DE69728654T2

DE69728654T2 - Verwendung von il-7 zur behandlung von autoimmunkrankheiten, insbesondere insulinabhängigem diabetes mellitus

Info

Publication number: DE69728654T2
Application number: DE69728654T
Authority: DE
Inventors: Jean-François Bach; Jean-Marc Gombert; Andre Herbelin; Michel Morre
Original assignee: Sanofi Synthelabo SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1997-02-26
Publication date: 2005-03-24
Anticipated expiration: 2017-02-27
Also published as: ATE264112T1; FR2745185A1; PT883406E; NO321569B1; NO983917L; JPH11508605A; JP3138481B2; EP0883406A1; DE69728654D1; DK0883406T3; BR9707776A; US6713053B1; EP0883406B1; FR2745185B1; NO983917D0; AU1929397A; WO1997031648A1; ES2217396T3; US20040180037A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Verwendung von Interleukin-7 (IL-7) bei der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, insbesondere des insulinabhängigen Diabetes mellitus.
Der Diabetes Typ 1 oder der insulinabhängige Diabetes mellitus (DMID) wird heutzutage als eine Autoimmunkrankheit angesehen (Endocr. Rev., 15(4) (1994), 516–542), die durch die Anwesenheit von Antikörpern gegen Anti-beta-Zellen gerichtet ist und durch ihre Empfindlichkeit gegenüber einer immunsuppressiven Therapie. Der DMID resultiert sowohl beim Menschen als auch der "nonobese diabetic" (NOD)-Maus in einer Immunantwort vom überwiegend zellulären Typ, wobei die humorale Antwort gekennzeichnet ist durch die Sekretion von Anti-Membran-Antikörpern und Antikörpern gegen sekretorischen Anti-Produkten von beta-Zellen (N. Engl. J. Med., 304 (1981), 1454–1465, N. Engl. J. Med., 327 (1992), 302). Die Immunantwort vom zellulären Typ ist gekennzeichnet durch histologische Läsionen oder "Insulitis", die durch Infiltration von entzündenden und immunreaktiven Zellen vom Makrophagen-Typ, Lymphozyten B und T in das Innere der Langerhansschen Inseln des Pankreas verursacht werden (Diabetologia, 32 (1989), 282–289; Insulitis and Type 1 Diabetes, Academic Press, Tokyo (1986), 35–50).
Die NOD-Maus ist ein spontanes Modell des autoimmunen Diabetes oder des Diabetes Typ 1. Übereinstimmende Argumente lassen darauf schließen, daß das Auftreten der Krankheit unter der Steuerung der immunoregulierenden T-Zellen CD4⁺ erfolgt. Dies wird in der Tat durch die im Alter von 3 Wochen durchgeführte Thymektomie beschleunigt (Eur. J. Immuno, 19 (1989), 889–895) und kann in einem Übertragungssystem vorgebeugt werden durch gemeinsame Injektion von Thymozyten oder Milzzellen CD4⁺ von jungen NOD-Mäusen, die noch nicht diabetisch sind (J. Exp. Med., 169 (1989), 1669–1680).
Es wurde vorgeschlagen und auf indirektem Wege gezeigt, daß die T-Helper 2-Lymphozytenzellen (Th2) aufgrund ihrer Fähigkeit, Interleukin-4 (IL-4) zu bilden, die in Rede stehenden immunoregulierenden T-Zellen CD4⁺ sind (Autoimmunity, 15 (1993), 113–122). Es wurde in der Tat gezeigt, daß die Verabreichung von IL-4 (J. Exp. Med. 178(1) (1993), 87–99) oder von monoklonalen Anti-Interferon-γ-Antikörpern (IFN-γ) der Auslösung des Diabetes vorbeugt und daß die Verabreichung von Interleukin-12 (IL-12), einem Induktor von T-Helper 1-Lymphozyten (Th1), die Auslösung des Diabetes beschleunigt (J. Exp. Med., 181(2) (1995), 817–821).
Andererseits hat eine Untersuchung gezeigt, daß, wenn diabetologische "Th2-like"-Zellen, die in die Inseln integriert worden sind, das Auftreten der Krankheit nicht verursachen, sie andererseits auch keinen signifikanten Schutz ergeben (Science, 268 (5214) (1995), 1185–1188). So wurde vorgeschlagen und in indirekter Weise gezeigt, daß die Auslösung des Diabetes bei der NOD-Maus unter Steuerung der Th2-Zellen erfolgt, wobei keinerlei Erklärung gegeben oder vorgeschlagen wird über den Charakter der bei den NOD-Mäusen vorliegenden Anomalie, des physiologischen Prozesses, der ausgelöst wird und der der Ursprung für das Auftreten einer Anti-Langerhanssche Inseln-Autoimmunität der Ursprung des Diabetes bei diesen Tieren ist. Es wurde weiterhin in jüngster Zeit angenommen, daß die Differenzierung der Th2-Zellen durch einen Untertyp von T-Zellen gesteuert werden kann, der durch den Phenotypus TCR-αβ, CD4^–CD8^– (doppelt negativ, DN) oder CD4⁺CD8^– (einfach positiv) charakterisiert ist, die einen reifen Phenotypus tragen (Nicht-Expression des "Heat Stable Antigen", HSA), und die selektiv Aktivierungsmarker CD44 exprimieren. Diese Unterpopulation, die weiterhin gekennzeichnet ist durch andere Stämme durch den Marker NK1.1, besitzt die Fähigkeit, nach der Stimulierung mit einem polyklonalen Anti-TCR-αβ-Antikörper (TCR-αβ : αβ-Rezeptor der T-Zellen) (J. Immunol., 155 (10) (1995), 4544–4550) eine große Menge von IL-4 zu produzieren.
