DE69727378T2

DE69727378T2 - Verwendung von antagonisten des 5-htia rezeptors zur behandlung von harninkontinenz

Info

Publication number: DE69727378T2
Application number: DE69727378T
Authority: DE
Inventors: Amedeo Leonardi; Rodolfo Testa
Original assignee: Recordati SA; Recordati Industria Chimica e Farmaceutica SpA
Current assignee: Recordati Ireland Ltd; Recordati Industria Chimica e Farmaceutica SpA
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1997-02-25
Publication date: 2004-12-09
Anticipated expiration: 2017-02-26
Also published as: EP0906100B1; ITMI960378A1; JP2001511763A; AU2093297A; DK0906100T3; ITMI960378A0; PT906100E; EP0906100A1; DE69727378D1; IT1282705B1; ES2213205T3; ATE258438T1; WO1997031637A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Zusammensetzungen und Verfahren zur Behandlung von bestimmten Erkrankungen des unteren Harnwegs bei Säugetieren, einschließlich Menschen, unter Verwendung von Verbindungen mit Serotonin 5-HT_1A Rezeptor antagonistischer Wirkung, die ihre inhibitorische Wirkungen sowohl über präsynaptische (somatodendritische) als auch postsynaptische Antagonismen ausüben.
Bei Säugetieren ist die Miktion ein komplexer Prozess, welcher die aufeinander abgestimmten Aktionen der Harnblase, deren interne und externe Schließmuskeln, der Muskulatur des Beckenbodens, und die neurologische Kontrolle über diese Muskeln auf drei Ebenen (in der Blasenwand oder dem Schließmuskel selbst, in den autonomen Zentren des Rückenmarks, und im zentralen Nervensystem auf Ebene des Miktionszentrum im Hirnstamm (Pons) unter der Kontrolle des cerebralen Cortex stehend) erfordert. Die Miktion erfordert dabei aus der Kontraktion des Detrusormuskels, welcher aus übereinanderliegenden glatten Muskelfasern besteht, die unter autonomer parasympathischer Kontrolle des sakralen Rückenmarks stehen. Ein einfacher Entleerungsreflex wird von sensorischen Nerven für Schmerz, Temperatur und Dehnung gebildet, welche von der Harnblase zum Rückgrat verlaufen. Jedoch erreichen auch sensorische Bahnen von der Harnblase das Miktionszentrum im Hirnstamm (Pons), wodurch Nervenimpulse generiert werden, die normalerweise den Reflexbogen des Rückenmarks unterdrücken, welcher das Entleeren der Harnblase kontrolliert. Daher wird die normale Miktion eingeleitet durch die willentliche Unterdrückung der kortikalen Inhibition des Reflexbogens und durch die Entspannung der Muskeln des Beckenbodens und des externen Schließmuskels. Schließlich kontrahiert der Detrusormuskel und das Entleeren tritt auf.
Funktionelle Abnormalitäten des unteren Harnwegs, z. B. die Dysurie, Harninkontinenz und die Anurie sind allgemein in der Population verbreitet. Die Dysurie umfasst die Harnfrequenz, die Nocturie und die Dringlichkeit und kann durch Zystitis, Prostatitis oder eine benigne Prostatahypertrophie (welche etwa 70% aller älteren Männer betrifft) verursacht sein, oder durch neurologische Erkrankungen. Inkontinenzsyndrome umfassen die Stress-Inkontinenz, die Drang-Inkontinenz und die Überlauf-Inkontinenz. Die Anurie betrifft die unfreiwillige Passage von Harn bei Nacht oder während des Schlaf.
Bevor die vorliegende Erfindung gemacht wurde, umfasste die Behandlung von neuromuskulären Erkrankungen des unteren Harnwegs die Verabreichung von Verbindungen, welche direkt auf die Blasenmuskulatur einwirken, wie beispielsweise Flavoxat, ein spasmolytisches Arzneimittel, welches auch auf das Miktionszentrum des Pons wirkt, oder anticholinerge Verbindungen wie Oxybutynin. Die Verwendung von α₁-adrenergen Rezeptorantagonisten zur Behandlung von benignen prostatischer Hypertrophie ist ebenfalls bekannt. Allerdings können Behandlungen, die die direkte Inhibition der Beckenmuskulatur (einschließlich des Detrusormuskels) umfassen, ungewünschte Nebenwirkungen wie unvollständiges Entleeren oder Paralyse des Accomodierungsreflexes, Tachykardie und trockener Mund. Es wäre daher von Vorteil Verbindungen zu verwenden, welche über das periphere oder das zentrale Nervensystem wirken, beispielsweise in dem sie den Rückenmarksreflexbogen und/oder die Inhibitionswege des Miktionszentrum des Pons auf eine Art und Weise beeinflussen, die die normale Funktion der Miktionsmechanismen wiederherstellen.
Lecci et. al. (J. Pharmacol. Exp. Therapeutics, 262, 181, 1992) beschreiben die Wirkung der 5-HT_1A Rezeptorliganden 8-hydroxy-2-di-N-propylamino-tetralin (8-OH-DPAT) und 1-2-methoxyphenyl-4-4-2-phthalimido-butyl-piperazin (NAN-190) auf Miktionsreflexe bei betäubten Ratten. 8-OH-DPAT (ein Agonist) symbolierte den supraspinalen Miktionsreflex, der aus dem Miktionszentrum des Pons stammt, während NAN-190 den supraspinalen Miktionsreflex inhibierte. Die Autoren schlossen daraus, dass spinale und supraspinale 5-HT_1A Rezeptoren in diesem System den supraspinalen Miktionsreflex modulieren. In vorliegender Erfindung wurde jedoch gefunden, dass die Inhibitionseffizienz von NAN-190 und anderen 5-HT_1A Rezeptorliganden bezüglich des supraspinalen Miktionsreflexes direkt korreliert ist mit deren relativen Bindungsaffinitäten für den α₁-adrenergen Rezeptor, im Gegensatz zu deren falls vorhandenen Affinität für den 5-HT_1A Rezeptor, was die Frage nach der Relevanz der mit der 5-HT_1A Rezeptoraktivität korrelierten Wirkungen bezogen auf den unteren Harnweg Erkrankungen aufwarf. Schließlich wird, wie unten diskutiert, NAN-190 als partieller 5-HT_1A Rezeptoragonist und nicht als vollständiger oder "echter" Antagonist angesehen. Daher war bevor die vorliegende Erfindung gemacht wurde, die Verwendung von echten 5-HT_1A Rezeptorantagonisten zur Behandlung von Harnwegserkrankungen unbekannt.
Es wurden mindestens zwei funktionell unterschiedliche Typen des 5-HT_1A Rezeptors identifiziert, und diese wurden "präsynaptisch" rund oder somatodendritisch rund und "postsynaptisch" bezeichnet.
Präsynaptische Rezeptoren liegen auf 5-HT-produzierenden Neuronen vor, und sind in die Autoregulation der 5-HT-Freisetzung involviert; ihre Aktivierung bewirkt physiologische Veränderungen einschließlich der Hyperphagie, Hypothermie (in der Maus), Bradykardie und niedriger Blutdruck. Postsynaptische Rezeptoren sind im gesamten Säugetiergehirn weit verbreitet und an Kaliumkanäle und die Adenylatcyclase gekoppelt, ihre Aktivierung führt zu dem "5-HT-Verhaltenssyndrom", Hypothermie (in der Ratte) und die Anhebung von Plasma-Kortikotropin-Leveln. Neben den Unterschieden in ihrer anatomischen Verteilung und Funktionsweise, können präsynaptische und postsynaptische Rezeptoren durch unterschiedliche Aktivitätsprofile von verschiedenen 5-HT1A Rezeptorliganden unterschieden werden. Beispielsweise besitzen vollständige Agonisten, wie 8-OH-DPAT und 5-carboxytryptamin agonistische Aktivität sowohl auf präsynaptische als auch auf postsynaptische Rezeptoren. Im Gegenteil hierzu besitzen partielle Agonisten wie Buspiron, Ipsapiron, Spiroxantin, Urapidil, NAN-190 und BMY 7378 agonistische Aktivität auf präsynaptische Rezeptoren und antagonistische Aktivität auf postsynaptische Rezeptoren. Schließlich weisen manche Verbindungen antagonistisch Aktivität sowohl auf präsynaptische als auch postsynaptische Rezeptoren auf. Diese letzt genannten Verbindungen, echte Antagonisten des serotonergen 5-HT_1A Rezeptors sind erfindungsgemäß verwendbar.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung einer Verbindung bereit, welche

(a) an einen klonierten humanen 5-HT_1A Rezeptor mit einer Affinität von mindestens 10^–7 M bindet,
(b) an einen Ratten 5-HT_1A Rezeptor mit einer Affinität bindet, die mindestens 50 × größer als die Affinität, mit der die Verbindung an den Ratten α₁-adrenergen Rezeptor bindet, und
(c) sowohl auf Maus präsynaptische als auch Ratten postsynaptische 5-HT_1A Rezeptoren 5-HT_1A rezeptorantagonistische Aktivität aufweist, oder eines Stereoisomers, eines Hydrats, eines Solvats oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes einer solchen Verbindung, für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von neuromuskulären Erkrankungen des unteren Harnwegs bei Säugetieren.

