DE69729380T2

DE69729380T2 - Bioaktivierte diagnostische bilderzeugungskontrastmittel

Info

Publication number: DE69729380T2
Application number: DE69729380T
Authority: DE
Inventors: B. Randall LAUFFER; J. Thomas McMURRY; O. Stephen DUNHAM; M. Daniel SCOTT; J. David PARMELEE; Stephane Dumas
Original assignee: Epix Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Epix Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-04-01
Filing date: 1997-03-25
Publication date: 2005-07-14
Anticipated expiration: 2017-03-26
Also published as: IS4833A; US20020034476A1; IL125895A; DK0907379T3; JP2000507577A; PT907379E; BR9708470A; US20060275216A1; CN1215341A; US6709646B2; NO984543D0; CA2247620A1; HK1016877A1; DE69729380D1; AU726914B2; AU2544897A; US7147837B2; NO319674B1; NO984543L; IL125895A0

Description

FACHGEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft verbesserte diagnostische Mittel zur Magnetresonanzbilderzeugung (MRI) und optischen Bilderzeugung. Diese Mittel erlauben den empfindlichen Nachweis einer spezifischen Bioaktivität innerhalb eines Gewebes. Diese Erfindung betrifft auch Arzneimittel, die diese Mittel umfassen, und Verfahren zur Verwendung der Mittel und Zusammensetzungen, welche die Mittel umfassen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Diagnostische Bilderzeugungsverfahren, wie MRI, Röntgen-Bilderzeugung, nukleare radiopharmazeutische Bilderzeugung, Bilderzeugung durch Ultraviolett-/sichtbares/Infrarot-Licht, und Ultraschall-Bilderzeugung, sind bei der medizinischen Diagnose etliche Jahre verwendet worden.
Häufig verwendete Kontrastmaterialien schließen organische Moleküle, Metallionen, Salze oder Chelate, Teilchen (insbesondere Eisenteilchen) oder markierte Peptide, Proteine, Polymere oder Liposomen ein. Nach Verabreichung können diese Mittel unspezifisch überall in den Körperkompartimenten diffundieren, bevor sie metabolisiert und/oder ausgeschieden werden; diese Mittel sind allgemein als unspezifische Mittel bekannt. In einer anderen Ausführungsform können diese Mittel Affinität zu einem/r besonderen Körperkompartiment, Zelle/Organ oder Gewebekomponente aufweisen; diese Mittel können als zielorientierte Kontrastmittel bezeichnet werden.
Durch Kontrastmittel verbesserte diagnostische Bilderzeugungsverfahren erhöhen wünschenswerterweise den Kontrast zwischen normalem und pathologischem Gewebe in einer solchen Weise, dass zwei grundsätzliche Klassen von Information bereitgestellt werden:

1) Nachweisdaten: Dies schließt Daten ein, die notwendig sind, um zu bestimmen, ob eine Abnormität in dem bildlich dargestellten Gewebe vorliegt, und in welchem Maße sie vorliegt. Die Fähigkeit, diese Klasse von Information bereitzustellen, betrifft die "Empfindlichkeit" des Bilderzeugungsverfahrens.
2) Differentialdiagnosedaten: Dies schließt Daten ein, die notwendig sind, um mit Genauigkeit den Typ der vorliegenden Abnormität zu identifizieren. Die Fähigkeit, diese Klasse von Information bereitzustellen, betrifft die "Spezifität" des Bilderzeugungsverfahrens. Spezifität ist notwendig, um eine genaue Prognose des Zustands des Patienten und einen Therapieplan zu erstellen. Obgleich zum Beispiel gegenwärtige Verfahren einen Tumor nachweisen können, sind sie im Allgemeinen unzureichend, um zu bestimmen, ob der Tumor gutartig oder bösartig ist, ob der Tumor wahrscheinlich metastasieren wird oder ob der Tumor auf die Therapie anspricht. Solche Bestimmungen erfordern einige Kenntnis über den spezifischen biochemischen Zustand des Gewebes.

