DE69736241T2

DE69736241T2 - Humaner neurotropher ciliarer Faktor mit geändertem Aktivitätsbereich gegenüber dem des Wildtyp-Moleküls

Info

Publication number: DE69736241T2
Application number: DE69736241T
Authority: DE
Inventors: Ralph Laufer; Annalise Di Marco
Original assignee: Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Current assignee: Istituto di Ricerche di Biologia Molecolare P Angeletti SpA
Priority date: 1996-07-10
Filing date: 1997-07-10
Publication date: 2007-05-31
Anticipated expiration: 2017-07-11
Also published as: ATE331734T1; US6756357B1; JP2000507271A; IT1284867B1; ITRM960492A1; EP0936919A2; DE69736241D1; EP0936919B1; CA2260296C; AU3557697A; IL127959A0; CA2260296A1; ITRM960492A0; JP3329826B2; WO1998001149A3; ES2265653T3; WO1998001149A2; AU719086B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Neurologie. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Mutanten des humanen ciliaren neurotrophen Faktors (hCNTF), die einen unterschiedlichen Wirkungsbereich zu dem des Wildtyp-Moleküls zeigen. Diese Varianten sind dadurch gekennzeichnet, dass sie eine stark reduzierte Fähigkeit besitzen, mit dem LIF-Rezeptor (LIFR) wechselzuwirken. Als eine Folge davon haben sie eine äußerst reduzierte biologische Aktivität bei der Mehrheit der Zellen, die auf CNTF ansprechen. Jedoch bewahren sie eine hohe biologische Aktivität gegenüber gewisse Nervenzellen, möglicherweise weil letztere große Mengen an Membran-gebundenen LIFR und/oder CNTF-Rezeptor-α (CNTFRα) exprimieren. Diese Eigenschaft kann genutzt werden, um die peripheren Nebenwirkungen, die sich aus der Verabreichung von CNTF ergeben, zu reduzieren.
Der humane ciliare neutrophe Faktor (hCNTF) ist ein Neurocytokin mit 23 kDa. Er wird in Schwann-Zellen und Astrocyten exprimiert, und übt starke stimulierende Wirkung auf das Weiterbestehen und die Differenzierung einer Vielzahl von neuronalen Zellen und Glialzellen (beides in vitro und in vivo), einschließlich motorische Neuronen, sensorische Neuronen, sympathische Neuronen, Neuronen des Hyppocampus und Oligodendrocyten (1, 2), aus. Die physiologische Rolle von CNTF scheint zu sein, dass dieser wie als ein Faktor agiert, der am Schutz gegen die neuronale Degeneration in Folge einer Verletzung beteiligt ist (2). Diese Schutzfunktion, welche CNTF in vivo an vielen Nervenzellen gezeigt hat, hat Hoffnung gemacht auf seine klinische Anwendung bei der Behandlung von humanen neurodegenerativen Erkrankungen (3).
Ebenso wie die neuronale Schutzfunktion hat sich jedoch gezeigt, dass CNTF ebenso in vivo eine Vielzahl von Effekten auslöst, die in Gewichtsverlust und Appetitlosigkeit, Akute-Phase-Reaktion und Fieber bestehen. Wegen dieser Nebeneffekte besteht daher ein Problem in der pharmakologischen Anwendung von CNTF.
Wie andere Wachstumsfaktoren und insbesondere Cytokine, übt CNTF durch das Binden, das sequenzielle Zusammenfügen und die Aktivierung eines Mehrfachuntereinheit-Rezeptor-Komplexes (4, 5), seine Aktivitäten aus. Der Rezeptorkomplex, von dem CNTF einen Teil bildet, besteht aus sechs Untereinheiten (ähnlich dem Fall von Interleukin 6) (6). Der Komplex besteht aus zwei CNTF-Molekülen, zwei α-rezeptorspezifischen Molekülen, die eine affinitätsarme Bindung mit CNTF (CNTFRα) bilden und zwei Signalwandeluntereinheiten (LIFR und gp130) (7). Die CNTF-Stellen, welche am Binden mit gp139 und dem spezifischen Rezeptor beteiligt sind, können mittels Analogie zu Interleukin 6 identifiziert werden (8, 9). Die Bindungsstelle für den CNTF und den LIF-Rezeptor (LIFR) wurde bis jetzt noch identifiziert.
Veröffentliche internationale Patentanmeldung WO 96/01319 (Cancer Research Campaign Technology Limited) offenbart Proteine, welche Varianten des humanen Leukämie-Inhibitorfaktors (hLIF), mit veränderten Bindungsaffinitäten zu dem LIF-Rezeptor und zu dem gp130-Rezeptor, sind.
