DE69732114T2

DE69732114T2 - Verfahren zum nachweis von autoimmunkrankheiten

Info

Publication number: DE69732114T2
Application number: DE69732114T
Authority: DE
Inventors: Michael Clare-Salzler
Original assignee: University of Florida; University of Florida Research Foundation Inc
Current assignee: University of Florida Research Foundation Inc
Priority date: 1996-08-23
Filing date: 1997-08-22
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2017-08-23
Also published as: NZ525200A; ES2234028T3; US5939069A; US6218133B1; EP1535614A2; US6168792B1; NZ507110A; US6953578B2; ATE286255T1; AU4160097A; NZ333831A; WO1998008101A1; JP2001503251A; CA2259310A1; EP0920632A1; US20010021510A1; DE69732114D1; EP1535614A3; PT920632E; EP0920632B1

Description

Hintergrund der Erfindung
Diabetes ist ein Sammelausdruck für Krankheiten, die sich aus einem gestörten Energiestoffwechsel und unterschiedlichen Graden an erhöhter Blutglucose oder Hyperglykämie ergeben. Eine der am besten charakterisierten Formen der Krankheit ist die Krankheitsform, die aus einer immunologisch vermittelten Zerstörung der Insulin sezernierenden, pankreatischen β-Zellen entsteht. Diese schwere Form der Krankheit wird als insulinabhängiger Diabetes (IDD oder IMD) bezeichnet, da sie mit einem zunehmenden Insulinmangel und damit einhergehenden Symptomen, wie Gewichtsverlust, Glycosurie und Polyurie, und verstärktem Durst oder Polydipsie verbunden ist. Andere Ausdrücke für diese Form von Diabetes sind Diabetes vom Typ 1 (Diabetes vom Typ 2 ergibt sich aus einer gegebenen Resistenz gegen die Wirkung von Insulin), "Ketosis Prone Diabetes" aufgrund der abnormalen Erzeugung von Ketokörpern als Ergebnis eines übermäßigen Abbaus von Körperfetten aufgrund des schweren Insulinmangels; oder Diabetes juvenilis, da praktisch sämtliche Diabetesfälle, die in der Kindheit und in der Jugend auftreten, diesem Typ angehören.
Diabetes ist ein wichtiges gesundheitliches Problem, insbesondere in westlichen Ländern. Die Fallraten variieren weltweit stark, von einer hohen Rate von 40 Fällen pro 100000 Personen in Finnland bis zu einer niedrigen Rate von 1 bis 2 Fällen pro 100000 Personen bei den Japanern. Das Maximum tritt während der Pubertätsjahre auf, in Verbindung mit den steigenden Bedürfnissen des Körpers nach Insulin in Zusammenhang mit dem Muskelwachstum. Die Verbreitung in der Bevölkerung der Vereinigten Staaten bei Personen unter 20 Jahren beträgt 0,25% und erreicht im gesamten Leben 0,4%, obgleich schätzungsweise 10–20% von Patienten mit nicht-insulinabhängigem Diabetes (NIDD) oder Typ 2-Diabetes oder erst im reiferen Alter einsetzenden Diabetes in Wirklichkeit einen langsam fortschreitenden IDD darstellen. Somit sind schätzungsweise mindestens 1 Million Amerikaner von IDD betroffen.
Diabetes führt zu einer zunehmenden Schädigung der Blutgefäße des Körpers, deren Ausmaß von der Schwere der Hyperglykämie und deren Dauer abhängt. Bezüglich der Sterblichkeitsrate bei IDD wurde im Vergleich zu altersmäßig übereinstimmenden, nicht-diabetischen Kontrollpersonen ein 7-fach höherer Wert berechnet. Obgleich die jahrzehntelange "Diabetes Control and Complications Trial"-Maßnahme (DCCT), die im Jahre 1994 vom NIH (National Institutes of Health) in den Vereinigten Staaten beendet wurde, ergab, dass eine peinlich genaue Insulin-Ersatztherapie das Auftreten von geschädigten Arterien verlangsamt, war es nicht möglich, diese Schädigung vollständig zu verhindern, da es schwierig war, die Blutglucosespiegel innerhalb normaler Grenzen zu halten. Augenkomplikationen bei Diabetes sind die hauptsächliche Ursache für Neuerblindungen bei Personen im Alter von 20 bis 74 Jahren. Die Gefahr einer Amputation der unteren Extremitäten ist bei Diabetikern 15-fach höher. Bei etwa 40% der Personen mit Nierentransplantationen liegt ein Nierenversagen aufgrund von Diabetes vor, wobei der Anteil aufgrund von Diabetes von Jahr zu Jahr steigt. Bei Diabetikerinnen beträgt die Sterblichkeit von Neugeborenen 5%. Zu weiteren Komplikationen bei Diabetes gehören vermehrte Fälle von Herzerkrankungen und Schlaganfällen, Verlust an Nervenzellen oder Neuronen unter Denervierung von Gliedmaßen und Darm, Impotenz und Unfruchtbarkeit, Katarakt in den Augenlinsen, vermehrte periodontale Krankheiten und Neigung zu infektiösen Krankheiten, insbesondere aufgrund von Bakterien und Hefen. Von sämtlichen Diabetespatienten ist bei solchen mit IDD ein unverhältnismäßig großer Anteil von diesen Komplikationen betroffen, was auf die Schwere und üblicherweise das frühe Einsetzen der Krankheit zurückzuführen ist. In den Vereinigten Staaten werden die auf Diabetes zurückzuführenden direkten Kosten des Gesundheitswesens im Jahre 1994 auf mehr als 120 Milliarden Dollar geschätzt. Somit ist es von Bedeutung, die Pathogenese von IDD zu kennen und Strategien zu entwickeln, um einen vollständigen klinischen Ausbruch der Krankheit zu verhindern.
