DE69802191T3

DE69802191T3 - Festphasen-Nukleinsäure-Isolierung

Info

Publication number: DE69802191T3
Application number: DE69802191T
Authority: DE
Inventors: Knut Rudi; Sigurd Kjetill JAKOBSEN
Original assignee: Genpoint AS
Current assignee: Genpoint AS
Priority date: 1997-05-13
Filing date: 1998-05-13
Publication date: 2008-02-07
Anticipated expiration: 2018-05-14
Also published as: CN1187362C; EP0988307B1; DE69802191D1; DE69802191T2; CN1260800A; GB9709728D0; EP0988307B2; AU751324B2; PT988307E; ES2163865T5; US20040072215A1; JP2002507116A; JP4175670B2; WO1998051693A1; CA2289943C; AU751324C; CA2289943A1; DK0988307T3; US7560228B2; ES2163865T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Detektion von der An- oder Abwesenheit prokaryotischer oder eukaryotischer Zellen, und insbesondere ein Verfahren, das einen Festphasen-Zellenisolierungsschritt mit einem Festphasen-DNS-Isolierungsschritt kombiniert.
Die Isolierung von Nukleinsäure ist ein wichtiger Schritt bei vielen biochemischen und diagnostischen Verfahren. Beispielsweise ist oftmals die Trennung von Nukleinsäuren aus komplexen Mischungen, in denen sie des öfteren vorkommen, notwendig, bevor weitere Untersuchungen und Verfahren, beispielsweise Detektion, Klonen, Sequenzierung, Amplifizierung, Hybridisierung, cDNS-Synthese usw. vorgenommen werden können; das Vorhandensein von großen Mengen von Zellmaterial oder anderem kontaminierenden Material, beispielsweise Proteinen oder Kohlenhydraten, behindert in derartigen komplexen Mischungen oftmals viele der Reaktionen und Techniken, die in der Molekularbiologie verwendet werden. Außerdem kann DNS die RNS-Präparate kontaminieren und umgekehrt. Nicht nur vom präparativen Standpunkt aus, sondern auch im Hinblick auf die vielen heutzutage verwendeten Verfahren, die auf der Identifizierung von DNS oder RNS beruhen, beispielsweise die Diagnose von mikrobiellen Infektionen, in der forensischen Wissenschaft, bei der Gewebe- und Bluttypisierung, bei der Detektion von genetischen Veränderungen usw., sind Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus komplexen Mischungen, wie beispielsweise Zellen, Geweben usw. erforderlich.
Der Einsatz der Identifizierung von DNS oder RNS ist heutzutage weithin als ein Mittel zur Unterscheidung zwischen unterschiedlichen Zellen oder Zellarten oder zwischen unterschiedlichen Varianten derselben Zelle, die DNS-Mutationen enthält, akzeptiert. Daher kann das HLA-Typing, das üblicherweise durch die Identifizierung von charakteristischen Oberflächen-Antigenen unter Verwendung von Antikörpern durchgeführt wird, alternativ durch die Identifizierung der DNS-Codierung für derartige Antigene durchgeführt werden. Eine mikrobielle Infektion oder Kontamination kann besser durch Nukleinsäureanalyse identifiziert werden, um den Zielorganismus zu detektieren, als daß man sich auf die Detektion von charakterisierenden Merkmalen der Zellen des Mikroorganismus, beispielsweise auf morphologische oder biochemische Weise, verläßt. Genetische Variationen können durch ähnliche Mittel identifiziert werden.
Im allgemeinen wird DNS oder RNS durch Hybridisierung mit einem oder mehreren Oligonukleotiden unter strengen Bedingungen durchgeführt, die ausreichend sind, daß ein niedriger Grad an unspezifischen Bindungen erhalten wird. Im allgemeinen werden die hybridisierenden Nukleotide in Form von Paaren als Primer bei den derzeit erhältlichen unterschiedlichen Arten von in-vitro-Amplifizierung verwendet, hauptsächlich bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), aber ebenso bei der Ligase-Amplifizierungsreaktion (LAR), bei der selbsterhaltenden Sequenzreplizierung (3SR) und bei dem Q-beta-Replikase-Amplifizierungssystem. Nach der Amplifizierung kann die DNS durch Sequenzierung weiter charakterisiert werden, beispielsweise durch das Verfahren nach Sanger. Amplifizierung und Sequenzierung können miteinander kombiniert werden.
Wie vorstehend erwähnt wurde, erfordern alle Verfahren im allgemeinen einen anfänglichen Nukleinsäure-Isolierungs schritt, um die Nukleinsäure von Materialien, beispielsweise Proteinen abzutrennen, die die nachfolgend verwendeten Hybridisierung- und Amplifizierungstechniken, stören können.
Eine große Anzahl von Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren sind bekannt, aber ganz allgemein beruhen diese Verfahren auf einer komplexen Abfolge von Extraktions- und Waschschritten und sind in ihrer Durchführung zeit- und arbeitsaufwendig.
Klassische Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus komplexen Ausgangsmaterialien, wie Blut oder Blutprodukten oder Gewebe, beinhalten die Lyse bzw. Auflösung des biologischen Materials durch ein Tensid oder einen chaotropen Stoff, wenn möglich in Gegenwart von proteinabbauenden Enzymen, gefolgt von mehreren Extraktionen mit organischen Lösungsmitteln, beispielsweise Phenol und/oder Chloroform, Fällung mittels Ethanol, Zentrifugationen und Dialyse der Nukleinsäuren. Derartige Verfahren sind in ihrer Durchführung nicht nur sehr mühselig und zeitaufwendig, sondern die relativ große Anzahl der erforderlichen Schritte vergrößert das Risiko des Abbaus, des Verlusts der Probe oder der Kreuzkontamination von Proben, wenn mehrere Proben gleichzeitig bearbeitet werden.
Daher werden Verbesserungen bei den Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren kontinuierlich erforscht und kürzlich wurden andere Verfahren vorgeschlagen, die auf der Verwendung einer festen Phase beruhen. In der US-A-5.234.809 wird beispielsweise ein Verfahren beschrieben, bei dem Nukleinsäuren an eine feste Phase in Form von Silikateilchen in Gegenwart eines chaotropen Agens, wie eines Guanidiniumsalzes, gebunden werden, wodurch sie vom Rest der Probe getrennt werden können. Die WO 91/12079 be schreibt ein Verfahren, bei dem Nukleinsäuren auf der Oberfläche einer festen Phase durch Fällung zurückgehalten werden. Im allgemeinen werden Alkohole und Salze als Fällungsmittel verwendet. Die WO-A-9207863 offenbart Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren, die folgende Schritte umfassen:

a) Immobilisierung der Zellen in einer Matrix
b) Auflösen der Zellen
c) Fixieren der Nukleinsäure auf der Oberfläche der Matrix, und
d) Eluieren der Nukleinsäuren.

