammoniumhydroxid, sondern mit anderen Reagentien entfernt werden.
Die thermodynamisch stabileren axial substituierten cyclischen Indolderivate reagierten viel langsamer als ihre äquatorial substituierten Isomere. Obgleich nicht gewünscht ist, an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, läuft die Verschiebung, die von 63 nach 64 und von 64 nach 65 führt, unter Inversion ab. Das schnell äquilibrierende Gemisch von langsam reagierendem 63ax und schneller reagierendem 63eq (Verhältnis ca. 99:1) stellt ein 7-9:1-Gemisch von nicht äquilibrierendem schnell reagierendem 64eq und langsam reagierendem 64ax bereit. Das schnell reagierende Indolderivat 64eq und sein langsam reagierendes Isomer 64ax werden dann unter Inversion unter Bereitstellung von 65 als Gemisch von Diastereomeren umgewandelt, in dem ein Isomer, von dem angenommen wird, dass es das Isomer mit der Rp-Konfiguration ist, als Hauptprodukt gebildet wird. Die Sulfurierung stellt ein Gemisch von Diastereomeren 66 in einem Verhältnis von ca. 70:1 bereit. Beispiel 48 Herstellung des Dinucleotidphosphorothioattriesters (66)
5'TOH=3'-O-tBDPS-Thymidin
In einen trockenen 5-ml-Rundkolben wurden 2 ml trockenes CHCl₃, Indoloxazaphosphorin 64eq (50 mg, 0,085 mmol) und 3'-O-tBDPS-Thymidin (40,8 mg, 0,085 mmol) zugesetzt, mit Argon gespült und mit einem Septum verschlossen. DBU (14 μl, 0,094 mmol) wurde dem Kolben über eine Spritze zugesetzt. Die Reaktionslösung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde die Lösung über eine kurze Kieselgelsäule gegeben, um DBU abzufiltrieren, und mit trockenem CH₂Cl₂/CH₃CN (1:1) eluiert. Das Lösungsmittel wurde entfernt, um ein farbloses Öl zu liefern. Das Öl wurde wieder in trockenem CH₂Cl₂ (5 ml) aufgelöst, und Beaucage-Reagens (30 mg, 0,15 mmol) wurde zugesetzt. Das Eindampfen der Reaktionslösung und die anschließende Flashchromatographie (CH₂Cl₂/CH₃COCH₃ 5:1) lieferten den Dinucleotidphosphorothioattriester 66 (71 mg, 78 %) als weißen Feststoff. ³¹P-NMR (202,3 MHz, CDCl₃): δ 66,76 (98,65 %), 66,59 (1,35 %). ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃, zugeordnet durch COSY): δ 9,93 (s, 1H, NH), 9,31 (s, 1H, NH-3-T^5'), 8,85 (s, 1H, NH-3-T^3'), 7,62-6,93 (m, 16H, Si(C₆H₅)₂, C₆H₄, H-6-T^3', H-6-T^5'), 6,46 (dd, 1H, ³J=8,0 Hz, ³J=6,0 Hz, H-1'-T^5'), 6,26 (s, 1H, CH-Ph), 6,05 (dd, 1H, ³J=9,2 Hz, ³J=5,5 Hz, H-1'-T^3'), 4,92 (m, 1H, CHOP), 4,76 (m, 1H, H-3'-T^3'), 4,31 (m, 1H, H-3'- T^5'), 4,03 (m, 1H, H-4'-T^5'), 3,82 (m, 1H, H-4'-T^3'), 3,80, 3,50 (m, 2H, H-5', H-5''-T^5'), 3,67, 3,58 (m, 2H, H-5', H-5''-T^3'), 3,00 (m, 2H, CH₂), 2,31 (m, 1H, H-2'-T^5'), 1,94 (s, 3H, CH₃C-5-T^5'), 1,90 (s, 3H, CH₃C-5-T^3'), 1,85 (m, 1H, H-2''-T^5'), 1,60 (m, 1H, H-2'-T^3'), 1,26 (d, 3H, ³J=6,0 Hz, CH₃), 1,14 (m, 1H, H-2''-T^3'), 1,80 (s, 9H, SiC(CH₃)₃-T^5'), 0,89 (s, 9H, SiC(CH₃)₃-T^3'), 0,07 (d, 6H, Si(CH₃)₂). ¹³C-NMR (125,7 MHz, CDCl₃, zugeordnet durch HMQC): δ 163,84, 163,80 (C-4-T^3', C-4-T^5'), 150,74, 150,34 (C-2-T^3', C-2-T^5'), 135,52, 135,49, 135,25, 134,56, 134,16, 132,73, 132,55, 130,15, 130,05, 128,48, 127,91, 127,85, 120,99, 119,59, 119,34, 111,24, 110,41(C₆H₅SiC₆H₅, C₆H₅NC, C-6-T^3', C-6-T^5'), 100,69 (PhCH), 85,29, 85,17 (C-4'-T^3', C-4'-T^5'), 84,87 (C-1'-T^5'), 84,27 (C-1'-T^3'), 79,70 (C-3'-T^3'), 76,82 (CH), 73,31 (C-3'-T^5'), 66,83 (C-5'-T^5'), 63,01 (C-5'-T^3'), 40,17 (C-2'-T^5'), 37,59 (C-2'-T^3'), 36,00 (CH₂), 26,67 (C(CH₃)₃-T^5'), 25,77 (C(CH₃)₃-T^3'), 21,24 (CH₃), 18,81, 18,15 (SiC-T^3', SiC-T^5'), –5,61, –5,56 (CH₃SiCH₃). MS (FAB, M+H): 1072. Fp. 115-116 °C. Beispiel 49 (R)-Glycidyl-tert-butyldimethylsilylether
Eine Lösung von (R)-Glycidol (5 g, 67,5 mmol) in trockenem Dichlormethan, enthaltend Triethylamin (10,3 ml, 74 mmol), abgekühlt auf 0 °C, wurde einer Lösung von tert-Butyldimethylsilylchlorid (11,2 g, 74 mmol) in trockenem Dichlormethan (30ml) zugesetzt. Anschließend wurde DMAP (0,33 g, 2,7 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und 5 Stunden gerührt. Die Triethylammoniumchloridkristalle wurden abfiltriert und mit Dichlormethan (2x10 ml) gewaschen. Die organische Lösung wurde mit Salzlösung (2x50 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde konzentriert und über eine kurze Kieselgelsäule gegeben, um polare Verunreinigungen zu entfernen, und mit Hexan/Ethylacetat (3:2) eluiert. Nach Entfernen des Lösungsmittels wurde ein farbloses Öl gesammelt und in vacuo getrocknet, um reinen (S)-Glycidyl-tert-butyldimethylsilylether (10,3 g, 81,2 %) bereitzustellen. ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): 3,81, 3,61 (m, 2H, CH₂OSi), 3,04 (m, 1H, CH), 2,72, 2,59 (m, 2H, CH₂O), 0,86 (s, 9H, C(CH₃)₃), 0,036 (d, 6H, Si(CH₃)₂). ¹³C-NMR (67,9 MHz, CDCl₃): 63,78 (CH₂OSi), 52,44 (CH₂O), 44,45 (CHO), 25,90 ((CH₃)₃), 18,38 (Csi), –5,28, –5,32 (CH₃SiCH₃).
