DE69815144T2

DE69815144T2 - Verfahren zur in vivo dns-verabreichung durch verwendung eines nadelfreien geräts

Info

Publication number: DE69815144T2
Application number: DE69815144T
Authority: DE
Inventors: Lorne Erdile; Jean Haensler
Original assignee: Aventis Pasteur SA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-11-20
Publication date: 2004-04-01
Anticipated expiration: 2018-11-21
Also published as: CA2310029A1; AU753976B2; PT1032429E; ES2198780T3; DK1032429T3; EP1032429B1; ATE241387T1; DE69815144D1; EP1032429A1; AU1757999A; WO1999026662A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur in vivo-Abgabe eines DNA-Moleküls. Ein derartiges Verfahren hat verschiedene Anwendungen, z. B. Impfung, Krebsimmuntherapie und Gentherapie.
Es ist nun gut nachgewiesen, dass nicht-infektiöse DNA-Moleküle wie z. B. Plasmide in vivo an Vertebraten, z. B. Säugetiergewebe und/oder Organe, abgegeben werden können und als Folge davon werden die Proteine, die durch die Sequenzen codiert werden, welche funktionell an einen geeigneten Promotor gebunden sind und in diesen DNA-Molekülen vorliegen, entweder lokal oder in anderer Art im Körper des Säugetiers exprimiert. Eine Abgabe kann unter Verwendung einer Vielzahl von Verabreichungsrouten erreicht werden; die Wahl hängt von dem Ziel, das verfolgt wird, ab; in der Tat hat eine in vivo-DNA-Abgabe breite Anwendungen auf mehreren Gebieten.
Darüber hinaus ist auch bekannt, dass ein Vertebrat, z. B. ein Säugetier, eine Immunantwort auf ein antigenes Protein, das nach DNA-Abgabe exprimiert wird, entwickeln kann und dass die Immunantwort protektiv sein kann. Um eine Immunantwort auf ein besonderes Antigen zu induzieren, wird ein DNA-Molekül, das für dieses Antigen codiert, typischerweise in die Haut oder Muskeln verabreicht, wie es im US-Patent Nr. 5,580,859 beschrieben ist. Die Wahl der Verabreichungsroute hängt von einer Reihe von Kriterien ab, die z. B. den Typ der Immunantwort, der gesucht wird, einschließen. In der Tat muss die Immunantwort auf intramuskulärem, intraepidermalem und intradermalem Weg nicht notwendigerweise identisch sein. Außerdem können einige Immunogene nur auf einem Weg eine protektive Immunantwort induzieren. Eine DNA-Abgabe in die Haut oder in die Muskeln kann auch in der Gentherapie eingesetzt werden, so dass ein therapeutisches Protein in diesen Geweben exprimiert werden kann.
Eine Verabreichung kann unter Verwendung einer Spritze oder einer nadelfreien Vorrichtung erreicht werden. Nadelfreie Vorrichtungen sind auf dem Fachgebiet bekannt. Einige von ihnen sind so konzipiert, dass sie die subkutane Gewebeschicht der Haut mit einer flüssigen Vakzindosis treffen, z. B. das Imojet^TM/Imule^TM-Injektorsystem (Pasteur Merieux Connaught), dessen Verwendung z. B. in Parent du Châtelet et al. Vaccine (1997) 15: 449 beschrieben wird. Weitere, die zum Abzielen auf die humane Haut geeignet sind, sind z. B. Mesoflash^TM-Injektor, der in FR 2 641 190 beschrieben wird und von PROLITEC, rue Gustave Gresse 26400 Aouste sur Sye, Frankreich (e-mail: PROLITEC@Compuserve.com) zur Verwendung in der Mesotherapie beschrieben wird. 1998 wurde die Handelsbezeichnung "Mesoflash" in "Isajet^TM" geändert.
Strahl-Injektoren, z. B. Ped-O-Jet^TM (Furth et al., Anal. Biochem. (1992) 205: 365), ein Dermojet mit geringer Kraft (Furth et al. Hybridoma (1995) 14: 149) und Med-E-Jet^TM (Vahlsing et al., J. Immunol. Meth. (1994) 174: 11) wurden in verschiedenen Gentransferassays, einschließlich eines DNA-Immunisierungsexperiments (Vahlsing et al.), erfolgreich eingesetzt. Allerdings hatte keine dieser Untersuchungen das Ziel, solche Vorrichtungen zur Verabreichung von DNA hauptsächlich an die Haut zu verwenden. Vahlsing et al. berichten über intramuskuläre Verabreichung, wohingegen Furth et al. kombinierte Haut- und Muskelinjektionen beschreiben.
Bis jetzt wurden nicht-infektiöse DNA-Vakzine entweder unter Verwendung (i) einer Injektionsvorrichtung (sogenannte "Genkanone"), die so angepasst ist, dass sie ein Pulver, das DNA, die auf Gold- oder Wolfram-Mikropartikel aufgetragen ist, enthält, direkt in die Zellen der Dermis oder Epidermis hinein treibt (eine solche Vorrichtung ist in den US-Patenten Nr. 4,945,050 und 5,015,580 und in WO 94/24263 beschrieben) oder unter Verwendung (ii) einer Spritze, die mit einer DNA-Lösung gefüllt ist, an die Haut abgegeben. Der Hauptgrund für die Genkanone, die Zellen mit Goldmikropartikeln, die mit DNA überzogen sind, bombardiert, ist der, dass sie die Membranbarrieren überwindet und eine direkte intrazelluläre Abgabe der DNA in die Hautzelle einschließlich der Langerhanschen Zellen, die wirksame APCs sind, abgibt (Condon et al., Nature Med. (1996) 2: 1122). Bisher wurde geglaubt, dass die Genkanone überlegene Abgabeeigenschaften hat und eine geeignete intradermale Immunisierung erzielt. Die Erzielung ähnlicherer Resultate mit einer weniger verfeinerten Injektion von DNA in Lösung ist sehr überraschend, da Plasmamembranen dichte Barrieren für extrazellulär abgegebene DNA-Moleküle bilden.
Tatsächlich wurde nun festgestellt, dass eine nichtinfektiöse DNA-Lösung auch unter Verwendung eines nadelfreien Geräts wirksam an die Haut abgegeben werden kann. Dieses Verfahren löst die Nachteile, die mit der Verwendung einer Spritze verbunden sind und ist insbesondere z. B. für groß angelegte DNA-Impf-Kampagnen geeignet.
Daher sorgt die vorliegende Erfindung gemäß Anspruch 1 für die Verwendung einer Lösung, die ein nicht-infektiöses DNA-Molekül umfasst, das in einem Vertebraten, z. B. einem Säugetier, ein physiologisch aktives Protein exprimieren kann, zur Herstellung eines Medikaments, das dazu bestimmt ist, ausschließlich an die Haut des Vertebraten abgegeben zu werden, wobei ein nadelfreies Gerät, das für diese Wirkung angepasst ist, verwendet wird.
Mit "nicht-infektiöses DNA-Molekül" ist ein DNA-Molekül gemeint, das fähig ist, in Vertebraten, z. B. Säugetieren, zu replizieren, und/oder unfähig ist, in den Vertebraten, z. B. Säugetiergenom, zu integrieren. Vorzugsweise ist das DNA-Molekül ein Plasmid. Typischerweise umfasst das DNA-Molekül eine Sequenz, die für das gewünschte Protein (Polypeptid ist anderes Wort für Protein) codiert und funktionell an einen Promotor (unter die Kontrolle eines Promotors gestellt), der zur Expression in einem Vertebraten, z. B. in einer Säugerzelle, geeignet ist, gebunden ist. Der Promotor kann überall wirken oder kann für die intradermalen Zellen spezifisch sein. Beispiele für nicht-gewebespezifische Promotoren umfassen den frühen Cytomegalovirus-(CMV)-Promotor (beschrieben in US-Patent Nr. 4,168,062) und den Rous Sarcoma Virus-Promotor, beschrieben von Norton & Coffin in Mol. Cell Biol. (1985) 5: 281). Noch allgemeiner sind verwendbare Vektoren i. a. in WO 94/21797 und Hartikka et al., Human Gene Therapy (1996) 7: 1205 beschrieben. Promotoren, die für die Zellen der Haut spezifisch sind, umfassen den Keratinpromotor (Lersch et al. Mol. Cell Biol. (1989) 9: 3685 und Leask et al., Genes Dev. 4: 1985) und den CD 11c-Promotor (Lopez-Cabrera et al., J. Biol. Chem. (1993) 268: 1187), wobei dieser letztgenannte für dendritische Zellen, z. B. Langerhans'sche Zellen der Haut, spezifisch ist.