Patienten mit IDD sind in ungewöhnlicher Weise anfällig für andere Krankheiten, die als Krankheiten mit autoimmuner Herkunft erkannt worden sind. Zu diesen Krankheiten gehören Thyroiditis oder Hashimoto-Krankheit, Graves-Krankheit, Addison-Krankheit, atrophische Gastritis und perniziöse Anämie, Zöliakie und Vitiligo (N. K. Maclaren, Diabetes Care, Bd. 8 (suppl.) (1985), S. 34–38). Beweise dafür, dass IDD selbst von autoimmuner Natur ist, erlangte man erstmals mit histologischen Untersuchungen von Patienten. Diese Untersuchungen ergaben, dass die Inseln mit einem chronisch entzündlichen (lymphozytischen) Infiltrat infiltriert waren (Insulitis). Dieser Befund wurde in den frühen 1970' Jahren gestützt durch Berichte über Inselzell-Autoantikörper, die gegenüber Antigenen reaktiv sind und sich innerhalb des Zytoplasmas befinden (ICA) (Lendrum et al., Lancet, Bd. 1 (1975), S. 880–882) oder auf die Inselzell-Oberflächen beschränkt sind (ICSA) (Maclaren et al., Lancet, Bd. 1 (1975), S. 977–1000), wie durch indirekte Immunofluoreszenz nachweisbar ist. Später hat man erkannt, dass zahlreiche Patienten auch vor der Diagnosestellung schon Autoantikörper gegen Insulin (IAA) entwickeln (Palmer et al., Science, Bd. 222 (1983), S. 1337–1339) sowie auch gegen Insulinrezeptoren (Maron et al., Nature, Bd. 303 (1983), S. 817–818). Über Autoantikörper gegen eine Inselzell-Proteinzusammensetzung mit einem Molekulargewicht von 64000 wurde auch beim Menschen (Baekkeskov et al., Nature, Bd. 298 (1982), S. 167–169), beim Biobreeding (BB)-Rattenmodell (Baekkeskov et al., Science, Bd. 224 (1984), S. 1348–1350) und beim "Non Obese Diabetic (NOD)-Mäusemodell (Atkinson und Maclaren, Diabetes, Bd. 37 (1988), S. 1587–1590) berichtet. Später wurde angegeben, dass ein 64 kDa-Antigen die Isoform mit niedrigerem Molekulargewicht von Glutaminsäure-decarboxylase darstellt (GAD₆₅) (Baekkeskov et al., Nature, Bd. 347 (1990), S. 151–156) (Kauffman et al., J. Clin. Invest., (1992), S. 283–292). GAD ist ein Enzym, das Glutamat in den membranstabilisierenden Neurotransmitter mit der Bezeichnung gamma-Aminobuttersäure oder GABA umwandelt. Zusätzlich zu den Antikörpern gegen GAD wurde von peripheren mononuklearen Blutzellen gezeigt, dass sie bei Patienten, die IDD entwickeln, autoreaktiv sind (Atkinson und Maclaren et al., Lancet, Bd. 339 (1992), S. 458–459; und Harrison et al., Lancet, Bd. 341 (1993), S. 1365–1369).
Bei mehreren Autoimmunkrankheiten, einschließlich IDD, systemischem Lupus erythematosus (SLE), rheumatoider Arthritis (RA), multipler Sklerose (MS) und Autoimmun-Thyroid-Krankheit, wurde gezeigt, dass Antigen-präsentierende Zellen (APCs), wie Monozyten und Makrophagen in ihrer Fähigkeit zur Aktivierung von T-Lymphozyten funktionsgestört sind (C. S. Via et al., J. Immunol., Bd. 151 (1993), S. 3914–3922; D. Serreze, FASEB J., Bd. 7 (1993), S. 1092–1096; L. Rasanen et al., Clin. Exp. Immunol., Bd. 71 (1988), S. 470–474; D. A. Hafler et al., J. Neuroimmunol., Bd. 9 (1985), S. 339–347). Der oder die Defekte in der APC-Funktion sind jedoch auf zellulärem oder molekularem Niveau bisher nicht näher bestimmt worden.
Bei Prostaglandinen (PGs) handelt es sich um Lipidmoleküle, die aus einem Vorläufermolekül, nämlich Arachidonsäure, durch Einwirkung von speziellen Enzymen mit der Bezeichnung Prostaglandin-synthasen (PGS-1 und PGS-2) gebildet werden. PGS-1-mRNA und -Protein werden konstitutiv exprimiert. Dieses Enzym ist für die Bildung von geringen Konzentrationen an PGs verantwortlich und dient als "Hauswirtschafts"-Molekül. PGS-2 ist ein induzierbares Enzym, das durch Makrophagen und Monozyten bei Entzündungen und im Anschluss an eine Belastung mit Mitogenen, Zytokinen und bakteriellen Zellwandprodukten, d. h. Lipopolysacchariden (LPS) gebildet wird (J. M. Farber, Mol. Cell. Biol., Bd. 12 (1992), S. 1535–1545; J. R. Vane, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 91 (1994), S. 2046–2050; D. A. Kujubn, J. Biol. Chem., Bd. 266 (1993), S. 12866–12872; A. Ristimaki et al., J. Biol. Chem., Bd. 269 (1994), S. 11769–11775). Es wurde gezeigt, dass PGS-2 in Zellen, mit denen die Gelenke von Personen mit rheumatoider Arthritis ausgekleidet sind, exprimiert wird und zur anhaltenden Entzündung im betroffenen Gelenk beitragen kann (L. J. Crofford et al., J. Clin. Invest., Bd. 93 (1994), S. 1095–1101).
Zusätzlich zu Prostanoiden erzeugen Monozyten Monokine, die stark Entzündungen und Immunreaktionen modifizieren. Unter den Monokinen, die im allgemeinen eine Hochregelung oder Förderung einer Entzündung und einer Immunität bewirken, befinden sich TNFα, IL-1α, IL-1β, IL-12 und IL-6. Monokine, die zur Herunterregelung dieser Reaktionen neigen, sind IL-4, IL-10, IL-13 und der IL-1-Rezeptorantagonist (IL-1RA).
Von Prostaglandinen ist bekannt, dass sie einen Einfluss auf die Expression von Monokinen ausüben. Beispielsweise ist von Prostaglandin E₂ (PGE₂) bekannt, dass es die Bildung von TNFα unterdrückt (P. M. Seldon et al., Mol. Pharmacol., Bd. 48 (1995), S. 747–757; R. M. Strieter et al., J. Leuk. Biol., Bd. 47 (1990), S. 366–370). Es gibt auch Berichte darüber, dass PGE₂ IL-1α unterdrückt (S. Endres et al., Immunology, Bd. 72 (1991), S. 56–60; W. W. Zhong, Immunology, Bd. 84 (1995), S. 446–452). Im Gegensatz zu den suppressiven Wirkungen stimuliert die PGE₂-Bildung die Bildung von IL-10 durch Monozyten (G. Strassman et al., J. Exp. Med., Bd. 180 (1994), S. 2365–2370). IL-10 moduliert seinerseits die Bildung von PGE₂ durch Unterdrückung der PGS-2-Bildung (P. M. Mertz et al., J. Biol. Chem., Bd. 269 (1994), S. 21322–21329). Ferner stimuliert IL-10 die Bildung eines weiteren starken immunoregulatorischen Monokins, nämlich IL-1RA (R. N. Spengler et al., J. Immunol., Bd. 142 (1989), S. 4346–4350). Daher kann PGE₂ die Immunoregulation aufgrund seiner eigenen Wirkung und durch seine Wirkungen auf die Monokinbildung stimulieren.
Wenn Monozyten in vitro chronisch der Einwirkung von PGE₂ unterliegen, kommt es zu einem Verlust ihrer Reaktionsfähigkeit. Diese Desensibilisierungserscheinungen werden durch die Herunterregulierung von PGE₂-Rezeptoren vermittelt (R. G. Coffey et al., J. Leuk. Biol., Bd. 48 (1990), S. 557–564). Beispielsweise unterdrückt PGE₂ in vitro normalerweise die TNFα-Bildung, wobei aber eine chronische Einwirkung zu einem Suppressionsverlust dieses Monokins durch PGE₂ führt. Die Entfernung oder Blockierung von PGE₂ kann den Desensibilisierungsvorgang umkehren (M. Howard et al., J. Clin. Immunol., Bd. 12 (1992), S. 61–784).
