-
Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines
makromolekularen Mikrogenpolymers durch Verwendung von DNA-Polymerase.
-
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
-
Das
Erscheinen der molekularen Evolutions-Biotechnologie ermöglichte
es, ein Enzym (Protein), das die Grundlage für Lebensreaktionen bildet,
oder ein Gen, das dieses codiert, in Labors zu erzeugen. Mit Hilfe dieser
Technologie kann man ein Enzym (Protein) mit einer neuen Aktivität, die in
der Natur nicht vorkommt, produzieren, und man erwartet, dass es
bei verschiedenen Anwendungen auf den Gebieten der Medizin und der
Biotechnologie verwendet werden kann.
-
Ein
Enzym (Protein) oder ein Gen, das es codiert, besteht aus einem
Polymer von Aminosäuren
bzw. Nukleotiden als Blockeinheit. Bei der molekularen Evolutions-Biotechnologie
wird ein Molekül
mit der gewünschten
Aktivität
aus einem Pool von Polymeren ausgewählt, die aus statistischen
Aminosäure- oder Nukleotid-Blockeinheiten
bestehen.
-
Selbst
wenn man versucht, Polymere mit jeder Kombination herzustellen,
gibt es jedoch eine Grenze der physikalischen Menge an Verbindungen,
die sich synthetisieren lässt,
so dass es eine Grenze für
die Anzahl der Blöcke
gibt, die sich verbinden lassen, und folglich lässt sich kein Protein oder
Gen erzeugen, das zu groß ist.
Bei der Berücksichtigung
eines In-vitro-Evolutionssystems
zur Translation eines Proteins aus einem Nukleinsäurepolymer
ist das Auftreten des "Stopp-Codons", das die Translation
beendet, ein großes
Problem. Daher wird ein Mikrogen, das einigermaßen groß ist, vorzugswei se als Blockeinheit
verwendet, so dass ein Gen gebildet wird, das ein großes Protein
codiert.
-
Es
besteht daher die Hypothese, dass ein großes Gen durch wiederholtes
Polymerisieren eines kleinen Gens (Mikrogens) (S. Ohno & J. T. Epplen,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 3391–3395) entsteht. Da man annimmt,
dass ein Polypeptid, das reich an einer einfachen Wiederholungsstruktur
ist, leicht eine stabile Sekundärstruktur
haben kann, erfordert die molekulare Evolutions-Biotechnologie,
die auf große
Proteine oder Gene gerichtet ist, die Techniken der wiederholten
Polymerisierung einer kurzen Struktureinheit zur Synthese eines
Makromoleküls
(Nature 367: 323–324,
1994).
-
Zur
Zeit wird das Syntheseverfahren des rollenden Kreises als Verfahren
zur Herstellung eines Polymers, welches aus einer kurzen wiederholten
DNA-Einheit besteht, beschrieben (PNAS 92: 4641–4645, 1995).
-
Dieses
Verfahren sollte eine Vielzahl von Schritten durchlaufen, wie u.
a. Phosphorylierungsreaktion, Verbindungsreaktion, Polymerisationsreaktion,
die Reaktion zur Bildung der doppelsträngigen Kette, weshalb sein
kompliziertes Reaktionssystem problematisch ist.
-
Unter
diesen Umständen
muss ein Reaktionssystem entwickelt werden, bei dem ein Genpolymer leichter
gebildet werden kann.
-
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
-
Die
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines
Verfahrens zur effizienten und einfachen Bildung eines Polymers,
das aus einem sich wiederholenden Mikrogen besteht.
-
Die
Erfinder haben aufgrund ihrer gründlichen
Forschung entdeckt, dass ein makromolekulares Mikrogenpolymer effizient
und einfach gebildet werden kann, indem man DNA-Polymerase auf Oligonukleotide,
deren 3'-terminale
Sequenzen zumindest partiell komplementär zueinander sind, einwirken
lässt,
und vollendeten so die vorliegende Erfindung.