Bei der Herstellung von DNA-Molekülen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung können Standardtechniken der Molekularbiologie zur Herstellung und Reinigung von DNA verwendet werden.
Erstens, ein Polynucleotid kann in reiner Form, frei von irgendwelchen Abgabevehikeln, z. B. anionische Liposome, kationische Lipide, Mikropartikel, beispielsweise Goldmikropartikel, Präzipitationsmittel, beispielsweise Calciumphosphat, oder eines anderen, die Transfektionerleichternden Mittels, verwendet werden. In diesem Fall kann das Polynucleotid einfach in einer physiologisch annehmbaren Lösung, z. B. sterile Kochsalzlösung oder sterile gepufferte Kochsalzlösung, die vorzugsweise isotonisch, schwach hypertonisch ist oder hypertonisch ist und eine relativ geringe Ionenstärke hat, wie sie z. B. durch eine Saccharoselösung, wie z. B. eine Lösung, die 20% Saccharose enthält, bereitgestellt wird, verdünnt sein.
Alternativ kann ein Polynucleotid mit Agenzien, die eine zelluläre Aufnahme unterstützen, assoziiert sein. Es kann i. a. in Liposome eingekapselt oder mit kationischen Lipiden kombiniert sein. Anionische und neutrale Liposome sind dem Fachmann gut bekannt (siehe z. B.: A Practical Approach, RPC Neue Ausgabe, IRL-Press (1990) bezüglich einer detaillierten Beschreibung von Verfahren zur Herstellung von Liposomen) und sind zur Abgabe eines großen Bereichs von Produkten, einschließlich Polynucleotiden, einsetzbar. Kationische Lipide sind auf dem Fachgebiet ebenfalls bekannt und werden üblicherweise zur Genabgabe verwendet. Solche Lipide umfassen DOTMR (N-[1-(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid), DOTAP (1,2-Bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonio)propan), DDAB (Dimethyldioctadecylammoniumbromid), DOGS (Dioctadecylamidologlycylspermin) und Cholesterinderivate, z. B. DC-Chol (3-beta-(N-(N',N'-Dimethylaminomethan)-carbamoyl)cholesterin). Eine Beschreibung dieser kationischen Lipide kann in EP 187 702 , WO 90/11092, im US-Patent Nr. 5,283,185, WO 91/15501, WO 95/26356 und im US-Patent Nr. 5,527,928 gefunden werden. Kationische Lipide zur Genabgabe werden vorzugsweise in Kombination mit einem neutralen Lipid, wie z. B. DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin) verwendet, wie es z. B. in WO 90/11092 beschrieben ist. Das handelsübliche transfizierende Reagenz Lipofectin^TM ist ein DOTMA/DOPE-Gemisch.
Andere eine Transfektion erleichternde Verbindungen können einer Formulierung, die kationische Liposome enthält, zugesetzt werden. Eine Reihe von ihnen sind z. B. in WO 93/18759, WO 93/19768, WO 94/25608 und WO 95/2397 beschrieben worden. Sie umfassen i. a. Sperminderivate, die zur Erleichterung des Transportes von DNA durch die Kernmembran verwendbar sind (siehe z. B. WO 93/18759, und Membran-permeabilisierende Verbindungen wie z. B. GALA, Gramicidin S. und kationische Gallensalze (siehe z. B. WO 93/19768). Außerdem bilden kationische Polymere und Polykatione eine große und wichtige Klasse von transfizierenden Agenzien, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können.
Das physiologisch aktive Protein, nach dessen in vivo-Expression gesucht wird, kann ein Säugetierprotein sein, das fähig ist, einen genetischen Defekt zu behandeln, z. B. Faktor XIII oder IX, oder ein Cytokin. Das Protein kann auch ein Antigen sein, das (a) für einen Mikroorganismus spezifisch ist, der eine Infektion in einem Säugetier induzieren kann, oder (b) mit einem Tumor in Verbindung steht, zur Behandlung einer Infektion oder Tumorerkrankung oder zur Vorbeugung dagegen. Der Mikroorganismus kann z. B. ein Virus, ein Bakterium, ein Pilz oder ein Parasit sein.
Ein Beispiel für ein Tumor-assoziiertes Antigen ist das Produkt des p53-Tumorsuppressorgens. Es ist ein attraktives Antigen für eine Krebsimmuntherapie, da es in sehr niedrigen Levels in normalen Zellen exprimiert wird, in etwa 50% aller humanen Krebsarten infolge von Missens-Mutationen, die die Halbwertszeit des Proteins deutlich erhöhen, überexprimiert wird. Es wurde nun gefunden, dass eine Immunisierung von Mäusen mit einem Plasmid, das für humanen p53-Wildtyp (bzw. Wildtyp-p53) codiert, einen vollständigen Schutz gegen einen Angriff mit einem Mausfibroblasten, der mit humaner p53-Mutante transfiziert war, induziert und einen partiellen, aber deutlichen, Schutz gegen ein transfiziertes Mastocytom induziert. Allgemeiner ausgedrückt, die Erfindung fasst die Verwendung eines DNA-Moleküls, das p53 codiert, Wildtyp oder Mutante, Volllänge oder Fragmente, und vorzugsweise humanen Ursprungs, ins Auge.
Die Menge an DNA, die einem Empfänger pro Dosis verabreicht werden soll, hängt z. B. von der Stärke des im DNA-Konstrukt verwendeten Promotors, der biologischen Aktivität des exprimierten Genprodukts, dem Zustand des Säugers, der für die Verabreichung vorgesehen ist (z. B. Gewicht, Alter und allgemeiner Gesundheitszustand des Säugetiers), dem Verabreichungsmodus und dem Formulierungstyp ab. Im allgemeinen kann eine therapeutisch oder prophylaktisch wirksame Dosis von etwa 10 μg bis etwa 1 mg, vorzugsweise von etwa 100 μg bis etwa 1 mg und bevorzugt von etwa 250 μg bis etwa 800 μg, humanen Erwachsenen verabreicht werden. Die Verabreichung kann in einer Einzeldosis erfolgen oder in Intervallen wiederholt werden. Die DNA muss irgendeiner der Hautschichten, vorzugsweise der Epidermis und Dermis, verabreicht werden. Eine Verabreichung wird streng durch die intraepidermale oder intradermale Routen, Bahnen verabreicht und es wird sogar überhaupt keine DNA außerhalb der Haut abgegeben (z. B. in die Fett-, Muskel- oder subkutane Schicht).
Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung kann eine nadelfreie Injektorvorrichtung i. a. irgendeine der bereits verfügbaren sein, vorausgesetzt, dass diese so eingestellt sind, dass sie eine Lösung im wesentlichen in die Haut verabreichen. Vorzugsweise verkratzt sie die Haut nicht und die Lösung wird dank einer Quelle für mechanische Energie, z. B. ein Gas oder eine Spritze, in die Haut eingetrieben. Beispielsweise kann das Mesoflash^TM M40 (nun als ISA40^TM)- Gerät für eine intradermale Verabreichung an Primaten, d. h. Affen und Menschen, verwendet werden, während das M10 (jetzt als ISA10^TM)-Modell bei Mäusen oder kleinen Vertebratentieren eingesetzt werden soll. Bei nadelfreien Injektoren wirkt die Druckstärke üblicherweise als Mittel zum Eintreiben der Lösung. Um auf die Haut abzuzielen, kann die Druckstärke auf verschiedene Weise eingestellt werden, was von den besonderen Merkmalen der Vorrichtung, die verwendet wird, abhängt.
Es wurde auch festgestellt, dass eine Änderung der Route und des Modus der Verabreichung von DNA-Vakzinen die Natur der induzierten Immunantwort beeinträchtigen kann. Tatsächlich wurde festgestellt, dass Antikörper, i. a. Antihämaglutinin-Antikörper, die durch DNA induziert wurden, welche auf intramuskulärem Weg (IM) injiziert wurde, vornehmlich zum IgG2a-Isotyp gehörten, wobei relativ geringe Level an IgG1-Antikörpern vorlagen, was nahelegt, dass eine Th1-Helfer-T-Zell-Antwort erzeugt wurde (Deck et al., Vaccine (1997) 15: 71). Diese Resultate werden nun bestätigt und es wird weiter angegeben, dass eine intradermale (ID)-Strahlimmunisierung höherer IgG1-Titer induziert und somit im Vergleich zu einer IM-Immunisierung eine ausgewogenere Immunisierung induziert. Wenn die Verabreichung des HA-DNA-Vakzins an die Haut unter Verwendung einer Genkanone durchgeführt wird, gehören die induzierten Antikörper hauptsächlich zum IgG1-Subtyp und der Isotyp gleicht in großem Maße zu Gunsten einer vorherrschenden Th2-Helfer-T-Zellantwort aus (Feltquate et al., J. Immunol. (1997) 158: 2278). Dementsprechend ist die vorliegende Erfindung insbesondere geeignet, wenn eine ausgewogene Immunantwort des Th1/Th2-Helfertyps gesucht wird.
