DE69716460T2

DE69716460T2 - Wundheilung und behandlung von fibrose

Info

Publication number: DE69716460T2
Application number: DE69716460T
Authority: DE
Inventors: Mark William James Ferguson; Sharon O'kane
Original assignee: Renovo Ltd
Current assignee: Renovo Ltd
Priority date: 1996-12-04
Filing date: 1997-12-04
Publication date: 2003-06-26
Anticipated expiration: 2017-12-05
Also published as: PT941108E; EP0941108A1; DE69716460D1; ES2183220T3; EP0941108B1; AU5401098A; AU744750B2; US7566446B2; HK1025732A1; US20070087969A1; DK0941108T3; WO1998024465A1; ATE226084T1; JP2001505219A; US20020103112A1; CA2274002A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Wundheilung und auch die Regulierung von Fibrose bei der Behandlung von Zuständen, bei welchen Fibrose ein Hauptmechanismus der Wiederherstellung von Gewebe ist oder wo übermäßige Fibrose zu pathologischer Unordnung und Funktionsstörungen von Gewebe führt.
Wundheilung bei Erwachsenen ist ein komplizierter Wiederherstellungsprozeß. Der Heilungsprozeß beginnt mit der Heranziehung einer Vielfalt von spezialisierten Zellen an die Stelle der Wunde und beinhaltet Ablagerung von extrazellulärer Matrix und Basalmembran, Angiogenese, selektive Proteaseaktivität und Reepithelisierung. Eine wichtige Komponente des Heilungsprozesses bei erwachsenen Säugetieren ist die Stimulierung von Fibroblasten, um die extrazelluläre Matrix zu erzeugen. Diese extrazelluläre Matrix bildet eine Hauptkomponente des Bindegewebes, welches sich entwickelt, wobei die Wundfläche wiederhergestellt wird.
Das Bindegewebe, das sich während des Heilungsprozesses bildet, ist in der Natur oftmals fibrös und bildet sich gewöhnlich zu einer Bindegewebsnarbe (ein Prozeß, der als Fibrose bekannt ist).
Eine Narbe ist eine abnormale morphologische Struktur, die aus einer vorherigen Verletzung oder Wunde (z. B. ein Einschnitt, eine Ausschneidung oder ein Trauma) entsteht. Narben bestehen aus einem Bindegewebe, welches überwiegend eine. Matrix von den Kollagentypen 1 und 3 und Fibronectin ist. Die Narbe kann aus Kollagenfasern in einer abnormalen Organisation bestehen (wie ersichtlich in Narben der Haut), oder sie kann eine abnormale Ansammlung von Bindegewebe sein (wie ersichtlich in Narben des zentralen Nervensystems). Die meisten Narben bestehen aus abnormal organisiertem Kollagen und außerdem überschüssigem Kollagen. Beim Menschen können in der Haut Narben unter die Oberfläche abgesenkt oder über die Oberfläche der Haut erhöht sein. Hypertrophe Narben sind eine ernstere Form normaler Vernarbung, sind über die normale Oberfläche der Haut erhöht und enthalten übermäßiges Kollagen, das in einem abnormalen Muster angeordnet ist. Ein Keloid ist eine andere Form pathologischer Vernarbung, welche nicht nur über die Oberfläche der Haut erhöht ist, sondern sich auch über die Grenzen der ursprünglichen Verletzung hinaus erstreckt. In einem Keloid gibt es übermäßiges Bindegewebe, welches in einer abnormalen Weise überwiegend in Wirbeln von kollagenem Gewebe organisiert ist. Es gibt genetische Prädispositionen zur Bildung sowohl von hypertrophen Narben als auch von Keloiden. Sie sind besonders häufig bei afrikanisch-karibischen und mongoloiden Rassen.
Es gibt einen Bedarf, Medikamente bereitzustellen, die die Heilung von Wunden fördern. Zum Beispiel ist es oftmals wünschenswert, in dem Fall von akuten Wunden (wie beispielsweise eindringende Verletzungen, Verbrennungen, Nervenschädigung oder auch Wunden, die aus elektiver Operation entstehen), chronischen Wunden (wie beispielsweise diabetische, venöse oder Dekubitalulzeration) oder für allgemein in der Heilung beeinträchtigte Individuen (zum Beispiel die Älteren) die Geschwindigkeit der Heilung zu vergrößern. In diesen Beispielen können die Wunden ernsthaft die Lebensqualität beeinflussen oder sogar zum Tod führen, und daher muß die Geschwindigkeit der Heilung oft vergrößert werden, so viel wie es klinisch möglich ist. Wo die Geschwindigkeit der Wundheilung vergrößert ist, gibt es oft eine damit verbundene Zunahme der Narbenbildung, aber diese kann im Vergleich zu der gewünschten Zunahme in der Geschwindigkeit der Heilung von sekundärer Bedeutung sein.
Der Begriff "Wunde", wie hier verwendet, wird beispielhaft durch Verletzungen der Haut dargestellt, ohne aber darauf begrenzt zu sein. Andere Typen von Wunde können Schädigung, Verletzung oder Trauma eines inneren Gewebes oder Organs, wie beispielsweise die Lunge, die Niere, das Herz, der Darm, die Sehnen oder die Leber, beinhalten.
Es gibt jedoch andere Fälle, wo die Regulierung der Narbenbildung von primärer Bedeutung ist und die Geschwindigkeit der Wundheilung nur von sekundärer Überlegung ist. Beispiele derartiger Situationen sind Narben der Haut, wo übermäßige Vernarbung und insbesondere, wenn Narbenkontraktur erfolgt (zum Beispiel Hautverbrennungen und -wunden, welche die Biegsamkeit eines Gelenks beeinträchtigen), für die Gewebefunktion schädlich sein kann. Die Verringerung der Vernarbung auf der Haut ist, wenn kosmetische Betrachtungen wichtig sind, ebenfalls höchst wünschenswert. In der Haut können hypertrophe oder Keloidnarben (insbesondere bei afrikanisch-karibischen und mongoloiden Rassen) funktionelle und kosmetische Schädigung verursachen, und es gibt einen Bedarf, ihr Auftreten zu verhindern. Vernarbung, die aus Hauttransplantaten sowohl an Spenderstellen als auch von der Aufbringung künstlicher Haut entsteht, kann ebenfalls problematisch sein und muß minimiert oder verhindert werden.
Ebenso wie Narben der Haut können innere Vernarbung oder Fibrose höchst schädlich sein, und zu speziellen Beispielen gehören:
(i) Innerhalb des zentralen Nervensystems kann Glianarbenbildung neuronale Wiederverknüpfung verhindern (z. B. im Anschluß an neurochirurgischen Eingriff oder durchdringende Verletzungen des Gehirns).
(ii) Vernarbung im Auge kann schädlich sein. In der Kornea kann Vernarbung abnormale Trübung ergeben und zu Problemen mit dem Sehvermögen oder sogar zu Blindheit führen. In der Retina kann Vernarbung Ausbeulung oder Retinaablösung und infolgedessen Blindheit verursachen. Vernarbung im Anschluß an Wundheilung bei Operationen zur Druckentlastung bei Glaukom (z. B. Glaukomfiltrationschirurgie) resultiert in dem Versagen des chirurgischen Eingriffs, wodurch der wässerige Humor versäumt abzulaufen und daher das Glaukom wiederkehrt.
(iii) Narbenbildung im Herzen (z. B. im Anschluß an chirurgischen Eingriff oder Myokardinfarkt) kann Anlaß zu abnormaler Herzfunktion geben.
(iv) Operationen, die das Abdomen oder die Pelvis einbeziehen, führen oft zu Adhäsion zwischen den Eingeweiden. Zum Beispiel können Adhäsionen zwischen Elementen des Darms und der Körperwand Verdrillung in der Darmschleife erzeugen und verursachen, die zu Ischämie, Gangrän und der Notwendigkeit für eine Notbehandlung führt (unbehandelt kann sie sogar fatal sein). Desgleichen können Trauma oder Einschnitte in die Därme zu Vernarbung und Narbenkontraktur zu Strikturen führen, welche Okklusion des Lumen der Därme verursachen, was wiederum lebensbedrohend sein kann.
(v) Narbenbildung in der Pelvis im Bereich der Eileiter kann zu Unfruchtbarkeit führen.
(vi) Vernarbung im Anschluß an Verletzung der Muskeln kann zu abnormaler Kontraktion und daher schlechter Muskelfunktion führen.
(vii) Vernarbung oder Fibrose im Anschluß an Verletzung der Sehnen und Ligamente kann zu ernsthaftem Funktionsverlust führen.
In Zusammenhang mit dem vorstehenden steht die Tatsache, daß es eine Anzahl von medizinischen Zuständen, bekannt als fibrotische Erkrankungen, gibt, bei welchen übermäßige Fibrose zu pathologischer Unordnung und Funktionsstörungen von Gewebe führt. Fibrotische Erkrankungen sind durch die Ansammlung von fibrösem Gewebe (überwiegend Kollagene) in einer abnormalen Weise innerhalb des Gewebes gekennzeichnet. Eine Ansammlung derartiger fibröser Gewebe kann sich aus einer Vielfalt von Krankheitsprozessen ergeben. Diese Krankheiten müssen nicht notwendigerweise durch chirurgischen Eingriff, traumatische Verletzung oder Wundenbildung verursacht sein. Fibrotische Erkrankungen sind gewöhnlich chronisch. Zu Beispielen von fibrotischen Erkrankungen gehören Leberzirrhose, Leberfibrose, Glomerulonephritis, Lungenfibrose, Sklerodermie, Myokardfibrose, Fibrose im Anschluß an Myokardinfarkt, Fibrose des zentralen Nervensystems im Anschluß an einen Schlaganfall oder neuro-degenerative Erkrankungen (z. B. Alzheimer-Krankheit), proliferative Vitreoretinopathie (PVR) und Arthritis. Es gibt daher ebenfalls einen Bedarf für Medikamente, welche für die Behandlung derartiger Zustände durch Regulierung (d. h. Verhinderung, Hemmung oder Umkehrung) von Fibrose/Vernarbung bei diesen fibrotischen Erkrankungen verwendet werden können.
