DE69734828T2

DE69734828T2 - 5-aminolevulinsaure synthase aus aspergillus oryzae und dafuer kodierende nukleinsaeure

Info

Publication number: DE69734828T2
Application number: DE69734828T
Authority: DE
Inventors: L. Susan ELROD; R. Joel CHERRY
Original assignee: Novozymes Inc
Current assignee: Novozymes Inc
Priority date: 1996-06-10
Filing date: 1997-06-09
Publication date: 2006-10-26
Anticipated expiration: 2017-06-10
Also published as: WO1997047736A1; DK0904356T3; JP2000501294A; ATE312169T1; CN1110554C; US5871991A; AU3382097A; DE69734828D1; EP0904356B1; US5958747A; CN1215428A; EP0904356A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft 5-Aminolevulinsäuresynthasen von Aspergillus oryzae und isolierte Nukleinsäurefragmente, die die 5-Aminolevulinsäuresynthasen kodierenden Nukleinsäuresequenzen umfassen. Die Erfindung betrifft auch die Nukleinsäuresequenzen umfassende Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und Wirtszellen, sowie Verfahren zur Herstellung der 5-Aminolevulinsäuresynthasen.
Beschreibung des Stands der Technik
Häm, ein Chelatkomplex von Protoporphyrin IX und Eisen, fungiert als prosthetische Gruppe von Hämoproteinen. Protoporphyrin IX besteht aus einem mit vier Methylgruppen, zwei Vinylgruppen und zwei Propionsäuregruppen substituierten Porphyrinring, der ein Eisenatom zum Bilden eines Häms aufnimmt. Die Biosynthese von Häm aus Glycin und Succinyl-CoA beteiligt acht enzymatische Schritte. Das erste Enzym im Biosyntheseweg ist 5-Aminolevulinsäuresynthase, die die Kondensation von Glycin und Succinyl-CoA unter Bildung von 5-Aminolevulinsäure katalysiert. Bei der Biosynthese von Häm in Leberzellen und differenzierenden Erythrocyten ist 5-Aminolevulinsäure ein regulatorisches Schlüsselenzym.
Die Umwandlung eines Apoproteins zu einem Hämoprotein hängt von der Verfügbarkeit von durch den Häm-Biosyntheseweg bereitgestelltem Häm ab. Die Apoproteinform des Hämoproteins vereinigt sich mit Häm zur Herstellung des aktiven Hämoproteins. Das aktive Hämoprotein nimmt eine Konformation an, die das Hämoprotein für proteolytischen Angriff stabiler als das Apoprotein macht. Ist die Menge an durch einen Mikroorganismus hergestelltem Häm in Bezug auf die Menge an hergestelltem Apoprotein geringer, häuft sich das Apoprotein an und unterzieht sich proteolytischem Abbau, wodurch die Ausbeute des aktiven Hämoproteins vermindert wird.
Zum Bewältigen dieses Problems zeigte Jensen, dass die Zugabe von Häm oder eines hämhaltigen Materials zu einem Fermentationsmedium zu einer deutlichen Zunahme der Ausbeute einer durch Aspergillus oryzae hergestellten Peroxidase führt (WO 93/19195). Während die Hämergänzung eines Fermentationsmediums zu einer deutlichen Verbesserung der Ausbeute eines Hämoproteins führt, ist dies nicht koscher, kostenintensiv und im großen Maßstab schwierig zu realisieren.
Das Klonen und Sequenzieren eines 5-Aminolevulinsäuresynthasegens von Aspergillus nidulans (Bradshaw et al., 1993, Current Genetics 2233:501–507) wurden offenbart.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue 5-Aminolevulinsäuresynthasen und diese kodierende Gene bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft im Wesentlichen reine von Aspergillus oryzae erhaltene 5-Aminolevulinsäuresynthasen und isolierte Nukleinsäurefragmente, die eine eine 5-Aminolevulinsäuresynthase von Aspergillus oryzae kodierende Nukleinsäuresequenz umfassen. Die vorliegende Erfindung stellt des Weiteren eine Nukleinsäurefragment der vorliegenden Erfindung umfassende Nukleinsäurekonstrukte, Vektoren und rekombinante Wirtszellen, sowie Verfahren zur Herstellung der 5-Aminolevulinsäuresynthasen bereit.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt eine Restriktionsabbildung von Plasmid pSE04.
2 zeigt eine Restriktionsabbildung eines genomischen Fragments mit 4,2 kb, das ein 5-Aminolevulinsäuresynthasegen von Aspergillus oryzae enthält. Eine Skalierung in Kilobasen (kb) ist unter der Abbildung dargestellt. Der Pfeil stellt die Lokalisierung des offenen Ableserahmens des Gens dar.
3 zeigt das Nukleotid und die abgeleitete Aminosäuresequenz von einem 5-Aminolevulinsäuresynthasegen von Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 1 bzw. 2). Möglicherweise wichtige Transktiptionsstellen, CCAAT-Box und TATA-Box sind unterstrichen. Die zwei bewahrten mutmaßlichen HRM-Motive sind umrandet; die an der pyridoxalen Phosphat-Co-Faktorbindung beteiligte Glycinschleife ist eingekreist und das wichtige Lysin ist mit einem Sternchen gekennzeichnet.
4 zeigt die bewahrten regulatorischen Hämmotive in verschiedenen 5-Aminolevulinsäuresynthasegenen. Die Pentapeptidmotive sind umrandet.
5 zeigt den Abgleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen für 5-Aminolevulinsäuresynthasen von Aspergillus oryzae, Aspergillus nidulans, Saccharomyces cerevisiae und Humanerythroid (SEQ ID NO: 2, 16, 17 bzw. 18). Bewahrte Aminosäuren sind umrandet.
6 zeigt eine Restriktionsabbildung von Plasmid pBANe6.
7 zeigt eine Restriktionsabbildung von Plasmid pSE31,
8 zeigt eine Restriktionsabbildung von Plasmid pJVi9.
9 zeigt eine Restriktionsabbildung von Plasmid pJeRS6.
10 zeigt eine Restriktionsabbildung von Plasmid pJRoC50.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft wie vorstehend erwähnt von einem Stamm von Aspergillus oryzae erhaltene 5-Aminolevulinsäuresynthasen. Stämme dieser Spezies sind für die Öffentlichkeit in einer Vielzahl von Kultursammlungen wie in der American Type Culture Collection (ATCC), der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), dem Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), dem International Mycological Institute (IMI), der Agricultural Research Service Patent Culture Collection, dem Northern Regional Research Center (NRRL) und dem Institute for Fermentation in Osaka, Japan (IFO) zugänglich.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung von Aspergillus oryzae oder einem mutanten Stamm davon erhältliche 5-Aminolevulinsäuresynthasen. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung von Aspergillus oryzae IFO oder einem mutanten Stamm davon erhältliche 5-Aminolevulinsäuresynthasen, z.B. die 5-Aminolevulinsäuresynthase mit der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz.
Die Identifikation und Isolierung von 5-Aminolevulinsäuresynthasegenen von einer anderen Quelle als diejenigen, die hier spezifisch veranschaulicht sind, können unter Verwendung der in den vorliegenden Beispielen beschriebenen Methodik mit allgemein erhältlichen Aspergillus-Stämmen erhalten werden.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet der Begriff „erhalten von", dass die 5-Aminolevulinsäuresynthase durch eine spezifische Quelle, z.B. einen Aspergillus-Stamm oder durch eine Zelle, in welche ein Gen von der die 5-Aminolevulinsäuresynthase kodierenden Quelle eingefügt wurde, hergestellt wird.
Die Erfindung umfasst auch 5-Aminolevulinsäuresynthasevarianten, die eine mindestens etwa 85%ige Homologie mit der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz aufweisen und die die Aktivität der hier beschriebenen 5-Aminolevulinsäuresynthasen qualitativ bewahren. Die vorliegende Erfindung betrifft auch 5-Aminolevulinsäuresynthasevarianten, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die sich durch drei Aminosäuren, vorzugsweise durch zwei Aminosäuren und stärker bevorzugt durch eine Aminosäure von der in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz unterscheiden. Jeder Unterschied kann eine Einfügung oder Deletion einer Aminosäure oder die Substitution eines Aminosäurerests durch eine andere Aminosäure sein. Nützliche Varianten in den vorstehend definierten Kategorien schließen z.B. diejenigen ein. in welchen bewahrende Aminosäuresubstitutionen durchgeführt wurden, wobei die Substitutionen die Aktivität des Proteins nicht merklich beeinträchtigen. Der Begriff bewahrende Substitution bedeutet, dass Aminosäuren derselben Klasse durch eine beliebige andere Aminosäure dieser Klasse substituiert werden können. Zum Beispiel können die nicht polaren aliphatischen Reste Ala, Val, Leu und Ile, sowie die basischen Reste Lys und Arg oder die sauren Aminosäurereste Asp und Glu untereinander ausgetauscht werden. Gleichermaßen sind Ser und Thr, sowie Asn und Gln bewahrende Substitutionen füreinander.
Die physikalisch chemischen Eigenschaften der 5-Aminolevulinsäuresynthasen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von verschiedenen auf dem Fachgebiet bekannten Techniken, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf SDS-PAGE, isoelektrisches Fokussieren und Kreuzreaktionsimmunidentitätstests bestimmt werden.