Die Herstellung der chiralen Hilfsverbindungen 67 bis 69 ist in dem folgenden Schema gezeigt:
Die chiralen Hilfsverbindungen 70 bis 72 sind mit den Standardreagentien, die zur Entfernung von Phosphor-Schutzgruppen geeignet sind, entfernbar. Beispiel 50 (R)-3-Indol-2-yl-propan-1,2-diol (67)
Einer Lösung von 1-Phenylsulfonylindole (6,2 g, 24 mmol) in trockenem THF (60 ml) unter Argon bei –78 °C wurde über eine Spritze während 10 Minuten eine Lösung von 1,6 M Butyllithium (15 ml, 24 mmol) zugetropft. Das Gemisch wurde 1,5 Stunden unter –70 °C gerührt und sodann langsam während 1 Stunde auf 5 °C aufwärmen gelassen. Die Lösung wurde auf –78 °C abgekühlt und sodann über eine Spritze mit einer Lösung von (S)-Glycidyl-tert-butyldimethylsilylether (4,5 g, 24 mmol) in trockenem THF (10 ml) behandelt. Das Gemisch wurde langsam über Nacht auf Raumtemperatur aufwärmen gelassen und in eine gesättigte NH₄Cl-Lösung (80 ml) gegossen. Die Lösung wurde mit Ethylacetat (3x40 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit H₂O (2x100 ml), gesättigter Natriumbicarbonatlösung (2x100 ml) und Salzlösung (2x100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und am Rotationsverdampfer eingedampft, um ein tiefrotes Öl zu ergeben. Dieses Öl wurde durch Kieselgelchromatographie (Ethylacetat/Hexan 1:1) gereinigt, um (R)-1-tert-Butyldimethylsiloxyl-3-(1-phenylsulfonylindol-2-yl)-propan-2-ol als hellrotes Öl bereitzustellen (5,2 g, 46 %). ¹H-NMR (500 MHz, CDCl₃): δ 7,19-8,16 (m, 9H, C₆H₅, C₆H₄), 6,57 (s, 1H, NCCH), 4,14 (m, 1H, CHO), 3,74, 3,58 (m, 2H, CH₂OSi), 3,23, 3,09 (m, 2H, CH₂C), 2,57 (d, 1H, ³J=4,5 Hz, OH), 0,93 (s, 9H, (CH₃)₃), 0,10 (d, 6H, CH₃SiCH₃). ¹³C-NMR (75,4 MHz, CDCl₃): δ 138,95, 138,32, 137,30, 133,66, 129,83, 129,22, 126,20, 124,19, 123,73, 120,37, 114,93, 111,25, 70,88, 66,52, 33,03, 25,90, 18,30.
Die Abspaltung der Phenylsulfonyl-Schutzgruppe wurde durch Kaliumhydroxid erreicht. 4,5 g (R)-1-tert-Butyldimethylsiloxyl-3-(1-phenylsulfonylindol-2yl)-propan-2-ol wurden in 50 ml Methanol/Wasser (3:1), enthaltend 2,8 g KOH, gelöst. Die Lösung wurde 5 Stunden unter Rückfluss erhitzt und mit Ethylacetat (2x50 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit H₂O (2x100 ml) und Salzlösung (2x100 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um reines (R)-3-Indol-2yl-propan-1,2-diol (1,68 g, 86,9 %) als helles bernsteinfarbenes Öl zu ergeben. ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): δ 8,58 (s, 1H, NH), 7,53-7,00 (m, 4H, C₆H₄), 6,21 (s, 1H, NCCH), 3,88 (m, 1H, CHO), 3,56, 3,40 (m, 2H, CH₂O), 3,2 (s, br, 1H, OH), 2,79 (m, 2H, CH₂C), 2,00 (s, breit, 1H, OH). ¹³C-NMR (67,9 MHz, CDCl₃): δ 136,24, 135,71, 128,46, 121,45, 119,96, 119,78, 110,75 (C₆H₄NC), 100,93 (CHCN), 71,80 (CHO), 66,06 (CH_IC), 31,87 (CH₂OH). Beispiel 51 1-p-Toluolsulfonsäure-3-indol-2-yl-propan-2-ol (68)
Einer Lösung von (R)-3-Indol-2-yl-propan-1,2-diol (1,20 g, 6,28 mmol) in trockenem Pyridin (60 ml), abgekühlt auf 0 °C, wurde p-Toluolsulfonylchlorid (1,20 g, 6,29 mmol) zugesetzt. Nach 5 Stunden Rühren bei 0 °C wurde die Lösung in 100 ml kaltes Wasser gegossen und mit Ether (3x30 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit 6 N Chlorwasserstoffsäure (2x50 ml), Salzlösung (2x50 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Erhalt von 1-p-Toluolsulfonsäure-3-indol-2-yl-propan-2-ol als weißer Feststoff (1,70 g, 78,6 %) eingedampft, welcher für die nächsten Umsetzungen nicht weiter gereinigt wurde. ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): 8,63 (s, breit, 1H, NH), 7,0-7,7 (m, 8H, C₆H₄, C₆H₄SO₂), 4,13 (m, 1H, CHO), 3,99 (m, 2H, CH₂O), 2,89 (m, 2H, CH₂C), 2,41 (s, 3H, CH₃). Beispiel 52 Hydroxycyanopropylindol 70