Die „Matrix" der WO-A-9207863 kann aus einem Bett von geringfügig aggregierten Partikeln bestehen, dergestalt, daß die Zwischenräume eine geeignete Größe zum Festhalten der Zellen aufweisen. Die Oberfläche der Matrix kann Ionenaustauscheigenschaften aufweisen, die die reversible Bindung der Nukleinsäure an die Oberfläche ermöglichen. Eine Bindung der Zellen an die Matrix ist nicht offenbart. DE 195 20 398 A1 beschreibt eine Art eines magnetischen Partikels, der eine äußere Oberfläche aus Glas hat. Vorgeschlagen in diesem Dokument, und gezeigt in 1 wird ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren, das zwei Arten dieser Partikel verwendet. Die erste trägt Antikörper zur Zellbindung und ein zweiter Satz zur Nukleinsäurebindung.
Während derartige Verfahren das Nukleinsäuretrennverfahren beschleunigen, besteht weiterhin ein Bedarf an Verfahren, die schnell und einfach in ihrer Durchführung sind, die gute Ausbeuten ohne Verluste ermöglichen und insbesondere in einfacher Weise auf die Isolierung von Nukleinsäuren aus Zellen in Mischungen oder Umgebungen anwendbar sind, bei denen sie in niedrigen Konzentrationen vorliegen können, als ein erster präparativer Schritt bei einer Isolierung von Nukleinsäuren aus Zielzellen bei auf Nukleinsäuren basierenden Zelldetektionsverfahren. Die vorliegende Erfindung wird diesem Bedürfnis gerecht. Während die auf Hybridisierung beruhenden Techniken, beispielsweise PCR und andere auf Nukleinsäure basierende Verfahren zur Detektion von Mikroorganismen eine hohe Empfindlichkeit bei der Detektion von Zellen in Proben ermöglichen, sind insbesondere die Probenherstellungsschritte, d.h. die Konzentration der Zielzellen und die Aufreinigung der Nukleinsäure, entscheidende Faktoren, um eine hohe Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit des Verfahrens zu erhalten. Gegenwärtig werden die Zellen üblicherweise zuerst durch Filtration, Zentrifugation oder Affinitätsbindung an Antikörper, die an einer festen Phase verankert sind, aus der Probe isoliert. Nach der so erfolgten Aufkonzentrierung der Zellen wird die DNS anschließend aus den konzentrierten Zellen, oft durch die vorstehend erläuterten klassischen Phenol/Chloroform-Extraktionsverfahren mit ihren damit verbundenen Nachteilen, gereinigt.
Wir schlagen nun eine neue Lösungsmöglichkeit für dieses Problem vor, die die Zellisolierung und Nukleinsäureaufreinigung in einem einzigen „Schritt" integriert, indem die gleiche Festphase sowohl für die Zelladsorption als auch für die Nukleinsäurereinigung verwendet wird. Dies wird dadurch erreicht, daß in einem ersten Schritt die Zellen auf einen festen Träger gebunden werden. Der gleiche feste Träger wird anschließend unter derartigen Bedingungen verwendet, daß die Auflösung der gebundenen Zellen erfolgt und anschließend die Nukleinsäuren an den Träger binden können.
Auf diese Weise kann Nukleinsäure durch ein einfaches und schnelles Verfahren, das weniger als 45 Minuten in Anspruch nimmt, in einer Form, die zur Detektion geeignet ist, aus einer Probe isoliert werden.
Unter einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird daher ein Verfahren zur Detektion der An- oder Abwesenheit einer eukaryotischen oder prokaryotischen Zielzelle in einer Probe zur Verfügung gestellt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt:

a) Bereitstellen eines teilchenförmigen festen Trägers und Mischen desselben mit der Probe und Zulassen des Bindens von Zellen in der Probe an den festen Träger, um Zellen aus der Probe zu isolieren,
b) Lysieren bzw. Auflösen der isolierten Zellen,
c) Binden von aus den lysierten Zellen freigesetzter Nukleinsäure an denselben festen Träger, und
d) Detektieren der An- oder Abwesenheit von für diese Targetzellen charakteristischen Nukleinsäure innerhalb der gebundenen Nukleinsäure.

Die Nukleinsäure kann DNS, RNS oder jede ihrer natürlich vorkommenden oder synthetischen Modifikationen sein, bzw. Kombinationen davon. Jedoch ist die Nukleinsäure vorzugsweise DNS, die als Einfach- oder Doppelstrang oder in jeder anderen Form, beispielsweise linear oder ringförmig vorliegt.
Der Begriff "Zelle" umfaßt, wie er vorliegend verwendet wird, alle prokaryotischen (einschließlich der Archaebakterien) und eukaryotischen Zellen. Typische "Zellen" umfassen daher alle Arten von Säugetier- und Nichtsäugetierzellen, Pflanzenzellen, Protoplasten, Bakterien und Protozoen.
Die Probe kann daher jedes Material sein, das Nukleinsäuren innerhalb derartiger Zellen umfaßt, einschließlich beispielsweise Nahrungsmittel und verwandte Produkte, klinische Proben und Umweltproben. Daher kann die Probe eine biologische Probe sein, die prokaryotische oder eukaryotische Zellen und Protoplasten enthält. Derartiges biologisches Material kann daher alle Arten von Säugetier- und Nichtsäugetierzellen, Pflanzenzellen, Algen, einschließlich blaugrüner Algen, Pilze, Bakterien, Protozoen usw. umfassen. Typische Beispiele umfassen daher Blut und Blutderivate, wie beispielsweise Plasma oder Buffycoat (Leukozytenmanschette), Urin, Kot, zerebrospinale Flüssigkeit (Liquor) oder andere Körperflüssigkeiten, Gewebe, Zellkulturen, Zellsuspension usw. und auch Umweltproben, beispielsweise Erdböden, Wasser oder Nahrungsmittelproben.
Die Probe kann ebenso relativ reine oder teilweise aufgereinigte Ausgangsmaterialien umfassen, wie beispielsweise halbaufgereinigte Reaktionsprodukte, die durch andere Zelltrennverfahren erhalten wurden.
Die Bindung der Zellen auf dem festen Träger kann auf jegliche bekannte oder übliche Weise erfolgen. Beispielsweise kann eine unspezifische Bindung der Zellen auf dem Träger durch eine entsprechende Auswahl des festen Trägers und der Bindungsbedingungen, beispielsweise der chemischen oder physikalischen Beschaffenheit (beispielsweise der Hydrophobizität oder Ladung) der Oberfläche des festen Trägers, des pH-Wertes oder der Zusammensetzung des Isolationsmediums usw. erfolgen. Die Beschaffenheit der Zielzellen kann ebenfalls eine Rolle spielen und es wurde beispielsweise gezeigt, daß gewisse hydrophobe Zellen sofort und unspezifisch an hydrophoben Oberflächen binden, während hydrophile Zellen an hydrophileren Oberflächen binden können. Es wurde ebenfalls beobachtet, daß negativ geladene Zellen, wie B-Lymphozyten, einen hohen Grad an unspezifischer Bindung an schwach positiv geladenen Oberflächen aufweisen. Daher können feste Träger verwendet werden, die entsprechend geladene Oberflächen zur Bindung eines gewünschten Zelltyps auf weisen. Entsprechende Puffer usw. können als Medien für den Zellisolierungschritt verwendet werden, um geeignete Bedingungen für die Zellbindung zu erreichen, indem einfach der feste Träger und die Probe in einem geeigneten Medium miteinander in Kontakt gebracht werden. Zweckmäßigerweise kann ein Puffer mit geeigneter Ladung, Osmolarität usw. der Probe vor oder gleichzeitig oder nach dem Inkontaktbringen mit dem festen Träger zugegeben werden.
