DE69714775T2

DE69714775T2 - Verfahren zur Tötung von Zielzellen in geernteten Zellpopulationen mit Hilfe von zwei Immunotoxinen

Info

Publication number: DE69714775T2
Application number: DE69714775T
Authority: DE
Inventors: Olav Engebraten; Oystein Fodstad; Siri Juell; Gunnar Kvalheim; Wang
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1996-03-13
Filing date: 1997-03-12
Publication date: 2003-04-24
Anticipated expiration: 2017-03-13
Also published as: CA2248620A1; BR9708049A; DE69714775D1; NZ331763A; HUP9901597A3; JP2000507230A; NO961031D0; AU2522997A; CN1218411A; EP0954329A1; SK125798A3; US20020151689A1; AU710184B2; US7198787B2; TR199801795T2; RU2182493C2; HUP9901597A2; WO1997033611A1; PL328804A1; IL126014A0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das selektive Entfernen von Zielzellen aus einer Zellpopulation, indem die Zellpopulation einer Kombination aus zwei Immunotoxinen ausgesetzt wird.
Die sogenannten autologen Stammzellen-Transplantate umfassen aus dem Blut oder dem Knochenmark von Krebspatienten isolierte Zellen, die nach einer Vorbehandlung der Patienten geeignete Mengen unreifer Vorläufer-Blut- und Immunzellen enthalten, wodurch die Funktion eines nicht-funktionierenden Knochenmarks kurzfristig oder über einen längeren Zeitraum wiederhergestellt werden kann, indem die Zellen wieder in das Blut der Patienten, aus denen sie gewonnen wurden, eingeführt werden.
Das Reinigen von autologen hämatopoetischen Transplantaten unter Verwendung von Antikörpern ist nach dem Stand der Technik bekannt, wobei die Transplantate unselektierte Knochenmarkproben darstellen. Ein solches Reinigungsverfahren wird u. a. beschrieben von Myklebust, A. T., Godal, A., Juell, S., und Fodstad ., Comparison of two antibody-based methods for elimination of breast cancer cells from human bone marrow", Cancer Res. (USA) 1994, 54/1: 209-214; und Myklebust, A. T., Godal, A., Pharo, A., Juell, S., und Fodstad, ., "Eradication of small cell lung cancer cells from human bone marrow with immunotoxins", Cancer Res. (USA) 1993, 53(16): 3784-3788. In beiden Veröffentlichungen werden Immunotoxine eingesetzt, wobei der Antikörper mit einem Toxin konjugiert ist. Das Prinzip besteht darin, maligne Zellen aus den gewonnenen Knochenmarkzellen abzutöten, bevor die Zellsuspension wieder in den Patienten injiziert wird.
In den letzten Jahren wurden Verfahren entwickelt, bei denen das Prinzip jedoch im Gegenteil besteht. Anhand der sogenannten Stammzellen-Transplantation versucht man, aus dem Blut oder dem Knochenmark eine Untergruppe von normalen Zellen positiv zu selektieren, die in der Lage sind, die normale Knochenmarkfunktion wiederherzustellen, nachdem sie wieder in den Patienten eingeführt wurden. Diese "Stammzellen" bestehen aus einem Gemisch aus den meisten unreifen Vorläufern für Blut- und Immunzellen und außerdem aus starker differenzierten Zellen. Solche Zellen können gewonnen werden, indem entweder eine sogenannte Apherese des peripheren Bluts durchgeführt wird, ein Verfahren, das einen oder mehrere Tage in Anspruch nimmt oder indem eine Immunadsorption/Selektion von CD34&spplus;-Zellen (unreifen Vorläuferzellen) aus dem Blut oder dem Knochenmark unter Verwendung anderer Techniken erfolgt, die dem Fachmann bekannt sind.
Stray, K. M., et al., "Purging tumor cells from bone marrow or peripheral blood using avidin, biotin, immuno adsorption"; In: P. G. Adrian, G. Samuel, und A. W.-W. Diana, (Hrsg.), Advances in bone marrow purging and processing, S. 97-103, Ortando: Willelis Inc., 1994; beschreiben das Reinigen von Knochenmarkzellen oder eines Aphereseprodukts aus peripherem Blut. Dieses Verfahren wird bei Patienten mit Lymphom und bei Patientinnen mit Brustkrebs zum Reinigen durchgeführt. Das Verfahren umfasst einen Anreicherungsschritt für CD34&spplus;-Zellen, worauf die Entfernung von B-Zellen oder Brustkrebszellen anhand einer sogenannten Avidin-Säule folgt. In diesem Fall wird die Reinigung indirekt durchgeführt, indem die Zellsuspension mit einem primären Antikörper inkubiert wird, der an die Brustkrebszellen bindet, indem die Zellsuspension sodann gewaschen und noch einmal mit einem Antikörper inkubiert wird, der an den primären Antikörper bindet. Dieser Ratten-Antikörper ist biotinyliert, d. h. er ist mit einem Molekül verbunden, das an Avidin stark bindet. Wenn diese Zellsuspension schließlich auf eine Säule mit Avidin-konjugierten Kügelchen aufgetragen wird, werden die Tumorzellen daran festgehalten, indem die Zellen mit dem primären Antikörper und dem sekundären biotinylierten Antikörper an das Avidin binden. Durch eine Reinigung unter Verwendung eines solchen Systems wurden maximal 3,2 log maligne Zellen entfernt. Das Prinzip ist jedoch sehr zeitaufwendig und umständlich, da die Zellsuspension in verschiedenen Schritten bearbeitet werden muss, einschließlich einer Inkubation mit einem Antikörper und zwei Waschgängen, bevor sie auf die Säule aufgetragen wird. Somit ist es schwierig, eine Schädigung der Stammzellen zu verhindern oder zu vermeiden, dass die Stammzellen unspezifisch in der Säule festgehalten werden, wodurch leider Zellen verloren gehen, die für die Wiederherstellung der normalen Knochenmarkfunktionen entscheidend sind.
Tyer, C. L., et al., "Breast cancer cells are effectively purged from peripheral blood progenitor cells using an immunomagnetic technique"; Abstact to the first meeting of International Society for Hematotherapy and Graft Engineering, Orlando, FL, 1993, beschreiben ein immunmagnetisches Verfahren, das ähnlich ist wie das Verfahren, das in der vorstehenden Veröffentlichung von Myklebust et al. verwendet wird. Dieses Verfahren wird jedoch mit peripheren Blutzellen durchgeführt. Auch dieses Prinzip unterscheidet sich völlig von der Verwendung von Immunotoxinen, wobei die Effektivität der Reinigung in Modellexperimenten von 3, 3 bis 4,8 log entfernten malignen Zellen variierte. In der Veröffentlichung wird keinerlei weitere Verwendungsmöglichkeit eines indirekten Systems erwähnt, mit Inkubation von primären Antikörpern, gefolgt von Waschen und erneuter Inkubation mit Kügelchen, die mit Antikörpern gekoppelt sind, welche an den primären Antikörper binden, dies wäre jedoch eine logische Folgerung. Auch dieses Verfahren umfasst eine weitere und möglicherweise traumatische Behandlung der normalen Zellen, und das Verfahren ist zeitaufwendig. Die Effektivität ist begrenzt, und in der Veröffentlichung wird nichts über das Reinigen einer CD34&spplus;-Zellpopulationen erwähnt, dies wäre jedoch ein Hauptproblem dieses Verfahrens, da die Selektion von CD34&spplus;-Zellen selbst zeitaufwendig und arbeitsintensiv ist. Somit wird in den meisten Fällen für die Selektion von CD34&spplus;-Zellen ein immunmagnetisches Prinzip eingesetzt, das in diesem Beispiel anhand von ein oder zwei immunmagnetischen Schritten zu Reinigungszwecken durchgeführt wird. Aus diesem Grund besteht hier ein deutliches Risiko, dass Zellen zerstört werden oder verloren gehen, und außerdem handelt es sich um ein Verfahren, für das eine langwierige Prozedur erforderlich ist und das hohe Kosten verursacht.
Lemoli, R. M., et al., (1994), Bone Marrow Transplant 13: 465-471, beschreiben eine Reinigung von menschlichen hämatopoetischen CD34&spplus;-Zellen unter Verwendung der Avidin-Biotin-Immunadsorptions-Technik. Sie konnten die neoplastischen Zellen besser entfernen, indem sie verschiedene Immunotoxine einsetzten, die das Ribosomen-inaktivierende Protein Saporin enthielten und die gegen die Lymphoid-assoziierten Antigene CD30 und CD2 gerichtet waren. Tecce, R., et al., (1991), Int. J. Cancer 49: 310-316, beschreiben das Reinigen von autologem Knochenmark vor der Transplantation in Patienten, die an Monozytenleukämie leiden, mit zwei Monozytenlinie-spezifischen Immunotoxinen, die konstruiert wurden mit Saporin und zwei MoAbs mit einer hohen Spezifität für zirkulierende Monozyten und M5b-akute nicht-lymphoide Leukämiq (ANLL). In WO91/09058 werden Immunotoxine beschrieben, umfassend den Myelomonozyten-spezifischen MoAb 195, der eingesetzt werden kann, um Knochenmark von ANLL zu reinigen. Tonevitsky, A. G., et al., (1986), Int. J. Cancer 37: 263-273, beschreiben das Entfernen von murinen erythroleukämischen Stammzellen aus dem Knochenmark, wobei ein Immunotoxin eingesetzt wird, das ein Konjugat aus einer Ricin-A-Kette und dem MoAb MAE15 umfasst, der an die Oberfläche von normalen und von neoplastischen murinen Erythrozyten bindet ein Modell für Studien der Knochenmark-Transplantationstherapie.
Beim Isolieren von Stammzellen für die Transplantation bestand eine der Hauptaufgaben darin, dass die Zellen, die wieder in die Patienten eingeführt werden sollen, in einer Art und Weise selektiv isoliert werden, dass die Transplantate keinerlei maligne Zellen mehr enthalten. Nach dem bisherigen Stand der Technik wurde kürzlich gezeigt, dass solche Zubereitungen von Stammzellen erstaunlicherweise in einer signifikanten Zahl der untersuchten Fälle maligne Zellen aufweisen. Bisher wurden nur in sehr beschränktem Ausmaß Versuche unternommen, um ausgewählte maligne Zellen in solchen Transplantaten zu entfernen oder abzutöten. Dies beruht zum Teil darauf, dass der Fachmann dies bisher nicht für erforderlich hielt, und auch darauf, dass man davon ausgegangen ist dass die zurzeit bekannten Verfahren nicht spezifisch sind und somit auch die empfindlichen Stammzellen abtöten oder entfernen werden. Außerdem ist die Gewinnung von Knochenmark oder von mobilisiertem peripherem Blut aus einem Patienten nicht einfach und nicht unbegrenzt möglich, und außerdem muss ein solches Verfahren zum Reinigen von Stammzellen-Transplantaten innerhalb eines kurzen Zeitraums durchgeführt werden, und es muss unkompliziert sein, um zu vermeiden, dass der normale Stammzellenvorrat vorloren geht oder dass er geschädigt wird. Somit besteht unter Berücksichtigung der vorstehenden Punkte die Voraussetzung bei der Verwendung von Stammzellen-Transplantaten einerseits darin, dass das Transplantat vollständig frei von Krebszellen sein sollte, und andererseits darin, dass die Rekonstitution der Funktion des Knochenmarks schneller erfolgt als nach einer Transplantation mit unselektiertem Knochenmark. Hieraus folgt, dass es unbedingt erforderlich ist, ein Verfahren zu erfinden, das die fragilen normalen Stammzellen intakt lässt und das in Kombination mit den Verfahren zur Isolierung von Stammzellen durchgeführt werden kann.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, ein Verfahren zum Reinigen von Stammzellen-Transplantaten bereitzustellen, bei welchen die vorstehenden Nachteile nicht auftreten.