Eine Lösung von Tosylate 68 (1,62 g, 4,7 mmol) in DMF (30 ml), die Natriumcyanid enthielt (0,5 g, 10,2 mmol), wurde vier Stunden bei 110 °C gerührt, anschließend auf Raumtemperatur abgekühlt, in 80 ml Eiswasser gegossen und mit Ethylacetat (330 ml) extrahiert. Die vereinigte organische Lösung wurde mit gesättigtem Natriumbicarbonat (230 ml), Salzlösung (230 ml) gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter Erhalt eines tiefroten Öls eingedampft. Dieses Öl wurde durch Flashchromatographie (Hexan:Ethylacetat 2:3) gereinigt, um das Nitril 10 (0,6 g, 64 %) zu ergeben. ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): 8,42 (s, breit, 1H, NH), 7,0-7,5 (m, 4H, C₆H₄), 6,30 (d, 1H, 4J=1,48 Hz, CHCN), 4,20 (m, 1H, CHO), 3,01 (m, 2H, CH₂), 2,47, 2,49 (m, 2H, CH₂CN). ¹³C-NMR (67,9 MHz, CDCl₃): 136,56, 133,58, 1218,55, 121,94, 120,16, 120,06, 110,74, 102,12 (C₈H₅N), 117,12 (CN), 67,55 (CH₂C), 35,10 (CHO), 25,28 (CH₂CN). Beispiel 53 Aminoverbindung 69
Einem Druckgefäß wurden 2,94 g 68 und 10 ml Isopropanol zugesetzt. Das Gemisch wurde über Nacht bei 110 °C gerührt. Das Eindampfen des Lösungsmittels lieferte ein bernsteinfarbenes Öl, welches durch Flashchromatographie gereinigt wurde, um 69 (1,6 g, 81 %) bereitzustellen.
¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): 9,01 (s, breit, 1H, NH), 7,0-7,5 (m, 4H, C₆H₄), 6,23 (s, 1H, CHCN), 3,89 (m, 1H, CHO), 2,72-3,03 (m, 5H, NCH, OH, NH, CH₂), 2,44, 2,59 (m, 2H, CH₂N), 1,05, 1,04 (d, 6H, ³J=6,18 Hz, (CH₃)₂). ¹³C-NMR (67,9 MHz, CDCl₃): 136,61, 136,28, 128,43, 121,12, 119,81, 119,46, 110,73, 100,68 (C₈H₅N), 69,37, 51,80, 49,04, 33,34, 23,12, 22,81. Beispiel 54 Verbindung 72
Einer Lösung von 69 (0,2 g, 0,86 mmol) in trockenem CH₃CN (20 ml) wurde Essigsäureanhydrid (0,1 ml, 1,06 mmol) zugesetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, anschließend mit gesättigter Natriumbicarbonatlösung (210 ml), Salzlösung (210 ml) gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde eingedampft, und der zurückbleibende Feststoff wurde durch Flashchromatographie (Ethylacetat) zu Verbindung 72 als farblose Kristalle (0,22 g, 92 %) aufgereinigt. ¹H-NMR (270 MHz, CDCl₃): 9,17 (s, breit, 1H, NH), 7,0-7,5 (m, 4H, C₆H₄), 6,25 (s, 1H, CHCN), 3,98 (m, 2H, CHO, CHN), 3,50, 3,10 (m, 2H, CH₂), 2,94 (m, 2H, CH₂N), 2,15 (s, 3H, CH₃CO), 1,14, 1,12 (d, 6H, ³J=6,42 Hz, (CH₃)₂). ¹³C-NMR (67,9 MHz, CDCl₃): 173,58 (CO), 136,34, 136,16, 128,24, 121,17, 119,70, 119,41, 110,89, 100,85 (C₈H₅N), 73,41, 50,15, 47,92, 34,12, 21,32, 20,73.
Fachleute wissen, dass an den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung zahlreiche Änderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, und dass solche Änderungen und Modifikationen ohne Abweichen vom Umfang der Erfindung erfolgen können. Darum ist beabsichtigt, dass die beigefügten Ansprüche sämtliche entsprechenden Variationen, wie sie in den Umfang der Erfindung fallen, einschließen.