Vorteilhafterweise kann die unspezifische Bindung der Zellen durch Fällung der Zellen erfindungsgemäß auf den Träger erreicht werden, beispielsweise indem die Zellen mit dem Träger in Gegenwart von Alkohol und Salz, beispielsweise durch Zugabe eines Puffers, der Alkohol und Salz enthält, in Kontakt gebracht werden. Die Verwendung von Alkohol und Salz in Trennungs- und Aufreinigungsverfahren, wie bei Fällungen, ist bekannt und es kann erfindungsgemäß jeder geeignete Alkohol oder jedes geeignete Salz, der bzw. das in derartigen Verfahren zum Einsatz kommt, verwendet werden. Daher wird der Alkohol zweckmäßigerweise ein beliebiges Alkanol sein und es wurde gefunden, daß niedrige Alkanole, wie Isopropanol und Ethanol, geeignet sind. Andere geeignete Alkohole umfassen Methanol und n-Butanol.
Das Salz kann aus jeder geeigneten Quelle stammen, beispielsweise kann es Natrium- oder Kaliumchlorid oder -acetat, oder Ammoniumacetat sein. Geeignete Alkohol- und Salzkonzentrationen können entsprechend dem genauen System und den eingesetzten Reagenzien bestimmt werden. Allgemein wurde gefunden, daß eine Zugabe von 0,5 bis 3 Volumina Alkohol, beispielsweise 1 Volumen, zur Probe geeignet ist. Zweckmäßigerweise wird der Alkohol in einer Konzentration von 50 bis 100 % (w/v) verwendet. Es wurde gefunden, daß die Verwendung von Salzkonzentrationen von beispielsweise 0,1 bis 10,0 M, insbesondere von 0,1 bis 7,0 M, beispiels weise von 0,1 bis 3,0 M, geeignet ist, und praktischerweise kann das Salz in den vorstehenden Konzentrationen bereits in der Alkohollösung enthalten sein. Daher kann ein sogenannter "Zellbindungspuffer" verwendet werden, der den Alkohol und das Salz in den gewünschten Konzentrationen enthält. Alternativ dazu können das Salz und der Alkohol getrennt voneinander zugegeben werden.
Die erfindungsgemäße Verwendung von Alkohol als Fällungsmittel für Zellen ist für eine Verwendung des Verfahrens in klinischen Diagnoseverfahren vorteilhaft, da die Verwendung von Alkohol zur Konservierung klinischer Proben üblich ist. Daher können Patientenproben einfach einem Alkohol enthaltenden Zellbindungspuffer zugegeben werden, wodurch die Proben konserviert werden und für die Aufreinigung der Nukleinsäuren bereit sind.
Als Alternative zur Fällung mit einem Salz/Alkoholgemisch können andere Fällungsmittel, beispielsweise Polyethylenglycole (PEG) oder andere Polymere mit hohem Molekulargewicht, die ähnliche Eigenschaften aufweisen, entweder alleine oder in Kombination mit Salz und/oder Alkohol verwendet werden. Die Konzentrationen derartiger Polymere können in Abhängigkeit von dem genauen System, beispielsweise in bezug auf das Polymer und den Zelltyp, variieren, aber im allgemeinen können Konzentrationen von 1 bis 50 % (w/v), beispielsweise von 2 bis 30 % verwendet werden.
Zellen mit phagozytischer Aktivität können aufgrund ihrer Fähigkeit, eine teilchenförmige feste Phase, beispielsweise Kügelchen, "zu binden" oder "zu verschlingen", zurückgehalten werden, und können daher in einfacher Weise aufgefangen werden. In diesem Fall muß die Zellen-enthaltende Probe einfach nur mit der festen Phase unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht oder inkubiert werden. Diese Art von Zelleinfang hängt nicht von einer spezifischen Bindungsart ab.
Der feste Träger kann ebenfalls mit Komponenten versehen werden, die das unspezifische Binden von Zellen unterstützen. Dies können beispielsweise Proteine oder Proteinfragmente oder Polypetide sein, die unspezifisch von Zellen gebunden werden. Daher bindet beispielsweise ein fester Träger, der mit Antikörpern beschichtet ist oder Antikörper trägt, die Zellen unspezifisch durch Fc-Rezeptoren auf der Zelloberfläche. Die Techniken zur Immobilisierung von Antikörpern und anderen Proteinen oder Polypetiden auf festen Oberflächen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Wie vorstehend erwähnt ist, kann schließlich eine unspezifische Zellbindung auf festen Trägern mit geladenen, hydrophoben oder hydrophilen Oberflächen durch Verwendung von Puffern erreicht werden, oftmals in Verbindung mit Salzen, um für die Bindung geeignete pH-Bedingungen zu erreichen. Die richtigen Puffer und Bedingungen variieren in Abhängigkeit von der Art der Zelle, des festen Trägers, usw.
Die verschiedenen Komponenten werden gemischt und einfach während eines geeigneten Zeitraums stehengelassen, um den Zellen die Bindung an den Träger zu ermöglichen. Der Träger kann anschließend aus der Lösung durch jedes geeignete Mittel, das selbstverständlich von der Art des Trägers abhängt, entfernt werden und umfaßt sämtliche Arten des Entfernens eines Trägers aus dem Überstand einer Probe oder umgekehrt, beispielsweise Zentrifugieren, Dekantieren, Pipettieren, usw.
Die Bedingungen während der Durchführung dieses Verfahrens sind unkritisch, und es wurde gefunden, daß es praktisch ist, beispielsweise einfach die Probe mit dem "Zellbin dungspuffer" in Gegenwart einer festen Phase zu mischen und sie vor dem Trennen bei Raumtemperatur, beispielsweise für 5 bis 30 Minuten, beispielsweise für 20 Minuten stehen zu lassen. Wie vorstehend erwähnt, ist die Reaktionszeit unkritisch und weniger als 5 Minuten sind oftmals ausreichend. Falls es zweckmäßig erscheint, können jedoch auch längere Zeiträume verwendet werden, beispielsweise 20 Minuten bis 3 Stunden oder selbst über Nacht. Das Vermischen kann durch jedes beliebige übliche Mittel erfolgen, einschließlich beispielsweise durch einfaches Rühren oder Verwirbeln. Falls gewünscht, können auch höhere oder niedrige Temperaturen verwendet werden, dies ist jedoch nicht notwendig.