Derzeit kann man Personen mit hohem Risiko einer Entwicklung von IDD nur aufgrund serologischer Verfahren einem Screening unterwerfen, die die autoimmune B- und T-Lymphozytenaktivität widerspiegeln. Serologische Tests identifizieren etwa 80–85% von Personen, bei denen eine existierende Autoimmunerkrankung gegen die insulinerzeugenden Zellen des Pankreas vorliegt. Unter der ICA⁺-Bevölkerung entwickeln etwa 80–85% innerhalb der folgenden 5 Jahre IDD. Derzeit gibt es abgesehen von diesen serologischen Tests keine immunologischen, genetischen oder anderweitigen Tests, die Personen mit einem IDD-Risiko identifizieren können.
Da es mehrere Jahre dauert, bis sich IDD in einem Individuum entwickelt, kann eine Autoimmunität erst mit Sicherheit zu dem Zeitpunkt festgestellt werden, an dem die Individuen ICAs entwickeln. Hintergrundinformationen über zelluläre oder genetische Faktoren, die für die Entwicklung einer Autoimmunkrankheit erforderlich sind und die im frühen Krankheitsstadium exprimiert werden, sind von großer klinischer Bedeutung. Durch den Nachweis dieser Faktoren würde es in bevorzugter Weise gelingen, Personen zu identifizieren, bevor die Autoimmunität eintritt, oder möglicherweise in einem im Vergleich zur Nachweismöglichkeit durch ICA früheren Krankheitsstadium. Ein früherer Nachweis wäre von großer klinischer Bedeutung bei der Identifizierung von Personen mit hohem Krankheitsrisiko, wobei durch Anwendung von präventiven Therapien versucht werden könnte, die verbleibenden, insulinsezernierenden Zellen zu erhalten.
Erfindungsgemäß können Diabetes und/oder andere Autoimmunkrankheiten vorhergesagt und/oder überwacht werden, indem man die Expression von Prostaglandin-synthase 2 (PGS-2) aufgrund von Antigen-präsentierenden Zellen testet. Somit beruht ein Aspekt der Erfindung auf dem Befund, dass PGS-2 einen zellulären Marker darstellt, der stark mit klinischen Autoimmunkrankheiten, wie IDD, assoziiert ist. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den Antigen-präsentierenden Zellen, die für diagnostische Zwecke überwacht werden, um Makrophagen und/oder Monozyten. Eine Expression von PGS-2 in diesen Zellen stellt einen Indikator für eine Autoimmunempfindlichkeit oder -krankheit dar.
Die Expression von PGS-2 kann auf einer Anzahl von Wegen nachgewiesen werden, die für den Fachmann aufgrund der Kenntnis der vorliegenden Offenbarung ersichtlich sind. Beispielsweise kann PGS-2 durch das Vorliegen einer PGS-2-Messenger-RNA (mRNA), durch das Vorliegen des PGS-2-Proteins selbst oder das Erfassen von biologischen Einflüssen des PGS-2-Proteins, d. h. die PGE₂-Bildung, nachgewiesen werden.
Es wird die Identifizierung von diagnostischen Markern für eine Autoimmunerkrankung an T-Zellen beschrieben. Es wurde festgestellt, dass eine CD25-Expression an T-Zellen mit einer Autoimmunerkrankung, wie IDD, in Korrelation gebracht werden kann. Speziell wurde festgestellt, dass Personen mit einer Anfälligkeit für Diabetes einen geringeren CD25-Expressionsgrad an T- Zellen aufweisen. Ferner wurde festgestellt, dass eine Hemmung von PGE₂ in signifikanter Weise die CD25-Expression in Zellen von Personen mit IDD-Risiko verstärkt. Eine Hemmung von PGE₂ verstärkte nicht die Expression von CD25 bei Personen, bei denen keine Gefahr der Entwicklung von IDD bestand. Es wurde festgestellt, dass Personen mit IDD-Risiko erhöhte Niveaus der FAS-Rezeptorexpression im Vergleich zu Personen, bei denen keine Gefahr zur Entwicklung von IDD bestand, aufweisen. T-Zellen, die sowohl den FAS-Rezeptor als auch CD25 exprimieren, werden in Bezug auf ein verringertes Niveau der Expression dieser Proteine geprüft. Ein verminderter Expressionsgrad des FAS-Rezeptors und von CD25 im Vergleich zu normalen Kontrollen stellt einen Hinweis auf Diabetes oder andere Autoimmunzustände dar.
Tests auf eine PGS-2-Expression, CD25-Expression und/oder FAS-Rezeptorexpression eröffnen neue Möglichkeiten zur Krankheitsvorhersage, z. B. eine Bestimmung der Krankheitsaktivität und des Krankheitsfortschritts sowie eine Bestimmung der Veranlagung zur Entwicklung anderer Autoimmunkrankheiten.
Die hier beschriebenen diagnostischen Verfahren können zum Nachweis einer Autoimmun-Fehlfunktion vor dem Auftreten von klinischen Symptomen herangezogen werden. Dieser frühe Nachweis ermöglicht es, geeignete präventive Maßnahmen einzuleiten.
Ferner wird ausgeführt, dass eine pharmakologische Hemmung von PGS-2 starke Hemmwirkungen auf die Entwicklung einer Autoimmunkrankheit hat. Eine IDD-Prophylaxe kann durch eine Arzneistofftherapie, die die enzymatische PGS-2-Aktivität blockiert, erreicht werden. PGS-2-Inhibitoren ergeben eine billige, sichere und gut verträgliche Möglichkeit zur Prophylaxe dieser Krankheit. Ferner kann die Wirksamkeit der Therapie durch Messung der PGE₂-Konzentrationen im Serum oder Urin überwacht werden. Außerdem wurde bei bestimmten Personen festgestellt, dass PGS-2-spezifische Inhibitoren in ausgeprägtem Maße in humanen Monozyten die Bildung von PGE₂ verringern und die Bildung des IL-1-Rezeptorantagonisten (IL-1RA) erhöhen.
Eine Behandlung für Diabetes oder andere Autoimmunkrankheiten, die eine Modulation der CD25-Expression und/oder FAS-Rezeptorexpression umfassen, werden beschrieben. Personen mit einem IDD-Risiko werden behandelt, um die CD25-Expression zu steigern. Diese Steigerung kann beispielsweise durch Verabreichung einer Verbindung, die die PGS-2-Aktivität, die PGE₂-Aktivität oder die Aktivität von cyclischem AMP oder verwandten Verbindungen hemmt, erreicht werden. Eine derartige Hemmung kann beispielsweise durch einen Inhibitor von PGS-1 oder PGS-2 erzielt werden. Es wird ein PGS-2-spezifischer Inhibitor, wie NS398, verabreicht.