Verbindungen, die zur Durchführung der Erfindung verwendbar sind, bindend an HT_1A Rezeptoren vorzugsweise mit einer Affinität (K_i) von mindestens 10^–8 M. Drückt man ihre 5-HT_1A rezeptorantagonistische Aktivität (sowohl auf präsynaptische als auch postsynaptische Stellen) als Funktion der Dosis aus, so weisen die Verbindungen ID50 Werte von 1–2000 μg/Kg, und vorzugsweise von 1–200 μg/Kg auf.
Da die zur Durchführung der Erfindung verwendbaren Verbindungen an die 5-HT_1A Rezeptoren mit einer Affinität binden, die mindestens 50-fach größer, und vorzugsweise 100-fach größer ist, als die mit der sie an α₁-adrenergen Rezeptoren binden, weisen sie α-adrenerge Rezeptorbindekonstanten im mikromolaren Bereich oder noch schwächer auf.
Erfindungsgemäß hergestellte Medikamente sind für die Behandlung von neuromuskulären Erkrankungen des unteren Harnwegs geeignet, insbesondere solche Erkrankungen, die Miktion umfassen, wie die Dysurie, die Inkontinenz und die Enuresis. Ohne von der Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die Verabreichung von 5-HT_1A Rezeptorantagonisten eine unerwünschte Aktivität des Rückenmarkreflexbogens und/oder von kortikalen Mechanismen, die die Miktion kontrollieren, vorbeugt. Es wird daher angenommen, dass eine große Vielzahl von Erkrankungen des unteren Harnwegs unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen behandelt werden können.
Die erfindungsgemäßen Erfindungen können in flüssige Dosierungsformen unter Verwendung eines physiologisch akzeptablen Träger, wie phosphatgepufferter Salzlösung oder dejonisiertem Wasser formuliert werden. Die pharmazeutische Formulierung kann auch Excipienten einschließlich Konservierungs- und Stabilisierungsmittel umfassen, welche auf dem Fachgebiet wohl bekannt sind. Die Verbindungen können in feste orale und nichtorale Dosierungseinheiten wie Tabletten, Kapseln, Pulver und Zäpfchen ausgebildet werden, und können zusätzlich Excipienten umfassen, umfassend ohne Begrenzung Lubricantien, Weichmacher, Färbemittel, Absorptionsverstärkemittel, Bakterizide und ähnliches. Die Verbreitung von Medikamenten, die unter Verwendung von echten 5-HT_1A rezeptorantagonistischen Verbindungen, deren Stereoisomeren oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen, Hydraten oder Solvaten hergestellt wurden, kann über jede effektive Route bewirkt werden, einschließlich der oralen, der enteralen, der intravenösen, der intramuskulären, der subkutanen, der transdermalen, der transmukosalen (einschließlich rektal und bukal) und durch Inhalationswege. Vorzugsweise wird ein oraler oder transdermaler Weg verwendet (d. h. über feste oder flüssige orale Formulierungs- oder Hautpflaster). Eine wirksame Menge des Medikamentes ist eine Menge, die eine messbare Verbesserung von mindestens einem Symptom der Erkrankung bewirkt. Diese effektive Menge kann durch Experimente wie sie im Fachgebiet bekannt sind bestimmt werden, beispielsweise durch Etablieren einer Matrix von Dosierungen und Häufigkeiten und Vergleichen einer Gruppe von experimentären Einheiten oder Subjekten mit jedem Punkt in der Matrix. Die Symptome von Harnwegserkrankungen umfassen Harndrang, Harnfrequenz, Durchsickern des Harns, Enuresis, Dysurie, Zögerlichkeit, Schwierigkeit beim Entleeren der Blase. Eine messbare Verbesserung irgendeines Symptoms oder Parameters würde durch den Arzt, der auf dem Fachgebiet bewandert ist, bestimmt oder vom Patienten dem Arzt berichtet.
Beispielsweise kann ein einzelner Patient an mehreren Symptomen der Dysurie gleichzeitig leiden, beispielsweise Harndringlichkeit und Harnfrequenz, wobei beide oder auch nur eines dieser Symptome durch die Verfahren der vorliegenden Erfindung verringert werden können. Im Falle der Inkontinenz wird jede Reduktion in der Frequenz oder dem Volumen des unerwünscht freigesetzten Urins als günstige Wirkung der vorliegenden Verfahren zur Behandlung angesehen.
Die Menge des zu verabreichenden Mittels kann im Bereich von etwa 0,01 – bis etwa 25 mg/kg/Tag, vorzugsweise von etwa 0,1–10 mg/kg/Tag und besonders bevorzugt von etwa 0,2–5 mg/kg/Tag liegen. Es ist verständlich, dass die Arzneimittelformulierungen der vorliegenden Erfindung nicht an sich die gesamte Menge des Mittels enthalten müssen, welche für die Wandlung der Erkrankung wirksam ist, weil solche wirksamen Mengen auch durch Verabreichung einer Mehrzahl von Dosierungen erreicht werden können.
In einem bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung wird N-{2-[4-(2-methoxyphenyl)-1-piperazinyl]-ethyl}-N-(2-pyridyl)-cyclohexanecarboxamid (im weiteren Verbindung A) in Kapseln oder Tabletten formuliert, wobei diese von 50–200 mg Verbindung A enthalten und wird einem Patienten in einer täglichen Dosis von 200 mg zur Erleichterung der Harninkontinenz verabreicht.
In einem weiteren bevorzugten Ausführungsbeispiel der Erfindung, wird N-{2-[4-(4-indolyl)-1-piperazinyl]-ethyl}-N-(2-pyridyl)-cyclohexanecarboxamid (im weiteren Verbindung B) in Kapseln oder Tabletten formuliert, wobei jede von 20–60 mg Verbindung B enthält und wird dem Patienten in einer täglichen Dosierung von 60 mg zur Erleichterung der Harninkontinenz verabreicht.
Verbindungen, die die erforderliche präsynaptische und postsynaptische 5-HT_1A antagonistische Aktivität aufweisen, können unter solchen Verbindungen gefunden werden, die ein protonierbares Stickstoffatom besitzen, welches auf einer Seite an einem aromatischen oder heteroaromatischen Ring und auf der anderen Seite an eine Kohlenstoffkette gebunden ist. Zusätzlich kann der protonierbare Stickstoff und die Kette einen Ring formen. Verbindungen, die zu dieser allgemeinen Klasse gehören, können unter Verwendung der unten diskutierten Verfahren getestet werden, um zu bestimmen, ob sie auch die anderen Kriterien einhalten, welche für die erfindungsgemäße Verwendung erforderlich sind.
Die Messung der spezifischen Bindeaktivität einer Verbindung hinsichtlich unterschiedlicher neuronaler Rezeptoren (wie beispielsweise serotonerge 5-HT_1A Rezeptoren, α₁- oder α₂-adrenerge Rezeptoren, dopaminerge D₂ Rezeptoren und serotoninerge 5-HT₂ Rezeptoren, kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren durchgeführt werden, die alle auf dem Fachgebiet sehr gut bekannt sind, wie beispielsweise das competitive Binden an native oder klonierte Rezeptoren. Typischerweise wird eine biologische Quelle von beispielsweise einem 5-HT_1A Rezeptor verwendet, in der der Rezeptor in einer ausreichend hohen Konzentration vorliegt, so dass markiertes 5-HT oder ein markierter 5-HT_1A Ligand einfach gemessen werden kann. Diese Quelle kann ein Säugetier, Gewebe oder Flüssigkeit (entweder in situ oder nach der Entfernung) oder eine Gewebekulturzelle umfassen. Der Zielrezeptor kann entweder von einem endogenen oder von einem transfizierten Rezeptor-kodierenden rekombinanten Gen exprimiert werden. Beispielsweise ist der Hippocampus der Ratte eine reiche Quelle für 5-HT_1A Rezeptoren. Alternativ kann die humane 5-HT_1A Rezeptor cDNA in E. coli – Zellen in Kultur exprimiert werden, wie in Bertin B. et al., J. Biol. Chem 267, 8200, 1992 berichtet. Die Fähigkeit der Testverbindung mit markiertem 5-HT (oder markiertem 5-HT_1A Liganden), um die Rezeptorbindung zu kompetitieren wird dann gemessen, und eine Bindekonstante ist unter Verwendung einer Scatchard-Analyse oder äquivalenter Berechnungsmethoden, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, kalkuliert.
Es ist klar, dass Messungen der Rezeptorbindungsaffinität einer bestimmten Verbindung abhängig von der Quelle des Rezeptors, des radioaktiv markierten Liganden und anderer Bestandteile wie auch der spezifischen Testbedingungen variieren kann. Daher wird Verbindung A in allen Tests als Standardisierungskontrolle eingeschlossen. Dies bedeutet, dass die Werte, die für die Bindungsaffinitäten von Verbindung A erhalten werden, mit den Werten verglichen werden, die in Beispiel 3, unten, gezeigt sind, d. h. K_i = 3 × 10^–10 M für 5-HT_1A Rezeptoren und 3 × 10^–7 M für α₁-adrenerge Rezeptoren und die Werte, die im selben Test für andere Testverbindungen erhalten werden, werden entsprechend normalisiert.