Andere optionale Komponenten der "Zellbindungs"-Zusammensetzung umfassen Polymere mit hohem Molekulargewicht, beispielsweise PEG usw., schwache ungeladene Tenside, beispielsweise Triton X-100, NP-40, usw., DNAsen und andere Enzyme, solange sie die Zellen intakt belassen.
Bevorzugte "Zellbindungs"-Zusammensetzungen können beispielsweise folgendes umfassen:
Isopropanol, 0,75 M Ammoniumacetat
75 % Ethanol, 0,75 M Ammoniumacetat
Obgleich das unspezifische Binden von Zellen erfindungsgemäß bevorzugt ist, ist es ebenso möglich, feste Träger zu verwenden, die modifiziert wurden, um die selektive Bindung erwünschter Zellen zu ermöglichen, die die Nukleinsäure enthalten. Daher können beispielsweise Träger, die Antikörper oder andere für einen gewünschten Zelltypus spezifische, bindende Proteine, beispielsweise Lektine, aufweisen verwendet werden. Dies kann einen Selektivitätsgrad bei der Isolierung der Nukleinsäure hineinbringen, da nur Nuklein säure aus einer gewünschten Zielquelle innerhalb eines komplexen Gemisches getrennt werden kann. Daher kann ein derartiger Träger beispielsweise dazu verwendet werden, die gewünschte Zielzellart aus der Probe abzutrennen und zu entfernen.
Die Darstellung derartiger selektiver Zellfängermatrizen ist aus dem Stand der Technik gut bekannt und in der Literatur beschrieben.
Der feste Träger ist teilchenförmig und nimmt die Form von Partikeln an.
Zweckmäßigerweise kann der Träger aus Glas, Siliziumdioxid, Latex oder einem polymeren Material bestehen. Bevorzugt sind Materialien, die eine hohe Oberfläche für die Bindung der Zellen und anschließend für die Nukleinsäuren aufweisen. Derartige Träger weisen im allgemeinen eine unregelmäßige Oberfläche auf. Kügelchen sind im allgemeinen aufgrund ihrer größeren Bindungskapazität bevorzugt, insbesondere polymere Kügelchen.
Zweckmäßigerweise umfaßt ein teilchenförmiger fester Träger, wie er erfindungsgemäß verwendet wird, sphärische Kügelchen. Die Größe der Kügelchen ist nicht kritisch, aber sie können beispielsweise einen Durchmesser in der Größenordnung von wenigstens 1, vorzugsweise von wenigstens 2 μm, und einen maximalen Durchmesser von vorzugsweise nicht mehr als 10 und besonders vorzugsweise nicht mehr als 6 μm aufweisen. Beispielsweise wurde nachgewiesen, daß Kügelchen mit einem Durchmesser von 2,8 μm und 4,5 μm gut funktionieren.
Monodisperse Teilchen, d.h. Teilchen, die im wesentlichen eine einheitliche Größe aufweisen, (beispielsweise eine Größe mit einer Standardabweichung des Durchmessers von weniger als 5 %) haben den Vorteil, daß sie eine einheitliche Reproduzierbarkeit der Reaktion ermöglichen. Monodisperse Polymerteilchen, die mit Hilfe der in der US-A-4.336.173 beschriebenen Technik hergestellt wurden, sind besonders geeignet.
Nichtmagnetische Polymerkügelchen, die zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind, sind bei der Firma Dyno Particles AS (Lillestrøm, Norwegen) und ebenso bei Qiagen, Pharmacia und Serotec erhältlich.
Jedoch sind magnetische Kügelchen bevorzugt, um die Handhabung und die Trennung zu vereinfachen bzw. zu unterstützen. Der Begriff "magnetisch", wie er hier verstanden wird, bedeutet, daß der Träger in der Lage ist, ein magnetisches Moment aufzuweisen, das auf ihn übertragen wird, wenn er in ein magnetisches Feld plaziert wird und er daher unter der Einwirkung dieses Feldes räumlich beweglich ist. Mit anderen Worten kann ein magnetische Teilchen umfassender Träger sofort durch magnetische Aggregation entfernt werden. Dies erlaubt eine schnelle, einfache und effiziente Art der Trennung der Teilchen im Anschluß an die Zell- und Nukleinsäurebindungsschritte und ist ein weit weniger hartes Verfahren als übliche Techniken, wie beispielsweise Zentrifugation, die Scherkräfte erzeugen, die die Zellen zerbrechen oder die Nukleinsäuren denaturieren bzw. abbauen können.
Bei der Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können daher die magnetischen Teilchen mit daran gebundenen Zellen durch das Anlegen eines magnetischen Feldes, beispielsweise unter Verwendung eines Dauermagneten, auf eine geeignete Oberfläche entfernt werden. Es ist für gewöhnlich ausreichend, einen Magneten an der Seite des die Probenmischung enthaltenden Gefäßes anzubringen, um die Teilchen an der Wand des Gefäßes zu aggregieren, und den Rest der Probe wegzuschütten.
Besonders bevorzugt sind superparamagnetische Teilchen, beispielsweise diejenigen, die von Sintef in der EP-A-106873 beschrieben wurden, da die magnetische Aggregation und das Zusammenklumpen der Teilchen während der Reaktion vermieden werden können und dadurch eine einheitliche Nukleinsäureextraktion gewährleistet wird. Die gutbekannten magnetischen Teilchen, die von der Firma Dynal AS (Oslo, Norwegen) unter dem Namen DYNABEADS verkauft werden, sind besonders zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet.
Funktionalisierte beschichtete Teilchen für eine Verwendung bei der vorliegenden Erfindung können durch Modifikation der Kügelchen aus den US-Patenten 4.336.173 , 4.459.378 und 4.654.267 hergestellt werden. Daher können Kügelchen oder andere Träger hergestellt werden, die unterschiedliche Arten funktionalisierter Oberflächen aufweisen, beispielsweise positiv oder negativ geladene, hydrophile oder hydrophobe Oberflächen.
Unterschiedliche Zellen weisen unterschiedliche Abstufungen unspezifischer Bindung an unterschiedlichen Oberflächen und Trägern auf und es kann daher vorteilhaft sein, die Menge des festen Trägers (beispielsweise die Zahl der Teilchen) pro Volumeneinheit zu "titrieren", um die Zellbindungsbedingungen zu optimieren und die optimale Trägerfläche zu bestimmen, beispielsweise die Partikelkonzentration in einem vorgegebenen System.