Etliche Ansätze sind vorgestellt worden, um zielorientierte Kontrastmittel herzustellen. US-Patent Nr. 4,880,008, beschreibt MRI-Kontrastmittel, die ein höheres Signal oder höhere Relaxivität zeigen, wenn sie nicht-kovalent an Serumproteine, wie menschliches Serumalbumin, binden. Für diese Klasse von Mitteln hängt die Relaxivität mit dem Prozent Kontrastmittel, das an Protein gebunden ist, zusammen und ist typischerweise fünf- bis zehnmal höher als die, die für Mittel beobachtet wird, die keine Proteine binden. In der ebenfalls anhängigen US-Anmeldung Ser.-Nr. 08/382,317 (am 1. Februar 1995 eingereicht), veröffentlicht als WO 96/23526, werden dem Protein-bindenden Kontrastmittel Blut-Halbwertszeit-Verlängerungs-Einheiten ("BHEMs") angehängt. Die erhaltenen Mittel zeigen relativ zu Mitteln, denen die BHEM fehlt, für einen längeren Zeitraum im Blut ein verbessertes oder verändertes Signal, was diese Materialien für Gefäß-Bilderzeugung besonders nützlich macht.
US-Patent Nr. 4,899,755 beschreibt MRI-Kontrastmittel, die bevorzugt in normale Hepatozyten aufgenommen werden, was zu einer Kontrastverstärkung zwischen normalem und abnormem Lebergewebe führt.
Ein weiterer Ansatz zur Zielorientierung basiert auf einer Konjugation der Kontrastmittel mit Proteinen, Antikörpern oder anderen Biomolekülen, von denen bekannt ist, dass sie mit Zelloberflächenrezeptoren, intrazellulären Rezeptoren, Transportern oder anderen biochemischen Bestandteilen wechselwirken. Siehe z. B. US-Patent Nr. 5,171,563. Jedoch umfasst eine solche Zielorientierung üblicherweise eine Eins-zu-Eins-Wechselwirkung zwischen dem konjugierten Mittel und dem biochemischen Ziel, das oft in relativ geringen Konzentrationen (häufig nanomolaren) vorliegt. Folglich ist die Zahl zielorientierter Kontrastmittelmoleküle, die sich in einem besonderen Gewebe unter Verwendung dieses Ansatzes anreichern, beschränkt. Für Bilderzeugungsmodalitäten, wo oft eine signifikante Konzentration an Mittelmolekülen für einen Nachweis (z. B. > 1 μM) benötigt wird, wie MRI und optische Bilderzeugung, ist dieser "Eins-zu-Eins"-Ansatz im Allgemeinen zu unempfindlich, um verwendbar zu sein.
Versuche, den biochemischen Zustand von Geweben abzubilden, schließen radiopharmazeutische Anwendungen ein, wo bestimmte bilderzeugende Mittel in einem bestimmten Gewebe zurückgehalten werden. Zum Beispiel wird die Positronen-emittierende ¹⁸F-markierte Fluordesoxyglucose durch passive Diffusion in das Gehirn transportiert, wo sie phosphoryliert und innerhalb des Hirngewebes zurückgehalten wird, was zu einer Kennzeichnung des Glucosemetabolismus führt (siehe M. Blau, Seminars in Nuclear Medicine. Bd. XV, Nr. 4 (Oktober), 1985). Ebenso wird berichtet, dass ein Technetium-99m-markiertes Nitroimidazol bevorzugt im ischämischen Herz zurückgehalten wird (siehe Y.-W. Chan et al., Proceedings of the 41st Annual Meeting of the Society of Nuclear Medicine, 5. Juni–8. Juni 1994, J. Nuclear Medicine (1994), Band 35, Zusammenfassung Nr. 65, S. 18 P). Jedoch bleibt in diesen Fällen das Signal von dem Radiopharmazeutikum konstant (d. h. jedes Radioisotop weist einen charakteristischen, unveränderlichen Zerfall und eine charakteristische, unveränderliche Energie der emittierten Teilchen auf) und wird weder durch eine Biomodifikation noch durch eine bevorzugte Retention in einem Gewebe beeinflusst. Die Spezifität und Empfindlichkeit der Information, die durch dieses Verfahren erhalten werden kann, ist beschränkt.
Es bleibt ein Bedarf an Kontrastmitteln mit verbesserter Spezifität und Empfindlichkeit. Insbesondere bleibt ein Bedarf an zielorientierten MRI- und optischen Bilderzeugungskontrastmitteln, die als Reaktion auf die Anwesenheit spezifischer Bioaktivitäten genügend Signalverstärkung oder Signalveränderung zeigen, um beim Diagnostizieren der Anwesenheit dieser Bioaktivitäten nützlich zu sein.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt neue verbesserte diagnostische MRI- und optische Bilderzeugungsmittel für den empfindlichen Nachweis einer spezifischen Bioaktivität innerhalb eines Gewebes und pharmazeutisch verträgliche Derivate davon bereit. Die Bilderzeugungsmittel sind Prodrugkontrastmittel, die in vivo in Anwesenheit der spezifischen Bioaktivität bioaktiviert werden. Wo die Bioaktivität katalytisch ist (z. B. auf Enzymaktivität zurückgeht), wird eine große Zahl aktivierter Kontrastmittelmoleküle für jede Einheit des bioaktiven Stoffs erzeugt. Die bioaktivierte Form des Bilderzeugungsmittels zeigt erhöhte Bindungsaffinität zu einem oder mehreren Proteinen im Vergleich zu dem Prodrug, und diese Änderung in der Bindungsaffinität verursacht eine nachweisbare Änderung in den Signaleigenschaften in dem Bilderzeugungsmittel. Diese nachweisbare Signaländerung erhöht den Signal- (oder Bild-)Kontrast zwischen Geweben, welche die Bioaktivität auf die abgezielt wird enthalten, und denjenigen, die es nicht tun, was folglich die Anwesenheit der Bioaktivität auf die abgezielt wird widerspiegelt.
Es ist eine Aufgabe dieser Erfindung, die Verwendung eines Prodrugs zur Herstellung eines MRI- oder optischen Kontrastmittels bereitzustellen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Damit die hier beschriebene Erfindung vollständiger verstanden werden kann, wird die folgende ausführliche Beschreibung dargelegt.
Die neuen erfindungsgemäßen Prodrugs werden unter Berücksichtigung von drei Beschränkungen entworfen: 1) sie müssen eine oder mehrere spezifische Stellen in ihrer Struktur aufweisen, die in vivo durch eine spezifische Bioaktivität modifiziert werden können; 2) die modifizierte Form des Bilderzeugungsmittels, die durch diese Bioaktivität erzeugt wird, muss in einem größeren Ausmaß als das Prodrug an ein oder mehrere Proteine binden; und 3) die Signaleigenschaften des Bilderzeugungsmittels müssen verändert werden, wenn es an ein Protein bindet.
Für die vorliegende Erfindung erfordert ein Bildkontrast zwischen normalem und abnormem Gewebe im Allgemeinen, dass die Bioaktivität in einem der Gewebe höher als die in dem anderen ist. Falls abnormes Gewebe eine größere Konzentration an Bioaktivität als normales Gewebe exprimiert, dann wird abnormes Gewebe mehr Prodrugkontrastmittel in die aktivierte Form umwandeln als es normales Gewebe wird (mit der Maßgabe, dass ähnliche Konzentrationen an Prodrug in beiden Geweben vorliegen). In dem speziellen Beispiel, wo erhöhte Proteinbindung durch das aktivierte Kontrastmittel ein intensiveres Signal erzeugt, führt die Anwesenheit von Bioaktivität zu dem Bild (oder Signal), das als "Hot Spot" nachgewiesen wird. Falls umgekehrt das abnorme Gewebe die geringere Bioaktivität exprimiert, dann wird abnormes Gewebe eine relativ geringere Konzentration an bioaktiviertem Kontrastmittel aufweisen. Falls in diesem Fall die erhöhte Proteinbindung durch das aktivierte Kontrastmittel ein intensiveres Signal erzeugt, führt die Anwesenheit an Bioaktivität zu dem Bild (oder Signal), das als "Cold Spot" nachgewiesen wird.
I. Definitionen
Nachstehend sind Definitionen von Begriffen aufgelistet, die zum Beschreiben der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Definitionen gelten für die Begriffe, wie sie überall in der Beschreibung verwendet werden, sofern es nicht anders angegeben ist.
Der Begriff "aliphatischer Rest", wie er hier allein oder als Teil eines anderen Restes verwendet wird, bezeichnet gegebenenfalls substituierte, gerad- und/oder verzweigtkettige, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffe, die Alkenyl-, Alkinyl-, Cycloalkyl- und Cycloalkenylkohlenwasserstoffe einschließen.
Der Begriff "Alkylrest", wie er hier allein oder als Teil eines anderen Restes verwendet wird, bezeichnet gegebenenfalls substituierte, gerad- und/oder verzweigtkettige gesättigte Kohlenwasserstoffe.
Die Begriffe "Alkoxyrest" oder "Alkylthiorest" bezeichnen einen Alkylrest, wie er vorstehend beschrieben ist, der über eine Sauerstoffbindung (-O-) bzw. eine Schwefelbindung (-S-) gebunden ist. Der Begriff "Alkylcarbonylrest", wie er hier verwendet wird, bezeichnet einen Alkylrest, der über eine Carbonylgruppe gebunden ist. Der Begriff "Alkylcarbonyloxyrest", wie er hier verwendet wird, bezeichnet einen Alkylrest, der über eine Carbonylgruppe gebunden ist, die wiederum über eine Sauerstoffbindung gebunden ist.
Der Begriff "Alkenylrest", wie er hier allein oder als Teil eines anderen Restes verwendet wird, bezeichnet gegebenenfalls substituierte, gerad- und verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste, die mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung in der Kette enthalten.
Der Begriff "Alkinylrest", wie er hier allein oder als Teil eines anderen Restes verwendet wird, bezeichnet gegebenenfalls substituierte, gerad- und verzweigtkettige Kohlenwasserstoffreste, die mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Dreifachbindung in der Kette enthalten.
Der Begriff "Cycloalkylrest", wie er hier allein oder als Teil eines anderen Restes verwendet wird, bezeichnet gegebenenfalls substituierte, gesättigte cyclische Kohlenwasserstoffringsysteme.
Der Begriff "Cycloalkenylrest", wie er hier allein oder als Teil eines anderen Restes verwendet wird, bezeichnet solche gegebenenfalls substituierten Reste, wie sie vorstehend für Cycloalkylreste beschrieben sind, die weiterhin mindestens eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Doppelbindung, die einen teilweise ungesättigten Ring bildet, enthalten.
Der Begriff "Arylrest", wie er hier allein oder als Teil eines anderen Restes verwendet wird, bezeichnet gegebenenfalls substituierte, homocyclische aromatische Reste.
Der Begriff "heterocyclischer Rest", wie er hier allein oder als Teil eines anderen Restes verwendet wird, bezeichnet gegebenenfalls substituierte völlig gesättigte oder ungesättigte, aromatische oder nichtaromatische cyclische Reste mit mindestens einem Heteroatom.
Der Begriff "Acylrest", wie er hier allein oder als Teil eines anderen Restes verwendet wird, bezeichnet die Einheit, die durch Entfernen der Hydroxylgruppe aus der Gruppe -COOH einer organischen Carbonsäure gebildet wird.
Der Begriff "Bioaktivität" schließt Änderungen im pH-Wert, im Redoxpotential, in der Konzentration der reaktiven Spezies, wie freie Radikale, oder die Anwesenheit oder den Anteil von Enzymen oder Biomolekülen (einschließlich RNA-Enzymen) ein, welche die Modifikation oder Spaltung einer oder mehrerer Bindungen in dem Prodrug fördern können. Eine "Bioaktivität" kann zwei oder mehrere Typen von Biomolekülen umfassen, die zusammen oder aufeinanderfolgend eine Modifikation des Prodrugs verursachen. Mehr als eine Biomodifikation kann an dem Prodrug auftreten (z. B. eine enzymatische Spaltung, gefolgt von einer einfachen Hydrolyse oder Decarboxylierung).
II. Struktur des Prodrugs
Die erfindungsgemäßen Prodrugs müssen drei Bereiche umfassen: eine Bild-verstärkende (oder Signal-erzeugende) Einheit("IEM"), eine Modifikationsstelle ("MS"), und eine Protein-bindende Einheit ("PBM").
Es wird in Erwägung gezogen, dass die erfindungsgemäßen Prodrugs auch eine physiologisch verträgliche Verknüpfer-Einheit (L) umfassen können, welche die funktionellen Bereiche verknüpft. Im Allgemeinen trägt L nicht wesentlich zur Protein-bindenden oder Bild-verstärkenden Funktionalität des Kontrastmittels bei. In einigen Fällen kann die Anwesenheit von L auf Synthesegesichtspunkten beruhend bevorzugt sein. In anderen Fällen kann L die Wirkung der Bioaktivität an der MS erleichtern. Beispiele von L schließen lineare, verzweigte oder cyclische Alkyl-, Aryl-, Ether-, Polyhydroxyl-, Polyether-, Polyamin-, heterocyclische, Peptid-, Peptoid- oder andere physiologisch verträgliche kovalente Verknüpfungen ein.
Ein bevorzugtes Verfahren zur Bioaktivierung der erfindungsgemäßen Kontrastmittel umfasst enzymatische Spaltung des Prodrugs an der MS (z. B. durch eine Esterase, Proteinase, Phosphatase, usw.). In diesem Fall umfassen die erfindungsgemäßen Prodrugs weiterhin eine Maskierungseinheit (MM). Die MM "maskiert" (oder vermindert) die Bindung des Prodrugs am Protein innerhalb des Gewebes, dessen bildliche Darstellung gewünscht ist; wenn einmal die MM durch Spaltung an der MS entfernt ist, wird dann die erhöhte Bindungsaffinität des Mittels exprimiert. In diesem Fall ist das Ziel oder Substrat für die Bioaktivität (z. B. eine Amidbindung) als die MS des Prodrugs definiert. Dieses besondere Verfahren der Bioaktivierung führt zur physikalischen Trennung von mindestens zwei Molekülfragmenten, einem, das die IEM und PBM enthält, und dem anderen, das die MM enthält.