Die Messung von präsynaptischen und postsynaptischen serotoninerger 5-HT_1A rezeptorantagonistischer Aktivität kann unter Verwendung von neurophysiologischen Testverfahren durchgeführt werden. Beispielsweise wird das Feuern von Raphezellen elektrophysiologisch gemessen und als ein Index der präsynaptischen 5-HT_1A Rezeptoraktivität verwendet (Vander Maelen et al., Brain Res. 289, 109, 1983). In diesem Test inhibiert ein 5-HT_1A Rezeptoragonist auf präsynaptischen somatodendritischen 5-HT_1A Rezeptoren das Feuern von Rapheneuronalzellen, was nachgewiesen wird durch Messen der elektrischen Aktivität von 5-HT enthaltenden Neuronen. Antagonisten verhinderen die inhibitorische Wirkung des 5-HT_1A Rezeptoragonisten, worauf die Beibehaltung von hohen Spiegeln an Serotonin in der synaptischen Spalte resultiert. Ein alternatives System zum Messen der präsynatpischen Aktivität ist die Inhibition der von 8-OH-DPAT in Mäusen induzierten Hypothermie (Moser, Eur. J. Pharmacol. 193, 165 1991).
Die Inhibition der Adenylatcyclaseaktivität in Schnitten von Ratten-Hippocampus wird als Indikator der postsynaptischen 5-HT_1A Rezeptoraktivität verwendet (Shenker et al., Eur. J. Pharmacol. 109, 427, 1985). In diesem Test antagonisieren Verbindungen, die eine antagonistische Wirkung auf postsynaptische 5-HT1A Rezeptoren aufweisen die inhibitorischen Effekte eines 5-HT_1A Agonisten ausschließlich auf die Forskolinstimmulierer Adenylatcyclaseaktivität und zeigen keinen intrinsischen Effekt auf die basale Aktivität des Enzyms. Alternative Verfahren zur Messung der postsynaptischen Aktivität umfassen die Inhibition von 8-OH-DPAT induziertem Verhaltensyndrom, insbesondere dem Vorderpfotentritt-Syndrom (Tricklebank et al., Eur. J. Pharmacol. 117, 15, 1985). Diese und andere Methoden sind ausführlich dargestellt in Fletcher et al. 14, 441, 1993.
Wie oben diskutiert, wird Verbindung A bei allen Tests als Positivkontrolle mitgeführt; die für die präsynaptische und postsynaptische antagonistische Aktivität der Verbindung A erhaltenen Werte werden entsprechend mit denen, die unten im Beispiel 4 und 5 (ID50 für präsynaptisch = 8,5 μg/Kg; postsynaptisch = 14 μg/Kg) normalisiert und die Werte, die für andere Testverbindungen behalten werden, werden verglichen.
Sobald eine Verbindung als 5-HT_1A rezeptorantagonistische Aktivität aufweisend identifiziert wird, wird dessen pharmakologische Aktivität unter Verwendung von einem oder mehreren Tiermodellsystemen für Erkrankungen des unteren Harnwegs bestätigt. Verwendbare Tiermodellsysteme umfassen isovolumetrische, rhythmische Blasenentleerungskontraktionen in betäubten Ratten und Zystometrie bei Ratten im Wachzustand. Im ersten Verfahren wird die Harnblase katheterisiert, legiert und mit einem Druckaufzeichnungsgerät verbunden. Die Blase wird dann gefüllt, bis Reflexentleerenkontraktionen auftreten, wonach die Frequenz um die Höhe der Entleerungskontraktionen gemessen werden. Bei dem zweiten Verfahren wird die Blasenvolumenkapazität und Miktionsdruck am Tag nach dem Blasenkatheterisieren gemessen. Bei der ersten Methode werden die Verbindungen vor den Messungen intravenös verabreicht. Bei der zweiten Methode können sowohl orale als auch intravenöse Verabreichungswege benutzt werden. Die Verfahren sind detaillierter in Beispiel 6 und 7 unten beschrieben, und wurden ursprünglich verwendet, die vorhergesagte Qualität von echten serotoninergen 5-HT_1A Rezeptorantagonisten für die vorhergehenden Harnwegserkrankungen zu überprüfen.
5-HT1A rezeptorantagonistische Verbindungen, die erfindungsgemäß geeignet sind, umfassen Piperazinderivate der allgemeinen Formel (I).
In diesen Verbindungen steht:
R steht für ein Wasserstoffatom oder eine niedrige Alkylgruppe;
R¹ steht für eine Aryl, stickstoffenthaltende Heteroaryl- oder stickstoffenthaltende bizyklische Heteroarylgruppe; und
X steht für eine der Gruppen:
wobei
n 1 oder 2 ist
m 1, 2 oder 3 ist;
R² für ein Wasserstoffatom oder eine niedrige Alkylgruppe steht,
R³ für eine Aryl- oder eine Aryl-(niedrig)Alkylgruppe steht,
R⁴ für ein Wasserstoffatom oder eine C₁-C₃-Alkylgruppe steht,
R⁵ für ein Wasserstoffatom oder eine C₁-C₃-Alkyl, C₃-C₁₂-cycloalkyl oder cycloalkyl(niedrig)alkylgruppe steht; oder R⁴ und R⁵ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, für eine 1-azetidinyl, 1-pyrrolidinyl, piperidino, 1-perhydroazepinyl, morpholino, oder 1-piperazinylgruppe stehen, wobei jeder optional durch eine niedrige Alkyl, Aryl oder Aryl(niedrig)Alkylgruppe substituiert sein kann;
R⁶ für eine monozyklische oder bizyklische Heteroarylgruppe steht,
R⁷ für ein Wasserstoffatom, eine niedrige Alkyl, eine Cycloalkyl, eine Cycloalkenyl, eine Cycloalkyl(niedrig)Alkyl, eine Aryl, eine Aryl(niedrig)Alkyl, eine Heteroaryl oder eine Heteroaryl(niedrig)Alkylgruppe steht, oder eine Gruppe -NR⁸R⁹ oder OR¹⁰;
R⁸ für ein Wasserstoffatom oder eine niedrige Alkyl, Aryl oder Aryl(niedrig)Alkylgruppe steht;
R⁹ für ein Wasserstoffatom oder eine niedrige Alkyl, -CO-(niedrig)Alkyl, eine Aryl, eine -CO-Aryl, eine Aryl(niedrig)Alkyl, eine Cycloalkyl oder eine Cycloalkyl(niedrig)Alkylgruppe steht; oder R⁸ und R⁹ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, eine gesättigte heterozyklische Gruppe stehen, welche ein zusätzliches Heteroatom tragen kann;
R¹⁰ für eine Niedrigalkylgruppe, eine Cycloalkyl, eine Cyclyalkyl(niedrig)alkyl, eine Aryl, eine Aryl(niedrig)Alkyl, eine Heteroaryl oder eine Heteroaryl und Niedrigarylgruppe steht.
R¹¹ für eine Aryl oder stickstoffenthaltende Heteroarylgruppe steht,
R¹² für ein Wasserstoffatom oder eine Niedrigalkylgruppe steht,
R¹³ für ein Wasserstoffatom oder eine C₁-C₃-Alkyl, C₃-C₁₂-Cycloalkyl oder Cycloalkyl(niedrig)alkylgruppe steht,
R¹⁴ für eine Arylgruppe steht,
Ka für eine C₂-C₄-Alkylgruppe steht, welche optional durch eine oder mehrere Niedrigalkylgruppen substituiert sein kann; und
Y für eine Carbonyl, Alkylen, Hydroxyalkylen oder Hydroxycycloalkylengruppe steht oder für eine Gruppe -S(O)_o; wobei o = 0–2 ist.
Wenn R¹ für eine Arylgruppe steht, steht es vorzugsweise für eine Phenylgruppe mit einem Substituenten in Orthostellung für eine 1-naphthylgruppe, welche optional in 2 oder 7 Positionen substituiert ist.
Beispiele für Arylgruppen R¹ sind o-(niedrig)-alkoxyphenyl, wo-methosyphenyl oder (niedrig)alkoxy-substituiertes 1-naphthyl.
Wenn R¹ für eine bizyklische Heteroarylgruppe steht, steht es vorzugsweise für eine 4-indolylgruppe.
Wenn R⁶ für eine bizyklische Heteroarylgruppe steht, können beide Ringe eines oder mehrere Heteroringatom(e) enthalten, oder es kann nur ein Ring eines oder mehrerer Heteroatome) enthalten. Im letzteren Fall ist die R⁶-Gruppe mit der Verbindung der Formel (I) über den Ring verbunden, der das oder die Heteroatome) enthält.
Beispiele für solche Heteroarylgruppen R⁶ beinhalten monozyklische Gruppen, die ein Heteroatom enthalten, wie Pyridyl (insbesondere 2-pyridyl); Monozyklische Gruppen die zwei Heteroatome enthalten, wie Thiazolyl (insbesondere 2-thiazolyl); und bizyklische Gruppen, die ein oder zwei Heteroatome enthalten, wie Quinolinyl oder Isoquinolinyl und insbesondere 2-quinolinyl.