Wenn auch die vorstehenden Überlegungen hauptsächlich auf Zustände, Erkrankungen oder Krankheiten des Menschen angewendet werden, wird erkannt, daß Wundheilung, Vernarbung und fibrotische Erkrankungen auch bei anderen Lebewesen, insbesondere Nutz- oder Haustieren (z. B. Pferde, Rindvieh, Hunde, Katzen usw.), problematisch sein können. Zum Beispiel sind abdominale Wunden oder Adhäsionen ein Hauptgrund dafür, Pferde (insbesondere Rassepferde) niederstrecken zu müssen, da sie eine Sehnen- und Ligamentschädigung sind, die zu Vernarbung oder Fibrose führt.
Es hat verschiedene neuere Entwicklungen auf den Gebieten der Wundheilung. Vernarbung und fibrotischen Erkrankungen gegeben. Einige von diesen Entwicklungen drehen sich um die neuere Einsicht, daß eine Gruppe von Zytokinen und Wachstumsfaktoren eng an der Wiederherstellung von Geweben beteiligt sind.
WO-A-92/17206 offenbart die Verwendung von Neutralisationsmitteln für Fibrose fördernde Wachstumsfaktoren, die verwendet werden können, um Narbenbildung während der Wundheilung zu hemmen. Zum Beispiel demonstriert WO-A-92/17206, daß Zusammensetzungen, welche speziell die Aktivität der Transforming Growth Factors β1 und β2 und des Platelet Derived Growth Factor hemmen, besonders vorteilhaft für die Verringerung der Narbenbildung sind.
WO-A-93/19769 offenbart die Verwendung nicht-fibrotischer Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise der Transforming Growth Factors β3, von welchen überraschenderweise gefunden wurde, daß sie die Heilung einer Wunde fördern, ohne Fibrose herbeizuführen.
GB-A-2288118 offenbart die Verwendung spezieller Antikörper, erzeugt gegen Wachstumsfaktoren, die die Heilung verbessern, indem sie die Wirkungen der Wachstumsfaktoren potenzieren.
Eine andere Entwicklung beinhaltet die Verwendung von Mannose-6-phosphat für die Verwendung bei der Behandlung fibrotischer Erkrankungen, die mit der Ansammlung von extrazellulärer Matrix und mit erhöhten Spiegeln der Transforming Growth Factors β1 oder β2 (GB-A-2265310) verbunden sind. Es wird angenommen, daß Mannose-6-phosphat die Umwandlung latenter Formen dieser Transforming Growth Factors in ihre aktive Form stört.
Andere Zusammensetzungen, die die Wirksamkeit des Wachstumsfaktors beeinflussen und die Wundheilung fördern, sind in WO-A-95/26203 offenbart.
Trotz derartiger Fortschritte verbleibt ein Bedarf, die Entwicklung von Medikamenten fortzusetzen, die verwendet werden können, um die Heilung von Wunden, Vernarbung und Fibrose abzuwandeln. Insbesondere gibt es einen Bedarf für Medikamente, welche nicht die Geschwindigkeit der Wundheilung oder die Qualität der Narbe zugunsten des einen oder des anderen gefährden.
Wie vollständiger nachstehend diskutiert, betrifft die Erfindung in ihrem breitesten Aspekt die Verwendung von Verbindungen, die Anordnung und Organisation von Actin für die Behandlung von Wunden abwandeln.
Alle eukaryotischen Zellen, ob einfache einzellige Organismen oder Zellen von menschlichem Gewebe, enthalten Actin. Actin kann als filamentöses Actin (F-Actin) gefunden werden, welches eine Hauptproteinkomponente des Zellgerüsts der Zelle ist. Das Zellgerüst beeinflußt viele zelluläre Funktionen und ist besonders bei der Regulierung von Motilität, Formänderungen, Chemotaxis und Sekretion relevant.
F-Actin ist ein Polymer, bestehend aus einer dichten Helix von gleichmäßig orientierten Actinmonomeren. Diese Monomere werden in der Zelle als globuläre Proteine eines einzigen Polypeptids, bekannt als globuläres Actin (G-Actin), exprimiert. Polymerisation von G-Actinmonomeren zu F-Actin erfolgt innerhalb des Zytoplasmas der Zelle.
F-Actin ist eine dynamische Struktur, und die Größe des Filaments kann entsprechend den funktionellen Bedürfnissen der Zelle reguliert werden. Zum Beispiel durch Verändern der Geschwindigkeit, mit welcher G-Actinmonomere hinzugegeben oder von dem Filament entfernt werden, oder durch Hemmen oder Fördern der F-Actinzersetzung. Ebenso wie es einen Teil des Zellgerüsts bildet, kann F-Actin auch zu zellulären Strukturen organisiert sein, wie beispielsweise dünne Filamente im Muskel, von welchen jedes eine spezielle zelluläre Funktion haben kann.
Viele Regulationsproteine beeinflussen die Anordnung und Organisation von F-Actin. Eine derartige Klasse dieser Regulationsproteine sind diejenigen, welche sich an Actinmonomere binden, das schnell wachsende Ende von Actinfilamenten besetzen und die Actinfilamente abtrennen. Zu Beispielen dieser Klasse von Regulationsproteinen gehören Gelsolin, Villin, CapG, Adseverin, Flightless-1 und Advillin.
Gelsolin ist ein 82kDa-Protein, natürlich in Zellen wie Blutplättchen, Fibroblasten, Neutrophilen und Makrophagen gefunden, und kann ein 1-um-Actinfilament in nur einer Sekunde zur Hälfte schneiden. Ein Forschungspapier von Witke et al. (Cell Bd. 81 S. 41-51, 1995) hat die Verwendung eines Mäusemodells eingeführt, welches entworfen worden war, um kein Gelsolin zu exprimieren (auch bekannt als Gsn'-Maus oder Gelsolin-Knockout-Maus), damit die Motilität von Neutrophilen und Fibroblasten in vitro und in vivo in Zellen, die kein Gelsolin exprimieren, beeinträchtigt wird.
Dieses Papier erwägt nicht die Verwendung von Gelsolin und ähnlichen Verbindungen für die Behandlung von Wunden, und überraschenderweise haben die Erfinder festgestellt, daß Verbindungen, welche Anordnung und Organisation von Actin abwandeln, für Wundheilung verwendbar sind.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung einer Verbindung, die intrazellulär und/oder extrazellulär Anordnung und Organisation von Actin abwandelt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fibrose in nichtpulmonalem Gewebe oder Wunden bereitgestellt.
Gemäß der Erfindung haben die Erfinder festgestellt, daß Verbindungen, welche Anordnung und Organisation von Actin abwandeln, verwendet werden können, um Wunden zu behandeln, um die Qualität der gebildeten Narbe zu verbessern und ebenfalls um die Geschwindigkeit der Heilung von Wunden zu verbessern. Die Verbindungen können ebenfalls verwendet werden, um Zustände zu behandeln, bei welchen es unangemessene Fibrose gibt.
Die Verbindungen sind bei der Abwandlung der Anordnung und Organisation von intrazellulärem Actin und/oder extrazellulär befindlichem Actin (welches zum Beispiel von toten oder beschädigten Zellen freigesetzt sein kann) wirksam.
Verbindungen, welche die Anordnung und Organisation von Actin abwandeln, können gemäß der Erfindung in Situationen oder bei Zuständen verwendet werden, wo Vernarbung verhindert oder verringert werden muß, wie beispielsweise:
(i) wo Narben der Haut und besonders, wenn Narbenkontraktur erfolgt oder erfolgen kann (zum Beispiel Hautverbrennungen und Wunden, welche die Biegsamkeit eines Gelenks beeinträchtigen, sowie besonders Vernarbung bei Kindern), übermäßig und/oder schädlich für die Gewebefunktion sein können;
(ii) Vernarbung auf der Haut, wenn kosmetische Betrachtungen wichtig sind;
(iii) wenn hypertrophe oder Keloidnarben (besonders bei afrikanisch-karibischen und mongoloiden Rassen) auftreten können, welche funktionelle und kosmetische Beeinträchtigung verursachen können;
(iv) Vernarbung, die aus Hauttransplantaten sowohl an Spenderstellen als auch von der Aufbringung künstlicher Haut resultiert;
(v) Vernarbung innerhalb des zentralen Nervensystems (z. B. im Anschluß an einen neurochirurgischen Eingriff oder durchdringende Verletzungen des Gehirns), zum Beispiel kann Glianarbenbildung die Wiederverknüpfung von durchtrennten Neuronen verhindern;
(vi) Vernarbung im Auge und besonders von der Kornea (Vernarbung kann in abnormaler Trübung resultieren und zu Problemen mit dem Sehvermögen oder sogar Blindheit führen), in der Retina (Vernarbung kann Ausbeulung oder Netzhautablösung und infolgedessen Blindheit verursachen) und Vernarbung im Anschluß an Wundheilung bei Operationen zur Druckentlastung bei Glaukom (z. B. Glaukomfiltrationschirurgie), welche in dem Versagen des chirurgischen Eingriffs resultieren kann, wodurch der wässerige Humor abzulaufen versäumt und daher das Glaukom wiederkehrt;
(vii) Vernarbung im Herzen (z. B. im Anschluß an chirurgischen Eingriff oder Myokardinfarkt), welche Anlaß zu abnormaler Herzfunktion geben kann;
