DE69704206T2

DE69704206T2 - Selbst-replizierende episomale expressionsvektoren, welche gewebespezifische expression vermitteln

Info

Publication number: DE69704206T2
Application number: DE69704206T
Authority: DE
Inventors: Michael Antoniou; Geradus Grosveld
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1996-08-16
Filing date: 1997-08-18
Publication date: 2001-08-30
Anticipated expiration: 2017-08-19
Also published as: EP0918874A2; EP0918874B1; DK0918874T3; PT918874E; WO1998007876A2; AU725474B2; AU4020997A; JP2000516472A; DE69704206D1; WO1998007876A3; ATE199570T1; ES2157084T3; GR3035838T3; CA2263796A1

Description

Allgemeines Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft stabil selbst replizierende episomale Expressionsvektoren zur Expression eines interessierenden Gens in eine Wirtszelle.

Hintergrund der Erfindung

Die Expression eines fremden Gens in eine Wirtszelle wird im Allgemeinen durch das Transferieren des Gens in die Wirtszelle unter Verwendung eines Gentransfervektors erreicht. Gentransfervektoren sind im Stand der Technik verfügbar und schließen zum Beispiel Retrovirusvektoren, Adenoviralvektoren und adenoassoziierte Viralvektoren ein. Viele Transfervektoren wirken durch Integration zumindest des transfizierten Gens, wenn nicht des gesamten Gentransfervektors in das Wirtszellenchromosom, obgleich auch nicht-integrierende Transfervektoren im Stand der Technik bekannt sind. Die Effizienz der stabilen Integration von transfizierten Genkonstrukten ist allgemein sehr ineffizient (1 : 10³-10&sup6;). Der Nachteil der Verwendung viralen Vektor-basierten Gentransfers ist, dass die Menge an genetischem Material, das der Vektor unterbringen kann, begrenzt ist durch die genetischen Verpackungsgrenzen des Virus. Gentransfervektoren, welche große Fragmente von insertiertem genetischen Material einschließen, sind schwierig in einem so ausreichend hohen Titer herzustellen, um von praktischem Wert zu sein. Deshalb ist es schwierig, zusätzliches genetisches Material in einen virusbasierten Vektor einzuschließen, wie zum Beispiel genregulierende Elemente, ohne den stabilen Gentransfer nachteilig zu beeinflussen.
Locus Kontrollregionen (LCRs) (Grosveld et al., Cell 51: 975-985 (1987)), auch bekannt als dominante Aktivatorsequenzen, Locus Aktivierungsregionen oder dominante Kontrollregionen, übertragen gewebspezifisch, Integrationsstellen-unabhängig und Kopienzahl abhängig, Expression auf ein gebundenes Gen, das in das Chromosom der Wirtszelle eingebaut wurde. LCRs wurden ursprünglich im menschlichen Globin-Gensystem entdeckt, das starke Positionseffekte zeigte, wenn es in ein Chromosom einer Wirtszelle in einem Gewebe einer transgenen Maus oder einer Erythroleukämia-Zelle (MEL) einer Maus eingebaut wurde (siehe zum Beispiel Magram et al., Nature 315: 338-340 (1985); Townes et al., EMBO J. 4: 1715-1723 (1985); Kollias et al., Cell 46: 89-94 (1986); Antoniou et al., EMBO J. 7: 377-384 (1988)).
Positionseffekte wurden überwunden, wenn die LCRs direkt an solche Transgene gebunden wurden (Grosveld et al., supra). Andere LCRs wurden seitdem identifiziert, einschließlich der β-Globin-LCR (βLCR), welche die Genexpression in Erythrozytengewebe fördert, und der CD2-LCR, welche die Genexpression in T-Zellen fördert (siehe zum Beispiel Greaves et al., Cell 56: 979 (1989), Europäische Patentanmeldung EP-A-0 668 357), die makrophagenspezifische Lysozym-LCR (Bonifer et al., (1985, 1990)) und ein Klasse II MHC-LCR (Carson et al., Nucleic Acids Res. 21, 9: 2065-2072 (1993).
Es ist ein Gegenstand der Erfindung, ein stabiles Gentransfersystem bereitzustellen, dass wenn es in einer Wirtszelle anwesend ist, die stabile und gewebebsgrenzte Expression eines interessierenden Gens bewirkt, das vom Vektor getragenen wird.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung stellt selbst replizierende, LCR- enthaltende, episomale Expressionsvektoren bereit, in welche ein interessierendes Gen zur Expression des Gens in Zellen eines spezifischen Gewebetyps insertiert ist.
Die Erfindung umfasst deshalb einen selbst replizierenden, episomalen DNA-Expressionsvektor, zur Expression eines interessierenden Gens in eine Wirtszelle in einer gewebsbegrenzten Weise, der Vektor umfassend:
(a) einen Replikationsursprung, geeignet, die Replikation des DNA-Expressionsvektors in Zellen des spezifischen Gewebetyps zu steuern; und (b) eine LCR oder deren Komponente, welche die Genexpression in einer gewebsbegrenzten Weise steuert,
wenn sie operativ an ein interessierendes Gen gebunden und in der Wirtszelle vorhanden ist.
Ein erfindungsgemäßer Vektor kann auch das interessierende Gen einschließen, eingefügt in eine Klonierungsstelle und operativ gebunden an die LCR.
Der Begriff "Gen" wird gebraucht, um jede DNA-Sequenz zu definieren, die geeignet ist, exprimiert zu werden. Das interessierende Gen kann ein fremdes oder heterologes Gen 'sein, das heißt ein Gen, dass entweder normalerweise nicht in der genomischen DNA der Wirtszellen gefunden wird oder normalerweise nicht in dieser Wirtszelle exprimiert wird. Das interessierende Gen kann auch eine künstliche DNA-Sequenz sein.
Die gewebsbegrenzte Expression eines interessierenden Gens wird in den erfindungsgemäßen Vektoren vermittelt durch Verwendung einer geeignete LCR oder deren Komponenten oder Teile, welche die gewebsspezifische Expression auf das interessierende Gen übertragen.
Wie hier verwendet, ist eine "Locus Kontrollregion" (LCR) definiert als ein genetisches Element, welches aus einem gewebspezifischen Locus einer eukaryotischen Wirtszelle erhalten wird und welches, wenn es an ein interessierendes Gen gebunden ist und eingebaut ist in ein Chromosom der Wirtszelle, Expression gewebspezifisch, Integrationsstellen-unabhängig (positionsunabhängig), Kopienzahl abhängig, auf das interessierende Gen überträgt. Eine erfindungsgemäß geeignete LCR, besitzt diese Charakeristika, wenn sie eingefügt wird in chromosomale DNA und wird die Fähigkeit behalten, gewebetypbegrenzte Expression eines gebundenen Gens zu übertragen, wenn sie in einem erfindungsgemäßen, selbst replizierenden, episomalen Vektor anwesend ist. Eine "Komponente" einer LCR bezieht sich auf einen Teil einer LCR, der auch gewebsbegrenzte Genexpression überträgt, wenn er an ein Gen gebunden ist und eingefügt ist in einen selbst replizierenden, episomalen Vektor. Eine LCR kann strukturell identifiziert werden, weil sie assoziiert ist mit einer oder mehreren DNase-I- hypersensitiven Stellen in ihrer natürlichen chromosomalen Umgebung, und eine erfindungsgemäß geeignete Komponente einer LCR wird auch wenigstens eine DNase-I- hypersensitive Stelle umfassen.
Ein "Enhancer" ist hierin als ein genetisches Element definiert, welches den Transkriptionsgrad eines gebundenen Gens verstärkt, wenn es sich auf einem selbst replizierenden, episomalen Vektor befindet, aber welches nicht die gewebsspezifische Genexpression überträgt, wenn es sich auf dem Vektor befindet.
Es ist bevorzugt, dass der Vektor eine Komponente einer LCR umfasst, welche gewebsspezifische Expression überträgt und wenigstens eine DNase-I-hypersensitive Stelle enthält. In der menschlichen β-Globin-LCR besteht die bevorzugte Komponente der LCR im Wesentlichen aus HS3; auch bevorzugt ist die menschliche β-Globin-LCR mit Ausnahme der HS2-Region; auch bevorzugt sind die HS3- und HS4- Regionen gemeinsam, ohne die HS2-Region.
Die Erfindung umfasst auch ein Vektorenpaar, umfassend ein selbst replizierendes episomales DNA- Expressionssystem zur Expression eines interessierenden Gens in eine Wirtszelle in einer gewebsbegrenzten Weise, das Vektorenpaar umfassend: einen ersten Vektor umfassend (a) einen Replikationsursprung;
(b) eine LCR oder deren Komponente, welche wenn operativ gebunden an ein interessierendes Gen und anwesend in einer Wirtszelle, die Expression dieses Gens in einer gewebsbegrenzten Weise steuert; und
(c) eine Klonierungsstelle für das interessierende Gen; und ein zweiter Vektor umfassend (d) einen Replikationsursprung; und (e) eine ein Replikationsprotein kodierende Sequenz, wobei das Replikationsprotein für die Replikation des Replikationsursprungs erforderlich ist.
In einem anderen Ausführungsbeispiel, kann der zweite Vektor auch eine LCR einschließen, welche die gleiche LCR sein kann, die im ersten Vektor vorliegt, oder sie kann eine andere LCR sein, welche die gleiche oder wenigstens eine überlappende Gewebespezifität spezifiziert wie die erste LCR, so dass das interessierende Gen und das virale Replikationsgen exprimiert werden in einigen der gleichen Zellen.
Es ist bevorzugt, dass für die auf rote Zellen begrenzte Genexpression, die β-Globin-LCR des β-Globin Locus verwendet wird. Wie hier gebraucht bezieht sich "rote Zellen" auf Zellen der Erythrozytenlinie.
Es ist bevorzugt, dass für die auf T-Zellen begrenzte Genexpression die CD2-LCR des CD2 Locus, oder eine ihrer Komponenten, verwendet wird, wenigstens eine DNase-I- hypersensitive Stelle enthaltend, welche die auf T- Zellen begrenzte Genexpression in einer episomalen Umgebung steuert. Es ist bevorzugt, dass für die auf Klasse II MHC-haltige Zellen begrenzte Genexpression die Klasse II MHC-LCR verwendet wird, oder eine ihrer Komponenten, enthaltend wenigstens eine DNase-I-hypersensitive Stelle, welche die auf MHC-haltige Zellen begrenzte Genexpression in einer episomalen Umgebung steuert. Es ist auch bevorzugt, dass für die auf Makrophagenzellen begrenzte Genexpression die Makrophagen/Lysozym-LCR oder eine ihrer Komponenten verwendet wird, enthaltend wenigstens eine DNase-I-hypersensitive Stelle, welche die auf Makrophagenzellen begrenzte Genexpression in einer episomalen Umgebung steuert.
Der Begriff "episomaler Vektor" bezieht sich auf einen Nukleinsäurevektor, der linear oder ringförmig sein kann und welcher gewöhnlich eine doppelsträngige Form besitzt. Ein erfindungsgemäßer Vektor ist allgemein in einem Größenbereich von 1 kb - 1000 kb, der bevorzugte Größenbereich ist in einem Bereich von 5 kb - 100 kb.
Die Begriffe "selbst replizierend", "stabil verbleibend" und "Persistenz" werden hier wie folgt definiert. Die selbst replizierende Funktion eines erfindungsgemäßen Vektors befähigt den Vektor dazu, in der Zelle stabil zu verbleiben, unabhängig von der Replikation genomischer DNA, und in Nachkommenzellen zu persitieren für drei oder mehr Zellteilungen ohne signifikanten Verlust an Kopienzahl des Vektors in der Zelle, das heißt ohne Verlust von mehr als durchschnittlich 50% der Vektormoleküle in Nachkommenzellen zwischen einer gegebenen Zellteilung. Diese Selbstreplizierungsfunktion wird bereitgestellt durch Verwendung eines viralen Replikationsursprungs und Bereitstellung eines oder mehrerer viraler Replikationsfaktoren, die benötigt zur Replikation werden, vermittelt durch diesen speziellen viralen Ursprung. Replikationsursprünge und, wenn nötig, jeder Replikationsfaktor aus einer Vielzahl von Viren kann verwendet werden, einschließlich Epstein-Barr-Virus (EBV), menschliche und Rinder- Papilloma-Viren und des Papova-Virus BK.
In einer bevorzugten Ausführungsform, ist der virale Replikationsursprung der OriP des EBV und der Replikationsproteinfaktor ist das trans-acting EBNA-1-Protein. EBNA-1 kann bereitgestellt werden durch Expression des EBNA-1- Gens auf dem gleichen episomalen Expressionsvektor, der den OriP trägt oder auf einem anderen Vektor in der Zelle oder von einem EBNA-1-Gen in der genomischen DNA der Wirtszelle.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Gen, das einen viralen Replikationsvektor kodiert, anwesend sein auf dem selbst replizierenden episomalen Vektor, das heißt entweder auf demselben Vektor, der das interessierende Gen trägt oder auf einem anderen Vektor eines Vektorpaars und operativ gebunden sein an eine LCR.
Wie hier verwendet, bezieht sich "gebunden" auf eine cis- Bindung, in welcher das interessierende Gen und/oder das einen viralen Replikationsfaktor kodierende Gen, und die LCR in demselben Vektor enthalten sind und sich deshalb in eis auf derselben DNA befinden, und "operativ gebunden" bezieht sich auf eine cis-Bindung, in welcher das interessierende Gen und/oder das virale Replikationsgen einer gewebsbegrenzten Expression via die LCR ausgesetzt wird/werden.
Optional kann ein Transkriptionsterminator in einen erfindungsgemäßen Vektor eingeführt werden, bevorzugt zwischen die LCR oder deren Komponente und dem Promotor des/der interessierenden Gens/e, welches/e virales Replikationsprotein oder virale Replikationsproteine kodieren, um die ungewünschte Transkription dieser Gene durch andere Promotoren, die auf den Vektoren anwesend sein können, zu verhindern. Alternativ kann ein Transkriptionsterminator upstream der LCR eingeführt werden und downstream des interessierenden Gens oder des/der viralen Replikationsgen/e.
Die erfindungsgemäßen episomalen Expressionsvektoren können in die Zellen eingetragen werden in vivo, ex vivo oder in vitro nach jedem der Vielzahl von Verfahren, die angewendet werden, um DNA-Moleküle einer Zelle zuzuführen. Die Vektoren können auch alleine oder in Form einer pharmazeutischen Zubereitung zugeführt werden, die die den Transport in die Zellen des Körper erhöht.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen Vektoren in der Gentherapie verwendet, um im Körper ein therapeutisch nützliches Protein in den Zellen eines spezifischen, erkrankten Gewebes, einschließlich Tumor-Gewebe, zu exprimieren.
Erfindungsgemäße Vektoren werden auch verwendet, um ein therapeutisch nützliches Protein in vitro in den Zellen eines speziellen Gewebetyps zu exprimieren.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die hierin beschriebenen Vektoren verwendet, um einen Typ von transgenem Tier zu erzeugen, in welchem ein fremdes oder heterologes Gen nur in einem speziellen Gewebetyp exprimiert wird, so wie es durch die im Vektor inkorporierte LCR oder deren Komponente gesteuert wird. Die Selbstreplizierungsfunktion des Vektors stellt sicher, dass der Vektor an die Nachkommenschaft des transgenen Tieres weitergegeben wird. Solche transgenen Tiere sind besonder nützlich um die Beweglichkeit und Wirksamkeit der gewebsspezifischen Genexpression zu testen, vor der klinischen Behandlung von Menschen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, zur Identifizierung einer LCR oder deren Komponente, welche wenn sie enthalten ist in einem episomalen DNA- Expressionsvektor, der operativ gebunden ist an ein interessierendes Gen und anwesend ist in einer Wirtszelle, die Expression des genannten Gens in einer gewebsbegrenzten Weise steuert, umfassend:
(i) das Untersuchen der LCR oder deren Komponente durch Transfizieren eines episomalen Vektors, welcher die Kandidaten-LCR oder deren Komponente enthält, operativ gebunden an ein Markergen, in einer Zelllinie, in welcher die LCR aktiv ist, wenn sie integriert ist, und auch in einer Zelllinie, in welcher die LCR inaktiv ist, wenn sie integriert ist; und
ii. Identifizieren der LCR oder deren Komponente, welche nur aktiv in der Zellinie ist, in welcher die LCR aktiv ist, wenn diese integriert ist.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung finden sich in den folgenden Zeichnungen, der Beschreibung und den Ansprüchen.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 zeigt eine schematische Karte eines auf einem EBV basierenden, selbst replizierenden Expressionsvektors p 220,0. p 220,2 ist ein 8952 bp Plasmid, welches EBNA-1, OriP und Hygromycin-Resistenz kodiert. Er repliziert als Plasmid in 143 und HeLa-Zellen. EBNA-I in diesem Konstrukt ist entnommen aus einem unbekannten Promoter, lokalisiert in der pBR322-Sequenz. DNA upstream von EBNA-1 insertiert scheint die Expression von EBNA-1 zu eliminieren, bp 1-35 sind pBR322. bp 36-2646 sind EBV EBNA-1 107567-110176 (Baer et al., Nature.; 310: 207-211, 1984) BamHI-PvuII-Fragment. Die BAMHI-Stelle wurde blunt-end an die HindIII-Stelle ligiert. bp 2647-4826 sind EBV OriP 7333-9516 Sphl-SstlI-Stellen blunt-end ligiert an die BstEII-Stelle (Sugden et al., MCB, 5: 410-413, 1985). bp 4827-5460 sind HSV TK regulierende Region (McKnight, NAR, 8: 5949-5964, 1980). bp6488-6747 sind ein HSV TK PvuII- Fragment ligiert an ungiftiges pBR322 an der NaeI-Stelle. Diese Stelle wurde beim Klonieren verloren, bp 5461-6487 sind das HPH-Gen (Gritz und Davies, Gene, 25: 179-188, 1983). Das BamHI-Fragment, blunt-end ligiert an die SmaI- und BglII-Stellen der HSV TK Sequenzen, bp 6748-8952 sind pBR322 ungiftiger Vektor (Deletion von 1,1 kb in pBR322) überträgt Ampicillin-Resistenz (Lusky und Botchan, Nature 293: 79-81, 1981). Die Polylinker-Form pUC 12 (Smal-HaeIII Fragment)wird eingeführt in eine NarI-Stelle innerhalb der HSV TK Sequenzen. (/) kennzeichnet blunt-end- Ligation.
Fig. 2 zeigt ein Reportergenkonstrukt:
a) Das β-Globin-Gen erstreckt sich von einer 5' Hpa-I- Stelle bei 815 bp zu einer EcoRV-Stelle 1685 bp hinter der Poly-A-Additionsstelle im Plasmid GSE1758 (Talbot et al., EMBO J. 9: 2169-2178, (1990)) und wurde als ein 4,1 kb EcoRV-Fragment entfernt und eingeführt in eine abgestumpfte Sall-Stelle im Polylinker von p220,2 (Fig. 1). Dieser Klonierungsschritt bringt eine Anzahl zusätzlicher Restriktionsstellen (einschließend einer einzigartigen SaII-Stelle) 5' des β-Globin-Gens.
Fig. 3 zeigt β-Globin-LCR-Konstrukte mit hypersensitiven Stellen. Konstrukte, welche mehr als eine hypersensitive Stelle enthalten werden so konstruiert, dass die Anordnung (site-order) zu der des Wild-Typ-β-Globin Locus passt. SalI-Linker werden sowohl zu den 5'- als auch zu den 3'-Enden zugegeben, der DNA ermöglichend, in eine einzigartige SalT-Stelle kloniert zu werden, upstream des β-Globin-Gens im p220,2 Reportervektor (Fig. 2).
Fig. 4 zeigt:
a) Ein Autoradiogramm einer SI-Nuklease-Analyse von RNA aus K562-Zellen, transfiziert mit selbst replizierenden, episomalen Expressionsvektoren, enthaltend ein menschliches β-Globin-Reportergen, operativ gebunden an verschiedene Kombinationen von HS-Komponenten aus der β-Globin- LCR. Bande β 1 (β-Globin-Gen allein), Banden 2 β 1 und 2 (HS2 operativ gebunden an β-Globin-Gen), Banden 3 β 1 und 2 (HS3 operativ gebunden an β-Globin-Gen), Banden 4 β 1 und 2 (HS4 operativ gebunden an β-Globin-Gen), Banden 4 β 1 und 2 (HS4 operativ gebunden an β-Globin-Gen), Banden 23β 1 und 2 (HS2/HS3-Kombination operativ gebunden an β- Globin-Gen), Banden 34β 1 und 2 (HS3/HS4-Kombination operativ gebunden an β-Globin-Gen), Banden 24β 1 und 2 (HS2/HS4-Kombination operativ gebunden an β-Globin-Gen), Banden 234β 1 und 2 (HS2/HS3/HS4-Kombination operativ gebunden an β-Globin-Gen). Bande +Gamma bezieht sich auf untransfizierte K562-Zellen als negative Kontrolle und Bande +beta bezieht sich auf MEL-Zellen transfiziert mit einem β-Globin-Gen plus ßLCR-Kombination, welche als positive Kontrolle fungieren. Alle Banden sind unabhängige Transfektionen.
b) End-markierte DNA-Sonden der 5'-Region des β-Globin- Gens sind schematisch gezeigt, einschließlich der S1- geschützten Fragmente.
Fig. 5 stellt Autoradiogramme von RNA-Blots von hierin beschrieben K562- oder HeLa-Zellen enthaltenden Konstrukten dar. In Tafel A: Bande M ist ein Hlnfl-Verdau von pBR322-Größenmarkern; Bande P ist RNA aus MEL-Zellen, stabil transfiziert mit menschlichem β-Globin-Gen als positive Kontrolle; Bande β ist das menschliche β-Globin- Gen allein; Bande 2β ist das menschliche β-Globin-Gen unter der Kontrolle von β-Globin-LCR-HS2; Bande 3β ist das menschliche β-Globin-Gen unter der Kontrolle von β- Globin- LCR-HS3 und Bande 5β ist das menschliche β- Globin-Gen unter der Kontrolle von β-Globin-LCR-HS2, -HS3 und -HS4; und Bande N sind untransfizierte K562-Zellen als negative Kontrolle. In Tafel B, sind die Banden die gleichen wie angegeben für Tafel A, ausgenommen, dass Bande N untransfizierte HeLa-Zellen als negative Kontrolle sind.
Fig. 6 zeigt ein Autoradiogramm einer SI-Nuklease- Analyse von RNA aus K562-Zellen, transfiziert mit selbst replizierenden, episomalen Expressionsvektoren, ein β- Globin-Reportergen enthaltend, operativ gebunden an verschiedene Kominbationen von HS-Komponenten aus der β- Globin-LCR. Bande M ist ein Marker; Bande β ist β-Globin- Gen alleine; Bande 2β ist β-Globin-LCR HS2; Banden 3β sind β-Globin-LCR HS3; Banden 4β sind β-Globin-LCR HS4; Banden 23β sind β-Globin-LCR HS2 und HS3; Banden 34β sind β-Globin-LCR HS3 und HS4; Banden 24β sind β-Globin-LCR HS2 und HS4; Banden 234 β sind β-Globin-LCR HS2, HS3 und HS4; Banden 234βi sind β-Globin-LCR-HS2-, -HS3- und -HS4- Konstrukt als stabiler Integrant; Banden βi sind das β- Globin-Gen alleine als stabiler Integrant; Bande N sind untransfizierte K562-Zellen als negative Kontrolle; und Bande P sind untransfizierte MEL-Zellen, stabil transfiziert mit dem menschlichen β-Globin-Gen als positive Kontrolle. Alle Banden sind unabhängige Transfektionen.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Der Inhalt aller Referenzen, auf die hier Bezug genommen wird, wird hiermit als Referenz inkorporiert.
Die Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass eine Locus Kontrollregion oder deren Komponente verwendet werden kann in einem stabil selbst replizierenden episomalen Vektor, der ein interessierendes Gen enthält um gewebsbegrenzte Expression eines interessierenden Gens zu spezifizieren.
Die Stabilerhaltung eines episomalen Vektors, der eine LCR in einer Wirtszelle enthält, wird erreicht durch Verwendung eines Replikationsursprungs, der wirksam ist eine episomale DNA zu initiieren und zu replizieren, unabhängig von den Wirtszellenchromosomen und einem Replikatiosursprungsfaktor.