Andererseits konnte gezeigt werden, daß dieser Untertyp die Besonderheit besitzt, durch Moleküle der Klasse I des Histokompatibilitäts-Hauptkomplexes (CMH) gehemmt zu werden und bevorzugt das Gen Vβ8 des T-Rezeptors zu verwenden (J. Exp. Med. 178 (1993), 901–908), einem Untertyp, dessen Vermehrung in spezifischer Weise durch Interleukin-7 induziert wird (J. Exp. Med., 180(2) (1994), 653–661).
Die Interleukin-7-Proteine von Säugern (Cytokin IL-7s), insbesondere beim Menschen und bei der Maus, die entsprechenden DNAs, die Expressionsvektoren, die für die IL-7s kodieren, die Verfahren zu ihrer Herstellung einschließlich von rekombinanten Systemen, wurden bereits beschrieben ( US 4 965 195 ).
Die Interleukin-7-Proteine von Säugern werden nachfolgend als "IL-7" bezeichnet. IL-7 ist ein lymphopoetischer Wachstumsfaktor, der die Fähigkeit besitzt, die Entwicklung und die Vermehrung von Knochenmarkzellen zu stimulieren (WO 89/03884). Die Stimulierung der Bildung von Blutplättchen (WO 90/09194), durch die Induktion der Vermehrung von Megakariozyten war eine der ersten Anwendungen der Verabreichung von IL-7. Andere Anwendungen von IL-7 wurden ebenfalls beschrieben, wie jene zur Behandlung von Krebs oder von Virusinfektionen durch Immunotherapie ausgehend von modifizierten Zellen, die IL-7 produzieren, entweder durch eine direkte Injektion der modifizierten Zellen in vivo oder durch eine vorausgehende in vitro-Behandlung vor der Injektion (WO 92/01459). Weiterhin wurde die Verwendung von IL-7 für die Vermehrung von anti-HIV-spezifischen menschlichen T-Lymphozyten beschrieben als potentielle AIDS-Therapie (J. of Leucocyte Biology, 58(6) (1995), 623–633), für die Behandlung von bösartigen Melanomen im Bereich der Dermatologie (Hautarzt, 46(10), (1995), 676–682) sowie als Potentiator für einen Impfstoff für die Vorbeugung einer Infektion (mikrobiell und viral) und die Erzeugung eines Tumors (WO 94/22473). Weiterhin wurde die Verwendung von Anti-IL-7-Antikörpern für das Studium und die Untersuchung von physiologischen und pathologischen Prozessen beschrieben, die insbesondere die Differenzierung und die Vermehrung von Lymphozyten betreffen (WO 94/28160). Andere Anwendungen, die den Einsatz von IL-7 zusammen mit anderen Cytokinen umfassen, wurden beschrieben als eine Kombination des IL-4 für die in vitro-Induktion der Differenzierung von Prä-B-Zellen (WO 94/04658) oder mit IL-3 für die Behandlung der Leukopenie (WO 92/04455) und für die Vorbeugung der Knochenmarksstörung nach der Krebstherapie oder der Knochenmarksübertragung (WO 93/03061).
Lynch et al., FASEB Bd. 4, Nr. 7 (1990), S. A2183 beschreiben die Immunotherapie von Tumoren unter Verwendung von mit IL-7 stimulierten T-Lymphozyten.
WO 96/01122 beschreibt die Induktion einer Immunantwort gegen ein Pathogen oder einen Tumor mit Hilfe von ex vivo mit IL-7 stimulierten T-Lymphozyten (Seite 2, Zeilen 16–31) und die Behandlung von Autoimmunkrankheiten mit Lymphozyten, die nicht reaktiv gehalten worden sind, indem man sie ex vivo mit einem Antigenund einem Anti-IL-7-Antikörper behandelt, der das normalerweise durch IL-7 in der Kette des Cytokin-Rezeptors induzierte Zellsignal inhibiert (Seite 2, Zeile 32 – Seite 3, Zeile 6).