Die Th1-Antwort bezüglich der Th2-Antwort kann bestimmt werden, indem z. B. der IgG2a- und der IgG1-Level, welche in Mäusen induziert werden, verglichen werden, wobei diese Level ein Hinweis für die Beteiligung der Th1- und Th2-Antworten sind. Tatsächlich wird davon ausgegangen, dass die Th1-Antwort im allgemeinen von einer Th2-Antwort begleitet wird. Allerdings wird angenommen, dass die Th2-Antwort bezüglich der Th1-Antwort nicht deutlich vorherrschend sein sollte. Die IgG2a- und IgG1-Level, die in Mäusen induziert werden, können herkömmlicherweise unter Verwendung eines ELISA-Tests beurteilt werden, vorausgesetzt, dass diese Tests für jeden der zwei Subtypen die gleiche Empfindlichkeit haben und insbesondere dass die Anti-IgG2a- und Anti-IgG1-Antikörper dieselbe Affinität haben.
Die Mengen an IgG2a und IgG1 können insbesondere unter Verwendung eines ELISA-Tests gemessen werden, der identisch mit dem unten beschriebenen oder diesem ähnlich ist. Die Vertiefungen einer Polycarbonat-ELISA-Platte werden mit 100 μl eines geeigneten Antigens mit etwa 10 μg/ml Carbonatpuffer beschichtet. Die ELISA-Platte wird für 2 h bei 37°C und dann über Nacht bei 4°C inkubiert. Die Platte wird mit PBS-Puffer (Phosphatpuffer-Kochsalzlösung), der 0,05% Tween 20 enthält (PBS/Tween-Puffer) gewaschen. Die Vertiefungen werden mit 250 μl PBS, der 1% Rinderserumalbumin enthält, gesättigt, um eine nicht-spezifische Bindung der Antikörper zu verhindern. Nach Inkubieren für 1 h bei 37°C wird die Platte mit PBS/Tween-Puffer gewaschen. Das Antiserum, das einige Tage, nachdem die letzte Maus die Zusammensetzung erhalten hatte, welche zur Induktion einer Immunantwort des Th1-Typs bestimmt war, aus Mäusen gesammelt worden war, wird in PBS/Tween-Pufferreihen Reihen-verdünnt. 100 μl der Verdünnungen werden zu den Vertiefungen gegeben. Die Platte wird für 90 min bei 37°C inkubiert, gewaschen und nach Standardverfahren beurteilt. Zum Beispiel wird ein Ziege-Antikörper gegen Maus-IgG2a oder IgG1, gekuppelt an ein Enzym wie Peroxidase, verwendet. Die Inkubation in Gegenwart dieses Antikörpers wird für 90 min bei 37°C fortgesetzt. Die Platte wird gewaschen und dann wird die Reaktion mit dem geeigneten Substrat (z. B. O-Phenyldiamindihydrochlorid, wenn das verwendete Enzym Peroxidase ist) entwickelt. Die Reaktion wird durch Colorimetrie (durch Messen der Extinktion durch Spektralfotometrie) beurteilt. Der IgG2A- oder IgG1-Titer des Antiserums entspricht dem Kehrwert der Verdünnung, die bei 490 nm eine Extinktion von 1,5 liefert.
Die Einführung einer verwendbaren Th1-Antwort zum Zwecke der vorliegenden Erfindung wird durch das Verhältnis der ELISA-IgG2a : IgG1-Titer in Mäusen, das etwa 1 sein sollte, gekennzeichnet. Wenn dieses Verhältnis etwa 1 ist, wird gesagt, dass Th1/Th2-Antwort gemischt oder ausgewogen ist. Wenn das Verhältnis größer oder gleich 5 ist, wird die Th1-Antwort als überwiegend bezeichnet.
Die Produktion einer Th1 (oder Th2)-Antwort in Mäusen ist für eine Th1 (oder Th2)-Antwort in Menschen vorhersagend. Obgleich es einfacher ist, den Antworttyp in Mäusen zu beurteilen, kann dies auch beim Menschen erfolgen, indem die Level an Cytokinen, die für die Th1-Antwort spezifisch sind, einerseits und andererseits für die Th2-Antwort spezifisch sind, welche nacheinander induziert werden, gemessen werden. Die Th1- und Th2-Antworten können beim Menschen direkt relativ zueinander auf der Basis der Level der Cytokine, die für diese zwei Antworttypen spezifisch sind, basierend auf dem IFN-γ/IL-4-Verhältnis, beurteilt werden.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand der folgenden Figuren erläutert:
1A und 1B zeigen die Anti-p53-CTL-Antwort, die durch intradermale Verabreichung von DNA induziert wird. Mäuse wurden intradermal in der Woche 0, 3 und 6 mit pC53-SN₃ oder dem Kontrollplasmid pUCneo (A) oder intramuskulär in der Woche 0, 3 und 6 mit pMP1406hup53 oder dem Vektor, dem das Gen p53 fehlt, pVec, immunisiert. Die Anti-p53-CTL-Antwort wurde 2 Wochen nach der letzten Immunisierung in Splenocyten, die zweimal in vitro mit naiven Splenocyten, infiziert mit vCP207 (A), stimuliert waren oder die einmal in vitro mit naiven Splenocyten, infiziert mit vP1101 (B), stimuliert waren, gemessen. Die Lyse wurden gegen P815 und 2E4 gemessen. Die Werte in (A) sind der Mittelwert von zwei Gruppen aus zwei Mäusen mit Standardabweichungen, dargestellt durch die Fehlerbalken, wohingegen die in (B) aus einem Einzelpool mit zwei Mäusen stammen.
In 1A: -•- entspricht pC53-SN₃ 1 μg/2E4;
entspricht pC53-SN₃ 10 μg/2E4;
entspricht pC53-SN₃ 100 μg/2E4; -o- entspricht pUC 100 μg/2E4 und -⎕- entspricht pC53-SN₃ 100 μg/P815.
In 1B:
entspricht pMPhup53/2E4; –⎕– entspricht pMPhup53/P815; -•- entspricht pVec/2E4; und -o- entspricht pVec/P815.
2A bis 2D zeigen den Schutz gegen einen Angriff nach Immunisierung mit pCP207 oder pC53-SN₃. Mäuse (neun pro Gruppe) wurden in der Woche 0, 3 und 6 mit 10⁷ TCID50 von vCP207 oder ALVAC intravenös (A, B und D) oder mit 100 μg pC53-SN₃ oder pUCneo intradermal (C und D) oder mit PBS immunisiert. Die Mäuse wurden subkutan 2 Wochen nach der letzten Injektion mit 10⁷ Zellen Clon 2–21 (A und C), 10⁷ Zellen nicht-transfizierter BALB/3T12-3 (B) oder 10⁴ Zellen Clon 4D5 (D) angegriffen. BALB/c-Mäuse wurden in (A, B und C) verwendet und DBA/2-Mäuse wurden in (D) verwendet.
In 2A: -o- entspricht Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS), -⎕- entspricht ALVAC; und
entspricht vCP207.
In 2B: -o- entspricht PBS; -⎕- entspricht ALVAC; und
entspricht vCP207.
In 2C: -o- entspricht PBS; -∆- entspricht PBS; entspricht pUCneo; und
entspricht pC53-SN₃.
In 2D: -o- entspricht PBS; -⎕- entspricht ALVAC;
entspricht vCP207; -∆- entspricht pUCneo; und
entspricht
pC53-SN₃.