Die Bereiche der Verbindungen dieser Erfindung können in den verschiedensten Stellungen in Bezug auf einander angeordnet werden. Obwohl diese Bereiche ohne irgendwelche speziellen Grenzen zwischen ihnen vorhanden sein können (z. B. kann die MS Teil der IEM sein), ist es zweckmäßig, sie als getrennte Einheiten des Moleküls zu konzipieren.
Das Prodrug weist eine Struktur auf, die aus: IEM-[(PBM)_m-[(MS)_n-(MM)_o]_p]_q (1)
besteht, wobei jeweils m, n, o, p und q gleich oder verschieden sind, q, n, m und p größer oder gleich 1, aber nicht Null sein können und o größer oder gleich Null sein kann. Im Allgemeinen sind q, m, n und p kleiner als fünf. Am häufigsten sind m, n, p und q 1 und o ist Null oder 1.
Wie sie hier verwendet werden, sind die Verbindungen dieser Erfindung definiert, dass sie pharmazeutisch verträgliche Derivate davon einschließen. Ein "pharmazeutisch verträgliches Derivat" bedeutet ein(en) beliebiges/n pharmazeutisch verträgliches/n Salz, Ester, Salz eines Esters oder anderes Derivat einer Verbindung dieser Erfindung, die nach Verabreichung an einen Empfänger (direkt oder indirekt) eine Verbindung dieser Erfindung oder einen hemmend wirksamen Metaboliten oder Rest davon bereitstellen kann. Besonders bevorzugte Derivate sind diejenigen, welche die Bioverfügbarkeit der Verbindungen dieser Erfindung erhöhen, wenn solche Verbindungen an einen Säuger verabreicht werden (z. B. dadurch, dass sich eine oral verabreichte Verbindung leichter ins Blut absorbieren lässt), oder welche die Abgabe der Stammverbindung an ein biologisches Kompartiment (z. B. das Gehirn oder Lymphsystem) relativ zur Stammspezies verbessern.
Pharmazeutisch verträgliche Salze der erfindungsgemäßen Verbindungen schließen diejenigen ein, die von pharmazeutisch verträglichen anorganischen und organischen Säuren und Basen abgeleitet sind. Beispiele geeigneter Säuren schließen Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Salpeter-, Perchlor-, Fumar-, Malein-, Phosphor-, Glycol-, Milch-, Salicyl-, Bernstein-, p-Toluolsulfon-, Wein-, Essig-, Zitronen-, Methansulfon-, Ethansulfon-, Ameisen-, Benzoe-, Malon-, Naphthalin-2-sulfon- und Benzolsulfonsäure ein. Andere Säuren, wie Oxalsäure, obgleich selbst nicht pharmazeutisch verträglich, können bei der Herstellung von Salzen verwendet werden, die als Zwischenprodukte zum Erhalten der Verbindungen der Erfindung und deren pharmazeutisch verträglichen Säureadditionssalzen verwendbar sind.
Salze, die von geeigneten Basen abgeleitet sind, schließen Alkalimetall- (z. B. Natrium-), Erdalkalimetall- (z. B. Magnesium-), Ammonium- und N-(C_1-4-Alkyl)₄ ⁺-Salze ein.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen enthalten ein oder mehrere asymmetrische Kohlenstoffatome und treten folglich als Racemate und racemische Gemische, einzelne Enantiomere, Diastereomerengemische und einzelne Diastereomere auf. Alle solchen isomeren Formen dieser Verbindungen sind ausdrücklich in der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Jedes stereogene Kohlenstoffatom kann die R- oder S-Konfiguration aufweisen. Obgleich die speziellen Verbindungen, die in dieser Anmeldung veranschaulicht werden, in einer besonderen stereochemischen Konfiguration dargestellt werden können, sind sowohl Verbindungen mit der entgegengesetzten Stereochemie an einem beliebigen gegebenen chiralen Zentrum als auch Gemische davon vorgesehen.
Kombinationen von Substituenten und Variablen, die durch diese Erfindung vorgesehen sind, sind nur diejenigen, die zur Bildung stabiler Verbindungen führen. Der Begriff "stabil", wie er hier verwendet wird, betrifft Verbindungen, die eine ausreichende Stabilität besitzen, um eine Herstellung zu erlauben, und welche die Integrität der Verbindung über einen ausreichenden Zeitraum erhält, um für die hier genau beschriebenen Zwecke verwendbar zu sein (z. B. therapeutische oder prophylaktische Verabreichung an einen Säuger oder zur Verwendung bei Affinitätschromatographieanwendungen). Typischerweise sind solche Verbindungen bei einer Temperatur von 40°C oder geringer in Abwesenheit von Feuchtigkeit oder anderen chemisch reaktiven Bedingungen für mindestens eine Woche stabil.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in Form von Salzen verwendet werden, die von anorganischen oder organischen Säuren abgeleitet sind. Eingeschlossen unter solchen Säuresalzen sind zum Beispiel die folgenden: Acetat, Adipat, Alginat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Butyrat, Zitrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Fumarat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Methansulfonat, 2-Naphthalinsulfonat, Nicotinat, Oxalat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Tosylat und Undecanoat.
Diese Erfindung sieht auch die Quaternisierung beliebiger basischer stickstoffhaltiger Reste der hier offenbarten Verbindungen vor. Das basische Stickstoffatom kann mit beliebigen Mitteln, die Durchschnittsfachleuten bekannt sind, einschließlich zum Beispiel Niederalkylhalogeniden, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butylchloriden, -bromiden und -iodiden, Dialkylsulfaten einschließlich Dimethyl-, Diethyl-, Dibutyl- und Diamylsulfaten, langkettigen Halogeniden, wie Decyl-, Lauryl-, Myristyl- und Stearylchloriden, -bromiden und -iodiden, und Aralkylhalogeniden einschließlich Benzyl- und Phenethylbromiden quaternisiert werden. Wasser- oder Öl-lösliche oder dispergierbare Produkte können durch eine solche Quaternisierung erhalten werden.
Selbstverständlich können die Verbindungen dieser Erfindung durch Anhängen geeigneter chemischer Reste modifiziert werden, um selektive biologische Eigenschaften zu verbessern. Solche Modifikationen sind im Fachgebiet bekannt und schließen diejenigen ein, die das biologische Eindringen in ein gegebenes biologisches Kompartiment (z. B. Blut, Lymphsystem, Zentralnervensystem) steigern, die orale Verfügbarkeit steigern, die Löslichkeit steigern, um eine Verabreichung als Injektion zu erlauben, den Metabolismus verändern und die Ausscheidungsrate verändern.
Selbstverständlich können die Verbindungen dieser Erfindung auch die verschiedensten Konformations- und Ionenformen in Lösung, in Arzneimitteln und in vivo annehmen. Obgleich hier die Darstellungen der speziellen Verbindungen dieser Erfindung von besonderen Konformationen und Ionenformen sind, sind andere Konformationen und Ionenformen dieser Verbindungen vorgesehen und durch diese Darstellungen umfasst.
Eine weitere ausführliche Beschreibung der IEM-, PBM-, MM- und MS-Einheiten wird nachstehend vorgelegt. Selbstverständlich werden Verbindungen dieser Erfindung durch Auswählen unter den verschiedenen Strukturen der hier gezeigten Einheiten und deren Einbauen in die Endverbindungen erhalten.
A. Bild-verstärkende Einheit (IEM)
Die IEM kann eine beliebige Chemikalie oder Substanz sein, die das Signal oder den Kontrast bei der Bilderzeugung bereitstellt. Wenn die Kontrastmittel dieser Erfindung an ein Protein binden, gibt es eine Änderung in der IEM-Signalcharakteristik, die durch das externe Nachweisinstrument nachweisbar ist. Für optische Bilderzeugung kann dies eine Änderung in der Extinktion, in der Reflexion, in der Fluoreszenz, eine Zunahme oder Abnahme in der Zahl der Extinktionspeaks oder eine beliebige Änderung in ihren Wellenlängenmaxima oder eine andere Änderung sein, die durch externen Nachweis einer gebundenen IEM entsprechen würde. Ebenso kann dies für MRI eine Änderung in den induzierten Relaxationsgeschwindigkeiten von Wasserprotonen (1/T₁ oder 1/T₂) oder beliebigen anderen nahe gelegenen Kernen oder eine Verschiebung eines oder mehrerer Peaks oder eine Veränderung in der Signalintensität im NMR-Spektrum entweder der IEM oder der Peaks, die von Kernen in der Bindungsstelle für die PBM erscheinen, sein.
Für die Zwecke dieser Anmeldung soll "MRI" magnetische Resonanzspektroskopieverfahren einschließen. Die Signale, die durch magnetische Resonanzspektroskopie erzeugt werden, stellen im Allgemeinen Information in Form einer chemischen Verschiebung (δ, in Einheiten von ppm) statt dreidimensionaler Bilder bereit. Die chemische Verschiebung eines bestimmten Kerns hängt mit seiner chemischen Umgebung zusammen. Wenn ein Prodrug bioaktiviert wird, wird die chemische Verschiebung der Kerne innerhalb des Prodrugs verändert werden.
Jede IEM umfasst einen Komplex zwischen mindestens einem physiologisch verträglichen cyclischen oder acyclischen organischen Chelatbildner und einem oder mehreren Metallionen mit den Ordnungszahlen 13, 21–34, 39–42, 44–50 oder 57–83. Paramagnetische Metallionen, die für MRI bevorzugt sind, schließen diejenigen mit den Ordnungszahlen 21–29, 42, 44 oder 57–83 ein.
Falls die IEM ein Metallchelat ist, sollte das Metallchelat während der Passage des Bilderzeugungsmittels durch den Körper einschließlich eines Gewebes, wo es eine Biomodifikation durchmachen kann, in keinerlei bedeutendem Ausmaß dissoziieren. Eine signifikante Freisetzung von freien Metallionen kann zu großen MRI- oder optischen Signalveränderungen führen, aber kann auch von Toxizität begleitet sein, die nur in pathologischen Geweben akzeptabel wäre. Es ist bevorzugt, dass die Bioaktivierung die Stabilität des Chelats nicht wesentlich gefährdet, so dass der Metallkomplex intakt bleiben und ausgeschieden werden kann. Für Komplexe, bei denen die kinetische Labilität gering ist, ist eine hohe thermodynamische Stabilität (eine Bildungskonstante von vorzugsweise mindestens 10¹⁵ M^–1 und stärker bevorzugt mindestens 10²⁰ M^–1) wünschenswert, um die Dissoziation und ihre damit verbundene Toxizität zu minimieren. Für Komplexe, bei denen die kinetische Labilität relativ höher ist, kann die Dissoziation mit einer niedrigeren Bildungskonstante, d. h. vorzugsweise 10¹⁰ M^–1 oder höher, minimiert werden.
Bildungskonstanten bekannter Koordinationskomplexe sind im Allgemeinen geringer als 10⁶⁰ und typischer im Bereich von 10¹⁵ bis 10⁴⁰. Koordinationskomplexe mit geeigneten Bildungskonstanten umfassen Eisenenterobactin (Bildungskonstante 10⁵²; W. R. Harris et al., J. Am. Chem. Soc. (1981), 103, S. 2667), Eisen-MECAMS (Bildungskonstante 10⁴¹; W. R. Harris et al., J. Am. Chem. Soc. (1979), 101, S. 2213), Gadoliniumdiethylentriaminpentaessigsäure ("DTPA") (Bildungskonstante 10^22,46; D. L. Wright et al., Anal. Chem. (1965), 37, S. 884–892), Gadolinium-(1,4,7,10-tetraazacyclotetradecen)-1,4,7,10-tetraessigsäure ("DOTA") (Bildungskonstante 10^25,3; K. Kumar et al., Inorganic Chemistry (1993), 32, S. 587–593), Gadolinium-DTPA-BMA (Bildungskonstante 10^16,9; W. P. Cacheris et al., Mag. Res. Imag. (1990), 8, S. 467–481) und Gadolinium-EDTA (Bildungskonstante 10^17,3; D. L. Wright et al., Anal. Chem. (1965) 37, S. 884–892). Formulierungen von Gadolinium-DTPA, DOTA und DTPA-BMA werden klinisch als MRI-Kontrastmittel verwendet.
Die Toxizität ist auch eine Funktion der Zahl offener Koordinationsstellen in dem Komplex. Je weniger Koordinationsstellen es gibt, desto geringer ist im Allgemeinen die Neigung des Chelatbildners, die paramagnetische Substanz abzugeben. Vorzugsweise enthält der Komplex deshalb zwei, eine oder keine offenen Koordinationsstellen. Die Anwesenheit von mehr als zwei offenen Stellen wird im Allgemeinen die Toxizität durch Abgabe des Metallions in vivo nicht inakzeptabel steigern.
Um MRI-Bilder effektiv zu verbessern, kann der Komplex vorzugsweise die Relaxationsgeschwindigkeiten 1/T₁ (longitudinal oder Spin-Gitter) und/oder 1/T₂ (transversal oder Spin-Spin) von Wasserprotonen oder anderen bilderzeugenden oder spektroskopischen Kernen einschließlich Protonen, P-31, C-13, Na-23 oder F-19 an anderen Biomolekülen oder injizierten Biomarkern steigern. Die Relaxivitäten R₁ und R₂ sind als die Fähigkeit definiert, 1/T₁ bzw. 1/T₂ pro mM Metallion zu erhöhen; Einheiten sind mM^–1s^–1. Für die häufigste Form der klinischen MRI, Wasserprotonen-MRI, ist die Relaxivität optimal, wenn das paramagnetische Ion, das an den chelatbildenden Liganden gebunden ist, noch eine oder mehrere offene Koordinationsstellen für den Wasseraustausch aufweist. Siehe S. M. Rocklage et al., "Contrast Agents in Magnetic Resonance", Magnetic Resonance Imaging, Zweite Auflage, Band 1, Kapitel 14, (1992), Mosby-Year Book, Inc.; R. B. Lauffer, Chemical Reviews (1987), 87, S. 901–927.
Zusätzlich zur Steigerung von 1/T₁ oder 1/T₂ der Gewebekerne über Dipol-Dipol-Wechselwirkungen können MRI-Mittel zwei weitere magnetische Eigenschaften beeinflussen und folglich klinisch verwendbar sein:

1) ein Eisenteilchen oder Metallchelat hoher magnetischer Suszeptibilität, insbesondere Chelate von Dy, Gd oder Ho, kann die MRI-Signalintensität des Gewebes durch Erzeugen mikroskopischer magnetischer Suszeptibilitätsgradienten verändern. Siehe A. Villringer et al., Magn. Reson. Med. (1988), 6, S. 164–174. Für diese Anwendung sind keine offenen Koordinationsstellen an einem Chelat erforderlich.
2) ein Eisenteilchen oder Metallchelat kann auch verwendet werden, um die Resonanzfrequenz von Wasserprotonen oder anderen bilderzeugenden oder spektroskopischen Kernen einschließlich Protonen, P-31, C-13, Na-23 oder F-19 an dem injizierten Mittel oder dem Protein, an das es bindet, zu verschieben. Hier können in Abhängigkeit von dem Kern und der verwendeten Strategie null bis drei offene Koordinationsstellen verwendet werden.

Das bevorzugte paramagnetische Metall wird aus Gd(III), Fe(III), Mn(II) und Mn(III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III), Ho(III), Er(III) und Eu(III) ausgewählt. Das am stärksten bevorzugte ist Gd(III).
Der organische chelatbildende Ligand sollte physiologisch verträglich sein. Die Molekülgröße des chelatbildenden Liganden sollte mit der Größe des paramagnetischen Metalls vereinbar sein. So erfordert Gadolinium(III), das einen Kristallionenradius von 0,938 Å aufweist, einen größeren chelatbildenden Liganden als Eisen(III), das einen Kristallionenradius von 0,64 Å aufweist.
Viele geeignete chelatbildende Liganden für MRI-Mittel sind im Fachgebiet bekannt. Diese können auch für Metallchelate für andere Formen biologischer Bilderzeugung verwendet werden. Für MRI-Bilderzeugung bevorzugte IEMs schließen ein:
Es ist im Fachgebiet bekannt, dass bei bestimmten Anwendungen andere Metalle Gd³⁺ ersetzen können.
Es wird auch erwogen, dass die IEM ein pharmazeutisch verträgliches Salz umfassen kann. Pharmazeutisch verträgliche erfindungsgemäße Salze schließen diejenigen ein, die von anorganischen oder organischen Säuren und Basen abgeleitet sind. Eingeschlossen unter solchen Säuresalzen sind die Folgenden: Acetat, Adipat, Alginat, Aspartat, Benzoat, Benzolsulfonat, Bisulfat, Butyrat, Zitrat, Camphorat, Camphersulfonat, Cyclopentanpropionat, Digluconat, Dodecylsulfat, Ethansulfonat, Fumarat, Glucoheptanoat, Glycerophosphat, Hemisulfat, Heptanoat, Hexanoat, Hydrochlorid, Hydrobromid, Hydroiodid, 2-Hydroxyethansulfonat, Lactat, Maleat, Methansulfonat, 2-Naphthalinsulfonat, Nicotinat, Oxalat, Pamoat, Pectinat, Persulfat, 3-Phenylpropionat, Picrat, Pivalat, Propionat, Succinat, Tartrat, Thiocyanat, Tosylat und Undecanoat. Basensalze schließen Ammoniumsalze, Alkalimetallsalze, wie Natrium- und Kaliumsalze, Erdalkalimetallsalze, wie Calcium-, Magnesium- und Zinksalze, Salze mit organischen Basen, wie Dicyclohexylaminsalze, N-Methyl-D-Glucaminsalze und Salze mit Aminosäuren, wie Arginin, Lysin und so weiter, ein. Auch die basischen stickstoffhaltigen Reste können mit solchen Mitteln wie Niederalkylhalogeniden, wie Methyl-, Ethyl-, Propyl- und Butylchloriden, -bromiden und -iodiden, Dialkylsulfaten, wie Dimethyl-, Diethyl-, Dibutyl- und Diamylsulfaten, langkettigen Halogeniden, wie Decyl-, Lauryl-, Myristyl- und Stearylchloriden, -bromiden und -iodiden, Aralkylhalogeniden, wie Benzyl- und Phenethylbromiden, und anderen quaternisiert werden. Wasser- oder Öl-lösliche oder -dispergierbare Produkte werden dadurch erhalten. Die bevorzugten Salze der IEM sind die N-Methyl-D-glucamin-, Calcium- und Natriumsalze.
B. Protein-bindende Einheit (PBM)
Die PBM der erfindungsgemäßen Kontrastmittel trägt zur Bindung der Mittel an ein oder mehrere Proteine innerhalb des Gewebes, das die Bioaktivität enthält, bei. Diese nicht-kovalente Bindung sollte ausreichend fest sein und die Gesamtzahl der Bindungsstellen für die PBM sollte ausreichend groß sein, so dass ein Kontrast zwischen Geweben mit unterschiedlichen Anteilen der Bioaktivität auf die abgezielt wird erzeugt wird.
Beispiele geeigneter PBMs schließen ein: Arzneistoffe, lipophile oder amphiphile organische Moleküle, Porphyrine, Rezeptorliganden, Steroide, Lipide, Hormone, Peptide, Proteine, Oligonucleotide (DNA, RNA oder chemisch modifizierte Versionen davon), Antikörper (einschließlich monoklonaler und genetisch manipulierter Versionen und ihrer Fragmente) oder andere Biomoleküle oder Substanzen, von denen bekannt ist, dass sie an ein oder mehrere Proteine in dem Gewebe, das die Bioaktivität enthält, deren bildliche Darstellung gewünscht ist, binden.
Die bevorzugten PBMs sind diejenigen, die reversibel an Proteine im Plasma, Interstitialraum (die Flüssigkeit zwischen Zellen) oder Intrazellularraum binden. Obgleich ein beliebiges Biomolekül oder eine beliebige Substanz, die an ein Protein bindet, verwendet werden könnte, sind diejenigen am nützlichsten, die an Proteine binden, die entweder in hoher Konzentration vorliegen oder eine große Zahl an Bindungsstellen für das Biomolekül oder die Substanz aufweisen. Dies bietet die Fähigkeit, die große Zahl modifizierter Mittel, die von der Bioaktivität katalytisch erzeugt werden, vorübergehend zu "fangen". Die reversible Beschaffenheit der Bindung erhöht die Wahrscheinlichkeit, dass die Mittel schließlich ausgeschieden werden, eine sehr wünschenswerte Eigenschaft für bilderzeugende Mittel.
Beispiele bevorzugter Proteine sind: menschliches Serumalbumin (HSA) (0,7 mM im Plasma, geringere Konzentrationen im Interstitialraum); Fettsäure-bindendes Protein (FABP; auch als Z-Protein oder Protein A bekannt) (ungefähr 0,1 mM in den primären Zellen der Leber, der Niere, des Herzens und anderer Gewebe); Glutathion-S-Transferase (GST, auch als Ligandin bekannt) (ungefähr 0,1 mM in den primären Zellen der Leber, der Niere, des Herzens und anderer Gewebe); Alpha-1-Säureglykoprotein (AAG, MG 41000) (0,55 g–1,4 g/l) und Lipoproteine (konzentriert in atherosklerotischem Plaque). Andere bevorzugte Beispiele schließen die Strukturproteine der extrazellulären Matrix (Kollagene, Laminin, Elastin, Fibronektin, Entaktin, Vitronektin), Amyloid (einschließlich des Beta-2-Amyloidproteins (A4) der Alzheimer-Krankheit), Ceroid (oder Lipofuscin) und Glykoproteine (zum Beispiel Osteonektin, Tenaszin und Thrombospondin) ein.
Ein stärker bevorzugtes Protein für positiv geladene Kontrastmittel oder Kontrastmittel, die basische PBMs enthalten, ist Alpha-1-Säureglykoprotein (AAG). Die Plasmaspiegel dieses positiven Akute-Phase-Proteins variiert signifikant mit dem Erkrankungsstadium. Zum Beispiel nehmen die Konzentrationen des AAG als Folge von Entzündungsreizen um das Zwei- bis Vierfache zu und Plasmaspiegel des AAG sind als prognostisches Hilfsmittel für Gliom, metastasenbildendes Brust- und andere Karzinome, Neugeboreneninfektion und chronische Schmerzen vorgeschlagen worden. Erhöhte Spiegel sind bei Atherosklerose, Morbus Crohn, Myokardinfarkt, Nephritis und bakteriellen, viralen und postoperativen Infektionen bemerkt worden. Liganden, die AAG binden, schließen zahlreiche basische Arzneistoffe, wie Propranolol (K_a = 11,3 × 10⁵), Imipramin (K_a = 2,4 × 10⁵) und Chlorpromazin (K_a = 35,4 × 10⁵) ein, die deshalb als PBMs verwendet werden können.
Liganden für HSA, FABP und GST sind stärker bevorzugte PBMs, da diese gewöhnlich neutral mit teilweise negativ geladenen Gruppen (z. B. einem Ester-, Amid- oder Keton-Carbonylsauerstoffatom) sind; solche Verbindungen sind im Allgemeinen weniger toxisch als positiv geladene Moleküle. Für aktivierte Mittel, die dafür vorgesehen sind, FABP oder GST zu binden, sind hydrophobe langkettige PBMs, welche die natürlichen Liganden (wie Palmitinsäure) nachahmen, oder ringhaltige PBMs (wie Indocyaningrün) bevorzugt.
Von diesen drei Proteinen ist HSA stark bevorzugt, da Liganden für HSA, anders als Liganden für FABP und GST, keine intrazelluläre Aufnahme vor der Bindung erfordern. Es braucht keine intrazelluläre Aufnahme der Liganden für HSA geben, da HSA in beträchtlichen Mengen in vielen extrazellulären flüssigen Milieus einschließlich Plasma, Interstitialraum normaler und krebsartiger Gewebe, Synovialflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit und Entzündungs- oder Abszessflüssigkeit vorliegt. In vielen pathologischen Geweben, wie in Tumoren, bei Entzündung, in atherosklerotischem Plaque oder den Wänden atherosklerotischer Arterien, sind die Kapillaren undicht, was zu sogar noch höheren lokalisierten HSA-Spiegeln führt.
Ein weiterer Grund, weshalb HSA stark bevorzugt ist, ist, dass jedes Proteinmolekül eine große Zahl an Liganden-Bindungsstellen aufweist. Siehe U. Kragh-Hansen, Pharm. Rev. (1981), 33, S. 17–53; X. M. He et al., Nature (1992), 358, S. 209–215; D. C. Carter, Adv. Protein Chem. (1994), 45, S. 153–203.
Die Gestaltung geeigneter PBMs wird im US-Patent Nr. 4,880,008 und in der US-Anmeldung Ser.-Nr. 08/382,317 (am 1. Februar 1995 eingereicht), als WO96/23526 veröffentlicht, diskutiert. Für die Bindung an HSA fungiert eine große Auswahl an hydrophoben oder amphiphilen Substanzen als PBM. Diese schließen aliphatische, Alkoxy- oder Alkylthio-, Alkylcarbonyl-, Alkylcarbonyloxy-, Aryl- oder heterocyclische Reste mit 1 bis 60 Kohlenstoffatomen und gegebenenfalls einem oder mehreren Stickstoff-, Sauerstoff-, Schwefel-, Halogenatomen, aliphatischen Amid-, Ester-, Sulfonamid-, Acyl-, Sulfonat-, Phosphat-, Hydroxyl- oder organometallischen Substituenten ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
In einer anderen Ausführungsform kann die PBM ein Peptid sein, das hydrophobe Aminosäurereste und/oder Substituenten mit oder ohne hydrophobe(n) oder hydrophile(n) Endgruppen enthält.
Der Zusatz lipophiler Reste in ein Kontrastmittel vermindert wahrscheinlich die Löslichkeit des Mittels. Um eine effiziente Löslichkeit des Kontrastmittels bei klinisch wirksamen Dosierungsspiegeln oder höheren zu behalten, kann es bevorzugt sein, einen oder mehrere wasserstoffbindende Reste (Sauerstoff, Stickstoffatome, usw.) in die PBM einzubauen.
Obgleich rein aliphatische Reste als PBMs verwendet werden können, können diese nicht so bevorzugt sein wie aus aliphatischen und Arylresten gemischte Reste oder reine Arylreste. Besonders wenn eine negative Ladung an der Endstelle langer und flexibler aliphatischer Reste gebunden ist, neigen die Kontrastmittel dazu, die Wechselwirkungen zwischen Membranproteinen und Lipiden zu stören. Dies kann die Toxizität des Mittels erhöhen. So ist es bevorzugt, dass die PBM mindestens einen Arylring enthält.
Im Fall HSA-gebundener MRI-Mittel für die Gewebeverstärkung ist es für das Kontrastmittel vorzuziehen, zwei oder mehr lipophile Reste zu enthalten, um das Mittel vollständig zu immobilisieren, wenn es am Protein gebunden ist. Diese Reste können an einer PBM oder als zwei oder mehr getrennte chemische Reste am Kontrastmittel gebunden sein. Aufgrund ihrer voluminösen Beschaffenheit und Steifheit ist es äußerst bevorzugt, dass die zwei oder mehr Reste jeweils einen Arylring enthalten, wobei die zwei oder mehr Ringe in einer steifen, nichtplanaren Orientierung angeordnet sind.
Bevorzugte PBMs, die zum Einbau in die erfindungsgemäßen Prodrugkontrastmittel geeignet sind, schließen die folgenden Strukturen ein:
wobei R einen aliphatischen Rest und/oder mindestens einen Arylring umfasst oder ein Peptid umfasst, das hydrophobe Aminosäurereste und/oder Substituenten mit oder ohne hydrophobe oder hydrophile Endgruppen enthält.
Das magnetische Resonanzphänomen ist komplex, und verschiedene paramagnetische Materialien verändern das MRI-Signal in unterschiedlichen Maßen. Siehe R. B. Lauffer, Chemical Reviews (1987), 87, S. 901–927. Eine quantitative Messung der Fähigkeit eines Kontrastmittels Wasserprotonen zu relaxieren und folglich das MRI-Bild zu beeinflussen wird durch seine Relaxivität bereitgestellt. Relaxivität ist die Abhängigkeit der Wasserprotonensignalintensität von der Konzentration des paramagnetischen Metallions in Lösung. Relaxivität ist als die induzierte T₁- oder T₂-Relaxation pro Zeiteinheit (R₁ oder R₂ in Einheiten von mM^–1 sec^–1) definiert, die für ein Kontrastmittel beobachtet wird, wenn die Konzentration des Mittels in Millimol (mM) ausgedrückt wird.
Die physikalischen Eigenschaften eines Gadoliniumkomplexes beeinflussen die Relaxivität des Kontrastmittels. Die Zahl der an den Gadoliniumkomplex gebundenen Wassermoleküle, die Geschwindigkeit des Austauschs des Wassermoleküls mit dem Lösungsvolumen, die Relaxationszeit der sieben ungepaarten Elektronen und die Rotationstrommelzeit (bekannt als Rotationskorrelationszeit) des Kontrastmittels in Lösung tragen alle zur insgesamt beobachteten Relaxivität bei. Eine Änderung in diesen physikalischen Eigenschaften kann die Relaxivität dramatisch verändern. Zum Beispiel verlangsamt die Bindung von Gadoliniumchelaten mit kleinem Molekulargewicht an große Makromoleküle die Rotationstrommelzeit und erhöht die Relaxationsverstärkung um Faktoren von 3 bis 10. Bindung des Kontrastmittels an das Protein verursacht, dass die magnetischen Fluktuationen zwischen dem paramagnetischen Ion und den Wasserprotonen auf der gleichen Zeitskala wie die Larmor-Frequenz erscheinen, wobei die effizienteste longitudinale (T₁) Relaxation, die möglich ist, und die höchste mögliche Relaxivität erzeugt wird. Somit ist die nicht-kovalente Bindung von MRI-Kontrastmitteln an große Makromoleküle, wie Proteine, ein effizienter Weg, das MRI-Signal zu steigern. Bildkontrast wird zwischen Flächen, die unterschiedliche Anteile nicht-kovalenter Bindung eines aktivierten Mittels aufweisen, erzeugt.
Um einen mit der Bioaktivität zusammenhängenden Kontrast zwischen normalen und abnormen Geweben zu erzeugen, sollte es einen erheblichen Unterschied zwischen der Protein-bindenden Affinität des Prodrugs und der des bioaktivierten Mittels geben. Die Prodrugbindungsaffinität ist wünschenswerterweise 80% oder weniger der Bindungsaffinität des aktivierten Mittels. Falls zum Beispiel das aktivierte Mittel zu 90% an ein Protein innerhalb eines Gewebes, das die Bioaktivität unter physiologisch relevanten Bedingungen enthält, gebundenen ist (d. h. Kontrastmittelkonzentration im Plasma 0,01–10 mM für MRI und optische Bilderzeugung), sollte das Prodrug unter denselben Bedingungen zu 72% oder weniger gebunden sein. Es ist bevorzugt, dass das Prodrug 50% oder weniger der Bindungsaffinität des aktivierten Mittels zeigt, stärker bevorzugt ist 40% oder weniger, sogar noch stärker bevorzugt ist 30% oder weniger, sogar noch stärker bevorzugt ist 20% oder weniger und am stärksten bevorzugt ist 10% oder weniger.
Bei MRI kann sich der mit der Bioaktivität zusammenhängende Kontrast zwischen normalen und abnormen Geweben als Änderung in den induzierten Relaxationsgeschwindigkeiten (1/T₁ oder 1/T₂) von Wasserprotonen oder Relaxivitäten R₁ und R₂ zeigen. In der vorliegenden Erfindung ist die Prodrug-Relaxivität R₁ wünschenswerterweise 80% oder weniger der Relaxivität R₁ des bioaktivierten Mittels. Vorzugsweise ist die Prodrug-Relaxivität R₁ 50% oder weniger der Relaxivität R₁ des bioaktivierten Mittels, stärker bevorzugt 20% oder weniger und am stärksten bevorzugt 10% oder weniger.
Proteinbindung von Kontrastmitteln kann in vitro durch Gleichgewichtsdialyse oder Ultrafiltration unter Verwendung einer physiologisch relevanten Proteinkonzentration in Puffer bestimmt werden. Siehe G. N. Rolinson und R. Sutherland, British J. Pharmac. Chemother. (1965), 25, S. 638 (Ultrafiltration); D. Glick, Methods Biochem. Anal. (1956), 3, S. 265 (Gleichgewichtsdialyse). Die in dieser Anmeldung dargelegten Proteinbindungsmessungen werden durch Ultrafiltration unter Verwendung von 4,5% (Gew./Gew.) menschlichem Serumalbumin in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,15 NaCl, 10 mM Phosphat, pH 7,4) bestimmt. Vorzugsweise werden mindestens 10% und stärker bevorzugt mindestens 50% und sogar noch stärker bevorzugt mindestens 80% und am stärksten bevorzugt mindestens 95% eines aktivierten Protein-bindenden Kontrastmittels unter physiologisch relevanten Bedingungen an das Protein gebunden werden. In dieser Anmeldung weist die Messung der Prozent Bindung des Kontrastmittels an HSA einen Fehler von etwa +/–5% auf. Proteinbindung an andere Proteine oder an Serum kann in ähnlicher Weise bestimmt werden.
Das Maß, in dem ein Mittel für maximale Relaxivität eingestellt worden ist, kann durch Messung der Relaxivität-gebunden (R₁-gebunden) in Gegenwart von HSA bewertet werden. Dies erfordert Messung der Relaxivität des freien Chelats (R₁-frei) sowie der Relaxivität (R₁- beobachtet) und Prozent Bindung des Mittels in 4,5% HSA. Der Wert R₁-beobachtet ist ein Molenbruch-gewichteter Mittelwert von R₁-frei und R₁-gebunden: R1-beobachtet = (Anteil-frei*R1-frei) + (Anteil-gebunden*R1-gebunden)
Somit:
Proteinbindung von Liganden kann auch theoretisch berechnet werden. Für eine gemeinsame Klasse von Liganden wird die Bindungsaffinität an HSA und andere Proteine im Allgemeinen mit der Hydrophobie der PBM steigern. Theoretische Abschätzungen der Hydrophobie eines Substituenten wie einer PBM können durch Berechnen des Beitrags zum log des Octanol-Wasser- (oder Octanol-Puffer-)Verteilungskoeffizienten (log P) für die PBM selbst unter Verwendung der Hansch-Konstanten n für Substituenten erhalten werden. Siehe A. Leo und C. Hansch, "Partition Coefficients and their Uses", Chemical Reviews, 71, S. 525–616 (1971); K. C. Chu, "The Quantitative Analysis of Structure-Activity Relationships", Burger's Medicinal Chemistry, Teil 1, S. 393–418, (4. Aufl. 1980). Die Bindungsaffinität wird mit zunehmenden log P-Beiträgen zunehmen. Zum Beispiel können für Substituenten an aliphatischen Resten die folgenden Konstanten n verwendet werden:

Rest n-aliphatisch

CH₃ 0,50

Phenyl 2,15
Für Substituenten an Arylresten können die folgenden Konstanten verwendet werden:

Rest n-aliphatisch

CH₃ 0,56

CH₂CH₃ 1,02

Phenyl 1,96

C(CH₃)₃ 1,98
Somit würde der log P-Beitrag für eine an eine IEM gebundene p-Methylbenzylgruppe folgendermaßen berechnet werden (unter Verwendung des Werts des n-aliphatischen für CH₃ als Schätzung für die Gruppe -CH₂-): log P-Beitrag = 0,50 + 2,15 + 0,56 = 3,21
Der log P-Beitrag für eine an eine IEM gebundene p-[4-(t-Butyl)phenyl)benzylgruppe würde folgendermaßen berechnet werden (unter Verwendung des Werts des n-aliphatischen für CH₃ als Schätzung für die Gruppe -CH₂-): log P-Beitrag = 0,56 + 2,15 + 2,15 + 1,98 = 6,84
Bei der Bindung an HSA ist ein minimaler log P-Beitrag von 2 (vier CH₃-Gruppen oder einem Phenylring äquivalent) erforderlich, um eine signifikante Bindung zu erreichen. Stärker bevorzugt ist ein log P-Beitrag von 4 oder mehr. Sogar noch stärker bevorzugt ist ein log P-Beitrag von 6 oder mehr.
Bei der optischen Bilderzeugung erfordert die Erfindung, dass es einen messbaren Unterschied zwischen den optischen Eigenschaften des nicht-Protein-gebundenen Prodrugs und des an bioaktiviertes Protein gebundenen Kontrastmittels gibt. Zum Beispiel wird die maximale Extinktion von Indocyaningrün nach Bindung an Proteine in Plasma oder Blut von 770–780 nm nach 790–805 nm verschoben. Dieser Unterschied wird verwendet, um Bioaktivität durch Bilderzeugung oder Nachweisen des Protein-gebundenen, aktivierten optischen Bilderzeugungsmittels nachzuweisen. Wie im Fall von MRI erhöht die Verwendung eines bioaktivierten Prodrugs des optischen Mittels die Spezifität des Mittels.
C. Modifikationsstelle (MS)
Der Modifikationsstellen-(MS-)Bereich an dem Prodrug wird durch die spezielle Bioaktivität, deren bildliche Darstellung gewünscht ist, verändert. Diese Veränderung, die eine Biotransformation (enzymatisch oder anders), wie Bindungsspaltung, Bindungsbildung, Oxidation, Reduktion oder Protonierung/Deprotonierung, ist, führt zur Erzeugung des bioaktivierten Mittels. Die MS kann ein inhärenter Teil der IEM oder PBM sein (so lange sie deren individuelle Funktionen nicht nachteilig beeinflusst) oder sie kann einen gesonderten Substituenten ausmachen. Ein Fachmann wird die chemischen Strukturen der MS erkennen, die durch die Bioaktivität verändert werden können.
Jede MS ist unabhängig eine Modifikationsstelle, die entweder mindestens eine Bindung umfasst, die in vivo durch ein Enzym verändert werden kann, oder die eine direkte Bindung zwischen PBM und MM oder zwischen IEM und MM ist.
Enzyme, die verwendbar sind, um die erfindungsgemäßen Prodrugs zu modifizieren, sind diejenigen, die in Säugern oder in infektiösen Mikroorganismen (Bakterien, Hefe, Viren, usw.) exprimiert werden, welche die Modifikation oder Spaltung einer oder mehrerer Bindungen in dem Prodrug fördern. Die Expression von Enzymmolekülen und mit ihnen in Verbindung gebrachten in vivo Hemmstoffen ist sehr empfindlich gegenüber dem Typ des Gewebes oder seines Zustands. Äußerst bevorzugte Modifikationsstellen sind diejenigen, die durch Enzyme verändert werden, die erhöhte Spiegel oder Wirkung bei Patienten aufweisen, die entzündliche Erkrankungen, eine Infektionskrankheit, Krebs, Atherosklerose, Thrombose, Myokardinfarkt, rheumatoide Arthritis, Osteoarthritis, Endometriose, eine Periodontalerkrankung, eine Autoimmunerkrankung und so weiter haben. Im Fall von enzymatischer Bioaktivität wird die chemische Struktur der MS nah mit der der natürlichen oder optimalen Substrate für das Enzym verwandt sein. Die natürlichen oder optimalen Substrate sind bekannt und in der Literatur beschrieben oder können durch gängige biochemische Verfahren identifiziert werden.
Bevorzugte Modifikationsstellen schließen diejenigen ein, die durch die EC-Klasse von Enzymen gespalten werden, die als Hydrolasen bekannt sind (EC 3.1.*.* bis EC 3.99.*.*). Diese Modifikationsstellen bestehen aus Kohlenstoff-Sauerstoff-, Kohlenstoff-Stickstoff-, Phosphor-Sauerstoff-, Kohlenstoff-Kohlenstoff- und anderen Bindungen, die durch die Wirkung des geeigneten Enzyms hydrolytisch gespalten werden. Stärker bevorzugte Modifikationsstellen schließen Phosphor-Sauerstoff-Bindungen ein, die durch Enzyme hydrolysiert werden, die als Phosphatasen bekannt sind (EC.3.1.3.*) (Klasse: Hydrolase; Unterklasse: Esterase; Unter-Unterklasse: Phosphomonoesterase). Spezielle Beispiele von Phosphatase-Enzymen und ihre allgemeinen Namen sind in der nachstehenden Tabelle I aufgelistet.
TABELLE I
Ein spezielles Beispiel einer Phosphor-Sauerstoff-MS-Stelle ist die, die im Prodrug-MRI-Kontrastmittel 1 enthalten ist. Solche Phosphatmonoesterderivate werden schnell durch alkalische Phosphatase hydrolysiert, wobei ein Alkohol (oder Phenol) und Phosphat (PO₄ ^2–) als Produkte erzeugt werden. In diesem speziellen Fall bindet das Phosphatmonoester-Prodrug 1 HSA weniger stark als sein enzymatisches Spaltprodukt, der entsprechende Alkohol. Die klinische Relevanz von Enzymen, die auf Phosphor-Sauerstoff-MS-Stellen wirken, wird durch den Fall saurer Phosphatase veranschaulicht, die erhöhte Spiegel bei Patienten mit Prostatakrebs aufweist und über Jahrzehnte umfassend bei der Diagnose, beim Bestimmen der Phase und Überwachen von Prostatakrebs verwendet worden ist.
Zusätzliche bevorzugte Modifikationsstellen schließen diejenigen ein, die durch Sulfatasen (EC 3.1.6.*; Klasse: Hydrolase; Unterklasse: Esterase; Unter-Unterklasse: Sulfatase), Enzymen, die Schwefel-Sauerstoff-Bindungen spalten, gespalten werden. Die Steroid-Sulfatase-Wirkung ist besonders hoch bei Brusttumoren und spielt eine Rolle bei der Steuerung der Bildung von Östrogenen innerhalb von Tumoren. Eine Auflistung von Sulfatasen, die Sulfat-MS-Stellen verändern können, und deren EC-Nummern sind in der nachstehenden Tabelle II aufgelistet.
TABELLE II
Äußerst bevorzugte MS sind Kohlenstoff-Stickstoff-Peptidbindungen, die durch eine Unterklasse von Hydrolase-Enzymen, bekannt als Proteinasen, (EC 3.4.*.*) hydrolysiert werden. Diese Enzyme hydrolysieren eine Amidbindung, wobei zwei Spaltprodukte, ein Amin und eine Carbonsäure, gebildet werden, von denen eines am bioaktivierten Mittel gebunden bleibt.
Die MS wird so gestaltet, dass sie ein natürliches oder optimales Peptidsubstrat für die spezielle enzymatische Wirkung, die bildlich darzustellen ist, nachahmt.
Besonders bevorzugte Kohlenstoff-Stickstoff-Peptid-MS sind diejenigen, die durch Serinproteasen (EC 3.4.21.*; Klasse: Hydrolase; Unterklasse: Peptidase, Unter-Unterklasse: Serin-Endopeptidase) hydrolysiert werden. Die Serinprotease-Wirkung ist mit primärem Brustkrebs, Tumorprogression, die zu Metastasierung bei Brustkrebs führt, der Aktivierung der Koagulation bei Patienten mit Lungenkrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs, schwerer Pankreatitis und Prostatakrebs verknüpft worden. Eine MS, die für diagnostische Mittel für Prostatakrebs verwendbar ist, ist eine, die durch Prostata-spezifisches Antigen (PSA) verändert wird, ein Serinproteaseglykoprotein (30–34 kDa), das ausschließlich durch Prostatagewebe erzeugt wird. PSA zeigt die enzymatische Wirkung, die für die Peptidasen Chymotrypsin und Trypsin typisch ist, und sein physiologisches Substrat scheint Samenbläschenprotein mit hohem Molekulargewicht (HMM-SV-Protein) zu sein. PSA ist äußerst nützlich zum Überwachen der Therapie, insbesondere der Prostatektomie, da seine Anwesenheit nach Entfernung der Prostata auf fast Null verringert wird. Ein langsamer Anstieg in PSA nach der Prostatektomie zeigt an, dass entweder die gesamte Prostata entfernt ist oder dass Lymphknotenmetastasen vorliegen und das Antigen erzeugen. Die Konzentration des PSA ist auch der Tumorbelastung oder dem bösartigen Potential proportional und ändert sich schnell als Reaktion auf die Therapie. Eine Auflistung spezieller Serinproteasen-Enzyme und ihre allgemeinen Namen sind in der nachstehenden Tabelle III aufgelistet.
TABELLE III
Bevorzugte MS sind diejenigen, die durch Matrixmetalloproteinasen (MMPs) (EC 3.4.24.*, Unterklasse: Peptidase; Unter-Unterklasse: Metalloendopeptidase) verändert werden, Enzyme, die hohe Bioaktivität im extrazellulären Raum zeigen, einem Gewebekompartiment, das für Kontrastmittel leicht zugänglich ist. Außerdem wird die MMP-Wirkung durch viele Erkrankungen verändert. In unterschiedlichen Maßen sind Mitglieder der MMP-Familie mit den folgenden Erkrankungen verknüpft: Krebs (besonders beim Abbau der extrazellulären Matrix vor Metastasierungen), Atherosklerose (besonders beim Abbau der faserigen Kappe von arteriosklerotischem Plaque, was zu Zerreißen, Thrombose und Myokardinfarkt oder instabiler Angina führt), rheumatoider Arthritis und Osteoarthritis (Zerstörung von Knorpelaggrecan und Kollagen), Periodontalerkrankung, Entzündung, Autoimmunerkrankung, Organtransplantat- Abstoßung, Ulzerationen (Hornhaut, Epidermis und Magen), Sklerodermie, Epidermolysis bullosa, Endometriose, Nierenerkrankung und Knochenerkrankung. Spezielle Metalloproteinase-Enzyme und ihre allgemeinen Namen sind in der nachstehenden Tabelle IV aufgelistet.
TABELLE IV
Im Fall, wo die Bioaktivität auf die abgezielt wird die enzymatische Wirkung ist, die durch MMP-1, einer Matrixmetalloproteinase, die bei bestimmten entzündlichen Erkrankungen erhöht ist, exprimiert wird, ist eine bevorzugte MS die Kohlenstoff-Stickstoff-Amidbindung, welche die Aminosäuren Glycin (Gly) und Isoleucin (Ile) verknüpft. Ein Beispiel eines Prodrugs, das eine Gly-Ile- Amidbindungs-MS-Stelle enthält, ist die Prodrugverbindung 2.
Den Fachleuten wird klar sein, dass andere Typen von MS (zum Beispiel Ester, Ether) durch geeignete Zielenzyme, wie diejenigen, die als Esterasen (EC 3.1.*.*) oder Etherhydrolasen (EC 3.3.*.*) kategorisiert sind, hydrolysiert werden und dass basierend auf dem Wissen über die Chemie des Zielenzyms dann optimale MS in das Prodrug eingebaut werden können.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, dass einer Veränderung der Modifikationsstelle eine zweite chemische Umsetzung folgt, um das aktivierte Kontrastmittel zu erzeugen. Neutrale oder negativ geladene PBMs sind gegenüber positiv geladenen PBMs für diejenigen Mittel, die zum Binden an HSA entworfen werden (siehe US-Patent Nr. 4,880,008) bevorzugt. So ist ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Aktivierung von Kontrastmitteln, die an HSA binden, eine sekundäre chemische Umsetzung, die einen positiv geladenen MS-Spaltungsrest in eine neutrale oder negativ geladene Gruppe überführt. Dies erhöht die Hydrophobie des Mittels (erhöhter log P) und erhöht gewöhnlich die HSA-Bindung.
D. Maskierungseinheit (MM)
Wenn sie in einem erfindungsgemäßem Prodrug vorliegt, wird eine MM von dem Prodrug abgespalten, wenn es bioaktiviert ist. Eine MM kann eine beliebige organische oder anorganische Einheit sein, welche die Proteinbindungsaffinität des Prodrugs im Vergleich zu dem bioaktivierten Kontrastmittel vermindert, wenn sie in das Prodrug in einer passenden Stellung eingebaut ist.
Beispiele geeigneter MMs schließen Polyethylenglycol, Dextran, Hyaluronsäure oder andere Substanzen ein, welche die Ladung oder Hydrophobie der Oberfläche der PBM verändern. Solche Materialien sind viel verwendet worden, um die Wechselwirkung von Materialien mit großem Molekulargewicht (zum Beispiel Polymeren, Proteinen oder Liposomen) mit zellulären Oberflächen im Blut zu verhindern. Zum Beispiel verhindert an Liposomen gebundenes Polyethylenglycol (PEG) die zelluläre Aufnahme in das retikuloendotheliale System, was zu einer verlängerten Zirkulation der Liposomen führt. Siehe D. Paphadjopoulos et al., Proceedings of the National Academy of Sciences (1991), 88, S. 11460–11464; T. M. Allen et al., Biochimica Biophysica Acta (1991), 1066, S. 29–36.
Für Prodrugkontrastmittel mit geringem Molekulargewicht (< 5000 Dalton) können hydrophile und/oder geladene Reste ebenso verwendet werden. Solche Reste können vernünftigerweise innerhalb der/des MM/Linkers positioniert werden, so dass sie effektiv die Proteinbindung maskieren, doch nach Bioaktivierung freigesetzt werden, und somit erlauben, dass das erhöhte Bindungsvermögen der IEM/PBM exprimiert wird. Für Kontrastmittel, die zum Binden an Serumproteine, wie HSA nach Bioaktivierung, entworfen werden, stellen hydrophile und/oder geladene Reste, wie Hydroxyl-, Amin- (oder Ammonium-), quartäre Amingruppen, bestimmte Aminosäuren (besonders Lysin, Arginin und Histidin), Sulfoxid, Phosphat, Sulfat, Carboxylat, Kohlenhydrat, Zucker und Metallchelate, in einfachen oder mehrfachen Konfigurationen potentiell effektive MMs dar.
Beispiele hydrophiler und/oder geladener Reste, welche die HSA-Bindungsaffinität beeinflussen, sind im Fachgebiet beschrieben. Die HSA-Bindung iodierter Röntgenkontrastmittel wird durch die kluge Substitution von Hydroxylgruppen kombiniert mit der Eliminierung von Carboxylatgruppen maskiert. Zum Beispiel bindet das Röntgenkontrastmittel Iodipamid mit hoher Affinität (> 98%) an HSA, während entsprechende neutrale iodierte Röntgenkontrastmittel, die modifiziert werden, um zahlreiche hydrophile Hydroxylgruppen zu enthalten, mit geringer Affinität (< 1%) an HSA binden. Siehe Radiocontrast Agents, M. Sovak, Hrsg., Springer-Verlag, New York (1984), Kapitel 1 "Chemistry of X-Ray Contrast Media", S. 23–125. Ebenso wird eine Verringerung der HSA-Bindungsaffinität für eine Reihe von Gallensäurederivaten bemerkt, wenn die Zahl hydrophiler Hydroxylgruppen erhöht wird. So bindet Lithocholsäure (Bindungskonstante = 2,0 × 10⁵) fester als Chenodesoxycholsäure (Bindungskonstante = 5,5 × 10⁴), die fester als Cholsäure (Bindungskonstante = 0,3 × 10⁴) bindet. Siehe Roda et al., J. Lipid Research (1982), 23, S. 490–495.
Es ist gezeigt worden, dass geeignet positionierte primäre, sekundäre oder tertiäre Amine die HSA-Bindungsaffinität bestimmter Antibiotika im Vergleich zu ähnlichen Arzneistoffen, denen diese Funktionalität fehlt, verringern. Dieser Effekt wird durch Daten veranschaulicht, die für einige neue Antibiotika, Enoxacin und NY-198, berichtet werden. Siehe E. Okezaki et al., Drug Metabolism and Disposition (1988), 16, S. 865–74. Es wurde berichtet, dass der Anteil dieser Verbindungen, die an HSA (f_b) gebunden wurden, im Vergleich zu den Analoga Miloxacin (f_b = 0,86) und Nalidixinsäure (f_b = 0,71), denen die Amingruppen fehlten, 0,35 bzw. 0,28 ist.
So stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Prodrugs zur Herstellung eines MRI- oder optischen Kontrastmittels bereit, das an einer besonderen Stelle modifiziert ist und das die Detektion einer spezifischen Bioaktivität innerhalb eines Gewebes ermöglicht, wobei das Prodrug durch eine niedrigere Proteinbindungsaffinität im Vergleich zu dem bioaktivierten Kontrastmittel gekennzeichnet ist; und das Prodrug eine Struktur aufweist, die ausgewählt ist aus: IEM-[(PBM)_m-[(MS)_n-(MM)_o]_p]_q;
wobei:
jede IEM eine Bild-verstärkende Einheit ist, die einen Komplex zwischen mindestens einem physiologisch verträglichen cyclischen oder acyclischen organischen Chelatbildner und einem oder mehreren Metallionen mit den Ordnungszahlen 13, 21–34, 39–42, 44–50 oder 57–83 umfasst, wobei die IEM ein oder zwei offene Koordinationsstellen aufweist;
jede PBM unabhängig eine Protein-bindende Einheit ist, die einen Arylrest umfasst, der in der Lage ist, innerhalb des Gewebes, das die zu detektierende Bioaktivität enthält, Protein zu binden;
jede MS unabhängig eine Modifikationsstelle ist, die entweder mindestens eine Bindung umfasst, die in vivo durch ein Enzym verändert werden kann oder die eine direkte Bindung zwischen PBM und MM oder zwischen IEM und MM ist;
jede MM unabhängig eine Maskierungseinheit ist, welche die Proteinbindungsaffinität des Prodrugs im Vergleich zu dem bioaktivierten Kontrastmittel herabsetzt;
und jedes m, n, o, p und q gleich oder verschieden ist; q, n, m und p größer oder gleich 1, aber nicht Null, sein können; und o größer oder gleich Null sein kann.
In den bevorzugten Prodrugs dieser Erfindung, umfasst die IEM ein DTPA-, DOTA-, DTPA-BMA- oder HP-DO3A-Chelat von Gd³⁺; die PBM umfasst eine oder mehrere der folgenden Strukturen:

wobei R einen aliphatischen Rest und/oder mindestens einen Arylring umfasst oder ein Peptid umfasst, das hydrophobe Aminosäurereste und/oder Substituenten mit oder ohne hydrophobe oder hydrophile Endgruppen enthält; und
die MS eine Bindung umfasst, die in vivo durch ein Hydrolase-Enzym verändert werden kann.
Vorzugsweise ist die MS eine Phosphor-Sauerstoff-Bindung, die in vivo durch ein Phosphatase-Enzym hydrolysiert werden kann, oder eine Amidbindung, die in vivo durch ein Metalloproteinase-Enzym oder ein Serinprotease-Enzym hydrolysiert werden kann. Gadoliniumkomplex 1, Gadoliniumkomplex 2 und Gadoliniumkomplex 10, die hier identifiziert werden, sind Beispiele bevorzugter Prodrugs.
III. Synthese
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können unter Verwendung herkömmlicher Verfahren synthetisiert werden. Vorteilhafterweise werden diese Verbindungen zweckmäßigerweise aus leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien synthetisiert. Viele Ausgangsmaterialien sind im Handel erhältlich, z. B. von Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI. Obgleich Verfahren für die Synthesen der erfindungsgemäßen Verbindungen Durchschnittsfachleuten auf dem Gebiet der organischen Synthese bekannt sind, werden die folgenden allgemeinen Verfahren zum Veranschaulichen dieser Synthesen dargelegt. Diese Verfahren sollten in keinerlei Weise als Begrenzung des Bereichs dieser Erfindung betrachtet werden.
Die Synthese von DTPA- und DOTA-Chelatbildnern, die mit organischen Substituenten, die verwendet werden, um das erhaltene Chelat kovalent mit Proteinen einschließlich monoklonaler Antikörper zu verknüpfen, modifiziert sind, ist in der Literatur beschrieben worden. Zum Beispiel wurde 1-(p-Isothiocyanatobenzyl)-DTPA durch Umsetzen des im Handel erhältlichen p-Nitrophenylalaninmethylesters (Aldrich Chemical) mit Ethylendiamin und anschließende Reduktion mit Boran, wobei das Triamin gebildet wurde, hergestellt. Alkylierung mit Bromessigsäure, gefolgt von einer Reduktion (H₂/Pd-C) und Umsetzung mit Thiophosgen ergibt das Isothiocyanat. Siehe M. W. Brechbiel et al., Inorganic Chemistry (1986), 25, S. 2772–2781. Chelatbildner, bei denen das DTPA-Kohlenstoffgrundgerüst mit einem Aminobutylrest, der von Lysin abgeleitet ist, substituiert worden ist, sind auch berichtet worden. Siehe J. P. L. Cox et al., J. Chemical Society Perkin Transactions I (1990), S.: 2567–2576. Ein synthetischer Ansatz für acetatsubstituierte DTPA-Moleküle über doppelte Alkylierung von p-Nitrophenylalanin ist auch beschrieben worden. Siehe M. A. Williams et al., Journal of Organic Chemistry (1993), 58, S. 1151–1158. Ebenso sind funktionalisierte makrocyclische DOTA-Moleküle ausgehend von Aminosäuren und gängigen Cyclisierungsverfahren hergestellt worden, die Richman-Atkins-Tosylat-Chemie (J. P. L. Cox et al., J. Chemical Society Perkin Transactions I (1990), S. 2567–2576) oder Ringbildung unter starker Verdünnung (T. J. McMurry et al., Bioconjugate Chemistry (1992), S. 108–117) einschließen.
Die Synthese hepatobiliärer MRI-Kontrastmittel, die lipophile Benzylsubstituenten enthalten, ist im US-Patent Nr. 4,899,755 beschrieben. MRI-Kontrastmittel, die PBMs und Bluthalbwertszeitverlängernde Einheiten enthalten, werden in US-Anmeldung Ser.-Nr. 08/382,317 (eingereicht am 1. Februar 1995), veröffentlicht als WO96/23526, beschrieben. Diese Anmeldung beschreibt die Synthese von DTPA-Chelatbildnern, die über Phosphodiesterbindungen mit PBMs verknüpft sind, sowie die Synthese einiger vielseitig verwendbarer Zwischenprodukte, die kohlensaures Hydroxymethyldiethylentriamin, Verbindung 3, und 1-Hydroxymethyl-DTPA-penta-t-butylester, Verbindung 4, einschließen (Schema 1).
Andere vielseitig verwendbare Synthesezwischenprodukte zur Herstellung von Prodrugkontrastmitteln schließen 1-p-Hydroxybenzyldiethylentriamin (Verbindung 6) ein. Siehe G. Schuhmann-Giampieri, Radiology (1992), 183, S. 59–64. Verbindung 6 wird durch Alkylierung mit t-Butylbromacetat in 1-(p-Hydroxybenzyl)-DTPA-penta-t-butylester, Verbindung 7, überführt (Schema 1):
Schema 1: Synthesezwischenprodukte
Das Carbamat 5 oder die Penta-t-butylesterzwischenprodukte 4 und 7 werden in einem einzigen Schritt mit PBM-Resten derivatisiert, welche die gewünschten funktionellen Bereiche (MS, MM, L) sowie funktionelle Gruppen einbauen, von denen im Fachgebiet bekannt ist, dass sie kovalente Bindungen mit Hydroxyl- oder Phenolgruppen bilden (zum Beispiel werden Ether durch Umsetzung von Alkylhalogeniden mit Alkoholen oder durch Diazodicarbonsäurediethylester-(DEAD-)katalysierte Umsetzung mit einem zweiten Alkohol gebildet). Siehe J. March, Advanced Organic Chemistry, 3. Auflage, John Wiley & Sons (1995), S. 1161 für weitere geeignete Umsetzungen und kovalente Bindungen. In einer anderen Ausführungsform werden die MS- und möglichen MM- und/oder L-Bereiche der PBM in schrittweiser Form zugesetzt. Zum Beispiel wird eine PBM, die ein reaktives Alkylhalogenid und eine zweite geeignet geschützte reaktive Gruppe (z. B. eine Hydroxyl- oder Carboxylatgruppe) enthält, an den DTPA-Penta-t-butylester über Bildung einer Etherbindung gekuppelt. Vorübergehender Schutz reaktiver Gruppen kann durch im Fachgebiet bekannte Möglichkeiten erreicht werden. Siehe z. B. T. W. Greene und P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Auflage ©1991, John Wiley and Sons, Inc., New York, NY auf S. 10–276. Es wird dann die zweite reaktive Gruppe entschützt und modifiziert, um die gewünschte MS oder sowohl eine MS als auch eine MM zuzufügen. Abschließende Schutzgruppenabspaltung der Schutzgruppen von dem t-Butylester unter Verwendung von Säure (HCl oder TFA) führt zum freien Pentasäureliganden, der dann mit Gadolinium(III) und Base umgesetzt wird, wobei der Gadoliniumkomplex gebildet wird.
Wie es vom Fachmann verstanden werden kann, sollen die vorstehenden Syntheseschemata keine umfassende Liste aller Möglichkeiten umfassen, durch welche die in dieser Anmeldung beschriebenen und beanspruchten Verbindungen synthetisiert werden können. Weitere Verfahren werden Durchschnittsfachleuten offensichtlich sein.
IV. Verwendung der verbesserten Kontrastmittel
Es wird in Erwägung gezogen, dass Arzneimittel hergestellt werden können, die beliebige erfindungsgemäße Prodrugs oder pharmazeutisch verträgliche Salze davon zusammen mit einem beliebigen pharmazeutisch verträglichen Träger, Hilfsstoff oder Vehikel umfassen. Der Begriff "pharmazeutisch verträglicher/s Träger, Hilfsstoff oder Vehikel" betrifft einen Träger oder Hilfsstoff, der zusammen mit einer erfindungsgemäßen Verbindung an einen Patienten verabreicht werden kann und der deren Wirkung nicht zerstört und ungiftig ist, wenn er in Dosen verabreicht wird, die ausreichen, um eine wirksame Menge des Mittels abzugeben. Pharmazeutisch verträgliche Träger, Hilfsstoffe und Vehikel, die in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln verwendet werden können, schließen Ionenaustauscher, Aluminiumoxid, Aluminiumstearat, Lecithin, Serumproteine, wie menschliches Serumalbumin, Puffersubstanzen, wie Phosphate, Glycin, Sorbinsäure, Kaliumsorbat, TRIS (Tris(hydroxymethyl)aminomethan), partielle Glyceridgemische von gesättigten pflanzlichen Fettsäuren, Wasser, Salze oder Elektrolyte, wie Protaminsulfat, Dinatriumhydrogenphosphat, Kaliumhydrogenphosphat, Natriumchlorid, Zinksalze, kolloidales Siliciumdioxid, Magnesiumtrisilikat, Polyvinylpyrrolidon, Substanzen auf Cellulosebasis, Polyethylenglycol, Natriumcarboxymethylcellulose, Polyacrylate, Wachse, Polyethylen-Polyoxypropylen-Blockpolymere, Polyethylenglycol und Wollfett ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Gemäß dieser Erfindung können die Arzneimittel in Form einer sterilen injizierbaren Zubereitung, zum Beispiel einer sterilen injizierbaren wässrigen oder ölhaltigen Suspension vorliegen. Diese Suspension kann gemäß Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, unter Verwendung geeigneter Dispergier- oder Netzmittel und Suspendiermittel formuliert werden. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem ungiftigen parenteral verträglichen Verdünnungs- oder Lösungsmittel, zum Beispiel als Lösung in 1,3-Butandiol, sein. Zu den verträglichen Vehikeln und Lösungsmitteln, die verwendet werden können, gehören Wasser, Ringer-Lösung und isotope Natriumchloridlösung. Außerdem werden herkömmlicherweise sterile, fette Öle als Lösungsmittel oder Suspendiermedium verwendet. Zu diesem Zweck kann ein beliebiges mildes fettes Öl einschließlich synthetischer Mono- oder Diglyceride verwendet werden. Fettsäuren, wie Ölsäure und ihre Glyceridderivate, sind bei der Herstellung von Injectabilia verwendbar, wie es natürliche pharmazeutisch verträgliche Öle, wie Olivenöl oder Rizinusöl, besonders in ihren polyoxyethylierten Versionen sind. Diese Öllösungen oder -Suspensionen können auch ein langkettiges Alkoholverdünnungsmittel oder -dispergiermittel enthalten.
In einigen Fällen können in Abhängigkeit von der Dosis und Injektionsgeschwindigkeit die Bindungsstellen an Plasmaproteinen mit Prodrug und aktiviertem Mittel gesättigt werden. Dies führt zu einem verminderten Anteil an Protein-gebundenem Mittel und könnte seiner Halbwertszeit oder Verträglichkeit sowie der Wirksamkeit des Mittels schaden. Unter diesen Umständen ist es wünschenswert, das Prodrug-Mittel zusammen mit einer sterilen Albumin- oder Plasmaersatzlösung zu injizieren. In einer anderen Ausführungsform kann eine Apparatur/Spritze verwendet werden, die das Kontrastmittel enthält und es mit Blut, das in die Spritze aufgezogen wurde, mischt; dieses wird dann dem Patienten wieder injiziert.
Die erfindungsgemäßen Prodrug-Verbindungen und Arzneimittel können oral, parenteral, durch Inhalationsspray, topisch, rektal, nasal, bukkal, vaginal oder über ein implantiertes Vorratsgefäß in Dosierungsformulierungen, die herkömmliche ungiftige pharmazeutisch verträgliche Träger, Hilfsstoffe und Vehikel enthalten, verabreicht werden. Der Begriff "parenteral" wie er hier verwendet wird, schließt subkutane, intravenöse, intramuskuläre, intraartikuläre, intrasynoviale, intrasternale, intrathekale, intrahepatische, intraläsionale und intrakranielle Injektions- oder Infusionsverfahren ein.
Wenn sie oral verabreicht werden, können die erfindungsgemäßen Arzneimittel in einer beliebigen oral verträglichen Darreichungsform verabreicht werden, die Kapseln, Tabletten, wässrige Suspensionen oder Lösungen einschließt, aber nicht darauf beschränkt ist. Im Fall von Tabletten zur oralen Verwendung, schließen Träger, die häufig verwendet werden, Lactose und Maisstärke ein. Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, werden typischerweise auch zugesetzt. Zur oralen Verabreichung in Kapselform schließen verwendbare Verdünnungsmittel Lactose und getrocknete Maisstärke ein. Wenn wässrige Suspensionen zur oralen Verwendung erforderlich sind, wird der Wirkstoff mit Emulgier- und Suspendiermitteln kombiniert. Falls gewünscht, können auch bestimmte Süß-, Geschmack- oder Farbstoffe zugesetzt werden.
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen Arzneimittel, wenn sie in Form von Zäpfchen zur rektalen Verabreichung verabreicht werden, durch Mischen des Mittels mit einem geeigneten nicht reizenden Excipienten hergestellt werden, das bei Raumtemperatur fest, aber bei Rektaltemperatur flüssig ist und deshalb im Rektum schmelzen wird, wobei der Arzneistoff abgegeben wird. Solche Materialien schließen Kakaobutter, Bienenwachs und Polyethylenglycole ein. Wie vorstehend vermerkt ist, können die erfindungsgemäßen Arzneimittel auch topisch verabreicht werden, besonders wenn das Ziel der Behandlung Flächen oder Organe, die durch topische Anwendung leicht erreichbar sind, einschließlich des Auges, der Haut oder des unteren Intestinaltrakts einschließt. Geeignete topische Formulierungen werden für jede dieser Flächen oder Organe leicht hergestellt.
Topische Anwendung für den unteren Intestinaltrakt kann in einer rektalen Zäpfchenformulierung (siehe vorstehend) oder in einer geeigneten Klistierformulierung bewirkt werden. Topisch-transdermale Pflaster können auch verwendet werden.
Für topische Anwendungen können die Arzneimittel in einer geeigneten Salbe formuliert werden, die den in einem oder mehreren Trägern suspendierten oder gelösten Wirkstoff enthält. Träger für topische Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen schließen Mineralöl, flüssige Vaseline, weiße Vaseline, Propylenglycol, Polyoxyethylen, Polyoxypropylenverbindung, selbstemulgierendes Wachs und Wasser ein, aber sind nicht darauf beschränkt. In einer anderen Ausführungsform können die Arzneimittel in einer geeigneten Lotion oder Creme formuliert werden, welche die in einem oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Träger suspendierten oder gelösten Wirkstoffe enthält. Geeignete Träger schließen Mineralöl, Sorbitanmonostearat, Polysorbat 60, Cetylesterwachs, Cetearylalkohol, 2-Octyldodecanol, Benzylalkohol und Wasser ein, aber sind nicht darauf beschränkt.
Für die Anwendung am Auge können die Arzneimittel als mikronisierte Suspensionen in isotoner, steriler Kochsalzlösung mit eingestelltem pH-Wert oder vorzugsweise als Lösungen in isotoner, steriler Kochsalzlösung mit eingestelltem pH-Wert entweder mit oder ohne Konservierungsmittel, wie Benzylalkoniumchlorid, formuliert werden. In einer anderen Ausführungsform für Anwendungen am Auge können die Arzneimittel in einer Salbe, wie Vaseline, formuliert werden.
Für die Verabreichung durch Nasenaerosol oder Inhalation werden die erfindungsgemäßen Arzneimittel gemäß Verfahren, die im Gebiet der pharmazeutischen Formulierung bekannt sind, hergestellt und können als Lösungen in Kochsalzlösung unter Verwendung von Benzylalkohol oder anderen geeigneten Konservierungsmitteln, Absorptionsbeschleunigern zum Verbessern der Bioverfügbarkeit, Fluorkohlenwasserstoffen und/oder anderen herkömmlichen Solubilisierungs- oder Dispergiermitteln hergestellt werden.