Die Autoren der vorliegenden Erfindung haben nunmehr auf der Grundlage einer phenotypischen Untersuchung durch Flußzytometrie unter Verwendung der Marker HSA, CD4, CD8, CD44 und Vβ8 gezeigt, daß eine Unterpopulation von Thymozyten des Phenotyps CD44⁺TCR-αβ HSA^– und unter bevorzugter Verwendung des Gens Vβ8 des Rezeptors T numerisch reduziert wird bei der NOD-Maus mit einem Alter von 3 Wochen (gleichzeitig für die Population CD4^–CD8^–DN (doppelt negativ CD4^–CD8^–) und CD4⁺ (einfach positiv)) und mit einem Alter von 8 Wochen (für die Population DN). Es wurde weiterhin gefunden, daß diese Unterpopulation mit beidem Alter wenig oder kein IL-4 produziert. Schließlich haben die Autoren der vorliegenden Erfindung gezeigt, daß diese doppelte numerische und funktionelle Anomalie in vitro und in vivo durch IL-7 korrigiert wird, wobei der Wachstumsfaktor dieser Zell-Unterpopulation ebenso wie IL-7 dazu in der Lage ist, Säuger gegen Diabetes, insbesondere den insulinabhängigen Diabetes mellitus, zu schützen, wobei diese Eigenschaft sich auch auf sämtliche Autoimmunerkrankungen erstrecken kann, die durch einen Mangel der Produktion von IL-4 durch Th2-Zellen verursacht werden, und insbesondere die oben beschriebene Unterpopulation und ganz allgemein auf sämtliche Autoimmunerkrankungen, insbesondere jene, die durch einen Mangel der Immunoregulierung durch die CD4⁺-Zellen verursacht werden.
Demzufolge betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform die Verwendung von IL-7 oder von T-Lymphozyten, die zuvor in Gegenwart von IL-7 inkubiert worden sind oder so modifiziert worden sind, daß sie IL-7 produzieren, für die Herstellung von Arzneimitteln oder pharmazeutischen Zubereitungen für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten und insbesondere Autoimmunkrankheiten, die durch einen Fehler der Immunoregulierung durch die T-Zellen CD4⁺ verursacht sind.
Diese Autoimmunkrankheiten sind bevorzugt die Autoimmunkrankheiten, die durch einen Fehler der Bildung von IL-4 durch die Th2-Zellen verursacht sind.
Besonders bevorzugte Autoimmunkrankheiten sind die Autoimmunkrankheiten, die durch einen Fehler der Bildung von IL-4 verursacht sind, der mit einem quantitativen und funktionellen Defizit von T-Zellen des Untertyps HSA^–, CD4^–CD8^– oder CD4⁺CD8^–, CD44⁺, TCR-αβ⁺, Vβ8⁺, NK1.1⁺ verknüpft ist.
Als Autoimmunkrankheiten können neben dem insulinabhängigen Diabetes mellitus die autoimmune Enzephalomyelitis, die autoimmune rheumatoide Arthritis, Polyarthrits, autoimmune Hepatits Typ 2, autoimmune Gastritis, autoimmune Sklerose, Sialadenitis, Adrenalitis, Oophoritis, Glomerulonephritis, autoimmune Thyroiditis bevorzugt mit den genannten Arzneimitteln oder Zubereitungen behandelt werden, ebenso wie jeder pathogene Mechanismus vom Autoimmun-Typ bei einer mit der Behandlung von AIDS verknüpften Therapie.
Vorzugsweise handelt es sich bei der Autoimmunkrankheit um den insulinabhängigen Diabetes mellitus.
Mit Vorteil sind die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten, in Gegenwart von IL-7-inkubierten T-Lymphozyten autologe Zellen oder syngene Zellen von Patienten, für die die sie enthaltenden Zubereitungen bestimmt sind.
Die Erfindung betrifft weiterhin pharmazeutische Zubereitungen, die für einen neuen Weg zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten bestimmt sind, die durch einen Mangel der Immunoregulierung durch die T-Zellen CD4⁺ verursacht sind.
Die Erfindung umfaßt insbesondere pharmazeutische Zubereitungen, die einen neuen Weg zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten ermöglichen, die durch einen Fehler der Produktion von IL-4 durch die Th2-Zellen verursacht sind, insbesondere Autoimmunerkrankungen, die durch einen Fehler oder Mangel der Produktion von IL-4 verursacht werden, der durch einen quantitativen und funktionellen Mangel des Untertyps von T-Zellen des Phenotyps HSA^–, CD4^–CD8^– oder CD4⁺CD8^–, CD44⁺, TCT-αβ⁺, Vβ8⁺, NK1.1⁺ verursacht sind, wie insbesondere der insulinabhängige Diabetes mellitus.
Solche Zubereitungen enthalten als Wirkstoff IL-7, vorzugsweise in löslicher Form und/oder autologe oder syngene T-Lymphozyten von Zellen des Patienten, für den die pharmazeutische Zubereitung bestimmt ist, wobei die genannten T-Lymphozyten zuvor in Gegenwart von IL-7 inkubiert worden sind. Sie können auch in Form einer Kombination mit anderen Wirkstoffen vorliegen, beispielsweise anderen immunomodulierenden Mitteln.