3 zeigt den Vergleich von Antikörperantworten in BALB/c-Mäusen nach IM- oder ID-Strahl-Immunisierung (Mesoflash^TMM10) mit pV1JHA. Weibliche BALB/c-Mäuse (6 pro Gruppe) wurden dreimal (in der Woche 0, 3 und 6) mit 10 μg pV1JHA-Plasmid, das für das Hämaglutin aus A/PR8/34-Influenza-Virus codiert, immunisiert. Immunisierungen wurden entweder durch Injizieren des Plasmids in 50 μl 20 mM Hepes-Puffer pH 7,2 durch die IM-Route in den linken Quadrizeps oder durch Injizieren des Plasmids in 100 μl desselben Puffers über die ID-Route unter Verwendung des Mesoflash^TMM10-Injektors (siehe Beispiel 2A) durchgeführt. Anti-Influenza-Immunglobuline wurden in der Woche 0 (präimmun), 3, 6, 10, 12, 16 und 20 in den Seren der immunisierten Mäuse durch ELISA-Titration, beginnend mit einer 1 : 25-Verdünnung der Seren, gemessen. Antikörpertiter werden über die Zeit als geometrischer mittlerer Endpunkt der Ig-Titer auf einer log2-Skala dargestellt.
4A und 4B zeigen den Vergleich von Antikörpersubtypen in BALB/c-Mäusen nach IM- oder ID-Immunisierung mit pV1JHA. Serumproben wurden durch ELISA gegen A/PR/8/34-Virus auf spezifische IgG1- und IgG2a-Isotypen titriert (siehe Beispiel 2A). Antikörpertiter werden über die Zeit als geometrische mittlere Endpunkt-IgG1 (4A)- und IgG2a (4B)-Titer an einer log2-Skala dargestellt.
5 zeigt die HI-Antikörper, die durch das pV1JHA-Plasmid-DNR-Vakzin in BALB/c-Mäusen erzeugt werden. Serumproben, die in den Wochen 0 (präimmun), 3, 6, 12 und 20 gesammelt worden waren, wurden auf HI-Antikörpertiter untersucht, wie es in Beispiel 2A beschrieben ist, wobei von einer 1 : 10-Verdünnung der Seren ausgegangen wurde. Endpunkt-HI-Titer für jedes einzelne Tier sind im Verlauf der Zeit dargestellt. Durch IM immunisierte Mäuse werden durch die offenen Symbole dargestellt, durch ID immunisierte Mäuse werden durch die ausgefüllten Symbole dargestellt.
Die 6A und 6B zeigen die cytotoxische T-Lymphocytenantwort, die durch das pV1JHA-Plasmid-DNA-Vakzin in BALB/c-Mäusen erzeugt wird. Am Ende der Untersuchung (Woche 20) wurden die Mäuse getötet und die Milz wurde entnommen, um in einem 4-stündigen Standard-⁵¹Cr-Freisetzungsassay auf das Vorliegen von HA-spezifischen CTLs zu untersuchen (siehe Beispiel 2A). P815-Zielzellen wurden entweder mit dem Influenza A/PR/8/34-HA-Peptid-CTL-Epitop (∆, "HA-Ziel" für die Messung der spezifischen Lyse) oder dem NP-Peptid-CTL-Epitop (O, "NP-Ziel" für die Messung der nicht-spezifischen Lyse) gepulst. Nicht-gepulste P815-Ziele (?, "leere Ziele") wurden als zusätzliche Negativkontrollen in diesem Assay verwendet, um die Abwesenheit einer nicht-spezifischen Lyse zu bestätigen. Der prozentuale Anteil der Zielzellenlyse ist als Funktion des Verhältnisses Effektorzellen zu Zielzellen (E : T-Verhältnis) für eine typische Maus in der IM-Gruppe (6A) und für eine typische Maus in der ID-Gruppe ( 6B) dargestellt.
7 zeigt den Vergleich von Antikörperantworten in Cynomolgus-Makakenaffen nach IM- oder ID-Strahl-Immunisierung (Mesoflash^TMM40) mit pV1JHA. Cynomolgus-Makakenaffen (2 männliche und 2 weibliche pro Gruppe) wurden dreimal (in der Woche 0, 6 und 19) durch die IM-Route in den Quadrizeps-Muskel mit 50 μg pV1JHA-Plasmid in 500 μl 9‰ NaCl oder durch die ID-Route in die rasierte Oberschenkelhaut entweder mit 10, 50 oder 250 μg pV1JHA-Plasmid in 100 μl 9‰ NaCl unter Verwendung des Mesoflash^TMM40-Injektors immunisiert (siehe Beispiel 3A). Spezifische Anti-HA-Antikörpertiter (spezifische Gesamtimmunglobuline) wurden im Verlauf der Zeit (0-präimmun, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 und 24 Wochen) durch ELISR-Titration verfolgt, wie es in Beispiel 2A beschrieben ist, wobei mit einer 1 : 25-Verdünnung der Seren begonnen wurde. Für jeden Immunisierungsplan (∆, 50 μg IM; O 10 μg ID;
50 μg ID; ⎕, 250 μg ID) ist die Anti-HA-Immunglobulinantwort im Verlauf der Zeit als geometrischer mittlerer Endpunkttiter – auf einer log2-Skala dargestellt.
8 zeigt die HI-Antikörper, die durch das pV1HHA-Plasmid-DNA-Vakzin in Cynomolgus-Makakenaffen erzeugt wurden (siehe Beispiel 3). Serumproben aus früheren Untersuchungen, die in den Wochen 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 und 24 gesammelt wurden, wurden auf HI-Antikörper untersucht, wie es in Beispiel 2A beschrieben ist, wobei von einer 1 : 10-Verdünnung der Seren ausgegangen wurde. Endpunkt-HI-Titer für jeden einzelnen Affen sind im Lauf der Zeit dargestellt. IM-immunisierte Affen sind durch O, ∆, ⎕, ∇ dargestellt; andere Symbole sind ID-immunisierte Affen. Weibliche Affen werden durch ⎕,
, ∇,
♦, ✴ dargestellt; andere Symbole sind männliche Tiere.
BEISPIEL 1: p53-Impfung
1A – Materialien und Verfahren
Plasmid und Virus-Konstrukte
Die ALVAC-Rekombinante, die humanes Wildtyp-p53 exprimiert (vCP207), wurde von Roth et al., PNAS (1996) 93: 4781 beschrieben. vP1101, eine NYVAC (abgeschwächtes Vakzinvirus)-Rekombinate, die humanes Wildtyp-p53 exprimiert, wurde von Tartaglia et al., Virology (1992) 188: 217 beschrieben. vCP297 und die RLVAC-Rekombinante, die Photinus pyralis-Luciferase exprimieren, wurden als Kontrolle verwendet. Zwei Plasmide, die humanes Wildtyp p53 (pC53-SN₃) und humanes p53 mit einer R- zu H-Mutation an Aminosäure 273 (pC53-4.2N₃) exprimieren, wurden so aufgebaut, dass die für p53 codierenden Sequenzen unter die Kontrolle des unmittelbaren früheren Promotor/Enhancers des humanen CMV gestellt wurden. Beide Plasmide enthielten auch den neo^®-Marker, der eine Selektion mit G418 erlaubt. Das Plasmid pMP1406hp53, das auch p53 unter der Kontrolle des unmittelbaren früheren Promotor/Enhancers des humanen CMV exprimiert, hat kein neo^®-Gen.
Transformierte Zelllinien
P815 ist eine murine Mastocytomlinie mit DBA/2-Ursprung. P815-HFR ist ein anderes Isolat dieser Linie. BALB/3T12-3, eine tumorigene Fibroblastenlinie, die aus BALB/c-Mausembryonen stammt, wurde von der ATCC (Nr. CCL 164) erhalten.
Zellen wurden mit pC53-4.2N₃ unter Verwendung von Lipofectamin (GIBCO BRL) für P815 und CaPO₄ für BALB/3T12-3 transfiziert. Transfektanten wurden selektiert und in Gegenwart von 400 μg/ml G418 ausgebreitet; Clone, die p53 in stabiler Weise exprimierten, wurden ausgewählt. Clon 2E4 wurde nach Transfektion aus P815 abgeleitet, Clon 4D5 wurde aus P815HFR abgeleitet und Clon 2–21 wurde aus BALB/3T12-3 abgeleitet.