-
Demnach
ist die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer
doppelsträngigen
DNA, die eine DNA-Doppelstrangkette
als Wiederholungseinheiten aufweist, umfassend:
- a)
Zulassen, dass die DNA-Polymerase auf zwei Oligonukleotide, deren
3'-terminale Sequenzen
Bereiche aufweisen, die zueinander komplementär sind, einwirkt, wobei die
beiden Oligonukleotide nur in dem Teil ihres komplementären Abschnitts
eine Doppelstrang-Kette bilden, so dass eine Polymerasekettenreaktion durchgeführt werden
kann, wobei zumindest eines der beiden Oligonukleotide an seinem
3'-Ende ein bis drei
Nukleotide enthält,
die kein Basenpaar mit dem anderen Oligonukleotid bilden können, damit
eine DNA mit Doppelstrangkette erhalten wird, und
- b) Polymerisieren der DNA mit Doppelstrang-Kette durch Fortsetzen
der PCR, damit eine doppelsträngige DNA
mit kontinuierlichen Wiederholungseinheiten erhalten wird.
-
Die
DNA-Polymerase enthält
Exonukleasen, insbesondere solche, die in 3'→5'-Richtung wirken.
Zudem ist die DNA-Polymerase
vorzugsweise thermostabil.
-
Bei
dem Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen makromolekularen
Mikrogenpolymers enthalten die 3'-Enden
von Oligonukleotid A und/oder Oligonukleotid B zumindest ein Nukleotid,
das kein Basenpaar mit dem anderen Oligonukleotid bilden kann.
-
KURZE BESCHREIBUNG DER
ZEICHNUNGEN
-
Es
zeigt/zeigen:
-
1 bis 1c, eine
schematische Darstellung, das erfindungsgemäße Verfahren;
-
2,
eine Photographie, das Ergebnis der Agarosegelelektrophorese;
-
3 die
durch das erfindungsgemäße Verfahren
synthetisierten Gene;
-
4,
eine Photographie, das Ergebnis der Agarosegelelektrophorese;
-
5,
eine Photographie, das Ergebnis der Agarosegelelektrophorese;
-
6,
eine Photographie, das Ergebnis der Agarosegelelektrophorese;
-
7,
eine Photographie, das Ergebnis der Agarosegelelektrophorese;
-
8,
eine Photographie, das Ergebnis der Agarosegelelektrophorese;
-
9 die
durch das erfindungsgemäße Verfahren
synthetisierten Gene;
-
10,
eine Photographie, die Ergebnisse der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
-
EINGEHENDE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
-
Nachstehend
wird die vorliegende Erfindung eingehend beschrieben.
-
Der 1a zufolge
werden zwei Oligonukleotide (Oligonukleotide A und B), deren 3'-terminale Sequenzen
zumindest partiell komplementäre
Bereiche aufweisen, vor der erfindungsgemäßen Durchführung der Polymerasekettenreaktion
syn thetisiert. In der vorliegenden Erfindung werden die Oligonukleotide
A und B derart synthetisiert, dass ihre 3'-terminalen
Sequenzen komplementär
zueinander sind. Die Anzahl der Oligonukleotide, die eine zueinander
komplementäre
Kette bilden, ist vorzugsweise mindestens 6, stärker bevorzugt mindestens 8,
obwohl es keine besondere Einschränkung gibt.
-
Außerdem werden
die Oligonukleotide A und B so synthetisiert, dass die 3'-Enden der Oligonukleotide A
und/oder B ein oder mehrere Nukleotide (vorzugsweise 1 bis 3 Nukleotide)
enthalten, die keine Basenpaare mit dem anderen Oligonukleotid bilden
können.
Durch diese Vorgehensweise kann die Effizienz der Reaktion erhöht werden.
-
Weil
außerdem
eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Erzeugung eines vollständig neuen
Genpolymers ist, das in der Natur nicht vorkommt, sind die beiden
Oligonukleotide nicht besonders eingeschränkt und können insofern willkürlich ausgewählt werden,
als ihre 3'-terminalen
Sequenzen zumindest partiell komplementär zueinander sind. Die synthetisierten
Oligonukleotide bilden nur in dem Teil ihres komplementären Bereichs
eine doppelsträngige
Kette.
-
Der
Begriff "komplementär", wie er hier verwendet
wird, kann nicht nur das Verhältnis
zwischen Adenin und Thymidin oder Guanin und Cytosin betreffen,
sondern auch das Verhältnis
zwischen Guanin und Thymidin oder dergleichen, insofern als die
Oligonukleotide A und B zumindest partiell komplementär zueinander
sind.