Diese verschiedenen Zubereitungen können in verschiedenartigen Verabreichungsformen verabreicht werden, die der Fachmann in Abhängigkeit von der Art der betreffenden Zubereitung bestimmen kann.
Die IL-7 als Wirkstoff enthaltenden Zubereitungen können beispielsweise auf systemischem Wege, vorzugsweise intravenösem Wege, intramuskulärem Wege, intradermalem Wege oder auf oralem Wege verabreicht werden.
Die Zubereitungen, welche T-Lymphozyten als Wirkstoff enthalten, werden vorzugsweise auf intravenösem oder intraperitonealem Wege gegeben.
Die bevorzugten Verabreichungsformen sowie die optimalen Dosierungen und galenischen Formen können unter Anwendung allgemeiner Kriterien bestimmt werden unter Berücksichtigung einer auf den Patienten angepaßten therapeutischen Behandlung, beispielsweise dem Alter oder des Körpergewicht des Patienten, der Schwere der Erkrankung, der Verträglichkeit der Behandlung und beobachteten Nebenwirkungen.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zubereitung für die Behandlung von Autoimmunkrankheiten, insbesondere Autoimmunkrankheiten, die durch einen Fehler in der Immunoregulierung durch die T-Zellen CD4⁺ verursacht werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man IL-7 und/oder autologe T-Lymphozyten oder syngene Zellen des Patienten, für den die Zubereitung bestimmt ist, wobei die T-Lymphozyten zuvor in Gegenwart von IL-7 inkubiert wor den sind, mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial oder Verdünnungsmittel, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Wirkstoffen, vermischt.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, die durch einen Fehler der Produktion von IL-4 durch die Th2-Zellen verursacht sind, insbesondere Autoimmunkrankheiten, die verursacht sind durch einen Fehler der Produktion von IL-4, der mit einem quantitativen und funktionellen Defizit des Untertyps von T-Zellen des Phenotyps HSA^–, CD4^–CD8^– oder CD4⁺CD8^–, CD44⁺, TCR-αβ⁺, Vβ8⁺, NK1.1⁺ verknüpft sind, wie insbesondere den insulinabhängigen Diabetes mellitus.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur therapeutischen Behandlung, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine therapeutisch wirksame Dosis von Interleukin-7 oder von T-Lymphozyten, die zuvor in Gegenwart von IL-7 inkubiert worden sind, einem Patienten verabreicht, der an einer Autoimmunkrankheit erkrankt ist, insbesondere einer Autoimmunkrankheit, die durch einen Fehler in der Immunoregulierung durch die T-Zellen CD4⁺ verursacht ist.
Mit Vorteil wird das erfindungsgemäße Verfahren auf die Behandlung von insulinabhängigem Diabetes mellitus angewandt.
Die vorliegende Erfindung wird durch die beigefügten 1 und 2 verdeutlicht.
Die 1 zeigt die in vitro-Korrekturwirkung von IL-7 auf die Produktion von IL-4 durch ausgereifte Thymozytenzellen HSA^–CD8^– bei der jungen (1) und der erwachsenen (1b) Maus NOD und C57BL/6.
Bei der vorgestellten Untersuchung züchtet man die frisch aus den jungen (mit einem Alter von 3 Wochen) oder den ausgewachsenen (mit einem Alter von 8 Wochen) Mäusen NOD oder C57BL/6 gewonnenen Thymozyten HSA^–CD8^– in einer Menge von 1,0 × 10⁵ Zellen/Näpfchen mit einem monoklonalen Anti-TCR-αβ-Antikörper in Gegenwart (schraffierte Balken) oder in Abwesenheit (nicht ausgefüllte Balken) von IL-7 in einer Menge von 1000 Einheiten/ml. Man gewinnt die überstehende Flüssigkeit nach einer Inkubationszeit von 48 Stunden und bestimmt die IL-4 durch ELISA (Mittelwert von 3 bis 4 unabhängigen Untersuchungen).
Weitere Kennzeichen und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der folgenden Beschreibung unter Bezugnahme auf die Beispiele und die Zeichnungen, in denen die experimentellen Ergebnisse zusammengefaßt sind.
Die 2 verdeutlicht die Wirkung der Behandlung der Mäuse mit IL-7 auf die Primärproduktion von IL-4 durch die Milzzellen.
Bei der dargestellten Untersuchung verabreicht man Mäusen unterschiedlicher Herkunft mit einem Alter von 8 bis 12 Wochen durch tägliche subkutane Injektion 2 μg IL-7 oder von Rinderserumalbumin (Trägermaterial) während 7 aufeinanderfolgenden Tagen. Am achten Tag behandelt man die Mäuse mit den Anti-CD3-Antikörpern, dann den gezüchteten Milzzellen (5·10⁶ Zellen pro Näpfchen) und mißt die bildung von IL-4 durch den Test CT.4S. Der Prozentsatz der Erhöhung der Produktion von IL-4 wird wie folgt berechnet: ((Menge des nach der Behandlung mit IL-7 produzierten IL-4)/(Menge des nach der Behandlung mit dem Trägermaterial gebildeten IL-4) – 1) × 100. Die Ergebnisse entsprechen einer typischen Erfahrung. Die Produktion von IL-4 (Einheiten/ml) durch die Milzzellen von Mäusen, die mit dem Trägermaterial behandelt worden sind, beträgt 94,3; 53,5; 11,0 bzw. 11,4 bei den Mäusen BALB/c, C57BL/6, NOD bzw. C57BL/6β2m⁺.