Die Wirkstoffmenge, die mit den Trägermaterialien kombiniert werden kann, um eine Einzeldarreichungsform zu erzeugen, wird in Abhängigkeit von dem behandelten Wirt und der besonderen Verabreichungsart variieren. Eine typische Zubereitung wird etwa 5% bis etwa 95% wirksame Verbindung (Gew./Gew.) enthalten. Vorzugsweise enthalten solche Zubereitungen etwa 20% bis etwa 80% wirksame Verbindung.
Für intravenöse und andere Arten der Verabreichung liegen verträgliche Dosisbereiche zwischen 0,001 und 1,0 mmol/kg Körpergewicht, wobei die bevorzugte Dosis der Wirkstoffverbindung zwischen 0,001 und 0,5 mmol/kg Körpergewicht liegt. Sogar noch stärker bevorzugt ist zwischen 0,01 und 0,1 mmol/kg und die am stärksten bevorzugte Dosis der Wirkstoffverbindung liegt zwischen 0,02 und 0,05 mmol/kg.
Wie der Fachmann verstehen wird, können geringere oder höhere Dosen als diejenigen, die vorstehend aufgezählt sind, erforderlich sein. Spezielle Dosierungsvorschriften für einen besonderen Patienten werden von den verschiedensten Faktoren abhängen, welche die Wirkung der speziellen verwendeten Verbindung, das Alter, das Körpergewicht, den allgemeinen Gesundheitszustand, das Geschlecht, die Ernährung, die Verabreichungszeit, die Ausscheidungsgeschwindigkeit, die Arzneistoffkombination und das Urteil des behandelnden Arztes einschließen.
Selbstverständlich sind die bevorzugten Arzneimittel diejenigen, welche die bevorzugten erfindungsgemäßen Prodrugs umfassen.
Damit diese Erfindung besser verstanden werden kann, werden die folgenden Beispiele dargelegt. Diese Beispiele dienen nur Veranschaulichungszwecken und sollen den Bereich dieser Erfindung in keinerlei Weise beschränken. In jedem der Beispiele wird HSA als Protein verwendet, an welches das bioaktivierte Kontrastmittel bindet.
BEISPIELE
Beispiel Ia: Synthese des Gadoliniumkomplexes 1
Zuerst wird Carbamat 5 mit dem Mono(diallylphosphat)ester von 4,4'-Dihydroxybiphenyl in Gegenwart von Azodicarbonsäurediethylester und Triphenylphosphin umgesetzt, wobei ein Ether gebildet wird (Schema 2). Nach Schutzgruppenabspaltung (TFA) und Alkylierung mit Brom-t- butylacetat wird die Schutzgruppe aus dem Phosphat mit Palladiumtetrakis(triphenyl)phosphin abgespalten. Die t-Butylester werden mit Trifluoressigsäure hydrolysiert. Umsetzung mit GdCl₃ und Natriumhydroxid erzeugt den Gadoliniumkomplex 1. Schema 2: Synthese des Gd-Komplexes 1
a) DEAD, PPh₃; b) TFA; c) BrCH₂CO₂-t-Bu; d) Pd(Ph₃P)₄, n-BuNH₂, HCO₂H; e) TFA; f) GdCl₃, NaOH
Beispiel Ib: Stärker bevorzugte Synthese des Gd-Komplexes 1
Zuerst wurde Boronsäure 13 in drei Schritten aus p-Bromphenol hergestellt (Schema 2a). Das Phenol wurde als tert.-Butyldimethylsilylether geschützt. Behandlung des Arylbromids mit Butyllithium erzeugte ein Aryllithium. Umsetzung des Aryllithiums mit Triisopropylborat, gefolgt von der Hydrolyse des Boratesterzwischenprodukts unter Verwendung milder saurer Bedingungen erzeugt Boronsäure 13. Schema 2a: Synthese der Boronsäure 13
a) t-BuMe₂SiCl, Imidazol, THF; b) n-BuLi, –78°C, THF; c) (i-PrO)₃B, THF, dann H₃O⁺
Mitsunobu-Reaktion zwischen dem Zwischenprodukt 5 und Bromphenol ergab den Ether 14. Schutzgruppenabspaltung der drei BOC-Gruppen mit Trifluoressigsäure, gefolgt von einer Alkylierung des Triamins mit tert.-Butylbromacetat ergab das Pentaacetat 15. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium-Kupplung (Suzuki-Kupplung) des Arylbromids 15 mit der Boronsäure 13 führte zum Biphenylderivat 16. Hydrolyse des Silylethers, gefolgt von einer Phosphorylierung und alkalische Hydrolyse des erhaltenen Phosphoryldichlorids erzeugte das Monophosphat 17. Die t-Butylester wurden mit Trifluoressigsäure entschützt. Umsetzung mit GdCl₃ und Natriumhydroxid erzeugte den Gadoliniumkomplex 1 (Schema 2b). Schema 2b: Stärker bevorzugte Synthese des Gd-Komplexes 1
d) p-Bromphenol, DEAD, PPh₃, THF; e) TFA; f) BrCH₂CO₂tBu, i-Pr₂NEt, DMF; g) 13, (PPh₃)₄Pd, Na₂CO₃, Toluol, MeOH, H₂O, Δ; h) POCl₃, Et₃N, dann H₂O/OH^–; i) TFA; j) GdCl₃, NaOH
Beispiel IIa: Synthese des Gadoliniumkomplexes 2
Carbamat 5 wird mit dem Methyl-5-bromsalicylat in Gegenwart von Azodicarbonsäurediethylester und Triphenylphosphin umgesetzt, wobei der Bromarylether gebildet wird. Tetrakis(triphenylphosphin)palladium-katalysierte Kupplung des Bromarylethers mit Phenylboronsäure ergibt den Biphenylether. Hydrolyse des t-Butylcarbamats mit Trifluoressigsäure und anschließende Alkylierung mit t-Butylbromacetat erzeugt das Biphenylether-substituierte Penta-t-butyldiethylentriaminpentaacetat. Hydrolyse des Methylesters mit 1 N NaOH in Dioxan ergibt das Biphenylcarboxylat, das mit dem Peptidfragment H₂N-Gly-Ile-Arg(BOC)₂-Lys(BOC)-OtBu unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylformamid gekuppelt wird. Hydrolyse in 6 N HCl/Dioxan erzeugt die Biphenylpeptid-substituierte Diethylentriaminpentaessigsäure. Umsetzung mit GdCl₃ und Base ergibt den Gadoliniumkomplex 2, der durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt wird (Schema 3a). Schema 3a: Synthese des Gadoliniumkomplexes 2
a) Methyl-5-Bromsalicylat, DEAD, PPh₃; b) ArB(OH)₂, Na₂CO₃, (Ph₃P)₄Pd; c) TFA; d) BrCH₂CO₂tBu, iPr₂NEt; e) NaOH, H₂O/Dioxan; f) H₂N-Gly-Ile-Arg(BOC)₂-Lys(BOC)-OtBu, DCC; g) HCl/Dioxan; h) GdCl₃, Base.
Beispiel IIb: Stärker bevorzugte Synthese des Gd-Komplexes 2
Carbamat 5 wurde mit Methyl-5-bromsalicylat in Gegenwart von Azodicarbonsäurediethylester und Triphenylphosphin unter Bildung eines Bromarylethers umgesetzt. Hydrolyse des Methylesters, gefolgt von einer Behandlung mit Chlorameisensäurebenzylester und Triethylamin in Gegenwart einer katalytischen Menge Dimethylaminopyridin führte zum Benzylester 18. Entschützung der drei BOC-Gruppen mit Trifluoressigsäure und anschließende Alkylierung mit tert.-Butylbromacetat erzeugte das Bromarylether-substituierte Penta-tert.-butyldiethylentriaminpentaacetat 19. Suzuki-Kupplung des Bromarylethers mit Phenylboronsäure ergab den Biphenylether. Hydrogenolyse des Benzylesters in Gegenwart von Palladiumkatalysator ergab das Biphenylcarboxylat 20. Kupplung von 20 mit Benzylglycinat, gefolgt von einer Hydrogenolyse des Benzylesters ergab das Amid 21. Kupplung von 21 mit dem geschützten Tripeptid, H₂N-Ile-Arg(BOC)₂-Lys(BOC)-OtBu, unter Verwendung von Dicyclohexylcarbodiimid in DMF und anschließende Schutzgruppenabspaltung des t-Butylesters und der BOC-Gruppen mit TFA führte zum Tetrapeptid 22. Umsetzung mit GdCl₃ in Gegenwart von Natriumhydroxid ergab den Komplex 2, der durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt wird (Schema 3b). Schema 3b: Stärker bevorzugte Synthese des Gd-Komplexes 2
a) Methyl-5-bromsalicylat, DEAD, PPh₃, THF; b) 2 N KOH (wässr.), MeOH; c) ClCO₂Bn, Et₃N, DMAP, CH₂Cl₂; d) TFA; e) BrCH₂CO₂tBu, i-Pr₂NEt, DMF; f) Ph-B(OH)₂, (PPh₃)₄Pd, Na₂CO₃, Toluol, MeOH, H₂O, Δ; g) H₂, Pd, C, MeOH; h) H₂NCH₂CO₂Bn, DCC, CH₂Cl₂; 1) H₂, Pd, C, MeOH; j) H₂N-Il3-Arg(BOC)₂-Lys(BOC)-OtBu, DCC, HOBt, DMF; k) TFA; i) GdCl₃, NaOH.
Beispiel IIIa: Aktivierung der Prodrugverbindung 1
Prodrug 1 wird durch alkalisches Phosphat aktiviert, wie es nachstehend gezeigt ist. Aktiviertes Kontrastmittel 8, das durch Hydrolyse der MS (Phosphor-Sauerstoff-Bindung) erzeugt wird, bindet bei einer Konzentration von 0,1 mM an HSA mit größerer Affinität als Prodrug 1. Die erhöhte Relaxivität resultiert aus einer Verkürzung von T₁, die als Zunahme in der Signalintensität in einem MRI-Bild nachgewiesen wird.
Aktivierung der Prodrugverbindung 1
Beispiel IIIb: Stärker bevorzugte Aktivierung der Prodrugverbindung 1
Verbindung 1 (siehe Beispiele Ib und IIIa) wurde synthetisiert, wie es in Beispiel Ib beschrieben ist. Prodrug 1 wurde durch alkalische Phosphatase aktiviert (siehe Beispiel IIIa Aktivierung des Prodrugs 1), welche die MS (Phosphor-Sauerstoff-Bindung) unter Bildung aktivierten Kontrastmittels 8 hydrolysiert. Verbindung 8 band bei einer Konzentration von 0,1 mM an HSA mit größerer Affinität als Prodrug 1 und mit einer höheren Relaxivität. Die höhere Relaxivität resultierte aus einer Verkürzung von T₁, die als Zunahme in der Signalintensität in einem MRI-Bild nachgewiesen wurde (Siehe nachstehende Tabelle V).
TABELLE V Relaxivität und Prozent Bindung an HSA
In Tabelle V wurden die longitudinalen Relaxivitäten (R₁) bei 20 MHz und 37°C durch Bestimmen der konzentrationsabhängigen Relaxationsgeschwindigkeit (1/T₁) von Wasserprotonen in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 150 mM NaCl, 10 mM Phosphat, pH = 7,4) oder in PBS-Lösungen, die 4,5% menschliches Serumalbumin (HSA) enthielten, erhalten. Das Prozent Bindung an HSA wurde durch Ultrafiltration einer 0,1 mM Chelat-Lösung mit 4,5% HSA bestimmt.
Eine Lösung des Prodrugs 1 (0,3 mM) wurde in PBS-Puffer (pH 7), der 4,5% HSA enthielt, hergestellt. Keine Änderung in der Protonen-Relaxationsgeschwindigkeit 1/T₁ bei 20 MHz wurde mit der Zeit beobachtet. Drei Einheiten alkalische Phosphatase (1 Einheit überführt 1 nmol p-Nitrophenylphosphat in p-Nitrophenol pro Minute in phosphatgepufferter Kochsalzlösung bei 0,1 mM Substrat) wurden der Lösung der Verbindung 1 mit 4,5% HSA zugesetzt und der 1/T₁-Wert wurde gegenüber der Zeit überwacht. Es wurde beobachtet, dass sich der 1/T₁-Wert für die Lösung änderte, wenn 1 enzymatisch in 8 überführt wurde (Tabelle VI. Nach Abschluss der enzymatischen Aktivierung von 1 zu 8 betrug die Änderung in 1/T₁ vom Zeitpunkt Null aus 2,86 sec^–1, was einer ungefähr erwarteten Zunahme in der Signalintensität von 24% entspricht.
TABELLE VI Bioaktivierung des Prodrugs 1 bei 20 MHz
Lösungen von 4,5% HSA enthaltenden Verbindungen 1 und 8 (0,1–0,2 mM) wurden hergestellt. Nach 15 Minuten wurde eine Ausgangs-T₁-gewichtete MRI-Abtastung (FISP-3D, TR = 60, TE = 5, α = 60) bei 1,0 Tesla der Lösungen mit 4,5% HSA erhalten. Die MRI-Abtastungen der 8 enthaltenden Lösungen waren heller als die der 1 enthaltenden Lösungen bei äquivalenten Konzentrationen. Drei Einheiten alkalische Phosphatase wurden der Hälfte der 1 enthaltenden HSA-Lösungen zugesetzt und zusätzliche T₁-gewichtete MRI-Abtastungen wurden erhalten. Nach 130 Minuten erhielten die Lösungen, die 1 und alkalische Phosphatase enthielten, 96% der Signalintensität für die Lösungen, die 8 bei äquivalenten Konzentrationen enthalten. Die Lösungen, die 1 ohne alkalische Phosphatase enthielten, verblieben als konstant dunkle Bilder während der MRI-Abtastungen. Eine 20%ige Zunahme in der Signalintensität wurde nach Zugabe alkalischer Phosphatase zu 1 enthaltenden Lösungen beobachtet.
Beispiel IV: Aktivierung des Gadoliniumkomplexes 2
Prodrug 2, das eine hydrophile Isoleucin-Arginin-Lysin-Seitenketten-MM enthält, wird durch Kollagenase (MMP-1) aktiviert. Die MS ist eine Kohlenstoff-Stickstoff-Peptidbindung, die selektiv durch MMP-1 (Gly-Ile) hydrolysiert wird. Freisetzung der Ile-Arg-Lys-MM erzeugt Verbindung 9, die durch höhere Bindungsaffinität zu HSA als das Prodrug 2 gekennzeichnet ist. Das veränderte Signal in dem MRI erlaubt, die Bioaktivität bildlich darzustellen.
Aktivierung des Gadoliniumkomplexes 2
Beispiel V: Aktivierung des Gadoliniumkomplexes 10
Dieses Beispiel zeigt auch, wie eine sekundäre chemische Umsetzung an einen primären mit der Bioaktivität zusammenhängenden Vorgang gekuppelt wird. Prodrug 10, das eine MM enthält, die aus dem Tripeptid tmLys-tmLys-Arg (wobei tmLys Nε,Nε,Nε-Trimethyllysin bedeutet) zusammengesetzt ist, wird durch Serinprotease aktiviert. Die MS ist die Arg-Glu-Kohlenstoff-Stickstoff-Peptidbindung, die durch Serinproteinase-enzymatische Bioaktivität gespalten wird, wobei die Maskierungseinheit freigesetzt wird. Der enzymatischen Hydrolyse unter Bildung der Zwischenverbindung 11 folgt eine sekundäre chemische Umsetzung (intramolekulare Cyclisierung) mit einem aliphatischen oder aktivierten Ester (z. B. R = p-Nitrophenyl). Dieser überführt die positiv geladene PBM-Einheit in 11 in das lipophilere, stärker HSA-gebundene, neutrale Lactamderivat 12.
Aktivierung der Prodrugverbindung 10
Beispiel VI: Verabreichung von Prodrugkontrastmitteln
Prodrugverbindung 2, ein MMP-Substrat, wird durch chemische und Peptid-Verfahren synthetisiert, die im Fachgebiet bekannt und vorstehend beschrieben sind. Eine Formulierung mit dem pH-Wert 7,0 in Wasser wird hergestellt und sterilisiert.
Die Formulierung wird einem Patienten, bei dem ein oder mehrere Tumoren vermutet werden, intravenös injiziert. Die verwendete Dosierung beträgt 0,025 mmol/kg. 15 Minuten nach der Injektion werden T₁-gewichtete MRI-Abtastungen des Körperbereichs erhalten, der im Verdacht steht, Tumoren zu enthalten. Massen, die auf den Bildern hell erscheinen, sind wahrscheinlicher bösartige Tumoren als gutartige.
Genau diese Formulierung wird einem Patienten, bei dem rheumatoide Arthritis in einem oder mehreren Gelenken vermutet wird, intravenös injiziert. Die verwendete Dosierung beträgt 0,025 mmol/kg. 15 Minuten nach der Injektion werden T₁-gewichtete MRI-Abtastungen der Gelenke des Körpers erhalten, die in Verdacht stehen, Arthritis zu enthalten. Gelenke, die auf den Bildern hell erscheinen, enthalten wahrscheinlicher eine aktive Entzündung.
Die gleiche Formulierung wird einem Patienten mit Atherosklerose in einer oder mehreren Arterien intravenös injiziert. Die verwendete Dosierung beträgt 0,025 mmol/kg. 15 Minuten nach der Injektion werden T₁-gewichtete MRI-Abtastungen (Querschnitts-Abtastungen oder MR-Angiographie) der Arterien erhalten. Arteriosklerotischer Plaque, der hell verstärkt ist, ist wahrscheinlicher instabiler Plaque, wird wahrscheinlich zerreißen und an dem Organ, das die Arterie versorgt, Ischämie verursachen.