(viii) Vernarbung des Darms, wie sie beispielsweise im Anschluß an Operationen erfolgen kann, die das Abdomen oder die Pelvis einbeziehen, die in Adhäsion zwischen den Eingeweiden resultiert (Adhäsionen zwischen Elementen des Darms und der Körperwand können Verdrillung in der Darmschleife erzeugen und verursachen, die zu Ischämie, Gangrän und der Notwendigkeit für Notbehandlung führt - unbehandelt kann sie sogar fatal sein); desgleichen können Trauma oder Einschnitte in die Därme zu Vernarbung und Narbenkontraktur oder Strikturen führen, welche Okklusion des Lumen der Därme verursachen, welche wiederum lebensbedrohend sein kann;
(ix) Vernarbung in der Pelvis im Bereich der Eileiter, welche zu Unfruchtbarkeit führen kann;
(x) Vernarbung im Anschluß an eine Verletzung der Muskeln, welche zu abnormaler Kontraktion und daher schlechter Muskelfunktion führen kann;
(xi) Vernarbung oder Fibrose im Anschluß an eine Verletzung der Sehnen und Ligamente, welche zu ernsthaftem Funktionsverlust führen kann.
Die Verbindungen können ebenfalls zur Behandlung oder Verhinderung von Fibrose verwendet werden. Zum Beispiel können die Verbindungen verwendet werden, um fibrotische Erkrankungen, wie beispielsweise Leberzirrhose, Leberfibrose, Glomerulonephritis, Lungenfibrose, Sklerodermie, Myokardhibernation, Fibrose im Anschluß an Myokardinfarkt, Fibrose des zentralen Nervensystems im Anschluß an einen Schlaganfall oder neuro-degenerative Erkrankungen (z. B. Alzheimer-Krankheit), proliferative Vitreoretinopathie (PVR) und Arthritis, zu behandeln.
Die Verbindungen sind zur Verringerung oder Verhinderung von Fibrose bei fibrotischen Krankheiten und zur Verringerung oder Verhinderung der Bildung von Fibrose, die sich als hypertrophe Vernarbung oder Keloide (besonders der Haut) manifestiert, verwendbar.
Verbindungen, die Anordnung und Organisation von Actin abwandeln, vergrößern auch die Geschwindigkeit der Heilung ebenso wie sie die Narbenqualität verbessern oder Fibrose behandeln. Wir haben gefunden, daß diese Verbindungen imstande sind, die Geschwindigkeit zu beschleunigen, mit welcher eine Wunde heilt. Somit sind derartige Verbindungen für akute Wunden (wie beispielsweise eindringende Verletzungen, Verbrennungen, Nervenschädigung, beschädigte Ligamente oder Sehnen oder sogar Wunden, die aus elektiver Operation entstehen), chronische Wunden (wie beispielsweise diabetische, venöse, Dekubitalulzeration und Druckgeschwüre) oder für allgemein in der Heilung beeinträchtigte Individuen (zum Beispiel die Älteren) verwendbar. Die Verbindungen sind besonders für die Behandlung von Wunden der Haut (d. h. Hautwunden) verwendbar. Die vorstehend beschriebenen Wunden können ernsthaft die Lebensqualität beeinflussen oder sogar zum Tod führen, und daher kann die Geschwindigkeit der Heilung vergrößert werden müssen, so viel wie es klinisch möglich ist.
Eine am meisten bevorzugte Verbindung zur Verwendung gemäß der Erfindung ist Gelsolin.
Die Erfinder haben Untersuchungen durchgeführt, welche demonstrieren, daß Verbindungen, welche die Anordnung und Organisation von Actin abwandeln, die Wundheilung beeinflussen. Zum Beispiel haben sie gefunden, daß bei einem Modell mit der Gelsolin-Knockout-Maus die Wundheilung beeinträchtigt und die Narbenqualität verringert wird. Weiterhin verbessert die Zugabe von Verbindungen wie beispielsweise Gelsolin aus einer exogenen Quelle die Narbenqualität und die Geschwindigkeit der Wundheilung im Vergleich zu der Heilung, die für unbehandelte Wunden beobachtet wird.
Weiter haben zu dem Papier von Witke et al. die Erfinder überraschenderweise gefunden, daß Verbindungen, welche Anordnung und Organisation von Actin abwandeln, besonders wirksam zur Behandlung von Wunden sind, wobei Narbenbildung verringert und außerdem die Geschwindigkeit der Wundheilung vergrößert wird. Obwohl die Antragsteller nicht wünschen, durch irgendeine Hypothese eingeengt zu sein, nehmen sie an, daß die Verbindungen, wie beispielsweise das Regulationsprotein Gelsolin, zur Verringerung von Vernarbung wirksam sind, weil sie gefunden haben, daß nicht nur diese Verbindungen die Motilität von Zellen abwandeln, sondern sie außerdem die Mobilität der Zellen innerhalb einer Wunde beeinflussen, Sekretion von Komponenten der extrazellulären Matrix bewirken und dadurch Fibrose und Narbenbildung regulieren. Die Erfinder nehmen an, daß diese Funktionen durch Rekonstruieren von F-Actin innerhalb und außerhalb dieser Zellen reguliert werden. Weiterhin nehmen die Erfinder an, daß die Verbindungen Fibroblastorientierung innerhalb der Wunde bewirken. Die Orientierung der Fibroblasten beeinflußt auch die Natur, Organisation und Orientierung der durch die Fibroblasten abgelagerten extrazellulären Matrix und beeinflußt daher die Bindegewebsnarbe, welche die verwundete Fläche wiederherstellt. Die Erfinder haben gefunden, daß Kollagenablagerung innerhalb der Matrix durch die Verbindungen besonders beeinfluß wird. Die Erfinder haben ebenfalls demonstriert, daß lösliches, extrazelluläres Gelsolin sich an extrazelluläres Actin, freigesetzt von degenerierenden Zellen an der Wundestelle, bindet und es beseitigt und daß diese Beseitigung von zellulärer Debris ein wichtiger Mechanismus bei der Beschleunigung der Heilung von chronischen Wunden sein kann. Die Erfinder nehmen daher an, daß die Aufbringung von Verbindungen, verwendet gemäß der Erfindung, auf eine Wunde die Endqualität und das Aussehen der Narbe verbessert und die Geschwindigkeit der Wundheilung wie vorstehend beschrieben vergrößert.
Während Gelsolin die bevorzugte Verbindung ist, können andere Verbindungen, wie beispielsweise Villin, CapG, Adseverin, Flightless-1 und Advillin oder Derivate davon, ebenfalls gemäß der Erfindung verwendet werden.
Verbindungen, die gemäß der Erfindung verwendet werden, können Proteine sein. Derartige Proteine können leicht modifiziert werden (zum Beispiel durch Aminosäureaddition, -substitution oder - deletion), wobei Derivate erzeugt werden, welche die Fähigkeit behalten, sich an Actinmonomere zu binden, das schnell wachsende Ende von Actinfilamenten zu besetzen oder Actinfilamente abzutrennen. Daher sind Derivate, welche funktionelle charakteristische Eigenschaften von natürlich vorkommenden Proteinen behalten, ebenfalls bevorzugte Verbindungen der Erfindung. Zu Beispielen derartiger Derivate gehören funktionell aktive Fragmente natürlich vorkommender Proteine und sogar Vorläufer natürlich vorkommender Proteine (z. B. Proproteine), welche in situ aktiviert werden.
Zusammensetzungen zur Wundheilung, die gemäß der Erfindung verwendet werden, können eine Anzahl verschiedener Formen annehmen, abhängig insbesondere von der Weise, in welcher sie verwendet werden sollen. So können sie zum Beispiel in der Form einer Flüssigkeit, Salbe, Creme, eines Gels, Hydrogels, Pulvers oder Aerosols sein. Alle derartigen Zusammensetzungen sind für topische Aufbringung auf die Haut geeignet, welche ein bevorzugtes Mittel der Verabreichung von Verbindungen der Erfindung an einen Patienten (Person oder Tier) ist, der einer Behandlung bedarf.
Die Zusammensetzung kann auf einem sterilen Verband oder Pflasterbereitgestellt werden, welche verwendet werden können, um eine Wunde, die behandelt werden soll, zu bedecken oder sogar zu verpacken. Alternativ kann die Zusammensetzung der Erfindung eine injizierbare Lösung sein oder als Augentropfen bereitgestellt werden.
Es wird erkannt, daß das Vehikel der Zusammensetzung der Erfindung eines sein sollte, welches von dem Patienten gut vertragen wird und Freisetzung der aktiven Verbindung an die Wunde erlaubt. Ein derartiges Vehikel ist vorzugsweise biologisch abbaubar, biologisch auflösbar und/oder nicht entflammbar.
Die Zusammensetzung kann gemäß der Erfindung auf einer Anzahl von Wegen verwendet werden. Somit kann, zum Beispiel, eine Zusammensetzung in und/oder um die Wunde eines Patienten herum aufgebracht werden, um die Wundheilung zu regulieren. Wenn die Zusammensetzung auf eine "existierende" Wunde aufgebracht werden soll, dann wird das pharmazeutisch verträgliche Vehikel eines sein, welches relativ "mild" ist, d. h. ein Vehikel, welches biologisch kompatibel, biologisch abbaubar, biologisch auflösbar und nicht entflammbar ist.
Es ist ebenfalls möglich, Zusammensetzungen gemäß der Erfindung vor dem chirurgischen Eingriff (insbesondere elektive Operation) zu verwenden, um Regulierung der Heilung der nachfolgend erzeugten Operationswunde bereitzustellen. In diesem Fall kann das Vehikel einer topisch aufgebrachten Zusammensetzung eines sein müssen, das imstande ist, durch die Keratinschicht der Haut zu gehen. Zu Beispielen geeigneter Vehikel für diesen Zweck gehören Dimethylsulfoxid und Essigsäure. Derartige prophylaktische Verwendung ist eine bevorzugte Verwendung von Verbindungen gemäß der Erfindung.