Wenn R¹¹ und R¹⁴ für eine Arylgruppe stehen, sind die bevorzugten Gruppen Phenylgruppen. Wenn R¹¹ für eine Heteroarylgruppe steht ist dies bevorzugt die Pyridylgruppe, ggf. durch eine oder mehrere Alkylgruppen substituiert.
Verfahren zur Herstellung der Piperazinderivate I sind in den folgenden Referenzen offenbart:
GB 2230780 ( EP 395313 ), GB 2230781 ( EP 395312 ), GB 2248836, ( EP 481744 ); GB 2255337, GB 2262093, WO 94/15919, WO 94/15928, WO 94/21610, WO 95/33743 und GB 2277517.
Bevorzugte Piperazinderivate I umfassen:
1-{4[-4-(2-methoxyphenyl)-1-piperazinyl]-3-phenylbutanoyl}-perhydroazepin,
1{-4[-4-(2-methoxyphenyl)-1-piperazinyl]-2-phenylbutanoyl}-perhydroazepin,
1-[N-cyclohexylcarbonal-N-(2-Pyridyl)-2-aminoethyl)-4-(2-methoxyphenyl)-piperazin, Verbindung A,
1-[N-cyclohexylcarbonyl-N-(2-Pyridyl)-2-aminoethyl)-4-(4-indolyl)-piperazin Verbindung B, und
1-[2-(2-biphenyl)-ethyl]-4-(2-methoxyphenyl)-piperazin,
und deren pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze.
Erfindungsgemäß steht Aryl für eine aromatische Gruppe mit 6–12 Kohlenstoffatomen wie Phenyl bzw. Naphthyl. Diese können durch einen oder mehrere Substituenten schließen Halogenatome und Niedrigalkyl, Niedrigalkoxy, Halo(niedrig)alkyl, Nitro, Zyano, Amido, (niedrig)alkoxycarbonyl; Amino, (niedrig)alkylamino; und di(niedrig)alkylaminogruppen ein. Zwei benachbarte Substituenten am aromatischen Ring können zusammen, um einen weiteren fusionierten Ring zu bilden, beispielsweise Benzodioxanyl. Der Ausdruck Halogenatom steht für Fluor, Chlor und Brom. Die bevorzugten Halogene sind Chlor und Fluor. Beispiele für bevorzugte Aryl(niedrig)alkylgruppen umfassen Benzyl und Phenethyl, ggf. wie oben beschrieben substituiert.
Erfindungsgemäß steht Heteroaryl für eine aromatische Gruppe, die eines oder mehrere Heteroatom(e) enthält (z. B. Sauerstoff, Stickstoff oder Schwefel) und welche monozyklisch oder bizyklisch sein kann. Die monozyklische Heteroarylgruppe steht für einen aromatischen Ring, der ein oder mehr Stickstoff oder andere Heteroatome enthält, wie Pyridyl, 2-thienyl, 2-furanyl, 1-methyl, 2-pyrrolyl, Pyrimidinyl, Pyrazinyl, Oxazolyl, Thiazinyl und ähnliche. Bevorzugte Heteroarylgruppen beinhalten 2-Pyridyl, 3-Pyridyl und 4-Pyridyl-Gruppen. Die Heteroarylgruppen können durch Halogenatome oder Niedrigalkyl, Niedrigalkoxy, Halo(niedrig)alkyl, Nitro, Amino, Zyano, Amido, (niedrig)alkoxycarbonyl, (niedrig)alkylamino und di(niedrig)-alkylamino-Gruppen substituiert sein. Bizyklisches Heteroaryl steht für Phenylringe, die mit einem zweiten Ring verbunden sind, der ein oder mehrere Heteroatom(e) enthält. Ein besonders bevorzugtes Heteroatom ist Stickstoff.
Beispiele für diese bizyklischen Heteroarylgruppen umfassen Indazolyl, Quinolinyl, Isoquinolinyl und Indolyl. Die bizyklischen Heteroarylgruppen können durch ein oder mehrere Substituenten substituiert sein. Eine bevorzugte bizyklische Heteroarylgruppe ist Indolyl, welches mit Alkoxycarbonylgruppen substituiert ist.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung. In den Beispielen wird bezug genommen auf die beigefügten Zeichnungen, von denen:
1 eine graphische Darstellung einer typischen Rekorderaufnahme ist, die die Wirkung von Verbindung A auch durch volumeninduzierte Kontraktionen betäubter Ratten zeigt, wobei der Pfeil die intravenöse Gabe von 300 μg/Kg Verbindung A zeigt und
2 eine graphische Darstellung einer typischen Rekorderaufnahme ist, welche die Wirkung von Verbindung A auf die zystometrographischen Parameter bei nicht betäubten Ratten zeigt, wobei der Pfeil die orale Behandlung des Tieres mit 3 mg/kg Verbindung A anzeigt.
Beispiel 1
N-{2-[4-(2-methoxyphenyl)-1-piperazinyl]-ethyl}-N-(2-pyridyl)-cyclohexaneacarboxamid·2.66HCl·0.33H₂O (Verbindung A)
23.5 g als 1-(2-aminoethyl)-4-(2-methoxyphenyl)piperazin [Hexachemie-Reuil Malmaison-France] und 4.85 ml 2-cholorpyridin wurden bei 160°C in einem geschlossenen Reaktionsgefäß 10,5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, in 320 ml Chloroform gelöst und mit 1 N Natriumhydroxid gewaschen (3 × 320 ml), gefolgt von Wasser (2 × 400 ml). Die organische Schicht wurde über Natriumsulfat getrocknet und dann zum Trocknen eingedampft unter reduziertem Druck. Das Rohprodukt wurde durch Säulenflash-Chromatographie unter Elution mit Ethylacetat : 3 N NH₃ in Methanol 100 : 2-Mischung gereinigt, was nach Eindampfung der gesammelten Fraktionen, 5 g 1-[N-(2-pyridyl)-2-aminoethyl]-4-(2-methoxyphenyl)-piperazin als Öls ergab. Eine Probe wurde aus Ethylacetat kristallisiert und ergab einen Schmelzpunkt aus dem Festen bei 89 bis 94°C.
¹H-NMR (CDCl₃, δ)
8.08. ddd, 1H, CH bei Position 6 im Pyridinring
7.40, ddd, 1H, CH bei Position 4 im Pyridinring
6.80–7.05, m, 4H, 2-methoxyphenyl CHs
6.55, ddd, 1H, CH an Position 5 im Pyridinring
6.40, dd, 1H, CH an Position 3 im Pyridinring
5.10, bs, 1H, NH
3.85, s, 3H, CH₃O
3.38, dt, 2H, CH ₂NH
3.00–3.15, in, 4H Piperazin CHs
2.60–2.75, in, 6H, Piperazin CHs und CH₂N
D₂O-Addition führt dazu, dass das NH-Signal oberhalb als HDO erscheint.
Zu einer Lösung von 4.26 g der so hergestellten Verbindung in 42,5 ml Tetrahydrofuran wurden tropfenweise bei –22°C 6,52 ml 12,5 N n-butyllithium (in Hexanlösung) hinzugefügt. Nach 40 Minuten Rühren bei –20°C, wurden 2,2 ml Cyclohexancarbonylchlorid tropfenweise hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde bei – 20°C 20 Minuten gerührt und dann bei Raumtemperatur für 3,5 Stunden. Wasser wurde vorsichtig hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden, gefolgt von 3 N Natriumhydroxid. Ethylacetatextraktion, gefolgt von Waschen der organischen Phase mit Wasser, Trocknen auf Natriumsulfat und Eindampfen des Lösungsmittel bis zur Trockne, unter reduziertem Druck ergab ein öliges Rohprodukt, welches durch Säulenflash-Chromatographie unter Elution mit einem Gemisch von Ethylacetat zu 3 N NH3 in Methanol 100 : 2 Elution gereinigt wurde. Eindampfen der gesammelten Fraktionen ergab 5 g der gesuchten Verbindung als eine Base, welche in das Hydrochlorid überführt wurde durch Lösung in Methanol und Zusatz von überschüssiger 2,8 N HCl in Diethylether. Aus Einnahme von der Lösungsmittel zur Trockne und die Trocknung des Feststoffes unter Vakuum ergab 5,3 g der gesuchten Verbindung. Schmelzpunkt 161–164°C.
Elementaranalyse für C₂₅H₃₄N₄O₂·2.66 HCl·0.33 H₂O:
errechnet (%): C 57.14, H 7.16, N 10.66, Cl 17.95, H₂O 1.13
gefunden (%): C 57.45, H 7.29, N 10.67, Cl 18.13, H₂O 1.20
H-NMR (D₆-DMSO, δ):
11.10–11.70, bs, 1H, NH+
8.58, dd, 1H, CH an Position 6 im Pyridinring
8.05, ddd, 1H, CH an Position 4 im Pyridinring
7.64, dd, 1H, CH an Position 3 im Pyridinring
7.45, dd, 1H, CH an Position 5 im Pyridinring
6.82–7.10, m, 4H, 2-methoxyphenyl CHs
5.20–5.80, bs, 2, 4H, NH+ (verbleibend) H₂O
4.17, t, 2H, CH2NCO
3.79, s, 3H, CH₃O
3.00–3.75, m, 10H, CH₂N und Piperazin CHs
2.15–2.35, m, 1H, Cyclohexan CHCO
0.85–1,85, m, 10H, Cyclohexan CHs
D₂O Addition führt dazu, dass das NH-Signal oberhalb als HDO auftritt.