Mehrfachabgleich mit Mensch-, Kaninchen-, Ratte- und Maus-CNTF-Sequenzen mit anderen Cytokin-Sequenzen, die den LIF-Rezeptor (wie z.B. LIF, Oncostatin M und CT-1) binden, lässt die Gegenwart von zwei konservativen Aminoresten innerhalb des Strukturmotives, welches als D1 bekannt ist, erkennen. Die zwei Aminosäuren sind Phenylalanin an Position 152 und Lysin an Position 155. Wie ausführlich in den folgenden Beispielen gezeigt wird, bilden die zwei Aminosäuren Teil der LIFR-Bindungsstelle. Auf Basis dieses Wissens wurden CNTF-Mutanten generiert, in welchen die zwei Aminosäuren durch Alanin ersetzt wurden und die Sequenzen von beiden, dem Wild-Typ-Molekül (SEQ-ID-NO: 1) und den Mutanten, die Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, sind in Tabelle 1 wiedergegeben (zur Vereinfachung ist nicht die ganze Aminosequenz angegeben, sondern nur die Aminosäurepositionen von 152 bis 167). Obwohl die Literatur angibt, dass eine der zwei Mutanten (Lys155Ala/CNTF) völlig inaktiv ist auf hen Neuronen (10), wurde die biologische Aktivität beider Mutanten festgestellt, und es wurde dargelegt, dass entgegen der bisherigen Berichte (10), diese als leistungsstarke Agonisten auf dem Membranrezeptor von bestimmten neuronalen Zellen agieren, wohingegen ihre biologische Aktivität, wenn diese an den LIF-Rezeptor oder den löslichen CNTF-Rezeptor gebunden sind, stark reduziert ist. Eine mögliche Interpretation dieses Phänomens mag die folgende sein: Nachdem die biologischen Wirkungen dieser Moleküle von den Konzentrationen des CNTFRα und des LIF-Rezeptors abhängen, werden sie, wenn die lokale Rezeptorkonzentration sehr hoch ist, wie das bei Rezeptoren der Fall ist, die an die Zellmembran von bestimmt neuronalen Zellpopulationen gebunden sind, amplifiziert.
Die Entdeckung, dass diese Moleküle eine biologische Aktivität auf neuronale Zellen, die Membran-gebundene Rezeptoren exprimieren, ausüben, und dass auf der anderen Seite diese eine extrem schwache biologische Aktivität aufweisen, wenn sie mit dem löslichen Rezeptor interagieren, weißt daraufhin, dass Moleküle, die in den angegebenen Positionen modifiziert sind, für spezifische Reaktionen mit neuronalen Zellen verwendet werden können, ohne die peripheren Nebeneffekte, vermittelt durch die lösliche Rezeptorbindung, zu verursachen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind daher Varianten des humanen ciliaren neurotrophen Faktors (hCNTF), gekennzeichnet durch den Austausch von Phenylalanin 152 und/oder Lysin 155 durch Alanin und durch die Tatsache, dass sie insbesondere eine Aminosäuresequenz, die von den Sequenzen in SEQ-ID-NO: 3 bis SEQ-ID-NO: 5 und SEQ-ID-NO: 7 angegeben, umfassen.
Die europäische Patentanmeldung EP 0749980 A1 (Sumitomo Pharmaceuticals Co., Ltd.) offenbart eine Modifikation eines hCNTF, worin der Aminosäurerest der Aminosäuresequenz, der zumindest dem 153ten Aminosäurerest der Aminosäuresequenz eines natürlichen humanen CNTF entspricht, durch einen anderen Aminosäurerest ersetzt worden ist.
Die Moleküle, dargestellt durch SEQ-ID-NO: 3 bis SEQ-ID-NO: 5, haben eine geringere Fähigkeit, an dem LIF-Rezeptor zu binden und ihn mittels eines löslichen CNTFRα zu aktivieren, und im Gegenteil agieren als Agonisten an dem CNTFR von gewissen neuronalen Zellen. Das Molekül, dargestellt durch SEQ-ID-NO: 7 agiert als kompetativer Antagonist für die CNTFR-α-Rezeptorbindung.
Die vorliegende Erfindung erstreckt sich ebenso auf pharmazeutische Mittel, die von diesen Molekülen Gebrauch machen, für die Behandlung von Krankheiten oder pathologischen Befunden des Nervensystems, oder für andere pathologische Befunde in denen Zellen involviert sind, die auf CNTF reagieren, einschließlich Krankheiten oder pathologische Befunde des Nervensystems, die Schaden an dem Nervensystem selbst verursachen.
Tabelle 2 zeigt die Daten bezüglich der CNTFRα-Rezeptor-Bindungsaktivitäten der verschiedenen Mutanten von CNTF. Die Konzentration die an Protein benötigt wird, um das Anbinden von biotinylierten DNTF oder biotinylierten MUT-DH an immobilisierten CNTFRα um 50 % (IC50) zu inhibieren, wurde bestimmt. Die relative Bindung ist das Verhältnis (IC50 von CNTF)/(IC50 des getesteten Proteins). TABELLE 2

* diese Sequenzen sind nur zum Vergleich aufgeführt

1 zeigt die Ergebnisse bezüglich Bindungstests einer Vielzahl von Rezeptorkomplexen, bei denen die Variant-CNTF-Moleküle, die die Untereinheiten gp130 und LIFR enthalten, einen Teil darstellen. Jeder Test wurde mit zwei unterschiedlichen Mengen an Variantmolekülen durchgeführt (1 oder 0,1 mg, wie in der Kopfzeile jeder Spalte angegeben). In jeder Figur gibt die letzte Spalte die negative Kontrolle wieder, in welcher der Test in Abwesenheit der Variantmoleküle durchgeführt worden ist. (A) Bindungstest für die Komplexe, welche die Varianten original MUT-DH, Phe152Ala/MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH, Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH enthalten und für Wildtyp CNTF (angegeben als MUT-DH, AK/DH, FA/DH, AA/DH bzw. wt) und für CNTFRα mit der Rezeptor-Untergruppe gp130. (B) Bindungstest für die Komplexe, welche die Varianten MUT-DH, Phe152Ala/MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH, Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH enthalten und für Wildtyp CNTF (angegeben als MUT-DH, AK/DH, FA/DH, AA/DH bzw. wt) und für CNTFRα mit der Rezeptor-Untergruppe LIFR. (C) Bindungstest für die Komplexe, die die Varianten MUT-DH, Phe152Ala/MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH, Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH enthalten und für Wildtyp CNTF (angegeben als MUT-DH, AK/DH, FA/DH, AA/DH bzw. wt) und für den Komplex LIFR/CNTFRα mit der Rezeptor-Untereinheit gp130.