Die Zusammensetzungen sind geeignet, zur Beschleunigung der Heilung und Verringerung oder Steuerung der Vernarbung, resultierend aus chirurgischen Operationen am Auge (z. B. laserchirurgischer Eingriff an der Kornea) verwendet zu werden. In diesem Fall können die Zusammensetzung oder das Medikament in der Form von Augentropfen sein.
Die Zusammensetzungen können in einem Bereich von Anwendungen zur inneren Wundheilung verwendet werden. So kann zum Beispiel die Zusammensetzung zur Inhalation für die Verwendung bei der Wundheilung der Lungen oder für die Verhinderung oder Behandlung von Fibrose und Strikturen in der Lunge formuliert sein.
Es wird erkannt, daß die Menge einer Verbindung, die Anordnung und Organisation von Actin abwandelt, die auf die Wundstelle aufgebracht werden soll, von einer Anzahl von Faktoren wie beispielsweise der biologischen Aktivität und biologischen Verfügbarkeit der Verbindung abhängt, welche dann wieder von der Art der Verabreichung und den physikochemischen Eigenschaften der Verbindung abhängt. Zu anderen Faktoren gehören:
A) Die Halbwertszeit der Verbindung in dem Patienten, der behandelt wird.
B) Der spezielle Zustand, der behandelt werden soll.
C) Ob schnelle Heilung oder verringerte Vernarbung gewünscht wird.
D) Das Alter des Patienten.
Die Häufigkeit der Verabreichung wird ebenfalls durch die vorstehend erwähnten Faktoren und insbesondere die Halbwertszeit der Verbindung innerhalb des Patienten, der behandelt wird, beeinflußt.
Allgemein sollte, wenn die Zusammensetzungen verwendet werden, um existierende Wunden oder fibrotische Erkrankungen zu behandeln, die Verbindung verabreicht werden, so bald wie die Wunde erfolgt ist oder die Erkrankung diagnostiziert worden ist. Therapie mit der Zusammensetzung sollte andauern, bis die Wunde zur Befriedigung eines Klinikers geheilt ist oder, in dem Fall einer fibrotischen Erkrankung, das Risiko oder die Ursache der Bildung von abnormalen fibrotischen Gewebe beseitigt worden ist.
Zusammensetzungen zur Förderung der Geschwindigkeit der Wundheilung sollten auf eine Wunde so bald wie möglich, nachdem die Wunde erzeugt worden ist, aufgebracht werden. Für akute Wunden und Wunden von Patienten, die heilungskompetent sind (z. B. die jungen) wird Aufbringung der Zusammensetzung idealerweise zu der Zeit der Verwundung geschehen, vorzugsweise innerhalb von Stunden der Wundenbildung und nicht länger als ein paar Tage nach der Wundenbildung. Für chronische Wunden oder Wunden von in der Heilung beeinträchtigen (z. B. die älteren) sollte die Verabreichung so bald wie möglich geschehen.
Zusammensetzungen, welche Vernarbung und/oder fibrotische Erkrankungen abwandeln, sollten ebenfalls so bald wie möglich auf eine Wunde aufgebracht werden, nachdem die Wunde erzeugt worden ist. Jedoch können sich Narben und Fibrose über Tage oder sogar Wochen entwickeln. Daher kann der Patient, der behandelt wird, Vorteil von der Verabreichung einer Verbindung (wie beispielsweise Gelsolin) haben, selbst wenn sie Tage oder sogar Wochen, nachdem die Wunde erfolgte oder die Erkrankung sich entwickelte (oder diagnostiziert wurde), verabreicht wird.
Wenn als Prophylaktikum (z. B. vor chirurgischem Eingriff oder wenn es ein Risiko der Entwicklung einer fibrotischen Erkrankung gibt) verwendet, sollten die Zusammensetzungen verabreicht werden, so bald wie das Risiko nicht wünschenswerter Fibrose oder ein Potential für eine schlechte Geschwindigkeit der Wundheilung erkannt worden ist (wie bei älteren Patienten der Fall sein kann). Zum Beispiel können eine Gelsolin enthaltende Creme oder Salbe auf eine Stelle auf der Haut des Patienten aufgebracht werden, wo elektive Operation durchgeführt werden soll und nachfolgend eine vergrößerte Geschwindigkeit der Windheilung erwünscht ist. In diesem Fall kann die Zusammensetzung während der präoperativen Vorbereitung des Patienten aufgebracht werden oder es kann sogar wünschenswert sein, die Zusammensetzung in den Stunden oder Tagen aufzubringen, die dem chirurgischen Eingriff vorausgehen (abhängig von dem Gesundheitsstatus und dem Alter des Patienten ebenso wie der Größe der Wunde, die erzeugt werden soll).
Die Häufigkeit der Verabreichung hängt von der biologischen Halbwertszeit der verwendeten Verbindung ab. Typischerweise sollte eine Creme oder Salbe, die eine Verbindung enthält, so auf ein Zielgewebe verabreicht werden, daß die Konzentration der Verbindung an der Wundstelle oder dem durch eine fibrotische Erkrankung betroffenen Gewebe auf einem Niveau aufrechterhalten wird, welches geeignet ist, eine therapeutische Wirkung zu haben. Dies kann Verabreichung täglich oder sogar mehrere Male täglich erfordern.
Bekannte Verfahren, wie beispielsweise diejenigen, die herkömmlicherweise durch die pharmazeutische Industrie angewendet werden (z. B. in-vivo-Experimentieren, klinische Versuche usw.), können verwendet werden, um spezielle Formulierungen der Zusammensetzungen und genaue therapeutische Regimes (wie beispielsweise tägliche Dosen der Verbindungen und die Häufigkeit der Verabreichung) festzustellen.
Im allgemeinen enthalten Zusammensetzungen gemäß der Erfindung 50-1000 nM der Verbindung (z. B. Gelsolin), am meisten bevorzugt 100-500 nM.
Bloß als Beispiel ist eine 100-500 ug/ml Gelsolin enthaltende Zusammensetzung zur Aufbringung auf eine existierende (d. h. "offene") Wunde geeignet.
Als weiteres Beispiel kann eine Zusammensetzung, welche präoperativ verwendet werden soll, um vorkommende Vernarbung zu verhindern oder die Geschwindigkeit der Heilung einer Wunde, die aus nachfolgendem chirurgischen Eingriff entsteht, zu verbessern, 500-1000 nM Gelsolin enthalten, um die gewünschte Auswirkung auf die Wundheilung zu haben.
Eine geeignete tägliche Dosis einer Verbindung, welche Anordnung und Organisation von Actin abwandelt, hängt von den vorstehend diskutierten Faktoren ebenso wie von der Größe der Wunde oder der Menge des von Fibrose befallenen Gewebes, welche behandelt werden soll, ab. Typischerweise liegt, abhängig unter mehreren anderen Faktoren von der Größe der Wunde oder der Ausdehnung von Fibrose, die Menge einer Verbindung, erforderlich zur Behandlung von Wunden oder fibrotischen Erkrankungen, innerhalb des Bereiches von 1 ng bis 100 g der aktiven Verbindung/24Stunden.
Es wird ebenfalls erkannt, daß Verbindungen, die gemäß der Erfindung verwendet werden, aus der Natur isoliert oder chemisch synthetisiert werden können. Derartige Verbindungen brauchen nicht Proteine zu sein oder nicht einmal natürlich vorkommenden Proteinen strukturell ähnlich zu sein, haben aber nichtsdestoweniger die gleichen Auswirkungen auf die Anordnung und Organisation von Actin. Diese Verbindungen sind ebenfalls bevorzugte Verbindungen zur Verwendung gemäß der Erfindung.
Proteine und Derivate davon, welche als Verbindungen zur Abwandlung der Anordnung und Organisation von Actin verwendet werden, können durch ein beliebiges herkömmliches Verfahren einschließlich Peptidligierung und vollständiger Proteinsynthese hergestellt werden. Alternativ können sie aus natürlichen Quellen gereinigt werden. Zum Beispiel kann Gelsolin aus Neutrophilen, Blutplättchen oder Fibroblasten, die das Protein exprimieren, isoliert werden (z. B. durch die Verfahren von Bryan J., Methods in Enzymology Bd. 215, S. 88-99, Academic Press. London 1992).
Eine bevorzugte Weise der Herstellung von Protein und Derivaten davon zur Verwendung in der Erfindung geschieht durch Expression aus einem System mit rekombinanter DNA.
Die Technologie mit rekombinanter DNA stellt ein bequemes Mittel bereit, durch welches ausreichende Mengen derartiger Proteine und Derivate davon zur Verwendung bei der Herstellung von Medikamenten in wünschenswerten Mengen erzeugt werden können.
Viele bekannte Verfahren der Verabreichung von Verbindungen an ein relevantes Gewebe haben den Nachteil, daß es schwierig sein kann, anhaltende Spiegel der aktiven Verbindung an einer Wundstelle oder Stelle von Fibrose über den Verlauf von selbst ein paar Tagen zu erreichen, weil die aktiven Mittel gewöhnlich in vivo sehr kurze Halbwertszeiten haben. Die Halbwertszeiten der Verbindungen neigen aus einer Anzahl von Gründen dazu, kurz zu sein, zu welchen gehören:
(i) Zersetzung durch Proteasen und dergleichen.