-
Die
Oligonukleotide A und B wirken als Primer, mit denen die PCR an
ihrem komplementären
Bereich (eine doppelsträngige
Kette in 1a) gestartet wird, wobei die
einzelsträngige
Kette (d. h. diejenige, die keine doppelsträngige Kette mit Oligonukleotid
B bildet) von Oligonukleotid A als Matrize zur Synthese von Oligonukleotid
B wirkt, und die einzelsträngige
Kette (d. h. diejenige, die keine doppelsträngige Kette mit Oligonukleotid A
bildet) von Oligonukleotid B als Matrize zur Synthese von Oligonukleotid
A wirkt (1a). Wird die PCR durchgeführt, indem
man eine thermostabile DNA-Polymerase mit 3'→5'-Exonuklease-Aktivität auf die
beiden Oligonukleotide einwirken lässt, wird doppelsträngige DNA
als sich wiederholende Einheit (1b) gebildet. Durch
weiteres Fortsetzen der PCR wird eine große DNA, die aus kontinuierlichen
Wiederholungseinheiten besteht, synthetisiert (1c).
-
Die
PCR mittels Polymerase (beispielsweise Taq-Polymerase) erfolgt über die Durchführung von
1 Zyklus bei 94°C
für 10
bis 120 sek., jeweils 30 bis 65 Zyklen bei 69°C für 10 bis 120 sek. und 1 Zyklus
bei 3 bis 7 min.
-
Zur
effizienten Durchführung
der PCR wird vorzugsweise eine zusätzliche Reaktion bei 94°C für 10 min
und bei 69°C
für 10
min durchgeführt,
bevor die vorstehenden Zyklen ausgeführt werden.
-
Auf
diese Weise dient der komplementäre
Teil der 2 Oligonukleotide als Selbstprimer, und das andere Oligonukleotid
dient als Matrize zu ihrer Synthese, was zur Polymerisation der
DNA mit einer doppelsträngigen DNA-Kettte
als Wiederholungseinheit (1b) mit
einer äußerst großen Kopienzahl
in der gleichen Richtung führt
(1c). Erfindungsgemäß kann der Ersatz, die Insertion
und/oder Deletion einiger Nukleotide insofern zwischen den Wiederholungseinheiten
auftreten, als die Wiederholungseinheiten eine komplementäre Kette bilden.
-
BEISPIELE
-
Nachstehend
wird die vorliegende Erfindung eingehender anhand der Beispiele
beschrieben, die jedoch den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung
nicht einschränken
sollen.
-
Beispiel 1
-
KY-794
(Seq.-ID.-Nr. 1) und KY-795 (Seq.-ID.-Nr. 2) wurden als Oligonukleotide
A bzw. B zur Verwendung bei der PCR synthetisiert. Die synthetisierten
Oligonukleotide A und B bestanden aus 22 bzw. 23 Nukleotiden, wobei
ihre 3'-terminalen 8 Nukleotide
komplementär
zueinander waren (die Sequenz an den Positionen 15 bis 22 in KY-794
war komplementär
zur Sequenz an den Positionen 15 bis 22 in KY-795). Adenin (A) wurde zum
3'-Ende von KY-795
zur Verhinderung der Bildung eines Basenpaars mit KY-704 dazu gegeben.
-
Die
Bedingungen für
die PCR mit den vorstehenden Oligonukleotiden in einem 50 μl Reaktionsvolumen
sind wie folgt:
| KY-794
(Seq.-ID.-Nr. 1) | 20
pmol |
| KY-795
(Seq.-ID.-Nr. 2) | 20
pmol |
| dNTP | 350 μM |
| MgCl2 | 1,75
mM |
| Tris-HCl,
pH-Wert 9,2 | 50
mM |
| (NH4)2SO4 | 14
mM |
| Taq-Polymerase | 2,6
Einheiten/50 μl |
-
Die
verwendete Taq-Polymerase war ein Gemisch aus Taq-Polymerase und Pwo-Polymerase,
das in ExpandTM Long Template PCR-System
(Boehringer) enthalten ist.
-
Die
PCR wurde mittels 9600 oder 2400 PCR-System (Perkin Elmer) für die Zyklus-Reaktion
unter den folgenden Bedingungen durchgeführt:
| 94°C | 10
min |
| 69°C | 10
min |
| (94°C für 10 sek.
und 69°C
für 60
sec) × 45
Zyklen | |
| 69°C | 7
min |
-
Das
Enzym wurde dazu gegeben, als das System 94°C erreichte.