Nach der Zellbindung werden die isolierten oder trägergebundenen Zellen lysiert, um ihre Nukleinsäure freizusetzen. Verfahren zur Lyse von Zellen sind aus dem Stand der Tech nik gut bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben und es kann jedes der bekannten Verfahren verwendet werden. Unterschiedliche Verfahren können für unterschiedliche Zellen besser geeignet sein, aber beispielsweise kann jedes der nachfolgenden Verfahren verwendet werden: Tensidlyse unter Verwendung von beispielsweise SDS, LiDS oder Sarkosyl in geeigneten Puffern, die Verwendung von chaotropen Stoffen, wie Guanidiumhydrochlorid (GHCl), Guanidiniumthiocyanat (GTC), Natriumjodid (NaI), -perchlorat usw.; mechanisches Brechen, beispielsweise unter Verwendung einer French Press, Beschallung, Mahlen mit Glaskügelchen, Aluminiumdioxid oder in flüssigem Stickstoff, enzymatische Lyse beispielsweise unter Verwendung von Lysozym, Proteinasen, Pronasen oder Zellulasen, oder jedes andere beliebige Lyseenzym, das handelsüblich erhältlich ist; Lyse der Zellen durch bakteriophage oder virale Infektion; Gefriertrocknen; osmotische Stöße; Mikrowellenbehandlung, Temperaturbehandlung, beispielsweise durch Erhitzen oder Kochen oder Einfrieren, beispielsweise in Trockeneis oder flüssigem Stickstoff, und Auftauen, alkalische Lyse. Wie vorstehend erwähnt wurde, sind alle diese Verfahren Standardlysetechniken und aus dem Stand der Technik bekannt und jedes einzelne dieser Verfahren oder eine Kombination von Verfahren kann verwendet werden.
Zweckmäßigerweise kann die Lyse erfindungsgemäß unter Verwendung von chaotropen Stoffen und/oder Tensiden durchgeführt werden. Es wurde gefunden, daß im Falle von Bakterienzellen beispielsweise die Kombination eines chaotropen Stoffs mit einem Tensid besonders effizient ist. Ein beispielhaftes geeignetes Lyseagens umfaßt daher einen chaotropen Stoff, wie beispielsweise GTC oder GHCl, und ein Tensid, wie beispielsweise SDS oder Sarkosyl. Die Lyseagenzien können in einfachen wäßrigen Lösungen zugegeben werden, oder sie können in einer Pufferlösung enthalten sein, um einen sogenannten "Lysepuffer" zu bilden. Jeder geeignete Puffer kann dazu verwendet werden, einschließlich beispielsweise Tris, Bicine, Tricine und Phosphatpuffer. Alternativ dazu können die Lyseagenzien getrennt zugegeben werden. Geeignete Konzentrationen und Mengen an Lyseagenzien variieren in Abhängigkeit von dem genauen System, der Art der Zellen usw. und können in zweckdienlicher Weise bestimmt werden, aber es können beispielsweise Konzentrationen von 2 M bis 7 M chaotroper Stoff, wie GTC, GHCl, NaI oder Perchlorat, 0,1 M bis 1 M alkalische Agenzien, wie Na-OH, und 0,1 bis 50 % (w/v), z. B. 0,5 bis 15 % Tensid verwendet werden. Ein Beispiel eines geeigneten typischen Lysepuffers umfaßt daher eine wäßrige Lösung von 4 M GTC und 1 % (w/v) Sarkosyl.
Um das erfindungsgemäße Verfahren durchzuführen, werden die isolierten, trägergebundenen Zellen zweckmäßigerweise vom Rest der Probe entfernt oder abgetrennt, um so die Zellen aufzukonzentrieren oder zu konzentrieren. Der Zellbindungsschritt dient daher auch dazu, die Zellen anzureichern oder diese in einem kleineren Volumen als dasjenige der ursprünglichen Probe zu konzentrieren. Die Lyse kann anschließend zweckmäßigerweise durch Zugabe eines geeigneten Lysepuffers durchgeführt werden, der die gewünschten Lyseagenzien enthält, oder indem die isolierten Zellen den gewünschten Lysebedingungen unterworfen werden. Für den Fall, daß nur ein die geeigneten Lysereagenzien enthaltender Lysepuffer zugegeben wird, können beispielsweise die isolierten Zellen einfach in Gegenwart des Lysepuffers während eines geeigneten Zeitraums inkubiert werden, so daß die Lyse stattfinden kann.
Unterschiedliche Inkubationsbedingungen können für unterschiedliche Lysesysteme geeignet sein und sind aus dem Stand der Technik bekannt. Beispielsweise kann die Inkuba tion bei einem Tensid und/oder einem chaotropen Stoff, das bzw. der den Lysepuffer enthält, bei Raumtemperatur oder bei höheren Temperaturen, beispielsweise bei 37 °C oder 65 °C stattfinden. Ebenso kann die Inkubationszeit von wenigen Minuten, beispielsweise 5 oder 10 Minuten, bis hin zu Stunden, beispielsweise von 1 bis zu 2 Stunden, variieren. Im Falle eines GTC/Sarkosyl-Lysepuffers und Bakterienzellen wurde gefunden, daß die Inkubation bei beispielsweise 65 °C während 10 bis 20 Minuten geeignet ist, aber dies kann selbstverständlich entsprechend den Bedürfnissen variiert werden. Im Falle von enzymatischer Lyse, beispielsweise unter Verwendung von Proteinase K usw., können auch längere Behandlungszeiten erforderlich sein, beispielsweise über Nacht.
Nach der Lyse wird die freigesetzte Nukleinsäure an den gleichen Träger gebunden, an den die lysierten Zellen gebunden sind. Diese Bindung von Nukleinsäuren kann auf jede Art und Weise, die aus dem Stand der Technik zur Bindung von Nukleinsäuren auf einem festen Träger bekannt ist, erreicht werden. Zweckmäßigerweise wird die Nukleinsäure unspezifisch an den Träger gebunden, d.h. unabhängig von ihrer Sequenz. Beispielsweise kann daher die freigesetzte Nukleinsäure auf den Träger unter Verwendung jedes beliebigen Fällungsmittels für Nukleinsäuren, beispielsweise Alkoholen, Alkohol/Salzkombinationen, Polyethylengykolen (PEG), usw. gefällt werden. Die derart erfolgte Fällung von Nukleinsäuren auf Kügelchen ist beispielsweise in der WO 91/12079 beschrieben. Salze können daher zu dem Träger und der freigesetzten Nukleinsäure in der Lösung zugegeben werden, gefolgt von der Zugabe von Alkohol, der die Ausfällung der Nukleinsäure verursacht. Alternativ dazu können das Salz und der Alkohol zusammen zugegeben werden oder das Salz kann weggelassen werden. Wie vorstehend in Bezug auf den Zellbindungsschritt beschrieben wurde, kann jeder ge eignete Alkohol oder jedes geeignete Salz verwendet werden, und geeignete Mengen oder Konzentrationen können schnell bestimmt werden.
Alternative unspezifische Nukleinsäurebindungstechniken umfassen die Verwendung von Tensiden, wie sie beispielsweise in der WO 96/18731 der Dynal AS (das sogenannte "DNS-Direkt"-Verfahren) beschrieben wurde, und die Verwendung von chaotropen Stoffen und einer Nukleinsäure-bindenden festen Phase, wie beispielsweise Siliziumdioxidteilchen, wie von der Firma Akzo N.V. in der EP-A-0.389.063 beschrieben wurde.