(ii) Beseitigung durch Bindungsproteine (z. B. α2-Makroglobulin).
(iii) Bindung und Hemmung der Aktivität des Mittels durch extrazelluläre Matrixmoleküle wie beispielsweise Decorin und Fibronectin.
Weiterhin müssen Verbindungen zur Wundheilung und/oder Behandlung von Vernarbung/Fibrose in einem geeigneten Vehikel verabreicht werden und werden oft als Zusammensetzung, umfassend die Verbindung und das Vehikel, bereitgestellt. Wie vorstehend dargestellt ist, sind derartige Vehikel vorzugsweise nicht entflammbar, biologisch kompatibel, biologisch resorbierbar und dürfen die aktive Verbindung (bei der Aufbewahrung oder beim Gebrauch) nicht zersetzen oder inaktivieren. Jedoch kann es oftmals schwierig sein, ein befriedigendes Vehikel zur Abgabe spezieller Verbindungen an ein zu behandelndes Gewebe bereitzustellen.
Ein bequemer Weg, auf welchem diese Probleme vermieden oder gelindert werden können, besteht darin, an einer Wundstelle (oder Stelle von Fibrose) eine therapeutisch wirksame, die Wunde heilende Menge einer Verbindung bereitzustellen, die Anordnung und Organisation von Actin durch Gen-Therapie abwandelt.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Abgabesystem zur Verwendung in einer Gen-Therapie-Technik bereitgestellt, wobei das Abgabesystem ein DNA-Molekül, codierend ein Protein, umfaßt, welches Anordnung und Organisation von Actin abwandelt, wobei das DNA-Molekül imstande ist, transkribiert zu werden, um zu der Expression des Proteins zu führen.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Abgabesystems, wie definiert in dem vorhergehenden Abschnitt, zur Verwendung bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von Wunden oder Fibrose bereitgestellt.
Die Verwendung des Abgabesystems gemäß der Erfindung ist in hohem Maße geeignet, um andauernde Spiegel einer Verbindung zu erreichen, welche Anordnung und Organisation von Actin an einer Wundstelle oder Stelle von Fibrose über einen längeren Zeitraum abwandelt, als für die meisten herkömmlichen Abgabesysteme möglich ist. Protein kann von Zellen an der Wundstelle oder Stelle von Fibrose, die mit dem DNA-Molekül der Erfindung transformiert worden sind, kontinuierlich exprimiert werden. Daher können, sogar wenn das Protein als Mittel in vivo eine sehr kurze Halbwertszeit hat, kontinuierlich therapeutisch wirksame Mengen des Proteins von dem behandelten Gewebe exprimiert werden.
Weiterhin kann das Abgabesystem gemäß der Erfindung verwendet werden, um das DNA-Molekül (und dadurch das Protein, welches ein aktives therapeutisches Mittel ist) ohne die Notwendigkeit, herkömmliche pharmazeutische Vehikel zu verwenden, wie beispielsweise diejenigen, die in Salben oder Cremes erforderlich sind, die in Kontakt mit der Wunde gebracht werden, bereitzustellen.
Das Abgabesystem der vorliegenden Erfindung ist derartig, daß das DNA-Molekül imstande ist, exprimiert zu werden (wenn das Abgabesystem an einen Patienten verabreicht wird), um ein Protein herzustellen, welches direkt oder indirekt Aktivität für Wundheilung und/oder Behandlung von Fibrose oder Vernarbung durch Abwandlung der Anordnung und Organisation von Actin hat. "Direkt" bedeutet für uns, daß das Produkt der Gen-Expression per se die erforderliche Aktivität für Wundheilung und/oder Regulierung von Fibrose oder Vernarbung hat. "Indirekt" bedeutet für uns, daß das Produkt der Gen- Expression sich mindestens einer weiteren Reaktion unterzieht oder sie vermittelt (z. B. als Enzym), um ein Mittel, wirksam für Wundheilung und/oder Regulierung von Fibrose oder Vernarbung durch Abwandlung der Anordnung und Organisation von Actin, bereitzustellen.
Es wird bevorzugt, daß das DNA-Molekül Gelsolin oder ein biologisches Fragment oder Derivat davon codiert. Das DNA-Molekül kann auch Verbindungen wie beispielsweise Villin, CapG, Adseverin, Flightless-1 und Advillin oder Derivate davon codieren. Alternativ kann das DNA-Molekül ein Protein codieren, welches indirekt die Expression von Verbindungen wie beispielsweise Gelsolin vergrößert. Zum Beispiel kann das DNA-Molekül ein Enzym, einen Transkriptionsfaktor oder dergleichen codieren, welche die Expression von Gelsolin fördern.
Das DNA-Molekül kann innerhalb eines geeigneten Vektors enthalten sein, um einen rekombinanten Vektor zu erzeugen. Der Vektor kann zum Beispiel ein Plasmid, Cosmid oder Phage sein. Derartige rekombinante Vektoren sind in den Abgabesystemen der Erfindung zum Transformieren von Zellen mit dem DNA-Molekül höchst nützlich.
Rekombinante Vektoren können auch andere funktionelle Elemente einschließen. Zum Beispiel können rekombinante Vektoren derart gestaltet sein, daß der Vektor autonom in dem Kern der Zelle repliziert. In diesem Fall können Elemente, welche DNA-Replikation anregen, in dem rekombinanten Vektor erforderlich sein. Alternativ kann der rekombinante Vektor derart gestaltet sein, daß der Vektor und das rekombinante DNA-Molekül sich in das Genom einer Zelle eingliedem. In diesem Fall sind DNA- Sequenzen, welche gezielte Eingliederung begünstigen (z. B. durch homologe Rekombination), wünschenswert. Rekombinante Vektoren können auch DNA-Codierung für Gene haben, die als selektierbare Marker in dem Klonierungsverfahren verwendet werden können.
Der rekombinante Vektor kann ebenfalls weiterhin einen Promoter oder Regulator umfassen, um die Expression des Gens wie erforderlich zu steuern.
Das DNA-Molekül kann (aber nicht notwendigerweise) eines sein, welches in die DNA von Zellen des Patienten, der behandelt wird, eingebaut wird. Undifferenzierte Zellen können stabil transformiert werden, was zu der Produktion genetisch modifizierter Tochterzellen führt. Wenn dies der Fall ist, kann Regulierung der Expression bei dem Patienten erforderlich sein, z. B. mit spezifischen Transkriptionsfaktoren, Genaktivatoren oder stärker bevorzugt mit anregbaren Promotoren, welches das Gen in Reaktion auf ein Signal transkribieren, das speziell an einer Wundstelle gefunden wird. Alternativ kann das Abgabesystem gestaltet sein, um unstabile oder vorübergehende Transformation von differenzierten Zellen bei dem Patienten, der behandelt wird, zu begünstigen. In diesem Fall kann Regulierung der Expression weniger wichtig sein, weil die Expression des DNA-Moleküls aufhört, wenn die transformierten Zellen sterben oder aufhören, das Protein zu exprimieren (idealerweise, wenn die Wunde, Fibrose oder Vernarbung behandelt oder verhindert worden ist).
Das Abgabesystem kann dem Patienten das DNA-Molekül bereitstellen, ohne daß es in einen Vektor eingebaut wird. Zum Beispiel kann das DNA-Molekül innerhalb eines Liposoms oder Viruspartikels eingebaut werden. Alternativ kann das "nackte" DNA-Molekül durch ein geeignetes Mittel, z. B. direkte endozytotische Aufnahme, in die Zellen eines Patienten eingefügt werden.
Das DNA-Molekül kann in die Zellen eines Patienten überführt werden, der durch Traasfektion, Infektion, Mikroinjektion, Zellfusion, Protoplastfusion oder ballistisches Bombardment behandelt werden soll. Zum Beispiel kann der Transfer durch ballistische Transfektion mit beschichteten Goldteilchen, das DNA-Molekül enthaltende Liposome, Virusvektoren (z. B. Adenovirus) und Mittel der Bereitstellung direkter DNA-Aufnahme (z. B. Endozytose) durch Aufbringung, topisch oder durch Injektion, von Plasmid- DNA direkt auf die Wundfläche geschehen.
Das von dem DNA-Molekül exprimierte Protein kann eines sein, welches direkt oder indirekt Wundheilung mit verringerter Vernarbung bereitstellt, eines, welches eine Zunahme in der Geschwindigkeit der Wundheilung bereitstellt, während es möglicherweise vergrößerte Narbenbildung ergibt, oder eines, welches dazu dient, Fibrose zu regulieren (hemmen, verhindern oder umkehren).
Es wird erkannt, daß das Abgabesystem gemäß dem vierten Aspekt der Erfindung gemäß dem fünften oder sechsten Aspekt der Erfindung verwendet werden kann, um einen der vorstehend beschriebenen Zustände zu behandeln.
Die vorliegende Erfindung wird in dem folgenden nicht begrenzenden Beispiel weiter beschrieben, welches sich auf die begleitenden Zeichnungen bezieht, in welchen:
Abb. 1 eine graphische Darstellung der linearen Breite von Wunden bei Gelsolin-Knockout- und Wildtyp-Mäusen von Beispiel 1 ist;
Abb. 2 eine graphische Darstellung des Prozentsatzes der Reepithelisierung von Wunden bei Gelsolin-Knockout- und Wildtyp-Mäusen von Beispiel 1 ist; und
Abb. 3 eine graphische Darstellung der mittleren Wunden-/Narbenbreite von Wunden bei Gelsolin-Knockout- und Wildtyp-Mäusen von Beispiel 1 ist.

