DE69908630T2

DE69908630T2 - Verfahren zur hemmung von diabetischen komplikationen

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Publication number: DE69908630T2
Application number: DE69908630T
Authority: DE
Inventors: W. John BAYNES; R. Suzanne THORPE; P. Thorsten DEGENHARDT; Gabriel Raja KHALIFAH; Billy Hudson; Nathan Alderson
Original assignee: University of South Carolina; University of Kansas Medical Center
Current assignee: University of South Carolina; University of Kansas Medical Center
Priority date: 1998-10-22
Filing date: 1999-10-21
Publication date: 2004-04-29
Anticipated expiration: 2019-10-22
Also published as: EP1121121A2; AU762030B2; AU2003248205A1; ATE241982T1; AU1127400A; CA2347117A1; JP2002527471A; DE69908630D1; WO2000023063A3; WO2000023063A2; JP3864050B2; ES2197689T3; CA2347117C; EP1121121B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft das Gebiet von Endprodukten fortgeschrittener Glykierung (AGEs), deren Bildung, Nachweis, Identifikation, Inhibierung und Inhibitoren davon.
Proteinalterung und Endprodukte fortgeschrittener Glykosylierung
Nicht-enzymatische Glykierung durch Glucose und andere reduzierende Zucker ist eine wichtige posttranslationale Modifikation von Proteinen, die zurnehmend mit verschiedenen Pathologien in Zusammenhang gebracht wurde. Irreversible nichtenzymatische Glykierung und Quervernetzung durch ein langsames, Glucoseinduziertes Verfahren kann viele der mit Diabetes assoziierten Komplikationen vermitteln. Chronische mit Diabetes assoziierte Hyperglykämie kann einen chronischen Gewebeschaden verursachen, der zu Komplikationen wie Retinopathie, Nephropathie und atherosklerotischer Erkrankung führen kann (Cohen und Ziyadeh, 1996, J. Amer. Soc. Nephrol. 7: 183–190). Es wurde gezeigt, dass der erhaltene chronische Gewebeschaden, der mit Langzeit-Diabetes mellitus assoziiert ist, zum Teil aus einer in situ-Immunkomplexbildung durch angehäufte Immunglobuline und/oder Antigene, die an langlebige Strukturproteine gebunden sind, die eine Bildung von Endprodukten einer fortgeschrittenen Glykosylierung (AGE) durchlaufen haben, über eine nicht-enzymatische Glykosylierung herrührt (Brownlee et al., 1983, J. Exp. Med. 158: 1739–1744). Es wird vermutet, dass das primäre Protein-Target extrazelluläres Matrix-assoziiertes Kollagen ist. Nicht-enzymatische Glykierung von Proteinen, Lipiden und Nukleinsäuren kann eine wichtige Rolle in den natürlichen Vorgängen des Alterns spielen. Kürzlich wurde eine fortgeschrittene Glykierung von Protein mit β-Amyloid-Ablagerungen und Bildung von Fädchenplaque in Alzheimer-Krankheit und möglicherweise mit anderen neurodegene rativen Erkrankungen, die eine Amyloidose einbeziehen, in Zusammenhang gebracht (Colaco und Harrington, 1994, NeuroReport 5: 859–861). Es wurde auch gezeigt, dass glykierte Proteine toxisch, antigen und fähig sind, Antworten auf Zellschädigung nach Aufnahme durch spezifische zelluläre Rezeptoren auszulösen (vgl. z. B. Vlassara, Bucala & Striker, 1994, Lab. Invest. 70: 138–151; Vlassara et al., 1994, PNAS(USA) 91: 11704–11708; Daniels & Hauser, 1992, Diabetes 41: 1415– 1421; Brownlee, 1994, Diabetes 43: 836–841; Cohen et al., 1994, Kidney Int. 45: 1673–1679; Brett et al., 1993, Am. J. Path. 143: 1699–1712; und Yan et al., 1994, PNAS(USA) 91: 7787–7791).
Das Auftreten von braunen Pigmenten während des Kochens von Nahrungsmitteln ist ein allgemein beobachtetes Phänomen, dessen Chemie zuerst von Maillard 1912 beschrieben wurde und das anschließend zu einer Forschung in das Konzept der Proteinalterung führte. Es ist bekannt, dass gelagerte und hitzebehandelte Nahrungsmittel eine nicht-enzymatische Bräunung unterlaufen, die durch quervernetzte Proteine gekennzeichnet ist, was deren Bioverfügbarkeit vermindert. Es wurde festgestellt, dass diese Maüard-Reaktion auch in vivo auftrat, wenn festgestellt wurde, dass eine Glucose über eine Amadori-Umlagerung an das Amino-Ende der α-Kette von Hämoglobin gebunden wurde.
Die vorliegende Beschreibung lehrt einen vorher unbekannten und nicht vorhergesagten Mechanismus in der Bildung von Post-Amadori-Endprodukten der fortgeschrittenen Glykierung (Maillard-Produkte, AGEs) und Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren von wirksamen Inhibitoren der Post-Amadori-AGE-Bildung. Die vorliegende Beschreibung zeigt die einzigartige Isolierung und kinetische Charakterisierung einer reaktiven Protein-Zwischenverbindung, die fähig ist, Post-Amadori-AGEs zu bilden, und zum ersten Mal werden Verfahren gelehrt, die die spezifische Aufklärung und schnelle quantitative genetische Untersuchung von "späten" Stufen der Protein-Glykierungsreaktion erlauben.
Im Gegensatz zu einer solchen "späten" AGE-Bildung wurden die "frühen" Schritte der Glykierungsreaktion relativ gut charakterisiert und für mehrere Proteine identifiziert (Harding, 1985, Adv. Protein Chem. 37: 248–334; Monnier & Baynes Hrsg., 1989, The Maillard Reaction in Aging, Diabetes, and Nutrition (Alan R. Liss, New York); Finot et al., 1990, Hrsg. The Maillard Reaction in Food Processing, Human Nutrition and Physiology (Birkhauser-Verlag, Basel)). Es ist bekannt, dass Glykie rungsreaktionen durch reversible Schiff-Base (Aldimin oder Ketimin)-Additionsreaktionen mit Lysin-Seitenketten-ε-Amino- und endständigen α-Aminogruppen ausgelöst werden, gefolgt von im Wesentlichen irreversiblen Amadori-Umlagerungen, um Ketoaminprodukte, z. B. 1-Amino-1-desoxyketosen aus der Reaktion von Aldosen, zu ergeben (Baynes et al., 1989, in The Maillard Reaktion in Aging, Diabetes, and Nutrition, Hrsg. Monnier und Bavnes (Alan R. Liss, New York, Seiten 43–67)). Typischerweise setzen sich Zucker anfangs in ihren offenkettigen (nicht die vorherrschenden Pyranose- und Furanosestrukturen) Aldehyd- oder Ketoformen mit Lysin-Seitenketten-ε-Amino- und endständigen α-Aminogruppen über reversible Schiff-Base-Kondensation um (30A). Die erhaltenen Aldimin- oder Ketiminprodukte unterlaufen sodann Amadori-Umlagerungen, um Ketoamin-Amadori-Produkte zu ergeben, d. h. 1-Amino-l-desoxyketosen aus der Reaktion von Aldosen (Means & Chang, 1982, Diabetes 31, Suppl. 3: 1–4; Harding, 1985, Adv. Protein Chem. 37: 248–334). Diese Amadori-Produkte unterlaufen dann über einen Zeitraum von Wochen und Monaten langsame und irreversible Maillard-"Bräunungs"-Reaktionen, wobei fluoreszierende und andere Produkte über Umlagerungs-, Dehydrierungs-, oxidative Fragmentierungs- und Quervernetzungsreaktionen gebildet werden. Diese Post-Amadori-Reaktionen (langsame Maillard-"Bräunungs"-Reaktionen) führen zu schlecht charakterisierten Endprodukten der fortgeschrittenen Glykierung (AGEs).
Wie mit Amadori- und anderen Glykierungszwischenverbindungen kann freie Glucose selbst oxidative Reaktionen unterlaufen, die zu der Herstellung von Peroxid und hochgradig reaktiven Fragmenten wie den Dicarbonylen Glyoxal und Glykoaldehyd führen. Folglich war die Aufklärung des Mechanismus der Bildung einer Vielzahl von AGEs extrem komplex, da die meisten in vitro-Untersuchungen bei extrem hohen Zuckerkonzentrationen durchgeführt wurden.
Im Gegensatz zu der relativ gut charakterisierten Bildung dieser "frühen" Produkte bestand ein klarer Mangel an Verständnis der Mechanismen eines Bildens der "späten" Maillard-Produkte, die in Post-Amadori-Reaktionen hergestellt werden, aufgrund ihrer Heterogenität, langen Reaktionszeiten und Komplexizität. Der Mangel an genauer Information über die Chemie der "späten" Maillard-Reaktion spornte eine Forschung an, fluoreszierende AGE-Chromophore zu identifizieren, die sich von der Umsetzung von Glucose mit Aminogruppen von Polypeptiden ableiten. Ein solches Chromophor, 2-(2-Furoyl)-4(5)-(2-furanyl)-1H-imidazol (FFI), wurde nach nicht-enzymatischer Bräunung von Rinder-Serumalbumin und Polylysin mit Glucose identifiziert und es wurde behauptet, dass es beispielhaft für das Chromophor ist, das in den intakten Polypeptiden vorhanden ist (Pongor et al., 1984, PNAS(USA) 81: 2684–2688). Spätere Untersuchungen stellten fest, dass FFI ein Artefakt ist, das während Säurehydrolyse für eine Analyse gebildet wurde.
Eine Reihe von US-Patenten wurde in dem Gebiet der Hemmung der Proteinglykosylierung und Quervernetzung von Protein-Zucker-Aminen erteilt, basierend- auf der Voraussetzung, dass der Mechanismus einer solchen Glykosylierung und einer Quervernetzung über eine gesättigte Glykosylierung und anschließend Quervernetzung von Protein-Zucker-Aminen über eine einzige grundlegende und sich wiederholende Reaktion auftritt. Diese Patente umfassen die US-PSen 4,665,192, 5,017,696, 4,758,853, 4,903,446, 4,983,604, 5,140,048, 5,130,337, 5,262,152, 5,130,324, 5,272,165, 5,221,683, 5,258,381, 5,106,877, 5,128,360, 5,100,919, 5,254,593, 5,137,916, 5,272,176, 5,175,192, 5,218,001, 5,238,963, 5,358,960, 5,318,982 und 5,334,617.
Der Fokus dieser US-Patente ist ein Verfahren zum Inhibiren einer AGE-Bildung, gerichtet auf die Carbonylgruppe des frühen Glykosylierungs-Amadori-Produkts, und insbesondere lehrte die wirksamste gezeigte Inhibierung die Verwendung von exogen verabreichtem Aminoguanidin. Die Wirksamkeit von Aminoguanidin als Inhibitor der AGE-Bildung wird gegenwärtig in klinischen Studien untersucht.
Eine Inhibierung der AGE-Bildung findet Anwendungen in den Bereichen von z. B. Nahrungsmittelverderb, Tierproteinalterung und Körperhygiene wie einer Bekämpfung des Bräunens von Zähnen. Einige wichtige, obwohl quantitativ geringere, Endprodukte der fortgeschrittenen Glykierung sind Pentosidin und N^ε-Carboxymethyllysin (Sell und Monnier, 1989, J. Biol. Chem. 264: 21597–21602; Ahmed et al., 1986, J. Biol. Chem. 261: 4889–4894).
Die FR-A-2349330 beschreibt eine Zusammensetzung, umfassend Pyridoxin und ein Antioxidans zur Behandlung von Hyperlipidämie.
Die US-A-5,288,716 betrifft die Verwendung von Pyridoxin-Derivaten in der Vermeidung und Behandlung von Hyperlipidämie und Atherosklerose.
Die GB-A-1478560 beschreibt Pyridoxin-Derivate für die Behandlung und Vermeidung von Hyperlipoproteinämie.
Die JP-A-10175954 beschreibt die Verwendung von Pyridin-Derivaten für die Behandlung und Vermeidung von diabetischen Komplikationen.
Die WO-A-9709981 beschreibt Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat als Inhibitoren einer Post-Amadori-AGE-Bildung.
Bucala et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9441–9445, zeigen, dass sich AGE-modifiziertes LDL in Patienten mit Niereninsuffizienz bildet.
Booth et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Com. 220: 113–119, beschreiben, dass Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat wirksamer sind bei der Inhibierung von AGE-Bildung als Aminoguanidin.
Williamson et al., 1993, Diabetes 42: 801–813, beschreiben die Mechanismen von Hyperglykämie-induzierten zellulären Redox-Ungleichgewichten und die Gewebe folgeschäden.
Das Amadori-Zwischenprodukt und die anschließende Post-Amadori-AGE-Bildung, wie erfindungsgemäß gezeigt, werden nicht vollständig durch Umsetzen mit Aminoguanidin gehemmt. Folglich tritt die Bildung von Post-Amadori-AGEs, wie durch die vorliegende Beschreibung gezeigt, über einen wichtigen und einzigartigen Reaktionsweg auf, der nicht früher gezeigt worden ist, oder für den es nicht einmal möglich war, ihn in isolierter Form zu zeigen. Es ist ein hochgradig wünschenswertes Ziel, ein effizientes und wirksames Verfahren zum Identifizieren und Charakterisieren von wirksamen Post-Amadori-AGE-Inhibitoren dieser "späten" Reaktion zu besitzen. Durch Bereitstellen von effizienten Screening-Verfahren und Modellsystemen kann eine kombinatorische Chemie verwendet werden, um Kandidatenverbindungen effektiv zu screenen, wodurch sehr stark Zeit, Kosten und Aufwand bei der eventuellen Validierung von Inhibitor-Verbindungen verringert werden. Es wäre sehr nützlich, in vivo-Verfahren zum Modellieren und Untersuchen der Wirkungen von Post-Amadori-AGE-Bildung zu haben, die sodann die effiziente Charakterisierung von wirksamen Inhibitoren erlauben würden.
Hemmende Verbindungen, die bioabbaubar und/oder natürlich verstoffwechselt werden, sind für eine Verwendung als Therapeutika wünschenswerter als hochgradig reaktive Verbindungen, die toxische Nebenwirkungen aufweisen können, wie Aminoguanidin.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung der allgemeinen Formel
worin R₁ eine CH₂NH₂-, CH₂SH-, COOH-, CH₂CH₂NH₂-, CH₂CH₂SH- oder CH₂COOH-Gruppe ist,
R₂ und R₆ H-Atome, OH-, SH-, NH₂-, C_1-18-Alkyl-, Alkoxy- oder Alkengruppen sind,
R₄ und R₅ H-Atome, C_1-18-Alkyl-, Alkoxy- oder Alkengruppen sind,
Y ein N- oder C-Atom ist, so dass, wenn Y ein N-Atom ist, R₃ nicht vorhanden ist, und, wenn Y ein C-Atom ist, R₃ eine NO₂- oder eine andere elektronenziehende Gruppe ist, und von Salzen davon zum Herstellen eines Arzneimittels zum Behandeln einer Erkrankung, ausgewählt aus Diabetes-assoziierter Hyperlipidämie, Diabetes-assoziiertem zellulärem Redox-Ungleichgewicht, Diabetes-assoziierter Hypercholesterinämie und Diabetes-assoziierter Hypertriglyceridämie.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verbindung Pyridoxamin.
Die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen können eine oder mehrere elektronenziehende Gruppen umfassen, wie in nicht-begrenzender Weise -NH₂, -NHR, -NR₂, -OH, -OCH₃, -OCR und -NH-COCH₃, worin R eine C_1-18-Alkylgruppe ist.
Unter "Alkyl" werden erfindungsgemäß unverzweigte oder verzweigtkettige Alkyl-gruppen mit 1-18 Kohlenstoffatomen verstanden, wie z. B. Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl-, n-Butyl-, sec-Butyl-, tert-Butyl-, Pentyl-, 2-Pentyl-, Isopentyl-, Neopentyl-, Hexyl-, 2-Hexyl-, 3-Hexyl- und 3-Methylpentylgruppen. Wenn nicht anders angegeben, sind die Alkylgruppensubstituenten gegebenenfalls mit mindestens einer Gruppe substituiert, unabhängig ausgewählt aus Hydroxy-, Mono- oder Dialkylamino-, Phenyl- oder Pyridylgruppe.
Unter "Alkoxy" werden erfindungsgemäß geradkettige oder verzweigtkettige Alkoxygruppen mit 1-18 Kohlenstoffatomen verstanden, wie z. B. Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy-, Isopropoxy-, n-Butoxy-, sec-Butoxy-, tert-Butoxy-, Pentoxy-, 2-Pentyl-, Isopentoxy-, Neopentoxy-, Hexoxy-, 2-Hexoxy-, 3-Hexoxy- und 3-Methylpentoxygruppen.
Unter "Alken" werden erfindungsgemäß geradkettige oder verzweigtkettige Alkengruppen mit 2–18 Kohlenstoffatomen verstanden, wie z. B. Ethylen, Propylen, 1-Buten, 1-Penten, 1-Hexen, cis- und trans-2-Buten oder 2-Penten, Isobutylen, 3-Methyl-1-buten, 2-Methyl-2-buten und 2,3-Dimethyl-2-buten.
Unter "Salze davon" werden erfindungsgemäß Verbindungen verstanden, die erfindungsgemäß als Salze und Metallkomplexe mit den Verbindungen verwendet werden, wie mit in nicht-begrenzender Weise Al, Zn, Mg, Cu und Fe.
KURZE BESCGREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Reihe von Diagrammen, die die Wirkung von Vitamin-B6-Derivaten auf die AGE-Bildung in Rinder-Serumalbumin (BSA) zeigen. 1A Pyridoxamin (PM); 1B Pyridoxalphosphat (PLP); 1C Pyridoxal (PL); 1D Pyridoxin (PN).
2 ist eine Reihe von Diagrammen, die die Wirkung von Vitamin-B1-Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf die AGE-Bildung in Rinder-Serumalbumin zeigen. 2A Thiaminpyrophosphat (TPP); 2B Thiaminmonophosphat (TP); 2C Thiamin (T); 2D Aminoguanidin (AG).
3 ist eine Reihe von Diagrammen, die die Wirkung von Vitamin-B6-Derivaten auf die AGE-Bildung in humanem Methämoglobin (Hb) zeigen. 3A Pyridoxamin (PM); 3B Pyridoxalphosphat (PLP); 3C Pyridoxal (PL); 3D Pyridoxin (PN).
4 ist eine Reihe von Diagrammen, die die Wirkung von Vitamin-B 1-Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf die AGE-Bildung in humanem Methämoglobin zeigen. 4A Thiaminpyrophosphat (TPP); 4B Thiaminmonophosphat (TP); 4C Thiamin (T); 4D Aminoguanidin (AG).
5 ist ein Balkendiagramm, das die Hemmung der Glykierung von Ribonuklease A durch Thiaminpyrophosphat (TPP), Pyridoxamin (PM) und Aminoguanidin (AG) vergleicht.
6A ist ein Diagramm der Kinetiken der Glykierung von RNase A (10 mg/ml) durch Ribose, wie mittels ELISA aufgezeichnet. 6B ist ein Diagramm, das die Abhängigkeit von reziproken Halbwertszeiten auf die Ribosekonzentration bei pH 7,5 zeigt.
7 sind zwei Diagramme, die einen Vergleich von nicht-unterbrochener und unterbrochener Glykierung von RNase durch Glucose (7B) urd Ribose (7A) zeigen, wie mittels ELISA detektiert.
8 sind zwei Diagramme, die die Kinetiken einer Pentosidin-Fluoreszenz (willkürliche Einheiten)-Erhöhung während einer nicht-unterbrochenen und unterbrochenen Riboseglykierung von RNase zeigen. 8A nicht-unterbrochene Glykierung in Gegenwart von 0,05 M Ribose. 8B unterbrochene Glykierung nach 8 und 24 Stunden Inkubation.
9 ist ein Diagramm, das die Kinetiken der Zunahme eines reaktiven Zwischenprodukts zeigt.
10 sind Diagramme einer Post-Amadori-Hemmung der AGE-Bildung durch Ribose. 10A zeigt Daten, wobei Aliquots in Inhibitor-enthaltende Puffer bei Zeitpunkt 0 verdünnt wurden. 10B zeigt Daten, wobei Proben bei 24 Stunden unterbrochen wurden und sodann in Inhibitor-enthaltende Puffer verdünnt wurden.
11 ist ein Diagramm, das die Abhängigkeit der Anfangsgeschwindigkeit der Bildung von antigenem AGE vom pH-Wert nach Unterbrechung der Glykierung zeigt.
12 sind zwei Diagramme, die die Wirkung eines pH-Sprungs auf die ELISAdetektierte AGE-Bildung nach unterbrochener Glykierung zeigen. Unterbrochene Proben, die 12 Tage bei 37°C in pH 5,0-Puffer belassen worden waren, ergaben beträchtliche AGEs (33%; 12B), wenn der pH-Wert auf 7,5 geändert wurde, verglichen mit der normalen Kontrollprobe, die keinem niedrigen pH-Wert ausgesetzt wurde (12A).
13 ist eine Reihe von Diagrammen, die die Wirkung von Vitamin-B6-Derivaten auf die AGE-Bildung während einer nicht-unterbrochenen Glykierung von Ribonuklease A (RNase A) durch Ribose zeigen. 13A Pyridoxamin (PM); 13B Pyridoxal-5'-phosphat (PLP}; 13C Pyridoxal (PL); 13D Pyridoxin (PN).
14 ist eine Reihe von Diagrammen, die die Wirkung von Vitamin-B1-Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf die AGE-Bildung während einer nichtunterbrochenen Glykierung von Ribonuklease A (RNase A} durch Ribose zeigen. 14A Thiaminpyrophosphat (TPP); 14B Thiaminmonophosphat (TP); 14C Thiamin (T); 14D Aminoguanidin (AG).
15 ist eine Reihe von Diagrammen, die die Wirkung von Vitamin-B6-Derivaten auf die AGE-Bildung während einer nicht-unterbrochenen Glykierung von Rinder-Serumalbumin (BSA) durch Ribose zeigen. 15A Pyridoxamin (PM); 15B Pyridoxal-5'-phosphat (PLP); 15C Pyridoxal (PL); 15D Pyridoxin (PN).
16 ist eine Reihe von Diagrammen, die die Wirkung von Vitamin-B1-Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf die AGE-Bildung während einer nichtunterbrochenen Glykierung von Rinder-Serumalbumin (BSA) durch Ribose zeigen. 16A Thiaminpyrophosphat (TPP); 16B Thiaminmonophosphat (TP); 16C Thiamin (T); 16D Aminoguanidin (AG).
17 ist eine Reihe von Diagrammen, die die Wirkung von Vitamin-B6-Derivaten auf die AGE-Bildung während einer nicht-unterbrochenen Glykierung von humanem Methämoglobin (Hb) durch Ribose zeigen. 17A Pyridoxamin (PM); 178 Pyridoxal-5'-phosphat (PLP); 17C Pyridoxal (PL); 17D Pyridoxin (PN).
18 ist eine Reihe von Diagrammen, die die Wirkung von Vitamin-B6-Derivaten auf die Post-Amadori-AGE-Bildung nach unterbrochener Glykierung durch Ribose zeigen. 18A BSA und Pyridoxamin (PM); 18B BSA und Pyridoxal-5'-phosphat (PLP); 18C BSA und Pyridoxal (PL); 18D RNase und Pyridoxamin (PM}.
19 sind Diagrammen, die die Wirkung von Thiaminpyrophosphat auf die Post-Amadori-AGE-Bildung nach unterbrochener Glykierung durch Ribose zeigen. 19A RNase, Figur 19B BSA.
20 sind Diagramme, die die Wirkung von Aminoguanidin auf die Post-Amadori-AGE-Bildung nach unterbrochener Glykierung durch Ribose zeigen. Figur 20A RNase, 20B BSA.
21 ist ein Diagramm, das die Wirkung von N-Acetyl-L-Lysin auf die Post-Amadori-AGE-Bildung nach unterbrochener Glykierung durch Ribose zeigt.
22 sind Balkendiagramme, die einen Vergleich einer Post-Amadori-Hemmung der AGE-Bildung durch Thiaminpyrophosphat (TPP), Pyridoxamin (PM) und Aminoguanidin (AG) nach unterbrochener Glykierung von RNase (22A) und BSA (22B) durch Ribose zeigen.
23 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen einer Ribosebehandlung in vivo allein auf den Schwanzmanschetten-Blutdruck von Ratten zeigt. Eine Behandlung erfolgte mit 0,05 M, 0,30 M und 1 M Ribose (R), injiziert für 1, 2 oder 8 Tage (D).
24 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen einer Ribosebehandlung in vivo allein auf die Creatinin-Clearance von Ratten (Clearance pro 100 g Körpergewicht) zeigt. Eine Behandlung erfolgte mit 0,05 M, 0,30 M und 1 M Ribose (R), injiziert für 1, 2 oder 8 Tage (D).
25 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen einer Ribosebehandlung in vivo allein auf die Albuminurie von Ratten (Albumin-Ausströmgeschwindigkeit) zeigt. Eine Behandlung erfolgte mit 0,30 M und 1 M Ribose (R), injiziert für 1, 2 oder 8 Tage (D).
26 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen einer Inhibitorbehandlung in vivo mit oder ohne Ribose auf den Schwanzmanschetten-Blutdruck von Ratten zeigt. Behandlungsgruppen waren: 25 mg/kg Körpergewicht Aminoguanidin (AG); 25 oder 250 mg/kg Körpergewicht Pyridoxamin (P); 250 mg/kg Körpergewicht Thiaminpyrophosphat (T) oder mit 1 M Ribose (R).
27 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen einer Inhibitorbehandlung in vivo mit oder ohne Ribose auf die Creatinin-Clearance von Ratten (Clearance pro 100 g Körpergewicht) zeigt. Behandlungsgruppen waren: 25 mg/kg Körpergewicht Aminoguanidin (AG); 25 oder 250 mg/kg Körpergewicht Pyridoxamin (P); 250 mg/kg Körpergewicht Thiaminpyrophosphat (T) oder mit 1 M Ribose (R).
28 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen einer Inhibitorbehandlung in vivo ohne Ribose und Ribose allein auf die Albuminurie von Ratten (Albumin-Ausströmgeschwindigkeit) zeigt. Behandlungsgruppen waren: 25 mg/kg Körpergewicht Aminoguanidin (AG); 250 mg/kg Körpergewicht Pyridoxamin (P); 250 mg/kg Körpergewicht Thiaminpyrophosphat (T) oder Behandlung mit 1 M Ribose (R) für 8 Tage (D). Eine Kontrollgruppe wurde nicht behandelt.
29 ist ein Balkendiagramm, das die Wirkungen einer Inhibitorbehandlung in vivo mit 1 M Ribose auf die Albuminurie von Ratten (Albumin-Ausströmgeschwindigkeit) zeigt. Behandlungsgruppen waren: 25 mg/kg Körpergewicht Aminoguanidin (AG); 25 und 250 mg/kg Körpergewicht Pyridoxamin (P); 250 mg/kg Körpergewicht Thiaminpyrophosphat (T) oder Behandlung mit 1 M Ribose (R) für 8 Tage (D) allein. Eine Kontrollgruppe wurde nicht behandelt.
30A zeigt das Schema 1, das ein Diagramm der AGE-Bildung aus Protein zeigt. 30B zeigt das Schema 2, eine chemische Struktur von Aminoguanidin. 30C zeigt das Schema 3, chemische Strukturen von Thiamin, Thioamin-5'phosphat und Thiaminpyrophosphat. 30D zeigt das Schema 4, chemische Strukturen von Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5'-phosphat und Pyridoxal. 30E zeigt das Schema 5, eine Darstellung von Kinetiken der AGE-Bildung. 30F zeigt das Schema 6, eine Darstellung von Kinetiken der AGE-Bildung und Zwischenproduktbildung.
31 zeigt ein 125 MHz C-13 NMR-Resonanzspektrum eines Ribonuklease-Amadori-Zwischenprodukts, das durch 24-stündige Reaktion mit 99% [2-C13]Ribose hergestellt wurde.
32 zeigt Diagramme, die eine Bildung von AGE-Zwischenprodukten unter Verwendung der Pentosen Xylose, Lyxose, Arabinose und Ribose zeigen.
33 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Glomeruli-Anfärbung bei einem pH-Wert von 2,5 mit Alcianblau zeigt.
34 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Glomeruli-Anfärbung bei einem pH-Wert von 1,0 mit Alcianblau zeigt.
35 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Immunfluoreszenz-Glomeruli-Anfärbung für RSA zeigt.
36 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Immunfluoreszenz-Glomeruli-Anfärbung für Heparan-Sulfat-Proteoglycan-Kernprotein zeigt.
37 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Immunfluoreszenz-Glomeruli-Anfärbung für Heparan-Sulfat-Proteoglycan-Seitenkette zeigt.
38 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse einer Analyse von Glomeruli-Schnitten für ein durchschnittliches glomeruläres Volumen zeigt.
39. Wirkung von AG und PM auf eine Entwicklung von Nephropathie in STZdiabetischen Ratten. Urin (24-Stunden-Proben) und Blut wurden bei 4-wöchigen Intervallen für eine Messung von Albuminurie (A) und Plasmacreatinin (B) gesammelt. Daten sind als Mittelwert ± SEM für nicht-diabetische Kontrolle (⦁ , nicht diabetische Kontrolle + PM
unbehandelte diabetische (∎), diabetische + PM (∎) und diabetische + AG (Δ)-Gruppen ausgedrückt. Proteinurie (C) wurde in einer 24-Stunden-Sammlung am Ende des Experiments (28 Wochen Diabetes) gemessen. Statistische Zusammenfassungen, bestimmt durch den Mann-Whitney-Rang-Summentest: alle diabetischen Gruppen gegen nicht-diabetische Kontrollen in A, B und C, p < 0,001. (A, Albuminurie): D-PM gegen D, p < 0,0001; D-AG gegen D, p = 0,05; D-PM gegen D-AG, p < 0,01. (B, Creatininämie): D-PM gegen D, p < 0,0001; D-AG gegen D, p < 0,05; D-PM gegen D-AG, p = 0,02. (C, Proteinurie): D-PM gegen D, p < 0,001; D-AG gegen D, p < 0,01; D-PM gegen D-AG, NS.
40. Wirkung von AG und PM auf Dyslipidämie in STZ-diabetischen Ratten. Plasma, das am Ende des Experiments (28 Wochen) erhalten wurde, wurde auf Triglyceride (A), Gesamtcholesterin (B), freie Fettsäuren (C) und Glycerin (D) untersucht. Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung für nicht-diabetische Kontrolle (⦁), nicht-diabetische Kontrolle + PM
unbehandelte diabetische Gruppe (❍), diabetische + PM-Gruppe (⎕) und diabetische + AG-Gruppe (Δ) angegeben. Eine statistische Analyse erfolgte durch den. Mann-Whitney-Rang-Summentest: alle diabetischen Gruppen gegen nicht-diabetische Kontrollen in A, B, C und D, p ≤ 0,001. (A): D-PM gegen D, p = 0,0001; D-AG gegen D, p = 0,05; D-PM gegen D-AG, p ^< 0,01. (B): D-PM gegen D: D-AG gegen D, NS; D-PM gegen D-AG, p < 0,01. (C): D-PM gegen D, p = 0,002; D-AG gegen D, p < 0,001; D-PM gegen D-AG, NS. (D): D gegen C, p < 0,0001; D-PM gegen D, p < 0,0001; D-AG gegen D, p < 0,0001; D-PM gegen D-AG, NS.
41. Wirkung von AG und PM auf Redox-Ungleichgewichte in STZ-diabetischen Ratten. Plasma, das am Ende des Experiments (28 Wochen) erhalten wurde, wurde auf Lactat (A)- und Pyruvat (B)-Konzentrationen untersucht. Deren Verhältnis von Lactat/Pyruvat, ein Anzeichen für den Redox-Status, ist in Rahmen (C) gezeigt. Symbole sind in der Legende zu 2 definiert. Eine statistische Analyse erfolgte durch den Mann-Whitney-Rang-Summentest. (C, Lactat/Pyruvat): D gegen C, p ^< 0,0001; D-PM gegen D, p < 0,001; D-AG gegen D, p = 0,002; D-PM gegen D-AG, p < 0,01.
42. Korrelationen zwischen AGEs in Hautkollagen und biochemischen und physiologischen Parametern. Korrelationen zwischen CML und Plasmatriglyceriden (A), Albumin im Urin und Plasmatriglyceridkonzentrationen (B) und CML und Albuminkonzentration im Urin (C) sind gezeigt. Eine statistische Analyse erfolgte durch Pearson-Produkt-Moment-Berechnungen. Symbole sind in der Legende zu 2 definiert. Korrelationskoeffizienten und p-Werte sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
GENAUE BESCHREIBUNG
Tiermodelle für Protein Alterung
Aloxan-induzierte diabetische Lewis-Ratten wurden als ein Modell für Protein-Alterung verwendet, um die in viuo-Effektivität von Inhibitoren der AGE-Bildung zu zeigen. Die gezeigte Korrelation liegt zwischen einer Hemmung einer späten, mit Diabetes verbundenen Erkrankung und einer wirksamen Hemmung der AGE-Bildung (Brownlee, Cerami und Vlassara, 1988, New Eng. J. Med. 318(20): 1315–1321). Streptozotocin-Induktion von Diabetes in Lewis-Ratten, Neuseeland-weißen Kaninchen mit induzierter Diabetes und genetisch diabetischen BB/Worcester-Ratten wurden auch verwendet, wie z. B. in der US-PS 5,334,617 beschrieben. Ein Hauptproblem mit diesen Modellsystemen ist die lange Zeitspanne, die benötigt wird, um eine mit AGE verbundene Schädigung zu zeigen und somit Verbindungen für eine AGE-Hemmung zu testen. Zum Beispiel wurde eine 16-wöchige Behandlung für die in der US-PS 5,334,617 beschriebenen Rattenstudien und 12 Wochen für die Kaninchenstudien benötigt. Somit wäre es hochgradig wünschenswert und nützlich, ein Modellsystem für eine mit AGE verbundene diabetische Erkrankung zu haben, die sich in einer kürzeren Zeitspanne manifestiert, wodurch eine effizientere und schnellere Bestimmung einer mit AGE verbundenen Schädigung und der Effektivität von Inhibitoren der Post-Amadori-AGE-Bildung ermöglicht wird.
Antikörper gegen AGEs
Ein wichtiges Werkzeug zum Untersuchen der AGE-Bildung ist die Verwendung von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für AGEs sind, die durch die Umsetzung von verschiedenen Zuckern mit einer Vielzahl von Ziel-Proteinen erzeugt werden. Die Antikörper werden für die erhaltene Spezifität für AGEs gescreent, d. h. unabhängig von der Natur der Proteinkomponente des AGE (Nakayama et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 162: 740–745; Nakayama et al., 1991, J. Immunol. Methods 140: 119–125; Horiuchi et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 7329–7332; Araki et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 10211–10214; Makita et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5133–5138). Solche Antikörper wurden verwendet, um die AGE-Bildung in vivo und in vitro zu beobachten.
Thiamin-Vitamin B1
Das erste Mitglied des zu identifizierenden Vitamin B-Komplexes, Thiamin, ist praktisch frei von pharmakodynamischen Wirkungen, wenn es in üblichen therapeutischen Dosen gegeben wird. Und sogar große Dosen sind nicht dafür bekannt, irgendeine Wirkung aufzuweisen. Thiaminpyrophosphat ist die physiologisch aktive Form von Thiamin und es fungiert hauptsächlich in dem Kohlenhydrat-Metabolismus als ein Co-Enzym in der Decarboxylierung von α-Ketosäuren. Tabletten von Thiaminhydrochlorid sind von jeweils 5 bis 500 mg erhältlich. Thiaminhydrochlorid-Injektionslösungen sind erhältlich, die 100 bis 200 mg/ml enthalten.
Zum Behandeln eines Thiaminmangels werden intravenöse Dosen so hoch wie 100 mg/1 parenteraler Flüssigkeit verwendet, wobei eine typische Dosis von 50 bis 100 mg verabreicht wird. Es wird angenommen, dass die GI-Absorption von Thiamin auf 8 bis 15 mg pro Tag begrenzt ist, aber durch orale Verabreichung in aufgeteilten Dosen mit der Nahrung übertroffen werden kann.
Wiederholte Verabreichung von Glucose kann einen Thiaminmangel bei unterernährten Patienten erzeugen und dies wurde während der Korrektur von Hyperglykämie bemerkt.
Überraschenderweise wurde erfindungsgemäß festgestellt, wie durch in vitro-Untersuchung gezeigt, dass eine Verabreichung von Thiaminpyrophosphat bei Mengen oberhalb derjenigen, die normalerweise im menschlichen Körper gefunden oder für eine Diättherapie verabreicht werden, ein effektiver Inhibitor der Post-Amadori-antigenischen AGE-Bildung ist, und dass diese Hemmung vollständiger ist als die durch die Verabreichung von Aminoguanidin mögliche.
Pyridoxin-Vitamin B6
Vitamin B6 ist typischerweise in Form von Pyridoxinhydrochlorid in rezeptfreien Zubereitungen erhältlich, die von vielen Quellen erhältlich sind. Zum Beispiel enthalten die Beach Pharmazeutika Beelith-Tabletten 25 mg Pyridoxinhydrochlorid, was 20 mg B6 entspricht, andere Zubereitungen umfassen Marlyn Health Care Marlyn Formula 50, die 1 mg Pyridoxin HCl enthält, und Marlyn Formula 50 Mega Forte, die 6 mg Pyridoxin HCl enthält, Wyeth-Ayerst Stuart Prenatal^®-Tabletten, die 2,6 mg Pyridoxin HCl enthalten, J & J-Merck Corp. Stuart Formula^®-Tabletten ent halten 2 mg Pyridoxin HCl und die CIBA Consumer Sunkist Kinder kaubaren Multivitamine, die 1,05 mg Pyridoxin HCl enthalten, 150% der US-RDA für Kinder von 2 bis 4 Jahren und 53% der US-RDA für Kinder über 4 Jahre und Erwachsene (Physician's Desk Reference for nonprescription drugs, 14. Auflage (Medical Economics Data Production Co., Montvale, N. J., 1993)).
Es gibt drei verwandte Formen von Pyridoxin, die sich in der Natur der Substitution an dem Kohlenstoffatom in Position 4 des Pyridinkerns unterscheiden: Pyridoxin ist ein primärer Alkohol, Pyridoxal ist der entsprechende Aldehyd und Pyridoxamin enthält eine Aminomethylgruppe an dieser Position. Jede dieser drei Formen kann von Säugern nach Umwandlung durch die Leber in Pyridoxal-5'-Phosphat, die aktive Form des Vitamins, verwendet werden. Es wurde lange Zeit angenommen, dass diese drei Formen in den biologischen Eigenschaften äquivalent sind und sie wurden als äquivalente Formen von Vitamin B6 im Fachgebiet behandelt. The Council on Pharmacy and Chemistry hat den Namen Pyridoxin dem Vitamin zugeschrieben.
Der aktivste Antimetabolit zu Pyridoxin ist 4-Desoxypyridoxin, dessen Antimetabolit-Aktivität der in viuo-Bildung von 4-Desoxypyridoxin-5-Phosphat, einem kompetitiven Inhibitor für verschiedene Pyridoxalphosphat-abhängige Enzyme, zugeschrieben wurde. Die pharmakologischen Wirkungen von Pyridoxin sind begrenzt, da es keine herausragenden pharmakodynamischen Wirkungen nach entweder oraler oder intravenöser Verabreichung hervorruft, und es weist eine niedrige akute Toxizität auf, wobei es wasserlöslich ist. Es wurde angenommen, dass sich eine Neurotoxizität nach einer verlängerten Aufnahme von so wenig wie 200 mg Pyridoxin pro Tag entwickeln kann. Physiologisch als ein Co-Enzym ist Pyridoxinphosphat an verschiedenen metabolischen Transformationen von Aminosäuren, einschließlich Decarboxylierung, Transaminierung und Racemisierung, als auch bei enzymatischen Schritten in dem Metabolismus von schwefelhaltigen und Hydroxyaminosäuren beteiligt. Im Fall der Transaminierung wird Pyridoxalphosphat zu Pyridoxaminphosphat durch eine Donor-Aminosäure aminiert und das gebundene Pyridoxaminphosphat wird sodann zu Pyridoxalphosphat durch die Akzeptor-α-Ketosäure desaminiert. Folglich ist der Vitamin B-Komplex dafür bekannt, dass er ein notwendiges Nahrungsergänzungsmittel ist, das beim spezifischen Abbau von Aminosäuren beteiligt ist. Für einen allgemeinen Überblick über den Vitamin B-Komplex siehe The Pharmacological Basis of Therapeutics, B. Auflage, Hrsg. Gilman, Rall, Nies und Taylor (Pergamon Press, New York, 1990, Seiten 1293–4; Seiten 1523–1540).