Es werden diagnostische und therapeutische Verfahren auf der Grundlage einer Modulation und/oder eines Nachweises des Zelltodmechanismus und von Zelltodereignissen beschrieben. Unterschiede in Zelltodereignissen in Bezug auf die Expression oder Aktivität von PGS-2 und/oder verwandten Molekülen können ausgenützt werden, um kritische diagnostische Informationen zu erhalten oder in Krankheitsprozesse einzugreifen. Personen mit einem Krebsrisiko oder mit einem Risiko zur Entwicklung von Autoimmunkrankheiten zeigen eine PGS-2-bezogene Resistenz gegenüber einem Zelltod bei Stimulation von Zellen durch chemische Faktoren unter Einschluss von (ohne Beschränkung hierauf) TNFα- und FAS-Liganden. Durch Eingriff in diesen Vorgang, beispielsweise durch eine Verabreichung von Inhibitoren der PGS-2-bezogenen Aktivität, ist es möglich, die Beendigung von Zelltodereignissen zu erleichtern, und zwar mit dem Ziel, ungeeignete Zellen aus der biologischen Umgebung zu beseitigen. Auf diese Weise können Autoimmun-T-Zellen durch den apoptotischen Mechanismus bei Stimulation durch geeignete chemische Signale oder Immunisierung mit krankheitsbezogenen Zielantigenen, wie Insulin oder GAD, beseitigt werden. Gleichermaßen können Krebszellen zum entsprechenden Zelltod geführt werden, wodurch man Tumoren und/oder andere unangemessene Zellproliferationen verhindert oder verringert.
Die Verabreichung von Inhibitoren von PGS-2 oder von dessen biologischen Aktivitäten zur Erzielung einer Modulation des programmierten Zelltods, so dass selbstdestruktive T-Zellen und/oder Krebszellen entfernt werden, um Autoimmun- oder Krebszustände zu verringern oder zu verhindern, wird beschrieben. Zu Inhibitoren von PGS-2, die verwendet werden können, gehören (ohne Beschränkung hierauf) Glucocorticoidhormone (die die Expression von PGS-2 unterdrücken), IL-10, IL-4, IL-13 und TGF-β.
Ein Zelltod kann durch Hochregelung der zellulären Reaktion, die sich aus einer Aktivierung des FAS-Rezeptors ergibt, moduliert werden. Diese Hochregelung kann durch Verabreichung eines Mittels erreicht werden, das die FAS-Rezeptorexpression verstärkt. Bei diesem Mittel kann es sich beispielsweise um einen PGE-Inhibitor handeln. Alternativ kann die Hochregelung der zellulären FAS-Reaktion beispielsweise durch Verabreichung von Mitteln erreicht werden, die die intrazelluläre Reaktion auf eine FAS-Rezeptoraktivierung verstärken. Somit kann bei Personen mit einem pathologischen Zustand, der fehlerhaften Zelltodvorgängen zuzuschreiben ist, der Zelltod durch Hochregelung der intrazellulären Kaskade von Ereignissen gefördert werden, wobei die FAS-Rezeptoraktivierung letztlich den Zelltod fördert. Diese Hochregelung kann vom Fachmann bei Kenntnis der vorliegenden Beschreibung beispielsweise durch stimulierende, enzymatische und/oder andere regulatorische Moleküle, die am FAS-Aktivierungsweg teilnehmen, erreicht werden. In einer speziellen Ausführungsform können Personen, bei denen ein Bedarf an einem verstärkten T-Zelltod festgestellt worden ist, mit dem Ziel behandelt werden, sowohl die CD25-Expression als auch die zelluläre Reaktion auf eine FAS-Rezeptoraktivierung zu verstärken. Diese Therapie kann ferner durch Verabreichung eines geeigneten Antigens unterstützt werden, wodurch man die CD25-Aktivierung verstärkt und die Spezifität der Behandlung erhöht. Beim Antigen kann es sich beispielsweise um ein Autoantigen handeln.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
1 zeigt die Blockierung der PGE₂-Bildung durch den PGS-2-spezifischen Inhibitor NS-398.
2 zeigt die Korrelation zwischen erhöhten PGS-2-Konzentrationen und einem erhöhten IDD-Risiko.
3 zeigt die Fähigkeit eines PGS-2-Inhibitors zur Steigerung der Expression von CD25.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft den Nachweis der Expression von Prostaglandin-synthase-2 (PGS-2) in Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) von Personen mit Risiko zur Entwicklung einer Autoimmunkrankheit. Bei dieser Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung den Befund, dass PGS-2 einen zellulären Marker für Personen mit Risiko von IDD und anderen Autoimmunkrankheiten darstellt.
Die vorliegende Erfindung stellt rasche und einfache Verfahren zur Bestimmung der Frage dar, ob bei einer Person das Risiko zur Entwicklung einer Autoimmunkrankheit besteht. Gemäß einem diagnostischen Aspekt der Erfindung können periphere Blutmonozyten einer Bewertung zur Bestimmung des PGS-2-Expressionsgrads unterzogen werden. Diese Bewertung kann durchgeführt werden, indem man sich eines beliebigen Verfahrens aus einer Reihe von diagnostischen Verfahren, die dem Fachmann geläufig sind, bedient. Diese Verfahren können dazu herangezogen werden, PGS-2 direkt nachzuweisen oder das Auftreten einer PGS-2-Expression nachzuweisen. Der Hinweis auf eine PGS-2-Expression umfasst beispielsweise das Vorliegen von PGS-2-mRNA. Die PGS-2-mRNA kann beispielsweise durch reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) nachgewiesen werden. PGE₂, das aufgrund der enzymatischen Aktivität von PGS-2 erzeugt wird, kann leicht beispielsweise durch ELISA, RIA oder andere antikörpergestützte Tests nachgewiesen werden. Die Expression von PGS-2- Protein kann auch durch fließzytometrische Verfahren oder Western-Blotting nachgewiesen werden.
T-Zellen können einer Bewertung zur Bestimmung des Ausmaßes der CD25-Expression und/oder der FAS-Rezeptorexpression herangezogen werden. Es wurde festgestellt, dass eine Verringerung der Expression von CD25 oder des FAS-Rezeptors ein Anzeichen für das Risiko einer Autoimmunkrankheit, insbesondere von IDD, darstellt. Eine Verminderung der kombinierten Expression von CD25 und des FAS-Rezeptors stellt insbesondere ein Anzeichen für das Risiko einer Autoimmunkrankheit dar. Der Expressionsgrad dieser Moleküle kann leicht vom Fachmann unter Anwendung üblicher Techniken, beispielsweise FACS-Analyse unter Verwendung handelsüblicher Antikörper, festgestellt werden. Ein weiteres diagnostisches Verfahren kann die Bestimmung der Zunahme der CD25-Expression als Folge der Verabreichung eines PGE-2-Inhibitors beinhalten. Eine Zunahme der CD25-Expression an T-Zellen bei Behandlung mit einem PGE-2-Inhibitor stellt einen Hinweis auf das Risiko einer Autoimmunkrankheit, einschließlich IDD, dar. Beim PGE-2-Inhibitor kann es sich beispielsweise um NS398 oder Indomethacin, das sowohl PGS-1 als auch PGS-2 hemmt, handeln.