Beispiel 2
N-{2-[4-(4-Indolyl)-1-Piperazinyl]-ethyl}-N-(2-pyridyl)-cyclohexanecarboxamid (Verbindung B)
Stufe a
N-(2,2-Dimethoxyethyl)-N-(2-pyridyl)-cyclohexanecarboxamid
13,2 ml einer 2,5 M Lösung von Butyllithium in n-hexan wurde zu einer Lösung von 6 g 2-(2-pyridylamino)-acetaldehyddimethyl-acetal (hergestellt wie in Beilstein E III/IV 22, 3871 beschrieben) in 40 ml Tetrahydrofuran zugefügt, bei 0° C gerührt und das resultierende Gewicht wurde bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt. 4,46 ml Cyclohexancarbonylchlorid wurden dann tropfenweise über eine Dauer von 5 Minuten zugefügt. Das Rühren wurde für 5,5 Stunden fortgesetzt, und dann wurde das Reaktionsgemisch in Vakuum bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flashchromatographie gereinigt, mit Chloroform : Ethylacetat 7 : 3 eluiert, wodurch 13,3 der gesuchten Verbindung erhalten wurden.
H-NMR (CDCl₃ δ):
8.48–8.54, m, 1H, CH bei Position 6 im Pyridinring
7.75, ddd, 1H, CH bei Position 4 im Pyridinring
7.18–7.44, m, 2H, CHs bei Position 3 und 5 im Pyridinring
4.65, t, 1H, CHCH₂
3.90, d, 2H, CH₂
3.31, s, 6H, 2 × CH₃O
2.32, tt, 1H, CH(CH₂)₂
0.80–1.85, m; 10H, Cyclohexan CH₂δ
Stufe b
N-Formylmethyl-N-(2-pyridyl)-cyclohexanecarboxamide
Ein Gemisch aus 1.46 g N-(2,2-dimethoxyethyl)-N-(2-pyridyl)-cyclohexanecarboxamid, 0,05 g 1,4-Hydroquinon und 25 ml 2 N HCl wurde bei 80°C 20 Minuten unter Stickstoffstrom gerührt. Die Mischung wurde dann auf 0°C abgekühlt, mit 50 ml Dichlormethan verdünnt, und auf pH 10 durch Zufügen einer 20%igen Lösung von Natriumcarbonat eingestellt. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit Dichlormethan extrahiert und die kombinierten organischen Phasen wurden über nicht wäßrige Natriumsulfat getrocknet. Die Eindampfung zur Trockne unter Vakuum ergab 0,94 g der gesuchten Verbindung, welche ohne weitere Reinigung in der nächsten Reaktionsstufe verwendet wurde.
H-NMR (CDCl₃, δ)
9.66, s, 1H, CHO
8.48–8.54, m, 1H, CH bei Position 6 im Pyridinring
7.79, ddd, 1H, CH bei Position 4 im Pyridinring
7.18–7.44, m, 2H, CHs bei Position 3 und 5 im Pyridinring
4.52, s, 2H, CH₂
2.48, tt, 1H, CH(CH₂)₂
0.80–1.95, m, 10H, Cyclohexan CH₂δ
Stufe c
N-{2-[4-(4-Indolyl)-1-piperazinyl]-ethyl}-N-(2-pyridyl)-cyclohexanecarboxamide HCl·1.25H₂O
Ein Gemisch von 0,94 g N-formylmethyl-N-(2-pyridyl)-cyclohexanecarboxamid, 0,69 g 1-(4-indolyl)-piperazin, 1,21 g Natrium-triacetoxyborohydrid, 0,44 ml Essigsäure und 30 ml 1,2-Dichlorethan wurden bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Das Gemisch wurde dann mit 20 ml Wasser verdünnt und auf pH 10 durch Zufügen einer 20%igen Lösung von Natriumcarbonat eingestellt. Die wäßrige Phase wurde zweimal mit 1,2-Dichlorethan extrahiert und die gereinigten organischen Phasen wurden über nicht wäßrige Natriumsulfat getrocknet. Die Eindampfung zur Trockne unter Vakuum ergab ein Rohprodukt, welches durch Flash-Chromatographie gereinigt wurde, unter Elution mit Dichlormethan : Methanol 98 : 2 bis 95 : 5, wodurch 0,96 g der Base der gesuchten Verbindung erhalten wurden. Diese wurde in 40 ml Dichlormethan gelöst und 3,8 N Wasserstoffchlorid in Diethylether wurde hinzugefügt. Die gesuchte Verbindung wurde präzipitiert und abgefiltert. Ausbeute 0,66 g, Schmelzpunkt 181–187°C.
Beispiel 3
Messung der Bindung der Testverbindungen an 5-HT_1A und α₁-adrenerge Rezeptoren
[³H] Prazosinverbindung (α₁-Rezeptoren)
Cerebrale Cortices aus Ratten wurden in 50 Volumen von eiskaltem 50 mM Tris-HCl pH 7.4 umorganisiert. Die Homogenate wurden bei 48.000 × g 10 Minuten zentrifugiert, und die Pellets wurden im gleichen Volumen eiskaltem Puffer resuspendiert, zentrifugiert und noch zweimal resuspendiert. Die erhaltenen Pellets wurden in 100 Volumen 50 mM Tris-HCl pH 7.4, welcher 0,1% Ascorbinsäure und 10 μM Pargyline enthielten, resuspendiert. 1-ml Proben wurden 30 Minuten bei 25°C mit 0,35 nM [³H]Prazosin inkubiert, in Abwesenheit oder Gegenwart von unterschiedlichen Konzentraten (10^–5 bis 10^–10 M) der Testverbindung. Nicht spezifische Bindungen wurden in Gegenwart von 10 μM Phentolamin bestimmt. Die Inkubationen wurden durch schnelles Filtrieren durch Whatman GF/B Filter unter Verwendung eines Brandel Zell Erntegeräts (Brandel Cell Harvester) beendet, wonach die Filter 3 × mit 3 ml eiskaltem Puffer gewaschen wurden. Die auf den Filtern verbliebene Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationszählung bestimmt. Die Resultate sind in der Tabelle 1 weiter unten gezeigt.
[³H]8-OH-DPAT Bindungen (5-HT_1A Rezeptoren)
Hippocampi aus Ratten wurden in 50 M Volumen eiskaltem 50 mM Tris-HCl pH 7.4 homogenisiert. Die Homogenate wurden bei 48.000 × g 10 Minuten zentrifugiert und Pellets wurden in einem gleichen Volumen eiskaltem Puffer resuspendiert, 10 Minuten bei 37°C inkubiert, zentrifugiert und noch zweimal resuspendiert. Die erhaltenen Pellets wurden in 100 Volumen 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 enthaltend 0.1% Ascorbinsäure und 10 μM Pargylin resuspendiert. 1 ml Proben wurden 30 Minuten bei 25°C mit 1 nM [³H]8-OH-DPAT in Abwesenheit oder Gegenwart von unterschiedlichen Konservationen (10^–5 bis 10^–10 M) der Testverbindung inkubiert. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von 10 μM 5-HAT bestimmt. Die Inkubationen wurden durch schnelles Filtern durch Whatman FG/B-Filter unter Verwendung eines Brandel-Zell-Erntegerätes (Brandell cell Harvester) beendet, wonach die Filter dreimal mit 3 ml eiskaltem Puffer gewaschen wurden. Die auf den Filtern verbliebene Radioaktivität wurde durch Flüssigszintillationszählung bestimmt. Die Resultate sind in der Tabelle 1 unten gezeigt.
Tabelle 1 Bindungsaffinität für den 5-HT_1A Rezeptor und den α₁-adrenergen Rezeptor Die Daten sind angegeben als Ki(nM)
Die Resultate zeigen, dass Verbindung A und Verbindung B fest und selektiv an den 5-HT_1A Rezeptor binden, im Gegensatz hierzu zeigt NAN-190 ein nahezu äquivalentes Binden an beide Rezeptoren.
Beispiel 4
Messung der resynaptischen 5-HT_1A rezeptorantagonistischen Aktivität
Antagonismus für Hypothermie, welche in Mäusen durch 8-OH-DPAT induziert wird
Da die antagonistische Wirkung von 5-HT_1A Rezeptorantagonisten auf Hypothermie induziert durch 8-OH-DPAT wurde durch die Methode von Moser (Moser, Eur., J. Pharmacol., 193, 165, 1991) mit geringfügigen Abänderungen untersucht.