Erfindungsgemäß geeignete Replikationsursprünge und Replikationsfaktoren

Plasmidvektoren zur Expression von heterologen Genen in eukaryotische Zellen wurden hergestellt, unter Verwendung eines Teils der genomischen DNA eines oder mehrerer eukaryotischer Viren, wie den Epstein-Barr-Virus, den menschlichen Papova-Virus BK, Adneovirus-basierte Vektoren und Rinder- und menschliche Papilloma-Viren. Erfindungsgemäße episomale Vektoren umfassen einen Teil einer genomischen Virus-DNA, die einen Replikationsursprung (ori) kodiert, welcher für solche Vektoren benötigt wird, um selbst replizierend zu sein und deshalb in einer Wirtszelle für mehrere Generationen zu persistieren. Zusätzlich kann ein erfindungsgemäßer, episomaler Vektor auch ein oder mehrere Gene enthalten, die virale Proteine kodieren, die für die Replikation benötigt werden, das heißt Replikatorprotein(e).
Optional, das/die Replikatorprotein/e, welche helfen die Replikation zu initiieren, können in trans an einem anderen DNA-Molekül exprimiert werden, so wie an einem anderen Vektor oder an einer genomische Wirts-DNA, in der Wirtszelle, einen erfindungsgemäßen, episomalen, selbst replizierenden Expressionsvektor enthaltend.
Erfindungsgemäß bevorzugte, selbst replizierende, episomale, LCR-enthaltende Expressionsvektoren enthalten keine viralen Sequenzen, die nicht benötigt werden für Langzeit-Stabilerhaltung in einer eukaryotischen Wirtszelle und welche in der Gesamtlänge eines viralen genomischen DNA-Moleküls vorhanden sein können, wie Kern- oder Hüllproteine- kodierende Regionen einer viralen genomischen DNA, die infektöse, virale Parikel oder virale, onkogene Sequenzen produzieren würden.
Der hierin erwähnte Begriff "Stabilerhaltung", bezieht sich auf die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen, selbst replizierenden, episomalen Expressionsvektor zu persistieren oder erhalten zu bleiben in nicht-teilenden Zellen oder in Nachkommenzellen von teilenden Zellen, in Abwesenheit kontinuierlicher Selektion ohne einen signifikanten Verlust (d. h. > 50%) an Kopienzahl des Vektors für zwei und bevorzugter Weise fünf oder mehr Generationen. Die am stärksten bevorzugten Vektoren bleiben über 10-15 oder mehr Zellgenerationen erhalten.
Im Gegensatz dazu bezieht sich "transiente" oder "Kurzzeit-"Persistenz eines Plasmids in einer Wirtszelle auf die Unfähigkeit eines Vektors, in einer Wirtszelle in stabiler Weise zu replizieren oder zu segregieren; das heißt der Vektor geht nach einer oder zwei Generationen verloren oder wird einen Verlust von > 51% seiner Kopien- Zahl zwischen aufeinander folgenden Generationen, erleiden.
Verschiedene repräsentative erfindungsgemäße selbst replizierende, LCR-enthaltende, episomale Vektoren werden weiter unten beschrieben. Die selbst replizierende Funktion kann alternativ bereitgestellt werden durch eine oder mehre Sequenzen vom Säugetier, wie beschrieben durch Wohlgemuth et al., 1996, Gene Therapy 3: 503; Vos et al., 1995, Jour. Gell. Biol., Supp. 21A, 433; und Sun et al., 1994, Nature Genetics 8: 33, optional in Kombination mit einer oder mehr Sequenzen, die zur Zellkernretention benötigt werden. Der Vorteil der Verwendung von Säugetier-, speziell menschlichen Sequenzen zur Bereitstellung der selbst replizierenden Funktion ist, dass keine fremden Aktivierungsfaktoren benötigt werden, die toxische oder onkogene Eigenschaften haben könnten. Jeder Fachmann wird verstehen, dass die Erfindung nicht begrenzt ist auf irgendeinen Replikationsursprung oder irgendeinen episomalen Vektor, sondern die Kombination der gewebsbegrenzten Kontrolle einer LCR in einem episomalen Vektor umfasst.
1. Erfindungsgemäß geeignete Epstein-Barr-Virus-basierte episomale Expressionsvektoren.
Der latente Ursprung oriP des Epstein-Barr-Virus (EBV) wird beschrieben in Yates et al., Proc. Natl. Acad. Bei. USA 81: 3806-3810 (1984); Yates et al., Nature 313: 812-815 (1985); Krysan et al., Mol. Cell. Biol. 9: 1026-1033 (1989); James et al., Gene 86: 233-239 (1990), Peterson und Legerski, Gene 107: 279-284 (1991) und Pan et al., Som. Cell Molec. genet. 18: 163-177 (1992). Ein erfindungsgemäß geeigneter, EBV-basierter, episomaler Vektor wird die oriP-Region des EBV enthalten, welche getragen wird von einem 2,61 kb Fragment des EBV (s. Fig. 1) und das EBNA-1-Gen, das getragen wird von einem 2,18 kb Fragment des EBV (s. Fig. 1). Ein Vektor, der die oriP und das EBNA-1-Gen des EBV trägt, wird in Fig. 1 gezeigt. Der in Fig. 1 gezeigte Vektor enthält auch ein antibiotisches Resistenzgen zur Selektion von stabil transfizierten, eukaryotischen Zellen in Kultur, eine Polylinkerklonierungsstelle zur Insertion eines interessierenden Gens und einen Teil von pBR322 zur Produktion einer Vektor-DNA in bakteriellen Wirtszellen.
Das EBNA-1-Protein, welches das einzige virale Genprodukt ist, das benötigt wird, episomale in trans Replikation von oriP-enthaltenden Vektoren zu unterstützen, kann bereitgestellt werden auf demselben episomalen oriP-enthaltend Expressionsvektor (siehe zum Beispiel James et al., supra; Peterson und Legerski, supra; Pan et al., supra). Es ist klar, dass so wie mit jedem Protein wie EBNA-1, welches bekannt dafür ist, das es benötigt wird, um die Replikation viraler Plasmide in trans zu unterstützen, das Gen auch auf einem anderen DNA-Molekül exprimiert werden kann, wie auf einem anderen DNA-Vektor oder der genomischen Wirts-DNA, in der Wirtszelle, die den erfindungsgemäßen, episomalen Expressionsvektor enthält.
2. Erfindungsgemäß geeignete, Papilloma-Virsu-basierte, selbst replizierende, episomale Expressionsvektoren.
Die erfindungsgemäßen, episomalen Expressionsvektoren können auch auf Replikationsfunktionen der Papilloma- Virus-Familie basieren, einschließend aber nicht begrenzt auf den Rinder-Papilloma-Virus (BPV) und menschliche Papilloma-Viren (HPVs). BPV und HPVs persistieren als stabil erhalten bleibende Plasmide in Säugetier-Zellen. Trans-acting Faktoren, kodiert durch BPV und HPVs, namentlich E1 und E2, welche notwendig und ausreichend sind für die vermittelte Replikation in vielen Zelltypen via minimale Replikationsursprünge, sind auch identifiziert worden (Ustav et al., EMBO J. 10: 449-457 (1991); Ustav et al., EMBO J. 10: 4231-4329, (1991); Ustav et al., Proc. Natl. Acad. Bei. USA 90: 898-902 (1993)).
Ein erfindungsgemäß geeigneter, episomaler Vektor ist das BPV-I-Vektorsystem, beschrieben in Piirsoo et al., EMBO J., 15: 1 (1996) und in WO 94/12629. Das BPV-1- Vektorsystem, beschrieben in Piirsoo et al., umfasst ein Plasmid, das den BPV-1-Replikationsursprung (minimaler Ursprung plus extrachromosomales Erhaltungselement) und optional die E1- und E2-Gene beherbergt. Die BPV-1 E1- und E2-Gene werden zur Stabilerhaltung eines episomalen BPV-Vektors benötigt. Diese Faktoren stellen sicher, dass das Plasmid repliziert wird zu einer stabilen Kopienzahl von bis zu 30 Kopien pro Zelle, unabhängig vom Zellzyklus-Status. Das Genkonstrukt persistiert deshalb stabil, sowohl in teilenden wie auch nicht-teilenden Zellen. Das erlaubt die Erhaltung des Genkonstrukts in Zellen wie hämopoetische Stammzellen und stärker festgelegten Präkursor-Zellen.
Der BPV-Replikationsursprung wurde lokalisiert am 3'-Ende upstream der Regulationsregion innerhalb eines 60 Basenpaar-(bp)-DNA-Fragmentes (Nukleotide (nt) 7914-7927), welches Bindungsstellen für E1- und E2- Replikationsfaktoren einschließt. Der minimale Replikationsursprung des HPV wurde auch im URR-Fragment charakterisiert und lokalisiert (nt 7022-7927) des HPV (siehe zum Beispiel Chiang et al., Proc. Natl. Acad. Bei. USA 89: 5799-5803 (1992)).
Wie hierin verwendet bezieht sich "E1" auf das Protein, kodiert durch Nukleotide (nt) 849-2263 des BPV-Subtyp 1 oder durch nt 832-2779 des HPV-Subtyp 11, auf äquivalente E1-Proteine anderer Papilloma Viren oder auf funktionale Fragmente oder Mutanten des Papilloma-Virus-E1-Proteins, das heißt Fragmente oder Mutanten von E1, welche die Replikationseigenschaften von E1 besitzen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "E2" auf das Protein, kodiert durch nt 2594-3837 des BPV-Subtyp 1 oder durch nt 2723-3823 des HPV-Subtyp 11, auf äqivalente E2-Proteine anderer Papilloma-Viren oder auf funktionale Fragmente oder Mutanten des Papilloma-Virus-E2-Proteins, das heißt Fragmente oder Mutanten von E2, welche die Replikationseigenschaften von E2 besitzen.
"Minichromosomales Erhaltungselement" (MME) bezieht sich auf das extrachromosomale Erhaltungselement des Papilloma-viralen Genoms, an welches virale oder menschliche Proteine im Wesentlichen zur Papilloma-viralen Replikation binden und die Region wesentlich ist zur stabilen, episomalen Erhaltung der Papilloma-viralen MO in einer Wirtszelle, wie beschrieben von Piirsoo et al. (supra). Bevorzugterweise ist MME eine Sequenz, die multiple Bindungsstellen für den Transkriptionsaktivator E2 enthält. Die MME in BPV ist hierin definiert als die Region des BPV, lokalisiert innerhalb der upstream Regulationsregion, welche ein Minimum von ungefähr sechs E2- Sequenzbindungsstellen einschließt und welche optimale Stabilerhaltung ergibt mit ungefähr zehn E2- Sequenzbindungsstellen. Die E2-Bindungsstelle 9 ist eine für diese Stelle bevorzugte Sequenz, wie hierin weiter unten beschrieben, worin die Sequenzstellen getrennt werden durch einen Spacer von ungefähr 4-10 Nukleotiden und optimalerweiser 6 Nukleotiden. E1 und E2 kann dem Plasmid entweder in eis oder in trans bereitgestellt werden, auch wie beschrieben in WO 94/12629 und in Piirsoo et al. (supra).
"E2-Bindungsstelle" bezieht sich auf die Minimalsequenz der doppelsträngigen Papilloma-Virus-DNA, an welche das E2-Protein bindet. Eine E2-Bindungsstelle kann die Sequenz 5'ACCGTTGCCGGT 3' einschließen, welche die hochaffine E2-Bindungsstelle 9 des BPV-1 URR ist; alternativ kann eine E2-Bindungsstelle Permutationen der Bindungsstelle 9 einschließen, wobei die Permutationen innerhalb der URR gefunden werden und in die generische E2- Bindungssequenz 5' ACCN6GGT 3' fallen. Eine oder mehrere Transkriptionsaktivator-E2-Bindungsstellen sind in den meisten Papilloma-Viren in der upstream Regulationsregion lokalisiert, wie in BPV und HPV.
Ein Vektor, der auch erfindungsgemäß geeignet ist, kann einschließen eine Region des BPV zwischen 6959-7945/1-470 auf der genetischen Karte des BPV (wie beschrieben in WO 94/12629), wobei die Region einschließt einen Replikationsursprung, einen ersten Promotor, operativ verbunden mit einem interessierenden Gen, das BPV-E1-Gen operativ verbunden mit einem zweiten Promotor, um die Transkription des E2-Gens zu steuern.
E1 und E2 aus BPV werden Vektoren replizieren, die den BPV-Ursprung oder den Ursprung vieler HPV-Subtypen enthalten (Chiang et al., supra). E1 und E2 aus HPV werden Vektoren replizieren via den BPV-Ursprung oder via den Ursprung vieler HPV-Subtypen (Chiang et al., supra). So wie bei allen erfindungsgemäßen Vektoren, müssen die BPV- basierten, erfindungsgemäßen, episomalen Expressionsvektoren über 2-5 oder mehr Teilungen der Wirtszelle persistieren.
3. Erfindungsgemäß geeignete, Papova-Virus-basierte, selbst replizierende, episomale Expressionsvektoren.
Die erfindungsgemäßen Vektoren können auch von genomischen, menschlichen Papova-Virus-BK-DNA-Molekülen abgeleitet werden. Zum Beispiel kann das BK-Virusgenom verdaut werden mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI um ein 5 Kilobasen(kb)-Fragment zu ergeben, das die BK- virale Replikationsursprungssequenz enthält, das die stabile Erhaltung auf Vektoren übertragen kann (siehe zum Beispiel De Benedetti and Rhoads, Nucleic Acids Res. 19 : 1925 (1991)), wie es ein 3,2 kb-Fragment des BK-Virus kann (Cooper und Miron, Human Gene Therapy 4: 557 (1993)).
4. Regulation der Expression des Replikationsursprungs- Faktors.
Wie oben bemerkt, können die erfindungsgemäßen Vektoren ein oder mehr Gene enthalten, die einen trans-acting viralen Replikationsfaktor kodieren, benötigt zur Stabilerhaltung der Vektoren in Wirtszellen. Die regulatorischen Elemente, z. B. Promotoren, Enhancer, LCRs, welche die Expression des/der Replikatorgens/e steuern, können infolgedessen identisch oder verschieden sein und können identische oder überlappende Gewebsspezifität zur LCR bereitstellen, wie zum Beispiel für einen Tumor, der in B- Zellen exprimiert wird, der Immunglobulin-H-Ketten- Promotor/-Enhancer für B-Zellen und die Ig H- oder L- Ketten-Promoter für Blutzellen-Expression oder für Tumore, die anwesend sind in einem nicht spezifizierten Zell- Typ, und auch einen Promoter von einem ubiquitär exprimierten Gen enthalten können, zum Beispiel von der Phosphoglycerin-Kinase, IE-CMC, RSV-LTR oder DHFR-Genen. Die Anordnung des/der Replikatorgens/e relativ zum episomalen Vektorreplikationsursprung kann die natürlichen Orientierungen dieser Sequenzen im Virusgenom nachahmen, oder sie kann eine Vielzahl anderer Orientierungen annehmen, deren Auswahl für einen Fachmann offensichtlich sein wird.
In EBV-basierten, episomalen Vektoren ist es häufig bevorzugt, dass die Transkription eines viralen Gens, das einen Replikationsfaktor kodiert, unter die Kontrollle eines relativ schwachen Promotors gestellt wird. Zum Beispiel kann die Expression des Gens, das EBNA-1 kodiert, toxisch sein für die meisten Zellen und/oder in unerwünschten Umlagerungen in Vektorsequenzen resultieren, wenn das Gen unter Verwendung des CMV-Promoters exprimiert wird, einem gut bekannten, relativ starken, eukaryotischen Promoter. Im Gegensatz dazu erlaubt die Expression des EBNA-1-Gens, eine relativ schwache eukaryotische Promotorsequenz verwendend, derart zu wirken, um einen wünschenswerten Grad (d. h. einen Grad, der für die Zellen in der Kultur nicht toxisch ist) der Vektorreplikation in der Wirtszelle zu erhalten. Solche relativ schwachen Promotorsequenzen, geeignet in den erfindungsgemäßen Vektoren, werden in einem Teil der Sequenz des bakteriellen Plasmids pBR322 und im Thymidinkinase(tk)- Promotor gefunden.
Bevorzugte Promotoren zur E1- und E2-Expression in Papilloma-basierten Vektoren schließen den Thymidinkinase- Promotor, den frühen SV40-Promotor, den CMV-Promotor und den SRoc-Promoter-5-Manufacture der Vektor-DNA ein.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Vektoren hergestellt, umfassend das Züchten einer Zelle, die den Vektor der vorliegenden Erfindung enthält, um ausreichend DNA zur erfindungsgemäßen Verwendung zu produzieren. Es ist besonders bevorzugt, dass solche Herstellung in niederen eukaryotischen Zellen stattfindet, z. B. in Hefe oder Insekten, oder prokaryotischen Zellen, z. B. Bakterienzellen wie E. coli oder Salmonella. Deshalb ist es bevorzugt, dass ein erfindungsgemäßer Vektor weiterhin umfassen wird einen Replikationsursprung von Hefe, einem Insekt oder bakteriellen Ursprungs, z. B. den pBR322-Replikationsursprung und ein oder mehr, einen selektierbaren Marker kodierende Gene, z. B. ein die Kanamyzin-Resistenz kodierendes Gen, zur Selektion von Zellen, die den Vektor und/oder Markergen enthalten, wie Lac Z.