2 zeigt die Stimulierungsergebnisse der Haptoglobinproduktion in HepG2-Zellen bei CNTF und CNTF-Varianten. Die Experimente wurden entweder bei Abwesenheit (A) oder in Gegenwart des löslichen CNTFRα-Rezeptors bei einer Konzentration von 800 ng/ml durchgeführt (B). Die getesteten Proteine waren: CNTF(o), Lys155Ala/CNTF (FA-CNTF) (☐), Lys155Ala/MUT-DH (FADH-CNTF) (∎), Phe152Ala/MUT-DH (AKDH-CNTF)
und Phe152Ala/Lys155Als/MUT-DH (AADH-CNTF)
. Die Daten sind als Prozentangaben des maximalen CNTF-Effektes angegeben, um die Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Experimenten zu normieren.
3 zeigt die Stimulationsergebnisse von Cholinacetyltransferase (Chat)-Aktivität in den IMR-32-Zellen. Die getesteten Proteine waren: CNTF(o), FA-CNTF (∎), FADH-CNTF (∎), AKDH-CNTF
und AADH-CNTF
. Die Daten sind als Prozentangaben des maximalen CNTF-Effekts angegeben, um die Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Experimenten zu normieren.
4 zeigt die Antagonisteneigenschaften der Mutante
Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH in HepG2-Zellen. 4A zeigt den Effekt von ansteigenden Dosen an CNTF bei der Cholinacetyltransferase (Chat)-Aktivität in IMR-32-Zellen in der Abwesenheit (•) und in der Gegenwart von
Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH in den folgenden Konzentrationen (in mg/ml): 0,01 (o), 0,1 (∎), 1 (☐), 10
. 4B zeigt den Effekt von ansteigenden Konzentrationen an Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH auf die Reaktion, die durch 3 ng/ml an CNTF induziert wird.
Soweit wurde eine allgemeine Beschreibung der vorliegenden Erfindung gegeben. Mit Hilfe der folgenden Beispiele wird nun eine detailliertere Beschreibung spezifischer Ausführungsformen gegeben, um ein besseres Verständnis der Aufgaben, Eigenschaften, Vorteile und Arbeitswesen der vorliegenden Erfindung zu geben.
HINTERLEGUNGEN
E.coli TOP10-Bakterien, transformiert unter Verwendung der Plasmide pRSET-AKDH-CNTF, pRSET-FADH-CNTF bzw. pRSET-AADH-CNTF, enthaltend die Nukleotid-Sequenzen, codierend für die Variante AKDH-CNTF, welche die Aminosäuresequenz SEQ-ID-NO: 3 enthält, für die Variante FADH-CNTF, welche die Aminosäuresequenz SEQ-ID-NO: 4 enthält und für die Variante AADH-CNTF, welche die Aminosäuresequenz SEQ-ID-NO: 6 enthält, wurden am 24. Juni 1996 am National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd. (NCIMB), Aberdeen, Scotland, UK mit der Zugangsnummer NCIMB 40809, NCIMB 40810 und NCIMB 40811 hinterlegt.