Männliche CD-1-Mäuse (28–38 g) erhalten von Charles River (Italien) wurden in einem klimakontrollierten Raum (Temperatur 22 +/–2°C; Feuchtigkeit 55 +/–15%) gehalten, und einem 12 Stunden Hell-/Dunkelzyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser unterzogen. Am Tag des Experiments wurden die Mäuse einzeln in lösdichtdicke Plastikboxen überführt, unter den selben Umgebungsbedingungen. Die Körpertemperatur wurde durch Insertion eines Temperaturfühlers (Termist TM-S, LSI) ins Rektum in einer Tiefe von 2 cm gemessen. Die rektale Temperatur wurde direkt vor der subkutanen Injektion der Testverbindung und 30 Minuten später gemessen. Danach erhielten alle Tiere 8-OH-DPAT (0,5 mg/kg s. c.) und ihre Temperatur wurde 30 Minuten später gemessen. Für jedes Tier wurden die Temperaturänderungen unter Berücksichtigung von Vorbehandlungswerten errechnet, und die durchschnittlichen Werte wurden für jede Behandlungsgruppe berechnet.
Eine lineare Regression wurde verwendet, um die ID50-Werte zu berechnen, welche definiert sind als die Dosis Antagonist, die benötigt wird, um 50% des hypothermen Effekts, welcher durch 0,5 mg/kg 8-OH-DPAT, welches subkutan verabreicht wurde, induziert wird.
Die Resultate sind in der Tabelle 2 unten gezeigt.
Tabelle 2 Antagonistische Aktivität bezogen auf den präsynaptischen 5-HT_1A Rezeptor
Die Resultate zeigen, dass sowohl Verbindung A als auch Verbindung B signifikante präsynaptische 5-HT_1A Rezeptorantagonistische Aktivität aufweisen.
Beispiel 5
Messung der postsynaptischen 5-HT_1A-rezeptorantagonistischen Aktivität
Inhibition der durch 8-OH-DPAT in Ratten induzierten Vorderpfotenscharren (Treading)
Der inhibitorische Effekt von 5-HT_1A Rezeptorantagonisten auf das Vorderpfotenscharren, welches durch subkutane Injektion von 8-OH-DPAT bei Ratten induziert wurde, wurde nach Methode von Tricklebank (Tricklebank et al., Eur. J. Pharmacol, 117: 15, 1985) mit geringfügigen Modifikationen durchgeführt.
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (150–175 g) von Charles River (Italien), wurden in einem klimakontrollierten Raum gehalten und einem 12 h Hell-/Dunkelzyklus mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser unterzogen. Am Tag des Experimentes wurden die Ratten einzeln in klare Plastikboxen gehalten. Reserpinisierte Ratten wurden mit Reserpin, 1 mg/kg s. c. behandelt, 18–24 h vor dem Test. Zur Untersuchung der antagonistischen Aktivität, wurden die Verbindungen i. p. oder s. c. 16 Minuten vor 8-OH-DPAT (1 mg/kg s. c.) verabreicht. Beobachtungssitzungen von 30 s Dauer begannen drei Minuten nach der Behandlung mit dem Agonisten und wurden für alle drei Minuten über einen Zeitraum von 15 Minuten wiederholt.
Das Auftreten des Vorderpfotenscharren-Syndroms, welches durch postsynaptische Stimulation der 5-HT1A Rezeptoren induziert wurde, wurde notiert und dessen Intensität wurde unter Verwendung einer abgestuften Intensitätsskala bewertet, bei der 0 = nicht vorhanden, 1 = verdächtig, 2 = vorhanden und 3 = intensiv bedeutete. Die Verhaltensbewertungen für jede behandelte Ratte wurden über den Zeitverlauf akkumuliert (5 Beobachtungsperioden) und als Durchschnittswerte von 8–10 Ratten angegeben.
Eine lineare Regression wurde verwendet, um ID50-Werte zu berechnen, die als die Dosis Antagonist definiert sind, die benötigt wird, um 50% der Vorderpfotenscharrenintensität induziert durch 1 mg/kg 8-OH-DPAT, welches subkutan verabreicht wurde, zu blockieren.
Die Resultate sind in Tabelle 3 unten gezeigt.
Tabelle 3
Diese Resultate zeigen, dass die Verbindung A signifikante postsynatpische 5-HT_1A Rezeptorantagonistische Aktivität aufweist. NAN-190 ist im Gegensatz dazu viel weniger aktiv. Insgesamt sind die Bioassays für die präsynaptische und postsynatpische antagonistische Aktivität zur Identifizierung von Verbindungen, die beide Aktivitäten aufweisen, in Intensitäten, die die Verbindungen zur Behandlung von Harnwegserkrankungen verwendbar machen, effektiv.
Beispiel 6
Wirkung von 5-HT_1A Rezeptorantagonisten auf die volumeninduzierten rhythmischen Blasenentleerungskontraktionen bei betäubten Ratten
Weibliche Sprague Dawley-Ratten mit einem Gewicht von 225/275 g (Crl: CD° BR, Charles River, Italien) wurden verwendet. Die Tiere wurden mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser gehalten und einen erzwungenen 12 Stunden Lichtdunkelwechselzyklus bei 22–24°C für mindestens eine Woche gehalten, mit Ausnahme während des Experiments. Die Aktivität des rhythmischen Blasenentleerenskontraktionen wurde nach der Methode von Dray (J. Pharmacol. Methods, 13: 157, 1985) bewertet, mit einigen Modifikationen wie in Guarneri (Pharmcol. Res., 27: 173, 1993). Kurz gesagt wurden Ratten durch subkutane Injektion von 1,25 g/kg (5 ml/kg) Urethan, wonach die Harnblase über die Harnröhre katheterisiert wurde unter Verwendung einer PE 50 Polyethylenröhre gefüllt mit physiologischer Salzlösung. Der Katheter wurde an Ort und Stelle befestigt mit einer Ligatur um die externe Harnröhrenöffnung und wurde mit einem konventionellen Druckfühler (Transducers) (Statham P23 ID/P23 XL) verbunden. Der intravesikale Druck wurde fortlaufend mit einem Diagrammaufnahmegerät (Battaglia Rangoni KV 135 mit DC1/T1 Verstärker) aufgezeichnet. Die Blase wurde dann mit dem Aufnahmekatheter mit inkremental ansteigendem Volumen warmer (37°C) Kochsalzlösung gefüllt bis Reflexblasenentleerungskontraktionen auftraten (normalerweise 0,8–1,5 ml). Aus dem Zystometrogramm wurden zwei Parameter ausgewertet: die Frequenz der Entleerungskontraktionen (errechnet durch Zählen der Anzahl der Gipfel (peaks/15 Minuten, Beobachtung und die mittlere Amplitude dieser Kontraktionen (mittlere Höhe der Peaks in mmHg) zum selben Zeitraum. Für die intravenöse (i. v.) Injektion der bioaktiven Verbindungen wurde eine PE 50 Polyethylenröhre gefüllt mit physiologischer Kochsalzlösung in die Jugularvene eingeführt.
Die Bioaktivität wurde für jedes individuelle Tier (unter Verwendung von 6–10 Ratten pro Dosierung) gemessen, in dem die Anzahl und Höhe der Peaks 15 Minuten nach Arzneimittelinjektion aufgenommen wurden, und diese mit den vorher 15 Minuten nach intravenöser Administration des Trägers allein aufgenommenen verglichen wurden. Zur Bewertung der mittleren Amplitude der Peaksnachbehandlung wurden nur die Resultate von Zystometrogrammen ausgewertet, die eine Reduktion der Frequenz der Kontraktionen von ≤ 50% zeigten. Die statistische Signifikanz der Veränderungen in der Frequenz und in der Amplitude vor und nach Behandlung wurden mit einem Student's-t-Test für gepaarte Daten bestimmt. Änderungen kommen, die eine Wahrscheinlichkeit P < 0,01 zeigten, wurden als signifikant angesehen.
Ein alles oder nichts Kriterium wurde ebenso verwendet, um die Bioaktivität zu vergleichen ausgedrückt in ED50-Werten. Ratten, die eine behandlungsabhängige Veränderung von ≥ 30% relativ zu dem Basalwert zeigten, wurden als positiv angesehen. Quantendosisantwortkurven und ED50-Werte wurden durch die Methode vom Bliss (J. Pharm. Pharmacol. 11: 192, 1938) ausgewertet. Zusätzlich wurde die Bioaktivität konventionell geschätzt, durch Messen der Dauer der Ruhephasen (d. h. der Dauer der Zeit, während der keine Kontraktionen auftraten), da die meisten Verbindungen einen Effekt hervorriefen, der relativ schnell begann und zu einer vollständigen Beendigung der Blasenkontraktionen führte (wie in 1 gezeigt). Um die Potenz der getesteten Verbindungen bei der Inhibition der Frequenz der Blasenentleerungskontraktionen zu vergleichen, wurden gleicheffektive Dosierungen, welche 10 Minuten Ruhezeit (disappearance time) (ED_10min) mit Hilfe der Least-square-linearen Regressionsanalyse berechnet.