Solche Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung gelöst die durch die beiliegenden Patentansprüche gekennzeichnet ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft das Reinigen von gewonnenen Stammzellen- Populationen in Fällen mit soliden Tumoren, wobei in dem Verfahren die Zellpopulation einer Zusammensetzung aus zwei oder mehr Antikörpern ausgesetzt wird, die mit bakteriellen Toxinen verbunden sind. Die verwendeten Antikörper sind gegen Zielzellenassoziierte Antigene gerichtet.
Im Folgenden wird die Erfindung genauer beschrieben, wobei ein Beispiel zum Reinigen von aus dem peripheren Blut gewonnenen Stammzellen-Transplantaten dargestellt wird, wodurch die Brustkrebszellen entfernt werden.
Bekannte Techniken zum Gewinnen von Zellen umfassen Immunadsorption/Selektion von Stammzellen aus peripherem Blut (PBSC) oder von CD34&spplus;-Zellen aus dem Blut oder dem Knochenmark. Jedoch sind keine unschädlichen und ausreichend wirksamen Techniken bekannt, mit denen Tumorzellen aus diesen Zellpopulationen entfernt werden können. Es scheint offensichtlich zu sein, dass sogar unter diesen unreifen Zellen maligne Zellen vorliegen, die gemäß dem bisherigen Wissen keine CD34-Rezeptoren aufweisen sollten. Ein wichtiger Punkt ist, dass durch die nachstehend beschriebene Erfindung erstaunlicherweise die Krebszellen auch ohne eine Toxizität für die normalen Vorläuferzellen entfernt werden.
Bevor ein Stammzellen-Transplaritat aus peripherem Blut gewonnen wird, ist es erforderlich, dass die Stammzellen aus dem Knochenmark anhand einer Chemotherapie oder einer Behandlung mit Wachstumsfaktoren nach bekannten Verfahren mobilisiert werden. Die Stammzellen können nach einem oder verschiedenen Verfahren gewonnen werden, abhängig davon, welche Zellart gewünscht wird. In einem Verfahren werden Stammzellen aus peripherem Blut hergestellt. Dies kann erreicht werden, indem Patienten einem Schema unterworfen werden, wobei an den Tagen 10 und 11 der G- CSF-Verabreichung (10 ug/kg/Tag) nach Verabreichung einer hochdosierten Chemotherapie oder nach einer Ganzkörperbestrahlung eine Leukapherese erfolgt. Die Fließrate des Bluts kann z. B. auf 70 ml/Min. eingestellt werden, indem ein CS-300 Plus Blutzellen-Separator verwendet wird (Baxter Healthcare Corporation, Fenwal Division, Deerfield, IL, USA). Durchschnittlich kann während eines solchen Verfahrens bei einem zweilumigen zentralen Venenkatheter ein Blutvolumen von etwa 10 Liter in 2¹/&sub2; Stunden behandelt werden. 50 ml PBSC können gewonnen und mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), 1% menschlichem Serumalbumin (HSA), in einem "Cobe Processor 2991" gewaschen werden, um die Thrombozyten zu entfernen. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann die Konzentration der Zellen (2 bis 4 · 10¹&sup0; pro Apherese) für eine negative Selektion (Reinigung) mit Immunotoxinen auf 1 · 10&sup8;/ml eingestellt werden.
Wenn CD34&spplus;-Zellen gewünscht sind, kann dies durch eine positive Selektion mit ISOLEX 50® oder ISOLEX 300® (Baxter) erfolgen. In diesem Verfahren kann das Produkt aus der Apherese oder aus dem Knochenmark, das etwa 4 · 10¹&sup0; bis 6 · 10¹&sup0; Zellen aufweist, z. B. mit dem gegen CD34&spplus; gerichteten monoklonalen Antikörper 905 bei 0,5 pg/1 · 10&sup6; Zellen gemischt und damit 30 Minuten bei 400 auf einem langsamen Rundschüttler inkubiert werden. Die behandelten Zellen werden mit PBS mit 1% HSA auf einem "Cobe Processor" gewaschen, um den ungebundenen Antikörper zu entfernen. Sodann werden DYNAL®-Kügelchen M-450 zu der CD34&spplus;-Fraktion mit 0,5 Kügelchen pro 1 kernhaltige Zelle für 30 Minuten bei 400 zugegeben. Die magnetische Trennung der Rosetten von den Nicht-Zielzellen kann erfolgen, indem die ungebundenen Zellen zwei- oder dreimal mit PBS, 1% HSA, weggewaschen werden. Anschließend können die CD34&spplus;-Zellen aus den DYNAL®-Kügelchen freigesetzt werden, indem z. B. ChymoCell-R (Chymopapain) in einer Endkonzentration von 200 pKat/ml zugegeben und das Ganze 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert wird. Außerdem sind noch weitere Verfahren zum Selektieren von Stammzellen/frühen Vorläuferzellen bekannt.
Das Bindungsprofil verschiedener Antikörper in Brustkrebs-Zelllinien und in Tumormaterialien wurde durch andere Forscher untersucht und durch uns teilweise bestätigt. Die Antikörper, die an einen großen Prozentsatz von Brustkrebszellen und nicht an wichtige unreife normale Zellen im Blut und im Knochenmark binden, wurden an das Pseudomonas Exotoxin A (PE) konjugiert, und sodann wurde ihre Fähigkeit zum Abtöten von Krebszellen in Kultur untersucht, und zwar hauptsächlich in Kolonieerzeugenden Tests. Aufgrund des Bindungsprofils der Antikörper stellten die Erfinder insgesamt fünf verschiedene Immunotoxine her.
1. MOC31-PE: Dieses Konjugat bindet an einen sehr hohen Prozentsatz aller Brustkrebszellen und war in den Modellexperimenten sehr wirksam und wies in den verwendeten Konzentrationen nur eine geringfügige Toxizität gegenüber den normalen hämatopoetischen Vorläuferzellen auf.
2. NrLu10-PE: Dieses bindet an das gleiche Antigen wie vorstehend, jedoch an ein anderes Epitop. Es ist etwas weniger wirksam als MQC31-PE.
3. BM7-PE: Dieses bindet an den Proteinteil eines Muzin-Antigens, das hauptsächlich auf Brustkrebszellen vorkommt. Das Antigen liegt auf einem großen Prozentsatz von Brustkrebszellen vor, jedoch nicht auf allen. Das Immunotoxin zeigte eine hohe spezifische Aktivität gegenüber Krebszellen, war jedoch nicht so wirksam wie die zwei vorstehenden Immunotoxine.
4. BM2-PE: Dieses bindet an ein Zucker-enthaltendes Epitop auf dem gleichen Antigen wie BM7-PE. Das Immunotoxin zeigte etwa die gleiche Wirksamkeit wie BM7-PE, diese ging mit einer sehr geringen Toxizität für normale Zellen einher.
5. MLuC1-PE: Dieses bindet an ein ganz anderes Antigen, das LewisY- Antigen. Das Immunotoxin war etwas weniger wirksam als das vorherige und zeigte außerdem eine mäßige Toxizität für normale Zellen.
Die Immunotoxine gemäß 1, 2 und 5 wurden einzeln und in Kombination in Modellexperimenten getestet wobei Krebszellen aus herkömmlichen Knochenmarkproben entfernt wurden (Myklebust et al., Cancer Research, 1994). Wie schon erwähnt wurde, ist die Verwendung von Stammzellen-Transplantaten ein großer Vorteil, da die normale Knochenmarkfunktion hierdurch in kürzerer Zeit wiederhergestellt werden kann (d. h. es handelt sich um ein Verfahren mit größerer Sicherheit). Jedoch sind solche Transplantate, entgegen der bisherigen Einschätzung, noch mit Tumorzellen verunreinigt, weshalb es erforderlich war, Immunotoxine anzuwenden, die in der Lage sind, sämtliche Krebszellen in dem Transplantat abzutöten, ohne die normalen Zellen signifikant zu beeinflussen.
Deshalb wurde nach Immunotoxinen gesucht die für Brustkrebs spezifischer sind als MLuC1-PE und die deshalb bei Brustkrebs besser zum Reinigen geeignet sind.
Während dieser Suche wurde erstaunlicherweise entdeckt, dass die Kombination von MOC31-PE und BM7-PE wirksamer war als die Summe der vorher jeweils alleine eingesetzten Immunotoxine. Dies ist in der nachstehenden Tabelle 1 dargestellt.
Weitere Studien zur Bindung zwischen dem Antikörper und den Zelllinien haben gezeigt dass die Kombination eine stärkere Bindung zur Folge hat als die einzelnen Antikörper.
MOC31 bindet an die meisten der Brustkrebszellen, auch an diejenigen, die weniger differenziert sind. BM7 erkennt ein Muzin-Antigen, das auf einer großen Fraktion von Brustkrebszellen exprimiert wird, auch auf Zellen, die stärker differenziert sind. NrLu10 und BM2 binden an das Antigen, das durch MOC31 bzw. BM7 erkannt wird, weshalb die Wahrscheinlichkeit nicht sehr groß ist, dass sie noch irgend etwas zu einer Kombination von MQC31- und 8M7-Immunotoxinen beitragen können. MLuC1-PE war theoretisch dadurch interessant, dass es an ein anderes Antigen als die vorstehend erwähnten Immunotoxine bindet. MLuC1-PE war jedoch für normale Zellen toxisch, und die Modellexperimente zeigten keinen entscheidenden Vorteil, wenn dieses Immunotoxin zu der Kombination zugegeben wurde.