Die erfindungsgemäßen diagnostischen Tests können dazu herangezogen werden, Anzeichen für eine Autoimmunkrankheit vor dem Auftreten von klinischen Symptomen zu erfassen. Ferner eignen sich die Tests zur Überwachung des Krankheitsverlaufs oder der Wirkung der Behandlung.
Die Aktivität von PGS-2 und/oder verwandter Moleküle kann blockiert werden. Es ist bekannt, dass Indomethacin die Aktivität von PGS-2 blockiert. Aminoguanidin stellt einen Inhibitor von induzierbarer Stickoxid-synthase (iNOS) dar. NO erhöht die PGS-2-Aktivität. Der hier verwendete Ausdruck "Verringerung der Schwere" einer Störung beinhaltet die Verhinderung oder Verzögerung der Störung oder eine Beeinflussung dahingehend, dass die Wirkungen der Störung physikalisch oder emotional weniger schädigend sind.
Die Behandlung von NOD-Mäusen, die von einer aktiven, nachgewiesenen Autoimmunkrankheit betroffen sind, unter Verwendung einer Arzneistoffkombination aus Indomethacin und Aminoguanidin verzögert in ausgeprägter Weise das Einsetzen von Diabetes und verringert dessen Häufigkeit. Die Kombination von Inhibitoren erweist sich als besonders wirksam. Ferner wird bei NOD-Mäusen in einem frühen Krankheitsstadium durch Behandlung mit Indomethacin allein die Entwicklung von IDD in wirksamer Weise blockiert. Außerdem wurde festgestellt, dass der PGS-2-spezifische Inhibitor NS-398 (erhältlich von der Fa. Cayman Chemical Company) in wirksamer Weise die gesamte in vitro-Bildung von PGS-2 in Monozyten von Personen mit hohem IDD- Risiko blockiert. Die Behandlung von Personen mit hohem IDD-Risiko kann dazu herangezogen werden, die Entwicklung einer Autoimmunität zu echtem Diabetes zu blockieren.
Die Behandlung kann auch zu einer Verringerung der Schwere der Nebenwirkungen einer Autoimmunkrankheit geeignet sein. Insbesondere lassen sich die Nebenwirkungen von Diabetes durch Behandlung mit einem Prostaglandin-Inhibitor verringern.
PGS-2-spezifische Inhibitoren können in Verbindung mit einer antigenspezifischen Immunisierungstherapie herangezogen werden. Bei beispielhaften Immunisierungsbehandlungen wird ein Zielantigen für IDD oder eine andere Autoimmunkrankheit zur Immunisierung des Individuums herangezogen. Dies führt zu einer Toleranz und zu einer unterbleibenden Entwicklung zum offenen Krankheitsausbruch. Im Fall von Diabetes gehören zu diesbezüglich geeigneten Antigenen (ohne Beschränkung hierauf) Insulin, GAD, IA-2, IA-2β sowie Fragmente und Varianten dieser Antigene. Zu Antigenen, die mit verschiedenen Autoimmunzuständen verbunden sind, gehören (ohne Beschränkung hierauf) die in Tabelle 1 angegebenen Antigene.
Tabelle 1
Da PGs die Lymphozytenaktivierung hemmen und die Aktivierung eine Voraussetzung für die Apoptose von T-Zellen ist, kann eine Behandlung von Personen mit PGS-2-Inhibitoren vor einer Immunisierung oder gleichzeitig damit die Wirkungen dieser Therapie verstärken. Daher können PGS-2-Inhibitoren im Rahmen einer Adjuvanstherapie zur Antigenimmunisierung zur Verhinderung von IDD oder anderen Autoimmunkrankheiten verwendet werden.
Die monozytäre Bildung der Monokine IL-1β, TNFα, IL-1RA und IL-10 in Kulturüberständen von gesunden Kontrollpersonen und bei der prädiabetischen Bevölkerung in Gegenwart und Abwesenheit des PGS-2-spezifischen Inhibitors NS-398 wurde bewertet. Es wurde festgestellt, dass NS-398 die Bildung der immunoregulatorischen Monokine IL-10 und IL-1RA fördert, was darauf schließen lässt, dass hohe Konzentrationen an PGE₂, die durch prädiabetische Monozyten gebildet werden, zu einer PGE₂-Desensibilisierung führen. Ferner wurde festgestellt, dass trotz verstärkter Konzentrationen an PGS-2 und PGE₂ bei diabetischen und prädiabetischen Personen keine entsprechende Zunahme an IL-10 vorliegt. Ferner hemmt bei NOD-Mäusen eine Verabreichung von IL-10 in überraschender Weise nicht die PGE₂-Bildung durch Monozyten. Es wird ein Verfahren zum Nachweis des Auftretens einer Autoimmunkrankheit, insbesondere von Diabetes, beschrieben, das die Bewertung von Monozyten umfasst, um festzustellen, ob derartige Monozyten eine verringerte Reaktion auf IL-10 in Bezug auf eine PGS-2-Expression zeigen. Eine derartige verringerte Reaktion würde einen Hinweis auf die Krankheit darstellen. Gemäß diesen Befunden können Verbindungen, die die Prostaglandinbildung hemmen, zur Modulation der Erzeugung von entzündungshemmenden Monokinen herangezogen werden, um die Immunreaktion zu beschränken. Die spontane Expression von PGS-2 und die Bildung von PGE₂ durch prädiabetische Monozyten kann deren Funktion beeinflussen und deren Fähigkeit zur Erzeugung von Monokinen begrenzen, die einen starken Einfluss auf die Beschränkung der Autoimmunreaktion auf β-Zellen der Inseln ausüben, wodurch eine Weiterentwicklung zu Diabetes gefördert wird.
Behandlungen, die PGE₂ hemmen, können herangezogen werden, um die Bildung dieser starken regulatorischen Monokine wieder aufzunehmen und den Autoimmunprozess entweder zu verlangsamen oder zu blockieren sowie entsprechende apoptotische Prozesse zu fördern. Ferner kann die Bildung von IL-10 durch Monozyten dazu herangezogen werden, die Bildung von Th2-Lymphozyten zu fördern, von denen angenommen wird, dass sie eine wichtige regulatorische Rolle bei IDD spielen. Außerdem kann eine Blockierung von PGE₂ und eine Begrenzung der Prostaglandin-Desensibilisierung zur Förderung der Erzeugung von TH2-Zellen herangezogen werden, da PGE₂-Promotoren die Bildung dieser Zellen fördern.
Die CD25-Expression von T-Zellen und die zelluläre Reaktion auf eine FAS-Rezeptoraktivierung können moduliert werden. Für Personen mit IDD-Risiko oder mit einem Bedarf an einem verstärkten programmierten Zelltod wird eine Behandlung bereitgestellt, bei der die Wirksamkeit des Zelltod-Weges durch Verstärkung der Expression von CD25 und/oder der Reaktion auf eine FAS-Rezeptoraktivierung verstärkt wird. Die Verstärkung der CD25-Expression kann durch Verabreichung eines Inhibitors von PGE₂ erreicht werden. Eine Hochregulierung der FAS-bezogenen zellulären Aktivierung wird vorzugsweise erreicht, indem man die Expression des FAS-Proteins verstärkt oder indem man die Menge oder die Aktivität von Verbindungen, die den intrazellulären FAS-Aktivierungsweg fördern, erhöht. Diese Therapie wird durch die Verabreichung eines Antigens unterstützt, wodurch die Aktivität, die sich aus der Expression von CD25 ergibt, verstärkt wird. Beim Antigen kann es sich beispielsweise um ein Autoantigen handeln.