Erfindungsgemäß geeignete LCRs und deren Komponeneten zur Bereitstellung gewebsspezifischer Genexpression

Die Erfindung beabsichtigt die Kombination eines stabil selbst replizierenden, episomalen Vektors und einer Locus Kontrollregion oder deren Komponente, zur gewebstypbegrenzten Expression eines im Vektor enthaltenen Gens.
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein wird angenommen, dass in der Umgebung der genomischen DNA die LCR eine Öffnung der normalerweise fest gewundenen Struktur des Chromatins in Zellen eines spezifischen Gewebetyps steuert und deshalb die Transkription der Gene in einer gewebsspezifischen Weise, in der Region des geöffneten Chroamtins erlaubt.
Zusätzlich sind LCRs befähigt, gewebsbegrenzte Genexpression zu übertragen, ob sie upstream oder downstream eines gebundenen Gens lokalisiert sind und ungeachtet der Orientierung bezüglich des Gens. LCRs, geeignet in einem erfindungsgemäßen, episomalen Vektor, können upstream oder downstream oder in jeder Orientierung bezüglich des gebundenen Gens platziert werden.
Vor der Erfindung war es nicht bekannt ob eine LCR, wenn in einer eher episomalen als chromosomalen Umgebung anwesend, gewebsbegrenzte Genexpression übertragen könnte. In der transienten Transfektion eines Vektors wurde weiterhin gefunden, dass die LCR-Komponenten die Expressionsstärke so lange nicht erhöhen, bis die LCR-Komponente ein klassisches Enhancer-Element einschließt (Tuan et al., 1989, Proc. Nat. Aca. Bei. 86: 2544).
In den hierin beschriebenen, selbst replizierenden, episomalen Expressionsvektoren ist eine LCR oder deren Komponente operativ gebunden an ein ausgewähltes Gen, anwesend auf dem Vektor, so dass die Genexpression nur in Zellen des speziellen Gewebetyps stattfindet, in welchem von der LCR oder deren Komponente bekannt ist, dass sie wirkt. Obwohl eine Begrenzung auf einen bestimmten Mechanismus nicht gewünscht wird, würde es scheinen, dass die hierin beschriebenen, selbst replizierenden Vektoren in einer Konformation stabil erhalten werden, gleich der des natürlichen Chromatins der Wirtszelle, welches die LCR oder deren Komponente zu öffnen befähigt ist und/oder dann die Transkription von Sequenzen zu steuern, an welche die LCR oder deren Komponente gebunden ist.
Ob eine LCR oder Komponente oder Kombination deren Komponenten, verwendet werden kann, gewebsspezifische Expression eines hetreologen Gens zu unterstützen, wird im allgemeinen einfach geprüft, unter Verwendung eines selbst replizierenden, episomalen Vektors, der eine LCR oder deren Komponente enthält, operativ gebunden an ein Reportergen. Die Expression des Reportergens in einer gewebsspezifischen Weise kann unter Verwendung von Standardmethoden untersucht werden und durch Vergleich der Reportergenexpression in Zellen des Gewebetyps, für welchen die LCR spezifisch ist, mit der Reportergenexpression in Zellen eines anderen Gewebetyps. Eine Vielzahl an Reportergenen und Reportergene enthaltende Vektoren sind kommerziell erhältlich, welche verwendet werden können, um die Promoter- und/oder Enhancer-Funktionen zu testen. Standard-Reportergene, die im Stand der Technik verwendet werden, schließen ein das die β-Galactosidase kodierende lacZ-Gen, das die Chloramphenicolacetytransferase kodierende CAT-Gen, das Luciferasegensystem und die Gene, die alkalische Phosphatasen kodieren (siehe zum Beispiel James et al., (supra); Peterson und Legerski, (supra); Pan et al., (supra)).
Zum Beispiel enthält die β-Globin-LCR wohldefinierte Teile, welche DNA-Fragmente sind, die DNase-I-hypersensitive Stellen einschließen, z. B. HS1, HS2, HS3 und HS4, lokalisiert upstream der fötalen Globin-Gene im β-Globin Locus; solche Stellen und ihr Nachweis ist beschrieben in Tuan et al., supra, (1985). Es wurde gefunden, dass wenn eine Kombination von HS2-, HS3- und HS4-Komponenten in einem erfindungsgemäßen, episomalen Vektor verwendet wird, die Kombination von LCR-Komponenten, HS2 enthaltend, nicht die gewebsspezifische Expression eines heterologen Gens in Erythroidenzellen überträgt; entsprechend überträgt eine Kombination von HS2 und HS3 keine gewebsspezifische Expression. Es ist jedoch auch gefunden worden, dass die HS3-Komponente alleine effektiv ist in der Übertragung gewebsspezifischer Expression eines gebundenen Gens, wie in den Beispielen unten gezeigt; jedoch besitzt die HS2-Komponente, die als Enhancer bekannt ist, keine Aktivität, wenn sie als alleinige LCR- Komponente auf dem episomalen Vektor anwesend ist. Es kommt erfindungsgemäß in Betracht, dass die Abwesenheit von HS2 in der episomalen β-Globin-LCR in gewebsspezifischer Genexpression resultiert.
Zusätzliche, erfindungsgemäß geeignete LCRs schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf die CD2-LCR, welche die Genexpression in T-Zellen steuert (siehe zum Beispiel Greaves et al., (supra)), die makrophagenspezifische Lysozym-LCR (Bonifer et al., (supra)) und eine Klasse II MHC-LCR (Carson et al., (supra)).
Ein Fachmann kann, wenn er der den Vorteil dieser Offenbarung nutzt, welche eine β-Globin-LCR-Komponente identifiziert, die gewebsspezifische Genexpression überträgt, wenn sie von einem Episom getragen wird, und Verfahren zum Finden andere solcher LCRs oder deren Komponenten, und auf diesem Fachgebiet verfügbare Techniken nutzt, zusätzliche LCRs oder deren Komponenten identifizieren, welche wenn sie auf einem episomalen Vektor getragen werden, gewebsspezifische Genexpression übertragen.
Um eine Komponente einer LCR zu identifizieren, die erfindungsgemäß geeignet ist (z. B. in einer episomalen Umgebung), kann ein Fachmann jede LCR oder deren Komponente individuell (z. B. die DNase-I-hypersensitive Stelle einer LCR) durch Transfektion eines episomalen Vektors testen, der die Kandidaten-LCR-Komponente und ein Markergen entält, in eine Zelllinie, in der die LCR aktiv ist (d. h. aktiv, wenn in das Genom integriert (spezifische Zelllinie)) und auch in die Zelllinie, in welcher die LCR bekanntermaßen inaktiv ist (d. h. inaktiv, wenn in das Genom integriert (nicht spezifische Zelllinie)). Wenn der Selektion für stabile Episomen gefolgt wird, die LCR- Komponente aktiv in der nicht-spezifischen Zelllinie ist, d. h. anzeigend, dass die LCR-Komponente nicht gewebsspezifisch ist (so wie HS2 der β-Globin-LCR), dann wird die LCR-Komponente als eine erfindungsgemäß geeignete Kandidaten-LCR-Komponente ausgeschlossen. Eine LCR-Komponente, die nicht aktiv ist in der nicht-spezifischen Zelllinie, aber aktiv ist in der spezifischen Zelllinie, ist erfindungsgemäß dadurch geeignet, dass sie Gewebsspezifität in der Umgebung eines stabilen Episoms überträgt. LCR- Komponenten, die als erfindungsgemäß geeignet angegeben werden, können dann kombiniert und zusammen verwendet werden um möglicherweise verstärkte, gewebsspezifische Expression zu ergeben.
Optional können auch einer oder mehr Transkriptionsterminatoren in die erfindungsgemäßen Vektoren inkorporiert werden, um unerwünschte Transkription anderer bekannter oder latenter Promotorsequenzen im Vektor zu verhindern, welche sich durch das Gen fortsetzen könnten (d. h. Transkriptions-Readthrough), dessen Expression unter die ausschließliche Kontrolle einer bestimmten LCR oder deren Komponente gestellt wurde. Ein Beispiel eines solchen geeigneten Transkriptionsterminators ist der β-Globin- Terminator, obwohl andere eukaryotische Transkriptionsterminatoren auch in den hier beschriebenen Vektoren verwendet werden können. Bevorzugterweise ist der Transkriptionsterminator platziert zwischen die LCR oder deren Komponente und den Promotor des Gens, an welches die LCR operativ gebunden ist.

Auswählen heterologer oder fremder, interessierender Gene

Die erfindungsgemäßen Vektoren sind besonders geeignet um heterologe oder fremde Gene in Zellen eines spezifischen Gewebetyps zu exprimieren.
Beispiele für therapeutische Nukleinsäuresequenzen, die in einen episomalen Vektor inkorporiert werden können schließen die folgenden ein. Therapeutisch geeignete Nukleinsauresequenzen schließen Sequenzen ein, die Rezeptoren, Enzyme, Liganden, regulatorische Faktoren und Strukturproteine kodieren. Therapeutische Nukleinsauresequenzen schließen auch Sequenzen ein, die Zellkern-Proteine, zytoplasmatische Proteine, mitochondriale Proteine, sezernierte Proteine, Plasmalemma-assoziierte Proteine, Serum-Proteine, virale Antigene, bakterielle Antigene, Protozoen-Antigene und Parasiten-Antigene kodieren. Erfindungsgemäß geeignete Nukleinsauresequenzen schließen auch Sequenzen ein, die Proteine, Lipoproteine, Glykoproteine, Phosphoproteine und Nukleinsäuren (z. B. RNAs oder Antisense-Nukleinsäuren) kodieren. Proteine oder Polypeptide, die exprimiert werden können, die episomalen Vektor der vorliegenden Erfindung verwendend, schließen ein Hormone, Wachstumsfaktoren, Enzyme, Gerinnungsfaktoren, Apolipoproteine, Rezeptoren, Arzneimittel, Onkogene, Tumorantigene, Tumorsuppressoren, virale Antigene, parasitische Antigene und bakterielle Antigene.
Spezifische Beispiele dieser Verbindungen schließen ein Proinsulin, Wachstumshormon, Androgenrezeptoren, Insulinähnlicher Wachstumsfaktor I, Insulinähnlicher Wachstumsfaktor II, Insulin-ähnliches Wachstumsfaktorbindeprotein, epidermaler Wachstumsfaktor TGF-α, TGF-β, PDGF, Angiogenesefaktoren (azidischer Fibroblastenwachstumsfaktor, basischer Fibroblastenwachstumsfaktor und Angiogenin), Matrixproteine (Typ IV Collagen, Typ VII Collagen, Laminin), Phenylalaninhydroxylase, Tyrosinhydroxylase, Onkogene (ras, fos, myc, erb, src, sis, jun), E6- oder E7- transformierende Sequenzen, p53-Protein, Rb-Genprodukt, Cytokinrezeptor, Il-1, Il-6, Il-8, virales Capsidprotein, und Proteine viraler, bakerischer und parasitischer Organismen, die verwendet werden können, um die immunologische Antwort zu induzieren, und andere Proteine mit nützlicher Signifikanz im Körper. Das Gen, das inkorporiert werden kann, ist nur begrenzt durch die Verfügbarkeit der Nukleinsäuresequenz, die das zu inkorporierende Protein oder Polypeptid kodiert. Ein Fachmann wird ohne weiteres erkennen, dass wenn mehr Proteine und Polypeptide identifiziert werden, sie in den episomalen Vektor integriert und in das tierische oder menschliche Gewebe exprimiert werden können.
Erfindungsgemäße Vektoren können auch verwendet werden, um Gene zu exprimieren, die bereits in einer Wirtszelle exprimiert sind (d. h. ein natives oder homologes Gen), zum Beispiel um die Dosierung des Genprodukts zu erhöhen. Es sollte jedoch zur Kenntnis genommen werden, dass die Expression eines homologen Gens in der deregulierten Expression resultieren kann, welche, aufgrund ihrer Über- Expression in der Zelle, nicht unter die Kontrolle einer LCR oder deren Komponente gestellt werden kann.

Vektor-Einbringung

Zahlreiche Techniken sind bekannt und erfindungsgemäß geeignet zur Einbringung hier beschriebener, selbst replizierender, LCR-(oder deren Komponente) enthaltender, episomaler Expressionsvektoren in Zellen, einschließend den Gebrauch von Nukleinsäure-kondensierenden Reagenzien, Elektroporation, Komplexierung mit Asbest, Polybrene, DEAE-Cellulose, Dextran, Liposomen, Lipopolyamine, Polyornithin, Teilchenbeschuß und direkte Mikroinjektion (ein Überblick wird gegeben von Kucherlapati und Skoultchi, Crit. Rev. Biochem. 16: 349-379 (1984); Keown et al., Methods Enzymol. 185: 527 (1990)).
Ein erfindungsgemäßer Vektor kann in eine Wirtszelle nicht-spezifisch oder spezifisch (d. h. zu einem ausgewählten Subset von Wirtszellen) eingebracht werden via ein virales oder nicht-virales Einbringungsmittel. Bevorzufte Einbringungsverfahren viralen Ursprungs schließen virale Teilchen produzierende Verpackungszelllinien als Transfektionsrezipienten für den Vektor der vorliegenden Erfindung ein, in welchen virale Verpackungssignale gentechnisch eingebaut wurden, wie solche des Adenovirus, der Herpesviren und Papovaviren. Bevorzugte, nicht-viral- basierte Geneinbringungsmittel und -verfahren können in der Erfindung auch verwendet werden und schließen ein Nukleinsäure-kondensierende Peptide, Verkapselung in Liposomen und Transfektion von Zellen ex vivo mit nachfolgender Reimplantation oder Applikation der transfizierten Zellen.
Verschiedene Peptide, abgeleitet von den Aminosäuresequenzen der viralen Hüllproteine, sind im Gentransfer verwendet worden, wenn sie co-appliziert wurden mit Polylysin-DNA-Komplexen (Plank et al., J. biol. Chem. 269: 12918-12924 (1994)); Trubetskoy et al., Bioconjugate Chem. 3: 323-327 (1992); WO 91/17773; WO 92/19287; und Mack et al., Am J. Med. Bei. 307: 138-143 (1994)) weisen darauf hin, dass die Co-Kondensation von Polylysin- Konjugaten mit kationischen Lipiden zu einer Verbesserung der Gentransfereffizienz führen kann. Die PCT- Druckschrift Nummer WO 95/02698 offenbart die Verwendung viraler Komponenten um zu versuchen, die Effizienz des kationischen Lipidgentransfers zu erhöhen.
Erfindungsgemäß geeignete, Nukleinsäure-kondensierende Reagenzien schließen ein Spermin, Spermin-Derivate, Histone, kationische Peptide und Polylysine. Spermin- Derivate beziehen sich auf Analoge und Derivate des Spermins und schließen Verbindungen ein, die dargelegt wurden in der internationalen Druckschrift Nr. WO 93/18759 (veröffentlicht am 30. September 1993).
Disulfidbindungen wurden verwendet, um die peptidischen Komponenten eines Einbringungs-Vehikels zu binden (Cotten et al. Meth. Enzymol. 217: 618-644 (1992)); siehe auch Trubetskoy et al. (supra).
Einbringungs-Vehikel zur Einbringung von DNA-Konstrukten in Zellen sind im Stand der Technik bekannt und schließen DNA/Polykation-Komplexe ein, die spezifisch sind für Zelloberflächenrezeptoren, wie zum Beispiel beschrieben in Wu und Wu, J. Biol. Chem. 263: 14621 (1988); Wilson et al., J. Biol. Chem. 267: 963-967 (1992); und U. S. Patent Nr. 5,166,320.
Die Einbringung eines erfindungsgemäßen Vektors ist beabsichtigt unter Verwendung von Nukleinsäurekondensierenden Peptiden. Ein Nukleinsäurekondensierendes Peptid, das besonders geeignet ist zur Kondensation von der Nukleinsäurekonstrukte und deshalb zur Einbringung der Nukleinsäure in die Zelle, schließt eine Aminosäuresequenz der allgemeinen Formel
NH&sub2;-A-(X&sub1;X&sub2;Y&sub1;Y&sub2;)nX&sub3;X&sub4;-(Z&sub1;Z&sub2;Z&sub3;Z&sub4;) - (X&sub5;X&sub6;Y&sub3;Y&sub4;)mX&sub7;X&sub8;BCOOH
ein, worin jedes der X&sub1;&submin;&sub8; unabhängig voneinander eine Aminosäure ist, die eine positiv geladene Gruppe in der Seitenkette hat; worin jedes der Y&sub1;&submin;&sub4; unabhängig voneinander eine natürlich vorkommende Aminosäure ist, welche Alphahelixbildung unterstützt; worin jedes der Z&sub1;&submin;&sub4; unabhängig voneinander eine natürlich vorkommende Aminosäure ist, mit wenigstens 3 Aminosäuren, die ein hohe Neigung haben, eine stabilisierte Windungsstruktur zu bilden; worin A ein aminoterminaler Serin- oder Threonin-Rest ist; worin B irgendeine Aminosäure ist; und worin n = 2-4 und m = 2 ist.
Andere Peptide sind solche, worin jedes der Xi 8 unabhängig voneinander Lysin, Arginin, 2,4-Diaminobuttersäure oder Ornithin ist; worin jedes der Yi 4 unabhängig voneinander Glutaminsäure, Alanin, Leucin, Methionin, Glutamin, Tryptophan oder Histidin ist; worin (jedes der) Zi 4 unabhängig voneinander Asparagin, Glycin, Prolin, Serin und Asparaginsäure ist; worin B irgendeines von Alanin, Glutaminsäure oder Cystein ist.
Es ist auch erfindungsgemäß vorgesehen, dass geeignete Peptide, für dieses Ausführungsbeispiel der Erfindung, welches das Einbringen einer Nukleinsäure in eine Zelle entweder ex vivo oder in vivo einschließt, ein oder mehrere interne Serin-, Threonin- oder Cystein-Reste enthalten können, bevorzugterweise in einer Position in der Sequenz, die für die Konjugation an einen ausgewählten Liganden exponiert sein wird, und deshalb nicht an der positiv geladenen (Nukleinsäure-orientiert) Fläche der α- Helix. Diese Positionierung ausgewählter, reaktiver Aminosäure-Reste innerhalb der Peptide sind so orientiert, dass sie nicht die Fläche des Peptids kontaktieren, das die Nukleinsäure kontaktiert, und damit Konjugation des Peptids mit anderen funktionellen Peptiden erlaubt durch Bindungen von ausgesuchter und definierter Stabilität. Cystein erlaubt spezifische Konjugation an Verbindungen, die andere reaktive Thiolgruppen enthalten, über die Thiolseitenkette (via Disulfidbindungen), Alkylierungsfunktionen (um Thioetherbindungen zu bilden) oder anderen Thiol-reaktiven Gruppen, wie Maleinimid-Derivate.
Peptide, die innerhalb diese allgemeine Sequenz fallen schließen ein:
NBC7 TRRAWRRAKRRAARRCGVSARRAARRAWRRE-OH und
NBC11 H-TKKAWKKAEKKAAKKCGVSAKKAAKKAWKKA-NH&sub2;.
Deshalb kann ein Nukleinsäure-kondensierendes Peptid, geeignet zum Einbringen einer Nukleinsäure enthalten: 1) Helix-bildende Aminosäure, 2) eine wiederkehrende dreidimensionale Struktur, welche die Hauptfurche der Nukleinsäure kontaktiert, 3) geeignete Chromophore zur quantitativen Bestimmung, und 4) eine Zahl von "Griffen" (d. h. reaktiven Stellen) zur regiospezifischen Konjugation von Liganden, welche zusätzliche funktionelle Regionen bilden.
Nukleinsäure-kondensierende Peptide können auch Teile von H1 einschließen (Sequenz I, II oder III, siehe unten) oder Sequenzen anderer menschlicher Histone (Sequenz IV, unten), die hierin als Sequenzen gekennzeichnet werden, welche die Fähigkeit besitzen, Nukleinsäuren zu kondensieren. Deshalb kann ein Nukleinsäure-kondensierendes Peptid eine lineare Kombination der folgenden drei Consensus-Sequenzen einschließen, wo die totale Sequenzlänge > 17 Reste ist:
Sequenz I: -K-K-X-P-K-K-Y-Z-B-P-A-J-
worin: K ist Lysin, P ist Prolin; A ist Alanin; X ist serin, Threonin oder Prolin; Y ist Alanin oder Valin; Z ist Alanin, Threonin oder Prolin; B ist Lysin, Alanin, Threonin oder Valin; und J ist Alanin oder Valin.
Sequenz II: -X-K-S-P-A-K-A-K-A-
worin: X ist Alanin oder Valin; K ist Lysin; S ist Serin; P ist Prolin; und A ist Alanin.
Sequenz III: -X-Y-V-K-P-K-A-A-K-Z-K-B-
worin: X ist Lysin oder Arginin; Y ist Alanin oder Theronin; Z ist Prolin, Alanin oder Serin; B ist Lysin, Threonin oder Valin; K ist Lysin; P ist Prolin; A ist Alanin.
Sequenz IV: -A-B-C-D-E-F-G-H-I-J-K-
worin: A ist bevorzugterweise Lysin oder Threonin; B ist bevorzugterweise Glycin oder Glutamin; C ist bevorzugterweise Glycin, kann jedoch auch Aspartat, Glutamat oder Serin sein; D ist bevorzugterweise Glycin, kann jedoch auch Lysin, Valin, Glutamin oder Threonin sein; E ist bevorzugterweise Lysin oder Alanin; F ist bevorzugterweise Alanin oder Lysin; G ist bevorzugterweise Arginin, kann jedoch auch Valin oder Isoleucin sein; H ist bevorzugterweise Alanin, kann jedoch auch Threonin, Histidin oder Prolin sein; I ist bevorzugterweise Lysin, Arginin oder Glutamin; J ist Alanin oder Arginin; und K ist bevorzugterweise Lysin oder Glutamin. Eine bevorzugte Consensus- Sequenz ist:
- K-G-G-G-K-A-R-A-K-A-K-.
Ein solches Peptid ist NBC1, welches die folgende Sruktur hat:
NH&sub2;-[SV40 NLS]-[Seq I]-[Seq II]-[Seq III]-[SV40 NLS]- [Seq I]-C-COOH, worin -C- Cystein ist; wo das SV40 NLS die Sequenz Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-Gln hat; und die Sequenz
Andere solcher erfindungsgemäßen Nukleinsäurekondensierenden Peptide werden eine Aminosäuresequenz haben, die innerhalb die folgende allgemeine Sequenz fällt: NH&sub2;-X-(Y)n-C-COOH, worin X entweder fehlt oder Serin oder Threonin ist; Y ist die Sequenz I, II oder III wie oben definiert; n ist 2-6; und C ist Cystein.
Andere solcher Peptide haben die folgenden Strukturen und Sequenzen:
NBC2 hat die Struktur:
NH&sub2;-[Seq III]-[SV40 NLS1]-[Seq I]-C-COOH,
worin -C- Cystein ist.
NBC8 hat die Struktur:
NH&sub2;-[Seq I]-[Seq I]-C-COOH,
worin -C- Cystein ist.
NBC9 hat die Struktur:
NH&sub2;-[Seq I]-[Seq I]-[Seq I]-C-COOH,
worin -C- Cystein ist.
NBC10 hat die Struktur:
NH&sub2;-[Seq I]-[Seq I]-[Seq I]-[Seq I]-C-COOH, worin -C- Cystein ist;
deren Aminosäuresequenzen sind wie folgt:
NBC2 H-KAVKPKAAKPKKPKKKRKVEKKSPKKAKKPAAC(Acm)-OH;
NBC8 H-KKSPKKAKKPAAKKSPKKAKKPAAC(Acm)-OH;
NBC9 H-KKSPKKAKKPAAKKSPKKAKKPAAKKSPKKAKKPAAC(Acm)-OH NBC10 H-KKSPKKAKKPAAKKSPKKAKKPAAKKSPKKAKKPAAKKSPKKAK- KPAAC(Acm)-OH.
Wie oben beschrieben, sind Nukleinsäure-kondensierende Peptide mit einem niedrigen Polydispersionsindex (PDI) zum Einbringen von Zellen einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure geeignet. Der PDI solcher Peptide kann berechnet werden durch Analyse der Peptide mit Elektrospray- Massenspektrometrie. Dieses Verfahren liefert die exakte Masse einer jeden Komponente innerhalb 0,001%. Die PDI- Werte der in der vorliegenden Erfindung geeigneten Peptidpräparate sind in einem Bereich von 1,0-1,100. Besonders geeignete Peptidpräparate der vorliegenden Erfindung besitzen einen PDI < 1,01, und gleichermaßen < 1,001.
Das erste Nukleinsäure-kondensierende Peptid kann 8-24 positiv geladene Aminosäureseitengruppen einschließen; zum Beispiel kann die Zahl der positiv geladenen positiv geladene Aminosäureseitengruppen in einem Bereich von 12- 18 liegen.
Das Verhältnis von positiven/negativen Ladungen in einem synthetischen, virusartigen Teilchen, das befähigt ist, auf einen spezifischen Säugetierzelltyp abzuzielen, ist innerhalb des Bereichs 0,5-3 pro Phosphatrest in der Nukleinsäure; dieses Verhälnis kann deshalb auch innerhalb eines Bereichs von 0,8-1,2 sein.
Das Verhältnis von positiven/negativen Ladungen in einem synthetischen, virusartigen Teilchen, das unbegrenzt ist bezüglich des Zelltyps, auf den es abzielt, ist innerhalb eines Bereichs von 0,5-5 pro Phosphatrest in der Nukleinsäure und kann deshalb auch innerhalb eines Bereichs von 1,2-2 sein.
Funktionelle Gruppen können an Peptide gebunden werden, die geeignet sind, einen erfindungsgemäßen Vektor einzubringen. Diese funktionellen Gruppen können einen Liganden einschließen, der auf einen spezifischen Zelltyp abzielt, wie monoklonale Antikörper, Insulin, Transferrin, Asialoglykoprotein oder Zucker. Der Ligand kann deshalb auf Zellen in einer nicht-spezifischen Weise oder in einer spezifischen Weise abzielen, die begrenzt ist in Bezug auf den Zelltyp.
Die funktionellen Gruppen können auch ein Lipid umfassen wie Palmitoyl, Oleyl oder Stearoyl; ein neutrales hydrophiles Polymer wie Polyethylenglykol (PEG) oder Polyvinylpyrrolidin (PVP); ein fusogenes Peptid wie das HA- Peptid des Influenza-Virus; oder eine Rekombinase oder Integrase. Die funktionelle Gruppe kann auch ein intrazelluläres Trafficking-Protein umfassen, wie eine nukleare Lokalisations-Sequenz (NLS).
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform für die Einbringung, das heißt worin die zweite funktionelle Gruppe kovalent gebunden ist an eine erste funktionelle Gruppe, welche direkt gebunden ist an das Nukleinsäurekondensierende Peptid, kann die erste funktionelle Gruppe eines der Lipide umfassen oder ein neutrales, hydrophiles Polymer wie PEG, und die zweite funktionelle Gruppe kann einen Liganden umfassen, der auf den Zelloberflächenrezeptor abzielt. Wenn beispielsweise die erste funktionelle Gruppe ein Lipid umfasst, kann die zweite Gruppe einen Liganden umfassen, der auf zelluläre Rezeptoren abzielt. Wenn die erste funktionelle Gruppe PEG umfasst, kann die zweite funktionelle Gruppe einen Liganden umfassen, der auf einen zellulären Rezeptor abzielt. Der Ligand kann zum Beispiel einer der Zucker-Anteile oder ein Ligand sein, dessen zellulärer Rezeptor auf einen Zelltyp begrenzt ist und deshalb kann die Targetzellenpopulation nicht begrenzt oder begrenzt sein, was den Zelltyp anbetrifft. Alternativ kann die zweite Gruppe PEG umfassen, wenn die erste funktionelle Gruppe ein Lipid umfasst.
Die oben beschriebenen Nukleinsäure-kondensierenden Peptid/Vektor-DNA-Verbindungen können wie folgt hergestellt werden. Die Verbindung wird derart formuliert, dass die Nukleinsäure- und die Peptid-Zubereitung in gleichen Volumina des gleichen Puffers (gewöhnlich 0,15 M bis 1,0 M NaCl; 25 mM HEPES, pH 7,4) hergestellt werden. Die Nukleinsäure wird geschüttelt oder verwirbelt während die Zubereitung des kondensierenden Peptids mit einer Rate von 0,1 Volumeneinheit pro Minute zugegeben wird. Der Komplex wird für 30 Minuten bei Raumtemperatur belassen, vor der Zugabe der Targetzellen oder vor der Applikation auf ein Objekt und kann bei 4ºC aufbewahrt werden. Das Teilchen wird zentrifugiert, um jedes aggregierte Material zu entfernen.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen DNA/Polykation- Komplexen für das Zelltargeting, sind im Stand der Technik Verfahren zur Herstellung von Nukleinsäure enthaltenden, Zelltargeting-Liposomen bekannt. Liposomen sind hohle, kugelförmige Vesikel, zusammengesetzt aus Lipiden, angeordnet in derselben Gestalt/Form wie solche Lipide, welche die Zellmembran bilden. Sie haben einen inneren, wasserhaltigen Raum um wasserlösliche Verbindungen einzuschließen und bewegen sich in einem Größenbereich von 0,05 bis zu mehreren Mikron im Durchmesser. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass Liposomen Nukleinsäuren in Zellen einbringen können und dass die Nukleinsäure biologisch aktiv bleibt.
Zum Beispiel wurde für Lipofektin, ein ursprünglich als Untersuchungsinstrument konstruiertes Lipsomeintragungs- Vehikel gezeigt, dass es intakte mRNA-Moleküle in Zellen einbringt, die Produktion des korrespondierenden Proteins bewirkend.
Liposome bieten verschiedene Vorteile: Sie sind nicht giftig und in Zusammensetzungen biologisch abbaubar; sie zeigen lange Zirkulations-Halbwertzeiten; und Erkennungsmoleküle zum Targeting auf Gewebe können ohne Schwierigkeiten an ihrer Oberfläche befestigt werden. Schließlich hat die kosteneffektive Herstellung von Liposom-basierten Pharmazeutika sowohl in einer flüssigen Suspension als auch in einem lyophilisierten Produkt die Lebensfähigkeit dieser Technologie als ein akzeptables Arzneimittel- Zuführungssystem gezeigt. Ein Beispiel von Targeting- Liposomen sind Immunoliposome. Liposome werden zum Beispiel hergestellt durch Adsorption von Proteinen (z. B. Immunoglobulin) auf der liposomalen Oberfläche; Inkorporation von nativem Protein in die Liposom-Membran während ihrer Bildung (z. B. Ultraschallbehandlung, Detergenz- Dialyse oder Umkehrphasenverdampfung); kovalente Bindung (direkt oder über eine Spacer-Gruppe) eines Proteins an reaktive Verbindungen, inkorporiert in die Liposom- Membran; nicht-kovalente, hydrophobe Bindung modifizierter Proteine während der Liposomen-Bildung oder durch die Inkubation mit vorgebildeten Liposomen; und indirekte Bindung, einschließlich kovalente Bindung von Immunoglobulin-Protein über ein Polymer an das Liposom (siehe Torchilin, V. P. CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 2(1)). Bindung des Nukleinsäure- Ligandenkomplexes an den Rezeptor unterstützt die Aufnahme der Nukleinsäure durch Rezeptor-vermittelte Endocytose.
Ein Nukleinsäure-Ligandenkomplex, gebunden an ein Adenovirus-Kapsid, welches spontan Endosomen spaltet und dadurch Material in das Zytoplasma freisetzt, kann verwendet werden um den Abbau des Komplexes durch intrazelluläre Lyosomen zu vermeiden (siehe zum Beispiel Curiel et al., Proc. Natl. Acad. Bei. USA 88: 8850 (1991); Cristiano et al., Proc. Natl. Acad. sei USA 90: 2122-2126 (1993)). Rezeptor-vermittelte Nukleinsäure-Aufnahme kann verwendet werden, um Nukleinsäure in Zellen einzuführen, entweder in vitro oder in vivo und hat ergänzend das zusätzliches Merkmal, dass die Nukleinsäure selektiv auf einen bestimmten Zelltyp gerichtet werden kann durch Verwendung eines Liganden, der an einen Rezeptor gebunden ist, der selektiv an einer interessierenden Target-Zelle exprimiert wird oder er kann nicht-selektiv sein in Bezug auf die Target-Zelltyp.
Das genaue stöchiometrische Verhältnis der verschiedenen Komponenten des Eintragungs-Vehikels kann variiert werden, um das Ausmaß der anfänglichen Immunantwort, die Effizienz der Eintragung und den Grad des spezifischen Targeting auf die Zelle zu kontrollieren.
In dem Fall der nicht-spezifischen Eintragung in Zellen, kann ein nicht-spezifischer Ligand verwendet werden, der auf einen Zelloberflächenrezeptor gerichtet ist; im Fall der spezifischen Eintragung kann ein Ligand verwendet werden, der auf eine spezifische Untereinheit von Zellen gerichtet ist. Zum Beispiel können lösliche DNA/Polylysin-Komplexe erzeugt werden (Li et al.; Biochem. J. 12: 1763 (1973)). Mit Asialoglykoprotein markierte Polylysin-Komplexe sind verwendet worden, DNA in vitro auf Hepatozyten zu richten (Wu und Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429 (1987); US Patent 5,166,320). Laktosyliertes Polylysin und galaktosylierte Histone (Chen et al., Human Gene Therapy 5: 429-435 (1994)) sind verwendet worden, um Plasmid-DNA auf Zellen zu richten, die Lektin-Rezeptoren enthalten und an Polylysin konjugiertes Insulin (Rosenkrantz et al., Exp. Gell Res. 199: 323-329 (1992)) auf Zellen, die Insulin-Rezeptoren enthalten. Monoklonale Antikörper wurden verwendet, um DNA auf bestimmte Zelltypen zu richten (Machy et al., Proc. Natl. Acad. Bei. USA 85: 8027-8031 (1988); Trubetskov et al., supra und WO 91/17773 und WO 92/19287).
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel ist ein Ligand in einem Eintragungs-Vehikel eingeschlossen zum Targeting eines erfindungsgemäßen Vektors auf Zellen eines spezifischen Gewebetyps. Bevorzugt ist der Ligand spezifisch für ein Epitop, exprimiert an der Oberfläche von Zellen eines speziellen Gewebetyps. Für bestimmtes Krebsgewebe schließen bevorzugte Liganden Antikörper oder deren Fragmente ein, wie den monoklonalen Antikörper C242, welcher die CA242-Domäne des CanAg erkennt, exprimiert auf den Colon- Krebsen (Lindholm et al., Int. Arch. Allergy Appl. Immunol. 72: 171-181 (1983) und Larson et al., Int. J. Cancer 42: 877-882 (1983)); der monoklonale Antikörper SM3, welcher polymorphes epitheliales Mucin (PEM) erkennt, exprimiert durch Brustkrebs-Zellen (Burchell et al., Cancer Research 47: 5476-5482 (1983)) und monoklonale Antikörper ein neuartiges Epitop erkennend, gefunden auf dem epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor menschlicher Glialtumoren aber nicht auf normalem Gewebe (Moscatello et al., Cancer Res. 55: 5536-5539 (1995)). Weiterhin können Wachstumsfaktoren auch verwendet werden, um auf Tumoren abzuzielen. Zum Beispiel der epidermale Wachstumsfaktor(EGF)-Rezeptor wird auf Lungenkrebs-Zellen über-exprimiert und deshalb kann EGF als der Ligand verwendet werden, der das Eintragungs-Vehikel auf Lungenkrebs ausrichtet (Cristiano et al., Cancer Gene Therapy 3: 4-10 (1996).
Zusätzlich können bestimmte lösliche Makromoleküle zum passiven Tumor-Targeting bestimmter Tumor-Typen verwendet werden. Viele feste/stabile Tumoren besitzen Blutgefäße, die hyperpermeabel für Makromoleküle sind. Obwohl die Gründe dafür noch nicht klar verstanden sind ist das Ergebnis, dass solche Tumoren selktiv zirkulierende Makromoleküle akkumulieren. Vom erhöhten Permeabilitäts- und Retentionseffekt (EPR-Effekt) wird vermutet, dass er den Mechanismus der Aktion von SMANCS (Styrol/Maleinsäureanhydridneokarzinostatin) begründet, jetzt in klinischer Anwendung in Japan zur Behandlung von Hepatoma. Eine andere Klasse von Konjugaten, unter Bebachtung zur Anti-Krebs-Aktivität, sind N-(2- Hydroxypropyl)-Methacrylamid-Copolymer-Anthracyclin- Konjugate (Seymour, L., Critical Reviews in Therapeutic Drug carrier Systems 9(2): 135-187 (1992)). Deshalb kann ein Polymer, Styrol/Maleinsäureanhydrid oder N-(2- Hydroxypropyl)-Methacrylamid-Copolymer umfassend, als Ligand verwendet werden, um auf das Eintragungsvehikel der vorliegenden Erfindung abzuzielen.

Pharmazeutische Zusammensetzungen und therapeutische Verwendung

Die phaarmazeutischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können einen selbst replizierenden, episomalen Vektor oder eine Eintragungs-Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfassen, falls gewünscht in Beimischung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger oder Streckmittel, zur Therapie um eine Krankheit zu behandeln oder die Zellen eines speziellen Gewebes mit einem vorteilhaften Protein oder einer Funktion zu versorgen.
Ein erfindungsgemäßer, selbst replizierender, episomaler, LCR-enthaltender Vektor oder eine Zusammensetzung oder ein Eintragungs-Vehikel, einen erfindungsgemäßen Vektor umfassend, können verabreicht werden über einen Weg, der einschließt intramuskulär, intravenös, aerosol, oral (Tabletten- oder Pillenform), topisch, systemisch, okular, als ein Zäpfchen, intraperitoneal, und/oder inthrathekal und direkte Injektion von Vektor-DNA oder Eintragungs-Vehikel in eine Tumor-Masse.
Das genaue Dosierungsschema wird natürlich durch individuelle Kliniker für individuelle Patienten bestimmt werden müssen und das wird im Gegenzug kontrolliert werden durch die exakte Natur des Protein, exprimiert durch das interessierende Gen und den Gewebetyp, auf den zur Behandlung abgezielt wird.
Die Dosierung wird auch von der Krankheitsindikation und dem Weg der Verabreichung abhängen. Vorteilhafterweise sind die erfindungsgemäßen Vektoren so gestaltet, eine Langzeit-Expression eines ausgewählten Gens nur in den Zellen eines spezifischen Gewebes bereitzustellen, d. h. in den Wirtszellen des Gewebes, in welchem die LCR oder deren Komponente funktional ist. Deshalb wird in solchen Wirtszellen die Behandlungsdauer im allgemeinen ununterbrochen sein oder bis die Zellen sterben. Die Zahl der Dosen wird abhängen von der Krankheit und Daten über die Wirksamkeit der klinischen Proben.
Die Menge an Vektor-DNA, eingetragen zur erfindungsgemäßen effektiven Gentherapie, wird in dem Bereich von zwischen ungefähr 50 ng - 1000 ug von Vektor-DNA/kg Körpergewicht liegen; und bevorzugt in dem Bereich von ungefähr 1-100 ug Vektor-DNA/kg.
Vektor einem Säugetier für in vivo Zell-Aufnahme zu verabreichen, kann ein Vektor, wie er hierin beschrieben ist, über die Nutzung eines ex-vivo-Ansatzes verabreicht werden, dabei werden die Zellen aus dem Tier entfernt, transduziert mit dem episomalen Vektor, ein ausgewähltes Gen enthaltend unter der Kontrolle einer speziellen LCR oder deren Komponente, und dann re-implantiert in das Tier.
Die Leber zum Beispiel kann erreicht werden durch einen ex-vivo-Ansatz, durch Entfernen von Hepatozyten aus einem Tier, transduzieren der Hepatozyten in vitro mit dem episomalen Vektor, der ein Gen enthält, das ein ausgewähltes Protein oder eine therapeutische Nukleinsäure kodiert, und re-implantieren der transduzierten Hepatozyten in das Tier (z. B. wie für Kaninchen beschrieben von Chowdhury et al., Science 254: 1802-1805, 1991, oder in Menschen von Wilson, Hum. Gene Ther. 3: 179-222, 1992). Solche Verfahren können auch effektiv sein für die Eintragung von erfindungsgemäßen Expressionsvektoren in verschiedene Zellpopulationen im Kreislauf- oder Lymphsystem, wie Erythrozyten, T-Zellen und B-Zellen.

Transgene Tiere zum Testen von Gewebspezifität oder Wirksamkeit der Gentherapie

In einem anderen Ausführungsbeispiel der Erfindung wird ein Säugetier-Modell bereitgestellt zur Bestimmung der Gewebsspezifität und/oder Wirksamkeit der Gentherapie, einen selbst erfindungsgemäßen replizierenden, episomalen, LCR-enthaltenden Vektor verwendend. Das Säugetier- Modell umfasst ein transgenes Tier, dessen Zellen den Vektor der vorliegenden Erfindung enthalten. Verfahren um transgene Mäuse zu machen (Gordon et al., Proc. Natl. acad. Bei. USA 77: 7380 (1980); Harbers et al., Nature 293: 540 (1981); Wagner et al., Proc. natl. Acad. Bei. USA 78: 6376 (1981); und Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Bei. USA 78: 6376 (1981), Schafe, Schweine, hühner (siehe Hammer et al., Nature 315: 680 (1985)) etc. sind im Stand der Technik wohlbekannt und sind zur erfindungsgemäßen Verwendung vorgesehen. Solche Tiere erlauben das Testen vor klinischen Prüfungen an Menschen.
Zum Beispiel kann das transgene Tier einen Tumor oder die Neigung haben, einen Tumor zu entwickeln. Stewart et al., Int. J. Cancer 53: 1023 (1993) beschreiben eine transgene Maus, die einen T-Zellen-Tumor hat. Teitz et al., Proc. Natl. Acad. Bei. USA 90: 2910 (1993)) beschreiben eine transgene Maus, die Rhabdomyosarkome und Insulinproduzierende pankreatische Insel-Tumoren hat. Ein episomaler Vektor, ein ausgewähltes Gen enthaltend, das alleine in die Tumor-Zellen exprimiert werden soll, kann in die Eizelle irgendeiner dieser Tumor-tragenden Mäuse transduziert werden, um ein Tier-Modell zu schaffen, zur Bestimmung ob die LCR oder deren Komponente strikt die Expression des ausgewählten Gen an Tumor-Zellen begrenzt und auch um das Ergebnis der Expression des ausgewählten Gens in solche Tumor-Zellen zu bestimmen.
Transgene Tiere, die erfindungsgemäße, selbst replizierende, LCR-enthaltende, episomale Vektoren enthalten, können auch zur Langzeit-Produktion eines interessierenden Proteins in gewebsspezifischer Weise verwendet werden; zum Beispiel zur Produktion von menschlichem Globin in roten Zellen des transgenen Tiers, die β-Globin-LCR oder die HS3- und HS4-Kombination oder HS3 alleine verwendend, oder Produktion eines interessierenden Proteins in der Milch eines transgenen Tieres, als LCR die Makrophage/Lysozym-LCR verwendend.
Die folgenden Beispiele sollen der Erläuterung dienen und beabsichtigen nicht, die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken. Die Herstellung, das Testen und die Analyse verschiedener repräsentativer, erfindungsgemäßer Konstrukte ist unten detailliert beschrieben. Ein Fachmann kann diese Verfahren adaptieren zur Herstellung und zum Testen anderer erfindungsgemäßer Vektoren, verschiedene episomale Vektoren, verschiedene LCRs oder deren Komponenten und verschiedene interessierende Gene verwendend.

Beispiel 1

Herstellung von Testgen-Konstrukten und Vektorsystemen

1. EBV-Vektor

Ein erfindungsgemäß geeigneter, EBV-basierter Vektor ist der p220,2-Vektor (Fig. 1). Der p220,2-Vektor enthält (i) den OriP und das EBNA-1-Gen des EBV, (ii) ein Hygromyzinresistentes Gen zur Selektion von stabil transfizierten, eukaryotischen Gewebskulturzellen, (iii) eine Polylinker- Klonierungsstelle für Test-Gene und (iv) ein pBR322- Vektor-Rückgrat, welches eine schwache eukaryotische Promotorsequenz enthält, welche die Expression des EBNA-1- Gens in eukaryotischen Zellen antreibt.

2. Reportergen

Die Repotergene (Fig. 2), verwendet um die LCR-Aktivität zu bewerten, stammen aus dem menschlichen β-Globin: 4,1 kb Hpal-EcoRV-Fragment mit 815 Basenpaaren (bp) 5' und 1685 bp 3' flankierende Sequenzen (Fritsch et äl., Gell 19: 959-972 (1980); Lawn et al., Gell 19: 959-972 (1980). Das Reportergen wurde separat geklont durch Blunt-End- Ligation in die einzigartige Polylinker-HindIII-Stelle von p220,2 (Fig. 2).

3. β-Globin-LCR-Testkonstrukte

Drei β-Globin-LCR-Komponenten sind die DNase-I- hypersensitiven Stellen HS2, HS3 und HS4 (Collis et al., EMBO J. 9: 223-240 (1990)). Diese Komponenten wurden als 1,5-2 kb Fragmente kloniert, individuell oder in Kombinationen von zwei oder drei Stellen (siehe unten) upstream der β-Globin- oder γH&sub2;K-Reportergene in der SalI-Stelle von p220,2 (siehe Fig. 3).

Beispiel 2

Analyse stabiler Transfektion von Gewebskulturzellen

EBV-basierte Vektoren sind höchst stabil als selbst replizierende Episomen in Primaten- oder menschlichen Zellen. Deshalb wurden stabile Transfektionen der β-Globin- Testgen-Konstrukte in der menschlichen, myelogenen Leukämie-Zelllinie K562 ausgeführt (Lozzio und Lozzio, Blood 45: 321-334 (1975)). Diese Zelllinie zeigt ein embryonales (s) und fetales (γ) Muster von Globingen-Expression (Andersen et al., Int. J. Cancer 23: 143-147 (1979)) und ist früher erfolgreich verwendet worden, die β-Globin- LCR-Funktion zu bewerten (Blom von Assendelft et al., Gell 56: 969-977 (1989)).

1. Transfektionsverfahren

K562-Zellen (10&sup7;) wurden durch Elektroporation mit 50 ug supergeknäulter Testkonstrukt-DNA transfiziert, ein Bio Rad Gen-Pulsator-Set (BioRad, Hercules, CA) bei 960 uF und 300 V verwendend, wie 1991 in Antoniou beschrieben. Jede elektroporierte Probe wurde gleichmäßig zwischen zwei 75 cm²-Kolben mit Gewebskultur aufgeteilt um zwei unabhängige Pools stabil transfizierter Zellen zu erzeugen. Hygromyzin B (250 ug/ml) wurde 24 Stunden nach der Elektroporation hinzugefügt und danach auf dieser Konzentration gehalten. Der Zelltod von nicht-transfizierten Zellen war augenscheinlich nach 7-10 Tagen (äquivalent zu ungefähr 10 Zellteilungen) und konfluente Kolben transfizierter Zellen wurden 7 Tage später erhalten.

2. RNA- und DNA-Präparation aus transfizierten Zellen

(i) Gesamt-RMA wurde durch selektive Ausfällung in Anwesenheit von 3 M LiCl und 6 M Harnstoff präpariert (Auffrey und Rougen, Eur. J. Biochem. 107: 303-314 (1980)).
(ii) Genomische Gesamt-DNA wurde präpariert aus isolierten Zellkernen. Zellen wurden zerteilt in RSB (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl&sub2; plus 0,1% NP40, gefolgt von Zentrifugation um die Zellkerne zu pelletieren. Die Zellkerne wurden anschließend lysiert durch Resuspendieren in TNE (150 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA), 1% SDS und 50 ug/ml Proteinase K und über Nacht bei 55ºC inkubiert. Dem folgte eine Extraktion mit einem gleichen Volumen Phenol/Chloroform (1 : 1) und die DNA fällt aus der wässrigen Phase mit 0,7 Volumenteilen Isopropanol aus. Der resultierende DNA-Niederschlag wird aus der Lösung gespoolt, einmal in 70% Ethanol gewaschen und in 200 ul TE (10 mM Tris-Cl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) gelöst.

3. Analyse für die Expression des Testgens

Transfizierte Genexpression wurde bewertet durch ein SI- Nuklease Protection Assay (Antoniou et al., Human Genetic Disease Analysis. A Practical Approach (second edition) (1993)) eine end-markierte DNA-Sonde aus der 5'-Region des β-Globins (Antoniou et al., (1988)) oder γH&sub2;K-Gene verwendend. Diese Sonden detektieren nur solche Transkripte, die durch Initiierung durch die korrekte, Cap- Stelle des Wildtyps entstanden sind (Fig. 4 und 5, untere Tafel). Als ein interner Standard wurden gleichzeitig alle Proben für die endogene γ-Globin-mRNA bewertet, eine Sonde aus dem 3'-Ende des Gens verwendend (Fig. 4, untere Tafel).

4. Bewertung des episomalen Status und der Kopienzahl transfizierter DNA

(a) Episomaler Status.
Gesamt-DNA (10 ug) aus isolierten Zellkernen wurde über Nacht mit Pvul und DpnI (6 Einheiten) verdaut und durch Elektrophorese auf einem 0,6% Agarosegel abgetrennt und Southern Blotted auf Magnacharge Plus Nylon- Transfermembranen. DpnI-Verdau stellt sicher, dass restliche Plasmid-DNA bakteriellen Ursprungs zerstört ist. Der Blot wird dann mit dem p220,2,- Vektor, markiert mit ³²P, durch Nick-Translation sondiert. Transfizierte DNA in Form von Episomen erscheint als lineares Molekül von 12-17,5 kb, abhängig von der Größe des Testkonstrukts.

(b) Episom Kopienzahl

Die gleiche Menge an DNA wird wie oben mit EcoRI und DpnI verdaut und Southern Blotted. Der Blot wird mit einem 920 bp BamHI-EcoRI-Fragment sondiert, umfassend Intron II des β-Globin-Gens. Dies führt zur Detektion eines 5,5 kb Fragments der drei Kopien des endogenen β-Globin-Gens und eines 7,2-12,7 kb Fragments der transfizierten Konstrukte.

Beispiel 3

1. Expressionsanalyse des β-Globin-Reportergen-Konstrukts

Fig. 4 (obere Tafel) zeigt das Autoradiogramm der Analyse von RNA durch ein S1-Nuklease Protection Assay für die Expression des transfizierten Genkonstrukts. Die Stellen wurden gebunden an das β-Globin-Gen im EBV-basierten, selbst replizierenden, episomalen Expressionsvektor p220,0 und stabil transfiziert in K562-Zellen. Gesamt-RNA wurde durch ein S1-Nuklease Protection Assay analysiert, eine Mischung von Sonden verwendend, um simultan sowohl die β-Globin 5'-mRNA des Transgens als auch die endogen exprimierte γ-Globin mRNA (3'-γ) zu detektieren, welche als interner Standard fungiert. Quantifizierung der Ergebnisse in Fig. 4 erfolgte durch Phosphorimager (Molecular Dynamics) und ist in Tabelle 1 zusammengefasst.
In diesem Experiment wurde eine geringe oder keine Expression mit dem β-Globin-Gen alleine (keine LCR- Komponente anwesend im selbst replizierenden, episomalen Vektor) (Bande β1) gesehen. Ein Vektor, der entweder HS2 oder HS3 enthält, verbessert die Expression nur zu einem geringen Grad (Banden 2β und 4β). Im Gegesatz dazu ergab ein Vektor, HS3 (Banden 3β) allein enthaltend, Expressionsstärken, die 10 mal größer waren als ein Vektor, entweder HS2 oder HS4 alleine enthaltend. Die Expressionsstärke erhalten mit einem Vektor, HS3 enthaltend, war vergleichbar mit der, beobachtet mit einem Vektor enthaltend eine Kombination von HS2/HS3 (Banden 23β) oder einem Vektor enthaltend eine Kombination von HS3/HS4 (Banden 34β). Der HS2/HS4-Vektor (Banden 24β) ergab die schwächste Transkriptionsaktivität der Zwei-Seiten-Konstrkte. Der höchste Wert der Transkription wurde erhalten unter Verwendung eines Vektors enthaltend eine Kombination aller drei β-Globin-LCR-Elemente (HS2, 3, 4) (Banden 123β). Dieser Wert war zweimal so hoch wie HS3 alleine oder die HS2/HS3- und HS3/HS4-Zwei-Seiten-Konstrukte.
Dieses Experiment wurde wiederholt und die Ergebnisse sind in Fig. 6 gezeigt. Die Ergebnisse des wiederholten Experiments zeigen wiederum, dass das β-Globin-Gen alleine unfähig ist in K562-Zellen (Banden β) zu exprimieren. Die Zugabe von entweder βLCR HS2 (Banden 2β) oder HS3 (Banden 3β) ergab signifikante Anstiege an Expression in einem vergleichbaren Grad. HS4 (Banden β4) hat die Expression nicht über die des β-Globin-Gens alleine hinaus verbessert. Die zwei βLCR HS-Stellen-Kombinationen (Banden 23β, 34β und 24β) steigerten alle die Expression über die irgendeiner HS-Stellen alleine. Die Kombination aller 3 HS-Stellen (Banden 234β) ergab die höchste Expressionsstärke, wie zuvor gesehen. Die Ergebnisse in Fig. 6 bestätigen im Wesentlichen die in Fig. 4 gezeigten Ergebnisse und veranschaulichen die Expression mit HS2 alleine. Tabelle 1: Expression des menschlichen β-Globins unter der Kontrolle der βLCR in selbst replizierenden EBV-basierten, episomalen Vektoren in K562-Zellen (Ergebnisse dargestellt in Fig. 4).
Diese Tabelle zeigt die quantitative Bestimmung des S1- Nuklease Protection Assays, dargestellt in Fig. 4, der RNA aus K562-Zellen stabil transfiziert, entweder mit dem menschlichen β-Globin-Gen alleine (β-1) oder unter der Kontrolle verschiedener Kombinationen der DNase-I- hypersensitiven (HS) Stelle der βLCR in dem selbst replizierenden EBV-basierten Vektor p220,0 (Fig. 3), einen Molecular Dynamics Phosphorimager verwendend.