Claims

Verfahren zur Synthese eines Oligomers mit einer Phosphorothioatverknüpfung, umfassend die Schritte: – Umsetzen eines ersten Synthons der Formel I:
wobei Q unabhängig O oder S ist; R¹ eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist; R² eine chirale Hilfsgruppe der Formel -C(R⁸)R³-C(R¹⁶)R⁵-CHR⁶-NHR⁷ ist; R³ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cyanomethyl, Monohalogenmethyl, Dihalogenmethyl, Trihalogenmethyl, -CH₂R₄, -CH₂Si(R⁴)₃ oder -CH₂-SO_kR⁴, wobei k 0, 1 oder 2 ist, ist; R⁴ unabhängig Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen, -N(R₇₀)-C(=O)-R₇₁, -S-C(=O)-R₇₀ oder -O-C(=O)-O-N(R₇₀)(R₇₁) ist; R₇₀ und R₇₁ jeweils unabhängig Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, α-Halogen-substituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen, α-Halogen-substituiertes Aralkyl mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Aryl mit 3 bis 14 Kohlenstoffatomen, die mit bis zu drei elektronenziehenden Gruppen substituiert sind; R⁵ H, -CN, -Si(R⁴)₃, SO_kR⁴ oder Halogen ist; oder R⁸ und R¹⁶ jeweils H sind und R³ und R⁵ zusammen eine der Strukturen
bilden, wobei: R¹⁰ und R¹¹ H, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, -CH₂C(=O)OR²², -CH₂CN, -CH₂Si(CH₃)₃ oder o- oder p-C₆H₄-R²¹ sind; R²¹ Wasserstoff, -O-C(=O)CH₃, Alkoxy mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, -NO₂ oder -N(R²²)₂ ist; R²² unabhängig H oder Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist; p 1 oder 2 ist; Z¹ und Z² unabhängig Halogen, CN, -Si(CH₃)₃ und -C(=O)OR²² sind; R³⁰ Wasserstoff, -O-C(=O)CH₃, Alkoxy mit 1 bis 10 Kohlenstoffen oder -O-Si(R₄)₃ ist; R⁶ H, Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist; oder R⁵ und R⁶ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden; R⁷ Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist; oder R⁶ und R⁷ zusammen eine der Strukturen
bilden, wobei V, T und Z unabhängig CH oder N sind; R₄₁, R₄₂, R₄₃ und R₄₄ jeweils unabhängig H oder eine elektronenziehende Gruppe sind; R⁸ H oder Methyl ist; R¹⁶ H, Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist; B eine Nucleobase ist; und n eine ganze Zahl von 0 bis 50 ist; mit einem zweiten Synthon der Formel II:
wobei R⁹ eine Hydroxyl-Schutzgruppe oder ein Linker ist, der an einem festen Träger gebunden ist; und m eine ganze Zahl von 0 bis 50 ist; für eine Dauer und unter Reaktionsbedingungen, die zur Bildung eines dritten Synthons der Formel III wirksam sind:
und – Zusammenbringen des dritten Synthons mit einem Sulfurierungsmittels unter Bildung eines Oligomers der Formel IV:
wobei D die Phosphorothioatverknüpfung mit der Formel
ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Phosphorothioatverknüpfung diastereomerisch angereichert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei 75 % der Phosphorothioatverknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei 85 % der Phosphorothioatverknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei 95 % der Phosphorothioatverknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form vorliegen.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Phosphorothioatverknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form, im Wesentlichen frei von anderen stereoisomeren Formen, vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei n 0 ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Synthon in einer einzigen stereoisomeren Form, im Wesentlichen frei von anderen stereoisomeren Formen, vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem die Entfernung der R¹-Gruppe aus dem Phosphorothioat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem die Entfernung der chiralen Hilfsgruppen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Entfernung der chiralen Hilfsgruppen über β-Eliminierung erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Entfernung der chiralen Hilfsgruppen mit Behandlung durch Säurereagentien erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Verbindung der Formel IV eine Vielzahl der Phosphorothioatverknüpfungen enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste und zweite Synthon bei einer Temperatur von –20 °C bis 40 °C umgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste und zweite Synthon bei einer Temperatur von –15 °C bis 0 °C umgesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Synthon durch Umsetzen einer Verbindung der Formel V:
mit einem Azaphospholan der Formel VIa
wobei R³-R⁸ wie vorstehend definiert sind; und X Halogen, Dialkylamino, Imidazol, Triazol oder substituiertes Phenoxy ist, wobei die Substituenten elektronenziehend sind.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die elektronenziehenden Substituenten Halogen oder Nitro sind.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Azaphospholan durch Umsetzung eines Reagens der Formel HO-C(R⁸)R³-C(R¹⁶)R⁵-CHR⁶-NHR⁷ und von Phosphortrihalogenid, Phosphor-tri(dialkylamid), Phosphortriphenoxid oder Phosphor-tri(imidazoliden) hergestellt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Synthon durch Umsetzung einer Verbindung der Formel VII
und eines γ-Aminoalkohols der Formel HO-C(R⁸)R³-C(R¹⁶)R⁵-CHR⁶-NHR⁷; wobei X und R¹-R⁸ und R¹⁶ wie vorstehend definiert sind, gebildet wird.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei X Chlor ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Umsetzung stereoselektiv ist. 22. Verfahren nach Anspruch 20, wobei das erste Synthon in einer einzigen stereoisomeren Form, im Wesentlichen frei von anderen stereoisomeren Formen, vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Umsetzung in Gegenwart eines Katalysators durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei der Katalysator eine der Formeln VIII oder IX aufweist:
wobei R¹² und R¹³ unabhängig Wasserstoff, Halogen, Cyano, Nitro, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, substituiertes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, eine Estergruppe sind oder R¹² und R¹³ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen substituierten oder unsubstituierten Phenylring bilden, wobei die Substituenten elektronenziehend sind; und R¹⁴ Wasserstoff, Halogen, Cyano, Nitro, Thio, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, substituiertes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, Norbornyl, substituiertes Norbornyl, Aryl mit 3 bis 14 Kohlenstoffatomen, substituiertes Aryl mit 3 bis 14 Kohlenstoffatomen, wobei die Substituenten elektronenziehend sind, ist oder die Formel
aufweist, wobei L eine Schutzgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei R¹⁴ Halogen oder Nitro ist und wobei R¹² und R¹³ jeweils Halogen oder jeweils Cyano sind.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei R¹⁴ Brom ist und R¹² und R¹³ jeweils Cyano sind.
Verfahren nach Anspruch 24, wobei R¹⁴, R¹² und R¹³ jeweils Brom sind.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei R¹⁴ eine der Formeln
aufweist, wobei R¹⁵ H, Methyl, Trialkylsilyl oder Acetyl ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei R³ Cyanomethyl oder -CH₂-SO_kR⁴, wobei k 0, 1 oder 2 ist, ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei R⁷ Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das erste Synthon eine der Formeln Xa, XIa, XIIa, XIIIa oder XXa ist:

wobei W die Formel
aufweist und R¹-R¹⁶, V, T und Z wie vorstehend definiert sind.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das erste Synthon die Formel XIa aufweist; R³ -CH₂R₄ ist; und R⁴ unabhängig -N(R₇₀)-C(=O)-R₇₁, -S-C(=O)-R₇₀ oder -O-C(=O)-O-N(R₇₀)(R₇₁) ist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei R₇₀ und R₇₁ unabhängig Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein α-Halogen-substituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das erste Synthon die Formel Xb oder Xc aufweist:
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das erste Synthon die Formel XIVa aufweist:
wobei p, Z¹ und Z² wie vorstehend definiert sind.
Verfahren nach Anspruch 35, wobei das erste Synthon die Formel XVa oder XVIa aufweist:
wobei Y, R⁷, Z¹, Z² und p wie vorstehend definiert sind.
Verfahren nach Anspruch 31, wobei das erste Synthon die Formel XVIIa oder XVIIIa aufweist:
wobei W, R⁷, R¹⁰ und R¹¹ wie vorstehend definiert sind.
Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem die Entfernung der R⁹-Gruppen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, das außerdem die Entfernung der R²-Gruppen umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Internucleotidverknüpfung, umfassend die Schritte: Auswählen eines ersten Synthons, wobei das erste Synthon aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Nucleosidphosphoramiditen und Nucleosidazaphospholanen; Auswählen eines zweiten Nucleosid-Synthons mit einer freien 5'-Hydroxylgruppe; und Umsetzen des ersten und zweiten Synthons in Gegenwart eines Katalysators unter Bildung der Internucleotidverknüpfung; wobei der Katalysator die Formel
aufweist, wobei R¹² und R¹³ unabhängig Wasserstoff, Halogen, Cyano, Nitro, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, substituiertes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, eine Estergruppe sind oder R¹² und R¹³ zusammen mit den Kohlenstoffatomen, an die sie gebunden sind, einen substituierten oder unsubstituierten Phenylring, wobei die Substituenten elektronenziehend sind, bilden; und R¹⁴ Wasserstoff, Halogen, Cyano, Nitro, Thio, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, substituiertes Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, Norbornyl, substituiertes Norbornyl, Aryl, substituiertes Aryl, wobei die Substituenten elektronenziehend sind, ist oder die Formel
aufweist, wobei L eine Schutzgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Internucleotidverknüpfung eine Phosphitverknüpfung ist.
Verfahren nach Anspruch 40, das außerdem den Schritt der Oxidation der Internucleotidverknüpfung unter Bildung einer Phosphordiesterverknüpfung, einer Phosphorothioatverknüpfung oder einer Phosphorodithioatverknüpfung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 23 oder Anspruch 40, wobei der Katalysator 2-Brom-4,5-dicyanoimidazol ist.
Oligomer der Formel IV nach Anspruch 1:
wobei D eine Phosphorothioatverknüpfung der Formel
ist.
Azaphospholan der Formel VIb
wobei: Y X oder W ist, wobei X Imidazol, Triazol oder substituiertes Phenoxy ist, wobei die Substituenten elektronenziehend sind, und W die Formel
aufweist, wobei Q unabhängig O oder S ist; R¹ eine Hydroxyl-Schutzgruppe ist; R² eine chirale Hilfsgruppe der Formel -C(R⁸)R³-C(R¹⁶)R⁵-CHR⁶-NHR⁷ ist; R³ Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cyanomethyl, Monohalogenmethyl, Dihalogenmethyl, Trihalo genmethyl, -CH₂R₄, -CH₂Si(R⁴)₃ oder -CH₂-SO_kR⁴, wobei k 0, 1 oder 2 ist, ist; R⁴ unabhängig Alkyl, Aryl, Aralkyl oder Alkaryl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen, -N(R₇₀)-C(=O)-R₇₁, -S-C(=O)-R₇₀ oder -O-C(=O)-O-N(R₇₀)(R₇₁) ist; R₇₀ und R₇₁ jeweils unabhängig Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, α-Halogen-substituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Aralkyl mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen, α-Halogen-substituiertes Aralkyl mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen oder Aryl mit 3 bis 14 Kohlenstoffatomen, substituiert mit bis zu drei elektronenziehenden Gruppen, sind; R⁵ H, -CN, -Si(R⁴)₃, SO_kR⁴ oder Halogen ist; oder R⁸ und R¹⁶ jeweils H sind und R³ und R⁵ zusammen eine der Strukturen
bilden, wobei R¹⁰ und R¹¹ H, Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffen -CH₂C(=O)OR²², -CH₂CN, -CH₂Si(CH₃)₃ oder o- oder p-C₆H₄-R²¹ sind; R²¹ Wasserstoff -O-C(=O)CH₃, Alkoxy mit 1 bis 10 Kohlenstoffen, -NO₂ oder -N(R²²)₂ ist; R²² unabhängig H oder Alkyl mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen ist; p 1 oder 2 ist; Z¹ und Z² unabhängig Halogen, CN, -Si(CH₃)₃ und -C(=O)OR²² sind; R³⁰ Wasserstoff, -O-C(=O)CH₃, Alkoxy mit 1 bis 10 Kohlenstoffen oder -O-Si(R₄)₃ ist; R⁶ H, Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist; oder R⁵ und R⁶ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden; R⁷ Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist; oder R⁶ und R⁷ zusammen eine der Strukturen
bilden, wobei X, T und Z unabhängig CH oder NH sind; oder Z und R⁵ zusammen mit den Atomen, an die sie gebunden sind, einen Phenylring bilden; R⁸ H oder Methyl ist; R⁹ eine Hydroxyl-Schutzgruppe oder ein fester Träger ist; R¹⁶ H, Alkyl oder Aralkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist; B eine Nucleobase ist; und n eine ganze Zahl von 0 bis 50 ist.