Die schnelle Dehnung der Harnblase in Urethan-betäubten Ratten rief eine Serie von rhythmischen Blasenentleerungskontraktionen hervor, deren Charakteristiken beschrieben worden sind (Maggie et al., Brain Res., 380, 83, 1986; Maggi et al., J. Pharmacol., Exp., Ther., 230, 500, 1984). Die Häufigkeit dieser Kontraktionen ist von dem sensorischen afferenten Arm des Miktionsreflexes und von der Integrität des Miktionszentrums abhängig, während ihre Amplitude abhängig ist vom efferenten Arm des Reflexes (Maggi et al., J. Pharmacol. Meth., 15, 157, 1986; Maggi et al., Brain Res., 415, 1, 1987; Maggi et al., Naun. Schmied. Arch. Pharmacol., 332, 276, 1986; Maggi et al., J. Urol., 136, 696, 1986). In diesem Modellsystem bewirken Verbindungen, die hauptsächlich auf das ZNS (beispielsweise Morphium) wirken, eine Reduktion in der Entleerungsfrequenz, während Drogen, die auf dem Level des Detrusormuskels wirken, die Amplitude der Blasenkontraktionen erniedrigen.
Die Resultate sind in den Tabellen 4 und 5 unten zusammengefasst.
Tabelle 4
Wirkungen auf rhythmische Blasenentleerungskontraktionen nach intravenöser Verabreichung
Die Daten stehen für die Durchschnittswerte ± der Standardabweichungen der Anzahl der Kontraktionen, die vor und nach der intravenösen Verabreichung der untersuchten Verbindungen beobachtet wurden, und die Amplitude der aufgenommenen Peaks, in Tieren, die eine Reduktion der Frequenz < 50% aufweisen. Die ED50 (und 95% Zuverlässigkeitsgrenze)-Werte wurden auf Basis eines Quantenkriteriums wie in den Methoden beschrieben bestimmt.

n.c.: nicht berechnet
n.a.: nicht aktiv bezogen auf diesen Parameter

Tabelle 5
Wirkungen auf rhythmische Blasenentleerungskontraktionen nach intravenöser Verabreichung
Die Daten stehen für die Durchschnittswerte ± der Standardabweichung der Dauer der Blasenruhezeit (Zeit bis zum Verschwinden der Kontraktion in min). Die ED_10min-Werte stehen für die extra-polated Dosis, die 10 Minuten Verschwindenszeit der Kontraktionen induziert.
Nach intravenöser Verabreichung inhibierter Verbindung B dosisabhängig die Frequenz des rhythmischen Blasenentleerens und reduzierte ebenso die Amplitude zu einem gewissen Maß. Verbindung A inhibierte nach intravenöser Verabreichung dosisabhängig die Frequenz des rhythmischen Blasenentleerens ohne Effekt auf dessen Amplitude. Die größte Veränderung dieses Parameters war tatsächlich etwa 13% und keine Dosisabhängigkeit wurde beobachtet. Von den hier gezeigten Testverbindungen war Verbindung B die potenteste, mit 46 bis 2650 × höherer Aktivität als NAN-190 bzw. Flavoxat. Verbindung A war 9 bis 530 × aktiver als NAN-190 bzw. Flavoxat.
Im Gegensatz hierzu war Oxybutynin nur wirksam hinsichtlich des Reduzierens der Amplitude der Kontraktionen, was bestätigt, dass seine Wirkung auf der kompletten Inhibition der muscarinergen Rezeptoren in der Blase beruht.
Die Verbindungen, die die Kontraktionsfrequenz reduzierten, induzierten eine vollständige und vorübergehende Verschwinden der Kontraktionen für einen Zeitraum, der direkt proportional war zur verabreichten Dosis (Tabelle 5).
Tabelle 4 und 5 zeigen ebenso die Wirkungen von Flavoxat auf die volumeninduzierten Blasenkontraktionen, einem Arzneimittel, dass weit verbreitet in der klinischen Therapie von Blasendysfunktionen verwendet wird.
Die Verabreichung dieses Arzneimittels resultierte in einer Unterdrückung der Blasenkontraktionen. Die mittlere Verschwindenszeit, die nach Verabreichung der höchsten getesteten Dosierung (10.000 μg/kg i. v.) war 8,25 ± 1,9 min. NAN-190 gab bei der höchsten getesteten Dosierung von 100–300 μg/kg eine maximale Verschwindenszeit von etwa 5,5–6,3 min. (Höhere Dosierungen wurden nicht getestet wegen der hohen Toxizität und der geringen Löslichkeit dieser Verbindung).
Diese Resultate zeigen, dass Verbindung B und Verbindung A sehr potente Verbindungen für die Reduktion der Frequenz der Entleerungskontraktionen sind, wenn man sie Flavoxat und NAN-190 sowohl hinsichtlich der absoluten Potenz (ED₅₀) und der Verschwindenszeit (ED_10min) vergleicht. Ihr Wirkmechanismus scheint unterschiedlich zu dem von Oxybutynin, einem peripheren antimuscarinen zu sein. Außerdem traten ihre Wirkungen bei sehr geringen Dosierungen auf.
Beispiel 7
Wirkung von 5-HT_1A Rezeptorantagonisten auf zystrometrische Parameter bei bewußten Ratten
A. Methoden
Männliche Sprague Dawley Ratten (Crl: CD°BR) mit einem Gewicht von 250–350 g wurden verwendet. Die Tiere wurden mit freiem Zugang zu Futter und Wasser gehaltet und einem erzwungenen 12 Stunden-Licht in Dunkelwechselzyklus bei 22–24°C für mindestens 1 Woche unterzogen, außer während der Durchführung des Experiments.
Um die urodynamischen Parameter bei bewussten Ratten zu quantifizieren, wurden zystometrographische Studien unter Verwendung der Verfahren, wie sie in Pietra et al., IRCS Med. Sci. 14, 992, 1986 beschrieben sind.
Männliche Ratten wurden mit Nembutal (30 mg/kg) und Chlorhydrat (125 mg/kg/i. p.) anästhesiert und in eine Rückenlage überführt. Es wurde ein etwa 10 mm langer mittiger Einschnitt in das rasierte und gesäuberte Abdomen durchgeführt. Die Harnblase wurde vorsichtig von anhaftendem Gewebe befreit, geleert und dann über einen Einschnitt an der Wölbung mit einer Polyethylenkanüle (Portex PP30) versehen, welche dauerhaft mit einem Seidenfaden zugenäht war. Die Kanüle wurde durch einen subkutanen Kanal in die retroscapulare Fläche ausgeführt, wo sie mit einem Plastikadapter verbunden wurde, um das Risiko einer Entfernung durch das Tier zu vermeiden. Zur intravenösen (i. v.) Injektion von Testverbindungen wurde eine PE 50 Polyethylenröhre gefüllt mit physiologischer Kochsalzlösung in die Jugularsehne eingeführt und in der retroscapularen Fläche nach außen geführt.
Da berichtet wurde, dass zystometrographische Parameter durch die Zeit, die seit der Katheterimplantation vergangen ist, beeinflusst werden, Yaksh et al. Amer, J. Physiol. 251, R1177, 1986 wurden die Ratten ausschließlich einen Tag nach Implantation verwendet.
Am Tag des Experiments wurden die Ratten in Bollmann's Käfige überführt; nach einer Stabilisierungsphase von 20 min. wurde das freie Ende des Blasenkatheters mit einer t-förmigen Röhre an einen Druckumwandler (Bentley T800/Marb P 82) und an peristaltische Pumpe (Gilson Minipuls 2) zur kontinuierlichen Infusion angeschlossen, bei einer konstanten Geschwindigkeit von 0,1/min. Kochsalzlösung in die Harnblase. Das intraluminale Drucksignal während der Infusion wurde kontinuierlich mit einem Polygraph (Battaglia Rangoni KO 380 mit ADC1/T Verstärker aufgenommen. Zwei urodynamische Parameter wurden gewertet: Blasenvolumenkapazität (BVC) und Miktionsdruck (MP). BVC (in ml) ist als minimales Volumen definiert, bei dem die Detrusorkontraktion (gefolgt durch Miktion) auftritt. MP (in mmHg) ist als der maximale intravesikale Druck definiert, welcher durch die Kontraktion des Detrusors während der Miktion hervorgerufen wird. Die basalen BVC und MP Werte wurden als Durchschnitt der ersten beiden aufgenommenen Zystometrogramme berechnet. An dieser Stelle wurde die Infusion unterbrochen und die Testverbindungen wurden gegeben. 15 Minuten nach der intravenösen Gabe, oder eine Stunde nach der oralen Arzneimittelverabreichung, wurden zwei zusätzliche Zystometrogramme für jedes Tier aufgenommen und die durchschnittlichen Werte der zwei zystometrographischen Parameter wurden berechnet. Eine typische Aufnahme ist in 2 gezeigt, in der die Wirkungen von 3 mg/kg p. o. von Verbindung A gezeigt sind.
Die statistische Signifikanz der Unterschiede der urodynamischen Parameterwerte wurde durch einen Student's t Test für gepaarte Daten berechnet. Nur Unterschiede mit einer Wahrscheinlichkeit p < 0.01 wurden als signifikant angesehen.
B. Ergebnis
Die Wirkungen von unterschiedlichen Dosierungen der Verbindung A und der Vergleichsverbindungen auf die urodynamischen Parameter bei bewussten Ratten nach i. v.-Gabe sind in den Tabellen 6 und 7 zusammengefasst.