-
Das
unter diesen Bedingungen erhaltene PCR-Produkt wurde einer 1,2%
Agarosegelelektrophorese unterworfen.
-
Das
Ergebnis ist in der 2 gezeigt.
-
Aus
der 2 geht hervor, dass DNA mit einigen Kilobasenpaaren
oder mehr in diesem Verfahren polymerisiert werden kann.
-
Das
so erhaltene Polymer wurde in den Plasmid-Vektor pTZ19R (Mead et
al., Protein Eng. 1: 67–74 (1986))
kloniert. Für
4 Klone (pSA32, pSA33, pYT5 und pYT8) wurden die Insertionsfragmente
mit einem Sequenziergerät
(Perkin Elmer) sequenziert.
-
Die
Ergebnisse sind in der 3 gezeigt. Die Nukleotidsequenzen,
die für
die jeweiligen Klone bestimmt wurden, sind in der Seq.-ID.-Nr. 3
für pSA32,
Seq.-ID.-Nr. 4 für
pSA33, Seq.-ID.-Nr. 5 für
pYT5 und Seq.-ID.-Nr. 6 für
pYT8 gezeigt.
-
In
der Seq.-ID.-Nr. 3 sind die Sequenzen an den Positionen 1 bis 36,
an den Positionen 40 bis 75 und an den Positionen 77 bis 112 identisch
zueinander. Daher versteht es sich, dass ein Polymer synthetisiert
wurde, in dem viele dop pelsträngige
Ketten als Wiederholungseinheiten mit jeweils 37 Basenpaaren, die
von KY-794 und KY-795 hergeleitet sind, in der gleichen Richtung
verbunden wurden. Dies gilt für
die Seq.-ID.-Nr. 4 bis 6.
-
In
der 3 bedeutet "p" das Fehlen des entsprechenden
Nukleotids im Verbindungsbereich der Wiederholungseinheiten, die
jeweils aus der von den Oligonukleotiden hergeleiteten Sequenz bestanden,
und die unterstrichenen Nukleotide sind ein Insert unbekannten Ursprungs
in dem Verbindungsbereich der Wiederholungseinheiten.
-
Beispiel 2
-
In
der in Beispiel 1 gezeigten Reaktion (2) hatte
das 3'-Ende von
KY-795 ein Nukleotid, das kein Basenpaar mit KY-794 bilden konnte.
In diesem Beispiel erfolgte die Polymerisation mit der Kombination
der Oligonukleotide KY-783 (Seq.-ID.-Nr. 7) und KY-794, d. h. mit
der Kombination, die keinen solchen Mismatch bildet.
-
Die
PCR-Bedingungen waren identisch zu denjenigen in Beispiel 1. Das
unter diesen Bedingungen erhaltene PCR-Produkt wurde einer 1,2% Agarosegelelektrophorese
unterworfen.
-
Das
Ergebnis ist in der 4 gezeigt.
-
Aus
der 4 geht hervor, dass die Effizienz der Polymerisation
verbessert wird, wenn mindestens ein Nukleotid, das kein Basenpaar
mit dem anderen Oligonukleotid bilden kann, am 3'-Ende des Oligonukleotids vorhanden
ist (4, Spur 2).
-
Beispiel 3
-
Der
5 zufolge
haben KY-794 und KY-795 einen komplementären Bereich von 8 Basen. Bei
diesem Beispiel wurde die Polymerisation mittels Oligonukleotid
KY-845 (Seq.-ID.-Nr. 8) und Oligonukleotid KY-846 (Seq.-ID.-Nr.
9) durchgeführt,
deren komplementärer
Bereich aus 6 Nukleotiden bestand, der um 2 Basen kürzer als
oben ist. Die Zusammensetzung der Reaktionslösung war die gleiche wie in
Beispiel 2, außer
dass die PCR unter den folgenden Zyklusbedingungen 1 oder 2 durchgeführt wurde: Bedingungen
1
| 94°C | 10
min |
| 63°C | 10
min |
| (94°C für 10 sek.
und 63°C
für 60
sec) × 45
Zyklen | |
| 63°C | 7
min |
Bedingungen
2
| 94°C | 10
min |
| 66°C | 10
min |
| (94°C für 10 sek.
und 66°C
für 60
sec) × 45
Zyklen | |
| 66°C | 7
min |
-
Die
unter diesen Bedingungen erhaltenen PCR-Produkte wurden einer 1,2%
Agarosegelelektrophorese unterworfen.