Es wird die Verabreichung eines Prostaglandin-Inhibitors an eine Person beschrieben, bei der das Risiko zur Entwicklung einer Autoimmunkrankheit festgestellt worden ist. Der Prostaglandin-Inhibitor kann chronisch verabreicht werden oder er kann in einer Dosis verabreicht werden, die höher als die Dosis ist, die beispielsweise zur Linderung von Schmerzen oder Entzündungen verwendet wird. Diesbezüglich soll der Inhibitor in einer Dosierung und in einer Art und Weise verabreicht werden, die in wirksamer Weise die Expression von CD25 an T-Zellen erhöhen. Beim Prostaglandin-Inhibitor kann es sich um einen Inhibitor von PGS-2 handeln. Die Therapie ist besonders vorteilhaft, wenn die Verabreichung erfolgt, bevor klinische Symptome einer Autoimmunkrankheit oder das Bedürfnis nach einem verstärkten programmierten Zelltod auftreten.
Materialien und Methoden
RT-PCR-Nachweis von PGS-2-mRNA in humanen Monozyten
Humanes peripheres Blut wird in sterile 10 ml-Röhrchen mit einer grünen Oberseite gesammelt. Tests werden vorzugsweise mit 5 ml Blut oder mehr durchgeführt. Das Blut wird 30 Minuten mit 1500 U/min auf einem Ficoll-Gradienten zentrifugiert. Monozyten werden in einer Reinheit von > 80% isoliert, indem man sie 2 Stunden an einer Kulturoberfläche aus Kunststoff haften lässt. Die Zellen werden sodann über Nacht in RMPI-1640 plus endotoxinfreiem fötalem Kälberserum gezüchtet. Die Zellen werden nach 16-stündiger Züchtung mit kaltem, Ca⁺⁺/Mg⁺⁺-freiem PBS geerntet. Die Zellen werden gezählt und ihre Lebensfähigkeit wird bestimmt. In 10 μg/ml LPS gezüchtete Monozyten dienen als positive Kontrolle für jede getestete Probe. Die poly-mRNA wird sodann auf einem Standard von 10⁵ Monozyten unter Verwendung einer Testpackung (Quiagen) geerntet. Die mRNA wird in einem Standardreaktionsgemisch einer reversen Transkription unterzogen. Die cDNA wird sodann durch PGS-2-spezifische Primer, die in unserem Labor konstruiert worden sind, unter Anwendung einer standardmäßigen reversen Transkriptase-Reaktion unter Durchführung von 45 Zyklen amplifiziert. Das PCR-Produkt wird sodann an Agarosegelen mit bekannten Standards laufen gelassen. Die Größe wird bestätigt. β-Actin wird bei diesen Reaktionen als interne Kontrolle verwendet. Die Identität von RT-PCR-Produkten wurde aufgrund der Größe und durch Southern-Blotting unter Verwendung einer PGS-2-spezifischen, markierten internen Sonde bestätigt.
Nachweis von PGS-2-Protein in humanen Monozyten
Ein PGS-2-spezifischer monoklonaler Mäuse-Antikörper (Cayman Chemical Company) wird zum Nachweis von PGS-2-Protein in Monozyten verwendet. Zellen zur Durchführung der immunozytochemischen Bestimmung werden 2 Stunden zur Haftung an Mehrkammer-Objektträgern gebracht, in 0,2% Paraformaldehyd fixiert und 10 Minuten mit Triton-X und Glycin in PBS permeabilisiert. Der primäre Antikörper wird über Nacht bei 4°C inkubiert und sodann mit FITC-markiertem Fab-Ziegen-anti-Kaninchen-Antiserum nachgewiesen. Die Zellen werden sodann mit einem fluoreszierenden Mikroskop betrachtet.
Ein fluoreszierend aktiviertes Zellsortierverfahren (FACS-Verfahren) kann ebenfalls für den Nachweis von PGS-2 in Monozyten herangezogen werden. Bei diesem Verfahren wird Vollblut mit anti-Monozyten-Antikörper CD14, der an ein Phycoerythrin-Molekül gekuppelt ist, markiert. Die Zellen werden sodann fixiert und mit FACS-Lyse (Becton-Dickenson) lysiert. Ferner werden die Zellen während des gesamten Verfahrens mit Saponinen permeabilisiert und sodann an einem FACS-Gerät analysiert. Der prozentuale Anteil an Monozyten, die in Bezug auf PGS-2 positiv sind, sowie die Fluoreszenzintensität werden sodann bestimmt. Etwa 15–70% von peripheren Blutmonozyten von ICA⁺-Personen erweisen sich bei diesem Verfahren als positiv.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, fallen aber nicht notwendigerweise unter den Umfang der beanspruchten Erfindung. Diese Beispiele sind nicht als Beschränkung anzusehen. Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich sämtliche Prozentangaben auf das Gewicht und sämtliche Lösungsmittel-Mischungsverhältnisse auf das Volumen.
Beispiel 1 – Nachweis von PGS-2-mRNA
Die Regulierung von mRNA und die Proteinexpression von PGS-2, dem induzierbaren Enzym, das für die Bildung großer Mengen an Prostaglandinen kritisch ist, wurde in Makrophagen der NOD-Maus geprüft. Makrophagen von Kontrollmausstämmen exprimierten PGS-2-mRNA nicht, wie durch die hochempfindliche reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion festgestellt wurde. Das PGS-2-Protein wird gleichermaßen nicht in ruhenden Kontrollmakrophagen exprimiert, wie durch indirekte Immunofluoreszenz unter Verwendung eines PGS-2-spezifischen Antikörpers festgestellt wird. Im deutlichen Gegensatz dazu exprimieren NOD-Makrophagen spontan hohe Konzentrationen an mRNA und Protein für dieses Enzym, wie durch diese Techniken festgestellt wird. Ferner wurde festgestellt, dass PGS-2 in den Makrophagen von NODscid/scid-Mäusen, denen funktionelle T- und B-Zellen fehlen, exprimiert wird. Infolgedessen entwickeln diese Tiere keine Autoimmunkrankheit oder Diabetes. Die Expression von PGS-2 in Makrophagen von NODscid/scid-Mäusen zeigt, dass die spontane PGS-2-Expression nicht vom Autoimmunmilieu abhängig ist, und lässt darauf schließen, dass die PGS-2-Expression ein Ergebnis eines primären Makrophagendefekts ist. Daher erklärt die fehlerhafte Expression von PGS-2 durch NOD-Makrophagen leicht die abnormale PG-Bildung durch diese Zellen und liefert die molekulare und zelluläre Basis für die APC-Fehlfunktion.
