DE69822856T2

DE69822856T2 - Aminoterminal verkürztes rantes als chemokin antagonist

Info

Publication number: DE69822856T2
Application number: DE69822856T
Authority: DE
Inventors: Paul Proost; Sofie Struyf; Jo Van Damme
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1997-09-29
Filing date: 1998-09-28
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2018-09-29
Also published as: AU9747498A; NO20001609D0; HUP0003505A2; PT1439231E; BR9812394A; BG104266A; EP1439231A3; US7338653B2; ES2287601T3; EE200000151A; UA73081C2; JP4230659B2; UA73080C2; DK1021541T3; HK1032426A1; DE69838188T2; US7326411B2; PL196427B1; NZ503235A; ES2218860T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft aminoterminal verkürzte RANTES, welchen die NH₂terminalen Aminosäuren fehlen, die den Aminosäureresten 1–2 der natürlich vorkommenden RANTES entsprechen und welche Chemokin-antagonistische Aktivität aufweisen, sowie cDNA-Sequenzen, welche sie kodieren, ihre Verwendung in der Therapie und/oder Diagnose von Krankheiten, in welchen eine antagonistische Aktivität der Chemokinwirkungen benötigt wird und pharmazeutische Zusammensetzungen, welche sie umfassen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Chemokine bilden eine Familie von kleinen pro-inflammatorischen Zytokinen mit Leukozyten-chemotaktischen und -aktivierenden Eigenschaften. In Abhängigkeit von der Position des ersten Cysteins kann die Chemokinfamilie in C-C-, C-X-C- und C-X₃-C-Chemokine unterteilt werden (Baggiolini M. et al., 1994; Baggiolini M. et al., 1997 und Taub D. et al., 1996).
Viele C-X-C-Chemokine, wie z. B. Interleukin-8 (IL-8) wirken chemotaktisch auf Neutrophile, während die C-C-Chemokine, wie z. B. das Monozyten-chemotaktische Protein-3 (MCP-3), aktiv auf eine Vielzahl von Leukozyten wirken, einschließlich Monozyten, Lymphozyten, Eosinophile, Basophile, NK-Zellen und dentritische Zellen.
Die NH₂-treminale Domäne von Chemokinen ist in die Rezeptorbindung involviert, und die NH₂-terminale Prozessierung kann die Chemokine aktivieren, ihre Chemokinaktivität vermindern oder die Chemokine vollständig inaktiv machen.
Das C-X-C-Chemokin Plättchen-basisches Protein (platelet basic protein) wird nur nach Entfernung der 24 NH₂-terminalen Reste zu einem Neutrophilen-chemotaktischen Peptid (NAP-2)(Walz A. et al., 1989 und Van Damme J. et al., 1990).
Die Deletion von bis zu 8 NH₂-terminalen Resten von IL-8 resultiert in einer verstärkten chemotaktischen Aktivität, die weitere Spaltung des Glu-Leu-Arg-Motivs jedoch, welches in allen Neutrophilen-chemotaktischen C-X-C-Chemokinen vor dem ersten Cys lokalisiert ist, verursacht eine vollständige Inaktivierung (Clark-Lewis I. et al., 1991).
Auf ähnliche Weise hat die NH₂-terminale Proteolyse (bis zu 8 Aminosäuren) eines anderen C-X-C-Chemokins, dem Granulozyten-chemotaktischen Protein-2 (GCP-2), keinen Effekt auf die Neutrophilen-chemotaktische Aktivität (Proost P. et al., 1993a).
Bei RANTES (ein Akronym für "Regulated upon Activation, Normally T Expressed, and presumably Secreted") handelt es sich um ein C-C-Chemokin, dessen cDNA-Klon von einer cDNA-Bibliothek, welche für T-Zell-spezifischen Sequenzen angereichert wurde, isoliert wurde (Schall T. J. et al., 1988).
Die synthetischen C-C-Chemokine MCP-1, MCP-3 und RANTES, welchen die 8 bis 9 NH₂-terminalen Aminosäuren fehlen, sind inaktiv in ihrer Wirkung auf Monozyten und sind nützlich als Rezeptorantagonisten (Gong J. et al., 1996; und Gong J. et al., 1995).
Die Verlängerung von RANTES mit einem Methionin resultiert in der vollständigen Inaktivierung des Moleküls, und Met-RANTES verhält sich als ein Antagonist gegenüber authentischem RANTES (Proudfoot A. E. et al., 1996).
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung sind aminoterminal verkürzte RANTES, welchen die NH₂-terminalen Aminosäuren fehlen, die den Aminosäureresten 1–2 der natürlich vorkommenden RANTES entsprechen und welche eine Chemokinantagonistische Aktivität aufweisen.
Eine besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist RANTES (3–68), welches ein RANTES ist, dem die ersten 2 Aminosäuren fehlen, wie in 1 und SEQ ID Nr. 2 gezeigt.
Das aminoterminal verkürzte RANTES gemäß der Erfindung kann in einer glycosylierten oder einer nicht-glycosylierten Form vorliegen.
Der Begriff "Chemokin-Antagonist" bedeutet "welcher als ein Antagonist auf die reifen, vollständig langen (full-length), natürlich vorkommenden Chemokine wirkt".
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung sind DNA-Moleküle, welche die DNA-Sequenzen umfassen, die für die aminoterminal verkürzten RANTES gemäß der Erfindung kodieren, einschließlich solcher Nukleotidsequenzen, welche im Wesentlichen die Gleichen sind. Die cDNA-Sequenz von intaktem RANTES ist in Schall T. J. et al. (1988) offenbart, und die cDNA des verkürzten RANTES kann einfach abgeleitet werden.
"Nukleotidsequenzen, welche im Wesentlichen die Gleichen sind" beinhalten alle weiteren Nukleinsäuresequenzen, welche aufgrund der Degeneration des genetischen Codes ebenfalls für die angegebenen Aminosäuresequenzen kodieren.
Die Erfindung beinhaltet außerdem Expressionsvektoren, welche die oben genannten DNAs umfassen, Wirtszellen, welche mit solchen Vektoren transformiert wurden und ein Verfahren zur Herstellung der aminoterminal verkürzten RANTES gemäß der Erfindung durch die Kultivierung der genannten transformierten Zellen in geeigneten Kulturmedien.
Die DNA-Sequenz, welche für die Proteine gemäß der Erfindung kodiert, kann in ein geeignetes Plasmid insertiert und ligiert werden. Sobald er fertiggestellt ist, wird der Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle eingeführt, welche anschließend den Vektor (die Vektoren) exprimiert, um das gewünschte Protein hervorzubringen.
Die Expression von jedem der rekombinanten Proteine gemäß der Erfindung wie hierin erwähnt kann in eukaryontischen Zellen (z. B. Hefen, Insekten- oder Säugetierzellen) oder in prokaryontischen Zellen, unter Verwendung der geeigneten Expressionsvektoren durchgeführt werden. Jedes auf dem Gebiet bekannte Verfahren kann angewendet werden.