BEISPIEL 1
Aufbau und Charakterisierung der CNTF-Mutanten
Aufbau der Mutanten
Mutationen wurden in das humane CNTF oder in das Variantmolekül MUT-DH (Ser166Asp/Gln167His/CNTF) durch inverse PCR unter Verwendung bekannter Methoden (11), und unter Verwendung von pRSET-CNTF oder pRSET-MUT-DH Vektoren als Template, eingeführt. Die folgenden Primer wurden für die PCR-Reaktionen verwendet:
Sinnprimer der für alle Mutanten verwendet wird
5'-CTGTGGGGCCTAAAGGTGCTG-3'
Antisinnprimer für die Mutanten Phe152Ala (der Codon für das entsprechende Ala 152 ist durch dicke Schreibweise angezeigt)
5'-CGCCTTCTCAAAGAGACCACCATCTCCAAC-3'
Inverser Primer für die Mutanten Phe152Ala/Lys155Ala (die korrespondierenden Codons zu Ala 152 und Ala 155 werden durch dicke Schreibweise angezeigt)
5'-CGCCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAAC-3'
Die PCR-Reaktionen werden unter Verwendung des DNA-Templates (pRSET-CNTF oder pRSET-MUT-DH; 10 fmol) und der Primer (jeder 1 mM) in 100 ml Reaktionsvolumen, welches 2 Einheiten an Taq DNA-Polymerase (Boehringer Mannheim) und 10 ml Puffer für 10 × PCR-Reaktionen enthält, durchgeführt. Die Amplifikation wurde für 25 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 45°C und 12 Minuten bei 72°C durchgeführt. Die vier Deoxynukleotide (250 mM) und 20 Einheiten von E.coli Polymerase I "Klenow fragment" wurden zu 95 ml der Amplifikationsmischung hinzugefügt, und die Reaktionsmischung wurde bei 37 °C für 30 Minuten inkubiert. Die DNA wurde unter Verwendung des "Wizard^TM PCR preps" Reinigungssystems isoliert und durch Inkubation mit 20 Einheiten an T4 Polynukleotid-Kinase (Promega) nach Händleranweisung inkubiert. Das Produkt wurde über ein Agarosegel (0,7 %) laufen gelassen und anschließend unter Verwendung eines Qiaex-Kits (Qiagen) gereinigt, dann einer Ligase-Reaktion unter Verwendung von 12 Einheiten an T4-Ligase bei 16 °C für 20 Stunden unterzogen. Die Reaktionsmischung wurde verwendet, um geeignete E.coli-Zellen des Stamms HB2151 zu transformieren. Die DNA wurde aus den Bakterienzellen gewonnen und die Identität der Regionen, die für die CNTF-Mutanten codieren, wurde durch Sequentierung der DNA unter Verwendung des USB-Sequenase-Protokolls ermittelt.
Die Codierungssequenz für Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH (AADH-PCR1) enthält zwei zusätzliche Mutationen (Ala70Thr/Val146Gly). Um diese Mutationen zu korrigieren, und um zur Originalsequenz zurückzukehren, wurde folgende Vorgehensweise angewendet: Um die Mutation Val146Gly zu eliminieren wurde ein NcoI/PstI-Fragment, welches die Codierungssequenz von CNTF von Position 1 bis Position 163 umfasst, unter Verwendung der DNA von AADH-PCR1 als ein Templat zusammen mit den folgenden Primern, amplifiziert:
Sinn: 5'-GTCACCATGGCTTTCACAGAGCATTCACCG-3'
Antisinn: 5'-AGCTCCTGCAGCACCTTTAGGCCCCACAGCGCCTTCT CAGCGAGACCACCATCTCCAACATTAAT-3'(das Codon für Val146 ist durch dicke Schreibweise angezeigt).
Die PCR-Reaktion wurde für 30 Zyklen (94 °C für 130 Sekunden; 50 °C für 130 Sekunden; 72 °C für 190 Sekunden) unter Verwendung von 2,5 Einheiten einer klonierten pfu-Polymerase (Stratagene) weitergeführt. Das Reaktionsprodukt wurde mit den Enzymen NcoI und PstI verdaut, der Elektrophorese auf 0,7 % Agarosegel unterworfen und unter Verwendung des Wizard^TM PCR preps DNA'' Reinigungssystems (Promega) gereinigt. Das Fragment wurde dann in den NcoI/PstI-verdauten pRSET-MUT-DH-Vektor subkloniert und somit das Konstrukt AADH-PCR2 erhalten. Um die Mutation Ala70Thr zu eliminieren, wurde AADH-PCR2 DNA mit HindIII verdaut und das resultierende Fragment (welches sich vom Rest in Position 79 zu dem Rest in Position 200 des CNTF erstreckt, und daher die Mutation in Position 70 exkludiert) wurde in einen HindIII-verdauten pRSET-CNTF-Vektor subkloniert. Die Tatsache, dass die Sequenz tatsächlich für Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH codiert wurde, wurde durch direkte Sequenzierung der DNA-Sequenz bestätigt.
Expression des Proteins und Isolation der bakteriellen Einschlusskörper wurden unter Verwendung folgender Vorgehensweise erreicht: die pREST-CNTF und pREST-Variant-Vektoren wurden verwendet, um E.coli-Zellen des Strangs BL21 (DE3) LysE (SupE minus Genotyp) zu transformieren. Die Transformanten wurden bei 37 °C in 1 Liter Luriabrühe, die 0,1 mg/ml an Ampizillin bei ein A₆₀₀ von 0,8 enthält, gerührt. Anschließend wurde Isopropylthiolgalactosid (0,4 mM) hinzugefügt und die Inkubation wurde für weitere 3 Stunden bei 37 °C durchgeführt. Die Bakterien wurden dann mittels Zentrifugation gesammelt und in 2 ml pro Gramm Körner in Puffer A (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10 mg/ml Leupeptin) resuspendiert. Dazu wurde 0,5 mg/ml Lysozim und 30 % w/v an Saccharose zugefügt. Die Suspension wurde für 1 Stunde bei 30 °C inkubiert. Nach Zugabe eines Volumens an Puffer A, wurden die Bakterien mittels zweimaligen nacheinander Durchführen durch die "French Press" bei einem Druck von 800 bar lysiert. Die eingeschlossenen Körper werden durch Zentrifugation bei 12000 × g für 30 Minuten isoliert. Die Körner wurden in einer Lösung aus 2 M Guanidinchlorid resuspendiert und dreimal unter Verwendung derselben Lösung gewaschen. Die Körner wurden in 5 ml einer 8 M Guanidinchlorid-Lösung resuspendiert und sofort viermal mit Puffer A verdünnt. Nach Zentrifugation bei 12000 × g für 30 Minuten wurde der Überstand bei 4 °C gegen 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 0,1 mM DTT pH 8 dreimal eine ansteigende Konzentration an Guanidinchlorid (1 M, 0,5 M, 0 M, jedes Mal für eine Nacht) und einmal gegen 20 mM Tris, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 25 mM NaCl, pH 8 dialysiert. Das endgültige Dialyseprodukt wurde mittels Zentrifugation bei 12000 × g für 30 Minuten gereinigt und durch ein 0,22 mm Filter geführt. Anschließende Reinigung wurde unter Verwendung einer HPLC durchgeführt, und unter Verwendung einer C4-Säule (Vydac 214 TP, 2,2 × 25 cm, 10 mm) bei einer Flussrate von 30 ml/min mit einem linearen Gradienten von 40 %–60 % Acetonitril/0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser/0,1 % Trifluoressigsäure, eluiert. Vor dem Entfernen des Lösungsmittels bei der Lyophilisation, wurde 0,1 % (w/v) n-Octylglucosepyranosid zu den Eluaten hinzugefügt. Das Protein wurde in Wasser resuspendiert und bei 4 °C gelagert.