Beispiel 2 – Rolle der PGS-2-Expression bei IDD
Um den genetischen Beitrag der PGS-2-Expression zur Autoimmunität bei den NOD-Mäusen in größerer Vollständigkeit aufzuklären, wurden kongene Mäuse untersucht. Das für PGS-2 kodierende Gen befindet sich am Chromosom 1, im Abstand von 76,2 CM vom Centromeren. Diese Mäuse mit der Bezeichnung B6.NOD.C1 weisen ein Segment am Chromosom 1 aus der NOD-Maus auf, das das "NOD-PGS-2-Gen" enthält, während der Rest des Mäusegenoms aus der nicht-autoimmunen C57BL/6-Maus stammt. Makrophagen von kongenen B6.BOD.C1-Mäusen exprimieren ähnlich wie NOD spontan PGS-2-mRNA und Protein. Diese Mäuse entwickeln eine Autoimmunkrankheit im Pankreas, entwickeln aber im Gegensatz zu NOD keinen Diabetes. Das Fehlen von Diabetes bei diesen kongenen Mäusen ist vermutlich auf den Mangel anderer Schlüsselgene aus NOD zurückzuführen, die zu anderen wichtigen Faktoren des gesamten Krankheitsprozesses beitragen. Eine weitere Linie von kongenen Mäusen erhielt die Bezeichnung NOD.B10.C1. Diese Mäuse enthalten das NOD-Genom mit Ausnahme eines Segments vom Chromosom 1, das von der nicht-autoimmunen C57BL/10-Maus stammt und das "C57BL/10-PGS-2-Gen" enthält. NOD.B10.C1-Mäuse exprimieren nicht spontan PGS-2 und weisen eine 40–50%ige Verringerung des Auftretens von Diabetes auf. Diese Daten lassen zusammen mit den Daten der kongenen B6.NOD.C1-Mäuse darauf schließen, dass die Expression von PGS-2 mit einem aggressiveren Autoimmun-Phänotyp korreliert.
Beispiel 3 – Blockierungsaktivität von PGS-2 als Therapie für IDD
Eine Blockierung der Aktivität von PGS-2 mit Arzneistoffen, die die PG-Bildung verringern, kann dazu herangezogen werden, die Entwicklung einer IDD-Krankheit zu verhindern oder zu verlangsamen. Wenn NOD-Mäuse mit einer gesicherten aktiven Autoimmunkrankheit durch das Trinkwasser mit einer Kombination von Arzneistoffen, unter Einschluss eines PGS-1/PGS-2-Inhibitors, einer geringen Dosis an Indomethacin (3 μg/ml), in Verbindung mit einem induzierbaren Stickoxid-synthase (iNOS)-Inhibitor, nämlich Aminoguanidin, das die Wirkungen von Indomethacin verstärkt, behandelt werden, sinkt das Auftreten von Diabetes bei NOD-Mäusen um 42% im Vergleich zu Kontrolltieren und Tieren, die mit geringen Dosen an Indomethacin oder Aminoguanidin allein behandelt worden sind.
Die Behandlung von NOD-Mäusen zu einem Zeitpunkt, bei dem die Autoimmunität sich im Endstadium befindet, mit hohen Dosen (15 μg/ml) an Indomethacin allein verringert das Auftreten von Diabetes von 77% auf 22%. Diese Daten belegen einen starken Einfluss von PGS-Inhibitoren auf die Entwicklung von IDD.
Beispiel 4 – Assoziation von PGS-2 und PGE₂ mit einer Autoimmunkrankheit
Die Einflüsse von nicht-steroidalen entzündungshemmenden Arzneistoffen (NSAIDs), die spezifisch in vitro PGS-2 hemmen, wurden bestimmt. Es wurde festgestellt, dass sie hochwirksame Blocker der PGS-2-Bildung von NOD-Mäusemakrophagen darstellen. Aspirinartige Arzneistoffe, die sowohl PGS-1 als auch PGS-2 hemmen, verursachen Magenreizungen, während dies bei PGS-2-spezifischen Arzneistoffen nicht der Fall ist.
Monozyten von ICA⁺-Personen mit hohem Risiko zur Entwicklung von IDD, von Personen mit gesicherter SLE und autoimmuner Thyroiditis und gesunden Kontrollpersonen wurden untersucht. Ein Teil der untersuchten prädiabetischen ICA⁺-Personen sind an einem IDD-Versuch beteiligt, bei dem sie täglich eine subkutane Verabreichung von Insulin als präventive Therapie erhalten. Monozyten von Personen ohne Autoimmunkrankheit exprimieren selten PGS-2-mRNA (12%) während Monozyten von Personen mit hohem Risiko zur Entwicklung von IDD PGS-2 in hoch signifikanter Häufigkeit exprimieren (84%, p < 0,0001). Die präventive Insulintherapie scheint nicht die PGS-2-mRNA- oder Proteinexpression zu beeinträchtigen (vergl. Tabelle 2).
Tabelle 2 PGS-2-mRNA-Expression in MOs von gesunden Kontrollpersonen und ICA⁺-Personen
Signifikante Differenz (p < 0,0001) bei Analyse durch einen zweiteiligen Fisher-Test.
Die PGS-2-Expression ist jedoch nicht spezifisch für IDD, da Personen mit SLE und Autoimmun-Thyroiditis ebenfalls spontan PGS-2 in ihren Monozyten exprimieren (vergl. Tabelle 3).
Tabelle 3 PGS-2-Expression in MOs von autoimmunen Kontrollpersonen
Zusätzlich zur Expression von PGS-2 wurde die Bildung von PGE₂ durch Monozyten der gleichen Kontrollpersonen und autoimmunen Personen geprüft. Es wurde festgestellt, dass die PGE2-Bildung bei Bestimmung durch einen spezifischen ELISA-Test in ICA⁺-Personen und bei autoimmunen Kontrollpersonen signifikant höher als in Kontrollmonozyten ist (p < 0,0001) (vergl. Tabelle 4).
Tabelle 4 PGE₂-Bildung durch MOs von gesunden Kontrollpersonen, ICA⁺-Personen und SLE-Personen
Signifikante Differenz (p < 0,0001) bei Analyse durch einen zweiteiligen Fisher-Test.
Schließlich wurde die Bildung von PGE₂ durch den PGS-2-spezifischen Inhibitor NS-398 vollständig blockiert (vergl. 1).
Beispiel 5 – Bildung von TNFα und IL-1β durch Monozyten
Die Expression von PGS-2 kann durch mehrere Faktoren induziert werden, einschließlich durch von Monozyten gebildete Zytokine, wie TNFα und IL-1β. Zur Bewertung der Möglichkeit, dass Monozyten von prä-IDD-Personen große Mengen an IL-1 und TNFα bilden, was PGS-2 induziert, wurden die Konzentrationen dieser Zytokine in Überständen von Monozyten von prä-IDD-Personen und gesunden Kontrollpersonen nach 24-stündiger in vitro-Züchtung gemessen. Wie in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt, wurde festgestellt, dass die Konzentrationen an IL-1 und TNFα, die von Monozyten gebildet werden, bei den prä-IDD-Personen tatsächlich niedriger als bei den Kontrollpersonen sind (vergl. Tabelle 5). Die geringeren Konzentrationen dieser Zytokine stehen im Einklang mit der konstitutiven Bildung von Prostaglandinen, die die Bildung von TNFα und IL-1β unterdrücken. Ein Vergleich der TNFα- und IL-1β-Konzentrationen zwischen mit Insulin behandelten und unbehandelten prä-IDD-Personen ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen diesen beiden Gruppen.