BEISPIEL 1
Untersuchung der Ontogenese von Thymozyten CD44⁺ TCR-αβ^– bei der NOD-Maus im Vergleich zu der nicht-diabetischen Maus C57BL/6
Man hält weibliche Zuchtmäuse und Mäuse C57BL/6 unter spezifischen nicht-pathogenen Umgebungsbedingungen. Sämtliche NOD-Mäuse werden dahingehend überprüft, daß sie keinerlei evidentes Anzeichen eines Diabetes aufweisen (keine Glykosurie oder Hyperglykämie). Man entnimmt vorsichtig die Thymusdrüsen von etwa 5 bis 15 ausgebluteten Mäusen und vermischt sie. Anschließend reichert man die doppelt negativen (ON) und CD4⁺ einfach negativen ausgewachsenen Thymozyten durch Inkubation bei 37°C während 40 Minuten mit den Anti-CD8-Antikörpern (3–15; IgM von Ratten beschrieben in J. Immunol., 125 (1980), 2665–2672), Anti-HSA-Antikörpern (J11D; IgM von Ratten, Pharmigen) und Anti-Komplement-Antikörpern (Kaninchenkomplement Low Tox, Cederlane, Ontario, Kanada) an. Anschließend entfernt man die toten Zellen durch Zentrifugation mit einem Dichtegradienten (J. Prep., Techgen, Les Ulis, Frankreich). Eine Flußzytometrie der spezifischen Antikörper, die verschieden von den für die Zelllyse verwendeten sind, zeigt, daß mehr als 95% der wiedergewonnenen Zellen vom Phenotyp HSA^–CD8^– sind.
Die Markierung erfolgt in der in J. Exp. Med., 180 (1994), 653–661 beschriebenen Weise. Die verwendeten Antikörper werden durch handelsübliche Hybridome gebildet. Die Anti-TCR-αβ-Antikörper (Klon H57-597, Pharmigen) oder Anti-Vβ8-Antikörper (Klon F23.1, beschrieben in J. Immunol., 143, 3994–4000), die Biotinyl-behandelt oder mit Fluoreszein markiert worden sind (FITC), werden in Kombination mit den Phytoerytrin (PE)-markierten Anti-CD4-Antikörpern (Klon RM 4.5, Pharmigen) und/oder mit den mit FITC markierten Anti-CD44-Antikör pern (Klon IM 7.8, Pharmigen) verwendet.
Für die Markierung mit 3 Farben inkubiert man die Zellen nach der Inkubation in Gegenwart von mit Biotinyl behandelten Antikörpern, die mit den geeigneten, mit FITC und PE markierten und mit Streptavidin-Tricolor (SDav-Tri, Caltag) konjugierten monoklonalen Antikörpern.
Die Kontrolle der nichtspezifischen Kontrollmarkierung erfolgt parallel. Die verwendete Vorrichtung ist ein Flußzytometer FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, CA). Die minimale Probengröße beträgt etwa 1 × 10⁴ lebensfähige Zellen.
Die Bestimmung der Zytokinproduktion erfolgt ausgehend von den Zellen in Kultur auf dem Medium, wie es in J. of Immunol., 155(10), (1995), 4544–4550 und J. Exp. Med., 180 (1994), 653–661 beschrieben worden ist. Man bringt etwa 10⁵ Zellen pro Näpfchen in die Vertiefungen mit rundem Boden in Mikroplatten mit 96 Näpfchen auf (Nunc, Roskilde, Dänemark), wobei jede Untersuchung dreimal wiederholt wird. Die Näpfchen werden mit 10 μg/ml Anti-TCR-αβ-antikörpern (Klon H57-597) bedeckt und die Zellen werden während 48 Stunden in Gegenwart oder in Abwesenheit von IL-7 bei 1000 Einheiten/ml (Sanofi, Toulouse, Frankreich) mit einem Endvolumen von 200 μl des Näpfchens inkubiert, wonach die überstehende Flüssigkeit gewonnen und vor der IL-4-Bestimmung bei –70°C gelagert wird.
Die IL-4-Bestimmung erfolgt durch die ELISA-Methode des Sandwich-Typs, wie es in J. of Immunol., 155(10), (1995), 4544–4550 beschrieben ist.