Die 5-Aminolevulinsäuresynthasen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren untersucht werden.
Die 5-Aminolevulinsäuresyntasen der vorliegenden Erfindung können durch eine Vielzahl von auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren, einschließlich jedoch nicht beschränkt auf Chromatographie (z.B. Ionenaustausch, Affinität, hydrophobe, Chromatofokussieren und Größenausschluss), elektrophoretische Verfahren (z.B. präparatives isoelektrisches Fokussieren), unterschiedliche Löslichkeit (z.B. Ammoniumsulfatausfällung oder Extraktion (siehe z.B. Protein Purification, Hrgb. J.-C. Janson und Lars Ryden, VCH Publishers, New York, 1989) gereinigt werden. Wie hier definiert, ist eine „im Wesentlichen reine" 5-Aminolevulinsäuresyntase eine 5-Aminolevulinsäuresyntase, die im Wesentlichen frei von anderen Proteinen, bei welchen es sich um keine 5-Aminolevulinsäuresyntase handelt, z.B. wie durch SDS-PAGE bestimmt mindestens etwa 20% rein, vorzugsweise etwa 40% rein, stärker bevorzugt etwa 60% rein, noch stärker bevorzugt etwa 80% rein, besonders bevorzugt etwa 90% rein und insbesondere mindestens etwa 95% rein ist.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Nukleinsäurefragmente, die eine eine 5-Aminolevulinsäuresyntase der vorliegenden Erfindung kodierende Nukleinsäuresequenz umfassen, und ein Nukleinsäurefragment der vorliegenden Erfindung umfassende Nukleinsäurekonstrukte.
In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die Nukleinsäuresequenz eine von Aspergillus oryzae erhältliche 5-Aminolevulinsäuresyntase. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform kodiert die Nukleinsäuresequenz eine von Aspergillus oryzae IFO 4177 erhältliche 5-Aminolevulinsäuresyntase, z.B. die in SEQ ID NO:1 dargestellte Nukleinsäuresequenz. Die vorliegende Erfindung umfasst auch Nukleinsäuresequenzen, die eine 5-Aminolevulinsäuresyntase mit der in SEQ ID NO:2 dargelegten Aminosäuresequenz kodiert, die sich von SEQ ID NO:1 durch die Entartung des genetischen kodes unterscheidet. Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung umfassen sowohl die darin dargestellte genomische Sequenz, sowie die entsprechenden cDNA- und RNA-Sequenzen, und der Ausdruck „Nukleinsäuresequenz" ist wie hier verwendet so zu verstehen, dass er alle derartigen Variationen, einschließlich synthetische DANN, umfasst.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Nukleinsäurefragment der vorliegenden Erfindung umfassende Nukleinsäurekonstrukte. Der Begriff „Nukleinsäurekonstrukt" soll so zu verstehen sein, dass er ein entweder einzel- oder doppelstrangiges Nukleinsäuremolekül bedeutet, das von einem natürlich vorkommenden Gen isoliert oder derart modifiziert wurde, dass es Nukleinsäuresegmente enthält, die in einer sonst in der Natur nicht vorkommenden Weise kombiniert und nebeneinander gestellt wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäurekonstrukte funktionsfähig an regulatorische Regionen gebunden, die die Expression der 5-Aminolevulinsäuresyntase in einem geeigneten Wirt leiten können.
Die vorliegende Erfindung stellt auch rekombinante Vektoren bereit, die ein Nukleinsäurekonstrukt der vorliegenden Erfindung umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig an eine Promotersequenz gebunden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfassen die Vektoren der vorliegenden Erfindung des Weiteren ein Transktiptionsterminationssignal und/oder einen selektierbaren Marker.
Die rekombinanten Vektoren der Erfindung sind zur Expression eines 5-Aminolevulinsäuresyntasegens von Aspergillus oryzae in aktiver Form nützlich. Ein nützlicher Vektor enthält ein Element, das unabhängig vom Genom eine stabile Integration des Vektors in das Wirtszellengenon oder eine autonome Replikation des Vektors in einer Wirtszellen der Wirtszelle erlaubt, und vorzugsweise einen oder mehrere phenotypische Marker, der/die eine leichte Selektion von transformierten Wirtszellen erlaubt/erlauben. Der Vektor kann auch Kontrollsequenzen wie einen Promoter, eine Ribosombindungsstelle, ein Translationsinitiierungssignal und wahlweise einen selektierbaren Marker oder verschiedene Aktivator- oder Repressorsequenzen einschließen. Zum Erlauben der Sekretion des exprimierten Proteins können eine Signalsequenz kodierende Nukleinsäuren vor die Kodierungssequenz des Gens eingefügt werden. Zur Expression unter der Leitung von Kontrollsequenzen ist ein erfindungsgemäß zu verwendendes 5-Aminolevulinsäuresyntasegen in derartiger Weise funktionsfähig an Kontrollsequenzen gebunden, dass eine Expression der Kodierungssequenz unter mit den Kontrollsequenzen verträglichen Bedingungen erzielt wird.
Bei den ein Nukleinsäurekonstrukt der vorliegenden Erfindung tragenden Vektoren kann es sich um einen beliebigen Vektor handeln, der günstigerweise rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen wurde. Die Auswahl eines Vektors hängt typischerweise von der Wirtszelle ab, in welcher der Vektor einzubringen ist. Der Vektor kann ein autonom replizierender Vektor, d.h. ein Vektor, der als extrachromosomale Einheit vorliegt, wobei die Replikation davon von der chromosomalen Replikation unabhängig ist, z.B. ein Plasmid, ein extrachromosomales Element, ein Minichromosom oder ein künstliches Chromosom sein. In einer anderen Ausführungsform kann der Vektor einer sein, der beim Einbringen in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert und zusammen mit dem (den) Chromosom(en), in welche/s er integriert wurde, repliziert wird. Bei dem Vektorsystem kann es sich um einen einzelnen Vektor oder ein einzelnes Plasmid oder zwei oder mehrere Vektoren oder Plasmide, die zusammen die gesamte in das Genom zu integrierende DNA enthalten, handeln.
In den Vektoren sollte die DNA-Sequenz funktionsfähig an eine geeignete Promotersequenz gebunden sein. Der Promoter kann eine beliebige in der Wirtszelle der Wahl transkriptionelle Aktivität zeigende DNA-Sequenz sein und von Proteine entweder homolog oder heterolog zu der Wirtszelle kodierenden Genen erhalten werden. Beispiele für geeignete Promoter zum Leiten der Transktiption des Nukleinsäurekonstrukts der Erfindung, insbesondere in einer Bakterienwirtszelle sind die Promoter des lac-Operons von E. coli, die dagA-Promoter des Agarasegens von Streptomyces coelicolor, die Promoter des α-Amylasegens (amyL) von Bacillus licheniformis, die Promoter des maltogenen Amylasegens (amyM) von Bacillus stearothermophilus, die Promoter der α-Amylase (amyQ) von Bacillus amyloliquefaciens, die Promoter der xylA- und xylB-Gene von Bacillus subtilis, der prokaryontische β-Lactamasepromoter (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75:3727–3731) oder der tac-Promoter (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80:21–25). Weitere Promoter sind in „Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242:74–94; und in Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor, New York, 1989, beschrieben. In einem Hefewirt ist ein nützlicher Promoter der eno-1-Promoter. Zur Transkription in einer Pilzzelle sind Beispiele für nützliche Promoter diejenigen, die von den Genen abgeleitet werden, die TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, Aspartamproteinase von Rhizomucor miehei, neutrale α-Amylase von Aspergillus niger, säurestabile α-Amylase von Aspergillus niger, Glucoamylase (glaA) von Aspergillus niger oder Aspergillus awamori, Lipase von Rhizomucor miehei, alkalische Protease von Aspergillus oryzae, Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae oder Acetamidase von Aspergillus nidulans kodieren. Besonders bevorzugte Promoter sind die TAKA-Amylase-, NA2-tpi- (ein Hybrid der Promoter von den Genen, die neutrale α-Amylase von Aspergillus niger und Triosephosphatisomerase von Aspergillus oryzae kodieren) und glaA-Promoter.
Die Vektoren der Erfindung können auch einen geeigneten Transktiptionsterminator und in Eukarionten Polyadendenylierungssequenzen, die funktionsfähig an die die 5-Aminolevulinsäuresynthase der vorliegenden Erfindung kodierende DNA-Sequenz gebunden sind, umfassen. Terminierungs- und Polyadenylierungssequenzen können von denselben Quellen wie der Promoter erhalten werden. Die Vektoren können des Weiteren eine DNA-Sequenz umfassen, die es ermöglicht, dass die Vektoren in der fraglichen Wirtszelle replizieren. Beispiele für derartige Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC19, pACYC177, pUB110, pE194, pAMB1 und pIJ702.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten vorzugsweise einen oder mehrere selektierbare Marker, die eine leichte Selektion von transformierten Zellen gewähren. Ein selektierbarer Marker ist ein Gen, dessen Produkt biozide oder virale Resistenz, Resistenz gegen Schwermetalle, Prototrophie für Auxotrophe und dergleichen bereitstellt. Der selektierbare Marker kann ausgewählt werden, aus der Gruppe, bestehend aus amdS, pyrG, argB, niaD, sC, trpC, bar und hygB, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Bevorzugt zur Verwendung in einer Aspergillus-Zelle sind die amdS- und pyrG-Marker von Aspergillus nidulans oder Aspergillus oryzae und der bar-Marker von Streptomyces hygroscopicus. Weiterhin kann eine Selektion durch Cotransformation, z.B. wie in WO 91/17243, wo der selektierbare Marker in einem separaten Vektor enthalten ist, beschrieben, erzielt werden.