BEISPIEL 1

Der Einfluß von Gelsolin auf die Wundheilung wurde bei Gelsolin-Knockout-Mäusen (KO - ohne eine Gelsolinexpression) und normalen "Wildtyp"-Mäusen (WT, die Gelsolin exprimieren) beurteilt. Gelsolin-Knockout-Mäuse, erzeugt entsprechend den experimentellen Verfahren, offenbart bei Witke et al. (Cell Bd. 81, S. 41-51, 1995), wurden in den experimentellen Verfahren verwendet.

1.1 METHODEN

1.1.1 BEHANDLUNGEN

48 erwachsene männliche Mäuse wurden in sechs Gruppen von acht geteilt: vier Knockout- und vier Kontroll-Mäuse. Die Mäuse wurden unter Verwendung einer IP-Injektion von Avertin anästhesiert, die Rückenfläche rasiert und zwei 1-cm-Einschnitte durch die Haut herab bis zu dem und einschließlich des Panniculus-carnosus-Muskels an speziellen anatomischen Positionen gemacht. Die Wunden wurden unvernäht gelassen und die Tiere in individuelle Käfige zurückgebracht. Eine Gruppe von Tieren wurde nach 1 Tag (d), 3d, 5d, 7d, 14 und 70d nach der Wundenbildung getötet und die Wunden gesammelt. Die Hälfte jeder gesammelten Wunde wurde in Formal-Kochsalzlösung fixiert und die andere Hälfte in OCT- Medium eingebettet und über flüssigem Stickstoff gefroren. Photographische Aufnahmen wurden von den Wunden zu jedem Zeitpunkt aufgenommen, um den Vergleich von mikroskopischen und makroskopischen Ergebnissen zu ermöglichen.

1.1.2 HISTOLOGISCHE BEURTEILUNG

Hämatoxylin und Eosin (H & E) und Masson-Trichrom-Färbemittel wurden verwendet, um den Zellreichtum bzw. Kollagengehalt der Wunden zu bestimmen.

1.1.3 BEWERTUNG VON NARBEN 70 TAGE NACH DER WUNDENBILDUNG

Die Histologie-Dias wurden unter Verwendung einer Visual Analogue Scale (VAS), bestehend aus einer 10-cm-Linie, wo 0 normale Haut und 10 eine hypertrophe Narbe/ein Keloid darstellt, und gesondert unter Verwendung einer Rangskala 0-5, wo 0 normale Haut und 5 eine hypertrophe Narbe/ein Keloid darstellt und 3 die Bewertung für eine Kontrollnarbe ist, bewertet.

1.1.4 IMMUNOHISTOCHEMIE

Die 1-, 3-, 5- und 7-Tage-Wunden wurden unter Verwendung verschiedener Antikörper gefärbt, wozu gehören:
1. Anti-Mäuse-Fibronectin.
2. Anti-Mäuse-Gelsolin, um die korrekte Genotypisierung von Gelsolin-Knockout-Mäusen zu bestätigen und um die Immunlokalisation von Gelsolin in Wunden von Wildtyp-Tieren zu bestimmen.
3. TRITC-markiertes Phalloidin. Phalloidin wird aus dem Pilz amanita phalloides extrahiert und bindet sich an filamentöses Actin (F-actin), ist so beim Lokalisieren und Unterscheiden zwischen extraund intrazellulärem F-Actin verwendbar.
Duale Färbung mit anti-Gelsolin (nachgewiesen mit einem FITC-markierten sekundären Antikörper) und TRITC-Phalloidin wurde ausgeführt, um zu bestimmen, ob das extrazelluläre Actin, beobachtet in der Wunde, gemeinsam mit extrazellulärem Gelsolin lokalisiert wurde, da von dem Blutsystem freigesetztes Plasma-Gelsolin für die Beseitigung von extrazellulärem Actin in Wunden verantwortlich sein kann.

1.1.5 BILDANALYSE

Die Bildanalyse wurde unter Verwendung eines computergestützten Bilderfassungssystems ('PC Image') ausgeführt, und die folgenden Parameter wurden gemessen, um Unterschiede zwischen Knockout- und Wildtyp-Wunden zu quantifizieren:
1. Wundbreite (sowohl linear zwischen den Wundrändern als auch der tatsächliche Umfang)
2. Retraktion des Panniculus-carnosus-Muskels
3. Mittlere Wundbreite
4. Reepithelisierung
5. Narbenbreite an 3 Punkten: Basis, Mitte und Oberseite
6. Dicke des neuen Epithels
Alle Wunden wurden für die Wundbreite und die Retraktion des Panniculus-carnosus-Muskels gemessen, die anderen Messungen wurden zu passenden Zeitpunkten genommen.
Die statistische Analyse der Messungen wurde unter. Verwendung des Simfit-Programms, geschrieben von Dr. W Bardsley, University of Manchester, durchgeführt. Die beiden verwendeten statistischen Tests waren der Mann-Whitney-U-Test und der Kolgomorov-Smirnov-Test, um Ergebnisse von der Wildtyp-Kontrolle und Knockout-Tieren zu vergleichen (siehe Tabelle 1).