In dem folgenden Beispiel wird das Reinigen von peripheren Stammzellen- Transplantaten (Aphereseprodukten) beschrieben. Außerdem führten die Erfinder verschiedene Experimente durch, wobei die Kombination von MOCS1-PE und BM7-PE in Experimenten eingesetzt wurde, bei denen vor einer immunmagnetischen positiven Selektion von CD34&spplus;-Zellen zu den gewonnenen peripheren Stammzellen oder zum gewonnenen Knochenmark Tumorzellen zugegeben wurden. Die Ergebnisse eines solchen Experiments sind in Tabelle 2 dargestellt. Mit zwei unterschiedlichen Zelllinien wird gezeigt, dass anhand einer positiven Selektion von CD34&spplus;-Zellen selbst (ohne andere Reinigungsform) bis zu 3,8 log Tumorzellen aus der ursprünglichen gewonnenen Zellpopulation entfernt werden können. In anderen Experimenten schwankt die "Reinigungsmwirkung einer CD34-Selektion von 2 bis 3 log, wie auch in der Literatur beschrieben. Wenn die Immunotoxin-Behandlung bei der positiv selektierten CD34-Population angewendet wurde, lag der Gesamt-Reinigungseffekt für beide Zelllinien bei über 4,7 log (Tabelle 2). Mehr als 4,7 log bedeutet in diesem Fall, dass alle nachweisbaren Tumorzellen entfernt wurden. In anderen Experimenten züchteten wir in getrennten Tests Tumorzellen und normale Vorläuferzellen, entnommen aus einer Co34&spplus;-Population, nach einer Stunde Immunotoxin-Behandlung. In diesen Experimenten stellten wir fest dass die Tumorzellen abgetötet wurden oder kurz nach der Behandlung abstarben, während die Tumorzellen in ungereinigten Kontrolipopulationen wuchsen und Kolonien bildeten und/oder sich in Zell-Adhärenztyp-Kulturen vermehrten. Die normalen Stammzellen werden durch die Behandlung nicht beeinflusst, so dass in drei verschiedenen Testsystemen die Überlebenszeiten der normalen Vorläuferzellen nur insignifikant reduziert sind. Tabelle 3 zeigt ein ähnliches Experiment, in dem die CD34&spplus;-Zellen mit den Immunotoxinen zwei Stunden bei 37ºC inkubiert wurden, wobei deutlich gemacht wird, dass die Stammzellen die Immunotoxin-Behandlung im Wesentlichen überleben. Tabelle 1 Wirkung von Immunotoxinen, die PE enthalten, auf das Abtöten von PM1-Brustkrebszellen Tabelle 2 Reinigungseffekte einer positiven immunmagnetischen Selektion von CD34&spplus; alleine und in Kombination mit den gegen Brustkrebs gerichteten MOC31- und BM7-Immunotoxinen in Modellexperimenten mit PM1- und T-47D-Brustkrebszellen, gemischt (1%) mit Stammzellen aus peripherem Blut
a Berechnen der Zahl der durch die Behandlung abgetöteten Zellen aus der festgestellten Kolonienzahl, wobei die Plattierungseffizienz berücksichtigt wurde;
b Mittelwert der Ergebnisse, die in unabhängigen Experimenten erhalten wurden, die jeweils in dreifacher Ausführung durchgeführt wurden.
c Die Immunotoxine MOC31-PE und BM7-PE wurden in einer Konzentration von jeweils 1 ug/ml eingesetzt. Tabelle 3 Wirkung von IT auf das Überleben von Kolonien bei CD34&spplus;-Zellen, die aus mobilisiertem peripheren Blut selektiert wurden. 1 · 10&sup5; CD34&spplus;-Zellen wurden mit den Immunotoxinen zwei Stunden bei 37ºC inkubiert, in CFU-GM- und CFU-GEMM-Kulturen ausgesät (5 · 10³/Platte) und wie in "Material und Methoden" im Beispiel beschrieben getestet.
Es war sehr erstaunlich, dass durch die Verwendung von zwei gegen durch Epithelzellen exprimierte Antigene gerichteten Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung, die jeweils kombiniert waren mit dem bakteriellen Toxin Pseudomonas Exotoxin A, die malignen Zellen abgetötet wurden, ohne dass die normalen Stammzellen in dem aus dem pheripheren Blut oder dem Knochenmark gewonnenen Produkt in irgendeiner Weise geschädigt wurden. Nach dem Stand der Technik ist bekannt, dass Zellen durch bakterielle Exotoxine abgetötet werden können und dass die Tötungswirkung verstärkt wird, indem das Toxin mit Antikörpern verbunden wird, die gegen Epitope gerichtet sind, welche durch die Zielzellen exprimiert werden. Jedoch ist auch bekannt dass sehr wohl die Möglichkeit besteht, wenn unreife Zellen einem oder mehreren Toxinen ausgesetzt werden, dass durch diese Behandlung die normalen Stammzellen in der Zellpopulation abgetötet werden. Außerdem sind diese normalen Stammzellen empfindlich gegenüber einer ex-vivo-Behandlung, die mit mechanischen Traumata und Temperaturänderungen einhergeht. In der vorliegenden Erfindung wird die Zellpopulation, z. B. ein Stammzellen-Transplantat, das aus peripherem Blut gewonnen wurde, einer Zusammensetzung aus zwei Antikörpern ausgesetzt, die jeweils mit PE konjugiert sind. Obwohl ein einzelnes Immunotoxin schon äußerst wirksam war, kann erstaunlicherweise gezeigt werden, dass bei Verwendung einer Zusammensetzung aus zwei Antikörpern, die mit einem bakteriellen Toxin verbunden sind, die Reinigungswirkung noch größer zu sein scheint als die Summe der Effekte, die bei getrennter Verwendung der immunotoxine erhalten werden. Dieser synergistische Effekt wird in Tabelle 4 der vorliegenden Beschreibung gezeigt, wobei die Antikörper BM7 und MOC31, die mit dem Pseudomonas Exotoxin A verbunden sind, zum Abtöten von PMI -Brustkrebszellen des Menschen eingesetzt werden. Die Immunotoxine enthalten die beiden monoklonalen Antikörper, die gegen Tumorassoziierte Antigene gerichtet sind, wobei die Antikörper mit dem bakteriellen Toxin Pseudomonas Exotoxin A verbunden sind. Einer der Antikörper erkennt ein Epithel-Antigen, das durch das Gen GA 733-2 codiert ist, welches durch die meisten Karzinomzellen exprimiert wird, und daher kann er in allen Fällen verwendet werden, an denen Karzinome beteiligt sind (z. B. Brustkrebs, kolorektaler Krebs, Prostatakrebs, Ovarkrebs, Lungenkrebs und Pankreaskrebs). Der andere Antikörper ist gegen Muzin gerichtet, ein Mukusprotein, das sich bei den verschiedenen Karzinomtypen geringfügig unterscheidet. Normalerweise können die Antigene als Proteine beschrieben werden, die durch die Gene MUC-1, MUC-2 und MUC-3 codiert sind. Beispiele der vorstehend erwähnten monoklonalen Antikörper sind MOC31 und BM7.
Die Konjugation von Antikörper und Toxin kann durch verschiedene bekannte Verfahren erfolgen. Zwei oder mehrere Antikörper, die in der Zusammensetzung an die bakteriellen Exotoxine gekoppelt werden sollen, werden so ausgewählt, dass die Bindung der Antikörper an Epitope erfolgt die auf der Mehrheit der Zielzellen und nicht auf den normalen Zellen exprimiert werden. Das bisherige Problem bestand darin, dass sowohl maligne Zellen als auch normale Blutzellen gemeinsame Antigene auf der Zelloberfläche exprimieren. In dem in der vorliegenden Beschreibung enthaltenen Beispiel werden die zwei monoklonalen Antikörper MOC31 und BM7 verwendet. Der erstere dieser Antikörper ist gegen Epithelzellen gerichtet, die, wenn sie im peripheren Blut vorliegen, maligne sind. Das Antigen (das ganze Protein) ist durch das Gen GA 733-2 codiert. Jedoch hat dieses Antigen verschiedene Epitope, und es ist wichtig, auf die Epitope zu zielen, die am häufigsten exprimiert werden.
Der Antikörper BM7 ist einer der Antikörper, die gegen ein Epitop des durch das Gen MUC1 exprimierten Antigens gerichtet sind. Mehrere Gene codieren ähnliche Antigene (z. B. MUC2, MUC3).
Das bakterielle Toxin, das Pseudomonas Exotoxin A, hat eine relativ mäßige toxische Wirkung auf normale Stammzellen und auf maligne Zellen. Wenn es jedoch mit Antikörpern verbunden ist, die gegen die auf den Zielzellen exprimierten Antigene gerichtet sind, ist die toxische Wirkung gegenüber diesen Zellen erheblich verstärkt. In Tabelle 5 wird gezeigt, dass das Gemisch aus Immunotoxinen gemäß der Erfindung sogar nach einer kurzen Inkubationszeit von nur 60 Minuten T-47D-Zellen, MCF7- Zellen und PM1-Zellen mit einem viel höheren Wirkungsgrad abtötet, als nach dem Stand der Technik für andere Verfahren bekannt ist. Die Kombination dieser zwei Immunotoxine ergibt somit erstaunliche Ergebnisse im Bezug auf die Werte, die vorausgesagt werden können, und zwar aufgrund der selektiven Wirksamkeit, der Einfachheit und der nur geringfügigen Toxizität gegenüber normalen Vorläuferzellen.
Es könnte geltend gemacht werden, dass die Verwendung verschiedener Immunotoxine bereits bekannt ist, wobei die Immunotoxine aus Pseudomonas Exotoxin A bestehen, das an drei verschiedene Antikörper konjugiert ist, vgl. Myklebust et al., 1993 und 1994. Einer der Antikörper (MOC31) wurde in ähnlicher Weise wie in der vorliegenden Erfindung eingesetzt, um unselektierte Knochenmarkzellen zu reinigen. Die anderen verwendeten Antikörper scheinen jedoch nicht optimal zu sein, u. a. deshalb, weil einer von ihnen gegen das gleiche Antigen wie MOC31 gerichtet ist und weil der andere (MLuC1) mit normalen Zellen kreuzreagiert, weshalb das an diesen Antikörper gebundene Immunotoxin leicht für die meisten unreifen Stammzellen toxisch sein könnte. In der vorliegenden Erfindung zum Reinigen von Stammzellen-Zubereitungen haben wir einen anderen monoklonalen Antikörper hergestellt der zur Wirkung von MOC31 beiträgt und wir haben festgestellt, dass die Kombination dieser zwei als Immunotoxine eingesetzten Antikörper zu sehr erstaunlichen Ergebnisse führt.
Aufgrund der hochspezifischen Aktivität der beschriebenen Immunotoxine scheint es möglich zu sein, das Gemisch als in-vivo-Behandlung an Patienten zu verabreichen, die an verschiedenen Arten von Karzinomen leiden. Wenn die Krebserkrankung begrenzt ist, besteht die Möglichkeit, jedes von ihnen oder das Gemisch zu injizieren oder intravenös zu infundieren, z. B. wenn gezeigt wurde, dass sich die Krankheit auf das Knochenmark ausgebreitet hat. Außerdem ist es möglich, die Immunotoxine alleine oder in Kombinationen den Patienten zu injizieren, bei denen sich die Krankheit weiter ausgebreitet hat und bei denen eine abdominale Flüssigkeit (Aszites) oder ein Pleuralerguss vorliegt. Eine dritte Möglichkeit besteht darin, Patienten zu behandeln, bei denen sich der Krebs auf das Zentralnervensystem ausgebreitet hat. In diesem Fall können die Immunotoxine direkt in das Tumorgewebe, in die Spinalflüssigkeit oder in die Arterie, die das Gehirn mit Blut versorgt, injiziert werden.
Bisher ist nichts bekannt, dass diese Immunotoxine in vivo eingesetzt wurden, mit Ausnahme von MOC31-PE, das in einem Leptomeninx-Tumormodell für kleinzelligen Lungenkrebs verwendet wurde. BM7-PE ist in der Literatur überhaupt noch nicht beschrieben.
Ein wichtiges Problem bei der in-vivo-Verwendung von Immunotoxinen besteht darin, dass ihre Halbwertszeiten häufig sehr kurz sind, d. h. die Immunotoxine werden gespalten und aus dem Blut entfernt, bevor die Konzentration im Tumor hoch genug ist. Im US PS 5 322 678 haben Morgan et al. eine Modifikation des Antikörperteil eines Immunotoxins patentiert, um das Problem mit der kurzen Halbwertszeit in vivo abzuschwächen. Der Erfinder schlägt eine ähnliche Modifikation des Toxinteils vor, ein Verfahren, das bisher nicht durchgeführt wurde und bisher nicht bekannt war.