Immunisierung von Mäusen
Acht Wochen alte BALB/c-ByJ-Mäuse (IFFA-CREDO oder Jackson Laboratories) oder weibliche DBA/2-Mäuse (IFFA-CREDO) wurden unter Verwendung einer Spritze zur intravenösen (100 μl in die Schwanzvene) und subkutane oder intramuskuläre Verabreichung (100 μl) immunisiert. Zur direkten Verabreichung in die Milz wurden Mäuse anästhesiert und rasiert und es wurde ein Mesoflash^TMM10-Gerät (Prolitec), das zur intradermalen Abgabe an Mäuse angepasst ist, verwendet, um 20 μl an jede von fünf getrennten Stellen am Rücken abzugeben. Lösungen, die injiziert werden sollten, wurden in eine 5 ml Glaskammer gefüllt, die sich in dem M10-Injektor befindet. Der Injektor war mit einer Düse ausgestattet, die fünf Öffnungen umfasste und so kalibriert war, dass sie pro Schuss festgelegte Volumina von 100 μl abgab. DNA zur Injektion wurde durch alkalische Lyse, gefolgt durch CsCl-Ethidiumbromid-Äquilibrierungsgradienten-Zentrifugation oder Qiagen-Säulenchromatographie, gereinigt.
ELISA zur Detektion von Mausserumantikörpern gegen humanes p53
Das Beschichtungs-Antigen war ein Kernextrakt von Sf9-Insektenzellen, die mit einem rekombinanten Baculovirus infiziert waren, welches humanes Wildtyp-p53 exprimiert. Der p53-Gehalt dieses Extrakts war nach Elektrophorese etwa 50%. Mikrotiterplatten (96-Vertiefungen) (Dynatech) wurden über Nacht bei 4°C mit 100 ng p53 in 100 μl/Vertiefung beschichtet. Nach Waschen mit PBS-0,005% Tween 20 (PBS-T) wurden die Platten für 1 h bei 37°C mit PBS-T, das 1% Rinderserumalbumin enthielt (PBS-T-BSA), blockiert und erneut gewaschen. Serum oder als Positivkontrolle monoclonaler Antikörper DO1 (Santa Cruz), der humanes p53 erkennt, wurde zugesetzt und die Platten wurden für 1,4 h bei 37°C inkubiert. Nach dem Waschen wurde der sekundäre Antikörper, Kaninchen-Anti-Maus-IqG, -IgA, -IgM (Zymed) in einer Verdünnung von 1/1000 in PBS-T-BSA zugesetzt und die Inkubation wurde für weitere 1,5 h bei 37°C fortgesetzt. Nach einem Endwaschgang wurde das Substrat Dinatrium-p-nitrophenyl-phosphat mit 1 mg/ml in 1M Diethanolamin, 0,3 mM MgCl₂, pH 9,8, zugesetzt und die Platten wurden für 30 min bei Raumtemperatur im Dunklen entwickelt. Die Reaktion wurde mit 50 μl 2N NaOH/Vertiefung gestoppt und die Platten wurden unter Verwendung eines Molecular Devices-Plattenlesegeräts bei 405 nm gelesen.
Bestimmung spezifischer CTLs gegen humanes p53 Milz aus immunisierten Mäusen wurde in RPMI mit 2% fötalem Kälberserum (FCS) dissoziiert und Splenocyten wurden hergestellt. Stimulatoren (aus nicht immunisierten Mäusen hergestellt wie oben) wurden mit einer Infektionsmultiplizität von 2–10 mit VP1101 oder vCP207, wie angegeben, infiziert. Nach einer 1 h bei 37°C mit 5% CO₂ wurden die infizierten Stimulatoren gewaschen und mit 25 Gy bestrahlt (oder wurden in einigen Fällen ohne Bestrahlung verwendet) und mit Effektoren in einem Verhältnis von 1 : 2 oder 1 : 5 in einem 75 cm³-Kolben bei einer Endkonzentration von 2 × 10⁶ Zellen/ml vermischt. Die Kolben wurden vertikal für 5 Tage in einem 37°C-Inkubator mit 5% CO₂ inkubiert. Wenn eine zweite Stimulation durchgeführt wurde, wurde ein Stimulator : Effektor-Verhältnis von 2 : 1 verwendet, und es wurden 10 E/ml murines Interleukin-2 (IL-2; Genzyme) zugesetzt. Die Restimulation erfolgt über 5 Tage.
Für den CTL-Assay wurden 10⁶ P815- oder 2E4-Zellen mit 200 μCi NR₂ ⁵¹CrO₄ (NEN, 40 mCi/ml) für 1 h bei 37°C markiert und dreimal in RPMI mit 10% FCS gewaschen. Es wurden 5 × 10³ – 10⁴ Zielzellen in jede Vertiefung einer Rundbodenmikrotiterschale mit 96 Vertiefungen verteilt. Effektoren wurden zugesetzt und die Platten wurden für 4 h bei 37°C inkubiert, wonach der Überstand geerntet und einer Zählung unterworfen wurde. Der prozentuale Anteil der spezifischen Lyse wurde als 100 × (Effektorfreisetzung – spontane Freisetzung)/(Gesamtfreisetzung – spontane Freisetzung) errechnet.
1B – Resultate
Vorläufige Experimente unter Verwendung von Kanarienpocken (ALVAC-Vektor, der für humanes Wildtyp-p53 codiert (vCP207))
Die Immunantwort (Antikörper- und CTL-Antworten) auf vCP207, das auf verschiedene Weise abgegeben wurde, wurde untersucht und die Resultate sind wie folgt.
Eine intravenöse Verabreichung von 107 TCID_5O des rekombianten, nicht aber des Vorläufer-ALVACs, in Woche 0, 3 und 5, induzierte eine signifikante spezifische IgG-Antwort in 11/12 Mäusen. Wenn allerdings dieselbe Impfung auf subkutaner Route durchgeführt wurde, reagierten nur drei von zwölf Mäusen und auch diese hatten Titer, die nur knapp über dem Hintergrund lagen. Wir erkannten auch nur eine geringe Antwort bei intradermaler Route.
Wir untersuchten auch die spezifische CTL-Aktivität von Splenocyten aus immunisierten Mäusen nach einer in vitro-Stimulation mit naiven Splenocyten, die mit einem rekombinanten, hoch-abgeschwächten Vakzin, NYVAC, das humanes Wildtyp-p53 exprimiert, (vP1101) infiziert waren. Splenocyten aus Mäusen, die dreimal intravenös mit vCP207 immunisiert worden waren, zeigten hohe Level einer Lyse von Clon 2E4, eine P815-Linie, die mit humaner R273H-Mutanten-p53 transfiziert war. Es gab eine klare lytische Aktivität, selbst nach einer Runde einer in vitro-Stimulation, obgleich die Level speziell bei niedrigen E : T-Verhältnissen, nach einer zweiten Runde der in vitro-Stimulation anstiegen. Die Antwort war für p53 spezifisch, da wir nur geringe Level einer Lyse von 2E4 nach Immunisierung mit dem ALVAC-Vektor und nur geringe Level einer Lyse von transfiziertem P815 feststellten. Im Gegensatz zu den Resultaten durch die intravenöse Route zeigten Splenocyten aus Mäusen, die subkutan mit demselben vCP207 immunisiert worden waren, keine Anzeichen einer CTL-Aktivität, und zwar selbst nach zwei Runden einer in vitro-Stimulation. Auch eine intradermale Verabreichung konnte keine spezifischen Anti-p53-CTLs zeigen.
Schließlich gingen wir davon aus, dass die Verabreichungsroute nur zur Auslösung (zum Priming) kritisch sein könnte; allerdings reagierten Mäuse, die auf intravenösem Weg ein Priming erfahren hatten und subkutan verstärkt worden waren, nicht.
Wir zogen daraus den Schluss, dass die intravenöse Route die optimale Route zur Induzierung einer für p53 spezifischen Immunantwort war, wenn rekombinanter Pockenvirus als Immunogen verwendet wurde.
Imunantwort (Antikörper- und CTL-Antriorten) auf eine nichtinfektiöse DNA, die für humanes Wildtyp-p53 codiert
Wir haben auch die Antwort auf eine Immunisierung mit einem Plasmid, das für humanes Wildtyp-p53 codiert, unter der Kontrolle des CMV-Promotors (pC53-SN₃) untersucht.
Eine intradermale Verabreichung von 100 μg dieses Plasmids in der Woche 0, 3 und 6 induzierte eine spezifische Antikörperantwort in drei von acht Mäusen, im Vergleich zu keiner der Mäuse bei dem pUCneo-Vektor. Trotz dieser eher variablen Antikörperantwort sahen wir eine CTL-Antwort in allen Tiergruppen, die mit 100 μg immunisiert worden waren, aber nicht bei denen, die mit 1 oder 10 μg pC53-SN₃ immunisiert worden waren (1A). Ähnlich wie die, die durch vCP207 induziert worden waren, waren die CTLs, die durch p53-DNA induziert worden waren, für p53 spezifisch, zeigten keine Lyse von 2E4 nach Immunisierung mit der pUCneo-Vektor-DNA noch eine signifikante Lyse von nichttransfiziertem P815. Wir erkannten auch eine klare CTL-Antwort nach intramuskulärer Injektion von 100 μg einer anderen DNA, die für humanes Wildtyp-p53 codiert, pMP1406hp53 (1B).