Azaphospholan nach Anspruch 45, wobei Y W ist und n 0 ist.
Azaphospholan nach Anspruch 45, wobei R⁷ Alkyl mit bis zu 15 Kohlenstoffatomen ist.
Azaphospholan nach Anspruch 45, wobei R⁷, R⁶ und die Atome, an die sie gebunden sind, einen 5- oder 6-gliedrigen Ring bilden.
Azaphospholan nach Anspruch 46, wobei R³ Cyanomethyl oder -CH₂-SO_kR⁴, wobei k 0, 1 oder 2 ist, ist.
Azaphospholan nach Anspruch 45 mit einer der Formeln XVIc oder XVId:
Azaphospholan nach Anspruch 45, mit einer der Formeln Xb, XIb, XIIb, XIIIb oder XXb:

wobei R³-R¹⁶, Y, V, T, Z, Z₁, Z₂ und p wie zuvor definiert sind.
Azaphospholan nach Anspruch 51 mit der Formel XIa.
Azaphospholan nach Anspruch 52, wobei R³ -CH₂R₄ ist; und R⁴ unabhängig -N(R₇₀)-C(=O)-R₇₁, -S-C(=O)-R₇₀ oder -O-C(=O)-O-N(R₇₀)(R₇₁) ist.
Azaphospholan nach Anspruch 52, wobei R₇₀ und R₇₁ unabhängig Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein α-Halogen-substituiertes Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen sind.
Azaphospholan nach Anspruch 51 mit der Formel XIVb:
wobei Y, R⁶, R⁷, R⁸, p, Z¹ und Z² wie zuvor definiert sind.
Azaphospholan nach Anspruch 50 mit der Formel Xd oder Xe:
wobei Y R³, R⁵, R⁸ und R¹⁶ wie zuvor definiert sind.
Azaphospholan nach Anspruch 51 mit der Formel XVIIb oder XVIIIb:
wobei Y, R⁷, R¹⁰ und R¹¹ wie zuvor definiert sind.
Azaphospholan nach Anspruch 49 mit der Formel XVb oder XVIb:
wobei Y, R⁷, Z¹, Z² und p wie zuvor definiert sind.
Azaphospholan nach Anspruch 45, wobei das Azaphospholan diastereomerisch angereichert ist.
Azaphospholan nach Anspruch 45, wobei 75 % des Azaphospholans in einer einzigen stereoisomeren Form vorliegen.
Azaphospholan nach Anspruch 45, wobei 85 % des Azaphospholans in einer einzigen stereoisomeren Form vorliegen.
Azaphospholan nach Anspruch 45, wobei 95 % des Azaphospholans in einer einzigen stereoisomeren Form vorliegen.
Azaphospholan nach Anspruch 45, wobei das Azaphospholan in einer einzigen stereoisomeren Form, im Wesentlichen frei von anderen stereoisomeren Formen, vorliegt.
Oligomere Verbindung der Formel III nach Anspruch 1, umfassend eine Gruppierung mit einer Phosphitverknüpfung der Formel XXX
wobei R³, R⁵-R⁸ und R¹⁶ wie nach Anspruch 1 definiert sind.
Oligomere Verbindung nach Anspruch 64, wobei 75 % der Phosphitverknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form vorliegen.
Oligomere Verbindung nach Anspruch 64, wobei 85 % der Phosphitverknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form vorliegen.
Oligomere Verbindung nach Anspruch 64, wobei 95 % der Phosphitverknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form vorliegen.
Oligomere Verbindung nach Anspruch 64, wobei die Phosphitverknüpfung in einer einzigen stereoisomeren Form, im Wesentlichen frei von anderen stereoisomeren Formen, vorliegt.