Die Vektoren der vorliegenden Erfindung enthalten auch eine Signalpeptidkodierungsregion, die für eine an den Aminoterminus des biosynthetischen Häm-Enzyms gebundene Aminosäuresequenz kodiert, wobei die Lokalisierung der 5-Aminolevulinsäuresynthase zu einer bestimmten Zellabteilung erlaubt wird. Die Signalpeptidkodierungsregion kann für die erste die 5-Aminolevulinsäuresynthase kodierende Nukleinsäuresequenz nativ sein oder von fremden Quellen erhalten werden. Das 5'-Ende der Kodierungssequenz der ersten Nukleinsäuresequenz kann selbst eine Signalpeptidkodierungsregion enthalten, die auf natürliche Weise im Translationsableserahmen mit dem die lokalisierte 5-Aminolevulinsäuresynthase kodierenden Segment der Kodierungsregion verbunden ist. In einer anderen Ausführungsform kann das 5'-Ende der Kodierungssequenz Nukleinsäuren enthalten, die eine Signalpeptidkodierungsregion enthalten, die für denjenigen Teil der Kodierungssequenz fremd ist, der das lokalisierte biosynthetische Häm-Enzym kodiert. Die Signalpeptidkodierungsregion kann von einem ATPase-Gen von Neurospora crassa (Viebrock et al., 1982, EMBO Journal 1:565–571) oder von einem Cytochrome-c-Peroxidasegen von Saccharomyces cerevisiae (Kaput et al., 1982, Journal of Biological Chemistry 257:15054–15058) erhalten werden. Jedoch kann jede beliebige Signalpeptidkodierungsregion in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, die eine Lokalisierung der 5-Aminolevulinsäuresynthase in einem Fadenpilzwirt der Wahl erlauben kann.
Zum Vermeiden der Notwendigkeit des Unterbrechens der Zelle zum Erhalt der exprimierten 5-Aminolevulinsäuresynthase und zum Minimieren der Menge an möglichem Abbau der exprimierten 5-Aminolevulinsäuresynthase in der Zelle ist es bevorzugt, das eine Expression des 5-Aminolevulinsäuresynthasegens ein Produkt liefert, das außerhalb der Wirtszelle sekretiert wird. Dazu kann die 5- Aminolevulinsäuresynthasen der vorliegenden Erfindung folglich eine Präregion umfassen, die die Sekretion des exprimierten Proteins in das Kulturmedium erlaubt. Falls gewünscht kann diese Präregion für die 5-Aminolevulinsäuresynthase der Erfindung nativ oder mit einer anderen Präregion oder Signalsequenz substituiert, was günstigerweise durch Substitution der die jeweiligen Präregionen kodierenden DNA-Sequenzen erzielt wird, sein. Zum Beispiel kann die Präregion von einem Glucoamylase- oder einem Amylasegen von einer Aspergillus-Spezies, einem Amylasegen von einer Bacillus-Spezies, einem Lipase- oder Proteinasegen von Rhizomucor miehei, dem Gen für den α-Faktor von Saccharomyces cerevisiae oder dem Kalbs-Präprochymosingen erhalten werden. Besonders bevorzugt ist die Präregion der TAKA-Amylase von Aspergillus oryzae, der neutralen Amylase von Aspergillus niger, der maltogenen Amylase von Bacillus NCIB 11837, der α-Amylase von Bacillus stearothermophilus oder von Subtilisin von Bacillus licheniformis. Eine wirksame Signalsequenz für Pilzwirte ist das TAKA-Amylasesignal von Aspergillus oryzae, das Aspartamproteinasesignal von Rhizomucor miehei oder das Lipasesignal von Rhizomucor miehei.
Die Verfahren, die zum Ligieren des Nukleinsäurekonstrukts der Erfindung, des Promoters, Terminators oder von anderen Elementen oder von zu deren Einfügen in geeigneten Vektoren, die die zur Replikation nötige Information enthalten, verwendet werden, sind dem Fachmann bekannt (vergleiche z.B. Sambrook et al., vorstehend).
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Nukleinsäurekonstrukt oder einen Expressionsvektor der Erfindung umfassende Wirtszellen, die vorteilhafterweise bei der rekombinanten Herstellung der 5-Aminolevulinsäuresynthasen der Erfindung verwendet werden. Die Zelle kann mit dem Nukleinsäurekonstrukt der Erfindung günstigerweise durch Integrieren des Konstrukts in das Wirtschromosomn transformiert werden. Es wird allgemein angenommen, dass diese Integration vorteilhaft ist, da die Sequenz wahrscheinlicher in der Zelle stabil gehalten wird. Eine Integration des Konstrukts in das Wirtschromosom. kann gemäß herkömmlichen Verfahren, z.B. durch homologe oder nicht homologe Rekombination durchgeführt werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Zelle mit einem wie nachstehend in Verbindung mit den verschiedenen Wirtszellentypen beschriebenen Expressionsvektor transformiert werden.
Die Wahl der Wirtszellen und Vektoren hängt größtenteils von der 5-Aminolevulinsäuresynthase und ihrer Quelle ab. Die Wirtszelle kann aus prokariontischen Zellen wie Bakterienzellen ausgewählt werden. Beispiele für geeignete Bakterien sind grampositive Bakterien, wie Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulars, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus, oder gramnegative Bakterien wie E. coli. Die Transformation der Bakterien kann z.B. durch Protoplasttransformation oder unter Verwendung von kompetenten Zellen in einer an sich bekannten Weise bewirkt werden.
Die Wirtszelle ist vorzugsweise ein Eukariont wie eine Säugerzelle, eine Insektenzelle, eine Pflanzenzelle oder vorzugsweise eine Hefe- und Fadenpilze einschließende Pilzzelle. Zum Beispiel schließen nützliche Säugerzellen CHO- oder COS-Zellen ein. Eine Hefewirtszelle kann ausgewählt werden aus einer Spezies von Saccharomyces oder Schizosaccharomyces, z.B. Saccharomyces cerevisiae. Nützliche Fadenpilze können ausgewählt werden aus einer Spezies von Aspergillus, z.B. Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger. In einer anderen Ausführungsform kann ein Stamm einer Fusarium-Spezies, z.B. Fusarium oxysporum oder Fusarium graminearum als Wirtszelle verwendet werden. Pilzzellen können durch ein Verfahren unter Beteiligung von Protoplastformation, Transformation der Protoplaste und Regeneration der Zellwand in einer an sich bekannten Weise transformiert werden. Ein geeignetes Verfahren zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen ist in EP 238 023 beschrieben. Ein geeignetes Verfahren zum Transformieren von Fusarium-Spezies ist von Malardier et al., 1989, Gene 78:147–156 oder in US 6,060,305 beschrieben.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Expression des 5-Aminolevulinsäuresynthasegens in einer Pilzwirtszelle wie Aspergillus erzielt. Das 5-Aminolevulinsäuresynthasegen wird in ein Plasmid ligiert, das vorzugsweise den TAKA-Amylaseptomoter von Aspergillus oryzae oder den neutralen Amylase-NA2-Promoter und amdS oder pyrG von Aspergillus niger als selektierbarer Marker enthält. In einer anderen Ausführungsform kann der selektierbare Marker auf einem separaten Plasmid vorliegen und bei der Cotransformation verwendet werden. Das Plasmid (oder die Plasmide) wird (werden) zum Transformieren einer Wirtszelle einer Aspergillus-Spezies wie Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger gemäß in Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81:1470–1474 beschriebenen Verfahren verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung einer 5-Aminolevulinsäuresynthase der vorliegenden Erfindung, umfassend (a) Züchten eines Stamms von Aspergillus oryzae in einem Nährmedium zur Herstellung der 5-Aminolevulinsäuresynthase und (b) Gewinnen der 5-Aminolevulinsäuresynthase.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zum rekombinanten Herstellen einer 5-Aminolevulinsäuresynthase der vorliegenden Erfindung, umfassend (a) Fermentieren einer Wirtszelle, umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt, umfassend eine die 5-Aminolevulinsäuresynthase kodierende Nukleinsäuresequenz, unter Bedingungen, die für die Herstellung des Enzyms förderlich sind, und (b) Gewinnen der 5-Aminolevulinsäuresynthase. Sekretiert das Expressionssystem die 5-Aminolevulinsäuresynthase in das Fermentationsmedium, kann das Enzym direkt aus dem Medium gewonnen werden. Wird die rekombinante 5-Aminolevulinsäuresynthase nicht sekretiert, kann es aus Zelllysaten gewonnen werden.
Jedes beliebige auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren zum Züchten einer Zelle kann verwendet werden, das zur Expression oder Isolierung einer 5-Aminolevulinsäuresynthase der vorliegenden Erfindung führt. Zum Beispiel ist das Züchten derart zu verstehen, dass das Züchten in einem Schüttelkolben, Fermentation in kleinem oder großem Maßstab (einschließlich kontinuierliche, Chargen-, Zufuhrchargen- oder Festzustandsfermentationen) in Labor- oder industriellen Fermentatoren, durchgeführt in einem geeignetem Medium und unter Bedingungen, die die Expression oder Isolierung der 5-Aminolevulinsäuresynthase erlauben, umfasst. Das Züchten findet in einem geeignetem Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und anorganische Salze umfassenden Nährmedium unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren (siehe z.B. Bennett, J.W. und LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991) statt. Geeignete Medien sind von kommerziellen Lieferanten verfügbar oder können gemäß veröffentlichten Zusammensetzungen (z.B. in Katalogen der American Type Culture Collection) hergestellt werden.
Die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellten 5-Aminolevulinsäuresynthasen können durch herkömmliche Verfahren, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf Zentrifugation, Filtration, Sprühtrocknen, Eindampfen oder Ausfällung aus dem Fermentationsmedium gewonnen werden. Das gewonnene Protein kann dann durch eine Vielzahl von chromatographischen Verfahren, z.B. Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Affinitätschromatographie oder dergleichen weiter gereinigt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Verfahren zur Verwendung der 5-Aminolevulinsäuresynthasen.
Die 5-Aminolevulinsäuresynthasen der vorliegenden Erfindung können zum Umwandeln von Glycin und Succinyl-CoA zu als Herbizid nützlicher 5-Aminolevulinsäure verwendet werden.
Die 5-Aminolevulinsäuresynthasen der vorliegenden Erfindung können auch zum Erhöhen der Ausbeute eines durch eine Wirtszelle hergestelltenen Hämproteins, wobei die 5-Aminolevulinsäuresynthase ein die Geschwindigkeit beschränkender Schritt bei der Herstellung von Häm in der Wirtszelle ist, durch Überexprimieren der die 5-Aminolevulinsäuresynthase in der Wirtszelle kodierenden Nukleinsäuresequenz verwendet werden. Das Verfahren umfasst:

(a) Einbringen von einer oder mehreren Kopien der die 5-Aminolevulinsäuresynthase kodierenden Nukleinsäuresequenz in die Wirtszelle, die das Hämprotein kodieren kann, wobei die Nukleinsäuresequenz funktionsfähig an regulatorische Regionen gebunden wird, die die Expression der 5-Aminolevulinsäuresynthase leiten können;
(b) Züchten der Zelle in einem zur Herstellung des Hämproteins und der 5-Aminolevulinsäuresynthase geeigneten Nährmedium; und
(c) Gewinnen des Hämoproteins aus dem Nährmedium der Zelle.

Die vorliegende Erfindung wird des Weiteren durch die folgenden Beispiele beschrieben, die nicht als Beschränkung des Umfangs der Erfindung angesehen werden sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1: Extraktion der genomisehen DNA des StammsA1560 von Aspergillus oryzae
Man ließ den Stamm A1560 von Aspergillus oryzae (IFO 4177) in 25 ml Medium aus 0,5%igem Hefeextrakt und 2%Glucose (YEG) für eine Dauer von 24 Stunden bei 32°C und 250 UpM wachsen. Die Mycelien wurden dann durch Miracloth (Calbiochem, La Jolla, CA) abfiltriert und einmal mit 25 ml 10 mM Puffer aus Tris und 1 mM EDTA (TE) gewaschen. Überschüssiger Puffer wurde von den Mycelien abgezogen, die anschließend in flüssigem Stichstoff eingefroren wurden. Die gefrorenen Mycelien wurden Pulver in einer elektrischen Kaffeemühle zu einem feinen gemahlen und das Pulver zu 20 ml TE-Puffer und zu 5 ml 20%iger G/V Natriumdodecylsulfatlösung (SDS) in einem geeigneten Einmalkunststoffzentrifugenröhrchen zugesetzt. Das Gemisch wurde zum Gewährleisen des Mischens mehrmals sanft gewendet und zweimal mit einem gleichen Volumen an Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1 V/V/V) extrahiert. Natriumacetat (3 M Lösung) wurde auf eine Endkonzentration von 0,3 M zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 2;5 Volumen eisgekühltem Ethanol zum Ausfällen der Nukleinsäuren. Die Nukleinsäuren wurden dann durch Zentrifugieren des Röhrchens mit 15.000 × g für eine Dauer von 30 Minuten pelletiert. Man ließ das Pellet für eine Dauer von 30 Minuten an Luft trocknen, bevor es in 0,5 ml TE-Puffer erneut suspendiert wurde. DNase-freie Ribonuklease A wurde auf eine Konzentration von 100 μg/m1 zugesetzt und das Gemisch bei 30°C für eine Dauer von 30 Minuten inkubiert. Proteinase K wurde dann mit einer Konzentration von 200 μg/ml zugesetzt und das Gemisch für eine zusätzliche Dauer von 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Schließlich wurde das Gemisch zweimal mit Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1 V/V/V) extrahiert, bevor die DNA wie früher beschrieben mit Natriumacetat und Ethanol ausgefällt wurde. Das DNA-Pellet wurde unter Vakuum getrocknet, erneut in TE-Puffer suspendiert und bei 4°C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt.
Beispiel 2: Konstruktion von Plasmid pSE04
Genomische DNA wurde vom Stamm A 26 von Aspergillus nidulans (Fungal Genetics Stock Center, Kansas City, KS) unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 1 beschrieben erhalten. Plasmid pSE04 wurde durch Ligieren von PCR-Fragmenten aus einer genomische DNA von A26 von Aspergillus nidulans enthaltenden Amplifikationsreaktion konstruiert. Die Amplifikationsreaktion enthielt die folgenden Bestandteile: 50 ng genomische DNA von A26 von Aspergillus nidulans, jeweils 100 μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), 50 pmol der Primer ALAS3d 5'-TTTATGATGGAGGCCCTTCTCCAGCAGTCTC-3' (SEQ ID NO:3) und ALAS4e 5'-CTATGCATTTAAGCAGCAGCCGCGACTGG-3' (SEQ ID NO:4), 2 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ) und 1x Taq-DNA-Polymerasepuffer (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ). Die Reaktion wurde in einer Wärmeumlaufapparatur des Typs Perkin Elmer (Perkin-Elmer Corp., Branchburg, NJ), programmiert auf 30 Zyklen, jeweils bei 95°C für eine Dauer von 1 Minute, 55°C für eine Dauer von 1 Minute und 72°C für eine Dauer von 90 Sekunden, inkubiert. Das PCR-Produkt mit 2 kb wurde durch Entfernung nach Elektrophorese unter Verwendung eines 1,1%igen Agarosegels mit niedriger Schmelztemperatur (FMC, Rockland, ME) mit 40 mM Puffer aus Tris, Acetat und 1 mM Dinatrium-EDTA (TAE) isoliert und gemäß den Anweisungen des Herstellers zur Herstellung von pSE04 (1) in den pCRII-Vektor (Invitrogen, San Diego, CA) subgeklont.
Beispiel 3: DNA-Genbanken des Stamms A1560 von Aspergillus oryzae und Identifikation von ALA-Synthase(hemA)-Klonen
Genomische DNA-Genbanken des Stamms A1560 von Aspergillus oryzae wurden unter Verwendung des Bakteriophagen-Klonvektors λZipLox (Life Technologies, Gaithersburg, MD) gemäß den Anweisungen des Herstellers unter Verwendung von Y1090ZL-Zellen von E. coli als Wirt zum Aufstreichen und Reinigen von rekombinantem Bakteriophage und DH10Bzip von E. coli zur Entfernung von einzelnen pZL1-hemA-Klonen konstruiert. Die gesamte wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellte Zell-DNA wurde mit Tsp509I teilweise verdaut und auf einem 1%igen Agarosegel mit 50 mM Puffer aus Tris, 50 mM Borat und 1 mM Dinatrium-EDTA (TBE) größenfraktioniert. DNA-Fragmente, die im Größenbereich von 4–7 kb migrierten, wurden entfernt und unter Verwendung von Prep-a-Gene-Reagenzien (BioRad Laboratories, Hercules, CA) aus dem Gel eluiert. Die eluierten DNA-Fragmente wurden mit EcoRI-gespaltenen und dephosphorylierten λZipLox-Vectorarmen ligiert und die Ligationsgemische unter Verwendung von im Handel erhältlichen Verpackungsextrakten (Stratagene, La Jolla, CA) verpackt. Die verpackten DNA-Genbanken wurden auf Y1090ZL-Zellen von E. coli aufgestrichen und amplifiziert. Die nicht amplifizierte genomische Genbank enthielt 1 × 10⁶ pfu/ml.
Bacteriophagen-DNA aus 7 × 10⁴ Plaques wurden in kreisförmige Zweifach-Nytran-Plus-Membranen (Schleicher & Schuell, Keene, NH) überführt und mit einer mit Digoxigenin (DIG) markierten Probe, die durch PCR-Amplifikation von genomischer DANN von hemA von Aspergillus nidulans von in Beispiel 2 beschriebenem Plasmid pSE04 hergestellt war, sondiert. Die Amplifikationsreaktion enthielt die folgenden Komponenten: 1X DIG Sondensynthesegemisch (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN), jeweils 100 μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 50 pmol Primer ALAS3d und Primer ALAS4e, beschrieben in Beispiel 2, 2 Einheiten Taq-DANN-Polymerase und 1x Taq-DANN-Polymerasepuffer. Die Reaktion wurde in einer Wärmeumlaufapparatur des Typs Perkin Elmer, programmiert auf 30 Zyklen, jeweils bei 95°C für eine Dauer von 1 Minute, 55°C für eine Dauer von 1 Minute und 72°C für eine Dauer von 2 Minuten, inkubiert. Die denaturierte Sonde wurde mit einer Konzentration von 2 ng/ml dem Hybridisierungspuffer zugesetzt und über Nacht mit vorhybridisierten Membranen inkubiert. Die Vorhybridisierung und Hybridisierung wurden bei 42°C in 5x SSC, 0,1% Sarkosyl, 0,02% SDS, 1% Geniusblockierungsreagens (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und 30% Formamid durchgeführt. Die Membranen wurden zweimal in 5x SSC/0,1% SDS gewaschen, gefolgt von zwei Waschungen in 2x SSC/0,1% SDS. Jede Waschung wurde für eine Dauer von 15 Minuten bei Raumtemperatur durchgeführt. Die gewaschene Membran wurde mit einem Film des Typs Kodak X-OMAT AR für eine Dauer von etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur belichtet, gefolgt von der Entwicklung unter Verwendung eines automatischen Filmprozessors des Typs Konica QX-70 gemäß den Anweisungen des Herstellers. Primäre Plagues wurden gereinigt und ein zweites Mal durchgemustert. Fünf Klone wurden identifiziert und gemäß den Anweisungen des Herstellers (Bethesda Research Laboratories, Inc., Gaithersburg, MD) in pZL-Derivate entfernt. Die pZL-Derivative wurden als DH5α pSE11, pSE13, pSE15, pSE17 und pSE20 von E. coli bezeichnet Es wurde gefunden, dass diese Klone eine Region mit 4,2 kb überlappte und überspannte, für welche die Restriktionsabbildung in 2 dargestellt ist.
Beispiel 4: Southern-Hybridisierung von genomischer DNA des Stamms A1560 von Aspergillus oryzae mit einer 5-Aminolevulinsäuresynthase(hemA)-Sonde
Genomische DNA des Stamms A1560 von Aspergillus oryzae (10 μg), hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde entweder mit BamHI oder EcoRI restriktionsverdaut. Die Fragmente wurden durch Elektrophorese auf einem 1%igen Agarose-TBE-Gel abgetrennt. DNA wurde in 0,4 N NaOH unter Verwendung einer TurboBlot-Apparatur (Schleicher & Schuell, Keene, NH) gemäß den Anweisungen des Herstellers zu einer Nytran-Plus-Membran überführt. Die Membrane wurden für eine Dauer von 2 Stunden bei 42°C in 5 X SSC, 0,1% Sarkosyl, 0,02% SDS, 1% Geniusblockierungsagens (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und 50% Formamid in einem Hybriddofen (Labnet, Woodbridge, NJ) prähybridisiert. Die Hybridisierung wurde mit einer mit DIG markierten hemA-Sonde, hergestellt durch PCR-Amplifikation wie in Beispiel 3, außer dass hemA-Klon pSEl7 als Templat verwendet wurde, mit Primer hemA5' 5'-TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3' (SEQ ID NO:5) und Primer hemA3' 5'-TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-3' (SEQ ID NO:6) erzielt. Die mit DIG markierte hemA-Sonde (1 ng Sonde/ml Lösung) wurde frischem Hybridisierungspuffer zugesetzt und mit der Membran über Nacht bei 42°C inkubiert. Anschließend wurde die Membran zweimal für eine Dauer von 15 Minuten jeweils bei Raumtemperatur in 5x SSC/0,1% SDS, gefolgt von zwei Waschungen unter denselben Bedingungen in 2x SSC/0,1% SDS gewaschen. Die gewaschene Membran wurde mit einem Film des Typs Kodak X-OMAT AR für eine Dauer von etwa 2 Stunden bei Raumtemperatur belichtet, gefolgt von der Entwicklung unter Verwendung eines automatischen Filmprozessors des Typs Konica QX-70 gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Die Southernblot-Hybridizsierung von genomischer DNA von Aspergillus oryzae mit der hemA-Sonde von Aspergillus oryzae zeigte die Gegenwart von Hybridisierungssignalen, die mit einer Einzelgenkopiezahl übereinstimmte. Eine in der BamHI-Spur beobachtete Bande mit 1,7 kb wurde aus der Restriktionsabbildung (2) vorhergesagt.
Beispiel 5: Charakterisierung des 5-Aminolevulinsäuresynthase(hemA)-Gens von A1560 von Aspergillus oryzae
DH5α pSE17 von E. coli, beschrieben in Beispiel 3, wurde gemäß dem folgenden Verfahren dem DNA-Sequenzieren unterzogen. Das DNA-Sequenzieren wurde in einer automatischen DNA-Sequenzierungsapparatur des Typs Applied Biosystems Model 373A (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) unter Verwendung der Primerwalkingtechnik durch Farbstoffterminatorchemie (Giesecke et al., 1992, Journal of Virol. Methods 38:47–60) unter Verwendung der M13-rückwärts-(-48) und M13-vorwärts-(-20) Primer (New England Biolabs, Beverly, MA) und für die zu sequenzierende DNA einzigartigen Primer von beiden Strängen durchgeführt.
Die Nukleotidsequenz des geklonten Gens zeigte, wie in 3 dargestellt, einen offenen Ableserahmen mit 1911 Nukleotiden (SEQ ID NO:1). Die Kodierungssequenz enthielt keine Introne, was durch cDNA-Klon- und Sequenzanalyse bestätigt wurde und im Gegensatz zu dem hemA-Gen von Aspergillus nidulans stand, das an seinem 5' Ende ein Intron enthält (Bradshaw et al., 1993, Current Genetics 23:501–507). Die untranslatierte 5'-Sequenz enthält wie in anderen Pilzgenen mehrere Pyrimidin-reiche und AT-reiche Regionen (Gurr et al., 1987, In Kinghorn, J.R. (ed.), Gene Structure in Eukaryotic Microbes, pp. 93–139, IRL Press, Oxford), eine CCAAT-Sequenz an Position -249 und eine an Position -35 lokalisierte mutmaßliche TATA-Box. Die CCAAT-Sequenz ist die übereinstimmende Stelle für Transkriptionsregulatoren, die die Transkription in Reaktion auf Sauerstoff modulieren, wie der Hap2/3/4-transkriptionsregulatorische Komplex in Hefe und Menschen (Olesen und Guarente, 1990, Molecular and Cellular Biology 12:2302–2314). Dieser regulatorische Komplex ist auch in Säugern bewahrt, und eine CCAAT-Bindunsgaktivität wurde in Aspergillus nidulans identifiziert (Davis et al., 1993, Genetica 90:133–145). Die Wichtigkeit dieser Sequenz im hemA-Gen von Aspergillus oryzae ist nicht bekannt und wurde auf Grund beschränkter Sequenzinformation in der hemA-5'-Region von Aspergillus nidulans nicht bestätigt (Bradshaw et al., 1993, vorstehend). Die Transkriprionsregulation des hemA-Gens von Aspergillus oryzae in Reaktion auf Sauerstoff ist gegenwärtig nicht bekannt, jedoch scheint es, dass hemA-Gen von Aspergillus nidulans auch unter Bedingungen der Sauerstoffbeschränkung nicht transktiptorisch reguliert ist (Bradshaw et al., 1993, vorstehend). Interessanterweise wurde das Hefe-HEM1-Gen auch konstitutiv exprimiert, jedoch wird dessen Expression durch ein Gleichgewicht zwischen positiven und negativen regulatorischen Stellen gesteuert (Keng und Guarente, 1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 84:9113–9117). Ein (AC)₃₅-Wiederholungsmotiv tritt in der untranslatierten 3'-Region auf. Ähnliche Wiederholungen wurden auch in subtelometrischen, Intron- und Promoterregionen von Säuger- und Hefegenen beobachtet und weisen keine bekannte Funktion auf, obwohl sie in Genamplifikationsfällen einbezogen waren (Passananti et al., 1987, EMBO Journal 6:1697–1703).
Die abgeleitete Aminosäuresequenz des Genprodukts des Stamms A1560 von Aspergillus oryzae ist in 3 (SEQ ID NO:2) dargestellt. Die Nukleotidsequenz kodiert ein vorhergesagtes Protein mit 636 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 68 kDa. Da dieses Enzym in den Mitochondrien lokalisiert ist, wird vorhergesagt, dass der N-Terminus eine mitochondriale Leadersequenz enthält. Tatsächlich sind die ersten 35 Aminosäuren reich an Serin-, Threonin-, Lysin- und Argininresten, was mit einer Funktion als mitochondrialer Leader übereinstimmt. Ein potentielles Häm-Regulationsmotiv (HRM) kommt in den mutmaßlichen mitochondrialen Leadersequenzen der hemA-Sequenzen sowohl von Aspergillus nidulans als auch Aspergillus oryzae vor (4). Es wird angenommen, dass an Leadersequenzen lokalisierte HRMs die Einfuhr von 5- Aminolevulinsäuresynthaseproteinen in die Mitochondrien in der Maus über direkte Wechselwirkungen mit Häm verhindern (Lathrop und Timko, 1993, Science 259:522–525; Zhang und Guarente, 1995, EMBO Journal 14:313–320). Ein zweites mögliches HRM kommt auch bei Beginn der mutmaßlichen reifen Proteinsequenz vor. Es ist möglich, dass die HRMs eine Rolle bei der Regulierung der 5-Aminolevulinsäuresynthaseaktivität spielen. Interessanterweise enthält die 5-Aminolevulinsäuresynthaseproteinsequenz von Saccharomyces cerevisiae keine mutmaßlichen HRMs und scheinen bei der Hefe-Häm-Biosynthese keine regulatorische Schlüsselrolle zu spielen (Labbe-Bois und Labbe, In Daley, Harry A., ed., Biosynthesis of Heme and Chlorophylls, 1990, McGraw Hill Publishers, New York, Seite 235–285).
Insgesamt teilt die wie in 5 dargestellte abgeleitete Aminosäuresequenz eine 81%ige Identität mit dem hemA-Gen von Aspergillus nidulans (SEQ ID NO:16), eine 57%ige Identität mit dem HEM1-Gen von Saccharomyces cerevisiae (SEQ ID NO:17; Urban-Grimal, 1986, European Journal of Biochemistry 156:511–519) und eine 51%ige Identität mit dem Humanerythroid-heml(ALAS2)-Gen (SEQ ID NO:18; Bishop, 1990, Nukleic Acids Research 18:7187–7188), die unter Verwendung des Programms Applied Biosystems GeneAssist (blosum62,mat matrix) bestimmt wurden. Jedoch findet der höchste Umwandlungsgrad in C-terminalen zwei Dritteln der Proteine statt, die die katalytische Domäne enthalten. Weiterhin sind auch die Lysin- und Glycinschleife, die für die katalytische Aktivität und die peroxidale Phosphatcofaktorbindung in anderen 5-Aminolevulinsäuresynthaseenzymen wichtig sind (Ferreira et al., 1995, Journal of Bioenergetics and Biomembranes 27:151–159; Ferreira, 1995, Protein Science 4:1001–1006) hoch bewahrt.
Beispiel 6: Konstruktion von Plasmid pSE31
Plasmid pSE31 wurde durch direktionales Klonen von PCR-amplifizierter hemA-DNA von Aspergillus oryzae in pBANe6 (6) konstruiert. Die PCR- Amplifikationreaktion wurde unter Verwendung von DNA von hemA-Klon DH5α pSE17 von E. coli, beschrieben in Beispiel 3 durchgeführt, wobei die Reaktion die folgenden Bestandteile enthielt: 50 ng pSE17, 2 Einheiten Vent-DNA-Polymerase (New England Biolabs, Beverly, MA), 1X Vent-DNA- Polymerasepuffer (New England Biolabs, Beverly, MA), jeweils 400 μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und 50 pmol Primer hemA5' 5'-TCATTTAAATGATGGAGTCTCTTCTCC-3' (SEQ ID NO:5) und Primer hemA3' 5'-TCTTAATTAATCAGCTCACATGCGGG-3' (SEQ ID NO:6). Die Reaktion wurde in einer Wärmeumlaufapparatur des Typs Perkin Elmer, programmiert auf 30 Zyklen, jeweils 95°C für eine Dauer von 1 Minute, 55°C für eine Dauer von 1 Minute und 72°C für eine Dauer von 90 Sekunden, inkubiert. Primer hemA5' enthält eine SwaI-Stelle (unterstrichen), und Primer hemA3' enthält eine PacI-Stelle (unterstrichen), die zum Klonen in mit SwaI und PacI verdautem pBANe6 zur Herstellung von pSE31 verwendet wurden (7).
Beispiel 7: Konstruktion des Stamms JRoC50.3.18A von Aspergillus oryzae Stamm JRoC50.3.18A von Aspergillus oryzae, enthaltend Plasmid pJR0C50, wude wie folgt konstruiert. Peroxidase-cDNA-Fragmente von IFO 8371 von Coprinus cinereus wurden unter Verwendung von nachstehend dargestellten spezifischen Oligonukleotidprimern (Saiki et al., 1988, Science 239:487–491), die auf der Basis der Aminosäuresequenz der Peroxidase von Coprinus macrorhizus (Baunsgaard et al., 1993, European Journal of Biochemistry 213:605–611) konstruiert waren, durch PCR hergestellt:

1, 5'-GCGCGAATTCGTNGGNATNGGNATNAA(CT)CA(CT)GG-3' (SEQ ID NO:7)
2, 3'-TACAGNTT(GA)AC(GA)GGNGGCCTAGGCG-5' (SEQ ID NO:8)
3, 5'-GCGAATTCACNCCNCA(GA)GTNTT(CT)GA(CT)AC-3' (SEQ ID NO:9)
4, 3'-GGNAA(GA)GGNCCNCT(CT)AA(GA)CCTAGGCG-5' (SEQ ID NO:10)
5, 5'-GCGCGAATTCTGGCA(GA)TCNAC-3' (SEQ ID NO:11)
6, 5'-GCGCGAATTCTGGCA(GA)AGNATG-3' (SEQ ID NO:12)
7, 3'-CGNTACCGNTT(CT)TACAGCCTAGG-5' (SEQ ID NO:13)

PCR wurde unter Verwendung des/der Gene-Amp-Kits und -Apparatur (Perkin Elmer Cetus, Norwalk, CT) gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt, außer dass die Reaktion bei 28°C für die ersten drei Zyklen durchgeführt wurde, um eine bessere Hybridisierung an der Erststrang-cDNA (hergestellt aus von Coprinus cinereus Stamm IFO 8371 erhaltener mRNA) zu erhalten und anschließend bei 65°C für 30 PCR-Zyklen durchgeführt wurde.
Die Primer wurden wie folgt kombiniert: 1 mit 2; 3 mit 4; 5 mit 7; 6 mit 7; 1 mit 4; und 3 mit 7, Die PCR-Fragmente wurden mit einer EcoRI-Stelle am 5'-Ende und einer BamHI-Stelle am 3'-Ende verlängert. Die Reaktionen wurden auf einem 1%igen Agarose-TBE-Gel analysiert, wobei in allen Reaktionen Banden mit der erwarteten Größe gefunden wurden. Zum Nachweis dessen, dass die Banden den Peroxidase-spezifischen Sequenzen entsprachen, wurde das Gel einem Southern-Blotten unterzogen und zu einer zwischen den Primern 3 und 4 positionierten Oligonukleotidesonde mit der folgenden Sequenz hybidisiert:
5'-GT(CT)TC(GA)AT(GA)TAGAA(CT)TG-3' (SEQ ID NO:14)
Es wurde gefunden, dass die Sonde zu Banden von etwa 130 bp, 420 bp, 540 bp und 240 bp hybridisiert, wodurch bestätigt wurde, dass die bewahrten DNA-Banden Peroxidasesequenzen entsprachen.
DNA aus den verschiedenen PCR-Reaktionen wurde mit EcoRI und BamHI verdaut und in das Plasmid pUC19 (New England Biolabs, Beverly, MA) geklont. Kolonien, enthaltend die korrekten PCR-Fragmente, wurden durch Hybeidisierung unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Oligonukleotidesonde (SEQ ID NO:14) identifiziert. DNA von positiven Kolonien wurden durch Restriktionsabbilden und Teil-DNA-Sequenzanalyse, wie beschrieben von Sanger et al. (1977, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463–5467), analysiert. Ein unter Verwendung der Primer 1 und 4 erhaltenes Fragment mit 430 bp von einem der Klone wurde zum Durchmustern einer cDNA-Genbank von Coprinus cinereus wie nachstehend beschrieben verwendet.
Die gesamte RNA wurde aus homogenisierten Mycelien des Stamms IFO 8371 von Coprinus cinereus extrahiert, die zum Zeitpunkt der maximalen Peroxidaseaktivität gemäß den von Boel et al. (1984, EMBO Journal 3:1097–1102) und Chirgwin et al. (1979, Biochemistry 18:5294–5299) beschriebenen Verfahren gesammelt wurden. Poly(A)-enthaltende RNA wurde wie beschrieben von Aviv und Leder (1972, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 69:1408–412) durch zwei Zyklen der Affinitätschromatographie auf Oligo(dT)-Cellulose erhalten. cDNA wurde durch einen cDNA-Synthese-Kit (Invitrogen, San Diego, CA) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Etwa 50.000 Rekombinanten von E. coli aus der cDNA-Genbank von Coprinus cinereus wurden auf Papierfilter des Typs Whatman 540 überführt. Die Kolonien wurden lysiert und wie von Gerger et al. beschrieben immobilisiert (1979, Nukleic Acids Research 7:2115–2135). Die Filter wurden mit der ³²P-markierten Peroxidase-spezifischen Sonde mit 430 bp in 0,2x SSC-0,1% SDS hybridisiert. Die Hybridisierung und das Waschen der Filter wurde bei 65°C durchgeführt, gefolgt von Autoradiographie für eine Dauer von 24 Stunden mit einer Verstärkerfolie. Nach der Autoradiographie wurden die Filter mit erhöhten Temperaturen gewaschen, gefolgt von Autoradiographie für eine Dauer von 24 Stunden mit einer Verstärkerfolie. Auf diese Weise wurden mehr als 50 positive Klone identifiziert. Miniprep-Plasmid-DNA wurde von den Hybridisierungsklonen durch Standardverfahren (Birnboim und Doly, 1979, Nukleic Acids Research 7:1513–1523) isoliert, und die DNA-Sequenzen der cDNA-Einfügungen wurden durch das Sanger-Dideoxyverfahren (Sanger et al., 1977, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 74:5463–5467) bestimmt. Eine der Kolonien wurde ausgewählt und der Vektor als pCiP bezeichnet. Das Proxidase-cDNA-Fragment wurde durch Spaltung mit BamHI/XhoI von dem Vektor entfernt und durch Agarosegelelektrophorese gereinigt, elektroeluiert und für Ligationsreaktionen vorbereitet. Das cDNA-Fragment wurde an mit BamHI/XhoI verdautes pHD414 gebunden, um pJVi9 zu bilden, wobei die cDNA unter Transkriptionssteuerung des TAKA-Promoters von Aspergillus oryzae und des wie in 8 dargestellten Terminators AMG^TM (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Dänemark) von Aspergillus niger stand.
Die die Peroxidase von Coprinus cinereus kodierende cDNA wurde von Plasmid pJVi9 als BamHI XhoI-Fragment entfernt und in Plasmid pJeRS6 (9) geklont, um Plasmid pJRoC50 (10) herzustellen, das pyrG als selektierbarer Marker, den TAKA-Promoter und den amdS-Terminator enthielt.
Transformanten des Stamms HowB425 Aspergillus oryzae wurden unter Verwendung von 5 μg gereinigtem Plasmid pJRoC50 wie nachstehend beschrieben mit den folgenden Änderungen hergestellt. Die Agarüberschicht wurde weggelassen, und die Protoplasten wurden direkt auf Minimalmediumplatten aufgestrichen. Die Transformation wurde mit Protoplasten mit einer Konzentration von 2 × 10⁷ Protoplaste pro ml durchgeführt. Einhundert μl Protoplaste wurden mit 5 μg DNA für eine Dauer von 30 Minuten auf Eis gegeben. Ein ml SPTC (40% PEG 4000, 0,8 M Sorbit, 0,05 M Tris pH 8,0, 0,05 M CaCl₂) wurden zugesetzt und die Protoplasten wurden bei 34°C für eine Dauer von 20 Minuten inkubiert. Die Transformation wurde direkt auf Minimalmedium enthaltende Platten aufgestrichen. Das Minimalmedium (pH 6,5) war aus 6 g NaNO₃, 0,52 g KCl, 1,52 g KH₂PO₄, 1 ml Spurenmetalle, 1 g Glucose, 500 mg MgSO₄·7H₂O, 342,3 g Saccharose und 20 g Edelagar pro Liter zusammengesetzt. Die Spurenmetalllösung (1000x) war aus 22 g ZnSO₄·7H₂O, 11 g H₃BO₃, 5 g MnCl₂·4H₂O, 5 g FeSO₄·7H₂O, 1,6 g CoCl₂·5H₂O, 1,6 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄ und 50 g Na₄EDTA pro Liter zusammengesetzt. Die Platten wurden für eine Dauer von 5 bis 7 Tagen bei 34°C inkubiert. Die Transformanten wurden auf Platten desselben Mediums überführt und für eine Dauer von 3–5 Tagen bei 37°C inkubiert.
Sechsundsechzig Transformanten wurden unter Verwendung des folgenden Enzymassays auf Peroxidaseaktivität untersucht: 180 μl Substratpuffer {20 ml 0,1 M Kaliumphosphat-0,01% Tween 80, pH 7,0, 250 μl 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonat)(ABTS)-Lösung (22 mg/ml) und 2 μl 30%iges Wasserstoffperoxid} wurden zu 20 μl auf 1:900 verdünnten Kulturüberstand zugesetzt, schnell gefolgt von Absorptionsmessung bei 405 nm bei 25°C unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts von Molecular Devices Thermomax (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Die Messungen wurden über eine Dauer von 2 Minuten unter Mischen alle 10 Sekunden aufgezeichnet und die V_max-Werte unter Verwendung des SOFTmax-Programms (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) berechnet. Die Peroxidaseeinheiten (POXU) pro ml wurden unter Verwendung einer mit einer bekannten Menge an Peroxidase von Cinereus coprinus als Standard aufgestellten Standardkurve bestimmt. Ein POXU wurde als die Enzymmenge definiert, die die Umwandlung von 1,0 μmol pro Minute von 0,88 mM H₂O₂, 1,67 mM ABTS, 0,1 M Phosphat, pH 7,0, bei 30°C katalysiert. Die vier Transformanten, die die höchsten Gehalte exprimierten, wurden durch Abstreifen der Sporen und Aufnehmen von isolierten Kolonien unter Verwendung derselben Platten und derselben wie vorstehend beschriebenen Bedingungen gereinigt.
Die Endbewertungen wurden in Schüttelkolben durchgeführt, in welchen etwa 5 × 10⁶ Sporen von jeden Transformanten in 25 ml MY25-Medium, enthaltend 1% Hefeextrakt, 2,5% Maltose, 0,2% Harnstoff und 1X MY-Salze, pH 6,5, geimpft wurden. 1x MY-Salze waren zusammengesetzt aus 2 g MgSO₄·7H₂O, 2 g K₂PO₄, 10 g KH₂PO₄, 2 g Zitronensäure, 0,5 ml Spurenmetalllösung und 1 ml 10% CaCl₂·2H₂O pro Liter. Die Spurenmetalllösung war zusammengesetzt aus 13,9 g FeSO₄·7H₂O, 8,5 g MnSO₄·H₂O, 14,28 g ZnSO₄·7H₂O, 1,63 g CuSO₄, 0,24 g NiCl₂·6H₂O und 3,0 g Zitronensäure pro Liter. Hemin wurde von einer frischen Stammlösung mit 10 mg/ml, hergestellt in 50 mM NaOH, auf eine Endkonzentration von 0,01 mg/ml zugesetzt. Die Schüttelkolben wurden bei 34°C und 200 UpM für eine Dauer von 7–8 Tagen inkubiert. Der beste Peroxidasehersteller wurde als JRoC50.3.18A bezeichnet.
Beispiel 8: Transformation von JRoC50.3.18A von Aspergillus oryzae mit pSE31
Stamm JRoC50.3.18A von Aspergillus oryzae wurde mit pSE31 transformiert, um zu bestimmen, ob eine Überexpression des hemA-Gens die Peroxidaseherstellung erhöhte.
Die Transformation wurde mit Protoplasten mit einer Konzentration von 2 × 10⁷ Protoplasten pro ml durchgeführt. Einhundert μl Protoplasten wurden bei 34°C mit 10 μg DNA und 200 μl einer Lösung von 60% PEG 4000, 10 mM HEPES und 10 mM CaCl₂ für eine Dauer von 30 Minuten inkubiert. Drei ml SPTC (40% PEG 4000, 0,8 M Sorbit, 0,05 M Tris, pH 8,0, 0,05 M CaCl₂) wurden zugesetzt und die Protoplasten direkt auf COVE-Transformationsplatten (pro Liter: 0,52 g KCl, 0,52 g MgSO₄·7H₂O, 1,52 g KH₂PO₄, 1 ml wie beschrieben in Beispiel 7 beschriebene Spurenmetalllösung, 342,3 g Saccharose, 25 g Edelagar, 10 ml 1 M Acetamid und 10 ml 3 M CsCl) für amdS-Transformationen aufgestrichen. Die Platten wurden für eine Dauer von 5–7 Tagen bei 34°C inkubiert. Die Transformanten wurden auf Platten desselben Mediums überführt und für eine Dauer von 3–5 Tagen bei 34°C inkubiert. Die Transformanten wurden dann durch Abstreifen von Sporen und Aufnehmen von isolierten Kolonien unter Verwendung derselben Platten unter denselben Bedingungen gereinigt.
Beispiel 9: Peroxidaseherstellung durch hemA-Transformanten
Die Transformanten von Beispiel 8 wurden in einzelne Mulden mit etwa 1 × 10⁵ Sporen pro Mulde einer 24-Mulden-Mikrotiterplatte, enthaltend 1 ml viertelstarkes MY25-Medium, zusammengesetzt aus 0,25% Hefeextrakt, 0,63% Maltose und 0,05% Harnstoff, pH 6,5, und 1x MY-Salze (siehe Beispiel 7), geimpft. Die Mikrotiterplatten wurden bei 34°C und 100 UpM in einer Feuchtigkeitskammer für eine Dauer von 5 Tagen inkubiert.
Die Peroxidaseherstellungsgrade wurden unter Verwendung des in Beispiel 7 beschriebenen Enzymassays bestimmt. Die Ergebnisse der Mikrotiterplattentests zeigen, dass die durchschnittliche POXU/ml von hemA-Transformanten um das 1,4-fache größer als der Durchschnitt der reinen Vektortransformanten war, wobei der beste hemA-Transformant eine 1,6-fache Erhöhung in der Peroxidaseherstellung zeigte.
Eine Minderheit (39%) der hemA-Transformanten zeigte Peroxidasegehalte, die mit dem Hauptteil der reinen Vektorkontrollen ähnlich war. Die CR-Amplifikation unter Verwendung von 50 ng wie in Beispiel 1 beschrieben isolierter genomischer DNA von jedem Transformanten wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt, außer dass die Primer hemA3' (siehe Beispiel 4) und Primer 5'-TCTCTTCCTTCCTGAATCCTC-3' (SEQ ID NO:15) verwendet wurden. Diese Analyse zeigte, dass die hemA-Transformanen die Expressionskassette enthalten.
Elf der besten vorstehend erhaltenen hemA-Transformanten wurden in Schüttelkolben gezüchtet, um die Wirkungen auf die Peroxidaseherstellung besser zu bewerten. Vier Schüttelkolbenbewertungen, etwa 5 × 10⁶ Sporen von jedem Transformanten, wurden in 25 ml MY25-Medium, enthaltend 1% Hefeextrakt, 2,5% Maltose, 0,2% Harnstoff und 1x MY-Salze pH 6,5 (siehe Beispiel 7) geimpft. Die Schüttelkolben wurden bei 34°C und 200 UpM für eine Dauer von 7 bis 8 Tagen inkubiert. Peroxidaseassays wurden wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigten, dass fünf Transformanten, SE01-15, SE01-20, SE01-26, SE01-28 und SE01-32, Peroxidasegehalte herstellten, die größer als die reinen Vektorkontrollstämme waren, wobei drei Transformanten Peroxidase mit einem Grad exprimierten, der um das 1,9-fache größer als die mittleren Kontrollperoxidasegehalte war. Die übrigen 6 hemA-Transformanten zeigten Peroxidasegehalte, die mit den Kontrollgehalten vergleichbar waren.
Transformant SE01-28 und ein Kontrollstamm SE05-18 (pBANe6 reiner Vektortransformant) wurden in Fermentationen mit 2 Liter und unter Verwendung eines Standartzufuhrchargenprotokolls, das Sirup mit hohem Maltosegehalt als Kohlenstoffquelle enthielt, gewachsen. Die Charge und die Zufuhr wurden mit FeCl₃ auf etwa 0,4 mM ergänzt. Positive gelöste Sauerstofftension wurde in beiden Kulturen beibehalten, wobei die Zufuhr mit einer Geschwindigkeit von etwa 2 Gramm Saccharid pro Liter pro Stunde von Tag 3 bis Tag 8 zugesetzt wurde. Dieser Gehalt wurde in schrittweiser Art über eine Dauer der Tage 2 und 3 erreicht. Die Biomasse in beiden Kulturen war für die Dauer der Fermentation etwa gleich.
Eine 2-fache Erhöhung in der Peroxidaseaktivität wurde mit SE01-28 gegenüber dem Kontrollstamm SE05-18 beobachtet. Es lag auch eine 2-fache Erhöhung im Polypeptidgehalt für SE01-28 in Bezug auf den Kontrollstamm SE05-18 vor.
Die Gesamtergebnisse zeigten, dass eine Überexpression des hemA-Gens zu einer 2-fachen Erhöhung in der Peroxidaseausbeute führte. Die Daten weisen weiter darauf hin, dass hemA als regulatorischer Schlüsselpunkt während der Häm-Biosymthese in Fadenpilzen darstellen kann, der durch genetische Manipulation die Hämoproteinherstellung in Abwesenheit von Heminergänzung verbessern kann.
HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
Der folgende Stamm wurde gemäß dem Budaprster Vertrag in der Agricultural Research Service Patent Culture Collection (NRRL), Northern Regional Research Laboratory, 1815 University Street, Peoria, Illinois 61604, USA hinterlegt.
Der Stamm wurde unter Bedingungen hinterlegt, die gewährleisten, dass während der Gültigkeit dieser Patentanmeldung derjenige Zugang zu der Kultur hat, dessen Berechtigung nach 37 C.F.R. §1,14 und 35 U.S.C. §122durch den Bevollmächtigten von Patenten und Marken bestimmt wurde. Die Hinterlegung stellt eine im Wesentlichen reine Kultur jedes hinterlegten Stamms dar. Die Hinterlegung ist, wie es durch fremde Patentgesetze in Ländern, in welchen Gegenstücke der diesbezüglichen Anmeldung oder ihrer Gültigkeit erteilt sind, erforderlich ist, verfügbar. Jedoch sollte es klar sein, dass die Verfügbarkeit einer Hinterlegung keine Lizenz zum Durchführen der gegenständlichen Erfindung unter Beeinträchtigung der Patentrechte, die durch behördliche Wirkung bewilligt wurde, bildet.
Die hier beschriebene und beanspruchte Erfindung ist im Umfang durch die spezifischen hier offenbarten Ausführungsformen nicht beschränkt, da diese Ausführungsformen als Veranschaulichungen der mehreren Aspekte der Erfindung dienen. Jegliche äquivalente Ausführungsformen sollen im Umfang dieser Erfindung liegen. Tatsächlich sind verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu denjenigen, die hier dargestellt und beschrieben sind, dem Fachmann aus der vorstehenden Beschreibung klar. Derartige Modifikationen sollen ebenso in den Umfang der anhängenden Ansprüche fallen. SEQUENZLISTE

Claims

Im Wesentlichen reine 5-Aminolevulinsäuresynthase, welche: (a) aus einem Stamm von Aspergillus oryzae erhalten wird; (b) eine Aminosäuresequenz aufweist, welche wenigstens 85% homolog zu der in SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenz ist.
5-Aminolevulinsäuresynthase gemäß Anspruch 1, welche aus Aspergillus oryzae IFO 4177 oder einem mutanten Stamm davon erhalten wird.
5-Aminolevulinsäuresynthase gemäß Anspruch 1, welche eine in SEQ ID NO:2 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist.
5-Aminolevulinsäuresynthase gemäß Anspruch 1, welche eine Aminosäuresequenz aufweist, die sich durch nicht mehr als drei Aminosäuren von der in SEQ ID NO:2 gezeigten Aminosäuresequenz unterscheidet.
Isoliertes Nukleinsäurefragment, enthaltend eine Nukleinsäuresequenz, die eine 5-Aminolevulinsäuresynthase gemäß Anspruch 1 kodiert.
Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 5, wobei die Nukleinsäuresequenz eine 5-Aminolevulinsäuresynthase, erhalten aus Aspergillus oryzae IFO 4177, kodiert.
Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 6, wobei die Nukleinsäuresequenz in SEQ ID NO:1 gezeigt ist.
Nukleinsäurekonstrukt umfassend ein Nukleinsäurefragment gemäß Anspruch 5, das in funktionsfähiger Weise mit regulatorischen Regionen verbunden ist, die, die Expression der 5-Aminolevulinsäuresynthase in einem geeigneten Expressionswirt steuern können.
Rekombinanter Vektor umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 8.
Vektor gemäß Anspruch 9, wobei die Nukleinsäuresequenz in funktionsfähiger Weise mit einer Promotorsequenz verbunden ist.
Vektor gemäß Anspruch 10, weiterhin umfassend ein Transkriptionsterminationssignal.
Vektor gemäß Anspruch 10, weiterhin umfassend einen selektierbaren Marker.
Rekombinante Wirtszelle umfassend das Nukleinsäurekonstrukt gemäß Anspruch 8.
Wirtszelle gemäß Anspruch 13, wobei das Nukleinsäurekonstrukt in einem Vektor enthalten ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 13, wobei die Wirtszelle eine Bakterienzelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 13, wobei die Wirtszelle eine Pilzzelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 16, wobei die Pilzzelle eine Fadenpilzzelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 17, wobei die Fadenpilzzelle eine Pilzzelle einer Spezies von Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium oder Trichoderma ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 16, wobei die Wirtszelle eine Hefezelle ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 19, wobei die Hefezelle ein Stamm von Saccharomyces oder Schizosaccharomyces ist.
Wirtszelle gemäß Anspruch 13, wobei das Nukleinsäurekonstukt in das Wirtszellgenom integriert ist.
Verfahren zum Herstellen einer 5-Aminolevulinsäuresynthase gemäß Anspruch 1 umfassend (a) Züchten eines Stamms von Aspergillus oryzae zur Herstellung der 5-Aminolevulinsäuresynthase; und (b) Gewinnen der 5-Aminolevulinsäuresynthase.
Ein Verfahren zum Herstellen einer 5-Aminolevulinsäuresynthase gemäß Anspruch 1 umfassend (a) Züchten einer Wirtszelle, umfassend ein Nukleinsäurekonstrukt, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, kodierende die 5-Aminolevulinsäuresynthase unter Bedingungen, die die Expression der 5-Aminolevulinsäuresynthase erlauben; und (b) Gewinnen der 5-Aminolevulinsäuresynthase.