Schutz gegen einen Angriff mit durch humanes p53-transfizierten Zelllinien nach Immunisierung mit vCP207 oder pc53-SN₃.
Sobald wir optimale Wege zur Induzierung von Anti-p53-Immunantworten bestimmt hatten, untersuchten wir, ob sie gegenüber einem Angriff mit murinen Tumorlinien, transfiziert mit humanem p53, schützen würden. In diesen Experimenten immunisierten wir in den Wochen 0, 3 und 6 und attaktierten in der Woche B. Eine Angriffslinie, Clon 2–21, wurde abgeleitet, indem BALB/3T12-3, ein tumorigenes Isolat von BALB/c-3T3, mit einem Plasmid, das für humane Mutante p53 codiert, (R273H), transfiziert wurde. Kontroll-immunisierte BALB/c-Mäuse entwickelten Tumore, die progressiv wuchsen, beginnend etwa 6 Wochen nach subkutaner Injektion von 10⁷ Zellen (2A). Vor einer intravenösen Immunisierung mit vCP207 wurde ein partieller, statistisch aber nicht signifikanter (P > 0,25 vs. PBS)-Schutz verliehen, wobei nur eine von 9 Mäusen bis zur Woche 15 tumorfrei blieb. Dieser Effekt war für p53 spezifisch, da eine Immunisierung mit dem ALVAC-Vektor nicht schützend war und in der Tat das Tumorwachstum im Vergleich zu PBS leicht beschleunigte. Auch vCP207 verlieh den nicht-transfizierten Eltern-BALB/ET12-3 überhaupt keinen Schutz (2B). Im Gegensatz zu dem partiellen Schutz, der durch das rekombinante Virus induziert wurde, induzierte eine intradermale Immunisierung mit pC53-SN₃-DNA einen vollständigen Schutz (P < 0,001 vs. sowohl PBS wie auch pUCneo; 2C).
Ein anderes Angriffsmodell, Clon 4D5, der durch Transfizieren von P815-Mastocytomzellen mit humanem R273H-mutantem p53, abgeleitet worden war, bildete Tumore, die etwa 3 Wochen nach subkutaner Injektion von 10⁴ Zellen in DBA2-Mäusen (2D) auftraten und schnell wuchsen, was etwa in Woche 6 zum Tod führt. In diesem Modell induzierten vCP207 und pC53-SN₃ beide einen partiellen Schutz (2D), allerdings unterschied sich nur die DNA-Gruppe signifikant von der PBS-Kontrollgruppe (P < 0,1 für vCP207 und p < 0,01 für pC53-SN₃). Weder Kontroll-ALVAC noch die Kontroll-DNR induzierte einen signifikanten Schutz im Vergleich zu PBS (P < 0,25).
1C – Diskussion
Wir verglichen die Immunantworten, die durch Abgabe des Volllängen-Wildtyp-p53-Gens, entweder über einen rekombinanten viralen Vektor oder Plasmid-DNA induziert wurden. Im Fall des rekombinanten ALVAC war der Verabreichungsweg für die Induktion einer optimalen Immunantwort kritisch. Wir stellten gute Antworten bei Immunisierung bei intravenöser Route fest, wie andere dies für Geflügelpocken beschrieben hatten. Allerdings war die Antikörperantwort bei subkutaner, intramuskulärer und intradermaler Route schwächer und induzierte keine nachweisbaren CTLs.
Während die Level an CTLs, die durch Immunisierung mit DNR und rekombinantem Pockenvirus erzeugt wurden, ähnlich zu sein schienen, ist es schwierig, die verwendeten Dosen zu vergleichen, und zwar aufgrund der unterschiedlichen Natur der zwei Vektoren. Während 100 μg DNA und 10⁷ Virus ausreichend waren, in beiden Fällen CTLs zu induzieren, konnte eine 10-fach niedrigere Dosis keine CTLs induzieren, d. h. weder 10 μg DNA (1A) noch 10⁶ vCP207 induzierten reproduzierten CTLs. Es ist auch erwähnenswert, dass DNA CTLs induzierte, wenn sie intradermal oder intramuskulär gegeben wurde, was von Haus aus praktischer ist und weniger leicht zu Sicherheitsbedenken führt als die intravenöse Route, die mit dem rekombinanten Virus verwendet wurde.
Trotz der Erzeugung von CTL lieferte eine intravenöse Immunisierung mit vCP207 nur einen partiellen Schutz in transfizierten 3T3- und P815-Modellen.
Kurz ausgedrückt, die Immunantwort- und Schutzdaten mit humanem p53 können wie folgt zusammengefasst werden.
Es ist sofort erkennbar, dass bei DNA-Immunisierung auf intradermaler Route unter Verwendung eines nadelfreien Injektors überlegene Resultate erzielt wurden.
Beispiel 2: Grippeimpfung bei Mäusen
2.A – Materialien und Verfahren
Plasmide
Das pV1JHA-Plasmid ist ein von pUCl9-abgeleitetes Plasmid, das den Ampicillinresistenzgenmarker, das Hämagglutinin (HA)-Gen, cloniert aus dem A/PR/8/34-Influenzavirus, den Enhancer, Promoter und das Intron A aus dem hCMV IE1-Gen und die Poly(A)-Signalsequenz aus dem Rinderwachstumshormongen enthält (Montgomery et al., (1993) 12: 777).
Dieses Plasmid wurde in E. coli XL1-blue strain wachsen gelassen, durch alkalische Standardlyseverfahren mit anschließender selektiver Präzipitation von RNAs durch LiCl/Ethanol extrahiert. Der Überstand wurde dann nacheinander mit RNaseA (0,01–0,05 mg pro mg DNA) und Proteinase K (0,04–0,2 mg pro mg DNA) verdaut. Die resultierende DNA wurde mit Phenol/Chloroform extrahiert. Plasmid-DNA wurde weiter mit einem CsCl-EtBr-Gradienten gereinigt. Das EtBr wurde durch 1-Butanolextraktion entfernt. Das Plasmid wurde EtOH-präzipitiert, in destilliertem Wasser resuspendiert und in einer Konzentration von 5 mg/ml bei –20°C gelagert. Die Konzentration und Reinheit der Plasmidpräparationen wurden durch Agarosegelelektrophorese und OD 260/280-Ablesungen bestimmt. Die OD 260/280-Verhältnisse waren 1,8.
Immunisierung von Mäusen
Acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (Charles River Laboratories, Saint Aubin les Elbeuf, Frankreich) wurden durch IP-Injektion einer Lösung, die 8 mg/ml Ketamin (Imalgene 500, Rhne-Merieux) und 1,6 mg/ml Xylazin (Rompun 2%, Bayer) in einem Gesamtvolumen von 0,2 ml Kochsalzlösung enthielt, anästhesiert. Weibliche BALB/c-Mäuse (6 pro Gruppe) wurden dreimal (Woche 0, 3 und 6) mit 10 μg Plasmid pV1JHA immunisiert. Die Immunisierungen wurden wie folgt durchgeführt:
Für IM-Injektionen wurden 50 μl DNA in 9‰ NaCl in den Quadrizeps-Muskel eines rasierten Oberschenkels, der mit Ethanol abgetupft worden war, unter Verwendung einer Micro-Fine-Insulinspritze, die mit einer 29G1/2-Nadel ausgestattet war, injiziert.
Für ID-Injektionen wurden 100 μl DNA in 9‰ NaCl in fünf Punkte rasierter dorsaler Haut, die mit Ethanol abgetupft worden war, unter Verwendung eines Mesoflash^TM M10-Strahlinjektors (Mesoflash^TM-Reihe, Prolitec, Aouste/Sye, Frankreich) injiziert. Zu injizierende Lösungen wurden in die 5 ml Glaskammer des M10-Injektors gefüllt. Dieser Injektor war mit einer rechteckigen Düse ausgestattet, die fünf Öffnungen aufwies, und so kalibriert, dass er fixierte Volumina von ca. 100 μl pro Schuss abgab.