Tabelle 6
Wirkungen auf Zystometrogramm in bewussten Ratten
Die Daten stehen für die durchschnittlichen Werte ± Standardabweichung (ml) der Blasenvolumenkapazität (BVC) vor und 15 Minuten nach der Injektion der Verbindungen.
Tabelle 7
Wirkungen auf Zystometrogramm bei bewussten Ratten
Die Daten stehen für die durchschnittlichen Werte ± Standardabweichung (mmHg) des Miktionsdrucks (MP), vor und 15 Minuten nach i. v.-Injektion der Verbindungen.
Die Gabe von Verbindung A induzierter konstanter und signifikanter Anstiege des BVC. Flavoxat (1000–3000 μg/kg) induzierte ebenso Anstiege in BVC, und die Unterschiede zwischen Basalwert und den Werten nach Behandlung waren statistisch signifikant. (Tabelle 6).
Oxybutynin zeigte keine Wirkung auf BVC (Tabelle 6), induzierte jedoch sehr konsistent, signifikant und dosisabhängig Reduktionen des MP (der ungefähre ED50-Wert war 400 μg/kg), im Gegensatz zu Verbindung A und Flavoxat, die auf diesen Parameter keine Wirkung zeigten (Tabelle 7). NAN-190 zeigte keine signifikanten Wirkungen auf beide Parameter bis hin zu der höchsten möglichen Dosis von 300 μ/kg.
Die Wirkungen dieser Verbindungen nach oraler Verabreichung wurden ebenso untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 8 und 9 unten gezeigt.
Tabelle 8
Wirkungen auf Zystometrogramm bei bewussten Ratten
Die Daten stehen für die durchschnittlichen Werte ± Standardabweichung (ml) der Blasenvolumenkapazität (BVC) vor und 1 Stunde nach der oralen Verabreichung der Verbindungen.
Tabelle 9
Wirkungen auf Zystometrogramm bei bewussten Ratten
Die Daten stehen für die durchschnittlichen Werte ± Standardabweichung (ml) der Blasenvolumenkapazität (MP) vor und 1 Stunde nach der oralen Verabreichung der Verbindungen.
Verbindung A rief einen signifikanten Anstieg des BVCs nach oraler Gabe von 3 mg/kg hervor und Änderungen in MP-Werten wurden nicht detektiert. Oxybutynin bewirkte einen signifikanten Anstieg des BVC nach oraler Gabe bei der geringsten verwendeten Dosierung (1 mg/kg) und rief eine dosisabhängige Reduktion der MP-Werte hervor, die konsistent und signifikant mit 3 und 10 mg/kg Dosierungslevels (etwa ED50-Wert war 4 mg/kg). NAN-190 war nach oraler Gabe inaktiv bei Dosierungen bis zu 30 mg/kg, eine Dosierung die 10 × höher als die minimale wirksame Dosis von Verbindung A ist.
Diese Resultate waren in Übereinstimmung mit denen, die für betäubte Ratten erhalten wurden, wie beschrieben in Beispiel 6 oben. Es wurde gefunden, dass Verbindung A aktiv ist beim Erhöhen des BVC ohne die Blasenkontraktilität (MP) zu beeinflussen, im Gegensatz zu Oxybutynin. Es wurde ebenso gefunden, dass Verbindung A sowohl nach i. v. und oraler Gabe Wirkung zeigte, im Gegensatz zu NAN-190, welches nach i. v. oder oraler Gabe in Dosierungen bis zu 10-fach höher als denen von Verbindung A inaktiv war. Die obigen Ergebnisse zeigen, dass Verbindungen, die über antagonistische Aktivität bei prä- und postsynaptischen 5-HT1A Rezeptoren verfügen, von keiner signifikanten Affinität für α-adrenerge Rezeptoren besitzen, unerwarteter Weise eine große pharmacollogische Aktivität auf den unteren Harnweg besitzen. Insbesondere sind diese Verbindungen fähig, den Miktionsreflex zu inhibieren und den Abstand zwischen der Miktion zu vergrößern, ohne die Fähigkeit des Detrusors zu mindern, effektive Entleerungen hervorzurufen, sobald die Miktionsschwelle erreicht ist. Dies ist deswegen wichtig, da die zur Zeit verwendeten Arzneimittel für die Behandlung der Harninkontinenz (hauptsächlich Anticholinerge) die Effizienz der Miktion verringern, wie es für Oxybutynin in Beispiel 7 gezeigt ist, wo der Miktionsdruck reduziert ist, was einen Anstieg des verbleibenden Volumens bewirkt wegen der Abnahme der kontraktilen Kraft der Blase.

Claims

Verwendung einer Verbindung, welche (a) an einen klonierten menschlichen 5-HT_1A Rezeptor mit einer Affinität von mindestens 10^–7 M bindet, (b) an einen 5-HT_1A Rezeptor aus Ratte mit einer mindestens 50-fach stärkeren Affinität bindet als der Affinität, mit der die Verbindung an einen Ratten α₁-adrenergen Rezeptor bindet, und (c) 5-HT_1A Rezeptor antagonistische Aktivität sowohl hinsichtlich prä-synaptischer 5-HT_1A Rezeptoren aus Maus als auch post-synaptischer 5-HT_1A Rezeptoren aus Ratten aufweist, zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von Erkrankungen des unteren Harnweges bei Säugetieren.
Verwendung nach Anspruch 1 einer Verbindung mit der allgemeinen Formel I
worin R für ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₄)Alkylgruppe steht; R¹ für eine Arylgruppe, eine Stickstoff enthaltende Heteroarylgruppe oder eine bizyklische Heteroarylgruppe steht; X für eine der Gruppen
steht, wobei n 1 oder 2 ist; m 1, 2 oder 3; R² für ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₄)Alkylgruppe steht; R³ für eine Arylgruppe oder eine Aryl-(C₁-C₄)Alkylgruppe steht; R⁴ für ein Wasserstoffatom oder eine C₁-C₃ Alkylgruppe steht; R⁵ für ein Wasserstoffatom oder eine C₁-C₃ Alkyl, C₃-C₁₂ Cycloalkyl oder Cycloalkyl-(C₁-C₄)Alkylgruppe steht, oder R₄ oder R₅ zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, für eine 1-Azetidinyl, 1-pyrrolidinyl, Piperidino, 1-Perhydroazepinyl, Morpholino, oder 1-Piperazinyl-Gruppen stehen, wobei jede gegebenenfalls durch eine (C₁-C₄)Alkyl, Aryl oder Aryl-(C₁-C₄)Alkylgruppe substituiert sein kann; R⁶ für eine monozyklische oder eine bizyklische Heteroarylgruppe steht; R⁷ für ein Wasserstoffatom, ein (C₁-C₄)Alkyl, Cycloalkyl, Cycloalkenyl, Cycloalkyl-(C₁-C₄)Alkyl, Aryl, Aryl-(C₁-C₄)Alkyl, Heteroaryl oder Heteroaryl-(C₁-C₄)Alkylgruppe, oder eine NR⁸R⁹ oder OR¹⁰-Gruppe steht; R⁸ für ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₄)Alkyl, Aryl oder Aryl-(C₁-C₄)Alkylgruppe steht; R⁹ für ein Wasserstoffatom oder eine (C₁-C₄)Alkyl, -CO-(C₁-C₄)Alkyl, Aryl, -CO-Aryl, Aryl-(C₁-C₄)Alkyl, Cycloalkyl oder Cycloalkyl-(C₁-C₄)Alkylgruppe steht; oder R⁸ und R⁹ zusammen mit dem Stickstoffatom, an welches sie gebunden sind, für eine gesättigte heterocyclische Gruppe steht, welche ein zusätzliches Heteroatom enthalten kann; R¹⁰ für eine (C₁-C₄)Alkyl, Cycloalkyl, Cycloalkyl-(C₁-C₄)Alkyl, Aryl, Aryl-(C₁-C₄)Alkyl, Heteroaryl oder Heteroaryl-(C₁-C₄)Alkylgruppe steht; R¹¹ für eine Aryl oder stickstoffenthaltende Heteroarylgruppe steht; R¹² für ein Wasserstoffatom oder ein (C₁-C₄)Alkylgruppe steht; R¹³ für ein Wasserstoffatom oder eine C₁-C₃ Alkyl, C₃-C₁₂ Cycloalkyl oder Cycloalkyl-(C₁-C₄)Alkylgruppe steht; R¹⁴ für eine Arylgruppe steht; Ka für eine C₂-C₄ Alkylengruppe steht, welche gegebenenfalls durch eine oder mehrere (C₁-C₄)Alkylgruppen substituiert sein kann; und Y für eine Carbonyl, Alkylen, Hydroxyalkylen oder Hydroxycycloalkylengruppe oder eine -S(O)o Gruppe steht; wobei o = 0 bis 2 ist.
Verwendung nach Anspruch 1 von 1-[N-cyclohexylcarbonyl-N-(2-pyridyl)-2-aminoethyl)-4-(2-methoxyphenyl)-Piperazin.
Verwendung nach Anspruch 1 von 1-[N-cyclohexylcarbonyl-N-(2-pyridyl)-2-aminoethyl)-4-(4-indolyl)-Piperazin.