CNTFRα-Rezeptor-Bindungsuntersuchung
Die Fähigkeit von CNTF-Varianten mit biotinylierten CNTF (8 nM), um das Binden an der extrazellulären Domäne des CNTFRα-Rezeptors zu konkurrieren, wurde in einer Festphasen-Bindungsuntersuchung in Gegenwart von löslichem gp130, wie in den vorausgehenden Veröffentlichungen (19) beschrieben, bestimmt. "Microtiter" 96-Mulden Polystyren Kulturplatten wurden mit 100 ml an 50 mM Natriumcarbonat pH 9,5 bedeckt, enthaltend 0,2 mg des monoklonalen Antikörpers 9E10, welcher gegen ein c-myd Epitop gerichtet ist, und die Platten wurden dann bei 4 °C über Nacht aufbewahrt. Die Mulden wurden anschließend fünf Mal mit TBS (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl), welches 0,05 % Tween enthält, gewaschen und für 90 Minuten bei Raumtemperatur in TBSMT (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 % (w/v) lyophilisierte nicht-fettige Milch) aufbewahrt. Alle anschließenden Inkubationen wurden bei Raumtemperatur in einem Mixer bei einer Geschwindigkeit von 700 rpm durchgeführt, nach jeder Inkubationsperiode wurden die Mulden mit TBS, welches 0,05 % Tween enthält, gewaschen (jedes Mal fünf Mal). Die folgenden Inkubationsperioden wurden durchgeführt: (1) 2 Stunden mit 50 ml TBSMT, enthaltend 10 mg von CNTFRα-myc; (2) 1 Stunde mit 50 ml an TBSMT, enthaltend 200 ng an gp130-flag, 5 nM biotinylisiertes CNTF, und die verschiedenen Konkurrenten und (3) 45 Minuten mit 50 ml an TBS, 5 % (w/v) an Rinderserumalbumin, 0,05 % (v/v) Tween 20, enthaltend 0,8 mg/ml Avidin, konjugiert mit alkalischer Phosphatase.
Die alkalische Phosphataseaktivität wurde bei 37 °C unter Verwendung von 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat in 1 M an Diethanolamin-HCl, pH 9,8, bestimmt und das Absorptionsvermögen bei 405 nm nach 40–60 Minuten unter einem geeigneten Lesegerät gemessen. In einigen Experimenten wurde das biotynilierte MUT-DH Variantmolekül (0,5 nM) als ein Ligand verwendet.
Die Vergleichsuntersuchung zeigte, dass die Substitution der Rest Phe152 und Lys155 mit Alanin, die Wechselwirkung mit dem CNTFRα-Rezeptor nicht ändert. Die zwei Mutanten Lys155Ala/CNTF und Phe152Ala/Lys155Ala/CNTF waren im Binden an den Rezeptor vergleichbar potent mit dem Wild-Typ Molekül. Wie früher berichtet (18), ist das Molekül MUT-DH näherungsweise 40 Mal leistungsstärker beim Rezeptorbinden als CNTF. Auch in diesem Fall waren die Mutanten Phe152Ala/MUT-DH, Lys155Ala/MUT-DH und Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH beim Binden an den Rezeptor vergleichbar potent mit dem Originalmolekül (MUT-DH). Die Ergebnisse, welche zum besseren Verständnis in Tabelle 2 zusammengefasst sind, zeigen, dass die Reste Phe152 und Lys155 nicht beim Binden an das CNFRα-Rezeptor beteiligt sind.