Eine ionische Bindung der Nukleinsäure auf dem Träger kann durch Verwendung eines festen Trägers mit einer geladenen Oberfläche, beispielsweise eines mit Polyaminen beschichteter Trägers, erreicht werden.
Der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Träger kann auch funktionelle Gruppen tragen, die zur spezifischen oder unspezifischen Bindung von Nukleinsäuren beitragen, beispielsweise DNS-bindende Proteine, wie beispielsweise Leucin-Zipper, Histone oder Einlagerungsfarbstoffe (beispielsweise Ethidiumbromid oder Hoechst 42945), mit denen der Träger beschichtet werden kann.
Ebenso kann der Träger mit Bindungspartnern versehen sein, um den selektiven Einfang von Nukleinsäuren zu unterstützen. Beispielsweise können komplementäre DNS- oder RNS-Sequenzen oder DNS-Bindungsproteine oder Virusproteine, die an virale Nukleinsäuren binden, verwendet werden. Die Verankerung derartiger Proteine auf dem festen Träger kann durch die Verwendung von aus dem Stand der Technik gut bekannten Techniken erreicht werden.
Ein praktisches erfindungsgemäßes Verfahren zur Fällung der Nukleinsäure besteht darin, ein Fällungsmittel, beispielsweise einen Alkohol, zu der Mischung, die den Träger und die lysierten Zellen enthält, hinzuzufügen. Ein entsprechendes Alkoholvolumen, beispielsweise 100 %-iges oder 96 %-iges Ethanol, kann daher einfach der Mischung zugegeben werden und während eines Zeitraums inkubiert werden, der ausreichend ist, um eine Bindung der freigesetzten Nukleinsäuren an dem Träger zu gestatten. Die Inkubationsbedingungen für diesen Schritt sind unkritisch und können einfach das Inkubieren während 5 bis 10 Minuten bei Raumtemperatur umfassen. Jedoch kann die Dauer des Zeitraums variiert werden und die Temperatur wahlweise erhöht werden.
Obgleich nicht notwendig, kann es praktisch sein, ein oder mehrere Waschschritte in das erfindungsgemäße Isolierungsverfahren einzuführen, beispielsweise nach dem Nukleinsäurebindungsschritt. Es kann jeder übliche Waschpuffer oder jedes andere Medium verwendet werden. Allgemein sind Puffer mit einer niedrigen oder mittleren Ionenstärke bevorzugt, beispielsweise 10 mM Tris-HCl bei einem pH von 8,0/10 mM NaCl. Andere Standardwaschmedien, beispielsweise Alkohole enthaltende Medien, können, sofern gewünscht, ebenso verwendet werden, beispielsweise Waschen mit 70 %-igem Ethanol. Die Verwendung von magnetischen Teilchen ermöglicht einfache Waschschritte, indem einfach die Teilchen aggregiert werden, das Nukleinsäurebindungsmedium entfernt wird, das Waschmedium zugegeben wird und die Teilchen, sooft dies erforderlich ist, wieder aggregiert werden.
Nach dem Nukleinsäureisolierungsverfahren und nach jedem eventuell erwünschten optionalen Waschschritt, kann der Träger, der die gebundenen Nukleinsäuren trägt, versetzt werden, beispielsweise kann er resuspendiert oder in jedes geeignete Medium, beispielsweise in Wasser oder in einen Puffer mit einer niedrigen Ionenstärke eingetaucht werden. In Abhängigkeit von dem Träger und der Art jedes sich anschließenden Verfahrensschrittes kann es wünschenswert oder nicht wünschenswert sein, die Nukleinsäuren von dem Träger abzulösen.
Im Falle eines teilchenförmigen festen Trägers, wie beispielsweise der magnetischen oder nicht-magnetischen Kügelchen, kann dieser in vielen Fällen, beispielsweise in einer PCR oder anderen Amplifizierungen, direkt verwendet werden, ohne die Nukleinsäure von dem Träger zu eluieren. Ebenso ist eine Elution für viele DNS-Detektions- oder Identifikationsverfahren nicht notwendig, da, obgleich die DNS in zufälliger Weise in Kontakt mit der Oberfläche des Kügelchen ist und an einer Anzahl von Stellen über Wasserstoffbrückenbindungen oder ionischen oder anderen Kräften gebunden ist, wird es im allgemeinen genug DNS-Längenabschnitte geben, die für eine Hybridisierung an Oligonukleotiden und für eine Amplifizierung zur Verfügung stehen.
Falls gewünscht, kann jedoch die Elution der Nukleinsäure schnell unter Verwendung von bekannten Mitteln, beispielsweise durch Erhitzen, z. B. auf 65 °C während 5 bis 10 Minuten, ausgeführt werden. Nachfolgend kann der Träger aus dem Medium entfernt werden, so daß die Nukleinsäure in Lösung verbleibt. Ein derartiges Erhitzen wird automatisch in einer PCR durch den DNS-Denaturierungsschritt, der dem Durchlaufen der Reaktionsabfolge vorgeschaltet ist, erhalten.
Falls es erwünscht ist, die RNS von der DNS zu entfernen, kann dies durch Zerstörung der RNS vor dem DNS-Trennschritt erreicht werden, beispielsweise durch Zugabe einer RNAse oder einer alkalischen Verbindung, wie beispielsweise NaOH.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, daß sie schnell und einfach auszuführen ist und mit einer geeigneten Kombination von Zellbindungs-, Lyse- und Nukleinsäurebindungsschritten ein Verfahren zur Verfügung stellt, das verläßlich und in einfacher Weise innerhalb kurzer Zeit isolierte Nukleinsäuren liefert, wobei die Zeitspanne in vielen Fällen weniger als eine Stunde oder sogar weniger als 45 Minuten beträgt. Die Einfachheit des Verfahrens ermöglicht einen hohen Probendurchsatz. Gleichzeitig führt der Zellbindungsschritt zu einer Anreicherung oder Konzentration der Zellen und damit zu einer Verbesserung des Nukleinsäureisolierungsverfahrens.
Die Erfindung ist in vorteilhafter Weise der Automatisierung zugänglich, insbesondere wenn Teilchen, und ganz besonders, wenn magnetische Teilchen als Träger verwendet werden.