Serumproben wurden in der Woche 0 (präimmun), 3, 6, 10, 12, 16 und 20 gewonnen. Anti-Influenza-Immunglobuline wurden durch ELISA-Titration, beginnend mit einer 1 : 25-Verdünnung der Seren, gemessen. Seren wurden auf spezifische IgG1- und IgG2a-Isotypen durch ELISA gegen A/PR/8/34-Virus titriert und auf HI-Antikörpertiter, beginnend mit einer 1 : 10-Verdünnung der Seren, untersucht. In Woche 20 wurden die Mäuse getötet und die Milz wurde entnommen, um auf das Vorliegen von HAspezifischen CTLs in einem 4-stündigen Standard-^5lCr-Freisetzungsassay zu untersuchen.
ELISA-Assay
Alle Volumina, die in diesem ELISA eingesetzt wurden, waren 100 μl/Vertiefung, wenn nichts Anderes angegeben ist. Maxysorp 96-Platten mit 96 Vertiefungen (Nunc) wurden über Nacht bei 4°C mit dem gesamten Influenzavirus (A/PR/8/34) mit 100 ng/100 μl (Gesamtprotein) in 0,1M Carbonat-Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, beschichtet. Die Platten wurden zweimal mit PBS, der 0,05 Vol.-% Tween 20 (Waschlösung) enthielt, gewaschen und mit PBS, der in 0,05 Vol.-% Tween 20 und 1 G/V fettfreie Milch enthielt (Blockierungslösung), blockiert. Nach 1 h Inkubation bei 37°C bei leichtem Schütteln wurden die Platten erneut zweimal gewaschen. Dann wurden nacheinander die folgenden Reagenzien auf die Platten übertragen und diese wurden erneut für 1,5 h bei 37°C unter leichtem Schütteln und ausgiebigem Waschen (vier Zyklen) zwischen jeder Inkubation inkubiert: i) Serumproben, verdünnt von 1/25–1/51200 durch Zweifach-Reihenverdünnungen in der Blockierungslösung, ii) biotinyliertes Schaf-Anti-Maus-IgG (bzw. Schaf-Anti-Mensch, im Affen-ELISA) (Amersham), verdünnt auf 1/5000 in der Blockierungslösung, ii) Streptavidinbiotinylierte Meerrettichperoxidase-Komplex (Amersham), verdünnt auf 1/2000 in der Blockierungslösung.
Um spezifische Immunglobulinisotypen im Maus-ELISA nachzuweisen, wurden biotinyliertes Schaf-Anti-Maus-IgG1 und -IgG2a verwendet.
Zur Farbentwicklung wurde 0,1M Natriumcitrat-Puffer, pH 5,6, der 0,03% Wasserstoffperoxid und 1 mg/ml O-Phenylendiamindihydrochlorid (Sigma) enthielt, zugesetzt. Die Farbreaktion wurde nach 30 min durch Zusatz von 50 μl 2M H₂SO₄ gestoppt und die Extinktionen wurden bei 490 nm unter Verwendung eines Vertikalstrahl-Spektrofotometers (Titertek, Flow Laboratories) abgelesen. Antikörpertiter wurden als Kehrwert der Serumverdünnung mit einem A490-Wert von 0,5 definiert. Die mittleren Serumantikörpertiter wurden als geometrische mittlere Titer (GMT) an einer log2-Skala ausgedrückt.
Hämagglutinationsinhibitions(HI)-Assay
Vor dem Assay wurden Seren von nicht-spezifischen Inhibitoren mit Receptor Destroying Enzyme (RDE, Sigma) und von kalten Agglutininen durch Hämadsorption geklärt. Kurz ausgedrückt, Seren (25 μl) wurden über Nacht bei 37°C mit 125 μl RDE (Pulver, gefriergetrocknet aus 5 ml Vibrio-Kulturfluid, rekonstituiert mit 2,5 ml destilliertem Wasser) inkubiert und für 1 h bei 56°C erwärmt. Die behandelten Proben (150 μl) wurden dann für 30 min bei Raumtemperatur mit 125 μl Hühnchen-Erythrozyten mit einer Konzentration von 10% (G/V) in PBS vorabsorbiert und die kalten Agglutinine wurden mit den Zellen durch 10-minütige Zentrifugation bei 3000 U/min entfernt. Diese sequentiellen Behandlungen induzierten eine ca. 10-fache Verdünnung der Seren.
Zweifache Reihenverdünnungen von Seren (von 1/10 bis 1/10240 in PBS) wurden dann in Platten mit 96 Vertiefungen (Greiner-Labor-Technik, 50 μl/Vertiefung) hergestellt, und es wurden 50 μl PBS, enthaltend 4 HA-Einheiten Influenza-Virus, in jede Vertiefung gegeben und die Platten wurden bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert. 50 μl Hühnchen-Erythrozyten mit einer Konzentration von 0,5%(G/V) in PBS wurden für 1 h zugesetzt und die Agglutination wurde durch visuelle Untersuchung bestimmt. Der HI-Titer wurde als Kehrwert der höchsten Verdünnung des Serums, die eine Hämagglutinationsinhibition induzierte, ausgedrückt.
Cyctotoxizitäts-Assay.
Splenocyten aus immunisierten Mäusen (Effektoren) wurden isoliert und in vitro durch Co-Kultur für 7 Tage mit syngenen Milzzellen (Stimulatoren), die mit A/Singapore/6/86-Influenza-Virus (Stamm H1N1, 100 HA-Einheiten/10⁶ Splenocyten) infiziert worden waren, und für vier weitere Tage mit frischen, mit Influenza infizierten syngenen Milzzellen, die mit Mitomycin (2,5 μg/10⁶ Splenocyten) behandelt worden waren, restimuliert. Etwa 7,5 × 10⁷ Effektoren und Stimulatoren wurden zusammen in Kolben in 30 ml RPMI 1640-Medium, das 10% FCS, 50 μM 2-Mercaptoethanol, Glutamin (2 mM) und Antibiotika enthielt (= Kulturmedium), gegeben.
Für die erste Stimulation war das Effektor/Stimulator-Verhältnis 3 : 2 und für die zweite Stimulation war das Effektor/Stimulator-Verhältnis 1 : 4; murines rekombinantes IL-2 (Boehringer Mannheim) wurde dem Kulturmedium mit 10 Einheiten/ml zugesetzt.
Die cytotoxischen Aktivitäten wurden in einem 4-stündigen Standard-^5lCr-Freisetzungsassay gemessen. Kurz ausgedrückt, die stimulierten Effektorzellen wurden durch Zentrifugation gewaschen und in Platten mit 96 Vertiefungen (Falcon) durch 3-fach-Reihenverdünnung von 500.000 Zellen/100 μl auf 18.500 Zellen/100 μl verdünnt. P815 (H-2K^d) Mastocytomzellen (Ziele) wurden durch Inkubation mit einem Peptid, das das A/PR/8/34-HA2-CTL-Epitop im H-2K^d-Haplotyp (13) (IYSTVASSLVL, 20 μg/10⁶ Zellen) umfasste oder mit dem A/RP/8/34-NP-CTL-Epitop (14) (TYQRALVTG, 20 μg/10⁶ Zellen = negative Kontrolle) sensibilisiert und mit ⁵¹Cr (300 μCi/10⁶ Zellen) beladen. 5000 Zielzellen in 100 μl Kulturmedium wurden in den Platten mit 96 Vertiefungen den Effektorzellen zugesetzt. Nach 4 h bei 37°C wurden die Platten mit 1400 U/min für 3 bis 4 min zentrifugiert und 30 μl der Überstände aus jeder Vertiefung wurden in die entsprechende Vertiefung einer Lumaplate (Packard) mit 96 Vertiefungen überführt, um die Radioaktivität unter Verwendung eines TopCount beta-Zählers (Packard) zu bestimmen.
Die Resultate sind als prozentualer Anteil der spezifischen ⁵¹Cr-Freisetzung, errechnet unter Verwendung der Formel:
(a – c/b – c) × 100, worin a = cpm, freigesetzt in Gegenwart von Effektorzellen, b = cpm, freigesetzt in Gegenwart von Detergens (maximale Freisetzung), und c = cpm, freigesetzt in den Kontrollvertiefungen ohne Effektorzellen (spontane Freisetzung), ausgedrückt.