Beispiel 1

Wirksames Entfernen von Brustkrebszellen aus den aus peripherem Blut gewonnenen Stammzellen mit Immunotoxinen

Einleitung

Immer häufiger wird eine hochdosierte Chemotherapie in Kombination mit einer Gabe autologer hämatopoetischer Stammzellen zur Behandlung von Patienten mit den verschiedensten Krebserkrankungen eingesetzt (1, 2). In Fällen, in denen diese Vorgehensweise erfolglos ist, ist der häufigste Grund ein Rezidivieren der Krankheit und nicht eine Toxizität, Infektionen und ein fehlendes Einwachsen des Transplantats (3). Es gibt deutliche Beweise, dass bei Patienten, die eine hochdosierte Behandlung erhalten, die Reinfusion von Autotransplantaten, die klonogene Tumorzellen enthalten, dazu beitragen kann, dass es zu einem Rückfall kommt oder der Ausgang beeinflusst wird (4). Untersuchungen mit Genmarkierungen an autotranspiantierten Zellen haben gezeigt dass Tumorzellen, die in dem reinfundierten Knochenmark verblieben sind, dazu beitragen, dass die Krankheit erneut auftritt (5). Diese Schlussfolgerung wird weiterhin durch Ergebnisse bei Patienten mit follikulären Lymphomen bestärkt, die zeigen, dass die erkrankungsfreie Überlebenszeit durch eine wirksame BM-Reinigung verlängert wird (6).
Anhand empfindlicher immunzytochemischer Techniken kann eine Verunreinigung mit Tumorzellen in histologisch normalen Knochenmark-Autotransplantaten festgestellt werden, und zwar in einem Bereich von 37 bis 62% der Brustkrebspatientinnen, die eine hochdosierte Behandlung durchlaufen (7). Periphere Blut-Stammzellen (PBSC)-Autotransplantate, die durch Apherese nach einer Vorbehandlung mit hämatopoetischen Wachstumsfaktoren und Chemotherapie gewonnen wurden, werden immer häufiger eingesetzt, in dem Glauben, dass diese Produkte mit geringer Wahrscheinlichkeit Tumorzellen enthalten. Kürzlich wurde jedoch gefunden, dass die Beteiligung von Tumorzellen in PBSC-Autotransplantaten zwar weniger ausgeprägt ist als in den BM- Präparaten, dass maligne Zellen aber immer noch häufig in mobilisierten PBSC- Präparaten aus Brustkrebspatientinnen gefunden wurden (4, 7). Außerdem zeigen kürzliche Ergebnisse, dass eine Chemotherapie und/oder Wachstumsfaktoren möglicherweise Tumorzellen in das periphere Blut von Patienten mobilisieren, und zwar sowohl bei Patienten, bei denen früher Krebszellen im Knochenmark nachweisbar waren, als auch bei solchen, bei denen dies nicht möglich war (7, 8), wobei diese Ergebnisse zeigen, dass das Risiko einer Verunreinigung mit Tumorzellen in PBSC-Transplantaten noch größer ist.
Um eine Reinfusion von malignen Zellen zu vermeiden, kann es erforderlich sein, dass PBSC-Autotransplantate in vitro von Brustkrebszellen gereinigt werden. Wir beschreiben hier ein praktisch durchführbares und schnelles Reinigungsverfahren, mit dem gezeigt wird, dass durch eine Inkubationsprozedur von 60 Minuten mit ITs, die direkt zu dem Aphereseprodukt zugegeben werden, mehr als 5 log Tumorzellen selektiv abgetötet werden.

Material und Methoden

Zelllinie: Die Brustkrebs-Zelllinie PMI wurde in unserem Labor aus der Aszitesflüssigkeit angelegt, die von einer Patientin mit fortgeschrittener Krankheit entnommen wurde. Die Zelllinien MCF7 und T-47D wurden von der American Type Culture Collection erhalten (Rockville, MD) (ATCC HTB 22 bzw. ATCC HTB 133). Die Zellen wurden bei 37ºC in einer 5% CO&sub2;-Atmosphäre in RPMI 1640-Medium (RPMI) gezüchtet, das angereichert war mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS) und Antibiotika (100 U/ml Penicillin, 100 pg/ml Streptomycin). Medium und Zusätze wurden von GIBCO (Paisley, UK) bezogen.
Menschliches Knochenmark ("Bone Marrow") und periphere Blut-Voräuferzellen: BM-Zellen wurden aus gesunden freiwilligen Spendern erhalten. Die Fraktion der BM- mononukleären Zellen (MNC) wurde durch Lymphoprep® (Nycomed Pharma, Oslo, Norwegen) erhalten und zweimal in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, bevor sie in den Experimenten eingesetzt wurden. Die PBSCs wurden aus Patienten mit Non-Hodgkin-Lymphom gewonnen. Um die PBSCs zu mobilisieren, wurden die Patienten mit Chemotheraple plus hämatopoetischen Wachstumsfaktoren vorbehandelt (G-CSF, Neupogen, Amgen/Hoffman-La Roche, Basel, Schweiz). 11 bis 12 Tage nach der Chemotherapie, wenn die Zahl der CD34&spplus;-Zellen im peripheren Blut hoch ist, wurden die Stammzellen gewonnen, indem ein CS-3000 Plus Blutzellen- Separator (Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division, Deerfield, IL) eingesetzt wurde.
Toxin, Antikörper und Konstruktion von Immunotoxinen: Der gegen MUC1 gerichtete (9) Antikörper BM7 (IgG1) war ein Geschenk von S. Kaut (Frauenklinik, Universität Heidelberg, Bundesrepublik Deutschland), und der gegen EGP2 gerichtete (10) Antikörper MQC31 (tgG2a) wurde freundlicherweise von L. de Leij (Universität Groningen, Niederlande) und von MCA Development (Groningen) zur Verfügung gestellt PE wurde vom Schweizer Serum- und Impfinstitut (Bem, Schweiz) erhalten. Jeder Antikörper wurde über eine Thioetherbindung an PE konjugiert, die mit Sulfosuccinimidyl-4-(N- maleinimidomethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Pierce, Rockford, IL) wie früher beschrieben (11) gebildet wurde.
Immunotoxin-Behandlung: Die Wirkung der IT-Behandlung auf das Überleben von klonogenen Brustkrebszellen wurde getestet, indem 2 · 106 exponentiell wachsende Tumorzellen in RPMI mit FCS mit den angegebenen Konzentrationen der ITs bei 37C unter leichter Bewegung (100 UpM auf einem Rundinkubator, Gallenkamp, Leicestershire, GB) verschiedenen Zeiten inkubiert wurden, wie für jedes Experiment angegeben. Die Zellen wurden zweimal in PBS mit 1% FCS gewaschen, bevor sie im klonogenen Test ausgesät wurden.
In einigen Experimenten wurden 10% Tumorzellen zu den BM-mononukleären Zellen oder zu den PBSCs zugemischt, mit ITs inkubiert, gewaschen und die Wirkung auf das Überleben von Tumorzellen oder von hämatopoetischen klonogenen Vorläuferzellen festgestellt.
Kolonietests auf Tumor- und hämatopoetische Vorläuferzellen: Der verwendete klonogene Weichagartest für Tumorzellen wurde früher beschrieben (12). Dreifache Kulturen wurden 14 Tage bei 37ºC in 5% CO&sub2;, 5% O&sub2; und 90% N&sub2; inkubiert und Kolonien mit mehr als 50 Zellen in einem Zeiss-Stereomikroskop gezählt.
Die klonogene Fähigkeit von behandelten und unbehandelten normalen Vorläuferzellen wurde in CFU-GEMM-Tests (13) festgestellt, in denen 5 · 10&sup4; PBSCs pro ml einzeln in Standard-Methylzellulose-Kulturen (HCC-4433 Methocult, Terry Fox Labs, Vancouver, BC) in IMDM-Medium (GIBCO) gezüchtet wurden. Nach 19 Tagen Inkubation wurden die BFU-E- und CFU-GM-Kolonien in einem Umkehrphasen- Kontrastmikroskop gezählt. Jeder Test wurde mit dreifachen Kulturen von 1 ml in 35- mm-Schalen bei 37ºC in einer Atmosphäre von 5% CO&sub2; und 100% Feuchtigkeit durchgeführt.