Aufbau des Rezeptorkomplexes in vitro
Es ist aus der Literatur bekannt, dass die Moleküle gp130 und LIFR in der Lage sind, selbstständig an den CNTF/CNTFRα-Komplex (11) zu binden. Um die funktionale Bedeutung der D1-Motivreste zu bestimmen, wurde die Fähigkeit von CNTF-Varianten Rezeptorkomplexe mit den verschiedenen Untereinheiten zusammenzufügen, geprüft. Das Binden des Cytokin/CNTFRα-Komplexes an gp130 oder LIFR, gemarkert mit ³⁵S, wurde unter Verwendung von Immunoprezipitationstests, wie in der Literatur (11) beschrieben, bestimmt. Der lösliche CNTFRα-Rezeptor wurde unter Verwendung des monoklonalen Antikörpers 9E10 anti-myc auf A-Sepharoseprotein immobilisiert, und mit löslichen gp130 oder LIFR gemarkert mit Schwefel ³⁵S, in Abwesenheit oder Anwesenheit von verschiedenen Mengen an CNTF-Varianten (1 oder 0,1 mg), inkubiert. Nach dem Waschen, wurde das gebundene Material eluiert und SDS-PAGE unterworfen.
Wie in 1A gezeigt, ist das Binden von gp130 an dem Komplex-MUT-DH/CNTFRα nicht durch die Substitutionen Phe152A (Spalte AK/DH), Lys155A (Spalte FA/DH) und Phe152A/Lys155A (Spalte AA/DH) beeinflusst. Im Gegensatz dazu, wie in 1B zu sehen, sind Varianten, die diese Substitutionen entweder einzeln oder zusammen aufweisen, nicht in der Lage, an den LIFR-Rezeptor zu binden. Um die Fähigkeit der Varianten, den dreiteiligen CNTFRα/gp130/LIFR-Komplex zu bilden, zu testen, wurde der LIFR-Rezeptor auf dem Protein A-Sepharose immobilisiert und mit löslichem CNTFRα, löslichen gp130, markiert mit ³⁵S und mit den CNTF-Varianten inkubiert (in diesem Fall wurde das Experiment zweimal mit zwei verschiedenen Mengen an Variantenmolekülen, 1 oder 0,1 mg durchgeführt).
Im Einklang mit den ersten beiden Ergebnissen, waren die Variantenmoleküle nicht in der Lage, an den CNTFRα/gp130/LIFR-Komplex, welcher der physiologisch aktiven Form des CNTF-Rezeptors auf der Zelloberfläche entspricht (siehe 1C), zu binden.
Die Ergebnisse zeigen, dass Phe152 und Lys155 Teil der LIFR-Rezeptorbindungsseite bilden.
BEISPIEL 2
Biologische Aktivität von CNTF-Mutanten
Untersuchung bezüglich der Sekretion von Haptoglobin bei humanen Hepatom-Zellen.
Die biologische Aktivität wurde in Zell-basierenden Untersuchungen bestimmt, die geeignet sind die Fähigkeit von CNTF (oder von den Mutanten) zu messen, einen funktionellen Rezeptorkomplex zwischen löslichen CNTFRα und zellulären LIF-Rezeptoren herzustellen. Die menschliche Hepatom-Zelllinie HepG2 exprimiert nicht CNTFRα, wohingegen sie den LIF-Rezeptor exprimiert und nur auf hohe Konzentration an Cytokin anspricht, wahrscheinlich wegen einer geringen Affinitäts-Wechselwirkung von CNTF mit zellulären LIF-Rezeptoren (18, 13). Die Untersuchung wurde wie folgt durchgeführt. Zuallererst wurden die HepG2-Zellen in 96-Mulden-Platten gezüchtet, bis sie eine einzelne konfluente Schicht bildeten, danach wurden sie in eine Mindestmenge an Kulturmedium, das 1 mM Dexamethason (14) enthält, gegeben, und für 24 Stunden mit gereinigten CNTF oder mit den Variantmolekülen, die zu testen sind, versehen. Die Menge an Haptoglobin, welches von den Zellen in dem Kulturmedium abgeschieden wird, wurde unter Verwendung eines ELISA-Tests bestimmt.
Nachdem die Haptoglobin-Sekretion, durch den LIFR-zellulären Rezeptor vermittelt ist, wird angenommen, dass die Aminosäuresubstitutionen, die die Bindung zu diesem Rezeptor schwächen, zu einer starken Reduktion der biologischen Aktivität diesen Typs verglichen zu dem Wildtyp-Molekül führt. In der Tat, wenn die Substitution von Phe152 oder Lys155 mit Alanin eine schwache biologische Aktivität (ungefähr 20 % bezüglich dem Maximumwert) bei hohen Konzentrationen ergibt, hebt die simultane Substitution von beiden Resten mit Alanin, sogar bei hohen Konzentrationen (2A), komplett die biologische Aktivität auf. In Gegenwart von löslichen CNTFRα werden Zellen, welche LIFR und gp130-Rezeptoren tragen, durch die Bildung des kompletten Rezeptorkomplexes empfindlich für geringe Konzentrationen an CNTF. Wie 2B entnommen werden kann, führt der Anstieg an Konzentration von exogenen CNTFRα zu einer Verschiebung der zellulären Antwort in Richtung geringer Konzentrationen an CNTF und seinen Varianten.
Führt man die Analyse über das Verhalten einzelner Varianten weiter, so kann gesagt werden, dass die Mutanten Lys155Ala/CNTF (FA-CNTF) und Lys155Ala/MUT-DH (FADH-CNTF) eine biologische Aktivität haben, die stark reduziert, aber nicht völlig aufgehoben ist. Auf der anderen Seite reduziert die Alaninsubstitution des Restes Phe152 (AKDH-CNTF) die biologische Aktivität des Moleküls zu einem geringeren Ausmaß als die Substitution von Rest Lys155 und eine simultane Substitution beider Reste (AADH-CNTF), welches völlig die Aktivität, sogar bei hohen Konzentrationen an beiden, Rezeptor und Cytokin, beseitigt.