Wie vorstehend erwähnt ist, muß die gebundene Nukleinsäure vorteilhafterweise nicht eluiert oder von dem Träger entfernt werden, bevor der Detektionsschritt durchgeführt wird, obgleich dies, sofern gewünscht, ebenfalls durchgeführt werden kann. Ob die Nukleinsäure eluiert wird oder nicht, kann auch von dem besonderen Verfahren abhängen, das für den Nukleinsäurebindungsschritt verwendet wurde. Daher binden bestimmte Nukleinsäurebindungsverfahren die Nukleinsäure fester als andere. Beispielsweise wird im Falle der DNS-Bindung unter Verwendung von Tensiden (beispielsweise durch DNS-Direkt) die Nukleinsäure von dem festen Träger eluiert, wenn ein Elutionspuffer oder ein anderes geeignetes Medium eingeführt wird. Nukleinsäure, die durch ein Fällungsmittel, wie einem Alkohol oder einem chaotropen Stoff, gebunden ist, bleibt fester gebunden und kann nicht eluiert werden, wenn sie in ein Puffermedium eingeführt wird, und sie kann daher erhitzt werden müssen, um eluiert werden zu können.
Die trägergebundene Nukleinsäure kann daher direkt in einem auf Nukleinsäure beruhenden Detektionsverfahren verwendet werden, einfach indem der Träger in einem Medium resuspendiert wird oder indem zum Träger ein Medium, das für den Detektionsschritt geeignet ist, zugegeben wird. Entweder kann die Nukleinsäure in das Medium eluiert werden, oder es ist, wie vorstehend erwähnt ist, nicht notwendig, diese zu eluieren.
Eine Anzahl von unterschiedlichen Techniken zur Detektion von Nukleinsäuren sind bekannt und in der Literatur beschrieben und jedes dieser Verfahren kann erfindungsgemäß verwendet werden. In einfachster Weise kann die Nukleinsäure durch Hybridisierung mit einer Sonde bzw. Probe detektiert werden und es wurden schon viele derartige Hybridisierungsprotokolle beschrieben (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). Am häufigsten umfaßt die Detektion einen in-situ-Hybridisierungsschritt und/oder einen in-vitro-Amplifizierungsschritt unter Verwendung eines beliebigen, in der Literatur für diesem Zweck beschriebenen Verfahrens. Wie erwähnt, können deshalb Techniken wie LAR, 3SR und das Q-beta-Replikase-System verwendet werden. Jedoch werden PCR und ihre verschiedenen Modifikationen, beispielsweise die Verwendung von verschachtelten Primern, im allgemeinen die Verfahren der Wahl sein (siehe beispielsweise Abramson und Myers, 1993, Current Opinion in Biotechnology, 4: 41–47 für eine Zusammenfassung der Nukleinsäure-Amplifizierungstechnologien).
Andere Detektionsverfahren können auf einem Sequenzierungslösungsweg beruhen, beispielsweise den Lösungsweg über Minisequenzierung, wie er von Syvänen und Söderlund, 1990, in Genomics, 8: 684–692 beschrieben ist.
Bei Amplifizierungstechniken, wie beispielsweise der PCR, kann das Erhitzen, das in dem ersten Schritt zum Schmelzen des DNS-Doppelstrangs erforderlich ist, dazu führen, daß sich die gebundene DNS von dem Träger ablöst. Im Falle eines nachfolgenden Detektionsschrittes, wie beispielsweise einer PCR, kann daher die trägergebundene Nukleinsäure direkt zu der Reaktionsmischung zugegeben werden und die Nukleinsäure wird in dem ersten Schritt des Detektionsprozesses eluiert. In dem Detektionsschritt kann die gesamte erfindungsgemäß erhaltene isolierte trägergebundene Nukleinsäureprobe oder ein Aliquot davon verwendet werden.
Die Ergebnisse der PCR oder anderer Detektionsschritte können durch viele im Stand der Technik beschriebene Mittel detektiert oder bildlich dargestellt werden. Beispielsweise können die PCR-Produkte oder andere Amplifizierungsprodukte in einem Elektrophoresegel, beispielsweise in einem mit Ethidiumbromid gefärbten Agarosegel unter Verwendung von bekannten Techniken, laufen gelassen werden. Alternativ dazu kann das DIANA-System verwendet werden, das eine Modifizierung der verschachtelten Primertechnik darstellt. Bei dem DIANA-System (Detection of Immobilised Amplified Nucleic Acids, Detektion immobilisierter amplifizierter Nukleinsäuren) (siehe Wahlberg et al., Mol. Cell Probes 4: 285 (1990)), trägt das innere zweite Primerpaar jeweils Mittel zur Immobilisierung, um einen Einfang amplifizierter DNS zu erlauben, und eine Markierung oder Mittel zur Verankerung auf einer Markierung, um einen Nachweis zu ermöglichen. Dies liefert die beiden Vorteile eines reduzierten Hintergrundsignals sowie eines schnellen und einfachen Mittels zur Detektion der amplifizierten DNS.
Durch Sequenzierung unter Verwendung einer beliebigen aus vielen unterschiedlichen Sequenzierungstechnologien, die gegenwärtig möglich sind, beispielsweise durch Standardsequenzierung, Festphasensequenzierung, zyklische Sequenzierung, automatische Sequenzierung und Minisequenzierung, kann die amplifizierte Nukleinsäure auch detektiert oder das Ergebnis bestätigt werden.
Es wurde vorteilhafterweise gefunden, daß erfindungsgemäß isolierte Zellen in einem "Zellbindungs"-Puffer, beispielsweise in einem Salz/Alkoholpuffer, für wenigstens eine Woche bei Raumtemperatur ohne einen detektierbaren Verlust an Empfindlichkeit im nachfolgenden Nukleinsäuredetektionsschritt aufbewahrt werden können. Eine derartige Stabilität ist ein Vorteil unter Außenbedingungen.
Die verschiedenen Reagenzien und Komponenten, die zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren erforderlich sind, können zweckmäßigerweise in Form eines Kits geliefert werden.
In seiner einfachsten Variante enthält ein Kit zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren:

a. einen teilchenförmigen festen Träger,
b. wahlweise Mittel zum Binden von Zellen an den festen Träger,
c. Mittel zum Lysieren der Zellen und
d. Mittel zum Binden von aus den lysierten Zellen freigesetzter Nukleinsäure an denselben festen Träger.

Die unterschiedlichen Mittel b, c und d können solche sein, die in Bezug auf das erfindungsgemäße Verfahren vorstehend beschrieben und erläutert wurden.
Ein weiterer optionaler Bestandteil ist Punkt e., d.h. Mittel zur Detektion der Anwesenheit oder Abwesenheit von Nukleinsäure, die für eine Zielzelle innerhalb dieser gebundenen Nukleinsäure charakteristisch ist. Wie vorstehend erläutert wurde, umfassen derartige Mittel geeignete Sonden- oder Primeroligonukleotidsequenzen zur Verwendung in hybridisierungs- und/oder amplifizierungsbasierten Detektionstechniken.
Wahlweise können in einem derartigen Kit darüber hinaus Puffer, Salze, Polymere, Enzyme, usw. enthalten sein.