Ergebnisse

Wachstum menschlicher Brustkrebszellen in Weichagar: In verschiedenen Experimenten wurde ein linearer Zusammenhang zwischen der Zahl der ausgesäten Tumorzellen und der Zahl der gebildeten Tumorkolonien festgestellt. Mit der Zelllinie PM1 lag die Klonierungseffizienz im Bereich von 20 bis 30% (nicht dargestellt). In Expeilmenten mit den Zelllinien T-47D und MCF7 wurde der früher beschriebene (14) lineare Zusammenhang mit PEs von 27% bzw. 22% bestätigt. Anhand dieser Ergebnisse wurde die mit der Behandlung erhaltene Effizienz bei der Entfernung von Brustkrebszellen errechnet.
Wirksamkeit einzelner Immunotoxine oder eines Gemisches aus Immunotoxinen beim Abtöten von Brustkrebszellen: In Modellexperimenten wurden drei verschiedene Konzentrationen von jedem IT verwendet. Wie in Tabelle 4 dargestellt ist wurden mit dem BM7-Konjugat bei den zwei niedrigeren Konzentrationen nur geringfügige Effekte festgestellt, während bei 1,0 pg/ml eine Tötung von 2,5 log Zellen erreicht wurde. Mit MOC31 war bei 0,1 pg/ml eine Tötung von fast 3 log Zellen zu sehen, und bei der höchsten Konzentration (1 ug)ml) betrug die Wirksamkeit mindestens 5 log, wobei es sich um die maximale Wirkung handelte, die in diesem Test erreicht werden konnte (14). Mit dem Gemisch aus den beiden ITs, jedes in den angegebenen Konzentrationen, wurden alle Tumorzellen bereits bei 0,1 pg/ml abgetötet (Tabelle 4). Die Ergebnisse zeigen, dass das Gemisch aus den zwei ITs die Brustkrebszellen sehr wirksam abtöten kann, und außerdem legen die Daten nahe, dass eine Additivität erhalten werden kann, wenn die zwei Konjugate miteinander kombiniert werden. Ähnliche Ergebnisse wurden erhalten, wenn die Wirksamkeit der ITs gegenüber zwei anderen Brustkrebs- Zelllinien getestet wurde (nicht gezeigt). Aufgrund der zu erwartenden Heterogenität bei der Antigenexpression auf Zielzellen war es logisch, dass die IT-Kombination noch für die weitere Entwicklung eines für den klinischen Einsatz geeigneten Verfahrens eingesetzt wird.

Tabelle 4

Wirksamkeit von Immunotoxinen, die das Pseudomonas Exotoxin A enthalten, beim Abtöten menschlicher PM1-Brustkrebszellen

PM1-Zellen wurden mit den Immunotoxinen zwei Stunden bei 37ºC inkubiert, in Weichagar ausgesät und die Koloniebildung festgestellt, wie in "Material und Methoden" beschrieben.
a Berechnet aus der festgestellten Kolonienzahl, wobei die Plattierungseffizienz berücksichtigt wurde, und bestimmt als Logarithmus der Zahl der durch die Behandlung abgetöteten Zellen.
b Mittelwert der Ergebnisse, die in unabhängigen Weichagar-Experimenten erhalten wurde, die jeweils in dreifacher Ausführung durchgeführt wurden.
c Jedes Immunotoxin wurde in der angegebenen Konzentration eingesetzt.
Einfluss der Inkubationszeit: In den vorstehenden Experimenten wurde die Inkubation mit den ITs 120 Minuten durchgeführt. Unter klinischen Bedingungen wäre es aus praktischen Gründen vorteilhaft, wenn eine noch kürzere Inkubationszeit eingesetzt werden könnte. Um zu testen, ob die Expositionszeit gegenüber den ITs verkürzt werden kann, ohne die spezifische Tötung von Tumorzellen zu beeinflussen, wurde das Gemisch aus den zwei Konjugaten, die jeweils bei einer Konzentration von 1 ug/ml eingesetzt wurden, mit verschiedenen Inkubationszeiten gegenüber den drei Brustkrebs- Zelllinien getestet. In allen Fällen führte die Exposition von 120 Minuten gegenüber den ITs zu einer Auslöschung aller Tumorzellen. Es ist sehr wichtig, dass die Behandlung genauso wirksam war, wenn die Inkubationszeit auf 90 Minuten und sogar auf 60 Minuten verkürzt wurde (Tabelle 5), wobei die Ergebnisse zeigen, dass bei den verwendeten IT-Konzentrationen die kürzeste Inkubationszeit ausreicht, um sämtliche, in den Tumorzellkulturen vorliegenden, klonogenen Tumorzellen abzutöten.

Tabelle 5

Einfluss der Inkubationszeit auf die Wirksamkeit eines Gemisches aus den MOC31- und BM7-Immunotoxinena beim Abtöten von Brustkrebszellen

Tumorzellen alleine (2 · 10&sup6;/ml) oder gemischt (Verhältnis von 1 : 10) mit peripheren Blut-Vorläuferzellen (insgesamt 1 · 10&sup7; Zellen/ml) wurden mit ITs bei 37ºC die angegebenen Inkubationszeiten inkubiert, in Weichagar ausgesät und wie in Tabelle 4 getestet.
a Jedes IT wurde in einer Konzentration von 1 ug/ml eingesetzt.
b Ergebnis, das in zwei unabhängigen Experimenten mit T-47D- und PM1-Zellen und in einem Experiment mit MCF7-Zellen erhalten wurde.
Um zu untersuchen, ob die Toxizität gegenüber Brustkrebszellen in Gegenwart einer hohen Zahl von normalen hämatopoetischen Zellen verändert sein könnte, wurden Experimente durchgeführt, in denen die Tumorzellen in einem Verhältnis von 1 : 10 mit den durch Apherese gewonnenen PBPCs gemischt wurden. Wie in Tabelle 5 zu sehen ist töteten die ITs mehr als 5 log der PMI-Tumorzellen auch in Gegenwart der normalen Zellen ab, und zwar bereits nach einer Inkubationszeit von nur 60 Minuten. Da die Ergebnisse für alle drei Zelllinien gleich waren, zeigen die Daten, dass das IT- Verfahren unter klinischen Bedingungen wirksam eingesetzt werden kann.
Einfluss von Inkubationsbedingungen und Zellkonzentration: Um die Wirksamkeit des IT-Verfahrens unter Bedingungen zu untersuchen, die ähnlich sind wie die Bedingungen bei klinischen Proben, wurden in Experimenten PMI-Tumorzellen in einem Verhältnis von 1 : 10 mit PBPCs gemischt, wobei die ungewaschenen Zellen, die vor der Inkubation mit den ITs direkt aus dem Apheresebeutel entnommen wurden, in normaler Kochsalzlösung mit ACD resuspendiert wurden (Vorratslösung-Beutel, R 2220, Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division). Die Ergebnisse wurden mit denen verglichen, die in den einleitenden Experimenten mit Zellen erhalten wurden, die in RPMI mit 10% 'FCS gewaschen und resuspendiert wurden. Dabei wurde gefunden (Tabelle 6), dass in beiden Fällen die Behandlung mit den ITs für 60 Minuten alle PMI-Zellen abtötetet, dies zeigt, dass die ITs bei der klinischen Anwendung direkt in den Apheresebeutel injiziert werden können und dass der niedrige pH-Wert unter solchen Bedingungen die Zytotoxizität der ITs nicht beeinflusst.

Tabelle 6

Wirkung der Inkubationsbedingungen auf die Wirksamkeit eines Gemisches aus den MOC31- und BM7-Immunotoxinen beim Abtöten von PM1-Brustkrebszellen, gemischt (im Verhältnis von 1 : 10) mit peripheren Blut-Voräuferzellen, isoliert durch Apherese anhand eines Blutzellen-Separators