Claims

Verwendung eines Prodrugs zur Herstellung eines MRI- oder optischen Kontrastmittels, welches an einer besonderen Stelle modifiziert ist und die Detektion einer spezifischen Bioaktivität innerhalb eines Gewebes ermöglicht, wobei das Prodrug durch eine niedrigere Proteinbindungsaffinität im Vergleich zu dem bioaktivierten Kontrastmittel gekennzeichnet ist; und das Prodrug, welches eine Struktur aufweist, ausgewählt ist aus: IEM-[(PBM)_m-[(MS)_n-(MM)_o]_p]_q;
wobei: jede IEM eine Bild-verstärkende Einheit ist, die einen Komplex zwischen mindestens einem physiologisch verträglichen cyclischen oder acyclischen organischen Chelatbildner und einem oder mehreren Metallionen mit den Ordnungszahlen 13, 21–34, 39–42, 44–50 oder 57–83 umfasst, wobei die IEM ein oder zwei offene Koordinationsstellen aufweist; jede PBM unabhängig eine Protein-bindende Einheit ist, umfassend einen Arylrest, welcher in der Lage ist, innerhalb eines Gewebes, das die zu detektierende Bioaktivität enthält, Protein zu binden; jede MS unabhängig eine Modifikationsstelle ist, die entweder mindestens eine Bindung, welche in vivo durch ein Enzym verändert werden kann, oder eine direkte Bindung zwischen PBM und MM oder zwischen IEM und MM ist; jede MM unabhängig eine Maskierungseinheit ist, welche die Proteinbindungsaffinität des Prodrugs im Vergleich zu dem bioaktivierten Kontrastmittel herabsetzt; und jedes m, n, o, p und q gleich oder verschieden ist; q, n, m und p größer oder gleich 1, aber nicht Null, sein können; und o größer oder gleich Null sein kann.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Metallion für den Komplex der IEM ein paramagnetisches Metallion ist, ausgewählt aus Gd(III), Fe(III), Mn(II), Mn(III), Cr(III), Cu(II), Dy(III), Tb(III), Ho(III), Er(III) und Eu(III).
Verwendung gemäß Anspruch 2, wobei das paramagnetische Metallion Gd(III) ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Komplex ein Bildungskonstante von größer als 10¹⁰ M^–1 aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 4, wobei der Komplex ein Bildungskonstante von größer als 10¹⁵ M^–1 aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 5, wobei der Komplex ein Bildungskonstante von größer als 10²⁰ M^–1 aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei der Chelatbildner für den Komplex der IEM aus DTPA, DOTA, DTPA-BMA und HP-DO3A ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die PBM aus Arzneistoffen, lipophilen und amphiphilen organischen Molekülen, Porphyrinen, Rezeptorliganden, Steroiden, Lipiden, Hormonen, Peptiden, Proteinen, Oligonukleotiden und Antikörpern ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Prodrug für mehr als ein Gewebeprotein eine niedrigere Affinität als die bioaktivierte Form des Kontrastmittels aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Prodrug eine niedrigere Affinität als die bioaktivierte Form des Kontrastmittels für ein Protein aus Plasma, Interstitialraum, Synovialflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Entzündungs-flüssigkeit, Abszessflüssigkeit oder Intrazellularraum aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 10, wobei das Protein aus menschlichem Serumalbumin, Fettsäure-bindendem Protein, Glutathion-S-transferase, alpha-1-Säureglycoprotein, Lipoproteinen, Strukturproteinen der extrazellularen Matrix, Amyloid, Ceroid und Glycoproteinen ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei das Protein ein alpha-1-Säureglycoprotein ist.
Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei das Protein aus menschlichem Serumalbumin, Fettsäure-bindendem Protein und Glutathion-S-transferase ausgewählt ist.
Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei das Protein menschliches Serumalbumin ist.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei mindestens 10% des bioaktivierten Kontrastmittels unter physiologisch relevanten Bedingungen an menschliches Serumalbumin bindet.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei mindestens 50% des bioaktivierten Kontrastmittels unter physiologisch relevanten Bedingungen an menschliches Serumalbumin bindet.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei mindestens 80% des bioaktivierten Kontrastmittels unter physiologisch relevanten Bedingungen an menschliches Serumalbumin bindet.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei mindestens 95% des bioaktivierten Kontrastmittels unter physiologisch relevanten Bedingungen an menschliches Serumalbumin bindet.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Bindungsaffinität des Prodrugs für menschliches Serumalbumin weniger als 80% der Bindungsaffinität des bioaktivierten Kontrastmittels beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Bindungsaffinität des Prodrugs für menschliches Serumalbumin weniger als 50% der Bindungsaffinität des bioaktivierten Kontrastmittels beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Bindungsaffinität des Prodrugs für menschliches Serumalbumin weniger als 40% der Bindungsaffinität des bioaktivierten Kontrastmittels beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Bindungsaffinität des Prodrugs für menschliches Serumalbumin weniger als 20% der Bindungsaffinität des bioaktivierten Kontrastmittels beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Bindungsaffinität des Prodrugs für menschliches Serumalbumin weniger als 10% der Bindungsaffinität des bioaktivierten Kontrastmittels beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Relaxivität (R₁) des Prodrugs 80% oder weniger der Relaxivität (R₁) des bioaktivierten Kontrastmittels beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Relaxivität (R₁) des Prodrugs 50% oder weniger der Relaxivität (R₁) des bioaktivierten Kontrastmittels beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Relaxivität (R₁) des Prodrugs 20% oder weniger der Relaxivität (R₁) des bioaktivierten Kontrastmittels beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei die Relaxivität (R₁) des Prodrugs 10% oder weniger der Relaxivität (R₁) des bioaktivierten Kontrastmittels beträgt.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei eine PBM mindestens zwei Arylringe umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Prodrugkontrastmittel zwei PBMs umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 29, wobei die PBMs jeweils mindestens einen Arylring umfassen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei eine PBM mindestens eine Struktur umfasst, ausgewählt aus:

wobei R einen aliphatischen Rest und/oder mindestens einen Arylring umfasst, oder ein Peptid umfasst, welches hydrophobe Aminosäurereste und/oder Substituenten mit oder ohne hydrophobe oder hydrophile Endgruppen enthält.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine MS in vivo durch ein Enzym, ausgewählt aus Oxidoreduktasen, Transferasen, Hydrolasen, Lyasen, Isomerasen, Ligasen, Metalloproteinasen, Proteinasen, Serinproteasen, Phosphatasen, Phospholipasen, Esterasen und Sulfatasen, verändert wird.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die MS eine Phosphor-Sauerstoff-Bindung ist, welche geeignet ist, in vivo durch ein Phosphatase-Enzym hydrolysiert zu werden.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die MS eine Amidbindung ist, welche geeignet ist, in vivo durch ein Metalloproteinase-Enzym oder ein Serinprotease-Enzym hydrolysiert zu werden.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die MM Polyethylenglycol umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die MM eine hydrophile und/oder geladene Gruppe, ausgewählt aus einer Hydroxyl-, Amin-, Ammonium-, quartären Amin-, Aminosäure-, Sulfoxid-, Phosphat-, Sulfat-, Carboxylat-, Kohlenwasserstoff-, Zuckergruppe und Metallchelatverbindung, umfasst.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die IEM eine DTPA-, DOTA-, DTPA-BMA- oder HP-DO3A-Chelatverbindung von Gd³⁺ umfasst; die PBM mindestens eine Struktur umfasst, ausgewählt aus den nachstehenden Strukturen:
wobei R einen aliphatischen Rest und/oder mindestens einen Arylring umfasst, oder ein Peptid umfasst, welches hydrophobe Aminosäurereste und/oder Substituenten mit oder ohne hydrophobe oder hydrophile Endgruppen enthält; und die MS eine Bindung umfasst, welche in vivo durch ein Hydrolase-Enzym verändert werden kann.
Verwendung gemäß Anspruch 37, wobei die MS eine Phosphor-Sauerstoff-Bindung ist, welche in vivo durch ein Phosphatase-Enzym hydrolysiert werden kann.
Verwendung gemäß Anspruch 37, wobei die MS eine Amidbindung ist, welche in vivo durch ein Metalloproteinase-Enzym oder ein Serinprotease-Enzym hydrolysiert werden kann.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Prodrug die nachstehende Struktur aufweist:
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Prodrug die nachstehende Struktur aufweist:
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Prodrug die nachstehende Struktur aufweist:
wobei R ein aliphatischer oder aktivierter Ester ist.