Die erhaltenen und in der nachfolgenden Tabelle 1 verdeutlichen Ergebnisse zeigen, daß das Auftreten der unter den T-Zellen HSA^–CD8^– quantitativ bestimmten Unterpopulation von Thymozyten des Phenotyps TCR-αβ⁺ CD44⁺ bei der NOD-Maus verzögert ist im Vergleich zu der Maus C57BL/6 bei einer sehr signifikanten Verringerung, die man im Alter von 3 Wochen beobachtet.
TABELLE 1
Die nachfolgende Tabelle 2 verdeutlicht die Ergebnisse, die man an doppelt negativen (CD4^–CD8^–) und CD4⁺ Thymozytenzellen an den Mäusen NOD und C57BL/6 mit einem Alter von 8 bis 10 Wochen erhalten hat. Das Niveau der Unterpopulation CD44⁺ TCR-αβ⁺ bei der NOD-Maus ist bei 8 Wochen weiter vermindert im Vergleich zu der an der Autoimmunkrankheit erkrankten Maus.
TABELLE 2
Es hat sich weiterhin gezeigt, daß die durch den Phenotypus HSA^–CD8^–CD44⁺ gekennzeichneten Thymozytenzellen die oben erwähnte Restriktion des Gens Vβ8 aufweisen.
In gleicher Weise konnte gezeigt werden (siehe 1), daß die Thymozytenzellen HSA^–CD8^–CD44⁺ bei der Kontrollmaus eine erhebliche Menge von IL-4 produzieren, wenn sie mit einem monoklonalen Anti-TCR-αβ-Antikörper stimuliert werden, während bei der NOD-Maus diese Produktion nach 3 und 8 Wochen in dramatischer Weise abfällt, selbst wenn man die verwendete Anzahl der Zellen HSA^–CD8^–CD44⁺ berücksichtigt (Tabelle 1).
BEISPIEL 2
in vitro-Korrektur des funktionellen Mangels der Unterpopulation von Thymozyten bei der NOD-Maus durch IL-7
Da bereits gezeigt wurde, daß IL-7 in spezifischer Weise die Vermehrung der Unterpopulation der Thymozyten HSA^–CD8^–CD44⁺DN (J. Exp. Med., 180 (1994), 653–661) induziert, zeigen die in der 1 zusammengefaßten Ergebnisse insbesondere, daß die Produktion von IL-4, die man an den Thymozyten nach der 48 stündigen Inkubation in Gegenwart von IL-7 und eines Anti-TCRαβ-Antikörpers bestimmt hat, bei der ausgewachsenen NOD-Maus (mit einem Alter von 8 Wochen) normal wird im Vergleich zu der Maus C57BL/6 mit einem entsprechenden Alter.
BEISPIEL 3
in vivo-Untersuchungen, die die Schutzwirkung von IL-7 auf das Wiederauftreten des Diabetes bei der NOD-Maus verdeutlichen
Die nachfolgend beschriebenen beiden Untersuchungen zeigen, daß die Lymphzellen, die aus der Thymusdrüse von NOD-Mäusen mit einem Alter von 3 Wochen stammen, gegen das Wiederauftreten des Diabetes in einem Co-Transfermodell schützen können. Genauer verhindert die Injektion von 50 Millionen vollständigen Thymuszellen von Mäusen mit einem Alter von 3 Wochen, die zusammen mit 5 bis 10 Millionen Milzzellen von diabetischen NOD-Mäusen an bestrahlte NOD-Tiere mit einem Alter von 10 Wochen das Wiederauftreten des Diabetes, den man normalerweise beobachtet, wenn die Milzzellen allein injiziert werden. Die Injektion von weniger als 10 Millionen Thymuszellen verursacht diese Schutzwirkung nicht. Wenn andererseits die Thymozyten zuvor in vitro in Gegenwart von IL-7 während 60 Stunden bei 37°C inkubiert worden sind, stellt eine Million Thymuszellen bei diesem oben beschriebenen Co-Transfermodell den Schutz sicher.
Andererseits ist es bekannt, daß eine Injektion von Cyclophosphamid (200 mg/kg) das Auftreten eines Diabetes bei männlichen NOD-Mäusen mit einem Alter von 8 Wochen mit einer sehr geringen Verzögerung (10 bis 20 Tage) gegenüber dem spontanen Auftreten des Diabetes (2 bis 4 Monaten) verursacht. Eine in vivo-Behandlung mit IL-7, die aus 2 Injektionen von IL-7 am Vortag und am Tag nach der Injektion von Cyclophosphamid, gegen das Wiederauftreten des durch Cyclophosphamid induzierte Diabetes schützt.
Diese beiden Untersuchungsreihen zeigen, daß IL-7 eine Schutzwirkung gegen das Wiederauftreten eines Diabetes bei genetisch prädisponierten Mäusen bewirkt.
3.1 Schutz gegen Diabetes durch Thymozyten, die in Gegenwart von Interleukin-7 inkubiert worden sind, in einem Co-Transfermodell
Man bereitet die Thymozyten oder Thymuszellen ausgehend von einem Thymus von weiblichen NOD-Mäusen mit einem Alter von 3 Wochen. Die Thymuszellen werden in vitro während 60 bis 72 Stunden bei 37°C in einem RPMI-Medium inkubiert, welches 10% Kalbsfötenserum enthält und mit IL-7 (500–1000 Einheiten/ml) versetzt worden ist. Am Ende dieser Inkubation injiziert man gleichzeitig 4, 2 oder 1 Million dieser Thymozyten und 5 oder 10 Million Milzzellen von NOD-Mäusen, die vor kurzer Zeit diabetisch geworden sind, an männliche NOD-Mäuse mit einem Alter von 10 Wochen, die mit einer Dosis von 700 rad bestrahlt worden sind. Das Wiederauftreten eines Diabetes wird dreimal pro Woche überwacht durch Überprüfung einer Glykosurie und wird bestätigt, wenn die Glykosurie beobachtet worden ist, durch den Nachweis einer Hyperglykämie.
Die in der nachfolgenden Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die in Gegenwart von IL-7 inkubierten Thymuszellen gegen den Diabetes in Dosierungen schützen, die dann keine Schutzwirkung ausüben, wenn nicht in Gegenwart von IL-7 inkubierte Thymuszellen verwendet werden.
TABELLE 3
3.2 Schutz gegen den durch eine Injektion von Cyclophosphamid induzierten Diabetes durch Injektionen von Interleukin-7
Man injiziert weiblichen NOD-Mäusen mit einem Alter von 6 bis 7 Wochen 200 mg/kg Cyclophosphamid und verabreicht an den Tagen –1 und +1 eine intravenöse Injektion von 1 μg IL-7. Man überprüft das Wiederauftreten eines Diabetes durch Untersuchung einer Glykosurie und einer Hyperglykämie gemäß der in Beispiel 1 angegebenen Methode.
Die in der Tabelle 4 angegebenen Ergebnisse zeigen, daß die Behandlung mit IL-7 in signifikanter Weise das Wiederauftreten des Diabetes verhindert im Vergleich zu Mäusen, die Cyclophosphamid ohne IL-7 erhalten haben.
TABELLE 4
Die Gesamtheit dieser Ergebnisse zeigt, daß die NOD-Mäuse einen frü hen Mangel einer Unterpopulation aufweisen von Thymozytenzellen HSA^–CD8TCR-αβ⁺, die den Marker CD44 exprimiert mit der Vβ8-Einschränkung und der Fähigkeit, IL-4 zu produzieren (als Zellen T NK1⁺ bezeichnet, die kürzlich in nicht-autoimmunen Stämmen identifiziert wurden). Ein numerischer Mangel ist in überraschender Weise mit einem funktionellen Mangel verknüpft, der durch eine erhebliche Verringerung der Produktion von IL-4 einhergeht.
Die Ergebnisse zeigen, daß die Anomalie dieses Mangels bei NOD-Mäusen, welche zugleich die Unterpopulation von Thymozyten CD4^–CD8^– (ON) und CD4⁺ (einfach positiv) betreffen, in vitro durch die Verwendung von IL-7 korrigiert wird.
Andererseits zeigen die in vivo durchgeführten Untersuchungen, und sei es durch Injektion von zuvor in Gegenwart von IL-7 inkubierten Zellen oder durch direkte Injektion einer wirksamen Menge von IL-7 an die Maus, daß die Verwendung von IL-7 eine Schutzwirkung gegen das Auslösen einer Autoimmunkrankheit, wie insbesondere den Diabetes, ausüben.
BEISPIEL 4
in vivo-Behandlung mit IL-7
Die in vivo-Behandlung mit IL-7 steigert die Produktion von IL-4 durch die Milz-T-Zellen (2). Diese Wirkung von IL-7 erreicht man bei der Gesamtheit der untersuchten Mäusestämme (C57BL/6, BALB/c, NOD), wobei der Effekt maximal ist bei der autoimmunen NOD-Maus, die einen Mangel der Produktion von IL-4 in der Peripherie aufweist (Legende der 2). Die Abwesenheit der Steigerung der Produktion von IL-4 bei den von dem Gen für β2-Mikroglobulin freien Mäusen C57BL/6 und die damit einen Mangel an den Zellen T NK1⁺ aufweisen, läßt darauf schließen, daß die Wirkung von IL-7 auf die Zellen T NK1⁺ als Ziel gerichtet ist.
Das Injektionsschema von IL-7 auf subkutanem Wege umfaßt zwei Dosierungen von 2 μg pro Tag während einer Zeitdauer von 4 bis 7 aufeinanderfolgenden Tagen. Man behandelt die Kontrollmäuse mit einem identischen Volumen der Trägerlösung (Rinderserumalbumin). Man bestimmt die Produktion von IL-4 nach einer einzigen intravenösen Injektion (1,33 μg) eines Antikörpers, der spezifisch gegen das Mäusemolekül CD3 gerichtet ist (Anti-CD3, Klon 145-2C11, IgG vom Hamster). Man tötet die Tiere 90 Minuten nach der Injektion der Anti-CD3-Antikörper. Man entnimmt die Milz sofort und bringt die Milzzellen während 90 Minuten in Abwesenheit jeglicher Reizung in eine Kultur ein (Yoshimoto et al., J. Exp. Med., 179, 1285–1295). Das RPMI-Medium, welches unvollständiges Kalbsfötenserum (10%), β-Mercaptoethanol (0,05 mM) und Antibiotika (Penicillin 100 IE/ml und Streptomycin 100 mg/ml) enthält, wird für die Gesamtheit der Zell kulturuntersuchungen verwendet. Die überstehenden Flüssigkeiten werden entnommen und ihr Gehalt an IL-4 mit Hilfe des biologischen Tests CT.4S bestimmt, das heißt, eine IL-4-abhängige Zellinie (Hu-Li et al., J. Immunol., 142, 800–807). Die Konzentration an IL-4 ist in Einheiten/ml angegeben (wobei eine Einheit etwa 1 pG entspricht) unter Anwendung einer Standardkurve, die mit Reihenverdünnungen von rekombinantem Mäuse-IL-4 ermittelt wurde. Die Empfindlichkeitsgrenze des Tests beträgt etwa 10 Einheiten/ml.
Die Abwesenheit der Produktion von IL-4 in der Peripherie durch die Zellen T NK1⁺ bei der NOD-Maus könnte den Mangel oder den Fehler der Th2-Funktion erklären, der das Auftreten von diabetogenen Zellen des Typs Th1 begleitet, die für die Autoimmunkrankheit bei diesem Stamm verantwortlich sind.
Diese Ergebnisse, welche den Hauptnachweis einer pharmakologischen in vivo-Wirkung von IL-7 auf die Produktion von IL-4 durch die Zellen T NK1⁺ verdeutlichen, eröffnen Perspektiven auf die Schutzwirkung von IL-7 gegenüber dem Auftreten eines autoimmunen Diabetes. Allgemeiner ermöglichen diese experimentellen Ergebnisse den Vorschlag der Verwendung von IL-7 als therapeutisches Mittel zur Beeinflussung der Immunantwort zur Begünstigung eines Profils des Typs Th2.

Claims

Verwendung von Interleukin-7 oder von T-Lymphozyten, die zuvor in Gegenwart von IL-7 inkubiert worden sind, für die Herstellung eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung einer Autoimmunkrankheit.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Autoimmunkrankheit durch einen Fehler der Bildung von IL-4 durch die Th2-Zellen verursacht ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Autoimmunkrankheit durch einen Fehler der Bildung von IL-4 verursacht ist, die mit einem quantitativen und funktionellen Defizit von T-Zellen des Untertyps HSA^–, CD4^–CD8^– oder CD4⁺CD8^–, CD44⁺, TCR^–αβ⁺, Vβ8⁺, NK1.1⁺ verknüpft ist.
Verwendung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei die Autoimmunkrankheit ausgewählt ist aus insulinabhängigem Diabetes mellitus, autoimmuner Encephalomyelitis, autoimmuner rheumatoider Arthritis, Polyarthritis, Autoimmun-Hepatitis Typ 2, autoimmuner Gastritis, autoimmuner Sklerose, Sialadenitis, Adrenalitis, Oophoritis, Glomerulonephritis, autoimmuner Thyroiditis und pathogenen Mechanismen vom Autoimmun-Typ bei einer mit der Behandlung von AIDS verknüpften Therapie.
Verwendung nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, wobei die Autoimmunkrankheit insulinabhängiger Diabetes mellitus ist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die T-Lymphozyten autologe oder syngene Zellen von Zellen des Patienten sind, für den die pharmazeutische Zubereitung bestimmt ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten, umfassend das Vermischen von autologen oder syngenen T-Lymphozyten von Zellen des Patienten, für den die Zubereitung bestimmt ist, wobei die T-Lymphozyten zuvor in Gegenwart von IL-7 inkubiert worden sind, mit einem pharmazeutisch annehmbaren Trägermaterial oder Verdünnungsmittel, gegebenenfalls in Kombination mit anderen Wirkstoffen.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Be handlung einer Autoimmunkrankheit nach Anspruch 7, welche Autoimmunkrankheit durch einen Fehler der Bildung von IL-4 durch die Th2-Zellen verursacht ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung einer Autoimmunkrankheit nach Anspruch 7 oder 8, wobei die Autoimmunkrankheit durch einen Fehler der Produktion von IL-4 verursacht ist, die mit einem quantitativen und funktionellen Defizit von T-Zellen des Untertyps HSA^–, CD4^–CD8^– oder CD4⁺CD8^–, CD44⁺, TCR^–αβ⁺, Vβ8⁺, NK1.1⁺ verknüpft ist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung einer Autoimmunkrankheit nach Anspruch 7, 8 oder 9, wobei die Autoimmunkrankheit insulinabhängiger Diabetes mellitus ist.