Zellen aus dem Apheresebeutel wurden in drei Röhrchen überführt, so dass jedes 1 · 10&sup8; Zellen enthielt. In zwei Röhrchen wurden die Zellen (in Volumina von 500 bis 700 ul) in PBS mit 20% ACD und 1% menschlichem Albumin auf ein Endvolumen von 1 ml verdünnt. Eines der Röhrchen wurde als Kontrolle und für die IT-Inkubation verwendet (Gruppe A). Die Zellen in dem dritten Röhrchen wurden gewaschen und auf 1 ml in RPMI mit 10% FCS resuspendiert (Gruppe B). In den Behandlungsgruppen wurden die Zellen eine Stunde bei 37ºC mit 1 ug/ml von jedem IT inkubiert, gewaschen und in Weichagar ausgesät, wobei die Tests und Berechnungen wie in Tabelle 1 erfolgten. Die Plattierungseffizienz in den unbehandelten Kontrollkulturen lag im Bereich von 20 bis 30%.
Im Apheresebeutel ist die Gesamtzahl der Zellen ziemlich hoch, und es wäre denkbar, dass bei solch hohen Zellkonzentrationen die Wirksamkeit des Verfahrens im Vergleich zu den in den Modellstudien verwendeten Bedingungen möglicherweise abgeschwächt sein könnte. Jedoch wurde in den Experimenten, in denen diese Möglichkeit getestet wurde, kein Unterschied in der Wirksamkeit festgestellt, wenn die Gesamtkonzentration der Zellen zuerst von 1 · 10&sup7; auf 5 · 10&sup7; und dann auf 1 · 10&sup7; pro ml erhöht wurde (Tabelle 6).
Toxizität der ITs auf normale hämatopoetische Vorläuferzellen: Die Wirkung der ITs auf das Überleben von CFU-GM und BFU-E wurde unter den Bedingungen wie vorstehend beschrieben untersucht. Es wurde gefunden (Tabelle 7), dass sogar bei einer Inkubation von 120 Minuten der kernhaltigen PBPCs mit dem IT-Gemisch die Überlebenszeit der Vouläuferzellen nicht verkürzt war, egal ob der Test nach Waschen und Resuspendieren der Zellen in RPMI plus 10% FOS oder an ungewaschenen Zellen, resuspendiert in normaler Kochsalzlösung mit ACD, erfolgte.
Da die behandelten Zellen unter klinische Bedingungen eingefroren und aufgetaut werden, bevor sie dem Patienten wieder zurückgegeben werden, wurde auch die Wirkung solcher Prozeduren auf die Vorläuferzellen untersucht. Dabei wurde gefunden, dass das Einfrieren und Auftauen die Zahl der CFU-GM und der BFU-E nur leicht reduzierte (Tabelle 7). Es ist zu beachten, dass die IT-Behandlung selbst das Überleben der Vorläuferzellen nicht signifikant reduzierte, wobei jedoch eine leichte Reduktion der durchschnittlichen Zahl der Zellkolonien in der Gruppe zu sehen war, in der die Zellen unter Bedingungen mit niedrigem pH-Wert behandelt wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Konzentration von ITs, die wirksam die Tumorzellen nach 60 Minuten Inkubation ausrotten, nur eine insignifikante Wirkung auf das Überleben von normalen klonogenen Zellen haben, die zweimal so lange behandelt wurden.

Tabelle 7

Toxizität eines Gemisches aus den MOC31- und BM7-Immunotoxinen auf CFU-GM und BFU-E in frischen menschlichen PBPCs, gewonnen nach Mobilisierung mit G-CSF. Wirkung der Inkubationsbedingungen und der Einfrierprozedur.

Kontroll- und Behandlungsgruppen wie in Tabelle 6. Kernhaltige PBPCs wurden mit 1 ug/ml von jedem der ITs zwei Stunden bei 37ºC inkubiert, bevor sie in dem Test ausgesät wurden (5 x 10&sup4; Zellen/Schale), wie in "Material und Methoden" beschrieben.
a Mittelwert ±SD der Ergebnisse, die aus dreifachen Kulturen in zwei getrennten Experimenten erhalten wurden

Diskussion

Die autologe Transplantation von zirkulierenden hämatopoetischen Stammzellen zog kürzlich gesteigertes Interesse auf sich, da hiebei Vorteile im Vergleich zur BM- Transplantation deutlich wurden (15, 16). Zusätzlich zu dem Vorteil, dass die Knochenmarkfunktion schnell rekonstituiert wird, wurde vermutet dass durch die Verwendung von PBSCs das Risiko ausgeschaltet werden könnte, dass Tumorzellen reinfundiert werden, die das Transplantat verunreinigen. Jedoch wurde gezeigt, dass das Problem der Verunreinigung mit Tumorzellen zwar abgeschwächt, jedoch nicht ganz beseitigt ist (4). Außerdem sollte beachtet werden, dass durch eine hochdosierte Chemotheraple, die die Verwendung von koloniestimulierenden Faktoren einschließt, möglicherweise Tumorzellen ins periphere Blut freigesetzt werden (7, 8). Aus diesem Grund besteht ein großer Bedarf für ein schnelles und praktisch durchführbares Verfahren zum Reinigen von Aphereseprodukten.
Verschiedene Verfahren zum Entfernen von Brustkrebszellen aus BM wurden beschrieben, umfassend eine Chemo-Immuntrennung, immunmagnetische Verfahren und die Verwendung von Immunotoxinen (14, 17, 18, 19). Im Gegensatz dazu wurden nur sehr wenigen Studien zum Reinigen von PBSC-Präparaten beschrieben (20, 21), jedoch wurden ITs, hergestellt mit einem Ribosomen-inaktivierenden Protein (22, 23), eingesetzt um lymphoide Tumorzellen abzutöten, die zu CD34-positiven Zellpräparaten zugegeben wurden, welche aus BM hergestellt worden waren (24). In der letzeren Untersuchung wurde eine Reinigungswirkung von 2 log erhalten, zusätzlich zu den 3 log der indirekten Reinigung, die durch das CD34-Selektionsverfahren erreicht wurden. Die Aufgabe der vorliegenden Studie bestand darin, ein sicheres IT-Verfahren zu entwickeln, um Brustkrebszellen aus den PBSCs zu entfernen. Die in Modellexperimenten erhaltenen Ergebnisse machen deutlich, dass eine Inkubation von 60 Minuten mit 1 ug/ml von jedem von zwei Konjugaten, die Anti-Karzinom-Antikörper und PE enthalten, sämtliche Tumorzellen, die den PBSCs beigemischt waren, wirksam abtötete, ohne dass eine Toxizität gegenüber den normalen Vorläuferzellen auftrat. Es ist wichtig, dass das Verfahren es möglich macht, dass die ITs direkt zu dem Aphereseprodukt zugegeben werden können und dass die Zellen nach der Inkubation gewaschen und zentrifugiert werden und sodann bereit fürs Einfrieren sind. Das Verfahren sollte insbesondere aufgrund seiner Einfachheit und Wirksamkeit attraktiv sein für die Verwendung zur Behandlung von ausgewählten Gruppen von Brustkrebspatientinnen in Verbindung mit einer hochdosierten Chemotherapie, kombiniert mit der Transplantation von PBSCs. Die hochselektive Wirksamkeit unseres Verfahrens lässt sich auf die folgenden Faktoren zurückführen:
Erstens ist bekannt, dass das Antigen, das durch den Antikörper MOC31 erkannt wird, auf den meisten Zellen in fast allen untersuchten Brustkrebsproben exprimiert wird (10). Außerdem bindet der Antikörper BM7, der das durch das Gen MUC-1 exprimierte Kernprotein erkennt (9), an eine große Fraktion von Brustkrebszellen (25). Diese beiden monoklonalen Antikörper scheinen zusammen die bei Brustkrebs nachgewiesene Heterogenität der Antigenexpression abzudecken, und zwar in einem angemessenen Ausmaß. Zweitens haben wir schon früher gezeigt, dass es beim Konstruieren von ITs wichtig ist, ein Toxin zu verwenden, das zu den verwendeten Antikörpern passt (11). Wir haben gefunden, dass. PE-Konjugate sehr wirksam sind, an denen verschiedene monoklonale Antikörper beteiligt sind, einschließlich der hier verwendeten Antikörper (14). Darüber hinaus sind ITs mit PE immer toxischer als äquimotare Konzentrationen von freiem PE (11,18), dies macht die Spezifität solcher ITs deutlich.
Reinigungsverfahren müssen wirksam und sicher sein, außerdem ist es erforderlich, dass das Verfahren praktisch durchführbar ist und in einem klinischen Maßstab eingesetzt werden kann. Zusätzlich zu dem Vorteil, dass die ITs direkt zu dem Apheresebeutel zugegeben werden können, ist in unserem Verfahren eine Inkubationszeit von nur 60 Minuten für das Abtöten sämtlicher onkogener Tumorzellen erforderlich. Außerdem ist diese Behandlung für normale hämatopoetische Vorläuferzellen nicht toxisch, und in BM-Reinigungsexperimenten wurden sogar noch höhere IT- Konzentrationen gut toleriert (14). Ferner haben wir gezeigt, dass das Einfrieren und Auftauen der mit den ITs behandelten PBSCs keine weitere Toxizität verursachte, und man sollte beachten, dass bei dem IT-Verfahren kein unspezifischer Verlust von Zellen auftritt, der z. B. bei Verfahren vorkommen kann, bei denen Tumorzellen mit Hilfe von Immunkügelchen oder Immunadsorption entfernt werden.
Wir haben früher die Menge des Konjugats, das nach dem Waschen in dem IT- behandelten BM verblieb, auf etwa 0,75% der zugegebenen Gesamtmenge berechnet (26). Unter klinischen Bedingungen kann man also davon ausgehen, dass die Behandlung von PBSCs, enthaltend etwa 2 · 10¹&sup0; mononukleäre Zellen, mit der empfohlenen Konzentration von 2 ug IT/ml (1 · 10&sup8; Zellen), zur Folge hat, dass im Endprodukt maximal 3 ug IT vorliegen. Dies stellt 100- bis 150-mal weniger freies Toxin dar als die theoretisch errechnete maximal tolerierbare Dosis (26). Somit kann man davon ausgehen, dass die Reinfusion der gereinigten PBSCs keinerlei systemische Toxizität ergibt.
Der Erfolg oder der Misserfolg einer hochdosierten Therapie in Kombination mit der Transplantation von autologen hämatopoetischen Vorläuferzellen hängt möglicherweise sogar mehr von der Wirksamkeit der systemischen Behandlung ab als von der Effizienz der Reinigung der Transplantate (1). Trotzdem ist es logisch, die Krebszellen zu entfernen, die im Autotransplantat vorliegen könnten, und außerdem zeigen kürzlich erhaltene Ergebnisse von Studien an anderen Tumortypen, wie wichtig die Reinigung ist (16). Beim Brustkrebs schlagen wir die Verwendung eines einfachen, sicheren und wirksamen Verfahrens vor, wie es hier beschrieben wird.