-
Die
Ergebnisse sind in der 5 gezeigt.
-
In 5 wurden
die Spuren 2 und 3 unter den Bedingungen 1 und die Spuren 4 und
5 unter den Bedingungen 2 erhalten.
-
Aus
den Spuren 1 und 2 in 5 ist ersichtlich, dass die
Polymerisationsreaktion durch Senken der Annealing-Temperatur der PCR-Zyklen
auf 63°C
sogar durch die Kombination der Oligonukleotide mit einem komplementären Bereich
von nur 6 Basen fortschreitet.
-
Beispiel 4
-
In
diesem Beispiel wurde die thermostabile DNA-Polymerase mit der 3'→5'-Exonuklease-Aktivität als Enzym
für die
PCR verwendet. Die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität ist zur
Erhöhung
der Polymerisationseffizienz wichtig. Folglich wurde die Bedeutung
der 3'→5'-Exonuklease-Aktivität mittels
thermostabiler DNA-Polymerase untersucht, der die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität fehlte.
-
Die
verwendeten Oligonukleotide waren KY-794 (Seq.-ID.-Nr. 1) und KY-785
(Seq.-ID.-Nr. 2). Die PCR-Reaktionslösung hatte die gleiche Zusammensetzung
wie in Beispiel 1, außer
dass das Enzym 1,9 Einheiten/50 μl
der thermostabilen Polymerase Pfu-DNA-Polymerase, die bei Stratagene
kommerziell erhältlich ist,
oder Exo-Pfu-DNA-Polymerase, der mutmaßlich die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität fehlt,
aufwies. Die PCR wurde unter den gleichen Zyklusbedingungen durchgeführt wie
in Beispiel 1. Das unter diesen Bedingungen erhaltene PCR-Produkt
wurde einer 2% Agarosegelelektrophorese unterworfen.
-
Das
Ergebnis ist in der 6 gezeigt.
-
Der 6 zufolge
wurde die Polymerisationseffizienz gesenkt, wenn Exo-Pfu-DNA-Polymerase,
der mutmaßlich
die 3'→5'-Exonuklease-Aktivität fehlte,
verwendet wurde (Spur 3) und zwar verglichen mit dem Fall, bei dem
Pfu-DNA-Polymerase mit der 3'→5'-Exonuklease-Aktivität verwendet
wurde (Spur 2)
-
Beispiel 5
-
In
diesem Beispiel erfolgte die Polymerisation mit Oligonukleotiden
verschiedener Sequenzen.
-
Der 7 zufolge
hat die Kombination von KY-794 (Seq.-ID.-Nr. 1) und KY-795 (Seq.-ID.-Nr.
2) und die Kombination von KY-808 (Seq.-ID.-Nr. 10) und KY-809 (Seq.-ID.-Nr.
11) die gleiche Anzahl (= 8) an Nukleotiden, die eine komplementäre Kette
bilden, jedoch unterscheiden sie sich stark hinsichtlich der Nukleotid-Zusammensetzung
des komplementären
Bereichs.
-
KY-827
(Seq.-ID.-Nr. 12), KY-828 (Seq.-ID.-Nr. 13), KY-829 (Seq.-ID.-Nr. 14) und KY-830 (Seq.-ID.-Nr. 15)
sind partiell modifizierte Sequenzen von KY-794 (Seq.-ID.-Nr. 1),
und KY-381 (Seq.-ID.-Nr. 16), KY-832 (Seq.-ID.-Nr. 17), KY-833 (Seq.-ID.-Nr.
18), KY-834 (Seq.-ID.-Nr. 19) und KY-835 (Seq.-ID.-Nr. 20) sind partiell modifizierte
Sequenzen von KY-795 (Seq.-ID.-Nr. 2).
-
Die
PCR wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 durchgeführt, indem
die folgenden Kombinationen verwendet wurden: KY-794 (Seq.-ID.-Nr.
1) und KY-795 (Seq.-ID.-Nr.