2B – Resultate
Die Immunantworten, die durch ID-Strahlimmunisierung induziert wurden, wurden mit denen einer Standard-IM-Injektion im Influenzamodell mit pV1JHA, das für das Hämagglutinin von Influenza A/PR/8/34-Virus (H1N1-Stamm) codiert, verglichen. In BALB/c-Mäusen war eine Dosis-Antwort-Beziehung zwischen der Dosis an pV1JHA-Plasmid und den Anti-Influenza-Antikörpern, die nach IM- oder ID-Strahl-Injektion (Mesoflash^TMM10) von pV1JHA erzeugt wurde, offensichtlich, wobei die niedrigste immunogene Dosis in einem Protokoll mit zwei Immunisierungen (nicht gezeigt) 0,1 μg ist. Diese Untersuchung zielte auf einen Vergleich der zwei Wege der Verabreichung in einem Protokoll, das drei Immunisierungen mit 10 μg pV1JHA (im Abstand von 3 Wochen) ab, wobei die Antikörperproduktion (Gesamt-Immunglobuline) nach Strahlinjektion des DNA-Vakzins in die Haut, verglichen mit der, die durch IM-Immunisierung induziert wurde, leicht erhöht war (1–2 ELISA-Verdünnungen, 2- bis 4-fach) (3).
In Anbetracht des niedrigen Levels der Plasmidexpression in der Haut legt dieses Immunisierungsexperiment nahe, dass wirksame Immunantworten aus einem sehr kleinen Protein immunogen erzeugt werden können, wenn dies in geeigneten Zellen oder Geweben produziert wird oder dort aufgenommen wird.
Bei Prüfung des IgG1/IgG2a-Gleichgewichts schien es, dass nur die IgG1-Titer durch die Immunisierungsroute beeinflusst wurden. Tatsächlich zeigt 4, dass IM- und ID-Strahlimmunisierte Mäuse sehr ähnliche IgG2a-Titer hatten, wohingegen der mittlere IgG1-Titer bei den ID-Strahlimmunisierten Mäusen einen maximalen Plateauwert erreichte, der etwa achtmal (3 ELISA-Verdünnungen) über dem mittleren Titer lag, der in der IM-Gruppe beobachtet wurde. Die durch ID-Strahlinjektion erhaltenen höheren IgG1-Titer korrelierten positiv mit höheren Virusneutralisierungstitern, die durch einen Standard-Hämagglutinationsinhibitions-Assay an frischen Hühnchen-Erythrozyten gemessen wurden, welche mit A/PR8/34-Influenzavirus inkubiert worden waren. Die HI-Titer waren in der ID-Strahl-immunisierten Gruppe im Vergleich zu der IM-Gruppe etwas höher (5).
Zusätzlich zu HI-Titern induzierte das DNA-Vakzin auch spezifische Anti-HA-CTL-Antworten bei den immunisierten BALB/c-Mäusen. Wir detektierten signifikante CTL-Antworten fünf Monate nach der Primärimmunisierung bei vier der sechs IM-immunisierten Mäuse und bei drei von fünf der Strahlimmunisierten Mäuse, die untersucht wurden. 6 zeigt die spezifischen CTL-Antworten, die in einer typischen ansprechenden Maus aus jeder der zwei Gruppen erzeugt wurden.
Beispiel 3: Grippeimpfung bei Affen
3A – Material und Verfahren
Das Plasmid ist wie in 2A beschrieben.
Immunisierung von Affen
Zwei Jahre alte männliche und weibliche Cynomolgus-Makakenaffen (Macaca fascicularis, 2,1–3,3 kg zur Zeit der Primärimmunisierung) aus Vietnam wurden von Naforimex (Hochiminh Ville) erhalten und unmittelbar nach der Ankunft in unseren Tierpflegeanlagen einer Tuberculin-Diagnose unterzogen und in Quarantäne gehalten. Vor Aufnahme in diese Untersuchungen hatten die Affen drei Injektionen inaktivierten Polioimpfstoff (Pasteur Merieux Connaught) erhalten. Die Affen wurden entsprechend den Richtlinien der europäischen Bestimmungen gehalten und erhielten Leitungswasser ad libitum, Früchte und handelsübliches Primatenfutter.
Die Affen wurden durch IM-Verabreichung von 50 mg Ketamin (0,5 ml Imalgene 1000, Rhône-Mérieux) in den Oberschenkel anästhesiert. Die Injektionsstelle war vor der Injektion Makakenaffen (2 männliche und 2 weibliche pro Gruppe) wurden dreimal (Woche 0, 6 und 19) wie folgt immunisiert:
Für IM-Injektionen wurden 50 μg Plasmid pV1JHA in 500 μl 9‰ NaCl in den Quadrizeps-Muskel injiziert, wobei eine 3 ml-Spritze verwendet wurde, welche mit einer 26G3/8-Nadel ausgestattet war.
Für ID-Injektionen wurden 10, 50 oder 250 μg Plasmid pV1JHA in 100 μl 9‰ NaCl in fünf Punkte der Oberschenkelhaut injiziert, wobei eine Mesoflash^TMM40-Strahlkanone (Mesoflash^TM-Reihe, Prolitec, Aouste/Sye, Frankreich) verwendet wurde. Zu injizierende Lösungen wurden in eine Spritze eingefüllt, die auf den M40-Injektor passt. Dieser Injektor war mit einer kreisförmigen Düse, die fünf Öffnungen umfasste und so geeicht war, dass sie fixierte Volumina von ca. 100 μl pro Schuss abgab, ausgestattet.
Serumproben wurden in den Wochen 0 (präimmun), 2, 4, 6, 8, 10, 12, 16 und 24 gewonnen. Spezifische Anti-HA-Antikörpertiter (spezifische Gesamtimmunglobuline) wurden durch ELISA-Titration, wie sie in 2A beschrieben ist, ausgehend mit einer 1 : 25-Verdünnung der Seren, verfolgt. Die Serumproben wurden auch auf HI-Antikörpertiter untersucht, wie es in 2A beschrieben ist, wobei von einer 1 : 10-Verdünnung der Seren ausgegangen wurde.
3B – Resultate
Wir verglichen eine ID-Strahlkanonenimmunisierung (Mesoflash^TMM40) mit einer IM-Immunisierung bei Affen. Zur Strahlkanonen-Immunisierung führten wir eine Untersuchung des Dosis-Antwort-Typs durch und beobachteten eine Korrelation zwischen der Menge an pV1JHA, die zur Immunisierung verwendet wurde und der Größenordnung der anschließenden Antikörperantwort. Wir fanden heraus, dass die 50 μg-Dosis von pV1JHA stärkere ELISA- und HI-Titer als die 10 μg-Dosis, die keine Antwort hervorrief, induzierte. Die Größenordnung der Antikörperantwort konnte durch Erhöhung der pV1JHA-Dosis von 50 μg auf 250 μg nicht verbessert werden, allerdings schienen die Antworten in der 250 μg-Gruppe homogener.
Der Vergleich zwischen IM- und ID-Strahlkanonen-Immunisierung mit 50 μg pV1JHA zeigte keinen signifikanten Unterschied in der Gesamtantikörperantwort. Allerdings zeigte die Untersuchung einzelner Titer eine schnellere Serokonversion bei zwei der IM-Affen. In beiden Gruppen wurden die Antworten durch die Boosterimmunisierung, die drei Monate nach der zweiten Verabreichung gegeben wurde, verbessert.

Claims

Verwendung einer ein nichtinfektiöses DNA Molekül, das in einem Vertebraten ein Antigen, das (a) spezifisch für einen zur Induktion einer Infektion in einem Vertebraten fähigen Mikroorganismus oder (b) tumorassoziiert ist, exprimieren kann, enthaltenden Lösung bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Infektion oder Tumorerkrankung oder zur Vorbeugung dagegen, das ausschließlich an die Haut des Vertebraten abgegeben werden soll, so daß eine ausgewogene Th1/Th2-Immunantwort gegen das Antigen induziert wird; wobei die Abgabe des Arzneimittels durch Verwendung eines nadelfreien Geräts mit einer Druckvorrichtung zum Hineintreiben des Arzneimittels, deren Druck so eingestellt wird, daß das Arzneimittel ausschließlich an die Haut abgegeben wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei des Arzneimittel ausschließlich an die Epidermisschicht der Haut abgegeben wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Arzneimittel ausschließlich an die Dermisschicht der Haut abgegeben wird.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das DNA-Molekül des tumorassoziierte p53-Antigen exprimieren kann.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das p53-Antigen menschlichen Ursprungs ist.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 6, wobei es sich bei dem p53-Antigen um einen p53-Wildtyp handelt.
Verwendung nach Anspruch 4 oder 5, wobei es sich bei dem p53-Antigen um eine p53-Mutante handelt.