Zum Beispiel werden die DNA-Moleküle, welche für die durch eines der oben genannten Verfahren erhaltenen Proteine kodieren, durch auf dem Gebiet wohl bekannte Verfahren in auf geeignete Weise konstruierte Expressionsvektoren insertiert (siehe Sambrook et al., 1989). Doppelsträngige cDNA wird durch Ankoppeln von Homopolymerschwänzen (homopolymeric tailing) oder durch Restriktionslinking, welches die Verwendung von synthetischen DNA-Linkern oder von Bluntend-Ligationsmethoden involviert, mit Plasmidvektoren verbunden: DNA-Ligasen werden verwendet, um die DNA-Moleküle zu ligieren, und unerwünschtes Verbinden wird durch die Behandlung mit Alkalischer Phosphatase vermieden.
Um im Stande zu sein, das gewünschte Protein zu exprimieren, sollte ein Expressionsvektor außerdem spezifische Nukleotidsequenzen umfassen, welche transkriptionelle und translationelle regulatorische Informationen enthalten, die mit der für das gewünschte Protein kodierenden DNA auf solche Art und Weise verknüpft sind, dass sie die Genexpression und die Produktion des Proteins ermöglichen. Damit das Gen transkribiert werden kann, muss ihm zunächst ein Promotor vorangehen, welcher für die RNA-Polymerase erkennbar ist und an welchen die Polymerase bindet und somit den Transkriptionsvorgang initiiert. Verschiedene solcher Promotoren werden verwendet, welche mit unterschiedlichen Effizienzen funktionieren (starke und schwache Promotoren).
Für eukaryontische Wirte können verschiedene transkriptionelle und translationelle regulatorische Sequenzen verwendet werden, in Abhängigkeit von der Art des Wirtes. Sie können von viralen Quellen, wie z. B. dem Adenovirus, dem bovinen Papillomavirus, dem Simianvirus oder dergleichen stammen, in welchen die regulatorischen Signale mit einem bestimmten Gen assoziiert sind, welches eine Expression auf hohem Niveau aufweist. Beispiele sind der TK-Promotor des Herpesvirus, der SV40-frühe Promotor, der Hefe-gal4-Genpromotor, etc. Regulatorische Signale für die transkriptionelle Initiation können ausgewählt werden, welche die Repression und Aktivierung erlauben, so dass die Expression der Gene moduliert werden kann.
Das DNA-Molekül, welches die für das Protein gemäß der Erfindung kodierende Nukleotidsequenz umfasst, wird in einen Vektor (Vektoren) insertiert, welcher) die in funktioneller Weise verbundenen transkriptionellen und translationellen regulatorischen Signale aufweist und welcher fähig ist, die gewünschten Gensequenzen in die Wirtszelle zu integrieren.
Die Zellen, welche durch die eingefügte DNA stabil transformiert wurden, können dadurch selektiert werden, dass außerdem ein oder mehrere Marker eingeführt werden, welche die Selektion der Wirtszellen, die den Expressionsvektor beinhalten, erlauben. Der Marker kann außerdem einem auxotrophen Wirt Phototrophie zur Verfügung stellen, Biozidresistenz, z. B. gegen Antibiotika oder Schwermetalle, wie z. B. Kupfer und dergleichen. Das selektierbare Markergen kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Sequenzen verbunden sein oder durch Kotransfektion in die gleiche Zelle eingeführt werden. Zusätzliche Elemente können außerdem für die optimale Synthese von Proteinen gemäß der Erfindung erforderlich sein.
Wichtige Faktoren bei der Auswahl eines bestimmten Plasmids oder viralen Vektors beinhalten: die Leichtigkeit, mit welcher die Rezipientenzellen, die den Vektor enthalten, erkannt werden können und aus solchen Rezipientenzellen, die den Vektor nicht enthalten, selektiert werden können; die Anzahl von Kopien des Vektors, welcher in einem bestimmten Wirt gewünscht wird; und ob es wünschenswert ist, in der Lage zu sein, den Vektor zwischen Wirtszellen unterschiedlicher Spezien zu "shutteln".
Sobald der Vektor (die Vektoren) oder die das Konstrukt (die Konstrukte) enthaltene DNA-Sequenz für die Expression hergestellt wurde, kann das DNA-Konstrukt (die Konstrukte) durch jedes von einer Vielzahl von geeigneten Mitteln in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden: durch Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Calciumphosphatpräzipitation, direkte Mikroinjektion, etc.
Die Wirtszellen können entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein. Bevorzugt sind eukaryontische Wirte, z. B. Säugetierzellen wie z. B. humane Zellen, Affenzellen, Mauszellen und Ovarzellen des chinesischen Hamsters (Chinese hamster ovary, CHO), da sie Proteinmolekülen posttranslationelle Modifikationen zur Verfügung stellen, einschließlich einer korrekten Faltung oder der Glycosylierung an den korrekten Positionen. Auch Hefezellen können posttranslationelle Peptidmodifikationen, einschließlich der Glycosylierung, ausführen. Eine ganze Anzahl von rekombinanten DNA-Strategien existiert, welche starke Promotorsequenzen und hohe Kopienzahlen von Plasmiden verwenden, welche für die Produktion der gewünschten Proteine in Hefe verwendet werden können. Hefe erkennt die Leadersequenzen in klonierten Säugetier-Genprodukten und sezerniert Peptide, welche Leadersequenzen tragen (d. h. Präpeptide).
Nach der Einführung des Vektors (der Vektoren) werden die Wirtszellen in einem selektiven Medium vermehrt, welches aufgrund des Wachstums von Vektor-enthaltenden Zellen selektioniert. Die Expression der klonierten Gensequenzen) resultiert in der Produktion der gewünschten Proteine.
Das aminoterminal verkürzte RANTES gemäß der Erfindung kann durch jede andere auf dem Gebiet wohl bekannte Prozedur hergestellt werden, insbesondere durch die gut etablierten Verfahren der chemischen Synthese, welche automatisierte Festphasenpeptidsynthesizer verwenden, gefolgt von chromatografischer Reinigung.
Die Chemokine gemäß der Erfindung können z. B. durch Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl), tBoc (t-Butoxycarbonyl) oder jede andere vergleichbare chemische Synthese mit oder ohne geeignete Seitenkettenschutzgruppen auf den verschiedenen Aminosäuren synthetisiert werden. Die Aminosäuren mit oder ohne geeignete Seitenkettenschutzgruppen werden voraktiviert- z. B. mit HBTU/HOBt [2-(1H-Benzotriazol-1yl)-1,1,3,3-tetramethyluromiumhexafluorphosphat/1-Hydroxybenzotriazol] – und an die wachsende Peptidkette gekoppelt. Vor dem Einfügen der nachfolgenden Reste wird die Schutzgruppe (z. B. Fmoc) von der α-Aminogruppe entfernt. Nach der Synthese werden alle Schutzgruppen entfernt, die intakten full length-Peptide werden gereinigt und chemisch oder enzymatisch in die korrespondierenden Chemokine gemäß der Erfindung gefaltet (einschließlich der Ausbildung von Disulfidbrücken zwischen den Cysteinen).