Die Erfindung wird nun im einzelnen in den nachfolgenden nicht einschränkenden Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben, wobei
1 die Ergebnisse einer EtBr-gefärbten Agarosegelelektrophorese zur Trennung von PCR-Amplifizierungsprodukten der DNS zeigt, die gemäß der Erfindung aus Zellen von 5 Cyanobakterien-Spezies erhalten wurde. Linien 1 bis 7 entsprechen den in Beispiel 1 beschriebenen Proben 1 bis 7.
Beispiel 1
Materialien
Beispiel 1: Planktothrix rubescens NIVA-CYA 1, Beispiel 2: Planktothrix agardhii NIVA-CYA 29, Beispiel 3: Planktothrix rubescens NIVA-CYA 55, Beispiel 4: Planktothrix mougeotii NIVA-CYA 56/1, Beispiel 5: Planktothrix agardhii NIVA-CYA 116, Beispiel 6: negative Kontrolle auf Zell- und DNS-Aufreinigungsreagenzien und Beispiel 7: negative Kontrolle auf PCR-Reagenzien.
Zell- und DNS-Isolierungsprotokoll:
0,5 ml Wasser, das ungefähr 10⁵ Zellen enthält, wurden mit 20 μl Kügelchen (1 μg/ml) und 0,5 ml Zellbindungspuffer (Isopropanol, 0,75 M NH₄Ac) in einem Mikrozentrifugenröhrchen gemischt. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur während 20 Minuten inkubiert und anschließend wurde das Röhrchen während 2 Minuten in einen MPC-E Magnet (Dynal A.S.) gestellt. Der Überstand wurde sorgfältig entfernt. 50 μl 4 M GTC, 1 % Sarkosyl wurden hinzugefügt und bei 65 °C während 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 200 μl 96 %-igem EtOH hinzugefügt und die Inkubation für 5 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt. Die Kügelchen wurden mit dem Magneten an die Röhrchenwand gezogen und der Überstand entfernt. Der Komplex wurde zweimal mit 500 μl 70 %-igem EtOH gewaschen. Das gesamte Ethanol wurde entfernt und 50 μl Wasser wurde hinzugefügt. Um Restethanol zu entfernen, wurden die Röhrchen bei 65 °C während 10 Minuten mit offenem Deckel inkubiert.
PCR-Amplifizierung:
Der Bereich zwischen den Genen, die für die RuBisCo Untereinheit Groß (Rbcl) und Klein (Rbcs) codieren, wurde amplifiziert. Die Amplifizierungen wurden unter Verwendung eines GeneAmp 2400 PCR Systems (Perkin Elmer) in 50 μl Volumina durchgeführt, die 10 pmol Primer (CW) 5'CGTAGCTTCCGGTGGTATCCACGT3' und (DE) 5'GGGCARYTTCCACAKNGTCCA3', 200 μM dNTP, 10 mM Tris-HCl (pH 8,8), 1,5 mM MgCl₂, 50 mM KCl, 0,1 % Triton X-100, 1 U DynaZyme thermostabile DNS-Polymerase (Finnzymes OY) und 5 μl der Kügelchen/DNS-Lösung enthielten. Das verwendete PCR-Programm hatte einen anfänglichen Denaturierungsschritt bei 94 °C während 4 Minuten, anschließendes Durchlaufen der Reaktionsabfolge mit folgenden Parametern: 94 °C während 30 Sekunden, 40 °C während 30 Sekunden und 72 C während 2 Minuten für 2 Reaktionsabfolgen, anschließend 94 °C während 30 Sekunden, 60 C während 30 Sekunden und 72 °C während 2 Minuten bei 40 Reaktionsabfolgen. Schließlich wurde während 7 Minuten ein Verlängerungsschritt durchgeführt. Die amplifizierten Fragmente wurden durch DNS-Sequenzierung als zu der Gegend zwischen RuBisCo Groß (Rbcl) und Klein (Rbcs) gehörig verifiziert.
Gel:
10 μl der amplifizierten Produkte von jeder der Proben 1 bis 7 wurden auf einem mit 1,5 EtBr gefärbten Agarosegel während 30 Minuten bei 100 Volt laufen gelassen. Der Molekulargewichtsstandard war mit ΦX 174 HaeIII verdaute DNS. Die Ergebnisse sind in 1 dargestellt.
Ergebnisse:
1 zeigt deutlich, daß die Zellen aus sämtlichen Beispielen 1 bis 5 detektiert werden konnten. Beruhend auf den erhaltenen PCR-Ergebnissen, wie sie auf dem mit EtBr gefärbten Agarosegel sichtbar gemacht sind, wurde die Detektionsgrenze auf 10 bis 100 Zellen/ml geschätzt.

Claims

Verfahren zur Detektion der Anwesenheit oder Abwesenheit einer enkaryotischen oder prokaryotischen Zielzelle in einer Probe, wobei das Verfahren folgende Schritte umfaßt: (a) Bereitstellen eines partikulären bzw. teilchenförmigen festen Trägers und Mischen des Trägers mit der Probe und Zulassen des Bindens von Zellen in der Probe an den festen Träger, um Zellen aus der Probe zu isolieren, (b) Lysieren der isolierten Zellen, (c) Binden von aus den lysierten Zellen freigesetzter Nukleinsäure an denselben festen Träger, und (d) Detektieren der Anwesenheit oder Abwesenheit von für die Zielzellen kennzeichnender Nukleinsäure unter der gebundenen Nukleinsäure.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure DNS ist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, wobei in Schritt (a) die Zellen auf den Träger unter Verwendung eines Fällungsmittels präzipitiert bzw. gefällt werden.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Fällungsmittel Alkohol und Salz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Zellen in Schritt (a) aufgrund von auf oder in dem Träger zur Verfügung gestellten zellbindenden Komponenten an den Träger binden.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die zellbindenden Komponenten eine selektive Bindung von Zielzellen erlauben.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei der Träger magnetische Kügelchen aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die Zellen in Schritt (b) unter Verwendung eines Detergens bzw. Tensids und/oder eines chaotropen Stoffes lysiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Nukleinsäure in Schritt (c) unspezifisch an den Träger gebunden wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Nukleinsäure unter Verwendung eines Fällungsmittels auf dem Träger präzipitiert bzw. gefällt wird.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Fällungsmittel Alkohol und wahlweise Salz und/oder ein Detergens bzw. Tensid aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Nukleinsäure in Schritt (c) aufgrund von Bindungspartnern an den Träger bindet, die auf dem Träger zur Verfügung ge stellt werden, um zum selektiven Einfang von Nukleinsäuren beizutragen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die an den Träger gebundenen Zellen vom Rückstand der Probe getrennt werden, wodurch die Zellen konzentriert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Probe in Schritt (a) mit dem partikulären bzw. teilchenförmigen Träger gemischt wird und während eines geeigneten Zeitintervalls stehengelassen wird, um das Binden der Zellen an den Träger zu gestatten, wonach der Träger aus dem Rückstand der Probe entfernt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Detektionsschritt (d) eine in-situ-Hybridisierung und/oder in-vitro-Amplifizierung und/oder Nukleinsäure-Sequenzierung umfaßt.