Stimultation von Cholinacetyltransferase (Chat) Aktivität in IMR-32-Zellen
Um die Effekte der Varianten an dem Membran-gebundenen CNTF-Neuronrezeptor zu bestimmen, wurden die Moleküle mittels Methoden, die aus der Literatur (15, 22) bekannt sind, bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, diese Aktivität in humanen Neuroblastoma-Zellen zu stimulieren. Diese Zellen exprimieren konstitutiv den CNTFRα-Rezeptor. Die Membran-gebundenen IMR-32 Rezeptoren, bewirkt durch die Einzelmutationen in den Positionen 152 und 155, haben sich als weniger sensitiv herausgestellt als der lösliche Rezeptor. Die Mutante Phe152Ala/MUT-DH war so aktiv wie das Wildtyp Cytokin und die Varianten Lys155Ala/CNTF und Lys155Ala/MUT-DH zeigten sich selbst als wirkungsvolle Agonisten. Jedoch führte auch in diesem Fall die gleichzeitige Substitution der beiden Reste zu einem totalen Verlust der biologischen Aktivität.
Die hohe biologische Aktivität der Mutanten Phe152Ala und Lys155Ala in IMR-32 Zellen ist wahrscheinlich durch die hohe lokale Konzentration an Rezeptoruntereinheiten auf der Oberfläche der Zelle bewirkt. In der Tat ist zu erwarten, dass CNTF-Mutanten mit einer reduzierten LIFR-Rezeptorbindungskapazität weiterhin eine starke Stimulierungsaktivität an anderen neuronalen Populationen die hohe Levels an Membran-Rezeptorkomplexen expremieren, z.B. solche die an motorischen Funktionen beteiligt sind, beibehalten. Es wird vermutet, dass die Nebenreaktionen, welche durch die Abgabe von CNTF resultieren, z.B. die Akut-Phase-Reaktion, vermittelt sind durch die Wirkungsweise die der zirkulierende lösliche CNTFRα-Rezeptor auf die Zellen, die den LIFR-Rezeptor exprimieren (z.B. Hepatocyten), ausübt. Es wird demnach erwartet, dass CNTF-Mutanten, welche eine schwache Aktivität zeigen, wenn sie mit dem löslichen Rezeptor interagieren und auf der anderen Seite einen hohen Level an biologischer Aktivität zeigen, wenn eine Wechselwirkung mit den Membran-gebundenen Rezeptorkomplexen der Zelle stattfindet, haben eine spezifischere neuronale Wirkungsweise, die die peripheralen Nebeneffekte reduziert.
BEISPIEL 3
Antagonisten-Eigenschaften von gewissen CNTF-Varianten
Es wird erwartet, dass CNTF-Mutanten, welche die Fähigkeit verloren haben, an den LIF-Rezeptor zu binden, aber weiterhin in der Lage sind, CNTFRα und gp130 zusammenzufügen, als kompetitive Antagonisten agieren werden. Die Inhibierung der biologischen Aktivität von CNTF bei diesen Mutanten wurde in IMR-32 Zellen unter der Vorgehensweise, wie in Beispiel 2 beschrieben, getestet. Das Variantprotein Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH verursacht eine Verschiebung der CNTF-Antwortkurve in Richtung hoher Konzentrationen des Agonistenmoleküls, was zeigt, dass es als ein kompetitiver Antagonist am Membran-gebundenen CNTFRα-Rezeptor agiert. Eine 50%ige Inhibierung von Chat-Aktivität, induziert durch eine noch nicht gesättigte Dosis an CNTF wurde mit einem 70-fachen Überschuss an Phe152Ala/Lys155Ala/MUT-DH erhalten (4B).
BEISPIEL 4
Konstruktion von CNTF-Varianten
Mutationen wurden in die humanen CNTF oder S166D/Q167H/CNTF (DH-CNTF) Sequenzen durch inverse PCR (Hemsley et al., 1989), unter Verwendung der pRSET-CNTF oder der pRSET-MUT-DH-Vektoren (italienische Patentanmeldung RM9500380) als Template, eingeführt. Synthetische Oligonukleotid-Primer wurden so konstruiert, dass sie "Rücken an Rücken" auf der Duplex liegen, wobei die 5'-Enden sich in unmittelbarer Nachbarschaft befinden und die 3'-Enden für den Aufbau in entgegengesetzte Richtungen um den Plasmidzirkel orientiert sind. Die folgenden Primer wurden verwendet:
Antisinn-Primer für FA-CNTF und FADH-CNTF:
5'CGCCTTCTCAAAGAGCCACCATCTCCAAC3'
Antisinn-Primer für AKDH-CNTF:
5'CTTCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAAC3'
Antisinn-Primer für AA-CNTF und AADH-CNTF:
5'CGCCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAAC3'.
Diese Mutantenprimer wurden zusammen mit den Sinn-Wildtyp-Primer:
5'CTGTGGGGCCTAAAGGTGCTG3'
in der PCR verwendet.