Beispiel 2

Da Brustkrebszellen möglicherweise eine unterschiedliche Empfindlichkeit gegenüber Immunotoxinen aufweisen, so dass die Reinigungswirkung von BM7 und MOC31 bei Brustkrebszellen aus verschiedenen Patienten unterschiedlich sein kann, wurde das gleiche Experiment, das vorstehend mit PM1-Brustkrebszellen durchgeführt wurde (Beispiel 1), mit einer anderen Zelllinie, MAI 1, wiederholt Dabei wurde gefunden, dass die Wirkung der Immunotoxin-Behandlung gegen die MAI 1-Zellen genauso gut wie bei den PM1-Zellen oder sogar noch besser war (Tabelle 4). Die Ergebnisse bestätigen die hohe spezifische Aktivität der Immunotoxin-Reinigungsbehandlung.
In getrennten Experimenten wurden die Kinetiken der zellabtötenden Wirkung des Immunotoxins untersucht und zwar in einem Experiment, in dem PMI- Brustkrebszellen zu peripheren Blut-Vorläuferzellen zugegeben wurden (Verhältnis 1 : 100). Nach zwei Stunden Inkubation wurde die gemischte Zellsuspension eingefroren und danach aufgetaut, sodann wurden die Zellen ausgesät und die Lebensfähigkeit der Krebszellen und der normalen Vorläuferzellen in parallelen Experimenten ermittelt. Dabei wurde gefunden, dass die Intoxikation der Brustkrebszellen schnell erfolgte und innerhalb von etwa 72 Stunden sämtliche Tumorzellen abgetötet waren. Im Vergleich dazu wurde kein Unterschied in der Lebensfähigkeit der normalen Blutvorläufer in Kulturen mit Immunotoxin-behandelten und nicht-behandelten Zellen im gleichen Zeitrahmen gefunden.

Beispiele 3 und 4

Karzinomzellen, die sich auf Knochen oder Knochenmark, auf Pleurahöhle und Abdominalhöhle, auf Gehirn- und Rückenmarkgewebe und auf den Urogenitaltrakt ausgebreitet haben, können durch Immunotoxine selektiv abgetötet werden, die in den Tumor, in die Körperflüssigkeiten oder systemisch verabreicht werden, wobei z. B. auf metastatische Tumorzellen in Geweben, wie Blut, Knochen und Knochenmark, gezielt wird.

Beispiel 3

Menschliche Brustkrebszellen MA-11 wurden in die linke Herzkammer von immungeschwächten Raffen injiziert. Bei unbehandelten Kontrolltieren entwickelten sich Symptome einer Rückenmarkkompression, und sie mussten 34 bis 37 Tage nach der Zellinjektion getötet werden. Tiere, die intravenös mit einer Einzeldosis von M0031-PE (20 ug/Ratte) behandelt wurden, zeigten eine verlängerte symptomfreie Überlebenszeit, und einige der Tiere lebten mehr als 50 Tage.
Ein weiteres Experiment in dem gleichen Modell bestätigte die Ergebnisse, wobei in diesem Fall einige der Tiere den ganzen Beobachtungszeitraum von 110 Tagen überlebten. In diesen Experimenten wurde eine Gruppe von Ratten mit einem Immunotoxin behandelt das aus dem gegen den EGF-Rezeptor gerichteten Antikörper 425.3 bestand, der an PE konjugiert war Alle Tiere in dieser Gruppe überlebten.
In einem dritten Experiment in diesem Modell zeigten die Kontroliratten Symptome einer Rückenmarkkompression und mussten zwischen Tag 40 und 60 nach der Zellinjektion getötet werden. In diesem Experiment waren drei Behandlungsgruppen enthalten, eine mit 20 pg 425.3-PE und je eine, die jeweils 10 mg der zwei Immunotoxine erhielt. Beide Immunotoxine, die einzeln eingesetzt wurden, bewirkten eine signifikante Verlängerung der erkrankungsfreien Überlebenszeit, wobei bei 60% und 80% mit MOC31-PE bzw. 425.3-PE ein langfristiges Überleben erreicht wurde. In den Kornbinationsexperimenten überlebten alle Tiere erkrankungsfrei.
In einem vierten Experiment in diesem Modell wurde die Wirkung von MOC13- PE mit der Wirkung von Cisplatin und Doxorubicin verglichen. In diesem Experiment überlebten alle mit MOC31-PE behandelten Tiere länger als 70 Tage, wohingegen Doxorubicin nur eine geringfügige Wirkung zeigte und die mit Cisplatin behandelten Ratten nicht länger lebten als die mit Kochsalzlösung behandelten Kontrolltiere. Diese Ergebnisse machen überzeugend deutlich, dass die verwendeten Immunotoxine beim Abtöten von Brustkrebsmetastasen deutlich besser wirken als Doxorubicin und Cisplatin, zwei der am häufigsten in der Klinik eingesetzten Arzneistoffe.

Beispiel 4

Die menschliche Brustkrebs-Zelllinie MT-1 wurde in zwei verschiedenen Experimenten eingesetzt. Im ersten Experiment wurden Zellen in die linke Herzkammer injiziert, wobei die Kontrolltiere aufgrund der Symptome einer Rückenmarkkompression nach einer Zeit von durchschnittlich 19 Tagen getötet werden mussten. Alle Tiere, die einen Tag nach der Zellinjektion intravenös mit 425.3-PE behandelt wurden, überlebten. In den anderen Experimenten wurden die MT-1-Tumorzellen direkt in die Knochenmarkhöhle der Rattentibia injiziert. Alle unbehandelten Tiere mussten 20 Tage später aufgrund von wachsenden Tibiatumoren getötet werden, wohingegen alle Ratten, die einen Tag nach der Zellinjektion mit 20 pg 425.3-PE intravenös behandelt worden waren, mehr als 100 Tage überlebten.
Ferner wurde in dem Modell, in dem MT-1-Tumorzellen direkt in das Knochenmark von Rattentibia injiziert wurden, die Wirkung von BM7-PE, verabreicht am Tag 1 oder am Tag 7, mit der von 425.3-PE verglichen, wobei die Tiergruppen an den gleichen Tagen behandelt wurden wie beim BM7-PE. Außerdem wurde die Wirkung von Doxorubicin (Adriamycin) untersucht das am Tag 7 und am Tag 14 intravenös verabreicht wurde. Dabei wurde gefunden, dass die beiden Immunotoxine 80% der Ratten heilten, egal ob sie am Tag 1 oder am Tag 7 verabreicht wurden. Wenn jeweils die Hälfte der Konzentrationen der jeweiligen Immunotoxine miteinander kombiniert wurden, überlebten alle Tiere. Im Vergleich dazu war Doxorubicin deutlich weniger wirksam, wobei nur 35% der Tiere nach 90 Tagen noch am Leben waren. Die Kontrolltiere mussten wie in früheren Experimenten 20 Tage nach der Injektion der Zellen getötet werden. Diese Ergebnisse bestätigen die schon früher gezeigte Wirkung von 425.3-PE. Es ist wichtig, dass gefunden wurde, dass BM7-PE genauso wirksam ist wie 425.3-PE. Beide Mittel zeigten eine deutlich bessere Wirksamkeit als Doxorubicin, einer der in der Klinik am häufigsten gegen Brustkrebs eingesetzten Arzneistoffe. Darüber hinaus heilte die Kombination der zwei Immunotoxine alle Tiere von ihrer Krankheit.

Beispiel 5

In zwei Experimentreihen wurde die Wirkung eines rekombinant produzierten Immunotoxins getestet, das gegen das Produkt des Gens erbB2 gerichtet war und das zusammen mit einer rekombinant hergestellten Variante von PE vorlag. In dem in Beispiel 4 beschriebenen Modell verlängerte die höchste Konzentration des rekombinanten Immunotoxins die Lebenszeit der Tiere signifikant, wobei 35% der Ratten überlebten. In einem Modell, in dem die MT-1-Brustkrebszellen in immungeschwächte Ratten intrathekal injiziert wurden, führte die Behandlung mit dem rekombinanten Immunotoxin, das auch intrathekal verabreicht wurde (an den Tagen 1, 2 und 3), zu einer signifikanten Verlängerung der Lebenszeit der Tiere. Diese Wirkung war dosisabhängig, und die zwei verschiedenen Dosen erhöhten die Lebenszeit der Tiere von 10,6 Tagen (mit Kochsalzlösung behandelte Kontrollen) auf 23,4 Tage und 32,8 Tage mit zwei unterschiedlichen Dosen des Immunotoxins. Bei der höchsten Dosis überlebten 20% der Ratten. Da auch bei der höchsten Immunotoxin-Dosis keine Toxizität festgestellt wurde, kann man davon ausgehen, dass die Wirkung bei optimalen Dosen sogar noch besser sein könnten.

Referenzen

1. Peters, W. P., Ross, M., Vredenburgh, J. J., Meisenberg, B., Merks, L. B., Winer, E., Kurtzberg, J., Bast R. C. J., Jones, R., Shpall, E., Wu, K., Rosner, G., Gilbert, C., Mathias, B., Coniglio, D., Petros, W., Henderson, I. C., Norton, L., Weiss, R. B., Budman, D., und Hurd, D., High-dose chemotherapy and autotogous bone marrow support as consolidation after standard-dose adjuvant therapy for high risk primary breast cancer J. Clin. Oncol., 11: 1132-1143, 1993;
2. Armitage, J. 0., Bone marrow transplantation; N. Engl. J. Med., 330: 827-838, 1994;
3. Moss, T. J., Senders, D. G., Lasky, L. C., und Bostrom, B., Contamination of peripheral blood stern cell harvests by circulating neuroblastome cells; Blood, 76: 1879- 1883, 1990;
4. Ross, A. A., Cooper, B. W., Lazarus, H. M., Mackay, W., Mass, 11 J., Ciobanu, N., Tailman, M. S., Kennedy, M. J., Davidson, N. E., Sweet, D., et ei., Detection and viability of tumor cells in peripheral blood stern cell collections from breast cancer petients using immunocytochemical and clonogenic essay techniques; Blood, 62: 2605- 2610, 1993;
5. Brenner, M. K., Rill, D. R., Moen, R. C., Krance, R. A., Mirro, J., Jr., Anderson, W. F., und Ihle, J. N., Gene-marking to traGe origin of relapse after autologous bonemarrow transplantation; Lancet, 341: 85-86, 1993;
6. Gribben, J. G., Freedman, A. S., Neuberg, D., Roy, D. S., Blade, K. W., Woo, S. D., Grossbard, M. L., Rabinowe, S. N., Corel, F., Freeman, G. J., et al., Immunologic purging of marrow assessed by PCR before autologous bone marrow transplantation for B-cell lymphoma; N. Engl. J. Med., 325: 1525-1533,1991;
7. Shpall, E. J., and Jones, R. B., Release of tumor cells from bone merrow; Blood, 83: 623-625, 1994;
8. Brugger, W., Bross, K. J., Glatt, M., Weber, F., Mertelsmann, R., and Kenz, L., Mobilization of tumor cells and hematopoietic progenitor cells into peripheral blood of patients with solid tumors; Blood, 83, 636-640, 1994;
9. Straus, G. J., und Dekker, J., Mucin-type glycoproteins; Crit. Rev. Biochem. Molecu. Biol., 27: 57-92, 1992;
10. Leij, L. D., Postmus, P. E., Poppema, S., Elema, J. D., und The, I. H., The use of monoclonat antibodies for the pathological diagnosis of lung cancer; In: H. H. Hansen (Hrsg.), Lung Cancer. Basic and Clinical Aspects, S. 31-48, Boston: Mortinus Niijhoff Publishers, 1986;
11. Godel, A., Kumle, B., Pihl, A., Juell, S., und Fodsted, ., Immunotoxins directed against the high-molecutar-weight metanome-essociated antigen; Identification of potent antibody-toxin combinations; Int. J. Cancer, 52: 631-635, 1992;
12. Courtenay, V. D., und Mills, J., An in vitro colony assay for human tumors grown in immune-suppressed mice and treated in vivo with cytotoxic agents; Br. J. Cancer, 37: 261-268, 1978;
13. Wang, M Y., Kvalheim, G., Kvaby, S., Beiske, K., Jakobsen, E., Wijdens, J., Pihl, A., und Fodstad, ., An effective immunomagnetic method für bone marrow purging in T cell malignancies; Bone Marrow Transplant, 9: 31 9-323, 1992;
14. Myklebust, A. T., Godal, A., Juell, S., Pharo, A., und Fodstad, ., Comparison of two antibody-based methods for elimination of breast cancer cells from human bone marrow; Cancer Res., 54: 209-214, 1994;
15. Eaves, C. J., Peripheral blood stern cells reach new heights; Blood, 82: 1957- 1959,1993;
16. Shpall, E. J., Jones, R. B., Bearman, S. I., Franklin, W. A., Archer, P. G., Curiel, T., Bitter, M., Claman, H. N., Stemmer, S. M., Purdy, M., Myers, S. E., Hami, L., Taffs, S., Heimfeld, S., Hallagan, J., und Berenson, J., Transplantation of enriched CD34- positive autotogous marrow into breast cancer patients following high-dose chemotherapy: Influence of CD34-positive peripheral blood progenitors and growth factor on engraftment; J. Clin. Oncol, 12: 28-36, 1994;
17. Bjorn, M. J., Groetsema, G., und Scalapino, L., Antibody-Pseudononas exotoxin A conjugates cyotoxic to human breast cancer cells in vitro; Cancer Res., 46: 3262- 3267, 1986;
18. Anderson, I. C., Shpall, E. J., Leslie, D. S., Nustad, K., Ugelstad, J., Peters, W. P., und Bast, R. C. Jr., Elimination of malignant clonogenic breast cancer cells from human bone marrow; Cancer Res., 49: 4659-4664, 1989;
19. O'Briant, K. C., Shpatl, E. J., Houston, L. L., Peters, W. P., Bast, R. C. Jr., Elimination of clonogenic breast cancer cetts from human bone marrow: A comparison of immunotoxin treatment with chemoimmunoseparation using 4-hydroperoxycyclophosphamide, monoclonal antibodies, and magnetic microspheres; Cancer. 68: 1272- 1278,1991;
20. Stray, K. M., Corpuz, D., Golter, K. M., Berenson, I., und Heimfeld, S., Purging tumor cells from bone marrow or peripheral blood using avidin biotin immunoadsorption; in: P. G. Adrian, G. Samuel, und A. W-W. Diana (Hrsg.), Advances in bone marrow purging and processing, S.. 97-103; Orlando: Wiley-Liss, Inc., 1994;
21. Tyer, C. L., Vredenburgh, J. J., Heimer, M., Bast, R. C. Jr., und Peters, W. P., Breast cancer cells are effectively purged from peripheral blood progenitor cells using an immunomagnetic technique; Abstact to First meeting of International Society for Hematotherapy and Graft Engineering, Orlando, FL, 1993;
22. Stirne, F., Barbieri, L., Battelli, M. G., Soria, M., und Lappi, D. A., Ribosomeinactivating protein from plants: Present status and future prospects; Bio/Technology 10: 405-412, 1992;
23. Barbieri, L., Battelli, M. G., Stirne, F., Ribosomeinactivating protein from plants; Biochem. Biophys. Acta. 1154: 237-282, 1993;
24. Lemoli, R. M., Tazzari, P. L., Fortung, A., Bolognesi, A., Gulati, S. C., Stirne, F., und Tura, S., Positive selection of hematopoietic CD34&spplus; stern cells provides indirecte purging of cd34-tymphoid cells and the purging efficiency is increased by anti-CD2 and CD30 immunotoxins; Bone Marrow Transplant., 13: 465-471, 1994;
25. Diel, I. J., Kaufmann, M., Goerner, R., Costa, S. D., Kaul, S., und Bastert, G., Deteotion of tumor cells in bone marrow of patients with primary breast cancer A prognostic factor for distant meastasis; J. Clin. Oncol., 10: 1534-15391 1992;
26. Myklebust, A. T., Godal, A., Pharo, A., Juell, S., und Fodstad, ., Eradication of small cell lung cancer cells from human bone marrow with immunotoxins; Cancer Res., 53: 3784-3788, 1993.

Claims

1. In vitro-Verfahren zum Töten von Brustkrebszellen oder anderen Karzinomzellen, welche die gleichen Zielantigene exprimieren, in einer Zellpopulation, umfassend aus peripherem Blut gewonnene kernhaltige Zellen oder aus den vorstehenden kernhaltigen Zellen selektierte CD-34&spplus;-Zellen oder andere unreife/frühe Vorläuferzellen aus multipotente Stammzellen enthaltendem Blut, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellpopulation einer Kombination von zwei Immunotoxinen ausgesetzt wird, wobei sich jedes Immunotoxin aus einem Konjugat zwischen einem Antikörper und einem Zelltoxin, einem Fragment eines Antikörpers und einem Zelltoxin oder einem rekombinant hergestellten Antikörper oder Fragment davon und einem Zelltoxin zusammensetzt und wobei der Antikörper von einem der Immunotoxine oder das Fragment davon gegen ein Epitop auf dem Antigen EGP2 gerichtet ist, das von dem Gen GA733-2 exprimiert wird, und der Antikörper von dem anderen Immunotoxin oder das Fragment davon gegen ein Epitop auf dem Antigen gerichtet ist, das von dem Gen MUC1, MUC2 oder MUC3 exprimiert wird, und das Toxin natives oder rekombinantes Pseudomonas Exotoxin A ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper, der gegen ein Epitop auf dem Antigen EGP2 gerichtet ist, das von dem Gen GA733-2 exprimiert wird, MOC31 ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper MOC31 und BM7 oder Fragmente davon sind.

4. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Antikörper MOC31 und BM2 oder 12H12 oder Fragmente davon sind.

5. Verwendung von zwei Immunotoxinen, wobei sich jedes Immunotoxin aus einem Konjugat zwischen einem Antikörper und einem Zelltoxin, einem Fragment eines Antikörpers und einem Zelltoxin oder einem rekombinant hergestellten Antikörper oder Fragment davon und einem Zelltoxin zusammensetzt und wobei der Antikörper von einem der Immunotoxine oder das Fragment davon gegen ein Epitop auf dem Antigen EGP2 gerichtet ist, das von dem Gen GA733-2 exprimiert wird, und der Antikörper von dem anderen Immunotoxin oder das Fragment davon gegen ein Epitop auf dem Antigen gerichtet ist, das von dem Gen MUC1, MUC2 oder MUC3 exprimiert wird, und das Toxin natives oder rekombinantes Pseudomonas Exotoxin A ist, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs, wobei die spezifischen Immunotoxine in vivo verabreicht werden.

6. Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunotoxine systematisch verabreicht werden, insbesondere im Fall einer malignen Ausbreitung in Gewebe wie etwa Knochen und Knochenmark.

7. Verwendung nach Anspruch 5, wobei die Immunotoxine direkt in einen Tumor oder in die Pleurahöhle und Bauchhöhle verabreicht werden.

8. Zubereitung von zwei Immunotoxinen zur Verwendung in dem Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass sie zwei Immunotoxine enthält, die gegen Antigene gerichtet sind, die auf malignen Zellen vorhanden sind, wobei sich jedes Immunotoxin aus einem Konjugat zwischen einem Antikörper und einem Zelltoxin, einem Fragment eines Antikörpers und einem Zelltoxin oder einem rekombinant hergestellten Antikörper oder Fragment davon und einem Zelltoxin zusammensetzt, wobei der Antikörper von einem der Immunotoxine oder das Fragment davon gegen ein Epitop auf dem Antigen EGP2 gerichtet ist, das von dem Gen GA733-2 exprimiert wird, und der Antikörper von dem anderen Immunotoxin oder das Fragment davon gegen ein Epitop auf dem Antigen gerichtet ist, das von dem Gen MUC1, MUC2 oder MUC3 exprimiert wird, und das Toxin natives oder rekombinantes Pseudomonas Exotoxin A ist.

9. Zubereitung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper oder das Fragment davon, der bzw. das gegen ein Epitop auf dem Antigen EGP2 gerichtet ist, das von dem Gen GA733-2 exprimiert wird, MOC31 ist und der Anti- Körper oder das Fragment davon, der bzw. das gegen ein Epitop auf dem Antigen gerichtet ist, das von dem Gen MUC1 oder MUC2 oder MUC3 exprimiert wird, aus BM7, BM2 oder 12H12 ausgewählt wird.

10. Verwendung der Zubereitung nach Anspruch 8 zum Herstellen eines therapeutischen Mittels gegen Krebs.

11. Kit zum Durchführen des Verfahrens nach Anspruch 1 oder Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es die Zubereitung nach Anspruch 8 in einer pharmazeutisch annehmbaren Formulierung enthält.

12. Zubereitung nach Anspruch 8 zur Verwendung in einer Therapie.