1.2 ERGEBNISSE

1.2.1 HISTOLOGIE

Die offensichtlichsten Unterschiede zwischen Kontroll- (WT = "Wildtyp") und Knockout-Mäusen (KO) wurden am Tag 5 nach der Wundenbildung beobachtet. Bei 24 h waren die Wunden der Knockout- Mäuse im Aussehen den Kontrollwunden ähnlich: die Wunden von allen Mäusen waren breit und enthielten Mengen von Entzündungszellen (siehe Abb. 1). Am Tag 3 nach der Wundenbildung waren die normalen Wunden fast reepithelisiert, mit noch vorhandenen Krusten und Zeichen von Neovaskularisation und Kollagenbildung in der Wundfläche. Die Wunden von Gelsolin-Knockout-Mäusen waren in der Reepithelisierung sehr veränderlich, wobei einige den Kontrollwunden ähnelten, andere überhaupt nicht reepithelisiert waren. Einige der Knockout-Wunden blieben sehr entzündlich, andere nicht sehr zellenreich, und in allen Fällen gab es ein abnehmendes Niveau neuer Kollagenbildung.
Am Tag 5 blieben die meisten Wunden der Gelsolin-Knockout-Mäuse sehr breit und waren, im Vergleich zu den Wildtyp-Kontrollen, wo in den meisten Fällen Reepithelisierung erfolgt war, nicht vollständig reepithelisiert (Abb. 2, 3; Tabelle 1). Am Tag 7 waren die Wunden wiederum heterogen, einige Knockout-Wunden waren reepithelisiert und enthielten relativ wenige Entzündungszellen, während andere noch ganz breit und zellreich waren und Krusten an der Oberfläche hatten. Es gab Büschel von Entzündungszellen und Fibroblasten innerhalb einiger der Knockout-Wunden. Die Kontrollwunden waren in diesem Stadium zumeist reepithelisiert und hatten hohe Niveaus von abgelegtem neuen Kollagen. Die Knockout-Wünden an sowohl Tag 5 als auch Tag 7 nach der Wundenbildung hatten sehr niedrige Niveaus von Kollagen, welches flickenartig erschien und in einem ausgeprägt linearen Muster senkrecht zu dem Epithel abgelagert war. Diese Büschelbildung von Zellen und flickenartigem Kollagen entstand als Ergebnis normaler Actinrekonstruktion, die bei Gelsolin-Knockout-Mäusen verändert worden war.
Am Tag 14 wiesen die meisten der Knockout-Wunden andauernde Entzündungszellen auf und blieben ganz breit, obwohl alle in diesem Stadium reepithelisiert waren. Die Menge von gebildetem Kollagen war variabel. Am Tag 70 nach der Wundenbildung hatten die Knockout-Tiere breite Narben ähnlich den Kontrolltieren, aber dort schien eine Menge von Fibroblasten in den Knockout-Narben zu sein. Zwei Narben von Knockout-Mäusen wiesen eine eindrucksvolle örtliche Ansammlung von Haarfollikeln unmittelbar angrenzend an und umgebend die Narben auf. Im allgemeinen waren an diesem Zeitpunkt die Narben von den Knockout-Tieren ähnlich, aber von einer schlechteren Qualität als Narben von den Wildtyp-Tieren.
Diese Ergebnisse waren überraschend und zeigen, daß Gelsolin die Qualität von Narben verbessert (ersichtlich nach 70 Tagen) und ebenfalls die Geschwindigkeit der Heilung verbessert (beispielhaft dargestellt durch die Beobachtungen am Tag 5). Daher können Verbindungen gemäß der Erfindung verwendet werden, um Wunden zu behandeln, und sind besonders nützlich, weil sie die Heilung beschleunigen und Narbenbildung verringern oder verhindern. TABELLE 1 Zusammenfassung von Werten aus der Bildanalyse von Gelsolin-Knockout- und Wildtyp-Wunden TABELLE 1a
*Knockout-Wunden signifikant breiter als Wildtyp-Wunden. Signifikant bei p < 0,05 (Mann-Whitney-U- Test).
((s.e.m. = standard error of median = Standardfehler des Medianwertes)) TABELLE 1b Wundbreite (Umfang) TABELLE 1c Panniculus-Carnosus-Breite
*Panniculus carnosus neigt dazu, in Wildtyp-Wunden weiter retrahiert zu sein als in Knockout-Wunden, p < 0,05 (Mann-Whitney-U-Test). TABELLE 1d Mittlere Wundbreite
*Knockout-Wunden signifikant breiter als Wildtyp-Wunden. Signifikant bei p < 0,05 (Kolgomorov- Smirnov) und p < 0,01 (Mann-Whitney-U-Test). TABELLE 1e Prozentsatz Reepithelisierung TABELLE 1f Mittlere Epitheldicke (5-14 Tage nur) TABELLE 1g Narbenbreite (nur Tag 14 und 70) TABELLE 2 Bewertungen für 70-Tage-Narben bei Wildtyp-(WT)- und Gelsolin-Knockout-(KO)-Tieren

1.2.2 IMMUNZYTOCHEMIE

Es wurde duale Färbung von Wundabschnitten von Knockout- und Wildtyp-Mäusen mit anti- Gelsolin und TRITC-Phalloidin auf dem konfokalen Biorad MRC600 Mikroskop analysiert, um Gebrauch von der überragenden Wellenlängenauftrennung zu machen. Dies verhinderte jedes Durchschlagen von dem FITC oder TRITC in den anderen Kanal.
Es war kein Gelsolin in den Knockout-Wunden vorhanden, weder wenn allein gefärbt, noch wenn dual mit TRITC-Phalloidin gefärbt. In Wildtyp-Wunden gab es am Tag 1 und Tag 3 nach der Wundenbildung ein hohes Niveau der Immunfärbung für TRITC-Phalloidin, und dieses nahm in einer zeitlichen Weise bis 7 Tage ab. Es gab Immunfärbung von Gelsolin in den Wildtyp-Wunden an allen analysierten Zeitpunkten, welche sich besonders in 7-Tage-Wunden zu vergrößern schien, obwohl dies auf die begleitende Abnahme bei Actin, markiert mit TRITC-Phalloidin, zurückzuführen sein kann. Es gab zunehmende Mengen von Immunfärbung für TRITC-Phalloidin in den Gelsolin-Knockout-Wunden bis zu 7 Tagen nach der Wundenbildung, welche durch den Mangel an Gelsolin (sowohl Zytoplasma als auch Plasma) erklärt werden kann. Dieses Versagen der Beseitigung von extrazellulärem Actin (freigesetzt von degenerierenden Zellen) in den Wunden von Gelsolin-Knockout-Mäusen kann die verzögerte Wundheilung erklären, daher kann die Zugabe von exogenem Gelsolin diese Beseitigung beschleunigen und daher die Wundheilung beschleunigen.

1.2.3 BILDANALYSE

Die Ergebnisse aus der Bildanalyse unterstützten die Beobachtung, daß es Unterschiede in der Reepithelisierung der Knockout- und Wildtyp-Wunden gab und daß die signifikantesten Unterschiede zwischen Wunden am Tag 5 nach der Wundenbildung bestanden. Siehe Tabelle 1 und Abb. 2 für die Zusammenfassung von Ergebnissen.

1.3 ZUSAMMENFASSUNG

1.3.1 AUSWIRKUNG VON VERNARBUNG UND/ODER FIBROSE

Die Ergebnisse aus dieser Untersuchung von Wunden von Gelsolin-Knockout-Mäusen liefern den Beweis, daß ein Mangel an Gelsolin in ungeordneter Orientierung von Fibroblasten in Wunden und nachfolgender schlechter Qualität der so erhaltenen Narben resultiert. Dies zeigt, daß anfängliche Fibroblasten Orientierung ein wichtiger Faktor bei der Bestimmung der endgültigen Qualität einer Narbe ist. Daher sind Verbindungen, die Anordnung und Organisation von Actin beeinflussen, wie beispielsweise Gelsolin, zur Behandlung von Wunden und insbesondere zur Verbesserung oder Verhinderung von Narbenbildung verwendbar.

1.3.2 AUSWIRKUNG AUF DIE GESCHWINDIGKEIT DER WUNDHEILUNG

Die Werte, die hier für die Wundbreite 5 Tage nach der Wundenbildung dargestellt sind, demonstrieren weiterhin, daß Gelsolin und andere Verbindungen, die Anordnung und Organisation von Actin beeinflussen, erforderlich sind, um die Geschwindigkeit der Wundheilung zu vergrößern (d. h. die Breite der Wunde zu verringern).

1.3.3 ALLGEMEIN

Die Ergebnisse von Gelsolin-Knockout-Mäusen liefern den Beweis, daß Verhinderung von anfänglicher Wundkontraktion nicht notwendigerweise zu einer besseren Narbe führt und in der Tat schädlich sein kann und daß Verzögerung der Wundheilung nicht die Vernarbung verbessert. Die Ergebnisse zeigen ebenfalls, daß exogene Zugabe von Verbindungen wie beispielsweise Gelsolin, welche extrazelluläre Debris abtrennen oder beseitigen, bei der Beschleunigung der Heilung von Wunden, speziell chronischen Wunden (z. B. venöse Geschwüre, diabetische Geschwüre oder Druckgeschwüre) verwendbar sein kann.
Weiterhin demonstrieren diese Werte, daß Verbindungen, welche Anordnung und Organisation von Actin abwandeln, verwendet werden können, um beide Aspekte der Wundheilung zu behandeln (d. h. Vernarbung zu verringern und zu gleicher Zeit die Geschwindigkeit der Wundheilung zu vergrößern). Dies ist ein überraschender Effekt, weil die meisten herkömmlichen Behandlungen für Wunden entweder die Vernarbung verringern oder die Geschwindigkeit der Wundheilung vergrößern und sehr oft die Behandlung eines Aspekts (z. B. Vernarbung) zum Schaden des anderen Aspekts (z. B. Geschwindigkeit der Heilung) ist.