Beispiel 4

Das menschliche β-Globin-Gen alleine (β) oder unter der Kontrolle von βLCR HS2(2β), HS3 (3β) und HS2, 3 und 4 (5β) in dem EBV-basierten, selbst replizierenden, episomalen Vektor p220,2 (siehe Fig. 2 und 3), wurden stabil transfiziert in K562- (Tafel A) und HeLa-Zellen (Tafel B) durch Elektroporation (siehe Text). Supergenäulte Plasmid-DNA (50 ug) wurde gemischt mit 2 · 10&sup7; Zellen und elektroporiert mit dem Bio Rad Pulsator-Set um einen einzigen Puls von 960 uF bei 300 V zu liefern. Stabil transfizierte Zellen wurden mit 250 ug Hygromyzin selektiert. Gesamt-RNA wurde aus den stabil transfizierten Pools extrahiert, die erzeugt und analysiert wurden für Transgen-Expression durch S1-Nuklease Protection Assay, end-markierte DNA-Sonden verwendend. Die β-Globin-mRNA aus den transfizierten Genen wurde mit der gleichen 5'- Sonde detektiert, wie in Fig. 4 gezeigt. Detektion von γ-Globin-mRNA mit einer 5'-ExonII-Sonde, ein geschütztes Fragment von 207 Nukleotiden ergebend (5'γ), fungierte als ein interner Standard. Die konstitutiv und ubiquitär exprimierte mRNA für hnRNPA2 wurde sondiert als eine interne Referenz in den von HeLa-Zellen abstammenden Proben (ein 122 Nukleotid S1-protected Fragment, A2 ergebend). Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen, dass ein episomaler Vektor, HS3 alleine tragend, gewebsspezifisch exprimiert wird, d. h. in K562-Zellen aber nicht in HeLa-Zellen, wohingegen ein episomaler Vektor, HS2 alleine tragend oder HS2, 3 und HS4 tragend, nicht gewebsspezifisch exprimiert wird, da jeder sowohl in K562- als auch in HeLa-Zellen exprimiert wird. Demnach resultiert die Anwesenheit von HS2 in einem episomalen Vektor in der Expression eines interessierenden Gens aber nicht in einer gewebsspezifischen Weise, wohingegen die Anwesenheit von HS3 alleine (d. h. in Abwesenheit von HS2) in der Expression eines interessierenden Gens in einer gewebsspezifischen Weise resultiert. Deshalb ist ein klassischer Enhancer wie HS2 (lokalisiert an eine NF-E2/AP 1-Dimer-Bindungsstelle innerhalb ihres Kerns), (Tuan et al., Proc. Natl. Acad. Bei. USA 86: 2554- 2558 (1989); Ney et al.; Genes Dev. 4: 993-1006 (1990a); und Ney et al., Nuc. Acids Res. 18: 6011-6017 (1990b)) unterscheidbar von einer LCR oder LCR-Komponente die Gewebsspezifität spezifizierend durch die Unfähigkeit der ersteren, erfindungsgemäß, gewebsspezifische Transkription zu übertragen.

Referenzen

Andersen, L. C., Nilsson, K. und Gahmberg, C. G. (1979) Int. J. Cancer 23, 143-7.
Antoniou, M. (1991) in: Methods in molecular biology: Gene transfer and expression protocols. Murray, E. J. (ed). The Humana Press Inc., Clifton NJ, pp 421-433.
Antoniou, M., deBoer E. und Grosveld, F. (1993). In: Human Genetic Disease Analysis.
A Pracitcal Approach (secon edition) Ed. K. E. Davies, IRL Press, Oxford, 83-108.
Auffrey, C. und Rougeon, F. (1980) Purificarion of mouse immunoglobulin heavy-chain RNAs from total myeloma tumor RNA. Eur. J. Biochem 107, 303-314
Bloom von Assendelft, M. Hanscombe, 0., Grosveld, F. und Greaves, D. R. (1989) Cell 56, 969-977.
Collis, P., Antoniou, M. und Grosveld, F. (1990) EMBO J., 9, 223-240.
Pritsche, E. F., Lawn, R. M. und Maniatis, T. (1980) Gell 19, 959-972.
Grosveld, F., Blom von Assendelft, M., Greaves, D. R. und Kollias, G. (1987) Gell 51, 975-958.
Lawn, R. M., Efstratiadis, A., O'Connell, C. und Maniatis, T. (1980) Gell 21, 647-651.
Lozzio, C. B. und Lozzio, B. B. (1975) Blood 45, 321-334.
Ney, P. A., Sorrentino, B. P., McDonagh, K. T. und Nienhuis, A. W. (1990a) Genes Dev. 4, 993-1006.
Ney, P. A., Sorrentino, B. P., Lowrey, C. H. und Nienhuis, A. W. (1990b) Nucl. Acids Res. 18, 6011-6017.
Tuan, D. Y. H., Solomon, W. B., London, L. M. und Lee, D. P. (1989) Proc. Natl. Acad. Bei. USA 86, 2554-2558.

Claims

1. Selbst replizierender episomaler DNA Expressionsvektor zur episomalen Expression eines interessierenden Gens in eine Wirtszelle in gewebsbegrenzter Weise, der Vektor umfasst:

(a) einen selbst replizierenden Replikationsursprung; und

(b) eine Locus Kontrollregion oder dessen Komponenten, welche die episomale Expression des genannten Gens in einer gewebsbegrenzenden Weise steuert, wenn diese operativ an ein interessierendes Gen gebunden und in einer Wirtszelle vorhanden ist.

2. Selbst replizierender episomaler DNA Expressionsvektor nach Anspruch 1, weiterhin umfassend ein interessierendes Gen, welches operativ an die Locus Kontrollregion oder dessen Komponente gebunden ist.

3. Selbst replizierender episomaler DNA Expressionsvektor nach Anspruch 2, worin die Komponente einer Locus Kontrollregion eine Komponente der Locus- Kontrollregion des β-Globins ist, bestehend im Wesentlichen aus HS3.

4. Selbst replizierender episomaler DNA Expressionsvektor nach Anspruch 2, worin die Locus Kontrollregion oder deren Komponente, die Locus Kontrollregion des β-Globins oder deren Komponente ist, mit Ausnahme der HS2 Region.

5. Selbst replizierender episomaler DNA Expressionsvektor nach Anspruch 2, worin die Komponente der Lokus- Kontroll-Region eine Komponente der Locus Kontrollregion des β-Globins ist, bestehend im Wesentlichen aus HS3 und HS4.

6. Selbst replizierender episomaler DNA Vektor nach irgendeinem der voranstellenden Ansprüche, worin der Replikationsursprung ein viraler Replikationsursprung ist.

7. Selbst replizierender episomaler DNA Expressionsvektor nach Anspruch 6, worin der virale Replikationsursprung ein Replikationsursprung des Epstein-Barr- Virus ist.

8. Selbst replizierender episomaler DNA Expressionsvektor nach irgendeinem der voranstehenden Ansprüche, weiterhin eine Sequenz umfassend, die einen Replikationsfaktor kodiert, der für die Replikation des Expressionsvektors in der Wirtszelle benötigt wird.

9. Selbst replizierender episomaler DNA Expressionsvektor nach Anspruch 8, worin die Sequenz, die den Replikationsfaktor kodiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Sequenz, die EBNA-1 des Epstein-Barr-Virus kodiert, einer Sequenz, die E1 des Papilloma-Virus kodiert und einer Sequenz, die E2 des Papilloma-Virus kodiert.

10. Selbst replizierender episomaler DNA Expressionsvektor nach irgendeinem der voranstehenden Ansprüche, weiterhin umfassend ein antibiotisches Resistenzgen zur Selektion von Zellen in Kultur, die stabil mit dem Expressionsvektor transfiziert sind.

11. Selbst replizierender episomaler DNA Expressionsvektor nach irgendeinem der voranstehenden Ansprüche, weiterhin umfassend eine eukaryontische Transkriptions-Terminationssequenz, welche zwischen der Locus Kontrollregion und dem interessierenden Gen platziert ist und in der Lage ist, die Transkription zwischen diesen zu verhindern.

12. Vektorenpaar, umfassend ein selbst replizierendes episomales DNA Expressionssystem zur episomalen Expression eines interessierenden Gens in einer Wirtszelle in einer gewebsbegrenzten Weise, das Vektorenpaar umfassend:

i. einen ersten selbstreplizierenden episomalen Vektor umfassend:

(a) einen Replikaktionsursprung;

(b) eine Locus Kontrollregion oder dessen Komponenten, welche die episomale Expression des genannten Gens in einer gewebsbegrenzenden Weise steuert, wenn diese operativ an ein interessierendes Gen gebunden und in einer Wirtszelle vorhanden ist; und

(c) eine Klonierstelle für das interessierende Gen; und

ii. einen zweiten Vektor, umfassend

(a) einen Replikaktionsursprung; und

(b) eine ein Replikaktionsprotein kodierende Sequenz, wobei das Replikaktionsprotein für die Replikation des genannten Replikaktionsursprungs erforderlich ist.

13. Vektorenpaar nach Anspruch 12, weiterhin umfassend ein interessierendes Gen, welches operativ an die Locus Kontrollregion oder dessen Komponente gebunden ist.

14. Vektorenpaar nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin die Komponente einer Locus Kontrollregion eine Komponente der Locus-Kontrollregion des β-Globins ist, bestehend im Wesentlichen aus HS3.

15. Vektorenpaar nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin die Locus Kontrollregion oder deren Komponente, die Locus Kontrollregion des β-Globins oder deren Komponente ist, mit Ausnahme der HS2 Region.

16. Vektorenpaar nach Anspruch 12 oder Anspruch 13, worin die Komponente der Lokus-Kontrollregion eine Komponente der Locus Kontrollregion des β-Globins ist, bestehend im Wesentlichen aus HS3 und HS4.

17. Vektorenpaar nach einem der Ansprüche 12 bis 16, worin der Replikationsursprung ein viraler Replikationsursprung ist.

18. Vektorenpaar nach Anspruch 17, wobei der Replikationsursprung vom Epstein-Barr-Virus stammt.

19. Vektorenpaar nach einem der Ansprüche 12 bis 16, worin die Sequenz, die den Replikationsfaktor kodiert, ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Sequenz, die EBNA-1 des Epstein-Barr-Virus kodiert, einer Sequenz, die E1 des Papilloma-Virus kodiert und einer Sequenz, die E2 des Papilloma-Virus kodiert.

20. Vektorenpaar nach einem der Ansprüche 12 bis 19, worin jeder genannte erste und zweite Vektor unabhängig voneinander weiterhin ein antibiotisches Resistenzgen umfassen, um Zellen in Kultur zu selektieren, die stabil mit dem Expressionsvektor transfiziert sind.

21. Vektorenpaar nach einem der Ansprüche 12 bis 20, worin genannter erster Vektor weiterhin eine eukaryontische Transkriptions-Terminationssequenz umfasst, welche zwischen der Locus Kontrollregion und der Klonierstelle des interessierenden Gens platziert ist.

22. Verfahren zur anhaltenden, gewebespezifischen Expression eines interessierenden Gens in einer Wirtszelle in Kultur, umfassend die Kultivierung einer Wirtszelle, transfiziert mit dem Vektor aus einem der Ansprüche 1 bis 11 oder mit dem Vektorenpaar aus einem der Ansprüche 12 bis 21.

23. Transgenes, nicht-menschliches Tier, enthaltend Zellen, welche den Expressionsvektor eines der Ansprüche 1 bis 11 oder ein Vektorenpaar eines der Ansprüche 12 bis 21 enthalten.

24. Verfahren zur Identifikation einer Locus Kontrollregion oder deren Komponente, welche, sofern diese in einem episomalen DNA Expressionsvektor enthalten, operativ an ein interessierendes Gen gebunden und in einer Wirtszelle vorhanden ist, die Expression des genannten Gens in einer gewebsbegrenzenden Weise steuert, umfassend:

i. das Untersuchen der Locus Kontrollregion oder deren Komponente, durch transfizieren eines episomalen Vektors, welcher die Kandidaten-Locus Kontrollregion oder deren Komponente, operativ gebunden an ein Markergen enthält, in eine Zelllinie, in welcher die Locus Kontrollregion aktiv ist, wenn sie integriert ist, und auch in eine Zelllinie, in welcher die Locus Kontrollregion inaktiv ist, wenn sie integriert ist;

ii. Identifizieren der Locus Kontrollregion oder deren Komponente, welche nur aktiv in der Zellinie ist, in welcher die Locus Kontrollregion aktiv ist, wenn diese integriert ist.