Die Reinigung der natürlichen, synthetischen oder rekombinanten Proteine wird durch irgendein der zu diesem Zwecke bekannten Verfahren ausgeführt, d. h. durch jede beliebige konventionelle Prozedur, welche die Extraktion, Präzipitation, Chromatografie, Elektrophorese oder dergleichen (siehe z. B. Proost P. et al., 1996) umfasst. Eine weitere Reinigungsmethode, welche vorzugsweise für die Reinigung des Proteins gemäß der Erfindung verwendet werden kann, ist die Affinitätschromatografie unter Verwendung monoklonaler Antikörper oder der Affinität für Heparin, welche das Zielprotein binden und welche hergestellt und auf einer Gelmatrix immobilisiert werden, die in einer Säule enthalten ist. Unreine Herstellungen, welche die Proteine enthalten, werden über die Säule gegeben. Das Protein wird durch den spezifischen Antikörper an die Säule gebunden, während die Verunreinigungen hindurchlaufen werden. Nach dem Waschen wird das Protein durch einen Wechsel im pH oder in der Ionenstärke von dem Gel eluiert.
Die aminoterminal verkürzten RANTES gemäß der Erfindung sind nützlich in der Therapie und/oder Diagnose von Krankheiten, in welchen eine antagonistische Aktivität der Chemokinwirkungen benötigt wird. Beispiele für solche Krankheiten beinhalten: inflammatorische Krankheiten, Angiogenese- und Hämatopoese-abhängige Krankheiten, Tumore, Infektionskrankheiten, einschließlich HIV, Autoimmunkrankheiten, Atherosklerose, Lungenkrankheiten und Hautstörungen. Die bevorzugte Verwendung erfolgt auf dem Gebiet der HIV-Infektion.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt die Verwendung der erfindungsgemäßen Proteine in der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung der oben genannten Krankheiten zur Verfügung.
Das Medikament besteht vorzugsweise in der Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung, umfassend die Proteine gemäß der Erfindung zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägem und/oder Exzipienzien. Solche pharmazeutischen Zusammensetzungen bilden noch einen weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren zur Behandlung der oben erwähnten Krankheiten, welches die Verabreichung einer pharmakologisch aktiven Menge der aminoterminal verkürzten RANTES gemäß der Erfindung an Individuen, welche gefährdet sind, solche Krankheiten zu entwickeln, oder an Individuen, welche bereits solche Pathologien zeigen, umfasst.
Es wurde außerdem festgestellt, dass CD26/DPP IV geeignet ist, NH₂-terminal verkürzte RANTES in vitro zu generieren. RANTES ist das erste Zytokin, von welchem berichtet wird, dass dessen biologische Aktivität durch CD26/DPP IV modifiziert werden kann.
Daher kann CD26/DPP IV in der Therapie und/oder Diagnose von Krankheiten, in welchen eine antagonistische Aktivität der Chemokinwirkungen benötigt wird, mit besonderem Fokus auf inflammatorische Krankheiten, Immun- und Infektionskrankheiten, ver wendet werden. Dieses stellt das erste Beispiel eines identifizierten Mechanismus für endogen regulierte Chemokinmodifikation in einen Antagonisten dar, ähnlich der physiologischen Prozessierung, jedoch vermittelt durch andere Faktoren (Proteasen).
Die Erfindung wird nun mittels der folgenden Beispiele beschrieben, welche nicht als in irgendeiner Weise die vorliegende Erfindung limitierend betrachtet werden sollten. Die Beispiele werden sich auf die Figuren beziehen, welche weiter unten spezifiziert werden.
BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1: zeigt die Aminosäuresequenz von RANTES. Signalsequenzen sind kursiv angegeben, während C-Reste fett gedruckt sind. Pfeile zeigen die ersten Aminosäuren des aminoterminal verkürzten RANTES gemäß der Erfindung an, auch RANTES (3–68) genannt.
2: Die chemotaktischen Wirksamkeiten von intakten und NH₂-terminal verkürzten Formen von natürlichen oder rekombinanten RANTES gegenüber monozytischen THP-1-Zellen wurden in dem Boyden-Mikrokammerassay verglichen: natürliches RANTES (1–68)(Δ), natürliches verkürztes RANTES (3–68) (☐), intaktes rekombinantes RANTES (1–68)
und CD26/DPP IVgespaltenes rekombinates RANTES (3–68)(∎). Die Ergebnisse stellen den mittleren chemotaktischen Index ± SEM (standard error of mean, Standardabweichung) von vier oder mehr unabhängigen Experimenten dar.
3: Effekt von natürlichem RANTES (3–68)(⎕), natürlichem RANTES (1–68) (Δ), rekombinantem RANTES (1–68) (
und rekombinantem CD26/DPP IVbehandeltem RANTES (3–68)(∎) auf das [Ca²⁺]_i in THP-1-Zellen. Die Ergebnisse stellen die mittlere Zunahme an [Ca²⁺]_i ± SEM von drei oder mehr unabhängigen Experimenten dar.
4: zeigt die Desensibilisierung der Ca²⁺-mobilisierenden Aktivität von intaktem recRANTES (1–68) durch RANTES (3–68). THP-1-Zellen wurden zunächst mit Puffer oder verschiedenen Konzentrationen an rekombinantem RANTES (1–68) oder RANTES (3–68) stimuliert. Die Ergebnisse stellen den Mittelwert ± SEM (von drei oder mehr unabhängigen Experimenten) der Zunahme an [Ca²+]_i in Antwort auf 30 ng/ml intaktem rekombinantem RANTES als ein zweiter Stimulus dar.
5: Vergleich der chemotaktischen Potenz von verkürztem RANTES (3–68) mit intaktem RANTES (1–68). Die Eosinophilen-Granulozyten-chemotaktische Aktivität von natürlichem (nat) und rekombinantem (rec) verkürztem RAN-TES, intaktem RANTES und synthetischem MCP-3 wurden in dem Mikrokammerassay bestimmt. Die Ergebnisse stellen den mittleren chemotaktischen Index (Cl) ± SEM von zwei oder mehr unabhängigen Experimenten (jeweils als Triplikat durchgeführt) dar.
6: Desensibilisierung der Calciummobilisierung durch intaktes RANTES in CCR-Transfektanten. Calciummobilisierungsexperimente wurden in HOS-Zellen, welche mit CD4 und den CC-Chemokinrezeptoren CCR1 oder CCR5 transfiziert wurden, durchgeführt. Die Zellen wurden zunächst mit verschiedenen Konzentrationen an intaktem oder verkürztem RANTES stimuliert, gefolgt von einer Stimulation mit 100 ng/ml intaktem RANTES. Der prozentuale Anteil der Inhibition des [Ca²⁺]_i-Anstiegs, welcher durch den zweiten Stimulus induziert wurde, ist gezeigt. Dieser prozentuale Anteil wurde berechnet durch Vergleichen der Antwort von 100 ng/ml intaktem RANTES nach der Zugabe von RANTES (1–68) oder RANTES (3–68) mit der Antwort nach der Stimulation mit Puffer (100%). Die Ergebnisse stellen die mittlere prozentuale Inhibition ± SEM von zwei oder mehr Experimenten dar.
7: Starker inhibitorischer Effekt von RANTES (3–68) auf die Infektion von mononukleären Zellen durch HIV-1. PHA-aktivierte PBMC wurden mit dem Mtropischem HIV-1 Ba-L-Stamm in Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen an RANTES (1–68) oder RANTES (3–68) (0 bis 1000 ng/ml, zugegeben zum Zeitpunkt der Infektion) infiziert. Nach zehn Tagen wurden die Virusausbeuten in dem Zellüberstand durch einen p-24 Ag-ELISA kontrolliert (ein repräsentatives Experiment von vier Experimenten ist gezeigt).
8: Wirkungen von RANTES (1–68) und RANTES (3–68) auf die Infektion durch den HIV-1 SF162-Stamm in PHA-aktivierten PBMC. Die Virusausbeuten wurden zehn Tage nach der Infektion durch einen p24 Ag-ELISA in dem Zellüberstand kontrolliert. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experimentes von dreien sind gezeigt. *Unter dem Detektionslimit des p24 Ag-ELISAs (<5 pg/ml).
9: Expression von CD26 auf HOS.CD4.CCR5-Zellen, U87.CD4.CCR5-Zellen und frisch isolierten PBMC. Der prozentuale Anteil (%) an CD26-positiven Zellen wird in jedem Histogramm angegeben.
10: Wirkungen von RANTES (1–68), RANTES (1–68) plus sCD26 (50 U/L) und RANTES (3–68) auf die Infektion von HOS.CD4.CCR5-Zellen durch den HIV-1 Ba-L-Stamm. Die Virusausbeuten wurden 8 Tage nach der Infektion in dem Zellüberstand durch einen p24 Ag-ELISA kontrolliert. Die Ergebnisse eines repräsentativen Experimentes von dreien werden gezeigt.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: Aminoterminal verkürztes RANTES
Material und Methoden
Reagenzien
Natürliches humanes RANTES wurde durch humane Malavu-Hepatosarkomzellen, MG-63 Osteosarkomzellen oder Leukozyten des peripheren Blutes (Bluttransfusionscenter von Antwerpen und Leuven) hergestellt und wie zuvor beschrieben gereinigt (Proost P. et al., 1996 und Proost P. et al., 1993). MCP-2, MCP-3 und GCP-2 wurden durch Fmoc-Chemie synthetisiert (Proost P. et al., 1995 und Wuyts A. et al., 1997), rekombinantes humanes RANTES wurde von Peprotech (Rocky Hill, NJ) erhalten und rekombinantes MCP-1 war ein Geschenk von Dr. J. J. Oppenheim (NCI-NIH, Frederick, MD).
Humane Osteosarkom (HOS)-Zellen, welche mit CD4 und einem der CC-Chemokinrezeptoren CCR1, CCR3 oder CCRS (Deng H., et al., 1996) transfiziert wurden, wurden in DMEM mit Glutamax vermehrt. Puromycin (1 μg/ml) wurde dem Medium als ein Selektionsmittel dazugegeben. Alle Wachstumsmedien (Gibco BRL/Liefe Technolgies, Paisley, UK) wurden mit 10% FCS angereichert.
Humanes CD26/DPP IV wurde von Prostasomen, Prostata abgeleiteten Organellen, welche frei in der Samenflüssigkeit vorkommen, erhalten. Das Enzym wurde wie zuvor beschrieben unter Verwendung von Ionenaustauschchromatografie, gefolgt von Affinitätschromatografie auf Adenosindeaminase bis zur Homogenität gereinigt (De Meester I. et al., 1996).
Inkubation von Chemokinen mit CD26/DPP IV und Detektion von proteolytischer Prozessierung
Ein 100 bis 1000 molarer Überschuss an Chemokin wurde über Nacht mit CD26/DPP IV in 100 mM Tris/HCl pH 7,7 inkubiert. Die Chemokine wurden durch SDS-PAGE auf einem Tris/Tricingelsystem, wie zuvor beschrieben (Proost P. et al., 1996), von CD26/DPP IV getrennt.
Die Proteine wurden auf PVDF (Polyvinylidenfluorid)-Membranen (Problott, Perkin Elmer, Foster City, CA) elektrogeblottet und mit Coomassiebrilliantblau R250 gefärbt. Nach der Entfärbung wurden die Membranen wenigstens fünfmal mit ultrareinem Wasser (Milli Q; Millipore, Bedford, MA) gespült.
Um ausreichende Mengen an reinem verkürztem Chemokin für biologische Assays zu erhalten, wurden etwa 50 μg rekombinantes Chemokin mit CD26/DPP IV behandelt, und das Spaltprodukt wurde mit 0,1% Trifluoressigsäure (trifluoroacefic acid, TFA) azidifiziert. Tween 20 (0,01%) wurde dazugegeben, um zu verhindern, dass die Chemokine an den Gefäßen kleben bleiben.
Die Chemokine wurden von CD26/DPP IV in einen Acetonitrilgradienten auf einer C-8 Aquapore RP-300-Säule (1 × 50 mm) (Perkin Elmer) abgetrennt. Fraktionen, welche Proteine enthielten, wurden durch SDS-PAGE und Silbertärbung wie beschrieben analysiert.
CD26/DPP IV-behandelte Chemokine, welche durch RP-HPLC gereinigt wurden oder aus PVDF-Blots ausgeschnitten wurden, wurden NH₂-terminal durch Edmanabbau in einem Flüssigfarben-477A/120A-Proteinsequenzierer (Perkin Elmer) unter Verwendung von N-Methylpiperidin als Kopplungsbase sequenziert.
Nachweis der chemotaktischen Aktivität
Die Chemokine wurden auf frisch isolierten neutrophilen Granulozyten des peripheren Blutes (10⁶ Zellen/ml) oder auf kultivierten monzytischen THP-1-Zellen (0,5 × 10⁶ Zellen/ml) in der Boyden-Mikrokammer (Proost P. et al., 1996 und Proost P. et al., 1993) auf ihre chemotaktische Potenz getestet.
Nach 45 min (Granulozyten) oder 2 Std. (THP-1-Zellen) Inkubation bei 37°C wurden die Zellen fixiert und gefärbt. Die Zellen, welche durch die Polycarbonatmembranen mit einer Porengröße von 5 μg migrierten, wurden mikroskopisch in zehn Ölimmersionsfelder gezählt.
Der chemotaktische Index (C. I.) einer Probe (Triplikate in jeder Kammer) wurde berechnet als die Anzahl von Zellen, welche zu der Testprobe migrierten, geteilt durch die Anzahl von Zellen, welche in das Kontrollmedium migrierten. In Desensibilisierungsexperimenten wurden die Zellen für 10 min bei 37°C mit biologisch inaktiven Chemokinvarianten inkubiert, bevor sie in die Kammer transferiert wurden.
Der Prozentsatz an Inhibition des C. I., welcher durch die Desibilisierung mit HBSS behandelten Kontrollzellen erhalten wurde, wurde für die Auswertung der Chemotaxis-Desensibilisierung berechnet.
Detektion von intrazellulären Ca²⁺-Konzentrationen
Die intrazellulären Ca²⁺-Konzentrationen ([Ca²⁺]_i) wurden wie zuvor beschrieben gemessen (Wuyts A., et al., 1997). Kurz beschrieben, wurden die gereinigten Zellen mit dem Fluoreszenzindikator fura-2 (2,5 μM Fura-2/AM, Molecular Probes Europe BV, Leiden, Niederlande) und 0,01% Pluronic F-127 (Sigma, St. Louis, MO) inkubier.
Nach 30 min wurden die Zellen zweimal gewaschen, in HBSS mit 1 mM Ca²+ resuspendiert und 10 min bei 37°C inkubiert, bevor die Fura-2-Fluoreszenz in einem LS50B-Lumineszenzspektrofotometer (Perkin Elmer) gemessen wurde. Nach der Anregung bei 340 und 380 nm wurde die Fluoreszenz bei 510 nm detektiert. [Ca²+]_i wurde berechnet durch die Grynkiewicz-Gleichung (Grynkiewicz G. et al., 1985).
Um den R_max zu bestimmen, wurden Zellen mit 50 μM Digitonin lysiert. Anschließend wurde der pH mit 20 mM Tris auf 8,5 eingestellt und R_min wurde durch die Zugabe von 10 mM EGTA zu den lysierten Zellen erhalten. Der für die Kalibrierung verwendete K_d betrug 224 nM. Für Desensibilisierungsexperimente wurden die Zellen zunächst mit Puffer oder Chemokin mit verschiedenen Konzentrationen stimuliert. Als ein zweiter Stimulus wurden Chemokine mit einer Konzentration dazugegeben, welche eine signifikante Zunahme in dem [Ca²⁺]_i nach Vorstimulierung mit Puffer induziert. Der Prozentsatz der Inhibition der [Ca²⁺]_i-Zunahme in Antwort auf den zweiten Stimulus wurde berechnet.
Inhibition der HIV-1-Infektion
Die HIV-1 M-tropischen Stämme BaL und SF162 wurden von dem MRC AIDS-Reagenzprojekt (Herts, UK) erhalten. Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood mononuclear cells, PBMC) von gesunden Spendern wurden durch Dichtegradientenzentrifugation (5,23) isoliert und mit PHA mit einer Konzentration von 1 μg/ml (Sigma, Bornem, Belgien) 3 Tage lang bei 37°C stimuliert. Die aktivierten Zellen (PHA-stimulierte Blasten) wurden dreimal mit PBS gewaschen und mit einem Virus, wie zuvor beschrieben (Schols D. et al., 1997), infiziert. HIV-1-infizierte oder scheininfizierte PHAstimulierte Blasten wurden in Anwesenheit von 25 U/ml IL-2 und variierenden Konzentrationen an RANTES (1–68) oder RANTES (3–68) kultiviert. Der Zellüberstand wurde an Tag 10 gesammelt, und HIV-1-Kernantigen in dem Überstand wurde durch einen p-24 Ag-ELISA-Kit (DuPont/NEN Life Science Products, Brüssel, Belgien) analysiert.
Ergebnisse
Identifizierung und biologische Charakterisierung von natürlichem NH₂-terminal verkürztem RANTES
Eine andere NH₂-terminal verkürzte Form von humanem GCP-2 wurde zuvor isoliert (Proost P. et al., 1993). Die am wenigsten verkürzte GCP-2-Form wurde hinter dem Pro an der vorletzten Position [GCP-2(3-75)] gespalten. Unter Verwendung eines ähnlichen Standardreinigungsverfahrens wurde das C-C-Chemokin RANTES von Leukozyten des peripheren Blutes oder Sarkomzellen gereinigt (Proost P. et al., 1996).
Insbesondere wurde konditioniertes Medium von MG-63- oder Malavu-Sarkomzellen, welche mit einer Zytokinmischung induziert wurden, fraktioniert, um natürliche Chemokinvarianten zu isolieren. Die Chemokine wurden durch anschließende Antikörper- oder Heparin-Affinitätschromatografie, Kation-Austauscherchromatografie (Mono S FPLC) und RP-HPLC gereinigt, und immunreaktive Formen wurden durch spezifische Chemokin-ELISAs detektiert. Auf einer Kationenaustauschersäule wurde von IL-8 beobachtet, dass es in unmittelbarer Nachbarschaft von RANTES (zwischen 0,7 und 0,75 M NaCl) eluiert. Nichtsdestotrotz wurden beide Chemokine durch RP-HPLC voneinander getrennt (RANTES und IL-8 eluieren bei 27,5% bzw. 30% Acetonitril). Aminosäuresequenzanalysen der gereinigten Proteine bestätigte, dass IL-8 in verschiedenen NH₂terminal verkürzten Formen erscheint, welche zuvor auf der Grundlage ihrer chemotaktischen Aktivität isoliert wurden (Van Damme J. et al., 1989). Für RANTES jedoch wurde nur eine einzige Form isoliert, welcher zwei NH₂-terminate Reste im Vergleich zu intaktem RANTES fehlte. Angesichts seines vorherrschenden Auftretens wurde dieses RAN-TES (3–68) in größerem Detail analysiert, um seine chemotaktische Aktivität auf Monozyten und Eosinophile zu überprüfen. Insbesondere wurde RANTES (3–68) auf seine chemotaktische Aktivität und/oder Aktivität zur Freisetzung intrazellulären Ca²⁺ getestet, und ihre biologische Potenz wurde mit der von den entsprechenden intakten Chemokinen verglichen.
Die NH₂-terminale Deletion von zwei Resten von RANTES resultierte in beträchtlich abgeschwächten Monozyten-chemotaktischen und Ca²⁺-freisetzenden Aktivitäten. Im Vergleich mit intaktem RANTES (minimale effektive Dosis von 3–10 ng/ml) war natürliches RANTES (3–68) vollständig inaktiv, wenn es mit so hohen Konzentrationen wie 300 ng/ml in der Boydenmikrokammer getestet wurde (2). Zusätzlich waren 10 mal höhere Konzentrationen an natürlichem RANTES (3–68) im Vergleich zu RANTES (1–68) notwendig, um eine ähnliche Ca²⁺-Antwort zu erhalten (3).
CD26/DPP IV entfernt die NH₂-terminalen Dipeptide von Chemokinen
Um zu untersuchen, ob die Aminopeptidase CD26/DPP IV verantwortlich sein könnte für die NH₂-terminale Verkürzung von RANTES, wurde das intakte Chemokin über Nacht mit CD26/DPP IV inkubiert, auf PVDF-Membranen geblottet, mit Coomassieblau gefärbt und einem automatischen Edmanabbau unterzogen. Die Behandlung von RANTES mit CD26/DPP IV resultierte in der Entfernung der NH₂-terminalen Dipeptide. Die parallele Inkubation von Chemokin in Puffer ohne CD26/DPP IV hatte keinen Effekt.
Da weitere Chemokine die Konsensussequenz für die CD26/DPP IV-Spaltung enthielten, und da von dem NH₂-Terminus von MCPs gezeigt wurde, dass er für die biologische Aktivität entscheidend ist (Gong J. et al., 1996 und Gong J. et al., 1995), wurden MCP-1, MCP-2 und MCP-3 ebenfalls mit CD26/DPP IV inkubiert.
Nach der Behandlung wurden die MCPs auf PVDF-Membranen geblottet und mit Coomassieblau gefärbt, um zu bestätigen, dass eine ausreichende Menge an Protein für den Edmanabbau gewonnen wurde.
Jedoch konnte keine NH₂-terminale Sequenz nachgewiesen werden, was andeutet, dass CD26/DPP IV den Endterminus von MCPs, welcher für den Edmanabbau durch eine Pyroglutaminsäure blockiert ist, nicht verändert.
Vergleich der biologischen Aktivität von intaktem und mit CD26/DPP IV-behandeltem RANTES.
Ähnlich wie natürliches RANTES (3–68), welches durch C-8 RP-HPLC gereinigt wurde, war CD26/DPP IV-behandeltes rekombinantes RANTES in Boyden-Mikrokammer-Chemotaxisexperimenten inaktiv, wenn es mit Konzentrationen von bis zu 1 μg/ml verwendet wurde, während mit intaktem rekombinantem RANTES von 30 bis 100 ng/ml aufwärts eine signifikante Monozyten-chemotaktische Antwort nachgewiesen wurde (2).
Als der Verkürzungseffekt in den Ca²⁺-Mobilisierungsassay untersucht wurde, induzierte RANTES (3–68) eine geringe, aber signifikante Zunahme bei einer Konzentration von 100 ng/ml. Intaktes RANTES jedoch war bereits bei einer Konzentration von 10 ng/ml aktiv (3). Schlussfolgernd gesagt, nahm die Monozyten-chemotaktische und Ca²⁺mobilisierende Potenz von RANTES 10- bis 100fach ab, obwohl nur zwei NH₂-terminale Reste entfernt wurden.
RANTES (3–68) ist ein natürlicher Chemotaxis-Antagonist für intaktes RANTES
Angesichts der Inaktivität von RANTES (3–68) in Monozyten-Chemotaxisexperimenten untersuchten wir, ob dieses verkürzte RANTES als ein Antagonist wirken könnte. RAN-TES (3–68) desensibilisierte bei einer Konzentration von 1 μg/ml fast vollständig (82%) für den chemotaktischen Effekt von 100 ng/ml intaktem RANTES (Tabelle I).
Wenn ein 3facher Überschuss an RANTES (3–68) in die obere Vertiefung gegeben wurde, wurde die Chemotaxis von THP-1-Zellen in Richtung intaktem RANTES um etwa 50–70% inhibiert. RANTES (3–68) mit einer Konzentration von 100 ng/ml konnte immer noch etwa 30% der chemotaktischen Antwort gegenüber einer gleichen Konzentration an intaktem RANTES inhibieren.
in Ca²⁺-Mobilisierungsexperimenten mit THP-1-Zellen (4) konnten 30 ng/ml intaktes RANTES für den Effekt von 30 ng/ml intaktem RANTES zu 39 ± 5% desensibilisieren. Etwa zehnfach höhere Konzentrationen von RANTES (3–68) waren notwendig, um dieselbe Menge an Desensibilisierung zu erreichen. Bei einer Konzentration von 300 ng/ml jedoch ergab RANTES (3–68) selbst eine signifikante Ca²⁺-Antwort. Diese Ca²⁺-Antwort war vergleichbar mit der Antwort, welche mit 300 ng/ml intaktem RANTES erhalten wurde.
TABELLE I RANTES (3–68) desensibilisiert für die durch RANTES (1–68) induzierte Monozytenchemotaxis¹
Beeinträchtigte chemotaktische Aktivität von RANTES (3–68) auf humane Monozyten und Eosinophile
In Tabelle II wird die chemotaktische Potenz von natürlichem RANTES (3–68) mit der des Monozyten-chemotaktischen Proteins MCP-3 und der von intaktem RANTES (1–68) verglichen. Es ist zu erkennen, dass MCP-3 und RANTES (1–68) noch bei Konzentrationen von 3 ng/ml bzw. 30 ng/ml chemotaktisch wirken auf frisch isolierte Monozyten des peripheren Blutes, während natürliches RANTES (3–68) bei 100 ng/ml inaktiv blieb.
Die reduzierte chemotaktische Wirksamkeit dieser natürlichen Variante wurde mit rekombinantem RANTES (3–68) bestätigt. Obwohl es auf Monozyten (bei 1 μg/ml) schwach chemotaktisch wirkte, zeigte gereinigtes rekombinantes RANTES (3–68) eine spezifische Aktivität, welche 10fach geringer ist als die von intaktem rekombinantem RANTES.
Schließlich wurde die chemotaktische Potenz von RANTES (3–68) auf humane Eosinophile verifiziert, welche noch ansprechempfindlich waren gegenüber 100 ng/ml intaktem RANTES und 30 ng/ml MCP-3 (5). Ähnlich wie bei Monozyten wurde die Eosinophilen-Migration nur durch RANTES (3–68) mit einer Konzentration von 1 μg/ml stimuliert.
TABELLE II Vergleich der Monozyten-chemotaktischen Aktivität von RANTES (3–68) mit RAN-TES (1–68) und MCP-3
RANTES (3–68) signalisiert und desensibilisiert für RANTES (1–68) über CCRS, nicht jedoch über CCR1 und CCR3
Um die reduzierte chemotaktische Aktivität von RANTES (3–68) zu erklären, wurde die Fähigkeit dieser Chemokinvariante, an die bekannten Rezeptoren, welche von RANTES verwendet werden, zu binden und über diese zu signalisieren, überprüft.
HOS-Zellen, welche mit den Chemokinrezeptoren CCR1, CCR3 oder CCRS transfiziert wurden, wurden in einem Signalgebungsassay (signaling assay) verwendet, welches die Zunahmen der intrazellulären Calciumkonzentration misst. Bei Konzentrationen von bis zu 300 ng/ml erhöhte RANTES (3–68) nicht das [Ca²⁺]_i in HOS-Zellen, welche mit CCR1 transfiziert wurden (Tabelle III) oder mit CCR3 (Daten nicht gezeigt), während 30 ng/ml und 100 ng/ml von intaktem RANTES ausreichend waren, um eine Erhöhung von [Ca²⁺]_i in CCR1- bzw. CCR3-Transfektanten zu induzieren.
Jedoch waren sowohl intaktes als auch verkürztes RANTES fähig, eine signifikante Zunahme von [Ca²⁺]_i in CCR5-Transfektanten bei einer Konzentration von 30 ng/ml zu induzieren. Darüber hinaus wurde durch eine Präinkubation von CCR5 transfizierten Zellen mit einem 3 bis 10fachen Überschuss an entweder RANTES (3–68) oder an intaktem RANTES eine vergleichbare Inhibition (etwa 75%) der [Ca²⁺]_i-Erhöhung durch eine anschließende erneute Stimulierung (challenge) mit intaktem RANTES (100 ng/ml) erhalten (6).
Dagegen konnten 300 ng/ml RANTES (3–68) für die Calciumantwort von CCR1- und CCR3-transfizierten Zellen gegenüber 100 ng/ml intaktem RANTES nur marginal desensibilisieren, während ein 3facher Überschuss an intaktem RANTES als erster Stimulus die [Ca²⁺]_i-Erhöhung in diesen Zellen durch anschließend gegebenes RANTES (1– 68) fast vollständig inhibierte. Daraus muss geschlossen werden, dass die Entfernung von zwei NH₂-terminalen Resten von RANTES eine signifikante Auswirkung auf die Signaltransduktion hat, insofern, als die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR3 nicht länger funktionell erkannt werden. Folglich kann die beeinträchtigte chemotaktische Potenz von RANTES (3–68) erklärt werden durch dessen Unfähigkeit, über CCR1 und CCR3 zu wirken. Dagegen behält RANTES (3–68) die CCR5-Signalisierungseigenschaften von intaktem RANTES vollständig. RANTES (3–68) kann durch Kompetitieren mit intaktem RANTES antünflammatorisch wirken, jedoch aufgrund des Erhalts seiner Fähigkeit, an CCRS zu binden, weiterhin als ein HIV-Inhibitor fungieren.
TABELLE III Calciummobilisierung durch RANTES-Formen in CCR1- und CCRS-Transfektanten
Inhibition von CC-Chemokin-induzierter Chemotaxis durch RANTES (3–68) in humanen monozytischen Zellen
Um zu überprüfen, ob die Inhibition der CC-Chemokinsignalgebung durch RANTES (3–68) auch in monozytischen Zellen auftrat, wurden Inhibitionsexperimente in THP-1-Zellen durchgeführt. Es wurde bewiesen, dass RANTES (3–68) eine 10fache Verminderung in der Fähigkeit, [Ca²+]_i in monozytischen Zellen zu erhöhen, im Vergleich mit intaktem RANTES zeigte (Daten nicht gezeigt). Zusätzlich war die chemotaktische Wirkung von intaktem RANTES (30 ng/ml) auf monozytische Zellen durch Inkubation der Testzellen mit 300 ng/ml RANTES (3–68) inhibiert (71%), wie in Tabelle IV gezeigt.
Darüber hinaus verminderte RANTES (3–68) die chemotaktische Antwort auf andere CC-Chemokine, einschließlich dem Monozyten-chemotaktischen Protein-3 (MCP-3) (67 %), dem Makrophagen-inflammatorischen Protein-1a (MIP-1α)(61%) und MIP-1β (80 %).
Dies veranschaulicht, dass RANTES (3–68) als ein Breitspektruminhibitor auf die durch andere CC-Chemokine induzierte monozytische Zellmigration wirkt.
TABELLE IV Inhibition der Chemotaxis von monozytischen Zellen gegenüber CC-Chemokinen durch RANTES (3–68)
Die CD26-spezifische Verkürzung von RANTES ist notwendig für dessen antivirale Aktivität
Die Wirkungen von verschiedenen Formen von RANTES wurden zunächst gegenüber zwei verschiedenen M-tropischen HIV-1-Stämmen (BaL und SF162) in humanen PBMC, welche von gesunden Blutspendern erhalten wurden, untersucht. Der IC₅₀ von intaktem RANTES (1–68) gegenüber dem BaL-Stamm war 3,4 nM und für RANTES (3–68) war der IC₅₀ 0,39 nM. Der IC₅₀-Wert für RANTES (1–68) betrug 71 nM, was in etwa das 10fache des IC₅₀ für RANTES (3–68) war. Bei der Untersuchung in PBMC war RANTES (1–68)(IC₅₀: 23 nM; IC₅₀: 95 nM) mehr als 10fach weniger aktiv als RANTES (3–68) (IC₅₀: 2 nM; IC₉₀: 8,2 nM) (Tabelle V). Die konzentrationsabhängigen Wirkungen von beiden Chemokinen bei Konzentrationen in einem Bereich von 133 bis hinunter auf 0,2 nM gegen HIV-1 SF162-Replikation in PBMC sind in 8 gezeigt. Eine Konzentration von 5,2 nM RANTES (3–68) war klar wirksam in der Reduzierung der Virusreplikation, während RANTES (1–68) bei dieser Konzentration inaktiv war. Kein Unterschied in der antiviralen Aktivität wurde zwischen intaktem RANTES, welches von PeproTech oder von R&D Systems erhalten wurde, beobachtet.
Der erstaunliche Unterschied in der antiviralen Aktivität zwischen den beiden Formen von RANTES wurde noch offensichtlicher, wenn sie in den humanen CCRS-transfizierten Zellen untersucht wurde. In U78.CD4.CCR5-Zellen war der IC₅₀ für RANTES (1–68) und RANTES (3–68) gegen den BaL-Stamm 21 nM bzw. 0,65 nM. Der IC₅₀ für RANTES (1–68) betrug mehr als 133 nM, während der IC₅₀ für RANTES (3–68) 63 nM betrug. In Tabelle V wird außerdem gezeigt, dass RANTES (1–68) praktisch inaktiv war in den HOS.CD4.CCR5-Zellen (IC₅₀ > 133 nM), während RANTES (3–68) ein starker Inhibitor der HIV-1 BaL-Replikation in diesen Zellen ist (IC₅₀: 5,5 nM). Jedoch wurden keine IC₅₀-Werte für beide Formen von RANTES in diesen Zellen erreicht.
Die antivirale Aktivität von RANTES ist abhängig von der Anwesenheit von membrangebundenem oder löslichem CD26 (sCD26).
Die CD26-Expression auf den beiden verschiedenen CCRS-transfizierten Zelllinien und auf frisch isolierten PBMC wurde untersucht. HOS-Transfektanten waren negativ für die CD26-Expression, wie durch durchflusszytometrische Analyse bestimmt, während U87- Transfektanten schwach, jedoch signifikant positiv mit dem Anti-CD26-Mausantikörper (anti-CD26 mAb, 9) gefärbt wurden. Zusätzlich wurde von einer Subpopulation von frisch isoliertem PMBC festgestellt, dass sie stark positiv für die CD26-Expression ist (9).
Die konzentrationsabhängige Wirkung von RANTES (1–68) und RANTES (3–68) auf die virale p24 Ag-Produktion durch den BaL-Stamm in HOS.CD4.CCR5-transfizierten Zellen in der Anwesenheit von sCD26 ist in 10 gezeigt. Die Zugabe von sCD26 zusammen mit RANTES (1–68) zu Beginn der HIV-Infektion verstärkte die antivirale Aktivität des intakten RANTES in HOS.CD4.CCR5-Zellen signifikant. Wenn sCD26 mit einer Konzentration von 50 U/I zusammen mit RANTES dazugegeben wurde, wurde ein IC₅₀ von 13 nM für RANTES erhalten. Die Zugabe von sCD26 allein hatte keinen Effekt auf die Virusreplikation. Die Zugabe von sCD26 zu RANTES (3–68) veränderte die antivirale Aktivität von RANTES (3–68) ebenfalls nicht (Daten nicht gezeigt). Folglich ist die Anwesenheit von CD26 essentiell, damit intaktes RANTES antiviral aktiv wird.
Die aminoterminale Verkürzung von natürlichem MIP-1α beeinträchtigt seine anti-HIV-1-chemotaktische und Ca²⁺-mobilisierende Aktivität nicht.
Da die Mehrheit von natürlichem MIP-1α NH₂-terminal verkürzt ist (vier Aminosäuren), haben wir untersucht, ob dieses verkürzte MIP-1α(5–70) eine veränderte HIV-1-inhibitorische Eigenschaft aufwies. Im Gegensatz zu den Ergebnissen, welche für RANTES erhalten wurden, wurden für die IC₅₀-Werte von intaktem MIP-1α und MIP-1α(5–70) in PMBC oder CCR5-transfizierten Zellen keine Unterschiede nachgewiesen (Tabelle V, 8). Zusätzlich wurden intaktes MIP-1α und verkürztes MIP-1α(5–70) in Chemotaxis-Assays und Mobilisations-Assays für intrazelluläres Ca²⁺ auf THP-1-monozytischen Zellen verglichen. Tabelle VI zeigt, dass die minimale wirksame Dosis von MIP-1α(5– 70), welche eine Erhöhung des [Ca²⁺]_i induziert, nur wenig geringer war als die von intaktem MIP-1α. Darüber hinaus waren die minimalen wirksamen Konzentrationen von beiden MIP-1α Isoformen relativ ähnlich, obwohl die maximale Migration, welche mit 0,13 nM in dem Chemotaxisassay erhalten wurde, höher für intaktes MIP-1α war. Zusammenfassend muss daraus geschlossen werden, dass die NH₂-terminale Prozessie rung von MIP-1α im Gegensatz zu RANTES dessen inflammatorische Aktivität und Anti-HIV-1-Aktivität nur minimal schwächt.
TABELLE V Anti-HIV-1-Aktivität von RANTES und MIP-1α in PHA-stimulierten PBMC, U87.CD4.CCR5-Zellen.
Die Virusausbeute wurde 8–12 Tage nach der Infektion in dem zellfreien Überstand durch den viralen p24 Ag-ELISA kontrolliert. Die durchschnittlichen IC₅₀- und IC₉₀-Werte (in nM) werden gezeigt. Die Daten stellen die Durchschnittswerte von zwei bis 4 unabhämgigen Experimenten dar. Der Wert, welcher durch ">130" gekennzeichnet ist, zeigt an, dass eine 50%- oder 90%-Inhibition bei 130 nM nicht erreicht wird. ND, nicht durchgeführt.
TABELLE VI Fehlen eines Unterschiedes in der biologischen Potenz zwischen intaktem und verkürztem MIP-1α.
REFERENZEN
Baggiolini M. et al., Ann. Rev. Immunol., 55, 97–179, 1994.
Baggiolini M. et al., Ann. Rev. Immunol., 15, 675–705, 1997.
Clark-Lewis I. et al., J. Biol. Chem., 266, 23128–23134, 1991.
De Meester I. et al., J. Immunol. Methods 189, 99–10526, 1996.
Deng H. et al., Nature, 381, 661–666, 1996.
Gong J. et al., J. Exp. Med., 181, 631–640, 1995.
Gong J. et al., J. Biol. Chem. 271, 10521–10527, 1996.
Grynkiewicz G. et al., J. Biol. Chem. 260, 3440, 1985.
Proost P. et al., Biochemistry, 32, 10170–10177, 1993a.
Proost P. et al., J. Immunol., 150, 1000–1010, 1993.
Proost P. et al., Cytokine, 7, 97–104, 1995.
Proost P. et al., Methods: A companion to Methods in Enzymol., 10, 82, 1996.
Proudfoot A. E. et al., K- Bopö- Chem., 271, 2599–2603, 1996.
Sambrook et al., Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Schall T. J. et al., J. Immunol., 141, 1918–1025, 1988.
Schols D. et al., J. Exp. Med., 186, 1383–1388, 1997.
Sozzani S. et al., J. Immunol, 152, 3615, 1994.
Taub D. et al., Cytokine & Growth Factor Reviews, 7, 335–76, 1996.
Van Damme J. et al., Eur. J. Biochem., 181, 337–344, 1989.
Van Damme J. et al., Eur. J. Immunol., 20, 2113–8, 1990.
Van Damme J. et al., J. Exp. Med., 176, 59, 1992.
Walz A. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 159, 969–75, 1989.
Wuyts A. et al., Biochemistry 36, 2716–2723, 1997.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Aminoterminal verkürztes RANTES, welchem die NH₂-terminalen Aminosäuren fehlen, die den Aminosäureresten 1–2 des natürlich vorkommenden RANTES entsprechen, und welches eine Chemokin-antagonistische Aktivität aufweist.
Aminoterminal verkürztes RANTES gemäß Anspruch 1, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr: 2 hat.
Aminoterminal verkürztes RANTES gemäß einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche, in glycosylierter Form.
DNA-Moleküle umfassend die DNA-Sequenzen, die für das aminoterminal verkürzte RANTES gemäß der Erfindung gemäß einem oder mehreren der vorangehenden Ansprüche kodiert, einschließlich solcher Nukleotidsequenzen, welche im Wesentlichen die gleichen sind.
Expressionsvektor, welcher das DNA-Molekül gemäß Anspruch 4 umfasst.
Wirtszelle umfassend den Expressionsvektor gemäß Anspruch 5.
Rekombinantes Verfahren zur Herstellung eines der Proteine gemäß der Ansprüche 1 bis 3, welches die Kultivierung der Zellen gemäß Anspruch 6 in einem geeigneten Kulturmedium umfasst.
Protein gemäß einem der Ansprüche von 1 bis 3 zur Verwendung als Medikament.
Verwendung eines Proteins gemäß einem der Ansprüche von 1 bis 3 in der Herstellung eines Medikamentes für die Therapie und/oder Diagnose von Krankheiten, in welchen die antagonistische Aktivität der Chemokinwirkung benötigt wird.
Verwendung gemäß Anspruch 9 in der Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von inflammatorischen Krankheiten, HIV-Infektion, Angiogenese- und Hämatopoese-abhängigen Krankheiten und Tumore.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend das Protein gemäß einem der Ansprüche von 1 bis 3, zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch annehmbaren Trägern und/oder Exzipienzien.