Tabelle 5
Die IL-10-Bildung durch Monozyten von prä-IDD-Personen und gesunden Kontrollpersonen wurde ebenfalls geprüft. Es wurde festgestellt, dass es keinen signifikanten Unterschied der IL-10-Konzentrationen gibt, die von ruhenden oder stimulierten Monozyten von prä-IDD- oder gesunden Kontrollpersonen gebildet wurden.
Diese Daten belegen, dass die PGS-2-Expression keine Sekundärwirkung von hohen Konzentrationen der IL-1β- oder TNFα-Bildung oder des Fehlens der IL-10-Sekretion durch prä-IDD-Monozyten ist. Diese Befunde stützen die Auffassung, dass die PGS-2-Expression in den prä-IDD-Monozyten einen primären Defekt darstellt.
Beispiel 6 – PGS-2-mRNA-Expression
Es wurde festgestellt, dass eine PGS-2-mRNA-Expression in prä-IDD-Personen stabil ist, da 5 Personen, die bei mehr als einer Gelegenheit (im Abstand von 3 bis 6 Monaten nach der früheren Untersuchung) positiv bleiben. Gleichermaßen bleiben 6 PGS-2-negative Kontrollpersonen bei einem ähnlichen Nachfolgetest negativ (vergl. Tabelle 6).
Tabelle 6
Beispiel 7 – PGS-2-Expression als primärer oder sekundärer Defekt
Sechs Langzeit-IDD-Patienten (Diabetes seit mehr als 5 Jahren) (wobei 5 dieser 6 Personen PGS-2 exprimieren) werden analysiert. Die Untersuchungen zeigen, dass ICA bei IDD-Patienten innerhalb von 5 Jahren nach dem Auftreten von klinischem Diabetes verloren geht, was einen "ausgebrannten" Autoimmunprozess widerspiegelt. Diese Daten liefern ferner einen Beleg für die Auffassung, dass PGS-2 einen primären Monozytendefekt bei humanem IDD ist, wie es bei den NOD-Mäusen der Fall ist.
Die Identifizierung von PGS-2 als primärer Defekt ermöglicht die Verwendung von PGS-2 als einem frühen zellulären Marker für IDD-Anfälligkeit. Unterschiede im PGS-2-Gen von normalen Personen und autoimmunen Personen können dazu herangezogen werden, ein genetisches Screening auf Personen durchzuführen, um eine Anfälligkeit für Diabetes oder eine andere Autoimmunkrankheit festzustellen.
Unabhängig vom Status als primärer Defekt spiegelt die PGS-2-Expression einen aktiven Autoimmunprozess wider und erweist sich als sehr vorteilhaft beim Identifizieren von Personen mit hohem IDD-Risiko. Diesbezüglich verlief bei PGS- 2-positiven Personen, die die höchsten Konzentrationen an PGS-2 bildeten, die Weiterentwicklung zum klinischen Diabetes am raschesten. Ferner ist es bekannt, dass Autoimmunkrankheiten sich zu spontanen Remissionen oder Verschlechterungen entwickeln. Die PGS-2-Expression kann zum Identifizieren und/oder Überwachen derartiger Veränderungen der Krankheitsaktivität herangezogen werden, d. h. ein positiver PGS-2-Befund spiegelt einen höheren Grad der Krankheitsaktivität wider, während ein Verlust an PGS-2-Expression ein Anzeichen für eine Remission ist. Dies ist von großer Bedeutung bei IDD, wo keine physikalischen Anzeichen oder Symptome einen Hinweis auf eine Verschlechterung des Autoimmunangriftes auf die Insulin erzeugenden Zellen liefern.
PGS-2 wird in einem hohen prozentualen Anteil von Monozyten von Personen mit Autoimmunstörungen, wie SLE und Thyroiditis, exprimiert. Somit kann eine PGS-2-Expression in Monozyten als zellulärer Marker für andere Autoimmunkrankheiten zusätzlich zu IDD herangezogen werden. Beim Screening von gesunden Personen ist eine Person auffällig, deren Monozyten stark positiv in Bezug auf die PGS-2-Expression sind und bei denen die persönliche oder familiäre Anamnese keinen Hinweis auf Autoimmunkrankheiten liefert. Diese Person entwickelte 6 Wochen nach dem Screening das Raynaud-Phänomen und erwies sich in Bezug auf ANA als hochgradig positiv, was auf die Entwicklung einer vaskulären Kollagenkrankheit schließen lässt. Dies stützt zusätzlich die Eignung der vorliegenden Erfindung für das allgemeine Screening auf Autoimmunfehlfunktionen.
Beispiel 8 – FACS-Test auf PGS-2
Ein Aspekt der Erfindung besteht in einer fluoreszierend aktivierten Zellsortiervorrichtung (FACS), auf der Grundlage eines Tests auf PGS-2-Protein. Bei Anwendung dieses Tests ist es möglich, den prozentualen Anteil an Zellen im peripheren Blut, die das PGS-2-Protein exprimieren, quantitativ zu bestimmen. Dieser Test bedient sich eines Antikörpers, der spezifisch an das PGS-2-Protein bindet. Die Bindung dieses Antikörpers an PGS-2 kann nachgewiesen werden, da der Antikörper an ein fluoreszierendes Molekül gekuppelt ist, der durch die Laserstrahlen der FACS-Vorrichtung nachgewiesen werden kann. Bei Anwendung dieses Verfahrens, bei dem nur ein halber Teelöffel Blut erforderlich ist, ist es möglich, die Expression von PGS-2-Protein in Blutzellen nachzuweisen und den prozentualen Anteil an Monozyten von prä-IDD-Personen zu bestimmen, die konstitutiv dieses Enzym exprimieren.
Es ist darauf hinzuweisen, dass die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur zu Erläuterungszwecken dienen.

Claims

In vitro-Verfahren zum Nachweis der Empfindlichkeit gegenüber einer Autoimmunkrankheit oder zum Überwachen des Fortschreitens einer derartigen Krankheit, umfassend das Testen von Antigen-präsentierenden Zellen auf eine verstärkte Expression von Prostaglandin-synthase 2 (PGS-2).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Expression von PGS-2 durch die Anwesenheit von PGS-2-Messenger-RNA nachgewiesen wird.
Verfahren nach Anspruch 2, umfassend den Nachweis der PGS-2-Messenger-RNA durch reverse Transkriptase-PCR.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Antigen-präsentierenden Zellen unter Makrophagen und Monozyten ausgewählt sind.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei es sich bei den Antigen-präsentierenden Zellen um periphere Blutmonozyten handelt.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, umfassend das Testen der Antigen-präsentierenden Zellen auf die Anwesenheit von verstärkten Konzentrationen an PGE₂.