2); KY-808 (Seq.-ID.-Nr. 10) and KY-809 (Seq.-ID.-Nr. 11); KY-827
(Seq.-ID.-Nr. 12) und KY-795 (Seq.-ID.-Nr. 2); KY-828 (Seq.-ID.-Nr. 13)
und KY-795 (Seq.-ID.-Nr. 2); KY-829 (Seq.-ID.-Nr. 14) und KY-795
(Seq.-ID.-Nr. 2); KY-830 (Seq.-ID.-Nr. 15)
und KY-795 (Seq.-ID.-Nr. 2); KY-794 (Seq.-ID.-Nr. 1) und KY-831
(Seq.-ID.-Nr. 16); Ky (Seq.-ID.-Nr. 1) und KY-832 (Seq.-ID.-Nr. 17); KY-794 (Seq.-ID.-Nr.
1) und KY-833 (Seq.-ID.-Nr. 18); KY-794 (Seq.-ID.-Nr. 1) und KY-834
(Seq.-ID.-Nr. 19);
und KY-794 (Seq.-ID.-Nr. 1) und KY-835 (Seq.-ID.-Nr. 20). Die unter diesen Bedingungen
erhaltenen PCR- Produkte
wurden einer 2% Agarosegel-Elektrophorese unterworfen.
-
Die
Ergebnisse sind in den 7 und 8 gezeigt.
-
Aus
den 7 und 8 ist ersichtlich, dass sich
die Effizienzen unterscheiden, aber die Polymerisationsreaktion
in einer beliebigen Kombination der verwendeten Oligonukleotid-Sequenzen fortläuft.
-
Beispiel 6
-
Damit
die Sequenz des resultierenden Polymers Diversität aufweist, wurde die Polymerisation
mit einem partiell randomisierten Oligonukleotid durchgeführt. KY-812
(Seq.-ID.-Nr. 21) und KY-795 (Seq.-ID.-Nr. 2) wurden als Primer
verwendet. KY-812 (Seq.-ID.-Nr. 21) ist ein Oligonukleotid, das
derart synthetisiert wurde, dass sich A, T, G oder C an den Positionen
3 und 11 befinden. Die PCR-Reaktion wurde auf die gleiche Weise wie
in Beispiel 1 durchgeführt.
Nach der Reaktion wurde das resultierende Polymer in den Plasmid-Vektor pTZ19R
kloniert. Für
die 4 Klone (pYT15, pYT16, pYT20 und pYT21) wurden deren Insertionsfragmente
sequenziert.
-
Die
Ergebnisse sind in der Tabelle 9 angegeben. Die für die entsprechenden
Klone bestimmten Sequenzen sind in Seq.-ID.-Nr. 22 für pYT15, Seq.-ID.-Nr. 23 für pYT16,
Seq.-ID.-Nr. 24 für
pYT20 und Seq.-ID.-Nr. 25 für
pYT22 gezeigt.
-
Aus
der 9 geht hervor, dass als Base an der Position 3
C bevorzugt wird, wohingegen A, T, G oder C als Base an der Position
11 erschienen, so dass der Sequenz des Polymers Diversität verliehen
wurde.
-
Beispiel 7
-
Das
von dem resultierenden Polymer codierte Protein kann in E. coli
exprimiert werden. Das durch die Kombination von KY-794 (Seq.-ID.-Nr.
1) und KY-795 (Seq.-ID.-Nr. 2) erhaltene Polymer, und das durch
die Kombination von KY-812 (Seq.-ID.-Nr. 21) und KY-795 (Seq.-ID.-Nr. 2)
erhaltene Polymer wurden jeweils in den Expressionsvektor pET23b
kloniert, so dass die Rekombinanten pYT32 und pYT33 erhalten wurden.
Die Proteine, die von den durch pYT32 und pYT33 codierten Polymeren
hergeleitet wurden, wurden in E. coli BL21 (DE3) exprimiert, und
ihr Zellextrakt wurde durch SDS-Polyacrylamind-Gelelektrophorese auf einem 15 bis 25%
Gradientengel analysiert.
-
Die
Ergebnisse sind in der 10 gezeigt. Die Molekulargewichtsmarker
sind 97400, 66267, 42400, 30000, 20100 und 14000.
-
Aus
der 10 geht hervor, dass Proteine mit einem Molekulargewicht
mit etwa 16 kDa, die von den Polymeren hergeleitet werden, exprimiert
werden.
-
Wie
vorstehend erläutert
lässt sich
ein Polymer, das aus einem Wiederholungsmikrogen besteht, effizient
und einfach erfindungsgemäß herstellen.
-
-
-
-
-
-