BEISPIEL 2

2.1 METHODEN

Beispiel 1 wurde unter Verwendung von 11 Wildtyp-(WT)- und 11 transgenen (KO) Wurfgeschwistern wiederholt. Das Wundengewebe wurde am Tag 5 (8 WT und 8 KO) und Tag 7 (3 WT und 3 KO) nach der Wundenbildung gesammelt, da diese die Zeitpunkte waren, wo in Beispiel 1 signifikante Unterschiede zwischen der Heilung von Knockout- und Kontrolimäusen beobachtet wurden.

2.2 ERGEBNISSE

Die Analysen der Breite des Wundumfangs und der Reepithelisierung sind in den Tabellen 3 und 4 zusammengefaßt.

2.2.1 WUNDBREITE

Tabelle 3 stellt die Umfangsbreite von Wunden für Gelsolin-null-Mäuse (KO) und Kontrollmäuse (WT) an den Tagen 5 und 7 nach der Wundenbildung dar.
Nach 5 Tagen waren die Wunden von KO-Mäusen breiter (mittlere Breite 2521,7 u) und zellreicher als die Kontrollwunden (mittlere Breite 1310,91 u). Es wurde wenig neues Kollagen beobachtet, und Zellen befanden sich in Büscheln innerhalb der Wundfläche. Statistische Analyse (unter Verwendung des Simfit-Programms, geschrieben von Dr. W. Bardsley, University of Manchester) demonstrierte, daß die Unterschiede zwischen der Wundbreite von WT- und KO-Mäusen am Tag 5 nach der Wundenbildung höchst signifikant waren.
Unterschiede in der Wundbreite zwischen WT- und KO-Mäusen 7 Tage nach der Wundenbildung waren nicht signifikant verschieden.

2.2.2 REEPITHELISIERUNG

Am Tag 5 nach der Wundenbildung gab es minimale Reepithelisierung (63,4%) bei transgenen (KO)- im Vergleich zu Wildtyp-(WT)-Wunden (95,4%) und es waren große Krusten vorhanden. Statistische Analyse demonstrierte, daß die Unterschiede zwischen der Wundbreite von WT- und KO- Mäusen 5 Tage nach der Wundenbildung höchst signifikant war.
Am Tag 7 nach der Wundenbildung waren die Wunden von Gelsolin-null-Mäusen (KO) fast alle reepithelisiert (der Mittelwert der Reepithelisierung war 95,03% mit nur einer Wunde, die nicht vollständig reepithelisiert war) und enthielten etwas neues Kollagen. Das Kollagen war jedoch in einer sehr unregelmäßigen flickenartigen Weise, in einer ähnlichen Weise wie der in Beispiel 1 beschriebenen, abgelagert.
Am Tag 7 nach der Wundenbildung waren von der Kontrolle die Wildtyp-Mäuse alle reepithelisiert und hatten hohe Niveaus von neuem Kollagen.
Unterschiede in den % Reepithelisierung zwischen WT- und KO-Mäusen 7 Tage nach der Wundenbildung waren nicht signifikant verschieden. Jedoch waren die Unterschiede, die in der Kollagenzusammensetzung beobachtet wurden, bemerkenswert. TABELLE 3 Wundbreite (Umfang)
Statistische Analyse von Werten in Tabelle 3:
(i) 5 TAGE*
1. Kolgomorov-Smirnov, Zwei-Proben-Test
H0:F(WT) ist gleich zu G(KO) gegen:
H1:F(WT) ist nicht gleich zu G(KO) p = 0,0007 (Höchst signifikant)
H0 gegen H3:F(WT) < G(KO) p = 0,0003 (Höchst signifikant)
2. Mann-Whitney-U-Test
H0:F(WT) ist gleich zu G(KO) gegen
H 1:F(WT) ist nicht gleich zu G(KO) p = 0,0002 (Höchst signifikant)
H0 gegen H3:F(WT) < G(KO) p = 0,0001 (Höchst signifikant)
(ii) 7 TAGE
1. Kolgomorov-Smirnov, Zwei-Proben-Test
H0:F(WT) ist gleich zu G(KO) gegen
H1:F(WT) ist nicht gleich zu G(KO)
H0 gegen H3:F(WT) < G(KO) p = 0,47 (nicht signifikant)
2. Mann-Whitney-U-Test
H0:F(WT) ist gleich zu G(KO) gegen
H1:F(WT) ist nicht gleich zu G(KO)
H0 gegen H3:F(WT) < G(KO) p = 0,3 (nicht signifikant) TABELLE 4 Prozentsatz Reepithelisierung
Statistische Analyse von Werten in Tabelle 3:
(i) 5 TAGE *
1. Kolgomorov-Smirnov, Zwei-Proben-Test
H0:F(WT) ist gleich zu G(KO) gegen:
H1:F(WT) ist nicht gleich zu G(KO) p = 0,0112 (Höchst signifikant)
H0 gegen H3:F(WT) < G(KO) p = 0,0056 (Höchst signifikant)
2. Mann-Whitney-U-Test
H0:F(WT) ist gleich zu G(KO) gegen
H1:F(WT) ist nicht gleich zu G(KO) p = 0; 0012 (Höchst signifikant)
H0 gegen H3:F(WT) < G(KO) p = 0,0005 (Höchst signifikant)
(ii) 7 TAGE
1. Kolgomorov-Smirnov, Zwei-Proben-Test
H0:F(WT) ist gleich zu G(KO) gegen
H1:F(WT) ist nicht gleich zu G(KO)
H0 gegen H3:F(WT) < G(KO) p = 0,5 (nicht signifikant)
2. Mann-Whitney-U-Test
H0:F(WT) ist gleich zu G(KO) gegen
H1:F(WT) ist nicht gleich zu G(KO)
H0 gegen H3:F(WT) < G(KO) p = 0,5 (nicht signifikant)
Um die Signifikanz der Werte, dargestellt in den Beispielen 1 und 2, zu veranschaulichen, wurden die Werte für beide Beispiele kombiniert und sind in den Tabellen 5-9 dargestellt. TABELLE 5 Lineare Breite (um) von Wunden von Gelsolin-Knockout- und Kontroll-Mäusen
**p < 0,01 TABELLE 6 Retraktionsbreite (um) des Panniculus-Carnosus-Muskels
*p < 0,05 TABELLE 7 Mittlere Wundbreite (um)
*p < 0,05 TABELLE 8 Breite des Wundumfangs (um)
**p < 0,01 TABELLE 9 Prozentsatz der Reepithelisierung
*p < 0,05, **p < 0,01

Claims

1. Verwendung einer Verbindung, die intrazellulär und/oder extrazellulär Anordnung und Organisation von Actin abwandelt, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Fibrose< in nichtpulmonalem Gewebe oder Wunden.

2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Verbindung, die Anordnung und Organisation von Actin abwandelt, Actinfilamente auseinander trennt.

3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Verbindung aus Gelsolin, Villin, CapG, Adseverin, Flightless-1, Advillin und Derivaten davon ausgewählt ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei die Verbindung Gelsolin oder ein Derivat davon ist.

5. Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch zur Behandlung von Wunden, um Narbenbildung zu hemmen oder zu verhindern.

6. Verwendung nach Anspruch 5 zur Hemmung oder Verhinderung von Vernarbung des Auges, des Nervengewebes oder der Därme.

7. Verwendung nach Anspruch 5 zur Hemmung oder Verhinderung von Hautvernarbung.

8. Verwendung nach den Ansprüchen 6 oder 7 zur Hemmung oder Verhinderung von Vernarbung nach einer Verbrennung.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-4 zur Behandlung von Wunden, derart, daß die Geschwindigkeit der Heilung von Wunden vergrößert wird.

10. Verwendung nach Anspruch 9 zur Behandlung von akuten Wunden.

11. Verwendung nach Anspruch 10, wobei die akute Wunde eine von einer eindringenden Verletzung, einer Verbrennung, Nervenschädigung oder einer Wunde, entstehend aus elektiver Operation, ist.

12. Verwendung nach Anspruch 9 zur Behandlung von chronischen Wunden.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die chronische Wunde eine von diabetischer, venöser oder Dekubitalulkus oder eine Wunde von einem allgemein in der Heilung beeinträchtigten Individuum ist.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 1-4 zur Verhinderung oder Verringerung von Fibrose von nichtpulinonalem Gewebe.

15. Verwendung nach Anspruch 14, wobei die Fibrose eine fibrotische Erkrankung ist.

16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die fibrotische Erkrankung eine von Glomerulonephritis, Leberzirrhose oder fibrös-zystischer Erkrankung ist.

17. Verwendung eines Abgabesystems, umfassend ein DNA-Molekül, codierend ein Protein, welches Anordnung und Organisation von Actin abwandelt, wobei das DNA-Molekül imstande ist, transkribiert zu werden, um zu der Expression des Proteins zu führen, bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von Fibrose in nichtpulmonalem Gewebe oder Wunden.

18. Verwendung nach Anspruch 17, wobei das DNA-Molekül eines von Gelsolin, Villin, GapG, Adseverin, Flightless-1, Advillin und Derivaten davon codiert.