Templat DNA (10 fmol), und Primersets (jedes 1 mM) wurden in 100 ml Reaktionsvolumen, welches 100 mM Tris-HCl pH 8,3, 500 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 0,2 mM für jedes dNTP und 2 Einheiten Taq-Polymersase (Boehringer) enthält, inkubiert.
Die Amplifikation lief durch einen Zyklus von Denaturation bei 94°C (1 min.), Annelierung bei 45 °C (1 min.) und Primerverlängerung bei 72 °C (12 min.) für insgesamt 25 Zyklen. Fünf Mikroliter Portionen der Probe, generiert durch PCR, wurden auf Agarosegel (0,7 %) analysiert, um die Effizienz der Amplifikation zu bestimmen. Der Verbleib (95 ml) wurde mit Klenow-Fragment der E.coli Polymerase I (20 Einheiten) und den vier dNTP einer entgültigen Konzentration je 250 mM versetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C für 30 min. inkubiert. Doppelstrahlung DNA wurde aus den PCR Reaktionsmischungen unter Verwendung von dem Wizard PCR preps DNA Reinigungssystem (Promega) isoliert und am 5'-Ende mittels Inkubation mit 20 Einheiten der T4 Polynukleotid-Kinase (Promega) und 1 mM ATP phosphoryliert.
Die phosphorylierten DNA-Proben wurden dann der Elektrophorese auf einem Agarosegel (0,7 %) ausgesetzt, und die passenden Banden wurden herausgeschnitten und unter Verwendung eines Qiagen-DNA-Reinigungskits aufgereinigt. Ein Volumen an 10 Mikroliter einer DNA (aus insgesammt 25 ml) wurde in einer Ligasereaktion, die einen Standard Stumpfenden Ligationspuffer und T4 DNA Ligase (12 Einheiten) enthält, verwendet. Die Ligationsmischungen wurden über Nacht bei 16 °C inkubiert, und dann auf 65 °C erwärmt und verwendet, um den E.coli Top 20 Zellen zu transformieren. Die Transformate wurden isoliert und die Identität der Klone wurde durch DNS-Sequenzanalyse bestätigt. Es hat sich herausgestellt, dass die Codierungssequenzen für AA-CNTF und AA-DH-CNTF 2 zusätzliche Mutationen (möglicherweise durch PCR-induzierte Fehler) an den Nukleotiden 208 und 435 enthielten. Die letztere Mutation wurde durch PCR unter Verwendung der folgenden Sinn- und Antisinn-Primer eliminiert:
Sinn:
5'GTCACCATGGCTTTCACAGAGCATTCACCG3'
Antisinn:
5'AGCTCCTGCAGCACCTTTAGGCCCCACAGCGCCTTCTCAGCGAGACCACCATCTCCAACATTAAT3'
Die PCR wurde für 30 Zyklen mit 140 Sekunden bei 94 °C, 140 Sekunden bei 50 °C und 190 Sekunden bei 72 °C unter Verwendung von 2,5 U an pfu DNA Polymerase (Stratagene) nach Herstellerangaben durchgeführt. Die PCR-Produkte wurden, wie oben beschrieben, isoliert, mit NcoI (Seite die an Nukleotid -2 der CNTF-Codierungssequenz gelegen ist) und PstI (Seite die an Nukleotid 484 der Codierungssequenz gelegen ist) verdaut und in die NcoI/PstI-verdauten pRSET-CNTF oder pRSET-DH-CNTF-Vektoren subkloniert. Dieses Vorgehen führte zu den Vektoren, die die Codierungssequenz für AA-CNTF oder AADH-CNTF enthalten, mit einer verbleibenden Mutation bei Nukleotid 208. Diese Mutation wurde durch die Verdauung der Vektoren mit HindIII (Seite die an Nukleotid 233 und an dem Ende der Codierungssequenz gelegen ist) und durch Austausch des großen Restriktionsfragmentes (umfassend Nukleotid 1 bis 233) mit dem korrespondierenden Fragment von pRSET-CNTF, eliminiert.
LITERATURVERZEICHNIS

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SEQUENZLISTE ALLGEMEINE INFORMATION

Claims

Variante eines humanen ciliaren neurotrophen Faktors (hCNTF), wobei die Variante gekennzeichnet ist durch die Substitution von Phenylalanin 152 und/oder Lysin 155 durch Alanin und eine Aminosäuresequenz umfasst, welche aus der in SEQ-ID-Nr. 3, SEQ-ID-Nr. 4, SEQ-ID-Nr. 5 oder SEQ-ID-Nr. 7 angegebenen Sequenz ausgewählt ist.
hCNTF-Variante nach Anspruch 1, wobei die Variante SEQ-ID-Nr. 3 umfasst.
hCNTF-Variante nach Anspruch 1, wobei die Variante SEQ-ID-Nr. 4 umfasst.
hCNTF-Variante nach Anspruch 1, wobei die Variante SEQ-ID-Nr. 5 umfasst.
hCNTF-Variante nach Anspruch 1, wobei die Variante SEQ-ID-Nr. 7 umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als aktiven Grundbestandteil mindestens eine Variante eines humanen ciliaren neurotrophen Faktors (hCNTF) nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
hCNTF-Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 zur Verwendung in der Therapie.
Verwendung der hCNTF-Variante nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 5 oder der Zusammensetzung nach Anspruch 6 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen.