DE69819167T2

DE69819167T2 - Modifizierter, das dorsalgewebe beeinflussender faktor

Info

Publication number: DE69819167T2
Application number: DE69819167T
Authority: DE
Inventors: Neil Kent Shore Drive Carmel STAHL; M. Richard HARLAND; N. Aris ECONOMIDES
Original assignee: University of California; Regeneron Pharmaceuticals Inc; University of California Berkeley
Current assignee: University of California; Regeneron Pharmaceuticals Inc; University of California Berkeley
Priority date: 1997-07-17
Filing date: 1998-07-17
Publication date: 2004-07-22
Anticipated expiration: 2018-07-18
Also published as: CA2296769C; DE69819167D1; IL134042A; CA2296769A1; WO1999003996A1; US6075007A; HK1026229A1; US20030129703A1; AU735851B2; JP4181300B2; AU8570898A; US6500640B1; JP2001510044A; EP1003860A1; IL134042A0; ATE252639T1; EP1003860B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein einen Wachstumsfaktor mit einer das dorsale Wachstum induzierenden Aktivität, insbesondere eine modifizierte Form des Spemann-Organisator-Signals Noggin, modifiziertes Noggin umfassende Zusammensetzungen und DNA- oder RNA-Sequenzen, die codierende (Sense) oder Antisense-Sequenzen für modifiziertes Noggin umfassen.
Technischer Hintergrund
Wachstumsfaktoren sind Substanzen wie Polypeptid-Hormone, die das Wachstum definierter Populationen tierischer Zellen in vivo oder in vitro beeinflussen, die jedoch keine Nährstoffsubstanzen sind. Am Wachstum oder an der Differenzierung von Geweben beteiligte Proteine können das Wachstum oder die Differenzierung fördern oder inhibieren und daher umfasst der allgemeine Begriff „Wachstumsfaktor" Cytokine und trophische Faktoren.
Wachstumsfaktoren, deren Rezeptoren, codierende oder Antisense-DNA- oder RNA-Sequenzen davon sowie Fragmente davon können bei einer Reihe von therapeutischen, klinischen, Forschungs-, diagnostischen und Arzneimittelentwicklungs-Anwendungen geeignet sein (vgl. beispielsweise das am 15. August 1989 erteilte US-Patent 4,857.637 (Verfahren zur Immunisierung eines Tieres gegen dessen Wachstumshormon-Rezeptor); das am 12. Juni 1990 erteilte US-Patent 4,933,294 (den humanen EGF-Rezeptor umfassende Tests und Therapien); das am 9. Juli 1991 erteilte US-Patent 5,030,576 (Rolle von Rezeptoren und Rezeptor-Hybriden bei der Arzneimittelentwicklung und beim Arzneimittel-Screening der pharmazeutischen Industrie); das am 11. Februar 1992 erteilte US-Patent 5,087,616 (Verfahren zur Zerstörung von Tumorzellen unter Verwendung einer Zusammensetzung, die ein Wachstumsfaktor-Konjugat umfasst); das am 24. März 1992 erteilte US-Patent 5,098,833 (Expressions-Systeme, die in therapeutischen oder diagnostischen Zusammensetzungen eingesetzt werden können); und die am 2. April 1992 veröffentlichte Internationale Anmeldung WO 92/05254 (verschiedene Aspekte der Isolierung, Herstellung und Anwendungen eines neuartigen neurotrophen Faktors), wobei jede Druckschrift durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung einbezogen wird.
Der Spemann-Organisator induziert Nervengewebe aus dorsalem Ektoderm und bewirkt die Dorsal-Entwicklung von lateralem und ventralem Mesoderm in Xenopus. Das erste Molekül, das die von einem Spemann-Organisator-Signal erwarteten Eigenschaften aufweist, wurde in einem Screening auf Expression von Aktivitäten identifiziert, die dorsale Strukturen in Xenopus-Embryonen induzieren und wurde als Noggin bezeichnet (Smith, W. C. und Harland, R. M., Cell, 70 (1992), 829–840). Vertreter der Klasse der knochenmorphogenetischen Proteine (BMP) der Gen-Überfamilie des transformierenden Wachstumsfaktors Beta (TGF-β) können Antagonisten von Organisator-Signalen wie Noggin sein. Vor kurzem wurde berichtet, dass das Noggin-Protein BMP-4 mit hoher Affinität bindet und die BMP-4-Aktivität durch Blockierung der Bindung an verwandte Zelloberflächen-Rezeptoren aufheben kann (Zimmerman, L. B. et al., Cell, 86 (1996), 599–606).
Neben ihrer Funktionen bei der normalen Knochenbildung scheinen die BMPs an Krankheiten beteiligt zu sein, wobei sie anormales Knochenwachstum fördern. Beispielsweise ist berichtet worden, dass BMPs eine ursächliche Rolle bei der als Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) bekannte Krankheit spielen, bei der Patienten ein anormales „zweites Skelett" wächst, das jegliche Bewegung verhindert.
Beschreibung der Figuren
1A und 1B – Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 1) des humanen Noggin-Gens und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 2). Die Codierung der KKLRRK-Deletion, die wie in Beispiel 9 (hNGΔ138–144) beschrieben eine Reduktion der Wechselwirkung mit Heparin bewirkt, die mit der für ionische Wirkungen erwarteten übereinstimmt, beginnt bei Nucleotid 415 (AAG...).
2A – Experimenteller Plan: kompetentes Ektoderm der animalen Kappe (AC) wurde wie gezeigt aus Embryonen definierter Stadien seziiert. Wie gezeigt, wurden auch dorsale und ventrale AC- und ventral-marginale Zonen (VMZ) von St10.5 seziiert. Explantate wurden einmal in Ringer-Lösung mit geringem Ca/Mg-Gehalt (LCMR) gewaschen und dann in Behandlungsmedium, enthaltend einen verdünnten Faktor in LCMR + 0,5% BSA, gegeben. Bis zu späten Stadien (St20+) kultivierte Explantate wurden 6–16 Stunden nach Beginn der Behandlung aus dem Behandlungsmedium entfernt und in LCMR gegeben. Wenn die Explantate das gewünschte Stadium erreichten, wurden sie entweder zur RNA-Isolierung geerntet oder zur situ-Hybridisierung als ganzes Präparat oder zur Antikörperfärbung fixiert.
2B – Neurale Induzierung durch Noggin in Abwesenheit von Muskelgewebe. Die Laufspuren 1–3 zeigen durch N-CAM-, β-Tubulin- beziehungsweise XIF-3-Sonden geschützte spezifische Fragmente, in Gesamt-RNA von St24-Embryonen. Die Laufspuren 4–8 zeigen den Schutz durch ein Gemisch der drei Sonden, während die Laufspuren 9–13 den Schutz von tRNA(t), St24-Embryo-RNA (E) und RNA, die aus mit 50 pM Activin (A), 25% eines 20-fach konzentrierten Kontroll-CHO-Zellmediums (C) oder 25% eines 20-fach konzentrierten Noggin-konditionierten CHO-Zellmediums (N) behandelten St9-AC gewonnen wurde, durch eine Actin-Sonde zeigen. Ubiquitär exprimiertes cytoskeletales Actin wurde als Beladungskontrolle verwendet, die zeigt, dass die RNA-Mengen bei allen Behandlungen vergleichbar waren (Laufspuren 11–13).
3 – SDS-PAGE (12%)-Lauf unter reduzierenden Bedingungen. Proteine wurden mittels Silberfärbung sichtbar gemacht. Laufspur 1 zeigt Molekulargewicht-Standards. Die Laufspuren 2–7 zeigen 0,0 μg, 0,1 μg, 0,2 μg, 0,5 μg, 1,0 μg und 2,0 μg gereinigtes humanes Noggin.
4A – Zeitlicher Verlauf von mit aufgereinigtem Noggin behandelten animalen Kappen gegenüber mit Activin behandelten; direkte neurale Induzierung gegenüber indirekter neuraler Induzierung. Animale Kappen wurden, wie in 2A gezeigt, dissiziiert und mit LCMR + 0,5% BSA (U), einer 20-fachen Verdünnung von Activin-konditioniertem COS-Zellmedium (A) oder 1 μg/ml aufgereinigtem humanem Noggin (N) behandelt. Zusammen mit St22-Embryo-Gesamt-RNA (Laufspur 1) und tRNA (Laufspur 14) wurde aus behandelten animalen Kappen isolierte RNA (Laufspuren 2–13) mit N-CAM, β-Tubulin, Muskel- und cytoskeletalen Actinen, Kollagen Typ II und EF-1α als Sonden inkubiert.
4B – Expression früher mesodermaler Marker in Activin-, nicht jedoch Noggin-induzierten animalen Kappen. Animale Kappen wurden aus St8-Embryonen dissiziiert, wie in 4A beschrieben behandelt und in St11 geerntet. Die Laufspuren 1 beziehungsweise 2 zeigen den durch die goosecoid- und Xbra-Sonden vermittelten Schutz von St10.5-Embryo-Gesamt-RNA. Die Laufspuren 3–6 zeigen den Schutz durch ein Gemisch dieser beiden Sonden. Relative RNA-Mengen wurden durch einen separaten Schutz durch die EF-1α-Sonde nachgewiesen.
4C – Eine Plasmid-gesteuerte Noggin-Expression im Gastrula-Stadium induziert direkt Nervengewebe. Embryonen im Einzell-Stadium wurden 20 pg pCSKAlacZ oder pCSKANoggin in den animalen Pol injiziert. Animale Kappen aus Embryonen, denen die Injektion verabreicht worden war, wurden aus St8–9 seziiert und bis St20 kultiviert, wo sie zur Analyse mittels RNase-Schutz geerntet wurden.
5 – Reaktivität dorsaler und ventraler animaler Kappen auf neurale Induzierung durch Noggin. Ventrale und dorsale animale Kappen in St105 wurden, wie in 2A–2B gezeigt, seziiert. Dorsale und ventrale animale Kappen wurden mit Activin-Medium (DA, VA) oder 1 μg/ml humanem Noggin (DN, VN) behandelt und in St26 für eine RNase-Schutz-Analyse unter Verwendung von N-CAM, β-Tubulin und Actin als Sonden geerntet.
6 – Reaktion ventral-marginaler Zonen und animaler Kappen auf Dosen von humanem Noggin-Protein. VMZs in St10.5 und animale Kappen in St9 wurden, wie in 2A gezeigt, dissiziiert und mit 0, 1, 10, 50, 200 und 1000 μg/ml humanem Noggin behandelt (Laufspuren 3–8 beziehungsweise 10–15). RNA aus behandelten Explantaten und ganzen Embryonen, deren Alter St26 entsprach, als Kontrolle wurde danach mittels RNase-Schutz unter Verwendung der Sonden N-CAM, β-Tubulin, Actin und Kollagen Typ II analysiert. Bei diesem Experiment ist die Muskelinduzierung bei einer Dosis von 1 ng/ml stärker als bei 10 ng/ml, und in nicht-induzierten VMZs liegt eine geringe Expression von Muskel-Actin vor. Dies könnte auf experimentelle Abweichungen zurückzuführen sein, da die Erfinder der vorliegenden Erfindung bei wiederholten Experimenten eine Muskelinduzierung nur bei Dosen von 50 ng/ml und mehr feststellten.
7A bis 7L – In situ-Hybridisierung und Antikörperfärbung. Im Hinblick auf NCAM gefärbte Schwanzknospen-Embryonen, wobei seitliche und dorsale Ansichten gezeigt sind (7A, 7B); NCAM-RNA wird nur Medullarrohr nachgewiesen, jedoch nicht in Rumpfsegmenten. Im Vergleich dazu werden Rumpfsegmente eines Embryos mit Schwanzknospen im Hinblick auf Muskel-Actin gefärbt; dorsale Ansicht (7C). Färbung mit dem Nerven-spezifischen Antikörper 6F11 in St30 (7D–7F). Einige Zementdrüsen-Pigmente verblieben nach Entfärbung in diesen Embryonen, wie in (7D) zu sehen, wobei sich jedoch dieses Pigment von der Antikörperfärbung unterscheidet. Die innen auftretende massenhafte Färbung der mit Noggin behandelten animalen Kappen ist auf den Nachweis des Antikörpers 6F11 zurückzuführen. In St23 nachgewiesene Zementdrüsen-spezifische XAG-1-Transkripte (7G–7i) und in St35 nachgewiesene Vorderhirn-otxA-Transkripte (7J–7L) bei ganzen Embryonen (7D, 7G, 7J), mit humanem Noggin (1 μg/ml) behandelten animalen Kappen (7E, 7H, 7K) und unbehandelten animalen Kappen (7F, 7i, 7L).
8 – Umkehrphasen-HPLC-Profil von zwei rückgefalteten Isoformen von Noggin. Die rückgefaltetes Noggin enthaltende Lösung wurde auf eine Brownlee-Aquapore-AX-300-HPLC-Säule mit Abmessungen von 0.46 × 22 cm bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 1 ml/min aufgetragen. Die Säule wurde mit Lösungsmitel A, enthaltend 0,1% TFA in Wasser, äquilibriert. Bei Lösungsmittel B handelte es sich um 0,1% TRA in Acetonitril. Die Säule wurde nach folgendem Protokoll entwickelt: a) 2 min isokratisch bei 95% Lösungsmittel A-5 % Lösungsmittel B; 60-minütiger linearer Gradient von 65% Lösungsmittel B und 35% Lösungsmittel A. Korrekt rückgefaltetes Noggin eluiert früher bei 44%–46% Lösungsmittel B.
9 – Charakterisierung von rekombinantem Noggin, das aus E. coli. rückgefaltet und aufgereinigt wurde, mittels Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie. Die Bedingungen entsprechen den in der Legende zu 8 dargelegten.
10 – In E. coli und in Insektenzellen hergestelltes rekombinantes Noggin, das mittels einer 12,5%-igen SDS-PAG analysiert wurde. Laufspuren H, L: Marker hohen beziehungsweise geringen Molekulargewichts der angegebenen Größe. Laufspuren 1, 2: In E. coli beziehungsweise in Insektenzellen hergestelltes rekombinantes Noggin, das vor Elektrophorese mit 2-Mercaptoethanol behandelt wurde. Die geringere Wanderungsgeschwindigkeit von Noggin aus Insektenzellen entspricht dem Größenzuwachs, der aufgrund der N-verbundenen Glycosylierung an der einzigen Konsensus-Stelle auftritt. Laufspuren 2, 3: In E. coli beziehungsweise in Insektenzellen hergestelltes rekombinantes Noggin, das vor Elektrophorese nicht mit 2-Mercaptoethanol behandelt wurde.
11 – Circulardichroismus-Spektren von rekombinantem Noggin, das in E. coli (--) und in Insektenzellen (-) hergestellt wurde.
12 – Test unter Verwendung ventral-marginaler Zonen, der die Induzierung von Muskel-Actin-mRNA nach Behandlung mit in Baculovirus hergestelltem humanen Noggin (0,01 μg/ml, 0,05 μg/ml, 0,2 μg/ml), einer scheintransfizierten Kultur von Baculovirus (0,02 μg/ml, 1 μg/ml) oder in E. coli hergestelltem humanen Noggin (0,1 μg/ml, 0,5 μg/ml, 2 μg/ml oder 10 μg/ml) zeigt.
13A und 13B – Nucleotidsequenz (SEQ ID Nr. 10) des Maus-Noggin-Gens und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 11).
14 – Aminosäuresequenz von hNGΔ133–144Fc. Die Sequenz des vermutlichen Signalpeptids von humanem Noggin (hNG) ist in Schrägschrift gezeigt.
(†) markiert die Position von Cystein-Resten (C) außer den nachstehend angegebenen Ausnahmen.
(¥) markiert die Position N-verbundener Glycosylierungsstellen.
(Δ) markiert die Position, an der die Deletion Δ133–144 erzeugt wurde. Die Sequenz der Aminosäuren 133 bis 144 im Wildtyp-hNG ist KKQRLSKKLRRK und kann als „basischer Bereich" von hNG bezeichnet werden.
Der CYS-Rest, der an der Disulfid-Brückenbildung zwischen einzelnen Ketten in hNG beteiligt ist, ist in Fettdruck angegeben (...SECKCSC...).
Die Position der Ser-Gly-Brücke, die die hNGΔ133–144-Sequenz mit dem konstanten Bereich von humanem IgG1 (Fc) verbindet, ist in Fettdruck gezeigt (SG). Die Sequenz der Fc-Domäne ist unterstrichen dargestellt.
(♢) markiert die beiden Cystein-Reste (Aminosäure-Nummern 371 und 374) des Fc vorausgehenden IgG-Hinge-Bereiches, der die zwischen den Ketten angeordneten Disulfid-Brücken bildet, die die beiden Fc-Domänen von humanem IgG1 verbinden.
(•) zeigt die Position des STOP-Codons.
15 – hNGΔ133–144Fc bindet an menschliches BMP4. Die Aktivität von entweder hNG oder hNGΔ133–144Fc wurde mittels eines Vergleiches ihrer Fähigkeit zur Bindung an humanes knochenmorphogenetisches Protein 4 (hBMP4) getestet.
ELISA-Platten (CORNING) wurden mit hBMP4 (2 μg/ml) mittels passiver Bindung beschichtet. Nicht gebundenes hBMP4 wurde durch viermaliges Waschen mit PBS entfernt und die Platten wurden mit 1% BSA in PBS blockiert. Eine Standard-Kurve von hNG-Fc wurde erstellt, um die dosisabhängige Bindung von hNG-Fc an hBMP4 zu zeigen, und mit identischen Mengen von hNGΔ133–144Fc verglichen. Nach einer 1-stündigen Inkubation wurde nicht gebundenes hNG-Fc oder hNGΔ133–144Fc durch viermaliges Waschen mit PBS entfernt und in jede Vertiefung wurden 0,5 μg/ml Konjugat eines gegen humanes IgG gerichteten Antikörpers mit alkalischer Phosphatase (anti-Fc·AP) gegeben. Nach einer 1-stündigen Inkubation wurde nicht gebundenes anti-Fc·AP durch viermaliges Waschen mit TBS + 0,1% Tween entfernt und danach wurde ein Substrat der alkalischen Phosphatase (para-Nitrophenylphosphat; Sigma) zugegeben. Alkalische Phosphatase wandelt dieses Substrat in ein Produkt um, dessen Erzeugung durch Bestimmung der Extinktion bei 405 nm verfolgt werden kann. Die Fähigkeit von hNG oder hNGΔ133–144Fc zur Bindung an BMP4 wurde durch den Vergleich der A405-Einheiten sichtbar gemacht. Man beachte, dass keine Bindung von hNG-Fc oder hNGΔ133–144Fc an die Platten erfolgt, wenn hBMP4 weggelassen wird.
16 – hNGΔ133–144Fc bindet mit verminderter Affinität an Heparin.
Etwa 1 μg hNG-Fc, hNGΔ138–144Fc oder hNGΔ133–144Fc wurden jeweils mit 50 μl Heparin-Agarose (Pierce) in 1 ml 1% BSA in PBS inkubiert. Nach einer 1-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Heparin-Agarose-Perlen mittels Zentrifugation präzipitiert, in PBS resuspendiert und in neue Teströhrchen überführt. Anschließend wurde jedes Pellet nacheinander mit 100 μl 0,1 M, 0,25 M, 0,5 M, 0,75 M und 1,0 M NaCl gewaschen und der bei jedem dieser Schritte erhaltene Überstand wurde aufbewahrt und auf 4%-ige bis 12%-ige NuPAGE/MES-Gele (Novex) unter reduzierenden Bedingungen aufgetragen. Auf die Gele wurde 1/5 jedes Überstandes und des resuspendierten Heparin-Agarose-Pellets aufgetragen. Die mit Fc-Markierungen versehenen hNGs wurden mittels Western-Blotting unter Verwendung eines mit Meerrettich-Peroxidase-konjugierten, gegen humanes IgG gerichteten Antikörpers (Rockland, Inc.), dem sich ein Chemilumineszenz-Nachweis (Pierce) anschloß, sichtbar gemacht.
17A – Pharmakokinetische Untersuchungen von hNGΔ133–144Fc bei Mäusen.
Sechs Wochen alten männlichen Balb/c-Mäusen wurden 0,1 mg hNGΔ133–144Fc intraperitoneal (ip) injiziert (2 Mäuse, 0,1 mg/Maus). Vor Injektion wurde aus jeder Maus eine Blutprobe gesammelt („Vorblutung"). Anschließend wurde den Mäusen 1, 3, 6 und 24 Stunden nach Injektion Blut entnommen. Unter Verwendung der folgenden serologischen Standard-Verfahren wurde aus diesen Proben Serum hergestellt und der Titer von biologisch aktivem hNGΔ133-144Fc, das in den Seren von Balb/c-Mäusen nach der ip-Injektion verfügbar war, wurde unter Verwendung eines funktionalen ELISA-Verfahrens bestimmt.
ELISA-Platten (Immulon4 von Dynatech) wurden mit hBMP4 (2 μg/ml) mittels passiver Bindung beschichtet. Ungebundenes hBMP4 wurde mittels viermaligen Waschens mit PBS entfernt und die Platten wurden mit 1% BSA in PBS blockiert. Es wurde eine Standardkurve von hNGΔ133–144Fc erstellt. Nach einer 1-stündigen Inkubation wurde ungebundenes hNG-Fc oder hNGΔ133–144Fc durch viermaliges Waschen mit PBS entfernt und 0,5 μg/ml Konjugat eines gegen humanes IgG gerichteten Antikörpers mit alkalischer Phosphatase (anti-Fc·AP) wurde der Platte zugegeben und wie vorstehend beschrieben (16) weiterverarbeitet. Der hNGΔ133–144Fc-Titer in den zu jedem Zeitpunkt gesammelten Seren wurde bestimmt, indem Reihenverdünnungen jeder Serumprobe auf den mit hBMP4-beschichteten ELISA-Platten durchgeführt wurden und die Fc-Immunreaktivität unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Tests nachgewiesen wurde. Die A405-Einheiten wurden dann in Konzentrationen von hNGΔ133–144Fc umgewandelt und als Funktion der Zeit aufgetragen.
Man beachte, dass die Menge der in diesen Testsystemen vorhandenen Serumproteine die Bindung und den Nachweis von hNGΔ133–144Fc nicht beeinträchtigte.
17B – Durchführung von pharmacokinetischen Untersuchungen mit hNGΔ133–144Fc bei Ratten.
Einer 250 Gramm schweren adulten männlichen Ratte wurden 1,0 mg hNGΔ133–144Fc intravenös (iv) injiziert. Vor Injektion wurde eine Blutprobe gesammelt („Vorblutung"). Anschließend wurde der Ratte 10, 30, 60, 120 und 240 Minuten nach Injektion Blut entnommen. Aus diesen Proben wurde das Serum mittels der folgenden serologischen Standard-Verfahren hergestellt und die Titer des in den Serumproben verfügbaren biologisch aktiven hNGΔ133–144Fc wurden unter Verwendung des in 17A beschriebenen funktionalen Elisa-Testes bestimmt.
18A–18C – Pharmakokinetische Profile von Molekülen von humanem Noggin (hNG) und modifiziertem humanen Noggin.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide, die das dorsale Wachstum bei Vertebraten induzieren und die für eine Reihe therapeutischer, klinischer und diagnostischer Anwendungen in löslicher, physiologisch aktiver Form hergestellt werden können.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft die Bereitstellung eines menschlichen Noggin-Polypeptides (SEQ ID Nr. 2) oder eines im wesentlichen ähnlichen Noggin-Polypeptids, wobei das Polypeptid durch Deletion mindestens der Aminosäuresequenz KKLRRK modifiziert ist und bei Vertebraten die dorsale Entwicklung induziert sowie die Aktivität des knochenmorphogenetischen Proteins (BMP) blockiert. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein menschliches Noggin bereit, das mittels Deletion der Aminosäurereste 138–144 oder 133–144 modifiziert ist. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein modifiziertes Noggin bereit, das mit Polyethylenglykol (PEG) konjugiert ist.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Bereitstellung einer isolierten Nucleinsäure, die ein erfindungsgemäßes modifiziertes Polypeptid codiert. Eine solche Nucleinsäure kann eine cDNA sein, die gegenüber SEQ ID Nr. 1 eine weitgehende Ähnlichkeit aufweist. Dieses Oligonucleotid kann einzel- oder doppelsträngig sein, kann aus DNA- oder RNA-Basen gebildet sein und kann gegenüber SEQ ID Nr. 1 in Antisense- Richtung vorliegen. SEQ ID Nr. 1 codiert das funktionelle Polypeptid, das die Erfinder der vorliegenden Erfindung als „Noggin" bezeichnet haben und das bei Expression die dorsale Entwicklung in Vertebraten induzieren kann.
Die modifiziertes Noggin codierende Nucleinsäure kann eine rekombinante DNA-Sequenz sein, die mit einer Expressions-Kontrollsequenz verbunden ist.
Noggin oder Fragmente oder Muteine davon (die auch mittels in vitro-Verfahren synthetisiert werden können) können (mittels rekombinanter Expression oder kovalenter in vitro-Verfahren) mit einem immunogenen Polypeptid fusioniert werden, wobei dieses seinerseits zur Immunisierung eines Tieres eingesetzt werden kann, um Antikörper gegen ein Noggin-Epitop zu erzeugen. Aus dem Serum immunisierter Tiere kann ein gegen Noggin gerichteter Antikörper gewonnen werden. In einer anderen Ausführungsform können in herkömmlicher Art und Weise aus Zellen eines immunisierten Tieres monoclonale Antikörper hergestellt werden. Mittels Routine-Screening identifizierte Antikörper binden an Noggin, zeigen jedoch im Wesentlichen keine Kreuzreaktion mit „wnt" oder anderen Wachstumsfaktoren Immobilisierte, gegen Noggin gerichtete Antikörper sind besonders zur (in vitro oder in vivo) Diagnose oder zur Aufreinigung von Noggin geeignet.
Noggin oder Fragmente oder Muteine davon können in vitro auch derivatisiert werden, um immobilisiertes Noggin und markiertes Noggin herzustellen, insbesondere zur Diagnose von Noggin oder dessen Antikörpern oder zur Affinitätsreinigung von gegen Noggin gerichteten Antikörpern.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Bereitstellung von Wirtszellen, die mit einem rekombinanten DNA-Molekül transformiert sind, das ein erfindungsgemäßes modifiziertes Polypeptid codiert. Solche Zellen können zur Expression von biologisch aktiven Noggin-Molekülen eingesetzt werden und können prokaryotischen oder eukaryotischen Ursprungs sein.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner daher ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Noggin-Polypeptids, umfassend: (a) Züchten einer erfindungsgemäßen rekombinanten Wirtszelle, so dass das rekombinante DNA-Molekül von der Wirtszelle exprimiert wird, um das modifizierte Noggin-Polypeptid herzustellen, und (b} Isolieren des exprimierten modifizierten Noggin-Polypeptids. Ein solches Verfahren kann zur Herstellung von modifiziertem Noggin in Mengen, die für therapeutische und diagnostische Anwendungen ausreichen, eingesetzt werden. Für die meisten Zwecke werden bei therapeutischer oder diagnostischer Anwendung vorzugsweise Noggin-Gene oder Genprodukte der gleichen Art eingesetzt, obwohl es in spezifischen Ausführungsformen der Erfindung nützlich sein kann, Noggin aus fremden Arten einzusetzen.
Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen sowohl die Bereitstellung von Arzneimitteln, die erfindungsgemäßes modifiziertes Noggin, das gegebenenfalls mit Polyethylenglykol konjugiert ist, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen, als auch die Verwendung von erfindungsgemäßem modifiziertem Noggin zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer Knochen befallenden Erkrankung oder Störung. Insbesondere kann das erfindungsgemäße modifizierte Noggin zur Behandlung sowohl von pathologischem Knochenwachstum als Folge von Hüftersatzoperation, Trauma, Verbrennungen oder Rückenmarksverletzung als auch von Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) verwendet werden.
Genaue Beschreibung der Erfindung
In der vorliegenden Anmeldung wird durchweg, wenn Polypeptide codierende Nucleinsäuresequenzen angegeben sind, selbstverständlich ebenso auch der komplementäre Strang der codierenden Sequenz gelehrt.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben einen strukturell einzigartigen Wachstumsfaktor entdeckt, der ohne weiteres in einer im Wesentlichen reinen löslichen Form erhältlich ist. Die Erfinder der vorliegende Erfindung haben das erfindungsgemäße Polpeptid als „Noggin" bezeichnet. Dieser Wachstumsfaktor induziert die dorsale Entwicklung und blockiert die BMP-Aktivität bei Vertebraten.
Die „wnt"-Proteine gehören zu einer früher beschriebenen Familie von Proteinen, die auch die dorsale Entwicklung induzieren. Im Gegensatz zu Noggin bleiben diese jedoch fest an Zelloberflächen gebunden. Die ursprünglichen Arbeiten der Erfinder der vorliegenden Erfindung mit Noggin sind bei Xenopus-Embryonen durchgeführt worden, wobei jedoch Arbeiten der Erfinder mit Maus-Noggin gezeigt haben, dass Noggin bei Vertebraten hoch konserviert ist. Bekanntlich ist die im Stand der Technik bekannte Familie von FGF-Wachstumsfaktoren an der frühen embryonalen Induzierung beteiligt, wobei sich jedoch sowohl die FGF-Proteine als auch deren Rezeptoren deutlich von Noggin unterscheiden. Noggin modifiziert die Wirkungen von FGF (und auch von Activin), beispielsweise durch Verstärkung des Wachstums, was nahelegt, es insbesondere in therapeutischen Zusammensetzungen in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren (als therapeutische Adjuvantien) zu verwenden, beispielsweise zur Modifizierung oder Verstärkung von deren Wirkungen.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Noggin-cDNA cloniert. Die Noggin-cDNA enthält einen einzigen Leserahmen, der ein 26 kDa-Protein mit einer hydrophoben Amino-terminalen Sequenz codiert. Noggin wird sezerniert. Die cDNA von Noggin codiert das Protein als 26 kDa-Protein, wobei die Erfinder der vorliegenden Erfindung jedoch ermittelt haben, dass Noggin in vivo offensichtlich als dimeres Glycoprotein mit einem anfänglichen apparenten Molekulargewicht von etwa 33 kDa (als Wildtyp-Untereinheit) sezerniert wird. Wenn die monomere Einheit nicht glycosyliert ist, weist sie bei SDS-PAGE ein apparentes Molekulargewicht von etwa 25–30 kDa auf.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben das Gen für humanes Noggin cloniert (1A–1B; SEQ ID Nr. 1). Die Sequenz codiert ein Protein, das Noggin-Aktivität aufweist (SEQ ID Nr. 2). Der Carboxy-terminate Bereich von Noggin zeigt Homologie zu einem Protease-Inhibitor vom Kunitz-Typ, was darauf hinweist, dass das Noggin-Protein oder Fragmente davon Aktivitäten eines Protease-Inhibitors zeigen können.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung konnten biologisch aktives Noggin sowohl in eukaryotischen als auch prokaryotischen Wirtszellen exprimieren. Bei den beiden Expressionssystemen, die die Erfinder erfolgreich zur Expression von biologisch aktivem Noggin eingesetzt haben, handelt es sich um Säuger-Zellinien (COS und Maus-293). Ein drittes Expressionssystem umfasst die Injektion von synthetischer mRNA in Xenopus-Oocyten. Außerdem haben die Erfinder biologisch aktives humanes Noggin erfolgreich in einem prokaryotischen System, nämlich E. coli, und in Baculovirus exprimiert.
Die Expression in diesen unterschiedlichen Systemen veranschaulicht den hohen Grad der Konservierung von Noggin. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben festgestellt, dass beispielsweise zwischen Frosch-Noggin und Maus-Noggin eine weitgehende Sequenz-Ähnlichkeit mit einer Reihe von vollständig konservierten Bereichen besteht. Die folgenden Aminosäuresequenzen stellen daher Bereiche dar, die bei Frosch-Noggin und Maus-Noggin vollständig konserviert sind:
Insgesamt besteht etwa eine 87%-ige Konservierung zwischen den Maus- und Frosch-Sequenzen, wobei die Erfinder auch eine einzigartige Cystein-Verteilung bei den beiden Sequenzen beobachtet haben.
Mit „stringenten Bedingungen" sind solche gemeint, bei denen (1) zum Waschen eine geringe Ionen-Stärke und eine hohe Temperatur eingesetzt werden, beispielsweise 0,15 M NaCl/0,015 M Natriumcitrat/0,1% NaDodSo₄ bei 50°C, oder (2) bei denen während der Hybridisierung ein Denaturierungsmittel wie Formamid verwendet wird, beispielsweise 50% (Vol./Vol.) Formamid mit 0,1% Rinderserumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphat-Puffer bei einem pH-Wert von 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat bei 42°C.
Bei Bezugnahme auf eine Nucleotidsequenz bedeutet „weitgehende Ähnlichkeit" eine Kreuzhybridisierung von Sequenzen unter Bedingungen mäßiger Stringenz und unter Verwendung einer Sonde mit einer Länge von mehr als 100 Nucleotiden bei 30°C in einem Standard-Puffer (Wahl et al., PNAS 76: 3683) und Waschen bei 37°C in 300 mM NaCl, 30 mM Natriumcitrat, 0,2% SDS bei einem pH-Wert von 7. In einer anderen Ausführungsform lässt sich ein DNA-Fragment, das Noggin oder einen Vertreter der Noggin-Familie codiert, mittels einer Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Primern mit degenerierten Sequenzen, die die von SEQ ID Nr. 3–7 codieren, isolieren.
Bei Bezugnahme auf Proteine ist unter „weitgehender Ähnlichkeit" zu verstehen, dass bei einem Noggin aus unterschiedlichen Spezies oder bei Vertretern der Noggin-Familie innerhalb einer Art die Positionen von Cystein-Resten bei mindestens 80% aller Positionen im gesamten Protein erhalten sind. Wie bei der Neurotrophin-Familie ist die Sequenz der reifen Form von Noggin und Noggin-verwandter Polypeptide bei mindestens 40% der Positionen identisch. Eine weitgehende Ähnlichkeit auf der Proteinebene umfasst die Fähigkeit eines Proteins zur Kompetition mit Noggin um Bindung an Rezeptoren und einige (jedoch nicht alle) monoclonale Antikörper, die gegen Noggin-Epitope erzeugt wurden.
Die clonierte cDNA voller Sequenz für Maus-Noggin ist in den 13A–13B(SEQ ID Nr. 10) gezeigt. Die humane Sequenz ist in der vorliegenden Anmeldung als SEQ ID Nr. l bezeichnet. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben RNA-Transkripte des Frosch-Noggin-Clons verwendet, um Embryonen zu retten und diese einer im Wesentlichen normalen Entwicklung zuzuführen, wenn ventralisierten Embryonen die Noggin-RNA injiziert wird. Bei hohen Dosen führt dies zu einer übermäßigen Entwicklung des Kopfes und aus diesem Grund bezeichneten die Erfinder das Protein als „Noggin". Bei der Northern-Blot-Analyse hybridisiert die Noggin-cDNA mit zwei mRNAs, die sowohl mütterlich als auch zygotisch exprimiert werden.
Bei Verwendung von Nucleotidsequenzen, die das erfindungsgemäße Noggin teilweise oder vollständig codieren, sollte die Sequenz zumindest eine ausreichende Länge aufweisen, so dass sie mit der endogenen mRNA des Vertebraten-eigenen Noggins hybridisieren kann. Typischerweise liegt eine ausreichende Sequenz-Größe (beispielsweise zur Verwendung als diagnostische Sonden) bei etwa 15 aufeinander folgenden Basen (DNA oder RNA) vor. Bei einigen diagnostischen und therapeutischen Anwendungen besteht möglicherweise der Wunsch, Noggin codierende Nucleotidsequenzen (die zur gesamten SEQ ID Nr. 10 oder SEQ ID Nr. 1 oder 14 (SEQ ID Nr. 23) oder einem Teil davon analog sind) in Antisense-Richtung, bezogen auf entweder SEQ ID Nr. 10 oder 1 oder 14 (SEQ ID Nr. 23), zu verwenden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung schlagen zur Amplifikation von Noggin aus anderen Arten (z. B. Mensch) einige bevorzugte Primer vor: 5'-Primer 1 (SEQ ID Nr. 12)
5'-Primer 2 (SEQ ID Nr. 13)
5'-Primer 3 (SEQ ID Nr. 14)
3'-Primer 1 (SEQ ID Nr. 15)
3'-Primer 2 (SEQ ID Nr. 16)
3'-Primer 3 (SEQ ID Nr. 17)
wobei N ein Gemisch aller vier Nucleotide darstellt und Gemische von zwei Nucleotiden durch Alternativen (beispielsweise A/G) dargestellt sind.
Obwohl das Noggin-Transkript in der Oocyte und im Embryo im Teilungs-Stadium nicht lokalisiert ist, sind zygotische Transkripte anfänglich auf das vermutliche dorsale Mesoderm beschränkt und erreichen ihre höchsten Mengen im Gastrula-Stadium in der dorsalen Lippe des Blastoporus (Spemann-Organisator). In der Neurula wird Noggin im Notochord und prächordalen Mesoderm transkripiert.
Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung Hypothesen über die embryologischen Wirkungen von Noggin formuliert, basierend darauf, wo es exprimiert wird, und basierend auf den Wirkungen der RNA-Injektion in Embryonen. Da Noggin im Spemann-Orginisator exprimiert wird, glauben die Erfinder, dass Noggin ein Mediator der Wirkungen des Spemann-Organisators, nämlich neurale Induzierung und Dorsalentwicklung des Mesoderms, ist. Die Erfinder haben gezeigt, dass Noggin die Nervengewebe-Bildung direkt induzieren kann. Da Noggin im Notochord und Kopf-Mesoderm exprimiert wird, ist anzunehmen, dass Noggin entweder die dorsal-ventralen Muster oder die anterior-posterioren Muster der Medullarplatte beeinflusst. Da Noggin in der Branchialbogen-Medullarwulst exprimiert wird, ist anzunehmen, dass es daher Einfluss darauf nehmen kann, ob die Medullarwulst-Zellen Knorpel einlagern, und auch das spätere Wachstum des Branchialbogens und den Umbau beeinflusst. Noggin wird in der Schwanzflossen-Medullarwulst exprimiert und da die Medullarwulst zum Wachstum der Flosse erforderlich ist, kann Noggin möglicherweise als Wachstumsfaktor für Epidermis oder Mesenchym wirken.
Obwohl ein Großteil der experimentellen Arbeit der Erfinder die Rettung der embryonalen Entwicklung umfasst, ist anzunehmen, dass Noggin auch als Zellfunktion des adulten Organismus exprimiert wird, weil in der wachsenden Schwanzknospe die Expression im Notochord bestehen bleibt und eine nicht kontinuierliche Linie gefärbter Zellen (was auf die an neuen Stellen initiierte Noggin-Expression hinweist) über die gesamte Länge der Dachplatte des Medullarrohres verläuft (und auch im Kopf-Mesoderm sichtbar ist).
Aufgrund seiner Eigenschaften wird für Noggin eine Reihe von Anwendungen vorgeschlagen. Die Noggin-cDNA sollte als diagnostisches Mittel geeignet sein (beispielsweise Verwendung von Oligonucleotiden als Primer in einem PCR-Test, um Sequenzen, die denen der Oligonucleotid-Primer ähnlich sind, zu amplifizieren und festzustellen, welche Menge von Noggin vorhanden ist, beispielsweise Primer wie die 5'-Primer 1–3 und die 3'-Primer 1–3).
Da Noggin ein Expressionsmuster aufweist, das vorschlägt, dass es zur Regulation der Knorpelproduktion im embryonalen Kopf verwendet wird, werden klinische Verwendungen von Noggin zur Regulation des Knorpel- und Knochenwachstums in therapeutischen Zusammensetzungen vorgeschlagen, insbesondere in Kombination mit anderen Wachstumsfaktoren aufgrund der Eigenschaft von Noggin, die Wirkung zumindest einiger Wachstumsfaktoren zu verstärken. Da Medullarwulst-Zellen erforderlich sind, damit die Froschlarven-Flosse wächst, scheint Noggin ein Wachstumsfaktor für die Gewebematrix und Epidermis zu sein und sollte sich für beispielsweise Zusammensetzungen zur Wundheilung als geeignet erweisen.
Wenn Noggin als Ligand in Komplexen angesehen wird, dann umfassen erfindungsgemäße Komplexe einen an Noggin gebundenen Antikörper, einen Antikörper, der an von Noggin stammende Peptide gebunden ist, an seinen Rezeptor gebundenes Noggin oder von Noggin stammende Peptide, die an dessen Rezeptor gebunden sind. Es ist davon auszugehen, dass mutierte Formen von Noggin, bei denen es sich entweder um stärkere Agonisten oder Antagonisten handelt oder die verbesserte Eigenschaften wie erhöhte biologische Verfügbarkeit aufweisen, klinisch nützlich sind. Solche Komplexe von Noggin und seinen Bindungsprotein-Partnern können in einer Reihe von Anwendungen eingesetzt werden.
Ein in einem Säuger-, Bakterien- oder viralen Expressionsvektor enthaltenes Oligonucleotid-Konstrukt umfasst eine Noggin codierende Sequenz und eine funktionell mit Noggin verbundende Promotor-Sequenz. Expression- und Clonierungs-Vektoren enthalten eine Nucleotidsequenz, die es dem Vektor ermöglicht, in einer oder mehreren ausgewählten Wirtszellen zu replizieren. Im allgemeinen handelt es sich bei dieser Sequenz in Clonierungs-Vektoren um eine Sequenz, welche es dem Vektor ermöglicht, unabhängig von den Wirts-Chromosomen zu replizieren, und welche Replikationsursprünge oder autonom replizierende Sequenzen enthält. Das wohlbekannte Plasmid pBR322 ist für die meisten gramnegativen Bakterien geeignet, der Ursprung des 2μ-Plasmides für Hefe, und verschiedene virale Ursprünge (SV40, Polyoma, Adenovirus, VSV oder BPV) lassen sich für Clonierungs-Vektoren in Säugerzellen einsetzen.
Expressions- und Clonierungs-Vektoren sollten ein Selektionsgen enthalten, das auch als selektierbarer Marker bezeichnet wird. Typischerweise handelt es sich dabei um ein Gen, das ein Protein codiert, das für das Überleben oder das Wachstum einer Wirtszelle, die mit dem Vektor transformiert ist, erforderlich ist. Die Gegenwart dieses Genes stellt sicher, dass eine beliebige Wirtszelle, bei der der Vektor entfernt wird, gegenüber transformierten Wirten keinen Vorteil bezüglich Wachstum oder Reproduktion erlangt. Typische Selektionsgene codieren Proteine, die (a) eine Resistenz gegen Antibiotika oder andere Toxine, beispielsweise Ampicillin, Neomycin, Methotrexat oder Tetracyclin vermitteln oder (b) einen auxotrophen Mangel komplementieren.
Beispiele geeigneter selektierbarer Marker für Säugerzellen sind Dihydrofolat-Reductase (DHFR) oder Thymidinkinase. Solche Marker ermöglichen die Identifizierung von Zellen, die kompetent waren und die Noggin-Nucleinsäure aufnehmen konnten. Die Säugerzell-Transformanten werden unter Selektionsdruck gegeben, bei dem nur die Transformanten eindeutig angepasst sind, so dass sie aufgrund der Tatsache, dass sie den Marker aufgenommen haben, überleben. Durch Kultivierung der Transformanten unter Bedingungen, bei denen die Konzentration eines Selektionsmittels im Medium allmählich geändert wird, wird ein Selektionsdruck erzeugt. Die Amplifikation ist ein Prozess, durch den Gene, für die bezüglich der Herstellung eines für das Wachstum kritischen Proteins ein größerer Bedarf besteht, innerhalb der Chromosomen aufeinander folgender Generationen rekombinanter Zellen in Tandemstellung wiederholt werden. Aus der amplifizierten DNA können daher erhöhte Noggin-Mengen synthetisiert werden.
Beispielsweise werden mit dem DHFR-Selektionsgen transformierte Zellen zuerst durch Kultivierung aller Transformanten in einem Kulturmedium, das Methotrexat (Mtx), einen kompetitiven Antagonisten von DHFR, identifiziert. Eine geeignete Wirtszelle in diesem Fall ist die Ovarial-Zellinie vom chinesischen Hamster (CHO), die einen Mangel in der DHFR-Aktivität aufweist, und die hergestellt und vermehrt wird, wie von Urlaub und Chasin, Proc. Nat. Acad. Sci., 77 (1980), 4216, beschrieben. Die transformierten Zellen werden dann erhöhten Mtx-Mengen ausgesetzt. Dies führt zur Synthese mehrfacher Kopien des DHFR-Gens und gleichzeitig mehrfacher Kopien anderer DNA umfassend die Expressions-Vektoren, beispielsweise die Noggin codierende DNA. In einer anderen Ausführungsform können Wirtszellen, die mit einem Expressions-Vektor transformiert sind, der Noggin und das Aminoglycosid-3'-Phosphotransferase (APH)-Protein codierende DNA-Sequenzen umfasst, durch Zellwachstum in einem Medium, das ein Aminoglycosid-Antibiotikum wie Kanamycin oder Neomycin oder G418 enthält, selektiert werden. Da eukaryotische Zellen normalerweise keine endogene APH-Aktivität exprimieren, können das APH-Protein, codierende Gene, die üblicherweise als neo-resistente Gene bezeichnet werden, als dominante selektierbare Marker für ein weites Spektrum eukaryotischer Wirtszellen verwendet werden, wobei mit dem Vektor transformierte Zellen leicht identifiziert werden können.
Anders als Clonierungs-Vektoren sollten Expressions-Vektoren einen Promotor enthalten, der vom Wirtsorganismus erkannt wird und funktionell mit der Noggin-Nucleinsäure verbunden ist. Promotoren sind untranslatierte Sequenzen, die stromaufwärts vom Start-Codon eines Strukturgenes (im allgemeinen innerhalb von etwa 100 bis 1000 bp) lokalisiert sind und die die Transkription und Translation der unter ihrer Kontrolle befindlichen Nucleinsäure kontrollieren. Sie gehören typischerweise zu zwei Klassen, nämlich induzierbaren und konstitutiven Promotoren. Induzierbare Promotoren sind Promotoren, die als Reaktion auf Veränderungen in den Kulturbedingungen, zum Beispiel Gegenwart oder Abwesenheit eines Nährstoffes oder einer Temperatur-Veränderung, eine erhöhte Transkription der unter ihrer Kontrolle befindlichen DNA initiieren. Gegenwärtig ist eine große Anzahl von Promotoren, die von einer Vielzahl potentieller Wirtszellen erkannt werden, gut bekannt. Diese Promotoren können mit der Noggin-codierenden DNA funktionell verbunden werden, indem sie über Restrektionsenzym-Spaltung von ihrem ursprünglichen Gen entfernt und anschließend in 5'-Richtung zum Startcodon für Noggin insertiert werden.
Eine Nucleinsäure ist funktionell verbunden, wenn sie in eine funktionelle Beziehung mit einer anderen Nucleinsäuresequenz gesetzt wird. Beispielsweise ist eine DNA für eine Präsequenz oder einen sekretorischen Leader mit einer DNA für ein Polypeptid funktionell verbunden, wenn dieses als Präprotein exprimiert wird, das an der Sekretion des Polypeptides beteiligt ist; ein Promotor oder Enhancer ist mit einer codierenden Sequenz funktionell verbunden, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomen-Bindungsstelle ist mit einer codierenden Sequenz funktionell verbunden, wenn sie so positioniert ist, dass sie die Translation fördert. Im Allgemeinen bedeutet „funktionell verbunden", dass die DNA-Sequenzen, die verbunden werden, benachbart sind und, im Fall eines sekretorischen Leaders, benachbart und im Leseraster sind. Die Verbindung wird durch eine Ligierung an geeigneten Restriktionsstellen erreicht. Wenn solche Stellen nicht existieren, dann werden entsprechend der herkömmlichen Praxis synthetische Oligonucleotid-Adaptoren oder Linker verwendet.
Die Transkription der Noggin-codierenden DNA in Säuger-Wirtszellen wird durch Promotoren kontrolliert, die aus den Genomen von Viren, wie dem Polyoma-Virus, dem Cytomegalovirus, dem Adenovirus, Retroviren, dem Hepatitis-B-Virus und am bevorzugtesten dem Affen-Virus 40 (SV40) oder von heterologen Säuger-Promotoren, zum Beispiel dem Actin-Promotor, erhalten werden. Für die anmeldungsgemäßen Zwecke lassen sich natürlich Promotoren aus der Wirtszelle oder verwandter Spezies einsetzen.
Insbesondere kann Noggin in E. coli exprimiert werden, vorzugsweise unter Verwendung von Vektoren, die folgende Bestandteile umfassen: einen lac UV5-Promotor, der vom Repressor des Lactose-Operon kontrolliert wird; eine starke Ribosomen-Bindungsstelle, beispielsweise die Ribosomen-Bindungsstelle des Bakteriophagen T7; eine Mutation in dem Replikations-Kontrollbereich des Plasmides, das die Kopienzahl erhöhen kann; und eine Mutation, die die Expression des Antibiotikaresistenz-Proteins beschränkt.
Noggin kann in einem Kanamycin-resistenten, von pBR322 abstammenden Plasmid hoher Kopienzahl unter der Kontrolle eines lac UV5-Promotors exprimiert werden. Außerdem kann Noggin in Insekten-Wirtszellen in einem Baculovirus unter der Kontrolle des Polyhedrin-Promotors des multiplen nucleären Polyhedrosis-Virus von Autographa californica exprimiert werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuartiger modifizierter Noggin-Moleküle sowohl zur Behandlung von Krankheiten oder Störungen, zu denen Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) gehört, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, als auch zur Behandlung anormalen Knochenwachstums als Folge von Hüftersatzoperationen, Trauma, Verbrennungen oder Rückenmarksverletzungen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zu Herstellung modifizierter Noggin-Moleküle, bei denen es sich nicht um die in der vorliegenden Erfindung spezifisch beschriebenen handelt und die verbesserte therapeutische Eigenschaften aufweisen.
Diese und andere Aufgaben werden erfindungsgemäß dadurch erreicht, dass Aminosäure-Deletionen im menschlichen Noggin-Protein dessen therapeutische Eigenschaften verbessern.
Die vorliegende Erfindung stellt sowohl ein humanes Noggin, das durch eine Deletion der Aminosäure-Reste 138–144 modifiziert ist, als auch ein humanes Noggin bereit, das durch eine Deletion der Aminosäure-Reste 133–144 modifiziert ist. Die vorliegende Erfindung stellt auch ein isoliertes Nucleinsäure-Molekül bereit, das ein modifiziertes humanes Noggin codiert. Das isolierte Nucleinsäure-Molekül kann ein rekombinantes DNA-Molekül sein, das funktionell mit einer Expressions-Kontrollsequenz verbunden ist. Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Wirtszelle bereit, die mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformiert ist.
Außerdem stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Noggin-Moleküls bereit, umfassend: (a) Züchten einer rekombinanten Wirtszelle, die das DNA-Molekül enthält, so dass das DNA-Molekül von der Wirtszelle exprimiert wird, um das modifizierte Noggin-Molekül zu produzieren, und (b) Isolieren des exprimierten, modifizierten Noggin-Moleküls. Das Verfahren kann in einer eukaryotischen Zelle oder einer prokaryotischen Zelle durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein modifiziertes humanes Noggin und einen Träger. Solche Zusammensetzungen können zur Behandlung von Krankheiten oder Störungen eingesetzt werden, zu denen, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP) und anormales Knochenwachstum, wie das pathologische Knochenwachstum als Folge von Hüftersatzoperation, Trauma, Verbrennungen oder Rückenmarksverletzung, gehören. Da Noggin und modifiziertes Noggin bekanntlich BMPs binden und antagonisieren, können die erfindungsgemäßen Moleküle zur Regulation der Prozesse verwendet werden, die an der Knochenproduktion und dem Knochen-Stoffumsatz beteiligt sind.
Erfindungsgemäß führen daher bestimmte Aminosäure-Deletionen im humanen Noggin-Protein zu einem modifizierten humanen Noggin-Protein, das in tierischen Seren eine verbesserte biologische Verfügbarkeit zeigt, wobei es die Fähigkeit zur Bindung an ein knochenmorphogenetisches Protein beibehält. Von einem solchen Noggin-Protein ist zu erwarten, dass es verbesserte therapeutische Eigenschaften aufweist.
Außerdem ist gezeigt worden, dass eine Pegylierung von Proteinen deren in vivo-Wirksamkeit durch Erhöhung der Stabilität und der biologischen Verfügbarkeit erhöht, während die Immunogenität minimiert wird. Es ist bekannt, dass die Eigenschaften bestimmter Proteine durch Anfügung von Polyethylenglykol (PEG)-Polymeren, die das hydrodynamische Volumen des Proteins erhöhen und dadurch dessen Clearance durch die Nieren-Filtration verlangsamen, moduliert werden können. (vgl. zum Beispiel Clark, R. et al., J. Biol. Chem., 271 (1996), 21969–21977). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben durch kovalente Bindung von Polyethylenglykol (PEG) an modifiziertes menschliches Noggin Moleküle mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften erzeugt.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Arzneimittel bereit, die ein in der vorliegenden Anmeldung beschriebenes modifiziertes Noggin-Molekül und einen geeigneten pharmazeutischen Träger umfassen.
Der Wirkstoff, der modifiziertes Noggin umfassen kann, sollte in einem geeigneten pharmazeutischen Träger zur systemischen oder lokalen Verabreichung in vivo mittels eines beliebigen Verabreichungsweges formuliert werden, wozu eine Injektion (zum Beispiel eine intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre, subkutane, endoneurale, perineurale, intraspinale, intraventrikuläre, intravitreale, intrathekale Injektion usw.), die Verabreichnung mittels Absorption durch epitheliale oder Schleimhaut-Auskleidungen (zum Beispiel orale Mukosa, rektale und intestinale Mukosa, usw.) oder die Verabreichung mittels eines Implantats mit verzögerter Freisetzung einschließlich eines zellulären oder Gewebe-Implantats gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Je nach Darreichungsform kann der Wirkstoff in einem flüssigen Träger wie Kochsalzlösung formuliert, in Liposomen-Mikrokapseln auf Polymer- oder Wachs-Basis und Präparaten mit kontrollierter Freisetzung eingeschlossen oder in Tabletten-, Pillen- oder Kapsel-Form formuliert werden.
Die Konzentration des in der Formulierung verwendeten Wirkstoffes hängt von der erforderlichen effektiven Dosis und der eingesetzten Darreichungsform ab. Die Dosis sollte ausreichend sein, um wirksame, im Blutkreislauf zirkulierende Plasma-Konzentrationen des Wirkstoffes zu erreichen. Effektive Dosen können anhand der Dosis-Reaktions-Kurven extrapoliert werden, die aus in vitro- oder tierischen Modell-Testsystemen abgeleitet werden.
Noggin-Präparate eignen sich als Standards in Testsystemen für Noggin und in Rezeptor-Bindungstests vom Kompetitions-Typ, wenn sie mit radioaktivem Iod, Enzymen, Fluorophoren, Spin-Markierungen und dergleichen markiert sind. Zur Aufbewahrung werden therapeutische Noggin-Formulierungen hergestellt, indem Noggin, das den gewünschten Reinheitsgrad aufweist, mit physiologisch verträglichen Trägern, Excipienten oder Stabilisierungsmitteln der Wahl in Form eines lyophilisierten Kuchens oder wässriger Lösungen gemischt werden. Verträgliche Träger, Excipienten oder Stabilisierungsmittel sind in den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen für den Rezipienten nicht toxisch und umfassen Puffer wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren, Antioxidantien einschließlich Ascorbinsäure, Polypeptide mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste) wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunoglobuline. Andere Bestandteile können Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin, Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine, Chelierungsmittel wie EDTA, Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit, salzbildende Gegenionen wie Natrium und/oder nicht-ionische oberflächenaktive Mittel wie Tween, Pluronics oder PEG umfassen.
Erfindungsgemäßes modifiziertes Noggin kann erfindungsgemäß wie a. a. O. beschrieben verwendet werden. Die Konzentration des in der Formulierung verwendeten Wirkstoffes hängt von der erforderlichen effektiven Dosis und der eingesetzten Darreichungsform ab. Die verwendete Dosis sollte ausreichend sein, um wirksame, im Blutkreislauf zirkulierende Plasma-Konzentrationen des Wirkstoffes zu erreichen. Effektive Dosen können aus Dosis-Reaktions-Kurven extrapoliert werden, die aus in vitro oder tierischen Modell-Testsystemen erhältlich sind.
Noggin kann in einem beliebigen pharmazeutisch verträglichen Träger verabreicht werden. Der Verabreichungsweg kann eine beliebige im Stand der Technik bekannte Darreichungsform umfassen, wozu, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, die intravenöse, intrathekale oder subcutane Injektion in das betroffene Gewebe, die intraarterielle, intranasale oder orale Verabreichung oder die Verabreichung über eine implantierte Vorrichtung gehören. Die vorliegende Erfindung stellt Arzneimittel bereit, die Noggin in einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfassen.
Die Verabreichung kann zur Verteilung von Noggin im ganzen Körper oder in einem begrenzten Bereich führen. Beispielsweise kann bei einigen Zuständen, die entfernte Bereiche des Nervensystems umfassen, eine intravenöse oder intrathekale Verabreichung von Noggin wünschenswert sein. In einer anderen Ausführungsform, die nicht beschränkend wirken soll, kann eine lokale Verabreichung wünschenswert sein, wenn begrenze Bereiche des Nervensystems involviert sind. In solchen Fällen kann ein Noggin enthaltendes Implantat in den von der Läsion betroffenen Bereich oder in dessen Nähe eingeführt werden. Geeignete Implantate umfassen einen Gelschaum, Wachs oder Implantate auf der Basis von Mikropartikeln, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.
Gegen Noggin gerichtete polyclonale Antikörper werden in Tieren durch mehrfache subkultane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen von Noggin und einem Adjuvans erzeugt. Es kann nützlich sein, Noggin oder ein die Ziel-Aminosäuresquenz enthaltendes Fragment mit einem Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen wirkt, zum Beispiel Keyhole-Limpet-Hämocyanin (Hämocyanin der Schlüssellochnapfschnecke), Serumalbumin, Rinder-Thyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsininhibitor, wobei ein bifunktionelles oder Derivatisierungsmittel, beispielsweise Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation durch Cystein-Reste), N-Hydroxysuccinimid (durch Lysin-Reste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl₂ oder R¹N = C = NR, verwendet wird.
Tiere können gegen die immunogenen Konjugate oder Derivate immunisiert werden, indem 1 mg oder 1 μg Konjugat (für Kaninchen beziehungsweise Mäuse) mit 3 Volumina komplettem Freund-Adjuvans kombiniert wird und die Lösung intradermal in mehrere Stellen injiziert wird. Einen Monat später erhalten die Tiere Auffrischungsinjektionen mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge des Konjugats in kompletten Freund-Adjuvans mittels subkutaner Injektion an mehreren Stellen. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen und das Serum wird im Hinblick auf den Titer der gegen Noggin gerichteten Antikörpers getestet. Die Tiere erhalten solange Auffrischungsinjektionen, bis der Titer ein Plateau erreicht. Vorzugsweise erhält das Tier eine Auffrischungsinjektion mit dem Konjugat des gleichen Noggin-Polypeptides, das jedoch mit einem anderen Protein und/oder über ein anderes Vernetzungsmittel konjugiert ist. Konjugate können auch in Kulturen rekombinanter Zellen als Protein-Fusionen hergestellt werden. Zur Erhöhung der Immunreaktion werden auch Aggregationsmittel wie Alaun verwendet.
Monoclonale Antikörper werden durch Gewinnung von Milzzellen aus immunisierten Tieren und Immortalisierung der Zellen in herkömmlicher Weise, beispielsweise mittels Fusion mit Myelom-Zellen oder mittels EB-Virus-Transfomation, und Screening auf Clone, die den gewünschten Antikörper exprimieren, hergestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform reagiert ein monoclonaler Ratten-Antikörper wie RP57-16, der nach Immunisierung einer Ratte mit rekombinantem humanem Noggin hergestellt wurde, spezifisch sowohl mit Xenopus- als auch humanem Noggin, nicht jedoch mit den Neurotrophinen BDNF, NT-3 und NT-4.
Gegen Noggin gerichtete Antikörper lassen sich für diagnostische Tests für Noggin oder dessen Antikörper einsetzen. In einer Ausführungsform eines Rezeptor-Bindungstestes wird eine Antikörper-Zusammensetzung, die an alle von mehreren ausgewählten Vertretern der Noggin-Familie bindet, an einer unlöslichen Matrix immobilisiert, die Testprobe wird mit der immobilisierten Antikörper-Zusammensetzung in Kontakt gebracht, so dass alle Vertreter der Noggin-Familie adsorbiert werden, und danach werden die immobilisierten Vertreter der Familie mit mehreren Antikörpern in Kontakt gebracht, die spezifisch für jeden Vertreter sind, wobei sich die Spezifität jedes der Antikörper für einen vorher bestimmten Familien-Vertreter, beispielsweise durch nur einmal vorkommende Markierungen wie diskrete Fluorophore oder dergleichen, individuell identifizieren lässt. Durch Bestimmung der Gegenwart und/oder der Menge jeder nur einmal vorkommenden Markierung kann der relative Anteil und die Menge jedes Vertreters der Familie bestimmt werden.
Gegen Noggin gerichtete Antikörper lassen sich auch zur Affinitätsreinigung von Noggin aus einer Kultur rekombinanter Zellen oder natürlichen Quellen verwenden. Gegen Noggin gerichtete Antikörper, die nachweisbar nicht mit anderen Wachstumsfaktoren kreuzreagieren, können zur Aufreinigung von Noggin, das frei von diesen anderen Familien-Vertretern ist, eingesetzt werden.
Erfindungsgemäße Ausführungsformen werden durch die folgenden Beispiele veranschaulicht.
BEISPIELE
Herstellung von Xenopus-Embrzonen
Xenopus-Embryonen wurden mittels des von Condie und Harland (Development, 101 (1987), 93–105) beschriebenen Protokolls hergestellt. Die Entwicklungsstadien der Embryonen wurden anhand der Tabelle von Nieuwkoop und Faber („Normal Table of Xenopus laevis" (Daubin), Amsterdam: North Holland, 1967) bestimmt. Ventralisierte Embryonen wurden mittels Bestrahlung mit einer Statalinker-Vorrichtung (Stratagene) erzeugt, und dorsalisierte Embryonen wurden durch Behandlung mit LiCl erzeugt, wie von den Erfindern der vorliegenden Erfindung in ihrem Artikel über bestimmte „wnt"-Proteine (bezeichnet als „Xwnt-8") beschrieben (Smith und Harland, Cell, Bd. 67 (1991), S. 753–765); durch Bezugnahme in die vorliegende Anmeldung einbezogen und nachstehend gelegentlich als „S&H, a. a. O." bezeichnet).
BEISPIEL 1
Isolierung und Sequenzierung der Noggin-cDNA
Die entsprechend ihrer Größe selektierte Plasmid-cDNA-Genbank aus LiCl-behandelten Embryonen in Stadium 11 wurde wie folgt konstruiert. Sechzig Mikrogramm Poly(A)-RNA aus LiCl-behandelten Embryonen in Stadium 11 wurden auf einem 10- bis 30%-igen Saccharose-Gradienten in Gegenwart von Methylquecksilber (II)-hydroxid entsprechend ihrer Größe fraktioniert. Der erste cDNA-Strang wurde aus 2 μg der entsprechend ihrer Größe fraktionierten Poly(A)-RNAs unter Verwendung eines Oligo(dT)-Oligonucleotids, das die Erkennungsstelle für NotI enthielt, als Sonde synthetisiert. Nach Synthese der zweiten Stranges wurden die cDNAs mit EcoRI-Methylase behandelt, mit EcoRI-Linkern ligiert, mit EcoRI und NotI gespalten und schließlich mit 125 ng modifiziertem pGEM-5Zf(-)(Promega) ligiert. Das verwendete Plasmid pGEM-5Zf(-) wurde durch Einfügen eines Oligonucleotides in die NsiI-Stelle modifiziert, um eine EcoRI-Stelle zu erzeugen. Der Vektor wurde nicht mit alkalischer Phosphatase behandelt, jedoch wurde die ausgeschnittene Polylinker-Sequenz auf einer Sepharose-4BCL-Säule entfernt. Die ligierten Produkte wurden zur Transformation von XL-I-Blue-Zellen (Stratagene) verwendet, wobei nach Plattierung 100.000 Kolonien pro 10 cm-Platte erhalten wurden. Aus den Platten-Kulturen wurden Plasmid-DNAs mittels eines alkalische Lyse und Polyethylenglykol-Präzipitation umfassenden Protokolls isoliert.
Die Dorsalentwicklung induzierende Aktivität in der Genbank wurde durch Injektion von RNA-Transkripten, die aus vereinigter Plasmid-DNA hergestellt wrden waren, getestet. Einzelkolonien wurden mittels eines Verfahrens der Geschwister-Selektion isoliert. Bei diesem Verfahren wurde die Plasmid-Genbank erneut auf 12 Platten ausplattiert, wobei pro Platte etwa 10-mal weniger Kolonien vorhanden waren. Aus den vereinigten Plasmid-DNAs, die von jeder Platte isoliert worden waren, wurde RNA synthetisiert und mittels Injektion in UV-ventralisierte Embryonen im Hinblick auf Aktivität getestet. Die vereinigten Plasmide mit einer Dorsalentwicklung induzierenden Aktivität wurden erneut ausplattiert und gescreent, wie vorstehend beschrieben. Dieses Verfahren wurde solange wiederholt, bis Einzelclone isoliert wurden.
Die in vitro-RNA-Synthese, der Injektionstest im Hinblick auf Rettung der dorsalen Achse und die Geschwister-Selektionen wurden auch durchgeführt, wie von den Erfindern in S&H, a. a. O. beschrieben.
Die Nucleotidsequenz beider Stränge des isolierten Noggin-cDNA-Clons wurde mittels des Didesoxy-Kettenabbruchverfahrens unter Verwendung von modifizierter T7-DNA-Polymerase (US Biochem) bestimmt. Deletionen wurden in Sequenzierungs-Matrizen durch Spaltung sowohl mit Restrektionsenzymen als auch mit Exonuclease III erzeugt (Henikoff, Meth. Enzymol, 155 (1987), 156–165).
In vitro – Translation
Ein halbes μg der in vitro synthetisierten Noggin-, Xwnt-8- und goosecoid-mRNAs wurden in einem Nuclease-behandelten Kaninchen-Reticulocytenlysat (Promega) mit zugegebenem ³⁵S-Methionin entsprechen den Anweisungen des Herstellers translatiert. Die Translationsprodukte wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (12%-ige Gele) und anschließender Fluorographie sichtbar gemacht. Das Noggin-Protein wies das Molekulargewicht auf, das aufgrund des offenen Leserahmens vorhergesagt worden war.
Isolierung und Analyse von RNA
Aus Embryonen und Oocyten wurde Gesamt-RNA mittels eines von Condie und Harland, a. a. O., beschriebenen Verfahrens im kleinen Maßstab isoliert. Dorsale Lippen wurden aus 30 nicht fixierten Embryonen in Stadium 10.5 dissiziiert und zur Präparation von Gesamt-RNA vereinigt. Proben, die Gesamt-RNA enthielten, die entweder 2,5 Embryonen oder etwa 2 μg Poly(A)+-RNA entsprach, wurden mittels Northern-Blot-Analyse analysiert. Nach dem Zufallsprinzip mit Primern versehene DNA-Sonden wurden aus einem 1323 bp-Fragment der Noggin-cDNA von der EcoRI-Stelle bei Nucleotid -83 bis zu einer EcoRV-Stelle, die im Vektor unmittelbar am 3'-Ende der cDNA liegt, hergestellt.
RNAse-Schutz-Tests wurden unter Verwendung eines von Melton et al. (Nuc. Acids Res., 12 (1984), 7035–7056) genau ausgeführten Protokolls mit kleineren Modifikationen (C. Kintner, Salk Institute, La Jolla, Kalifornien) durchgeführt. Ein mittels Exonuclease III erzeugter Deletions-Clon der Xenopus-Noggin-cDNA (entspricht 2A von Smith und Harland, Cell, 70 (1992), 829–840, der jedoch eine Deletion vom 3'-Ende bis Nucleotid 383 aufweist) wurde als Matrize zur Synthese von RNA-Sonden verwendet. Die Matrizen-DNA wurde durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym EcoRI linearisiert und unter Verwendung von T7-RNA-Polymerase wurde eine Antisense-RNA von 463 Basen mit eingebautem ³²P synthetisiert. Als Kontrolle für die RNA-Menge pro Probe wurde eine Antisense-EFIα-RNA-Sonde von 387 Basen verwendet. Vor Verwendung wurden die Sonden auf einem Gel aufgereinigt.
In situ-Hybridisierung
Nach Fixierung und Aufbewahrung wurden die Embryonen überprüft, um sicherzustellen, dass Blastocoel und Archenteron punktiert waren. Es wurde Sorge dafür getragen, dass sowohl das restliche Blastocoel von Neurulae und Larven als auch das Archenteron punktiert wurden. Embryonen wurden bei Raumtemperatur in 100% Ethanol erneut zwei Stunden gewaschen, um restliches Lipid zu entfernen. Nach Hybridisierung ließ man die Färbung die Nacht über entwickeln, und danach wurden die Embryonen in Bouin-Lösung fixiert. Frisch gefärbte Embryonen weisen einen starken Hintergrund mit einer rosa Färbung auf, wobei jedoch das meiste davon ausgewaschen wird und eine spezifische Färbung übrig bleibt. Nach einer Fixierung über Nacht wurden die Embryonen gründlich mit 70%-igem Ethanol, mit PBS gepuffertem 70%-igem Ethanol und Methanol gewaschen. Die Embryonen wurden in Murray-Gemisch gereinigt und mit einem Kodak-Ektar 25-Film unter Verwendung eines Zeiss-Axioplan-Mikroskops (2,5 oder 5 × Objektiv mit 3 × 12B-Teleskop zur Unterstützung der Fokussierung) fotografiert.
Nachweis von Abstammungslinien
Der Nachweis der Abstammungslinien mit mRNA, die nucleär lokalisierte B-Galactosidase codiert, erfolgte wie von den Erfindern in S&H, a. a. O., beschrieben. Ventralisierten Embryonen wurden im 32-Zellstadium 0,5 ng B-Galactosidase und 25 pg NogginΔ5'-mRNAs co-injiziert. Etwa in Stadium 22 wurden die Embryonen fixiert und mit X-gal gefärbt.
Ergebnisse
Noggin-cDNA codiert ein neuartiges Polypeptid
Die 1833 Nucleotide umfassende Sequenz des selektierten Clons ist in 2A von Smith und Harland, Cell, 70 (1992), 829–840, gezeigt und wird gelegentlich als „Clon A3" bezeichnet. Die Sequenz enthält einen einzigen langen offenen Leserahmen, der ein 222 Aminosäure umfassendes Polypeptid mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 26 kDa codiert. Der am Amino-Terminus gelegene hydrophobe Abschnitt von Aminosäuren legt nahe, dass das Polypeptid in den sekretorischen Stoffwechselweg eintritt. Bei Aminosäure 61 (Asn) gibt es eine einzige potentielle Stelle für die N-verbundene Glycosylierung. Sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende des Leserahmens befinden sich ausgedehnte untranslatierte Bereiche (593 bzw. 573 bp). Der am 3'-Ende befindliche untranslatierte Bereich ist besonders reich an wiederholten dA- und dT-Nucleotiden und enthält neben einer Polyadenylierungs-Signalsequenz, die 24 by stromaufwärts vom Start des Poly A-Schwanzes gelegen ist, 147 by weiter stromaufwärts eine zweite potentielle Polyadenylierungs-Sequenz.
Sense-RNA, die von Clon A3 mit SP6-RNA-Polymerase synthetisiert worden war, wurde in einem Kaninchen-Reticulocytenlysat-System translatiert. Die 3S-markierten Produkte wurden auf einem 12%-igen SDS-Polyacrylamid-Gel fraktioniert und mittels Fluorographie sichtbar gemacht. Das Haupt-Proteinprodukt wies das erwartete Molekulargewicht von etwa 26 kDa auf.
Bei einem Vergleich der Aminosäuresequenz des vorhergesagten Polypeptides mit dem BLAST-Netzwerk des National Center for Biotechnology Information (nicht redundante Datenbasis) wurde keine ähnliche Sequenz identifiziert. Dieser Clon codiert daher einen neuen Typ eines Proteins, das von den Erfindern als „Noggin" bezeichnet wurde, das sezerniert wird und das in Xenopus eine die Dorsalentwicklung induzierende Aktivität aufweist.
Noggin-mRNA kann eine vollständige dorsal-ventrale Achse retten
Die Injektion von Noggin-RNA in ein einziges Blastomer eines im Vierzell-Stadium befindlichen UV-ventralisierten Embryos kann das vollständige Spektrum dorsaler Strukturen wiederherstellen. Das Ausmaß der Achsen-Rettung war von der injizierten RNA-Menge abhängig, wobei Embryonen, die geringe Dosen erhalten hatten, nur posterior-dorsale Strukturen aufwiesen, während Embryonen, die höhere Dosen erhalten hatten, im Überschuss vorliegendes dorsal-anteriores Gewebe aufwiesen. Es wurden RNA-Transkripte von 2 Noggin-Plasmiden getestet. Das erste enthielt die vollständige cDNA. Das zweite (pNogginΔ5') wies eine Deletion auf, wobei die ersten 513 Nucleotide des 5'-untranslatierten Bereiches bis zur EcoRI-Stelle entfernt wurden. Die nach Injektion von RNA-Transkripten dieser beiden Plasmide erhaltenen Embryonen wurden ebenso wie die zum Vergleich dienenden Embryonen, die unter Verwendung von Xwnt-8-RNA erhalten worden waren, zur Auswertung entsprechend der Dorsoanterior-Index (DAI)-Skala von Rao und Elinson (Dev. Biol., 127 (1988), 64–77) herangezogen. In dieser Skala wird ein vollständig ventralisierter Embryo mit Null eingestuft, ein normaler Embryo wird mit 5 eingestuft und die Embryonen mit den schwersten Dorsoanterior-Veränderungen, nämlich die, die radiale Dorsoanterior-Strukturen aufweisen, werden mit 10 eingestuft. Von pNogginΔ5' synthetisierte RNA (NogginΔ5'-mRNA) führte wiederholt zu einem höheren DAI-Wert als eine äquivalente mRNA-Menge, die von der vollständigen cDNA synthetisiert worden war. Die Dosis-Abhängigkeit der Achsen-Rettung durch NogginΔ5'-mRNA war der von Xwnt-8-mRNA sehr ähnlich.
UV-behandelten Embryonen wurde auch eine höhere Dosis (1000 pg) der Noggin-mRNAs injiziert. Die Injektion dieser Dosis von Noggin-mRNA in ein Blastomer im Vierzell-Stadium führte zu Embryonen mit einer sehr schweren HyperDorsalentwicklung (DAI > 7). Die meisten dieser Embryonen starben jedoch im späten Gastrula-/ frühen Neurula-Stadium. Offensichtlich führten übermäßig starke Gastrulationsbewegungen dazu, dass das Blastocoel-Dach dünner wurde und zerriss. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben diese Wirkung auch bei hohen Dosen injizierter Xwnt-8-mRNA beobachtet.
Die Rettung der dorsalen Entwicklung sowohl durch NogginΔ5'-mRNA als auch durch Xwnt-8-mRNA folgte einem übereinstimmenden Muster, wobei sich erhöhende Mengen der mRNAs dazu führten, dass fortschreitend mehr anteriore Strukturen gerettet wurden. Beispielsweise wurden bei Embryonen, die 1 pg der RNAs erhalten hatten, hauptsächlich die posterioren und Rumpf-Dorsalstrukturen gerettet, wobei ihnen zum größten Teil Kopfstrukturen fehlten. Höhere Dosen (10 oder 100 pg) der beiden RNAs führten zu Embryonen mit einer stärker ausgeprägten anterioren Entwicklung, wobei viele davon entweder nahezu normale oder hyperdorsalisierte Phänotypen aufwiesen.
In Blastomeren injiziertes Noggin wirkt als Nieuwkoop-Zentrum
Es wurde untersucht, welche Wirkung die Veränderung der Noggin-mRNA-Injektionsstelle hat. UV-behandelten Embryonen im 32-Zellstadium wurden entweder 0,5 ng B-Galactosidase-mRNA allein oder 0,5 ng B-Galactosidase, gemischt mit 25 pg NogginΔ5'-mRNA, injiziert. Eine Injektion von Noggin-mRNA in Blastomeren der vegetalen Schicht ergab Embryonen mit der am stärksten ausgeprägten Dorsoanterior-Entwicklung. In beiden Fällen, wo die Injektion in vegetale Bereiche der Embryonen erfolgte, wurde die nucleäre X-Gal-Färbung fast ausschließlich im Endoderm gefunden (die mRNA codiert eine B-Galactosidase, die in den Nucleus transloziert, so dass eine Unterscheidung zu der diffusen Hintergrundfärbung ermöglicht wird). Einer der gezeigten Embryonen wies infolge der Noggin-mRNA-Injektion eine starke hyperdorsale Entwicklung auf (DAI etwa 7) und hatte einen stark verkürzten Schwanz und vergrößerte Kopfstrukturen. Embryonen wurden auch mittels Noggin-mRNA-Injektionen in die marginale Zone gerettet. Bei diesen Embryonen wurde die B-Galactosidase-Färbung hauptsächlich im axialen und Kopf-Mesoderm beobachtet. Eine Injektion der Noggin-mRNA in den animalen Pol hatte nur eine sehr geringe Wirkung auf die Achsenbildung. Ebenso hatte B-Galactosidase-mRNA allein keine Wirkung.
Noggin-mRNA wird sowohl mütterlich als auch zygotisch exprimiert
Bei einer Northern-Blot-Analyso von RNA aus Xenopus-Embryonen wurden zwei Noggin-mRNA-Arten mit Größen von etwa 1,8 und 1,4 kb beobachtet. Eine relativ geringe Menge der Noggin-mRNA wurde in Oocyten nachgewiesen. In Stadium 11 war die Menge der Noggin-mRNA signifikant höher, was die zygotische Transkription widerspiegelt (im Vergleich zu den mütterlich eingelagerten Transkripten, die in Oocyten zu sehen sind). Die Noggin-mRNA blieb bis zu dem letzten untersuchten Stadium (Stadium 45) erhöht.
Die Erfinder erwarten, dass die primäre dorsalisierende RNA in ihrer Genbank bei LiCl-behandelten Embryonen im Vergleich zu normalen oder UV-behandelten Embryonen erhöht ist. Eine Behandlung mit Lithium-Ionen führte im Vergleich zu unbehandelten Embryonen zu einer starken Erhöhung der exprimierten Noggin-mRNA.
Eine UV-Behandlung hatte die entgegengesetzte Wirkung. In Gesamt-RNA-Proben aus diesen Embryonen ließ sich eine Noggin-mRNA-Expression im Wesentlichen nicht nachweisen. Die mit großer Häufigkeit vorkommende Noggin-mRNA in manipulierten Embryonen entspricht daher der Rettungs-Aktivität.
Die Erfinder analysierten die Verteilung von Noggin in Oocyten und Embryonen im Furchungsstadium. Da die Menge der mütterlich eingelagerten Noggin-RNA für eine in situ-Hybridisierung zum Nachweis oberhalb des Hintergrund-Niveaus zu gering ist, verwendeten die Erfinder einen RNAse-Schutztest. Oocyten wurden in die animalen und vegetalen Hälften dissiziiert. In keiner der Hemisphären wurde eine Anreicherung von Noggin-mRNA, bezogen auf die Oocyten-Gesamt-RNA, festgestellt. Embryonen im Vierzell-Stadium wurden sowohl in die dorsalen und ventralen Hälften als auch in die animalen und vegetalen Hälften dissiziiert. Es stellte sich heraus, dass Noggin-Trankripte in den dorsalen und ventralen Hälften gleichmäßig verteilt waren, ebenso in den animalen und vegetalen Hälften. Das gleiche Ergebnis wurde bei Embryonen erhalten, die unmittelbar nach Befruchtung in eine Schräglage von 90° gebracht und dann mit einem Vitalfarbstoff an ihrer obersten Seite markiert wurden, um die zukünftige dorsale Seite darzustellen. Ältere Blastula-Embryonen (32 Zellstadium) wurden ebenfalls in die dorsal-ventralen und animal-vegetalen Hälften dissiziiert. In keiner der Hemisphären wurde eine Anreicherung von Noggin-mRNA, bezogen auf den Gesamt-Embryo, festgestellt. Außerdem wurde durch die Behandlung das reichliche Vorkommen mütterlich eingelagerter Noggin-RNA nicht geändert, was darauf hinweist, dass in ventralen Geweben kein bevorzugter Abbau erfolgt. Bei dem RNAase-Schutztest wurden Proben mit bekannten Mengen der in vitro synthetisierten Noggin-mRNA einbezogen. Aufgrund dieser und anderer Daten schätzen die Erfinder, dass pro Embryo im Blastula-Stadium etwa 0,1 pg Noggin-mRNA vorliegen und pro Embryo im Gastrula-Stadium 1 pg.
Die Lokalisierung von Noggin-Transkripten wurde bei Embryonen im frühen Gastrula-Stadium untersucht. Dorsale Lippen wurden aus Embryonen in Stadium 10.5 dissiziiert. Bei einer Northern-Blot-Analyse wurden gleiche Mengen von Gesamt-RNA aus intakten Embryonen, dissiziierten dorsalen Lippen und dem nach Dissektion der dorsalen Lippe verbleibenden Rest des Embryo mit einer Noggin-Sonde hybridisiert und dann erneut mit einer EFIα-Sonde als Kontrolle für die pro Probe aufgetragene RNA-Menge hybridisiert. Das Autoradiogramm des Blots zeigte, dass in diesem Stadium Noggin-mRNA in der dorsalen Lippe angereichert ist.
In situ-Hybridisierung: Zygotische Expression von Noggin im Spemann-Organisator
Die Lokalisierung von Noggin-Transkripten bei sich entwickelnden Embryonen wurde unter Verwendung vollständiger Präparate mittels in situ-Hybridisierung genauer untersucht. Ganze fixierte Embryonen wurden mit Digoxigenin enthaltenden RNA-Sonden hybridisiert.
Hybridisierte RNA-Sonden wurden danach mit einem Antikörper gegen Digoxigenin, der mit alkalischer Phosphatase konjugiert war, sichtbar gemacht. Die Spezifität der mit Antisense-Noggin-Sonden festgestellten Hybridisierung wurde sowohl durch Hybridisierung von Embryonen mit Sense-Noggin-Sonden als auch unter Verwendung von zwei nicht überlappenden Antisense-Sonden getestet. Sowohl aufgrund der geringen Expression als auch der Hintergrundfärbung konnte Noggin-mRNA vor dem späten Blastula-Stadium nicht eindeutig nachgewiesen werden. Die erhöhte Menge von Noggin-mRNA, die nach Aktivierung der zygotischen Transkription mittels Northern-Blot-Analyse nachgewiesen worden war, war bei einer in situ-Hybridisierung in Stadium 9 als Haufen gefärbter Zellen auf der dorsalen Seite des Embryos sichtbar. Vom vegetalen Pol aus betrachtet, beschränkte sich dieser Zellhaufen auf einen Sektor von etwa 600. Eine seitliche Ansicht des gleichen Embryos zeigt, dass die gefärbten Zellen innerhalb der marginalen Zone (d. h. zwischen dem animalen und dem vegetalen Pol und innerhalb des Bereiches, der vermutlich dorsales Mesoderm bildet) befanden. In diesem Stadium sind die Transkripte größtenteils auf den Nucleus beschränkt.
Eine seitliche Ansicht eines Embryos im frühen Gastrula-Stadium 30 (etwa Stadium 10.5) zeigt eine spezifische Hybridisierung hauptsächlich in dem sich involutierenden Mesoderm an der dorsalen Lippe. Eine vegetale Ansicht des gleichen Embryos (Blastoporus-Lippe mit einem Pfeil versehen) zeigt, dass Noggin-mRNA am häufigsten auf der dorsalen Seite vorkommt, wobei sich jedoch eine geringere Expression bis zur ventralen Seite des Embryos erstreckt. Mittels dieses Verfahrens der in situ-Hybridisierung werden keine Transkripte in dem dotterreichsten endodermalen Bereich von Embryonen nachgewiesen, so dass die Erfinder eine Expression in vegetaleren Bereichen als denen, die in der Figur zu sehen sind, nicht ausschließen können. Behandlungen, von denen bekannt ist, dass sie die Größe der dorsalen Lippe beeinflussen (LiCl-Behandlung, UV-Bestrahlung), hatten eine starke Wirkung auf das Muster der Noggin-in situ-Hybridisierung. Bei LiCl-behandelten Embryonen ist die Färbung in der ganzen marginalen Zone intensiv. Durch eine UV-Behandlung wird das Hybridisierungs-Signal auf geringe Mengen vermindert. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit den Mengen von Noggin-mRNA, die mittels Northern-Blot-Analyse zu festzustellen sind. Der UV-behandelte Embryo dient auch als Negativkontrolle für die Spezifität der Hybridisierung.
Mit fortschreitender Gastrulation folgt die Noggin-mRNA-Färbung dem involutierenden Mesoderm und ist im vermutlichen Notochord am höchsten. Im späten Neurula-Stadium (etwa 18) sind Noggin-mRNA exprimierende Zellen am deutlichsten in dem am weitesten dorsal gelegenen Mesoderm zu sehen, hauptsächlich im Notochord, wobei sie sich jedoch auch in stärker anterior ausgerichtete Gewebe bis zum prächordalen Mesoderm erstrecken. Die vordere Spitze des Notochord ist mit einem Pfeil versehen. Während der Schwanzknospen-Stadien geht die Expression von Noggin im dorsalen Mesoderm zurück, obwohl die Expression im Notochord in der wachsenden Schwanzknospe bestehen bleibt. Die Expression von Noggin wird an verschiedenen neuen Stellen injiziert, was mit zunehmender Reifung der Froschlarve zunehmend klarer wird. Eine nicht kontinuierliche Linie gefärbter Zellen verläuft über die Länge der Dachplatte des Medullarrohres. Eine Färbung ist auch im Kopf-Mesoderm, hauptsächlich in den Kiefern- und Kiemebögen, sichtbar. Vermutlich entspricht diese Expression den skeletogenen Medullarwulst-Zellen. Außerdem exprimieren Untergruppen dieser Zellen Homeobox-Gene, die in Anterior-Posterior-Bereichen unterschiedliche Mengen der Kopf-Medullarwulst markieren, so ist beispielsweise En-2 im Kiefernbogen mittels Antikörper-Färbung zu sehen. In der Schwanzflosse wurden aufgrund der Noggin-mRNA Zellen mit sternartiger Morphologie gefärbt. Diese sternförmigen Zellen stammen wahrscheinlich auch von der Medullarwulst ab. Mit der Sense-Sonde oder einer Reihe anderer Sonden wurde keines dieser Muster festgestellt.
Beispiel 2
In COS-Zellen transfizierte Noggin-cDNA erzeugt aktives konditioniertes Medium
Für COS-Zellen wurde die Noggin-cDNA in einen COS-Zell-Expressionsvektor insertiert. COS-Zellen wurden transfiziert und nach Expression der eingeführten Noggin-Gene wurde Medium geerntet. Dieses Medium ist in einem Testsystem unter Verwendung animaler Kappen im Hinblick auf Mesoderm-induzierende oder Dorsalentwicklung induzierende Aktivität getestet worden. Die Erfinder haben zwei Transfektions-Protokolle getestet, nämlich ein Standard-Protokoll, wobei Zellen geerntet und danach in ein serumfreies Medium überführt wurden, und ein alternatives Protokoll, wobei Zellen in ein definiertes Medium überführt werden, dem Serum fehlt, das jedoch Transferrin, Insulin und BSA enthält. In dem angereicherten Medium bleiben die Zellen gesund und ein co-transfiziertes (3-Galactosidase-Gen zeigt eine 100-fach höhere Aktivität als im nicht angereicherten Medium. Die bei der Behandlung von Zellen mit diesen Medien erhaltenen Ergebnisse sind nachstehend in Tabelle 1 gezeigt. Ventralisierien Tieren wurden animale Kappen entnommen, behandelt und am Ende der Neurulation im Hinblick auf eine Verlängerung beurteilt, was üblicherweise ein Zeichen dafür ist, dass Notochord- oder Nerven-Gewebe induziert wurden. Eine Verlängerung ist in Tabelle 1 als „+" angegeben und eine noch größere Verlängerung als „++", Außerdem wurden sie mittels Northern-Blot-Analyse bezüglich eines molekularen Markers beurteilt.
Wie die Daten von Tabelle 1 zeigen, hat die Noggin-cDNA eine große Wirkung auf das durch COS-Zellen konditionierte Medium. Noggin tritt jedoch wahrscheinlich mit irgendeiner Substanz im Medium in Wechselwirkung, da durch COS-Zellen konditioniertes Medium allein eine gewisse Aktivität aufweist. Möglicherweise bewirkt Noggin, dass die Zellen eine Substanz sezernieren, die normalerweise nicht sezernieren würde, wobei die Experimente jedoch darauf hindeuten, dass Noggin sezerniert wird und für einen Teil der Aktivität verantwortlich ist.
Tabelle 1 COS-Zell-konditioniertes Medium: Wirkungen auf animale Kappen
In Oocyten injizierte Noggin-mRNA erzeugt aktives sezerniertes Noggin-Protein
Eine zweite Vorgehensweise zur Untersuchung, ob ein Protein in aktiver Form sezerniert werden kann, besteht darin, mRNA in Oocyten zu injizieren und das durch die Oocyte sezernierte Material zu gewinnen. Ein besonderer Vorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass injizierte mRNA effizient translatiert wird, wobei die Translation der Oocyte zum größten Teil an der injizierten mRNA erfolgt. Ein neues Protein, dessen Synthese durch die injizierte Noggin-mRNA kontrolliert wird, wird in das Medium sezerniert. Noggin und Activin weisen deutliche synergistische Wirkungen auf, wobei verlängerte Explantate erzeugt werden, die erhöhte Mengen von Muskel-Actin exprimieren.
Biochemische Eigenschaften von Noggin
Injizierten Oocyten wird mRNA injiziert und es erfolgt eine Markierung mit ³⁵S-Methionin. Der größte Teil des in das Medium sezernierten radioaktiven Proteins stammt von der injizierten mRNA. Das Noggin-Protein, das fast isotopisch rein ist, kann dann analysiert werden. Anhand dieser Analyse haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung ermittelt, dass Noggin ein als Dimer vorliegendes Glycoprotein ist. Bei Auftrennung unter reduzierenden Bedingungen und Behandlung mit N-Glycanase zur Entfernung von Zuckerresten wandert Noggin nur ein wenig langsamer als aufgrund seines vorhergesagten Molekulargewichts von 26 kDa erwartet. Die Entfernung der Zucker-Seitenketten führt zu einem Verlust von etwa 4 kDa, bezogen auf ein apparentes Ausgangs-Molekulargewicht von 33 kDa. Bei Auftrennung unter nicht reduzierenden Bedingungen wandert es bei dem doppelten Wert.
Die Erfinder wissen noch nicht, ob das Dimer des Proteins die aktive Form ist und ob es eine proteolytisch prozessierte Form gibt, die aktiv ist. Bei einem Kontroll-Experiment mit Activin-mRNA erzeugen Oocyten eine Activin-Aktivität, wobei jedoch der Großteil des radioaktiv markierten Proteins als Präcursor-Form wandert. Nur eine kleine Menge des prozessierten Proteins (15 kDa) wurde nachgewiesen. Es ist möglich, dass Oocyten, denen Noggin injiziert wurde, überwiegend unprozessiertes Protein und ein extrem aktives prozessiertes Protein in Spurenmengen sezernieren, das die Erfinder nicht nachgewiesen haben. Trotz dieser Zweifel besteht das bei der Analyse der injektionsbehandelten Oocyten und transfizierten COS-Zellen erhaltenen Hauptergebnis darin, das aktives Noggin als frei lösliches sezerniertes Polypeptid erhalten werden kann. Dies ist der Unterschied zu der anderen Gen-Gruppe mit einer die Dorsalentwicklung induzierenden Aktivität, nämlich den wnts-Genen. Wnt-Proteine sind nicht in löslicher Form erhältlich und dies hat die Analyse ihrer biologischen Aktivitäten und des Rezeptors, der an sie bindet, stark behindert.
Beispiel 3
Clonierung des Maus-Noggin-Homologs
Es ist derzeit nicht möglich, in sich entwickelnden Xenopus-Embryonen die zygotische Noggin-Transkription auszuschalten. Im Gegenteil dazu sollte es möglich sein, in der Maus homozygote Null-Mutationen zu erzeugen. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Maus-Noggin-cDNA cloniert. Diese eignet sich zur Erzeugung mutierter Mäuse. Neben der Erzeugung der Sonden und Mittel zu Herstellung von Maus-Mutanten sollte ein Vergleich der Noggin-Sequenzen geeignet sein, konservierte Domänen und Funktionen vorherzusagen. Die 80 C-terminalen Aminosäuren sind bei Xenopus- und Maus-Noggin zu 87% identisch.
Maus-Noggin wurde aus einer embryonalen cDNA-Genbank isoliert, indem diese mit einer radioaktiv markierten Frosch-Noggin-cDNA als Sonde unter Bedingungen mäßiger Stringenz (wie vorstehend definiert) inkubiert wurde. Anschließend wurde ein genomischer Clon isoliert, indem eine genomische Genbank mit der Maus-Noggin-cDNA 15 als Sonde unter Bedingungen hoher Stringenz (wie definiert, wobei jedoch die Hybridisierung bei 42°C erfolgte und das Waschen bei 50°C in 15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat) inkubiert wurde. Sowohl die Nucleotidsequenz der Maus-Noggin-cDNA voller Länge (SEQ ID Nr. 10) als auch die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID Nr. 11) sind in den 13A–13B gezeigt. Zwischen Maus-Noggin und humanem Noggin gibt es nur zwei Aminosäure-Unterschiede.
Beispiel 4-Clonierung des humanen Noggin-Homologs
Materialien und Verfahren
Sonden-Herstellung
Auf der Basis der Maus-Noggin-Sequenz (a. a. O.) wurden zwei Oligonucleotide synthetisiert. Die Oligonucleotidsequenz für Noggin-5'ist: 5'-CAG ATG TGG CTG TGG TCA-3' (SEQ ID Nr. 18), was den Aminosäuren QMWLWS (SEQ ID Nr. 19) entspricht, und für Noggin-3': 5'-GCA GGA ACA CTT ACA CTC-3' (SEQ ID Nr. 20), was den Aminosäuren ECKCSC (SEQ ID Nr. 21) des Maus-Noggin-Proteins entspricht.
Die Oligonucleotide wurden zur PCR-Amplifikation eines DNA-Abschnittes von 260 Nucleotiden unter Verwendung eines Maus-cDNA-Clons, der wie in Beispiel 3 dargelegt hergestellt wurde, als Matrize eingesetzt. Das amplifizierte Fragment wies eine Nucleotidsequenz auf, die den Nucleotiden 856 durchgehend bis 1116 der in 13 gezeigten Maus-Sequenz (SEQ ID Nr. 10) entspricht. Nach Amplifikation wurde die PCR-Reaktion einer Elektrophorese auf Agarose-Gelen unterworfen, die DNA-Bande von 260 Nucleotiden wurde mittels „Magic PCR" (Promega) aufgereinigt und als Matrize für die Sonden-Markierungsreaktion verwendet. Die Sonde wurde unter Verwendung einer Standard-PCR-Reaktion (Perkin-Elmer) mit 20 ng DNA-Matrize und 0,2 mCurie von alpha-³²P-dCTP (Du Pont; 3000 Ci/mmol) anstelle von dCTP markiert. Die nicht eingebaute Markierung wurde auf einer G50-NICK-Säule (Pharmacia) von den Sonden getrennt. Das ausgeschlossene Volumen der Reaktion enthielt insgesamt 1,8 × 108 cpm.
Außerdem wurde ein als Noggin-D bezeichnetes degeneriertes Oligonucleotid, das den konservierten Maus- und Xenopus-Noggin-Sequenzen entspricht, wie folgt synthetisiert: Noggin D: 5'- GAR GGI ATG GTI TGY AAR CC-3' (SEQ ID Nr. 22). Noggin D (SEQ ID Nr. 22) wurde mittels Kinase-Reaktion unter Verwendung von T4-Polynucleotidkinase und gamma-³²P-ATP markiert. Das markierte Oligonucleotid wurde mittels einer NAP5 (Pharmatia)-Säule aufgereinigt und zur Hybridisierung der Genbank verwendet.
Durchmustern der Genbank
Eine humane genomische Plazenta-Genbank (Clontech Cat#HL1067J, durchschnittliche Insertionsgröße 15 kb) im Vektor EMBL-3 wurde entsprechend den Anweisungen des Herstellers in E. coli NM 538 ausplattiert. Etwa 3 Millionen Plaques wurden in drei Replikaten (bezeichnet als A, B und C) auf Nitrocellulose-Filter (BA-85; Schleicher und Schuell) überführt und gemäß Maniatis et al. (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual, (1989), CSH Lab Press, New York) durchmustert. Die Replikat-Filter A und C wurden in einem Puffer, enthaltend 0,5 M Natriumphosphat, pH-Wert 7,2, 7 Natriumdodecylsulfat, 1% kristallines BSA, 1 mM EDTA, 40 mg/ml denaturierte Lachs-Sperma-DNA und etwa 1 × 106 cpm/ml PCR-Sonde (a. a. O.), hybridisiert. Nach einer 12-stündigen Hybridisierung bei 65°C wurden die Filter zweimal bei Raumtemperatur in 2 × SSC (30 mM Natriumcitrat, 0,3 M NaCl), 0,1% SDS und danach 20 min bei 65°C in 2 × SSC, 0,1 % SDS, gewaschen und auf einen Kodak-X-OMAT-AR-Film aufgelegt. Die Replikat-Filter B wurden mit dem markierten Oligonucleotid Noggin-D 12 h in 6 × SSC, 0,1% SDS bei 51°C hybridisiert, anschließend in 2 × SCC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur und in 6 × SSC, 0,1% SDS bei 50°C gewaschen und auf einen Kodak-X-OMAT-AR-Film aufgelegt. Von allen Replikaten wurden positive Plaques isoliert und mittels eines vorstehend beschriebenen erneuten Screenings aufgereinigt. Aufgereinigte positive Plaques wurden in 500 μl SM (100 mM NaCl, 10 mM MgSO₄ × 7H₂O, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,01% Gelatine) suspendiert. 160 μl Phagen-Suspension wurden mit 0,5 ml gesättigter NM538-Kultur gemischt, 20 min bei 37°C inkubiert und danach in 250 ml LB, enthaltend 10 mM MgSO₄ und 0,2% Maltose, überimpft. Die Kulturen wurden bei 37°C bis zur Zell-Lyse (7–8 h) inkubiert. Die Phagen-Lysate wurden zur Phagen-DNA-Aufreinigung mittels des Qiagen-Verfahrens nach den Empfehlungen des Herstellers (Qiagen) verwendet.
Sequenzierung
Die Sequenzierung wurde unter Verwendung der automatischen Sequenziervorrichtung Modell 373A von Applied Biosystems und des Sequenzierungs-Kits Taq-DyeDeoxy^TM-Terminator-Cycle von Applied Biosystems durchgeführt.
Ergebnisse
Filter, die mit den PCR-Maus-Noggin-Sonden (SEQ ID Nr. 18 und 20) hybridisierten, zeigten zwei starke Signale, die den als hnogλ-9 und hnog-10 bezeichneten Phagen-Plaques entsprachen. Diese Plaques hybridisierten auch mit der degenerierten Oligonucleotid-Sonde Noggin-D (SEQ ID Nr. 22), was zeigte, dass diese Clone dem humanen Noggin-Gen entsprachen. Außerdem erzeugten zwei andere, als hnogλ-5 und hnogλ-7 bezeichnete Plaques bei Hybridisierung mit den PCR-Sonden etwas schwächere Signale. Diese Clone entsprechen entweder dem humanen Noggin-Gen oder (einem) verwandten Gen(en). Alle humanen DNA-Insertionen können unter Verwendung bekannter Restriktionsstellen, die in der für jede spezifische Genbank betreffenden Literatur beschrieben sind, ausgeschnitten werden.
Ein das humane Noggin-Gen enthaltendes SacI-Fragment von 1,6 kb des Clons hnogλ-9 wurde subcloniert und die Nucleotidsequenz wurde wie in den 1A–1B dargelegt bestimmt. Die aus der Nucleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz für humanes Noggin ist auch in den 1A–1B gezeigt. Da Gen oder die cDNA kann in verschiedenen eukaryotischen oder prokaryotischen Expressions-Systemen exprimiert werden, um biologisch aktives humanes Noggin-Protein herzustellen. Es ist zu erwarten, dass das humane Protein eine neurotrophe Aktivität zeigt, die der ähnlich ist, die vom Xenopus-Noggin-Protein gezeigt wird.
Beispiel 5 - Gewebe-Lokalisierung der Boten-RNA von humanem Noggin
Materialien und Verfahren
Sonden-Herstellung
Die Proben wurden wie in Beispiel 4 dargelegt hergestellt. Die verwendeten Oligonucleotide waren wie folgt:
(Die unterstrichene Sequenz stellt die Maus-Noggin-Sequenz dar; bei der restlichen Sequenz handelt es sich um Schwänze, die Restriktionsstellen zum Clonieren enthalten.) Ein DNA-Fragment von etwa 300 by wurde mittels PCR-Amplifikation eines Maus-cDNA-Clons, der wie in Beispiel 3 beschrieben hergestellt wurde, erhalten.
RNA-Herstellung und Northern-Blots
Aus Sprague-Dawley-Ratten wurden ausgewählte Gewebe seziiert und sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren. RNAs wurden mittels Homogenisierung der Gewebe in 3 M LiCl und 6 M Harnstoff isoliert, wie 1990 von Bothwell et al. (Methods of Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Boston, MS, Jones and Bartlett) beschrieben. RNAs (10 μg) wurden mittels Elektrophorese durch vier 1%-ige Agarose-Formaldehyd-Gele fraktioniert (Bothwell et al., 1990, Methods of Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Boston, MS, Jones and Bartlett), der sich ein kapillarer Transfer auf Nylon-Membranen (MagnaGraph, Micron Separations Inc.) mit 10 × SSC (pH 7) anschloß. RNAs mit den Membranen wurden durch Behandlung mit ultraviolettem Licht (Stratalinker, Stratagen, Inc.) UV-vernetzt und bei 68°C mit radioaktiv markierten Sonden in Gegenwart von 0,5 M NaPO₄ (pH 7), 1% Rinder-Serumalbumin (Fraktion V, Sigma, Inc.), 7% SDS, 1 mM EDTA (Mahoudi et al., Biotechniques, 7 (1989), 331–333), 100 μg/ml ultraschallbehandelte denaturierte Lachs-Sperma-DNA hybridisiert. Die Filter wurden bei 68°C mit 3 × SSC, 0,1% SDS gewaschen und einer 1-tägigen bis 2-wöchigen Autoradiographie mit ein oder zwei Verstärkerfolien (Cronex, DuPont) und einem Röntgen-Film (AR-5, Kodak) bei 70°C unterworfen. Eine Ethidiumbromid-Färbung der Gele zeigte, dass in den unterschiedlichen Proben äquivalente Mengen von Gesamt-RNA getestet wurden (wie in Maisonpierre et al., Science, 247 (1990), 1446–1451, beschrieben). RNA wurde aus den folgenden humanen Zell-Linien präpariert:
Ergebnisse
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben aus dem Maus-Noggin-Plasmid ein DNA-Fragment amplifiziert, das dem bei Xenopus- und Maus-Noggin konservierten Bereich entspricht.
Das amplifizierte Fragment von etwa 300 by wurde als Sonde zur Hybridisierung mit Northerns-Blots eingesetzt, wobei die RNAs sowohl aus adulten und embryonalen Geweben als auch aus verschiedenen Zell-Linien hergestellt worden waren. Ein Noggin-Transkript mit einer Größe von etwa 2 kb wurde in adultem Ratten-Hirn und in der Zell-Linie SKMES, einem kleinzelligen Lungencarcinom, nachgewiesen.
Die Expression der Noggin-Transkripte wurde in verschiedenen Geweben von Ratte und Maus in unterschiedlichen Entwicklungsstadien und in adulten Tieren untersucht. Bei der Maus können Noggin-Transkripte sowohl in Embryonen oder im Kopf von E9 bis E12 als auch im Hirn Neugeborener und im adulten Hirn nachgewiesen werden. Außer im Skelett-Muskel gab es in den untersuchten peripheren Geweben kein nachweisbares Signal. Eine sehr häufige Expression wurde auch in Hippokampus-Astrozyten, die aus der postnatalen Maus isoliert worden waren, festgestellt.
Bei der Ratte konnten Noggin-Transkripte sowohl in Embryonen oder im Kopf von E9 bis E18 als auch im Hirn von P1, P19 und im adultem Hirn nachgewiesen werden. Im Cerebellum schien die Noggin-Expression in E18 und P1 höher zu sein; im Rückenmark erreichte die Expression der Noggin-mRNA in P1 einen Peak. Die Untersuchung der Noggin-Expression erfolgte in allen Bereichen des ZNS, insbesondere im Bulbus olfactorius, Mittelhirn, Hinterhirn und Cerebellum. Beim adulten Tier konnte Noggin-mRNA in allen ZNS-Bereichen, insbesondere im Bulbus olfactorius und Cerebellum nachgewiesen werden. Auch in der Haut waren geringe Mengen zu sehen.
Beispiel 6
Neurale Induzierung durch Noggin
Materialien und Verfahren
Herstellung von Medium, das durch Xenopus-Noggin-CHO-Zellen konditioniert ist
Durch Xenopus-Noggin-CHO-konditioniertes Medium wurde mittels Selektion auf stabil transfizierte CHO-Zellen hergestellt. Elterliche CHO-Zellen, die keine Dihydrofolatreductase (DHFR) aufwiesen (J. Papkoff Syntex Research) wurden mit einem Xenopus-Noggin enthaltenden Expressionsplasmid transfiziert, das Noggin in Tandemstellung mit dem Dihydrofolatreductase-Gen enthielt. Das Züchten in Nucleosid-freien Medium wurde zur Selektion erfolgreich transfizierter Zellen verwendet. Neun Kolonien von Transfektanten wurden abgenommen und einzeln gezüchtet. Das in diesen Zellen vorhandene Noggin-Gen wurde durch eine langsame Erhöhung der Dosis von Methotrexat, einem DHFR-Inhibitor, amplifiziert. Die Gegenwart von Noggin-Transkripten wurde zuerst mittels Northern-Analyse getestet. Anschließend zeigte sich, dass die beiden Clone B3 und C3 Noggin-Protein sezernieren, da konditioniertes Medium dieser Linien die Dorsalentwicklung von ventralmarginalen Zonen induzieren konnte. Durch Markierung zellulärer B3-Proteine mit ³⁵S-Methionin konnte außerdem das Noggin-Protein als Bande von etwa 30 kD auf einer reduzierenden SDS-PAGE und als Bande von 60 kD auf einer nicht reduzierenden SDS-PAGE identifiziert werden, was darauf hinwies, dass es das erwartete Dimer bildet. Diese Eigenschaften stimmten mit denen des Noggin-Proteins überein, das bereits, wie a. a. O. beschrieben, in Xenopus-Oocyten erzeugt worden war (Smith et al., Nature, 361 (1993), 547– 549). B3-konditioniertes Medium wurde in einem Gemisch aus 1 Teil alpha-MEM und 9 Teilen CHO-S-SFMII (Gibco-BRL) gesammelt. Man ließ die Zellen drei Tage das Medium konditionieren. Ein Kontroll-Medium von elterlichen Zellen (CHO dhfr) wurde in identischer Weise gesammelt. Unter Verwendung von Centriprep 10-Konzentrator-Vorrichtungen wurde ein 20-fach konzentriertes Medium hergestellt, wobei die 20-fache Veränderung anhand des Volumens bestimmt wurde.
Aufreinigung von humanem Noggin aus COS-Zellen
Humanes Noggin-Protein wurde mittels einer Kationenaustausch-Säule aufgereinigt. COS/M5-Zellen wurden kurzzeitig mit dem humanes Noggin enthaltenden Expressionsplasmid pCAE11 transfiziert. Man ließ die Zellen zwei bis drei Tage DMEM-Medium (spezielle Medien) konditionieren, wonach das Medium entfernt wurde. Aus dem Medium wurden kleine Partikel mittels eines Zentrifugationsschrittes und einer anschließenden Passage durch einen 0,2 μm-Celluloseacetat-Filter entfernt. Dieses geklärte Medium wurde auf eine MonoS (Pharmacia)-Säule gepumpt, die mit mehreren Volumina 40 mM Natriumphosphat (pH 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA gewaschen wurde. Danach wurden Proteine mit einem linearen Gradienten von 40 mM Natriumphosphat ( pH 8,5) 1,8 M NaCl, 1 mM EDTA eluiert. Noggin-Protein eluiert bei 0,8 M NaCl und ist bei SDS-PAGE eine Reinheit von > 90%
Xenopus-otx-Isolierung
Zur Isolierung von Xenopus-otx-Clonen wurde eine Froschlarven-Kopf-cDNA-Genbank (Hemmati-Brivanlou et al., Development, 106 (1989), 611–617) mit einer Maus-otx-cDNA (S-L Ang und Rossant, Toronto) bei geringer Stringenz durchmustert. Die abgenommenen Clone gehörten zwei Klassen an. Eine Klasse, die die Erfinder als otxA bezeichneten, umfasste pXOT21.2, bei dem es sich um die in der vorliegenden Erfindung verwendete Sonde handelt. Mittels in situ-Hybridisierung werden Transkripte zuerst vor der Gastrulation in der Oberflächen-Schicht auf der dorsalen Seite nachgewiesen. Während der Neurulation wurde das Gen in einer großen vorderständigen Domäne, die sowohl neurale als auch nicht-neurale Gewebe umfasste, exprimiert. Nachdem die Expression in der Schwanzknospen-Froschlarve zurückging, wurde das Gen erneut spezifisch im Gehirn und in den Augen exprimiert.
Test mit ventral-marginalen Zonen
Embryonen-Präparation
Xenopus laevis-Embryonen wurden befruchtet und, wie beschrieben (Condie und Harland, Development, 101 (1987), 93–105) routinemäßig am Abend vor Durchführung der Dissektionen verflüssigt. Die Embryonen werden die Nacht über bei 15°C kultiviert. Am folgenden Morgen wird die Vitellin-Membran, die jeden sich entwickelnden Embryo im späten Blastula-Stadium umgibt, manuell entfernt. Bis zur Dissektion werden die Embryonen in 1/3 × modifizierter Ringer-Lösung in Agarose-beschichteten Schalen gehalten.
Dissektion ventral-marginaler Zonen
Die Embryonen werden mit ihrer dotterreichen vegetalen Hemisphäre nach oben gelegt, so dass die dorsale Seite identifiziert werden kann. Die dorsale Seite der frühen Gastrula ist durch die Gegenwart eines kleinen Bogens mit dichtem Pigment, der als „dorsale Lippe" bezeichnet wird und der den Beginn der Involution des dorsalen Mesoderms markiert, gekennzeichnet. Die ventral-marginale Zone (VMZ) findet sich direkt gegenüber der dorsalen Lippe und wird dissiziiert. Da die Vitellin-Membran entfernt worden ist, neigen die Embryonen dazu, flach zu werden. Unter Verwendung eines speziell konstruierten Messers, das aus einer Augenbraue, die mit Wachs auf eine Glaspipette aufgebracht ist, hergestellt wurde, werden zwei Schnitte durch den abgeflachten Embryo vom oberen Teil, der dem vegetalen Pol gegenüberliegt, hindurch bis zum animalen Pol durchgeführt. Die Schnitte erfolgen so, dass dabei etwa 30–60 Grad der ventralen Seite von den mehr lateral gelegenen Geweben isoliert werden. Mittels eines dritten Schnittes, der senkrecht zu den ersten zwei Schnitten verläuft, wird das Gewebe der ventral-marginalen Zone vollständig aus dem restlichen Embryo isoliert. Dieser dritte Schnitt erfasst etwa zwei Drittel des Embryo-Radius beginnend im Zentrum. Vor Behandlung wird die VMZ 1 × in Kulturmedium gewaschen.
Test
Pro Test werden etwa 5 bis 10 VMZs verwendet. Die gewaschenen VMZs werden sorgfältig abgetropft (wobei versucht wird, die Übertragung von Flüssigkeit zu minimieren) und in Eppendorf-Röhrchen überführt, die das für den Test gewünschte Behandlungs-Proteinmedium, enthalten. Man lässt die VMZs bis zum späten Neurula- oder frühen Schwanzknospen-Stadium entwickeln, wie anhand der Entwicklung eines als Kontrolle dienenden ganzen Embryos bestimmt. Zu diesem Zeitpunkt wird RNA aus den VMZs und ganzen Kontroll-Embryonen isoliert, wie beschrieben (Condie und Harland, ibidem). Die Expression von Muskel-Actin in VMZs deutet auf ein Ereignis hin, das die Dorsalentwicklung induziert (Lettice und Slack, Development, l 17 (1933), 263–72). RNA aus jeder Probe wird auf einem Formaldehyd-Agarose-Gel laufen gelassen und auf einen Gen-Screen geblottet. Der Blot wird danach mit einer Xenopus-Muskel-Actin-Sonde (Dworkin-Rastl et al., J. Embryol. Exp. Morph., 91 (1986), 153–68) hybridisiert. Die quantitive Bestimmung der Dorsalentwicklung kann mittels Normalisierung des Muskel-Actin-Signals auf das von ubiquitär exprimiertem EF-1α durchgeführt werden (Krieg et al., Devl. Biol. 133 (1989), 93–100). Die quantitative Bestimmung erfolgt unter Verwendung von Phophor-Bildgebungsverfahren.
RNase-Schutz-Test
Der RNase-Schutz wurde wie beschrieben (D. A. Melton et al., Nucleic Acids Res., 12 (1984), 7035–56) durchgeführt, wobei eine Modifikation dahingehend erfolgte, dass die Spaltung bei Raumtemperatur (22°C) ausschließlich unter Verwendung von RNAse T1 (Calbiochem 556785) in einer Menge von 10 Einheiten/ml durchgeführt wurde. Für jede Laufspur wurden 20–30 animale Kappen geerntet, wobei 80% davon für neurale Marker und 10% für Muskel-Action und Kollagen Typ II verwendet wurden. Für „goosecoid" und „Kurzschwänzigkeit" wurden 20 Kappen verwendet. Die Behandlung erfolgte über einen Bereich von 12 Stunden bis 5 Tagen. In allen Fällen wurden die Filme vorher mit Blitzlicht behandelt. In den Fällen, wo ein Marker nicht exprimiert wurde, wurde das Ergebnis unter Verwendung von Phosphor-Bildgebungsverfahren mit größerer Sensitivität bestätigt.
Ergebnisse
Die Entwicklung von Vertebraten-Embryonen erfordert verschiedene induktive Wechselwirkungen. Mesoderm, das letztendlich Gewebe wie Notochord, Muskel, Herz, Mesenchym und Blut bildet, wird im Äquator-Bereich des Embryos induziert (Nieuwkoop, Wilhelm Roux' Arch. EntwMech. Org., 162 (1969), 341–372). Dieses Induzierungsereignis ist gut untersucht und es gibt mehrere Kandidaten für den/die endogenen Induktor(en), zu denen Vertreter der Familie der Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGF) und Activin (Jessell und Melton, Cell, 68 (1992), 257–70; Sive, Genes Dev., 7 (1993) 1–12) und der TGFb-Familie (Asashima et al., Roux's Arch. Dev. Biol., 198 (1990), 330–335; Asashima et al., Naturwissenschaften, 77, 8 (1990), 389–91; Green und Smith, Nature 347 (1990), 391–394; Smith et al., Nature, 345, 6277 (1990), 729–31; Thomsen et al., Cell, 63 (1990), 485–493; Van et al., Nature, 345, 6277 (1990), 732–4) gehören. Die Verwendung dominanter negativer Rezeptoren sowohl für FGF (Amaya et al., Cell, 66 (1991), 257–270) als auch für Activin (Hemmati-Brivanlou und Melton, Nature, 359 (1992), 609–614) in Xenopus-Embryonen legt stark nahe, dass die durch diese Moleküle aktivierten Signal-Pathways für eine korrekte Mesoderm-Bildung essentiell sind. Moleküle wie wnts (Christian et al., Development, 111 (1991), 1045–1055; McMahon und Moon, Cell, 58 (1989), 1075–84; Smith und Harland, Cell 67 (1991), 753–765; Sokol et al., Cell, 67 (1991), 741–752) und Noggin (Smith et al., Nature, 361 (1993), 547–49) modifizieren die Mesoderm-Arten, die ohne induzierendes Mesoderm direkt gebildet werden.
Bei einer nachfolgenden Induzierung signalisiert das dorsale Mesoderm des Spemann-Organisators dem nahe gelegenen lateralen Mesoderm. eine stärker dorsal orientierte Entwicklungsrichtung zu nehmen. (Dale und Slack, Development, 100, 2 (1987), 279–95; Lettice und Slack, Development, 117 (1993), 263–271; Spemann und Mangold, Arch. mikrosk. Anat. EntwMech., 100 (1924), 599–638; Stewart und Gerhart, Development, 109 (1990), 363–372). Der einzige bekannte Faktor, der im Organisator exprimiert wird und dessen die Dorsalentwicklung induzierende Aktivität nachahmen kann, ist Noggin.
Das dorsale Mesoderm des Spemann-Organisators gibt auch dem nahe gelegenen Ektoderm das Signal, Nervengewebe zu werden. Eine neurale Induzierung durch neurales Mesoderm ist in Amphibien (Dixon und Kintner, Development, 106 (1989), 749–757; Doniach et al., Science, 257, 5069 (1992), 542–5; Hamburger, The Heritage of Experimental Embryology: Hans Spemann and the Organizer, (1988); Kintner und Melton, Development, 99 (1987), 311– 25; Spemann, Arch. mikrosk. Anat. EntwMech., 100 (1938), 599–638), Vögeln (Kintner und Dodd, Development, 133 (1991), 1495–1506; Tsung et al., Acta Biol. exp. Sinica, 10 (1965), 69–80) und kürzlich in Mäusen (Ang und Rossant, Development, 118 (1993), 139–149) gezeigt worden. Trotz Jahrzehnte langer Anstrengungen ist bezüglich der molekularen Natur der für diese Wechselwirkung verantwortlichen Faktoren wenig bekannt. Von den bekannten Induktoren kann Activin die Bildung von Nervengewebe fördern, wobei dies jedoch auf eine sekundäre Induzierung durch das dorsale Mesoderm, das Activin induziert, zurückzuführen ist (Green et al., Development, 108 (1990), 173–83; Green und Smith, Nature, 347 (1990), 391– 394; Kintner und Dodd, Development, 113 (1991), 1495–1506). Bei Zugabe zu Gastrula-Ektoderm kann Activin daher die Bildung von Nervengewebe nicht fördern; jedoch bleibt ein solches Ektoderm kompetent und kann durch dorsales Mesoderm bis zum Ende der Gastrulation zur Bildung von Nervengewebe angeregt werden (Sharpe und Gurdon, Development, 109 (1990), 765–74).
Direkte neurale Induzierung durch Noggin
Von den Kandidaten für den endogenen Induktor wird erwartet, dass sie Nervengewebe in Abwesenheit von dorsalem Mesoderm induzieren. Kompetentes Ektoderm aus animalen Kappen von Embryonen im späten Blastula-Stadium (St9) wurde verwendet, um die Fähigkeit von Noggin zur neuralen Induzierung zu testen. Durch Xenopus-Noggin-Protein konditioniertes Medium wurde aus stabil transfizierten CHO-Zellen gesammelt und 20-fach konzentriertes Medium wurde zur Behandlung animaler Kappen in St 9 verwendet. Bei den in einem RNase-Schutz-Test verwendeten Marker handelte es sich um N-CAM (Jacobson und Rutishauser, Developmental Biology, 116 (1986), 524–31; Kintner und Melton, Development, 99 (1987), 311–25), ein Nervenzell-Adhäsions-Molekül, eine nervenspezifische Isoform von b-Tubulin (Good et al., Nucleic Acids Res., 17 (1989), 8000; Good et al., Dev. Biol., 137 (1990), 414–8; Richter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85 (1988), 8086–90), die im Hinterhirn und im Rückenmark exprimiert wird, und XIF3, ein neural exprimiertes Gen für ein intermediäres Filament (Sharpe et al., Development, 107 (1989), 701–14), um im Hinblick auf neurale Induzierung zu testen. Alle diese Marker sind auf Nervengewebe beschränkt, wobei jedoch nur NCAM im ganzen Nervensystem exprimiert wird. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung stellten fest, dass durch Xenopus-Noggin konditioniertes Medium eine hohe N-CAM- und XIF3-Expression (2; Laufspur 8) in behandelten animalen Kappen induziert, ohne jedoch Muskel-Actin (Laufspur 13) zu induzieren (Dworkin-Rastl et al., J. Embryol. exp. Morph., 91 (1986), 153–168; Mohun et al., Nature, 311 (1984), 716–721). Kontroll-CHO-Zellmedium induziert weder Muskel- noch Nervengewebe (Laufspuren 7, 12). Mit Activin behandelte animale Kappen in St 9 exprimieren Muskel-Activin (Laufspur 11) und alle drei neuralen Marker (Laufspur 6), was die Fähigkeit von Activin zur indirekten Erzeugung von Nervengewebe zeigt. Es ist interessant festzustellen, dass Noggin, wenn überhaupt, eine sehr geringe b-Tubulin-Expression induziert, während hohe Mengen von N-CAM induziert werden, wobei eine Induzierung durch Activin nahezu die gegenteiligen Wirkung hat.
Zur Bestimmung, ob das Noggin-Protein zur Induzierung von Nervengewebe ausreicht, wurden COS-Zellen mit pCAE11, einem humanes Noggin enthaltenden Expressionsplasmid, transfiziert, und das konditionierte Medium wurde mittels Kationenaustausch-Chromatographie aufgereinigt, wobei Noggin-Präparate erhalten wurden, die zu 90% rein waren (3). Ein solches aufgereinigtes humanes Noggin-Protein kann auch in animalen Kappen Nervengewebe induzieren (4a, vgl. nachstehend).
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, dass Noggin in animalen Kappen im späten Blastula-Stadium keine Muskeln induziert, wobei es jedoch möglich ist, dass Noggin andere Typen von dorsalem Mesoderm induziert. Um dieses Problem zu lösen, stellten sich die Erfinder die Frage, ob Noggin die Expression der frühen mesodermalen Marker goosecoid (Blumberg et al., Science 253 (1991), 194–6; Cho et al., Cell, 67 (1991), 1111–20), einem Marker des Organisator-Gewebes und anschließend des Kopf-Mesoderms, oder X-brachyury (Kurzschwänzigkeit) (Smith et al., Cell, 67 (1991), 79–87), das offensichtlich früh in allen mesodormalen Präcursoren und anschließend im posterioren Mesoderm und im Notochord exprimiert wird, induzieren kann. Animale Kappen wurden in Stadium 9 behandelt und in Stadium 11 gesammelt, wenn im normalen Embryo eine hohe Expression von goosecoid und brachyury vorliegt. Keiner der Marker wird durch aufgereinigtes menschliches Noggin ( 4b, Laufspur 5) in einer Dosis mit nachgewiesener neuraler Induzierungsaktivität (6, Laufspur 15) angeschaltet; wobei im Gegensatz dazu animale Kappen, die in gleicher Weise mit Activin behandelt wurden, sowohl die goosecoid- als auch die X-brachyury-Expression (4b, Laufspur 4) zeigen, wie für diesen Mesoderm induzierenden Faktor erwartet (Cho et al., Cell, 67 (1991), 1111–20; Smith et al., Cell, 67 (1991), 79–87). Unbehandelte animale Kappen zeigen keine Expression dieser mesodermalen Marker (Laufspur 3), wobei sich jedoch bei der EF-1α-Expression zeigt, dass die RNA-Mengen in den gesammelten animalen Kappen vergleichbar sind (Krieg et al., Dev. Biol., 133 (1989), 93–100).
Da aufgereinigtes humanes Noggin die neurale Induzierung steuern kann, sind keine weiteren Faktoren erforderlich, die möglicherweise im konditionierten Roh-Medium vorhanden sind. Außerdem können sowohl Xenopus- als auch humanes Noggin bei einer Aminosäure-Identität von 80% Nervengewebe in Xenopus induzieren, was eine konservierte Funktion der beiden Proteine nahe legt. Damit Noggin jedoch ein Kandidat für einen endogenen Nerveninduktor sein kann, muss es Nervengewebe in einem Stadium induzieren können, in dem in normalen ganzen Embryonen die neurale Induzierung erfolgt. Es ist unklar, wann bei Embryonen die ersten entscheidenden Signale aus dem dorsalen Mesoderm in das Ektoderm gesendet werden. Bekanntlich ist jedoch in frühen Gastrula-Stadien dorsales Ektoderm bereits so geprägt, dass es Nervengewebe wird (Jones und Woodland, Development, 107 (1989), 785–91). Die Initiierung des neuralen Induzierungs-Signals erfolgt daher wahrscheinlich vor diesem Stadium. Das späteste Stadium, in dem sich gezeigt hat, dass animale Kappen kompetent sind und auf neural induzierendes Mesoderm reagieren, ist die frühe Neurula (ST13–14) (Sharpe und Gurdon, Development, 109 (1990), 765–74). Ein Kandidat für einen endogenen neuralen Induktor muss daher Nervengewebe aus kompetentem Ektoderm des Gastrula-Stadiums induzieren können.
Neurale Induzierung im Gastrula-Stadium
Zur Abschätzung der Kompetenz des Ektoderms, auf Noggin zu reagieren, behandelten die Erfinder der vorliegenden Erfindung animate Kappen, die Embroynen im Blastula (St8)-, dem späten Blastula (St9) oder dem frühen Gastrula (St10)-Stadium entnommen worden waren, und ventrale animale Kappen aus Embryonen im mittleren Gastrula-Stadium (St10,5) mit aufgereinigtem humanen Noggin (2). Die Erfinder behandelten auch animale Kappen aus ähnlichen Stadien mit Activin, um dessen Mesoderm-induzierende und sekundäre neurale induzierende Aktivitäten nachzuweisen und die Wirkungen von Activin denen von Noggin gegenüberzustellen (4a). Mit Activin behandelte animale Kappen zeigen eine neurale Induzierung nur im Zusammenhang mit der Induzierung von dorsalem Mesoderm, wie Muskel und Notochord (Laufspuren 3, 6, 9). Bei einer Reihe von Experimenten bestätigte sich, dass die Fähigkeit von Activin zur Induzierung von dorsalem Mesoderm und folglich Nervengewebe im Gastrula-Stadium schnell abnimmt (Laufspur 12) (Green et al., Development, 108 (1990), 173–83; Kintner und Dodd, Development, 113 (1991), 1495–1506). In dem hier gezeigten Experiment wurde eine Activin-Dosis verabreicht, die größer als die übliche war. Unter diesen Bedingungen wird nur eine kleine Nervengewebe-Menge erzeugt, wahrscheinlich weil soviel Mesoderm induziert wird, dass im Explantat nicht ausreichend kompetentes Ektoderm übrig bleibt, dass Nervengewebe bilden kann. Im Gegensatz dazu kann Noggin Nervengewebe in animalen Kappen, die allen diesen Stadien entnommen wurden, induzieren, ohne dass die Notochord- und Rumpfsegment-Marker Kollagen Typ II (Amaya et al., Development, 118 (1993), 477–87; Bieker und Yazdani-Buicky, J. Histochem. Cytochem., 40 (1992), 1117–20) oder Muskel-Actin induziert werden (Laufspuren 4, 7, 10, 13). Dies unterstützt zusätzlich die Vermutung, dass Noggin ein direkter neuraler Induktor ist, da er seine Wirkung in Abwesenheit sowohl früher als auch später mesodermaler Marker entfalten kann. Darüberhinaus haben die Erfinder gezeigt, dass Noggin in kompetentem Ektoderm Nervengewebe zu einem Zeitpunkt induzieren kann, wenn die mesodermalen Induktoren nicht aktiv sind.
Bei einigen Experimenten führte die Noggin-Zugabe zu animalen Kappen der Gastrula (nicht jedoch der Blastula) zur Muskel-Induzierung. Dies erfolgte in Stadien, wenn Activin Muskeln nicht mehr induzieren konnte. Die Erfinder interpretieren dies als Folge einer die Dorsalentwicklung induzierenden Wirkung von Noggin auf Gewebe, die ein schwaches Mesoderm-induzierendes Signal erhalten haben. Das Mesoderm-induzierende Signal, das sich in die animale Kappe der Gastrula ausbreitet, reicht nicht zur Induzierung von Mesoderm aus, wobei jedoch in Gegenwart von Xwnt-8 oder Noggin Muskel gebildet wird. Eine interessante Folge der Muskel-Induzierung besteht darin, dass die im Explantat nachgewiesenen Nervengewebe-Arten modifiziert sind. Eine Induzierung in Explantaten, die keinen Muskel enthalten, führt zur N-CAM-Expression, wobei jedoch, falls Muskel vorhanden ist, die Expression sowohl von N-CAM als auch von b-Tubulin festgestellt wird. Dieses Phänomen ist in der sekundären neuralen Induzierung durch Activin in animalen Kappen in St.9 ( 2) und beim Vergleich der durch Noggin induzierten Nervengewebe, entweder in ventralmarginalen Zonen oder in animalen Kappen (6), nachzuweisen. In den ventralmarginalen Zonen und animalen Kappen, in denen Muskel vorhanden ist, werden sowohl N-CAM als auch b-Tubulin exprimiert, während induzierte animale Kappen ohne Muskel nur eine N-CAM-Expression zeigen.
Neurale Induzierung nach Injektion einer Noggin-codierenden DNA
Um die Schlussfolgerungen der Erfinder zu bestätigen, wurde die Noggin-Expression in animalen Kappen des Gastrula-Stadiums unter Anwendung einer anderen experimentellen Vorgehensweise eingeleitet, indem das Plasmid pCSKA-Noggin in den animalen Pol eines Embryos im Einzell-Stadium injiziert wurde. Dieses Plasmid, bei sich Noggin unter der Kontrolle des cytoskeletalen Actin-Promotors befindet, schaltet die Expression der Noggin-mRNA zu Beginn der Gastrulation an (Smith et al., Nature, 361 (1993), 547–49). Animale Kappen im Blastula-Stadium werden dissiziiert und dann zur molekularen Analyse bis zu Schwanzknospen-Stadien ausgereift. Animale Kappen, denen das Noggin-Plasmid injiziert wurde, zeigen eine Expression von N-CAM in Abwesenheit von Muskel- oder Notochord-Markern (4c, Laufspur 2). Ein Kontroll-Plasmid, das die Expression von lacZ steuert, zeigte wie erwartet keine neurale oder mesodermale Induzierung (Laufspur 1). Dieses Experiment zeigt, dass eine ektopische Noggin-Expression Nervengewebe in Ektoderm im Gastrula-Stadium, einem Stadium, bei dem in ganzen Embryonen eine neurale Induzierung erfolgt, direkt induzieren kann.
Unterschiedliche Kompetenz von dorsalen und ventralen animalen Kappen
Der dorsalen Seite von Embryonen im Gastrula-Stadium entnommene animale Kappen zeigen eine größere Kompetenz zur Bildung von Nervengewebe als ventrale animale Kappen (Otte und Moon, Cell, 68 (1992), 1021–29; Sharpe et al., Cell, 50 (1987), 749–58), wenn involutiertes anteriores Mesoderm als Induktor verwendet wird. Dieser Mesoderm-Typ weist jedoch eine geringere induzierende Fähigkeit auf als der Rest des involutierten Mesoderms (Sive et al., Cell, 58 (1989), 171–180). Außerdem kann die ventrale Seite eines Embryos die Bildung einer vollständigen sekundären Achse unterstützen, wenn der Organisator auf dieser Seite platziert wird (Gimlich und Cooke, Nature, 306 (1983), 471–3; Smith und Slack, J. Embryol. Exp. Morph., 78 (1983), 299–317; Spemann, Arch. mikrosk. Anat. EntwMech., 100 (1938), 599–638), was darauf hinweist, dass es keinen qualitativen Unterschied der Kompetenz gibt. Obwohl ein schwacher Induktor geringe Unterschiede in der Kompetenz des Ektoderms enthüllen kann, ist daher die Vermutung geäußert worden, dass sich die Wirkungen eines starken neuralen Induktors auf dorsales und ventrales Ektoderm nur geringfügig unterscheiden (Servetnick und Grainger, Development, 112 (1991), 177–88). Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben daher die Wirkungen von Noggin auf dorsales und ventrales Ektoderm der frühen Gastrula getestet. Bei der N-CAM-Expression ist kein Unterschied nachzuweisen (5, Laufspuren 4, 6), während mit Noggin behandelte ventrale animale Kappen eine größere Muskel-Actin-Expression zeigen (vermutlich durch die Dorsalentwicklung von Geweben, bei denen ein geringe Mesoderm-Induzierung erfolgte). Mit Activin behandelte dorsale Kappen zeigen eine Induzierung, die grob der Muskel-Actin-Expression entspricht (Laufspur 5), ebenso wie die mit Noggin behandelten ventralen Kappen, wobei jedoch durch die Activin-Behandlung keine nachweisbaren nervenspezifischen Transkripte induziert wurden (Laufspuren 3, 5). Dies weist daraufhin, dass in diesem Stadium induziertes Muskel-Gewebe nicht ausreicht, um Nervengewebe sekundär zu induzieren und dass Noggin vorhanden sein muss, um Nervengewebe zu induzieren.
Die Erfinderschließen daraus, dass bei der Noggin-vermittelten neuralen Induzierung kein dorsal-ventraler Unterschied auftritt, was nahe legt, dass sich Noggin wie das starke neural-induzierende Signal des Spemann-Organisators verhält und nicht wie das schwächere Signal aus dem frühen anterioren Mesoderm.
Dosis-Abhängigkeit
Zur Bestimmung, welche Mengen des Noggin-Proteins für die Nerven-induzierende Äktivität erforderlich sind, wurde ein Dosis-Reaktions-Experiment durchgeführt. Neben der Bestimmung der Dosen, die in animalen Kappen für die neurale Induzierung erforderlich sind, wurde auch die Dosis-Reaktion der Dorsalentwicklung ventral-marginaler Zonen ermittelt, um die für diese beiden Induzierungstypen erforderlichen Dosen zu vergleichen. Animale Kappen in Stadium 9 oder VMZ in St. 10.5 wurden mit aufgereinigtem humanen Noggin behandelt, wobei N-CAM und (3-Tubulin zum Testen der neuralen Induzierung verwendet wurden, während Muskel-Actin als Marker für dorsales Mesoderm verwendet wurde. Dieses Experiment zeigt, dass eine neurale Induzierung bei einer Dosis von 1 μg/ml erfolgt, was eine 20-fach höhere Dosis ist als die, die zur Dorsalentwicklung von VMZ erforderlich ist ( 5). Es gibt mehrere Beobachtungen, die die scheinbar hohe erforderliche Dosis begründen können. Um eine maximale neurale Reaktion im dorsalen Mesoderm zu erhalten, müssen erstens die Gewebe während des größten Teils der Neurulation in Kontakt gehalten werden (Sharpe und Gurdon, Development, 109 (1990), 765–74), während im Gegensatz dazu mit Noggin behandelte animale Kappen schnell eng aneinanderrücken, wodurch diesem Faktor den Zugang verwehrt wird und sie dementsprechend nur kurzzeitig eine effektive Dosis erhalten. Zweitens ist es wahrscheinlich, dass Noggin nicht der einzige neurale Induktor ist, der im Embryo aktiv ist; bei einer Vielzahl von Amphibien hat sich gezeigt, dass die Rumpfsegmente (Hemmati-Brivanlou et al., Science, 250 (1990), 800–802; Jones und Woodland, Development, 107 (1989), 785–91) und die Medullarplatte neurale induzierende Aktivität aufweisen (Hamburger, The Heritage of Experimental Embryology: Hans Spemann and the Organizer, 1988; Servetnick und Grainger, Dev. Biol., 147 (1991), 73–82), wobei Noggin-Transkripte dort nicht nachgewiesen werden. Es ist daher plausibel, dass Noggin eine von mehreren neural-induzierenden Aktivitäten ist. In diesem Zusammenhang ist es erwähnenswert, dass die Fähigkeit von Noggin zur Induzierung von Nervengewebe in ventralmarginalen Zonen genauso stark ist wie seine Fähigkeit zur Induzierung von deren Dorsalentwicklung zur Erzeugung von Muskel. Zahlreiche weitere Experimente (vgl. 5) zeigen, dass in diesem Stadium die Induzierung einer ähnlichen Muskel-Menge durch Activin nicht zur neuralen Induzierung führt. Viertens ist es möglich, dass nur eine kleine Fraktion des aufgereinigten Proteins aktiv ist und dass bei dem Experiment die zur neuralen Induzierung benötigte Protein-Menge zu hoch eingeschätzt wird. Schließlich ist es möglich, dass die Zugänglichkeit von exogen zugegebenem löslichen Noggin signifikant geringer als die des endogen sezernierten Noggin-Proteins ist.
Muster-Bildung
Embryonales Nervengewebe entwickelt ein anteroposteriores (A-P)-Muster mit verschiedenen Gehirn-Strukturen, Augen und dem Rückenmark. Es ist davon auszugehen, dass neurale A-P-Muster die Gegenwart von dorsalem Mesoderm erfordern, unabhängig davon, ob es in einer Ebene neben dem reagierenden Ektoderm liegt (Dixon und Kintner, Development, 106 (1989), 749–757; Doniach et al., Science, 257 (1992), 542–5; Kintner und Melton, Development, 99 (1987), 311–25; Ruiz i Altaba, Development, 108 (1990), 595–604), oder ob es direkt darunter liegt und eine vertikale Wechselwirkung vorliegt (Dixon und Kintner, Development, 106 (1989), 749–757; (Hemmati-Brivanlou et al., Science, 250 (1990), 800–802; Sharpe und Gurdon, Development, 109 (1990), 765–74; Sive et al., Cell, 58 (1989), 171–180). Beide dieser Wechselwirkungs-Typen treten bei der normalen Entwicklung auf und beide tragen wahrscheinlich zu den resultierenden Mustern bei. Zur Bestimmung, ob Noggin Muster von Nervengewebe induziert, und falls dies zutrifft, welche Nervenbereiche dabei auftreten, verwendeten die Erfinder der vorliegenden Erfindung Xenopus-otx als Marker für das Vorderhirn und das Mittelhirn, En-2 (Hemmati-Brivanlou et al., Development, 111 (1991), 715–724) als Marker für die Mittelhirn-Hinterhirn-Grenze und Krox-20 (Wilkinson et al., Nature, 337 (1989), 461–4) als Marker für die dritten und fünften Rhombomeren des Hinterhirns bei einer in situ-Hybridisierung (Harland, Methods in Cell Biology, 36 (1991), 675–685). Gegen XIHbox 6 gerichtete Antikörper (Wright et al., Development, 109 (1990), 225–34) markieren Strukturen des posterioren Hinterhirns und des Rückenmarks. Vor Verwendung dieser Marker beobachteten die Erfinder die Bildung von Zement-Drüsen bei mit Noggin behandelten animalen Kappen. Da Zement-Drüsen induzierte Organe ektodermalen Ursprungs sind, die anterior zum Medullarrohr zu finden sind, legt dieses Ergebnis nahe, dass Noggin anteriore Strukturen induziert. Eine in situ-Hybridisierung bestätigt dies, wobei die Gegenwart eines Zement-Drüsen-spezifischen Transkripts, nämlich XAG-1 (Sive et al., Cell, 58 (1989), 171–180) in Noggin-behandelten animalen Kappen, nicht jedoch in kontrollbehandelten animalen Kappen gezeigt wird (7A–L). Eine in situ-Hybridisierung mit den für den Bereich spezifischen neuralen Markern (7A–L) zeigt, dass Noggin Gewebe vom Vorderhirn-Typ induziert, wie durch Expression von otx in Noggin-behandelten animalen Kappen nachgewiesen. En-2, Krox20 oder XIHbox sind nicht nachgewiesen worden, was nahe legt, dass diese mehr posterior gelegenen Marker nicht durch Noggin induziert werden.
Expression neuraler Antigene
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gezeigt, dass Noggin die Expression nerven-spezifischer Transkripte direkt induziert. Ein weiterer Nachweis erfolgte unter Verwendung von Antikörpern, die gegen nervenspezifische Antigene gerichtet sind, um zu zeigen, dass das Noggin-induzierte Gewebe den Phänotyp von Nervengewebe aufweist. Zu diesem Zweck haben die Erfinder Gewebe animaler Kappen mit Noggin behandelt und zum Anfärben mit Antikörpern bis zu einem späten Stadium (St 35) kultiviert. Dabei wurde der gegen N-CAM gerichtete Antikörper 6F11 verwendet, der das gesamte Medullarrohr eines normalen Embryos anfärbt. Mit Noggin behandelte animale Kappen exprimieren dieses Antigen ( 7A–L), nicht jedoch als Kontrolle verwendete unbehandelte animale Kappen. Dies zeigt, dass Noggin die Produktion nervenspezifischer Proteine in behandelten animalen Kappen induzieren kann. Die Erfinder konnten die Expression zahlreicher anderer Antigene, die für verschiedene Unterklassen differenzierter Nervenzellen charakteristisch sind, nicht nachweisen. Dazu gehörten 2G9, das den größten Teil von Nervengewebe einschließlich peripherer Neuronen färbt, Tor 24.55, das sensorische Neuronen färbt, und Tor 23, das eine Vielzahl von Neuronen einschließlich motorischer Neuronen färbt.
Beispiel 7
Herstellung von rekombinantem humanen Noggin in E. coli und Baculovirus
Materialien und Verfahren
Gentechnische Verfahren und Zellkultivierung
Ein Lactose-induzierbares Expressionsplasmid wurde konstruiert, indem der SwaI/BsmI-Bereich von pRPN40 (Masiakowski et al., J. Neurochem., 57 (1991), 1003–1012) durch den SwaI/BsmI-Bereich des humanen Noggin-Gens ersetzt wurde, der mittels PCR erhalten wurde und die gleichen Restriktionsstellen überspannt, wobei das Plasmid pRG301 erhalten wurde. pRG301 ist ein Kanamycin-resistentes Plasmid mit hoher Kopiezahl, das von pBR322 abstammt, wobei das humane Noggin-Gen unter der Kontrolle des lacUV5-Promotors steht. Ein Plasmid, das das Kanamycin-Resistenz-Gen in hoher Kopiezahl enthält, wurde bei Agricultural Research Collection (NRRL), Peoria, Illinois hinterlegt und trägt die Hinterlegungsnummer B-18600. Dieses Plasmid wurde in der US-Patentanmeldung Serien-Nr. 07/478,338 beschrieben, die durch Bezugnahme vollständig in den vorliegenden Text einbezogen wird. E. coli W3110 laclq-Zellen, die mit pRG301 transformiert worden waren, wurden bei 37°C gezüchtet, mit Lactose induziert, mittels Zentrifugation geerntet, einmal mit 100 mM Tris-HCl, 50 mM EDTA, pH-Wert 8, gewaschen und in gefrorener Form aufbewahrt, im Wesentlichen wie beschrieben (Masiakowski et al., ibidem).
Gewinnung von Einschluß-Körperchen Eine E. coli-Zellpaste (32 g) wurde in zehn Volumina (Vol./Gew.) 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, und 5 mM EDTA suspendiert, in einer French Press-Vorrichtung bei 8000 psi und 8°C lysiert und 30 Minuten bei 8000 x g und bei 4°C zentrifugiert. Das Noggin enthaltende Pellet wurde im Originalvolumen 2 M Harnstoff-20 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0 suspendiert und 30 min gerührt. Die Suspension wurde 30 Minuten bei 8000 × g und bei 4°C zentrifugiert und das hauptsächlich aus Einschluß-Körperchen (IB) bestehende Pellet wurde in 20 Volumina (Vol./Gew.) 6 M Guanidin-HCl, 50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 50 mM DTT suspendiert und eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach einer 30-minütigen Zentrifugation bei 8000 × g wurde der 0,45–0,50 g denaturiertes und reduziertes Noggin enthaltende Überstand einer Diafiltration gegen 10 Volumina 6 M Harnstoff-50 mM Natriumactetat, pH-Wert 4,5, 1 mM EDTA, 0,1 mM DTT unter Verwendung von Omega-Membranen mit einem Molekulargewicht-Rückhaltevermögen von 10000 unterworfen. Das 0,4–0,44 g Noggin enthaltende Diafiltrat wurde mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 30 ml/min auf eine 2,6 × 10 cm-Säule von S-Sepharose (Pharmacia) geladen, die mit 6 M Harnstoff, 50 mM Natriumactetat, 1 mM EDTA und 0,1 mM DTT, pH-Wert 4,5, äquilibriert worden war. Die Säule wurde zuerst mit dem gleichen Puffer und dann mit einem Ein-Liter-Gradienten (0–1 M NaCl) bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 30 ml/min gewaschen. Noggin enthaltende Fraktionen wurden mittels Gel-Elektrophorese identifiziert und vereinigt. Die Ausbeute betrug 0,2–0,25 g Noggin.
Rückfaltung
Die denaturiertes und reduziertes Noggin enthaltende Lösung wurde auf eine Proteinkonzentration von 0,05–0,2 mg/ml eingestellt und auf 1,5–2,5 M Guanidin-HCl, 0,1 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 0,1 mM EDTA, 0,2–2 mM reduziertes Glutathion, 0,02–0,2 mM oxidiertes Glutathion (reduziertes zu oxidiertem Glutathion vorzugsweise in einem Verhältnis von 10 : 1) gebracht. Nach 24–72 Stunden wurden mittels Umkehrphasen (RP)-HPLC-Chromatographie zwei rückgefaltete Noggin-Isoformen identifiziert (8). Die rückgefaltetes Noggin enthaltende Lösung wurde einer Diafiltration gegen 20 Volumina 0,05 M Natriumacetat, pH-Wert 4,5, unterworfen, auf 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,2 gebracht und mindestens 1 Stunde bei 4°C langsam gerührt. Nicht korrekt rückgefaltetes Noggin präzipitierte und wurde mittels einer 30-minütigen Zentrifugation bei 8000 × g entfernt.
Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie
Rückgefaltetes Noggin kann mittels Chromatographie auf einer 12 mm-CB-Dynamax 300 A-Säule mit Abmessungen von 1 × 25 cm, die in Lösungsmittel A (0,1% TFA in Wasser) äquilibriert wurde, aufgereinigt werden. Nach Beladung wurde die Säule mit Lösungsmittel A gewaschen und dann bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 4 ml/min entsprechend dem folgenden Protokoll entwickelt: (a) 10 min isokratisch bei 70% Lösungsmittel A und 30% Lösungsmittel B (0,1% TFA in Acetonitril); 30-minütiger linearer Gradient bis 60% Lösungsmittel B und 40% Lösungsmittel A. Korrekt rückgefaltetes Noggin eluiert früher bei 44%–46% Lösungsmittel B. Die Ausbeute betrug 0,07–0,1 g Noggin.
Herstellung von humanem Noggin in einer Baculovirus-Zellkultur
Die SF21-Linie von Spodoptera frugiperda wurde routinemäßig als Zell-Monolayer in Grace-Insektenzell-Medium gehalten, das mit Lactalbuminhydrolysat und Yeastolate (Gibco) angereichert worden war. Dieses mit 10% (Vol./Vol.) Hitze-inaktiviertem fötalen Kälberserum (Irvine Scientific) komplettierte Medium wird als TMNFH-10 bezeichnet. Zellen wurden auch nach Anpassung in Serum freiem Medium (SF-900-II; Gibco) kultiviert. Suspensions-Kulturen in einem dieser Medien wurden in Microcarrier-Kulturflaschen (Bellco) angelegt, wobei eine Rührgeschwindigkeit von 80 Upm verwendet wurde. Alle Kulturen wurden bei einer Lebensfähigkeit von > 96% gehalten, wie mittels des Trypan Blau-Ausschlussverfahren beurteilt.
Konstruktion eines rekombinanten Baculovirus
Humanem Noggin entsprechende Sequenzen wurden als 5'-BamHI-PstI-3'-Fragment aus einem das humane Noggin-Gen enthaltenden Expressionsplasmid ausgeschnitten. Dieses Fragment wurde in pVL1393 (Invitrogen), das mit BamHI und PstI gespalten worden war, insertiert. Das erhaltene Plasmid pTR 1009 weist die humane Noggin-Sequenz unmittelbar stromabwärts des Polyhedrin-Promotors des multiplen nucleären Polyhedrosis-Virus von Autographa californica (AcMNPV) auf, wobei diese Fusion des Promotors mit dem heterologen Gen ihrerseits von Rekombinations-Zielorten flankiert wird, die aus dem AcMNPV-Polyhedrin-Bereich stammen. Rekombinante Plasmid-DNA wurde mittels alkalischer Lyse und CsCl-Zentrifugation aufgereinigt. SF21-Zellen wurden mit Plasmid- und viraler DNA mittels des folgenden Verfahrens co-transfiziert: Plasmid-DNA (3 mg) wurde mit 0,5 mg linearisierter, deletierter viraler DNA (Baculo Gold^TM, Pharminigen) gemischt und mit Ethanol präzipitiert. Getrocknete DNA wurde dann in Wasser (50 ml), das mit 1,5 ml Grace-Medium gemischt worden war, und 30 ml kationischen Lipofectin^TM-Liposomen (BRL) resuspendiert. Das DNA-Liposomen-Gemisch wurde einer Vortex-Behandlung unterworfen, dann ließ man es 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen und gab es tropfenweise auf einen SF21-Zell-Monolayer (2 × 106 Zellen/60 mm-Platte). Nach einer 4-stündigen Inkubation bei 27°C wurden 2 ml TMNFH-10 zugegeben und die Kultur wurde erneut einer 5-tägigen Inkubation zugeführt. Das Gewebe-Kulturmedium wurde geerntet und als Virus-Quelle zur Plaque-Isolierung verwendet.
Rekombinanter Virus wurde mittels mehrfacher Plaque-Aufreinigungszyklen auf SF21-Zellen isoliert. Verdünnter Virus (0,5 ml) wurde bei 27°C über einen Zeitraum von einer Stunde an Zell-Monolayern (2 × 106 Zellen/60 mm-Platte) adsorbiert, abgesaugt und nach Überschichtung mit 0,5%-iger Agarose in TMNFH-10-Medium ließ man dann Virus-Plaques über einen Zeitraum von 6 Tagen entwickeln. Nach mikroskopischer Untersuchung wurden Virus-Plaques abgenommen und in 2 ml SF900-II-Medium eluiert. Virus-Stämme wurden mittels Infektion bei einer geringen Multiplizität (0,1 pfu (plaquebildende Einheiten)/Zelle) vermehrt. Noggin exprimierende Virus-Clone wurden durch metabolische Markierung infizierter Kulturen mit ³⁵S-Methionin und ³⁵S-Cystein und Analyse des markierten Gesamt-Proteins mittels Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese und Autoradiographie identifiziert. Mittels dieses Verfahrens wurde in Kandidaten-Clonen ein markiertes Protein mit dem erwarteten apparenten MG von 20000–30000 nachgewiesen, nicht jedoch in Kontroll-Kulturen.
Expression und Aufreinigung von aus Baculovirus stammendem Noggin
SF21-Zellen wurden in Suspensions-Flaschen in SF900-II-Medium bis zu einer Dichte von etwa 1,8 × 106/ml kultiviert. Kulturen (500 ml) wurden mittels einer 10-minütigen Zentrifugation bei 1000 x g gesammelt und in 20 ml Wachstumsmedium resuspendiert, das 5– 10 pfu (plaquebildende Einheiten)/Zelle rekombinanten Virus enthielt. Unter vorsichtigem Mischen ließ man den Virus 1 Stunde bei Raumtemperatur adsorbieren. Infizierte Zellen wurden dann mit frischem Wachstumsmedium auf ihr Ausgangsvolumen verdünnt und 3 Tage bei 27°C inkubiert. Das Wachstumsmedium wurde anschließend mittels einer 20-minütigen Zentrifugation bei 1000 × g von Zellen und Zelltrümmern geklärt.
Die Zellüberstände wurden auf einen pH-Wert von 8,0 gebracht, durch einen 0,45 mm-Millipack-60-Filter laufen gelassen und auf eine Fast S-Säule aufgetragen, die in 25 mM HEPES, pH-Wert 8,0, äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen und mit einem linearen NaCl-Gradienten entwickelt, um andere Bestandteile des Mediums zu entfernen. Noggin eluierte aus dieser Säule bei 1 M NaCl.
Ergebnisse
Charakterisierung von humanem Noggin, das in E. coli und Baculovirus hergestellt worden war
Eine Umkehrphasen-HPLC-Chromatographie zeigt, dass aus E. coli rückgefaltetes und aufgereinigtes rekombinantes Noggin als ein einzelner scharfer Peak eluiert, was auf das Vorhandensein einer vorherrschenden Isoform hinweist (9). Eine Elektrophorese auf reduzierenden 15%-igen Polyacrylamid-SDS-Gelen zeigt, dass Noggin aus entweder E. coli-oder Insektenzellen eine Reinheit von mehr als 95% aufweist und als einzelne Bande wandert, die einem Protein von 20–30 kD entspricht. Noggin aus Insektenzellen zeigt eine etwas geringere Wanderungsgeschwindigkeit, was offensichtlich auf die zusätzliche Masse aufgrund der N-verbundenen Glycosylierung an der einzigen Konsensus-Stelle zurückzuführen ist (10). Eine Behandlung mit Endo F wandelt die Wanderungsgeschwindigkeit des in Insekten erzeugten Noggins in die des bakteriell erzeugten Proteins um.
In Abwesenheit reduzierender Mittel verhält sich Noggin, das entweder in E. coli oder in Baculovirus hergestellt wurde, wie ein Disulfid-verbundenes oligomeres Protein (10). Wie jedoch mittels Gelfiltrations-Analyse und Massenspektroskopie gezeigt, ist Noggin hauptsächlich ein dimeres Protein.
Circulardichroismus-Untersuchungen zeigen, dass sowohl rekombinantes Noggin, das aus E. coli rückgefaltet und aufgereinigt wurde, als auch Noggin, das aus Insektenzellen aufgereinigt wurde, sehr ähnliche Konformationen aufweisen (11). Die mittels dieses Verfahrens ermittelte Sekundär-Struktur zeigt, dass Noggin zu 48% aus Alpha-Helix-Strukturen, zu 0% aus Beta-Strukturen und zu 52% aus Zufallsknäuel-Strukturen besteht.
Biologische Aktivität von humanem Noggin, das in E. coli und Baculovirus hergestellt wurde Die biologische Aktivität von humanem Noggin, da in E. coli oder in Baculovirus hergestellt wurde, wurde durch Testen der Muskel-Actin-Expression in dem a. a. O. beschriebenen ventral-marginalen Zonen-Test bestimmt. Die in 12 gezeigten Ergebnisse zeigen eine positive Dosis-Reaktion bezüglich der Induzierung der Muskel-Actin-mRNA in VMZ, die entweder mit bakteriell hergestelltem humanen Noggin oder mit in Baculovirus hergestelltem humanen Noggin behandelt worden waren.
Beispiel 8
Herstellung und Charakterisierung des monoclonalen Ratten-Antikörpers RP57-16, der mit humanem Noggign reagiert
Materialien und Verfahren
Herstellung des Antikörpers
Der monoclonale Ratten-Antikörper RP57-16, der mit rekombinantem humanen und Xenopus-Noggin reagiert, wurde durch Immunisierung einer weiblichen Lewis-Ratte mit vier 35 μg-Injektionen von gereinigtem rekombinantem humanen Noggin (hergestellt in E. coli) über einen 2-monatigen Zeitraum hergestellt. Zur ersten Immunisierung wurde das Protein in komplettem Freund-Adjuvans in die Fußballen-Rückseite injiziert. Nachfolgende Injektionen wurden in den gleichen Fußballen unter Verwendung von inkomplettem Freund-Adjuvans verabreicht. Die Ratte wurde 3 Tage nach der vierten Injektion getötet.
Lymphknoten-Zellen der immunisierten Ratte würden im Verhältnis von 2 : 1 mit SP2/0-E.O.-Maus-Myelomzellen gemischt. Nach Zentrifugation wurde das Zellgemisch über einen Zeitraum von insgesamt 3 Minuten in 0,25 ml 42% (Gew./Vol.) PEG 3350 (Baker) in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung mit 10% (Vol./Vol.) Dimethylsulfoxid (Sigma) in einem 37°C-Wasserbad resuspendiert. Die Zellen wurden in einer Dichte von 5 × 10⁴ Lymphocyten pro Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen (Falcon 3072) in DMEM/F-12 (Mediatech, Inc.) enthaltend 10% FBS (angereichert mit Streptomycin, Penicillin, Pyruvat und Glutamin) und HMGT (1,6 × 10^–3 M Thymidin, 4,0 × 10^–4 Methotrexat, 1,3 × 10^–3 Natriumhydrogencarbonat und 1,0 × 10^–2 Hypoxanthin) ausplattiert. Nach einer 10-tägigen Kultur wurden die Überstände geerntet und mittels eines indirekten ELISA-Tests im Hinblick auf Antikörper-Aktivität gegen rekombinantes humanes Noggin getestet. Der Überstand aus COS-MS-Zellen, die mit dem das humane Noggin-Gen enthaltenden Plasmid transfiziert wurden, wurden die Nacht über in Probind-Testplatten mit 96 Vertiefungen (Falcon 3915) luftgetrocknet. Nicht-spezifische Bindung wurde mittels einer 2-stündigen Inkubation mit PBS/1% BSA (Sigma) bei Raumtemperatur beseitigt. Die Platten wurden zweimal mit PBS/0,02% Tween 20 gewaschen. Danach wurden Kulturüberstände zugegeben und bei Raumtemperatur wurde eine 1-stündige Inkubation durchgeführt. Die Platten wurden 4-mal mit PBS/0,02% Tween 20 gewaschen. Ein 1 : 2000 in PBS/1% BSA verdünnter sekundärer Antikörper, bei dem es sich um ein Konjugat eines gegen Ratten-IgG gerichteten Ziegen-Antikörpers (H + L) mit alkalischer Phosphatase (Caltag) handelte, wurde in jede Vertiefung zugegeben und die Platten wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden erneut 4-mal mit PBS/0,02% Tween 20 gewaschen. Die Antikörper-Bindung wurde durch eine 1-stündige Inkubation bei Raumtemperatur in der Dunkelheit mit 1 mg/ml pNPP (p-Nitrophenylphosphat, Sigma) in Diethanolamin-Puffer, pH-Wert 9,8, sichtbar gemacht. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens 100 mM EDTA gestoppt. Die Extinktion wurde bei 405 nm auf einer Thermomax-Mikroplatten-Lesevorrichtung (Molecular Devices) bestimmt. Eine Reaktion wurde dann als positiv bewertet, wenn die Extinktion das 2-fache der der Negativ-Kontrolle (nur Lösungsmittel und anschließend Behandlung mit sekundärem Antikörper und Substrat) betrug. Positive Clone wurden vermehrt, und der Kulturüberstand, der den monoclonalen Antikörper enthielt, wurde für die Analyse der Spezifität gesammelt.
RP57-16-Clone wurden in Weichagar erhalten. Clonierte Hybrid-Zellen wurden in DMEM/F-12 (Mediatech, Inc.) enthaltend 10% FBS (angereichert mit Streptomycin, Penicillin, Pyruvat und Glutamin) vermehrt. Der den Antikörper enthaltende Überstand wurde in Aliquotes aufgeteilt und bis zur Verwendung bei –70° C aufbewahrt.
Analyse der Spezifität
ELISA
100 ng aufgereinigtes rekombinantes humanes Noggin-, Xenopus-Noggin-, BDNF-, NT-3- und NT-4-Protein wurden separat einer passiven Adsorption an Probind-Testplatten mit 96 Vertiefungen unterworfen, wobei die Nacht über in 50 mM-Hydrogencarbonat-Puffer, pH-Wert 9,6 bei 4°C inkubiert wurde. BDNF, NT-3 und NT-4 wurden zur Bestimmung der nicht-spezifischen Bindung des monoclonalen Ratten-Antikörpers RP57-16 verwendet. Überstände von COS-MS-Zellen, die entweder mit dem das humane Noggin-Gen enthaltenden Plasmid oder dem Plasmid, das das Xenopus-Noggin-Gen mit der flg-Markierung des C-Terminus enthielt, transfiziert worden waren, wurden die Nacht über in Probind-Platten mit 96 Vertiefungen luftgetrocknet. Die nicht-spezifische Bindung wurde durch eine 2-stündige Inkubation bei Raumtemperatur mit PBS/1% BSA (Sigma) beseitigt. Die Platten wurden 2-mal mit PBS/0,02% Tween 20 gewaschen. Unverdünntes RP57-16 wurde zugegeben und es wurde eine 1-stündige Inkubation bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Platten wurden 4-mal mit PBS/0,02% Tween 20 gewaschen. Ein 1 : 2000 in PBS/1% BSA verdünnter sekundäre Antikörper, bei dem es sich um das Konjugat eines gegen Ratten-IgG gerichteten Ziegen-Antikörpers (H+L) mit alkalischer Phosphatase (Caltag) handelte, wurde in jede Vertiefung zugegeben und die Platten wurden bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Die Platten wurden erneut 4-mal mit PBS/0,02% Tween 20 gewaschen. Die Antikörper-Bindung wurde mittels einer 1-stündigen Inkubation mit 1 mg/ml pNPP (p-Nitrophenylphosphat; Sigma) in Diethanolamin-Puffer, pH-Wert 9,8, bei Raumtemperatur in der Dunkelheit sichtbar gemacht. Die Reaktion wurde durch Zugabe eines gleichen Volumens von 100 mM EDTA gestoppt. Die Extinktion wurde bei 405 nm auf einer Thermomax-Mikroplatten-Lesevorrichtung (Molecular Devices) bestimmt. Eine Reaktion wurde positiv bewertet, wenn die Extinktion etwa das 2-fache der der Negativ-Kontrolle (Verdünnungsmittel allein, anschließend Behandlung mit sekundärem Antikörper und Substrat) betrug.
Elektrophorese und Western-Blot-Analyse
Der monoclonale Ratten-Antikörper RP57-16 wurde auch mittels Western-Blot-Analyse analysiert. 50 ng rekombinantes humanes Noggin wurde sowohl einer nicht-reduzierenden als auch einer reduzierenden Elektrophorese auf 12,5 %-igen SDS-Polyacrylamid-Gelen unterworfen und mittels Electroblotting auf Nitrocellulose-Membranen übertragen. Die Membranen wurden mit PBS/1% Casein/0,1% Tween 20 blockiert und danach 2 Stunden mit einem unverdünnten RP57-16-Kulturüberstand inkubiert. Nach 4-maligem Waschen in PBS/0,02% Tween 20 wurden die Membranen mit einer 1 : 5000-Verdünnung eines Konjugates eines gegen Ratten-IgG-gerichteten Ziegen-Antikörpers (H+L) mit Meerrettich-Peroxidase (Pelfreeze) in PBS/1% BSA/0,1% Tween 20 inkubiert. Die Membranen wurden 4-mal mit PBS/0,02% Tween 20 gewaschen. Die Proteine wurden mit ECL-Western Blot-Reagenzien (Amersham) entsprechend den Anweisungen des Herstellers sichtbar gemacht. Danach wurden die Membranen 5 Sekunden auf einen XAR 5-Scientific Imaging-Film (Kodak) aufgelegt.
Ergebnisse
Der monoclonale Ratten-Antikörper RP57-16 reagiert mit rekombinantem humanen und Xenopus-Noggin, ebenso mit rekombinantem humanen Noggin, das in E. coli, in Insektenzellen und in COS-MS-Zellen hergestellt wurde. Der Antikörper reagiert nicht mit den Neurotrophinen BDNF, NT-3 und NT-4. Eine Western Blot-Analyse zeigte, dass mit dem Antikörper sowohl reduziertes als auch nicht-reduziertes Protein nachgewiesen wird.
Beispiel 9
Erzeugung von Noggin-Deletionsmuteinen
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner die Entdeckung, dass natives humanes Noggin modifiziert werden kann, um neue Verbindungen mit hoch erwünschten Merkmalen zu erzeugen.
Der basische Bereich von Xenopus-Noggin entspricht den Aminosäuren 123–135 (KKHRLSKKLRRKL) des Moleküls (vgl. Smith, W. C. und Harland, R. M., Cell, 70 (1992), 829–840, hinsichtlich der Sequenz). Auf der Basis dessen, was über die TGF-β-Molekülfamilie bekannt ist, scheint der basische Bereich eine mögliche Prozessierungs-Stelle zu sein. Zum besseren Verständnis der Funktion des basischen Bereiches wurden Konstrukte von Xenopus-Noggin erzeugt, bei denen der hoch konservierte basische Bereich (Δ123–135) oder ein größerer Teil des Peptides einschließlich des basischen Bereiches (Δ91–135) deletiert war. Beide dieser Deletionsmutanten waren aktiv, wobei nach Injektion als RNA Embryonen mit Hyperdorsalentwicklung erhalten wurden. Außerdem zeigten vorläufige Experimente, dass Noggin eine Affinität bezüglich Heparin aufwies, während eine modifizierte Form, bei der der basische Bereich deletiert war, diese Bindungs-Aktivität nicht besaß.
Natives humanes Noggin (hNG) zeigt in tierischen Seren eine geringe biologische Verfügbarkeit, was wahrscheinlich auf seine Bindung an die extrazelluläre Matrix zurückzuführen ist. Es hat sich herausgestellt, dass mit Fc-Markierungen versehenes humanes Noggin (hNG-Fc) mit sehr hoher Affinität an BMP4 bindet (Zimmerman, L. B. et al., Cell, 86 (1996), 599–606). Die hNG-Modifikation hat zur Identifizierung von Verbindungen geführt, die eine verbesserte biologische Verfügbarkeit zeigen, wobei die Fähigkeit zur Bindung und Antagonisierung von knochenmorphogenetischen Proteinen (BMPs) beibehalten wird. Die zu veränderten biologischen Eigenschaften führenden spezifischen Modifikationen umfassen die Deletion von Aminosäuren, die nachgewiesenermaßen dafür verantwortlich sind, dass dem nativen Noggin-Molekül die Heparin-Bindungsaktivität verliehen wird. Dem erhaltenen modifizierten Noggin fehlt die Heparin-Bindungsaktivität, wobei es jedoch unerwartet die Fähigkeit zur Bindung von BMP4 und zur Wirkung als dessen Antagonist beibehält.
Die Anmelder der vorliegenden Erfindung haben insbesondere zwei Moleküle erzeugt, die als hNGΔ138–144Fc und hNGΔ133–144Fc bekannt sind. Bei diesen Molekülen handelt es sich um mit Fc-Markierungen versehene Deletions-Muteine von humanem Noggin, denen entweder die Aminosäuren 138 bis 144 (hNGΔ138–144Fc) oder 133 bis 144 (hNGΔ133-144Fc) fehlen und deren C-Termini mit der Fc-Domäne von humanem IgG 1 markiert sind. Zur Konstruktion der mit Fc-Markierungen versehenen Noggin-Formen kann ein BspEI-NotI-Fragment von humanem IgG1 (vgl. Davis, S. et al., Science, 266 (1994), 816–819; Economides, A. N. et al., Science, 270 (1995), 1351–1353) mit humanem Noggin fusioniert werden, indem ein eine Peptid-Brücken-Sequenz codierendes Oligonucleotides verwendet wird, wie von Zimmerman, L. B. et al., Cell, 86 (1996), 599–606 beschrieben. Wie nachstehend beschrieben, zeigten die Deletions-Muteine hNGΔ138–144Fc und hNGΔ133-144Fc sowohl eine gegenüber hNG-Fc identische Aktivität zur Bindung an BMP4 als auch eine reduzierte Affinität für Heparin sowie im Vergleich zu hNG überlegene pharmacokinetische Eigenschaften in tierischen Seren.
Konstruktion von hNGΔ133–144Fc
hNGΔ133–144Fc besteht aus der Sequenz von humanem Noggin (hNG) mit einer Deletion der Aminosäuren 133 bis 144 (die Nummerierung beginnt mit dem ersten Methionin-Rest, der Aminosäure-Nummer 1 ist), die über eine Ser-Gly-„Brücke" (codiert von einer gentechnisch hergestellten Bsp EI-Restrictionsenzym-Stelle) mit dem konstanten Bereich von humanem Immunglobulin G1 (Fc) fusioniert ist (14) (SEQ ID Nr. 23). hNGΔ133–144Fc wurde mittels PCR konstruiert und unter Verwendung von gentechnischen Standard-Verfahren in den Säuger-Expressionsvektor pMT21 cloniert (pMT21.hNGΔ133–144Fc). Mittels Sequenzierung wurde bestätigt, dass die Sequenz von hNGΔ133–144Fc korrekt ist. Anschließend wurde dieses Deletionsmutein auch in den Expressionsvektor pSRa überführt, wobei sowohl die mit der Fc-Markierung versehene als auch die nicht markierte Version dieses hNG-Mutiens konstruiert wurden (pSRa.hNGΔ133–144Fc beziehungsweise pSRa.hNGΔ133–144).
Expression von hNGΔ133–144Fc
hNGΔ133–144Fc wurde am Anfang in COS7-Zellen unter Verwendung eines auf Lipofectamin (GIBCO/BRL) basierenden Transfektions-Protokolls exprimiert. hNGΔ133– 144Fc, das wie hNG sezerniert wird, wurde aus den konditionierten Medien aufgereinigt, indem man es durch eine Protein A-Sepharose-Säule (Pharmacia) hindurch laufen ließ und mit 100 mM Essigsäure, die anschließend mit Tris-Puffer bis zu einem pH-Wert von 7 neutralisiert wurde, eluierte. Die Reinheit dieses Präparates wurde mittels SDS-PAGE und anschließendem Färben mit dem Fluoreszenzfarbstoff SYPRO Orange (Molecular Probes, Inc.) überprüft. Das erhaltene Präparat wies anhand dieser Kriterien eine Reinheit von mehr als 90% auf, wobei es hauptsächlich in einer Disulfid-verbundenen Dimer-Form vorlag, was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt, die sowohl mit unmarkiertem hNG als auch mit hNG-Fc gemacht wurden, die beide ebenfalls Disulfid-verbundene Dimere bilden.
Aktivität von hNGΔ133–144Fc
Bindung an BMP4:
Zur Bestimmung, ob dieses hNG-Mutein aktiv war, wurde seine Fähigkeit zur Bindung an hBMP4 mit der von hNG-Fc verglichen, das humanes knochenmorphogenetisches Protein 4 (hBMP4) mit einer Affinität bindet, die im Wesentlichen identisch zu der von nicht markiertem hNG ist. Zum Vergleich der beiden Proteine wurde ein Test im ELISA-Format verwendet, wobei hBMP4 an der Oberfläche einer ELISA-Platte eingefangen wurde. Das hNGΔ133–144Fc-Mutein zeigte die gleich Bindung an BMP4 wie hNG-Fc (15), was darauf hinweist, dass die beiden Proteine die gleiche biologische Aktivität aufweisen.
Bindung an Heparin:
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung untersuchten das Heparin-Bindungsprofil von hNG-Fc und verglichen es mit dem von hNGΔ133–144Fc und eines anderen hNG-Deletionsmuteins, das im basischen Bereich eine kürzere Deletion trägt, nämlich hNGΔ138– 144Fc (auch als hNGΔKKLRRK-Fc bezeichnet). Wie in 16 gezeigt, beginnt hNG-Fc bei etwa 0,75 M NaCl von Heparin zu eluieren, während hNGΔ133-144Fc und hNGΔ138– 144Fc bei 0,25 M NaCl zu eluieren beginnen. Die Bindung an Heparin bei Konzentrationen von mehr als 0,5 M NaCl wird als Affinitäts-Wechselwirkung mit Heparin angesehen, während anzunehmen ist, dass die Bindung an Heparin bei Konzentrationen von weniger als 0,5 M NaCl auf ionische Wechselwirkungen zurückzuführen ist (Heparin enthält Sulfat-Gruppen, die negativ geladen sind, und hNG weist Bereiche auf, die positiv geladen sind). Daher scheint es, dass die beiden hNG-Deletionsmuteine hNGΔ133–144Fc und hNGΔ138– 144Fc mit Heparin durch ionische Wechselwirkungen in Wechselwirkung treten, während hNG-Fc Affinität für Heparin zeigt. Da die KKLRRK-Deletion (das heißt diejenige, die durch hNGΔ138–144Fc verkörpert wird) ausreicht, die Wechselwirkung mit Heparin bis auf die für ionische Wirkungen erwartete zu reduzieren, schlussfolgern die Erfinder, dass die Sequenz KKLRRK (das heißt, Aminosäuren 138 bis 144 in hNG) die Heparin-Bindungsdomäne von hNG darstellt oder diese enthält. Die Fc-Domäne zeigt keine Bindung an Heparin.
Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens haben die Erfinder auch festgestellt, dass hNG und hNG-Fc eine identische Bindung an Heparin zeigen, während eine chemisch modifizierte hNG-Form (Citraconyl-hNG) nicht an Heparin bindet. Die Erfinder haben auch das Heparin-Bindungsprofil eines anderen hNG-Deletionsmuteins untersucht, das eine längere Deletion über den basischen Bereich hinaus aufweist, nämlich hNGΔ133–179Fc. hNGΔ133–179Fc zeigt das gleiche Bindungsprofil an Heparin wie hNGΔ133–144Fc und hNGΔ138–144Fc, was darauf hinweist, dass eine weitere Deletion der stromabwärts vom basischen Bereich gelegenen Sequenz nicht zu einer weiteren Verminderung der ionischen Komponente der hNG-Bindung an Heparin fuhrt. Daraus ziehen die Erfinder die Schlussfolgerung, dass die ionische Komponente der hNG-Bindung an Heparin innerhalb der Kunitz-artigen hNG-Domäne liegen muss. Außerdem sind das chemisch modifizierte Citraconyl-hNG und die beiden Deletionsmuteine hNGΔ138–144Fc und hNGΔ133–144Fc allesamt biologisch aktiv (d. h., sie binden BMP4 mit der gleichen apparenten Affinität wie hNG-Fc), während das Deletionsmutein hNGΔ133–179Fc inaktiv ist. Zusammen gefasst zeigen diese Ergebnisse, dass die hNG-Bindung an Heparin von der Bindung an BMP4 getrennt werden kann, und dass die Heparin-Bindungsdomäne von hNG nicht für dessen BMP4-Blockierungsaktivität erforderlich ist.
Pharmacokinetisches Profil von hNGΔ133–144Fc
Die pharmacokinetischen Eigenschaften von hNGΔ133–144Fc wurden sowohl bei Mäusen als auch bei Ratten getestet. Es ist bereits bestimmt worden, dass nicht modifiziertes hNG, das in E. coli exprimiert und rückgefaltet wurde, nach intravenöser Verabreichung in Rattenserum eine sehr geringe biologische Verfügbarkeit zeigt, wobei die apparente Halbwertzeit weniger als 60 Minuten beträgt. Citraconyl-hNG, das nicht an Heparin bindet, zeigt eine 30-fache Verbesserung der biologischen Verfügbarkeit, verschwindet jedoch ebenfalls etwa 2 Stunden nach Injektion aus dem Blutkreislauf. Die Erfinder schlossen daraus, dass hNGΔ133–144Fc, das nicht an Heparin bindet und das auch eine Fc-Markierung aufweist, eine längere Halbwertzeit in vivo aufweist. Zur Untersuchung dieser Möglichkeit wurde hNGΔ133–144Fc Mäusen und Ratten injiziert, und seine biologische Verfügbarkeit in Seren wurde bestimmt.
Wenn hNGΔ133–144Fc Mäusen intraperitoneal (ip) injiziert wurde, war es selbst nach 24 Stunden, dem spätesten Zeitpunkt, wo Proben entnommen wurden, nachweisbar, wobei Titer von 2 μg/ml erreicht wurden (17A). Eine intravenöse Injektion in Ratten zeigte auch günstige pharmacokinetische Eigenschaften, obwohl die späteste Serum-Probe nach 6 Stunden entnommen wurde. Bei diesem Experiment wurden etwa 18 μg/ml hNGΔ133–144Fc nachgewiesen (17B). Ähnliche Ergebnisse sind mit hNGΔ138–144Fc erhalten worden, was darauf hinweist, dass die Deletion der Heparin-Bindungsdomäne von hNG für das gegenüber hNG verbesserte pharmacokinetische Profil dieser Moleküle verantwortlich ist. Da der zum Nachweis von hNGΔ133–144Fc in tierischen Seren nach ip- oder nach iv-Injektion verwende Test auf der Fähigkeit von hNGΔ133–144Fc zur Bindung an BMP4 beruht, ist auch bekannt, das das nachgewiesene hNGΔ133–144Fc funktional ist und mit BMP4 in Wechselwirkung treten kann. Da hNG eine sehr hohe Affinität für BMP4 zeigt, ist außerdem zu erwarten, dass die in diesen Experimenten erreichten hNGΔ133–144Fc-Titer die BMP4-Aktivität im tierischen Modell und in der klinischen Praxis blockieren.
Beispiel 10
Konstruktion des hNGΔB2-Säuger Expressionsplasmides pSRa.hNGΔB2
Ein die cDNA des humanen Noggin Muteins hNGΔ133–144 (ohne Fc-Markierung) enthaltender Säuger-Expressionsvektor wurde wie folgt konstruiert. Nachfolgend wird hNGΔ133–144 auch als hNGΔB2 bezeichnet. Ähnlich wird hNGΔ138–144 als hNGΔB1 bezeichnet.
Das als pCAE294 bezeichnete Plasmid, das die cDNA für humanes Wildtyp-Noggin (hNG) enthält, die in den Säuger-Expressionsvektor pSRa subcloniert worden war, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Mlu I (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) gespalten. Durch diese Restriktionsspaltung wird ein 4 kb-DNA-Fragment freigesetzt, das sowohl die vollständige pSRa-Vektor-Sequenz als auch das C-terminal gelegene Drittel (223 Nucleotide) von humanem Wildtyp-Noggin (hNG) umfasst. Das Fragment wurde mittels molekularbiologischer Standard-Verfahren Gel-gereinigt (vgl. beispielsweise Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Herausgeber: Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY).
Das als pCAE302 bezeichnete Plasmid, das die cDNA für hNGΔ133–144-Fc (vgl. Beispiel 9) enthält, die in den Expressionsvektor pMT21 (Genetics Institute, Inc.) subcloniert worden war, wurde mit den Restriktionsenzymen EcoRI und Mlu I gespalten, wobei ein 500 bp-DNA-Fragment beigesetzt wurde, das die am N-Terminus gelegenen zwei Drittel (439 Nucleotide) von humanem Noggin-Mutein codiert, das eine Deletion der die Aminosäuren 133 bis 144 codierenden Sequenz aufweist. Dieses DNA-Fragment wurde ebenfalls Gel-gereinigt. Das 500 bp-DNA-Fragment und das 4 kb-DNA-Fragment wurden entsprechend Standard-Verfahren ligiert (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Herausgeber: Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY), wobei der neue Säuger-Expressionsvektor pSRa.hNGΔB2 erzeugt wurde.
Beispiel 11
Konstruktion des prokaryotischen hNGΔB2-Expressionsplasmides pRG625
Ein prokaryotischer Expressionsvektor, der die cDNA für das humane Noggin-Mutein hNGΔ133–144 (hNGΔB2) enthält, wurde wie folgt konstruiert.
Ein DNA-Fragment, das die cDNA für humanes Noggin (hNG) codiert, wurde aus einem als pUC-hNog#7 bezeichneten Plasmid, das die cDNA für humanes Noggin enthält, die in den Vektor pUC subcloniert worden war, PCR amplifiziert. Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung von Standard-Verfahren durchgeführt (vgl. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Herausgeber: Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY), wobei die Amplifikationsprimer:
(SEQ ID Nr. 24)
(SEQ ID Nr. 25)
Das erhaltene PCR-amplifizierte 1005 bp-DNA-Fragment wurde mit den Restriktionsenzym Sph 1 (New England Biolabs, Beverly, Massachusetts) gespalten und in pRG09 ligiert, ein Plasmid mit niedriger Kopienzahl, das das β-Lactamase-Gen und den lacUV5-Promotor enthält und das zur Ligierung durch Spaltung mit den Restriktionsenzymen Sph I und Nru I präpariert worden war. Nach Ligierung und bakterieller Transformation wurde ein Clon, der das humane Noggin-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV5-Promotors enthält, identifiziert und als pRG292 bezeichnet. Das Plasmid pRG292 wurde mit den Restriktionsenzymen Swa I und Bsm I gespalten, wobei ein 1054 bp-DNA-Fragment freigesetzt wurde. Dieses DNA-Fragment wurde mittels Standard-Verfahren Gel-gereinigt und in pCP146 ligiert, eine das kan 1-Gen codierendes Plasmid mit hoher Kopienzahl, das zur Ligierung mittels Spaltung mit den Restriktionsenzymen SwaI und BsmI präpariert worden war. Das erhaltene Plasmid wurde als pRG301 bezeichnet. Zur Konstruktion der ΔB2-Deletion (Deletion der die Aminosäuren 133–144 codierenden Sequenz) wurde pRG301 mit den Restriktionsenzymen Mlu I und Msc I gespalten, wobei ein im humanen Noggin-Gen enthaltenes internes 238 bp-Fragment freigesetzt wurde (Nucleotide 378–615 von SEQ ID Nr.:1). Dieses Fragment wurde dann durch ein 202 bp-Fragment ersetzt, das innerhalb des hNGΔB2-Gens in pVAE302 liegt (vgl. Beispiel 9 – pMT21.hNGΔ133–144 Fc), das durch Spaltung mit Mlu I und Msc I freigesetzt wurde. Das erhaltene prokaryotische Expressionsplasmid wurde als pRG625 bezeichnet.
Beispiel 12
Expression von hNGΔB2 in E. coli
Der E. coli-Wirtsstamm RFJ141, der das hNGΔB2-Expressionsplasmid pRG625 enthält, wurde in 40 1 Medium in einem 60 L-Bioreaktor (ABEC, Inc., Allentown, PA) gezüchtet. Das Glukose-Minimalmedium enthielt Dibasisches Kaliumphosphat (5 g/l), monobasisches Kaliumphosphat (1 g/l), Ammoniumsulfat (0,35 g/l), Natriumcitrat (1 g/l), Natriumsulfat (1,3 g/l), das Antischaummittel Dow P2000 (1 ml/l), Calciumchlorid (0.075 g/l), 30 g/l Glucose und 3 ml/l einer Spurenelemente enthaltenden Lösung (3 ml/l), enthaltend geeignete Spurenmengen von Eisensulfat, Zinksulfat, Kupfersulfat, Mangansulfat, Cobaltchlorid und Natriummolybdat.
Die Fermentation wurde bei einer Temperatur von 37°C durchgeführt. Der pH-Wert der Fermentation wurde unter Verwendung von gasförmigem Ammoniak auf 7,0 eingestellt, und gelöster Sauerstoff bei einer Konzentration von 20% durch einen allmählichen Druckanstieg, Lüftung und Sauerstoff-Fluss zur Aufrechterhaltung des vorgegebenen Wertes. Wenn die optische Dichte einen Wert von 50 erreichte, wurde die Proteinsynthese-Induzierung durch Zugabe des chemischen Induktors Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid (IPTG) eingeleitet. Man ließ die Fermentation weitere 3 Stunden fortschreiten, so dass sich eine ausreichende Menge des hNGΔB2-Proteins in den Zellen akkumulieren konnte. Die Zellen wurden mittels Tangentialfluß-Filtration unter Verwendung von Koch-500 NMWCO-Hohlfaserfiltern geerntet und in einen Lyse-Puffer, enthaltend 20 mM Tris, 20 mM EDTA und 120 mM NaCl diafiltriert und bei –20°C eingefroren.
Beispiel 13
Rückfaltung und Aufreinigung von hNGΔB2
Zellen aus der Fermentation wurden aufgetaut, in 20 mM Tris, 20 mM EDTA, 1% Tween 80-Puffer resuspendiert und unter Verwendung einer Manton Gaulin-Homogenisiervorrichtung bei 8000 psig aufgebrochen. Unter Verwendung eines Tangentialfluß-Filtrationssystems mit Microgon-Hohlfasermembranen (Microgon, CA) mit einer nominellen Porengröße von 0,2 Micron wurden Einschlusskörperchen zur Entfernung kontaminierender E. coli-Proteine gewaschen. Der zum Waschen der Einschlusskörperchen verwendete Puffer enthielt 20 mM Tris, 20 mM EDTA und 1% Tween 80. Die gewaschenen Einschlusskörperchen wurden in 6 M Guanidinhydrochlorid und 10 mM DTT solubilisiert. Das Protein wurde teilweise aufgereinigt, indem das Protein durch eine 100 K-Ultrafiltrationsmembran (Millipore, MA) zur Entfernung von Verunreinigungen hohen Molekulargewichts und von Lipiden hindurch gelaufen lassen wurde. Das Protein wurde mit einem 10 K-Filter (Millipore, MA) konzentriert und dann zur Rückfaltung auf eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml in einem Puffer, enthaltend 1,5 M Guanidinhydrochlorid, 20% Glycerin, 20 mM Tris, 2 mM EDTA, 0,5 mM oxydiertes Glutathion und 5 mM reduziertes Glutathion, verdünnt. Man ließ das Protein 8 Tage bei 4°C rückfalten. Das rückgefaltete Protein wurde konzentriert und in einen Puffer, enthaltend 4 M Harnstoff, 20 mM Natriumacetat, pH-Wert 4,0, diafiltriert und auf eine Säule mit einem Durchmesser von 10 cm, die 2,8 1 SP-Sepharose FF-Harz (Pharmacia) geladen, die mit 20 mM Natriumacetat, 20% Glycerin, 4 M Harnstoff und 0,02% CHAPS äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit drei Säulenvolumina des gleichen Puffers, der 350 mM NaCl enthielt, gewaschen. Das Protein wurde mit einem ansteigenden Salz-Gradienten (400– 750 mM NaCl) mit zehn Säulenvolumina unter Verwendung des gleichen Puffers eluiert. Eine weitere Proteinmenge wurde bei einem pH-Wert von 8,5 unter Verwendung von 20 mM Bicine, 20 mM Acetat, 20% Glycerin, 4 M Harnstoff und 500 mM NaCl eluiert. Das eluierte Protein wurde 4-fach verdünnt, um die Löslichkeit zu erhalten. Das Protein wurde konzentriert und in einen Puffer, enthaltend 4 M Harnstoff, 20 mM Bicine, pH-Wert 8,5, diafiltriert und auf eine Säule mit einem Durchmesser von 10 cm, enthaltend 2,8 1 Q-Sepharose FF-Harz (Pharmacia) aufgetragen, die mit Puffer A (4 M Harnstoff, 20% Glycerin, 50 mM Bicine, 0,02% CHAPS, pH-Wert 8,5) äuilibriert worden war. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen und mit einem linearen Salz-Gradienten von 100 mM bis 300 mM NaCl über 7 Säulenvolumina bei 100 ml/min. eluiert. Die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert und vereinigt, wobei 1,8 Gramm gereinigtes hNGΔB2-Protein bereitgestellt wurden.
Beispiel 14
Pegylierung von hNGΔB2
Die Deletionsmutante hNGΔB2 wurde mittels kovalenter Anlagerung von Polyethylenglycol unter Verwendung des folgenden Verfahrens modifiziert. Methoxy-PEG-propionaldehyd (MG = 20 000) von Shearwater Polymers (Kat. Nr. M-ALD-20000) wurde mit 300 mg hNGΔB2 (MG = 21,495) bei einem stöchiometrischen Verhältnis von 20 : 1 PEG-Reagenz zu Protein umgesetzt. Das Umsetzungsgemisch wurde sterilfiltriert und man ließ die Umsetzung 12 Tage bei Raumtemperatur unter einer Argon-Atmosphäre in einem Puffer, enthaltend 100 mM Bicine, 5 mM Natriumcyanoborhydrid, 20% Glycerin, 4 M aufgereinigten Harnstoff, pH-Wert 8,1, ablaufen. Die hNGΔB2-Konzentration im Umsetzungsgemisch betrug 0,75 mg/ml. Vor Verwendung wurde der Harnstoff vorgereinigt, indem man ihn über eine Kationenaustauschsäule zur Entfernung kontaminierender Amine laufen ließ. Die Verwendung des Cyaonoborhydrids ist erforderlich, um das Schiff-Basen-Zwischenprodukt zu einer sekundären Amin-Bindung zwischen dem mit einer Methoxy-Cap-Struktur versehene PEG und der umgesetzten Aminogruppe des Proteins zu reduzieren. Das Umsetzungsprodukt enthielt ein Gemisch von unPEGylierten, monoPEGylierten und polyPEGylierten Formen.
Beispiel 15
Aufreinigung von PRG-hNGΔB2
Die Aufreinigung von monoPEGyliertem hNGΔB2 wurde unter Verwendung eines zwei Schritte umfassenden Chromatographie-Verfahrens, zu dem ein Kationenaustausch und anschließend ein Größenausschluß gehörten, durchgeführt. Im ersten Schritt wurde das Umsetzungsgemisch um den Faktor 5 mit Puffer A, enthaltend 4 M Harnstoff, 15 mM Natriumcitrat, 20% Glycerin, pH-Wert 5,5, verdünnt und auf eine Chromatographiesäule mit einem Durchmesser von 5 cm und einer Länge von 13 cm (Pharmacia XK50) aufgetragen, die mit SP-Sepharose HP-Kationenaustausch-Harz (Pharmacia) gepackt worden war, wobei eine lineare Geschwindigkeit von 45 cm/HR verwendet wurde. Nach Beladung wurde die Säule mit Puffer A gewaschen und PEGylierten hNGΔB2 wurde unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 500 mM NaCl in Puffer A über 6 Säulenvolumina bei einer linearen Durchflussgeschwindigkeit von 45 cm/h eluiert. Mit den Säulen-Fraktionen wurde eine SDS-PAGE-Gelanalyse durchgeführt und diejenigen, die monoPEGyliertes hNGΔB2 enthielten, wurden vereinigt. Das monoPEGylierte Protein (PEG-hNGΔB2) wurde unter Verwendung eines Amicon-Rühr-Zellkonzentrators mit einem Durchmesser von 7 cm auf 0,76 mg/ml konzentriert. Das Protein wurde auf eine 100 cm-XK26-Säule (Pharmacia) geladen, die 95 cm Superdex 200-Größenausschluß-Harz (Pharmacia) enthielt, die mit 2 M Harnstoff, 150 mM NaCl, 20% Glycerin, 10 mM Natriumcitrat, pH-Wert 5,5, äquilibriert worden war. Das Protein wurde bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 3 ml/min. eluiert. Die Fraktionen wurden mittels SDS-PAGE analysiert, und die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt. Das vereinigte monoPEGylierte hNGΔB2 wurde in 50 mM Tris, 150 mM NaCl, 10% (Vol./Vol.) Glycerin, pH-Wert 7,5, dialysiert. Das Protein wurde in Aliquotes aufgeteilt und bei –40°C gefroren aufbewahrt.
Beispiel 16
Vergleich der Heparin-Bindungsprofile von hNG, PEG-hNG, Citraconyl-hNG hNGΔB1 hNGΔB2, PEG-hNGΔB2 und hNGΔB2-Fc
Proteine, die geringe Affinität für Heparin zeigen, können von Affinitätssäule früher, das heißt, bei einer geringen NaCl-Konzentration, als Proteine eluiert werden, die eine hohe Affinität zu Heparin zeigen (Lobb, R. R. et al., Anal Biochem. Apr., 154 (1986), 1–14). Die Bindung an Heparin bei einer Salzkonzentration von 0,1 bis 0,5 M NaCl wird auf ionische Wechselwirkungen mit den Sulfat-Gruppen, die auf Heparin vorhanden sind, zurückgeführt, währen die Bindung oberhalb von 0,5 M NaCl auf bona fide-Heparin-Bindungsstellen zurückgeführt wird. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die Fähigkeit von sowohl hNG und hNG-Muteinen als auch markierter oder chemisch modifizierter hNG- und hNG-Protein-Formen zur Bindung mit Heparin unter Verwendung einer Heparin-Affinitäts-Säule hoher Auflösung verglichen, wobei die Idee darin bestand, dass eine geringe Bindung mit Heparin eine wünschenswerte Eigenschaft für ein Protein-Basierendes Pharmazeutikum ist, das zur systemischen Abgabe bestimmt ist. Eine Affinitätschromatographie hoher Auflösung war das Verfahren der Wahl, da es genauer und stark reproduzierbare Ergebnisse liefert und selbst kleine Unterschiede bei der Heparin-Bindung anzeigt. Die Heparin-Bindungsprofile von hNG, PEG-hNG, Citraconyl-hNG, hNGΔB1, hNGΔB2, PEG-hNGΔB2 und hNGΔB2-Fc wurden verglichen, indem sie schrittweise auf eine TSK-SW-Heparin-Säule (Toso Haas, Montgomeryville, PA) wie folgt injiziert wurden: von hNG, PEG-hNG, hNGΔB2-Fc und hNGΔB2 jeweils 40 μg; 9 μg Citraconyl-hNG und 15 μg PEG-hNGΔB2, jeweils in einem Volumen von 50 μl. Nach Injektion wurde jede Probe einem Salz-Gradienten von 150 mM bis 2 M NaCl in 100 mM Tris, pH-Wert 7,6, unterworfen und das Elutionsprofil der Proteine wurde mittels des A₂₈₀-Wertes kontrolliert.
Es stellte sich heraus, dass hNG bei 1,2 M NaCl eluierte (18A–18C), was mit früheren Experimenten übereinstimmte, bei denen ein Batch-Elutionsverfahren verwendet worden war. Mit Polyethylenglycol (PEG) mit einem MG von 20000 chemisch modifiziertes hNG unter Bildung von PEG-hNG führte zu einem Molekül, das eine nur marginal geringere Heparin-Affinität zeigte, und bei etwa 1 M NaCl eluierte (18A). Im Gegensatz dazu zeigte Citraconyl-hNG, bei dem es sich um hNG handelt, das an den zugänglichen Lysin (LYS)-Positionen mit Citraconyl-Gruppen chemisch modifiziert worden ist, wobei diese positiv geladenen Reste (unter physiologischen Bedingungen) zu negativ geladenen Resten verändert werden, eine extrem geringe Affinität für Heparin und eluierte bei 0,15 M NaCl (18A). Das bestätigt, dass der basische hNG-Bereich (Aminosäuren 133 bis 144, wobei die Nummerierung des ersten Methionin-Rests mit Nummer 1 beginnt), der 5 LYS-Reste enthält, die Heparin-Bindungsstelle von hNG für Heparin darstellt.
Das Deletionsmutein hNGΔB1 (auch bekannt als hNGΔKKLRRK oder hNGΔ139–144 a. a. O.) zeigte eine verminderte Bindung an Heparin und eluierte bei etwa 0,75 M NaCl (18B). Das Deletionsmutein hNGΔB2, dem zwei weitere LYS-Reste fehlen, eluierte noch früher im Gradienten bei etwa 0,6 M NaCl (18B). Eine weitere chemische Modifikation dieses Muteins durch ein einzelnes Molekül von PEG 20 000 bei einem stöchiometrischen von einem PEG-Molekül pro hNGΔB2-Dimer (PEG-hNGΔB2) führte zu einer weiteren Verminderung der Bindung an Heparin, wobei die Elution bei 0,45 M NaCl erfolgte ( 18B). Dies stimmt mit der Hypothese überein, dass PEG den Proteinen, an das es kovalent gebunden ist, erhöhte Löslichkeit verleiht und kann auch darauf zurückgeführt werden, dass einige der ionischen Wechselwirkungen, die zwischen hNGΔB2 und Heparin bestehen, maskiert werden. Interessanterweise kann eine ähnliche verminderte Bindung erreicht werden (18C), indem hNGΔB2 mit dem konstanten Bereich von humanem IgG1 (Fc) markiert wird, um das chimäre Protein hNGΔB2-Fc herzustellen.
Hinterlegung von Mikroorganismen
Die folgenden Mikroorganismen wurden bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852 unter den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt:
Obwohl die vorliegende Erfindung in Verbindung mit bevorzugten spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden ist, sollen die Beschreibung und Beispiele den Schutzumfang der Erfindung nur veranschaulichen und nicht beschränken.
Sequenzprotokoll

Claims

Menschliches Noggin-Polypeptid (SEQ ID Nr. 2) oder ein im Wesentlichen ähnliches Noggin-Polypeptid, wobei das Polypeptid durch die Deletion von mindestens der Aminosäuresequenz KKLRRK modifiziert ist und die Dorsalentwicklung auslöst und die Aktivität der knochenmorphogenetischen Proteine (BMP) in Vertebraten blockiert.
Menschliches Noggin (SEQ ID Nr. 2), das durch eine Deletion der Aminosäuregruppen 138–144 modifiziert ist.
Menschliches Noggin (SEQ ID Nr. 2), das durch eine Deletion der Aminosäuregruppen 133–144 modifiziert ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das das modifizierte Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3 codiert.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4, das ein rekombinantes DNA-Molekül ist, welches mit einer Expressionskontrollsequenz funktionell verknüpft ist.
Wirtszelle, die mit dem rekombinanten DNA-Molekül nach Anspruch 5 transformiert ist.
Verfahren zur Herstellung eines modifizierten Noggin-Polypeptids umfassend: (a) Züchten einer rekombinanten Wirtszelle, die das DNA-Molekül nach Anspruch 6 enthält, so dass das DNA-Molekül von der Wirtszelle exprimiert wird, um das modifizierte Noggin-Polypeptid zu produzieren, und (b) Isolieren des exprimierten modifizierten Noggin-Polypeptids.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine eukaryotische Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Wirtszelle eine prokaryotische Zelle ist.
Arzneimittel, das ein modifiziertes Noggin-Polypeptid nach Anspruch 1, 2 oder 3 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Modifiziertes Noggin nach Anspruch 1, 2 oder 3, das mit Polyethylenglykol (PEG) konjugiert ist.
Arzneimittel, das das modifizierte Noggin nach Anspruch 11 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Modifiziertes Noggin nach Anspruch 1, 2, 3 oder 11, ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 4 oder eine Zusammensetzung nach Anspruch 10 oder 12 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung des menschlichen Körpers oder in einem Diagnoseverfahren.
Verwendung eines wie in Anspruch 1, 2, 3 oder 11 definierten modifizierten Noggins in der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer Knochen befallenden Erkrankung oder Störung.
Verwendung nach Anspruch 14 zur Behandlung von Fibrodysplasia ossificans progressiva (FOP).
Verwendung nach Anspruch 14 zur Behandlung einer Erkrankung oder Störung, die anormales Knochenwachstum zur Folge hat.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das anormale Knochenwachstum das krankhafte Knochenwachstum als Folge von Hüftersatzoperation, Trauma, Verbrennungen oder Rückenmarkverletzung ist.