Überraschenderweise wurde erfindungsgemäß herausgefunden, dass wirksame Dosen der metabolisch vorübergehenden Pyridoxalaminform von Vitamin B6 (Pyridoxamin) bei Mengen oberhalb derjenigen, die normalerweise im menschlichen Körper gefunden werden, ein wirksamer Inhibitor der Post-Amadori-antigenischen AGE-Bildung sind, und dass diese Hemmung vollständiger sein kann als die durch die Verabreichung von Aminoguanidin mögliche.
Bildung eines stabilen Amadori/Schiff-Base-Zwischenprodukts
Die typische Untersuchung der Reaktion eines Proteins mit Glucose, um AGEs zu bilden, war diejenige durch ELISA unter Verwendung von Antikörpern, die gegen antigenische AGEs gerichtet sind, und die Detektion der Herstellung eines säurestabilen fluoreszierenden AGE, Pentosidin, durch HPLC, gefolgt von Säurehydrolyse. Glykierang von Ziel-Proteinen (d. h. BSA oder RNase A) mit Glucose und Ribose wurde durch Beobachten der ELISA-Reaktvität von polyklonalen Kaninchen-anti-Glucose-AGE-RNase- und anti-Glucose-AGE-BSA-Antikörpern verglichen. Das Antigen wurde dadurch hergestellt, dass 1 M Glucose mit RNase 60 Tage und BSA 90 Tage umgesetzt wurden. Die Antikörper (R618 und R479) wurden gescreent und zeigten eine Reaktivität mit nur AGEs und nicht dem Protein, mit Ausnahme des Carrier-Immunogens BSA.
Beispiel 1
Thiaminpyrophosphat und Pyridoxamin hemmen die Bildung von antigenischen Endprodukten der fortgeschrittenen Glykierung aus Glucose: Vergleich mit Aminoguanidin
Es wurde kürzlich vorgeschlagen, dass einige B6-Vitamere, insbesondere Pyridoxalphosphat (PLP), als "kompetitive Inhibitoren" der frühen Glykierung fungieren, da sie als Aldehyde selbst Schiff Base-Addukte mit Protein-Aminogruppen bilden können (Khatami et al., 1988, Life Sciences 43: 1725–1731), und somit die Menge an Aminen begrenzen, die für eine Glucose-Anbindung verfügbar sind. Jedoch ist die Effektivität bei der Begrenzung der anfänglichen Zuckeranbindung keine Vorhersage für eine Hemmung der Umwandlung eines jeden gebildeten Amadori-Produkts zu AGEs. Die vorliegende Erfindung beschreibt Inhibitoren von "späten" Gly kierungsreaktionen, wie sie durch deren Wirkungen auf die in vitro-Bildung von antigenischen AGEs angegeben sind (Booth et al., 1996, Biochem. Biophys. Res. Com. 220: 113–119).
Chemikalien Rinderbauchspeichel-Ribonuklease A (RNase) war chromatographisch rein, eine Aggregat-freie Güte von Worthington Biochemicals. Rinder-Serumalbumin (BSA; Fraktion V, Fettsäure-frei), humanes Methämoglobin (Hb), D-Glucose, Pyridoxin, Pyridoxal, Pyridoxal-5'-phosphat, Pyridoxamin, Thiamin, Thiaminmonophosphat, Thiaminpyrophosphat und Ziegen-Alkaliphosphatase-konjugiertes anti-Kaninchen-IgG waren alle von Sigma Chemicals. Aminoguanidinhydrochlorid wurde von Aldrich Chemicals bezogen.
Nicht-unterbrochene Glykierung mit Glucose Rinder-Serumalbumin, Ribonuklease A und humanes Hämoglobin wurden mit Glucose bei 37°C in 0,4 M Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 und 0 02% Natriumazid inkubiert. Das Protein, Glucose (bei 1,0 M) und voraussichtliche Inhibitoren (bei 0,5, 3, 15 und 50 mM) wurden in das Inkubationsgemisch gleichzeitig eingebracht. Lösungen wurden in. Röhrchen mit Deckeln im Dunkeln gehalten. Äliquots wurden entnommen und sofort eingefroren, bis sie durch ELISA beim Abschluss der Reaktion analysiert wurden. Die Inkubationen betrugen 3 Wochen (Hb) oder 6 Wochen (RNase, BSA).
Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen AGE-Proteine
Immunogenherstellung folgte früheren Protokollen (Nakayama et al., 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 162: 740–745; Horiuchi et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 7329–7332; Makita et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5133–5138). Kurz gesagt wurde ein Immunogen durch Glykierung von BSA (R479-Antikörper) oder RNase (R618-Antikörper) bei 1,6 g Protein in 15 ml für 60–90 Tage unter Verwendung von 1,5 M Glucose in 0,4 M Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 und 0,05% Natriumazid bei einem pH-Wert von 7,4 und 37°C hergestellt. Weiße, männliche Neuseeland-Kaninchen von 8–12 Wochen wurden durch subkutane Verabreichung einer 1 ml-Lösung immunisiert, die 1 mg/ml des glykierten Proteins in Freund'schem Adjuvans enthielt. Die erste Injektion verwendete das vollständige Adjuvans und drei Auffrischungsimpfungen wurden bei 3-wöchigen Intervallen mit Freund'schem unvollständigem Adjuvans durchgeführt. Kaninchen wurden 3 Wochen nach der letzten Auffrischimpfung zur Ader gelassen. Das Serum wurde durch Zentrifugation des geronnenen Gesamtbluts gesammelt. Die Antikörper waren AGE-spezifisch, wobei sie unreaktiv entweder mit nativen Proteinen (mit Ausnahme des Carriers) oder mit Amadori-Zwischenprodukten waren. Die polyklonalen anti-AGE-Antikörper waren nachweislich ein sensitives und wertvolles analytisches Werkzeug für die Untersuchung einer "späten" AGE-Bildung in vitro und in vivo. Die Natur des dominanten Antigen-AGE-Epitops oder Haptens verbleibt zweifelhaft, obwohl kürzlich vorgeschlagen wurde, dass das Protein-Glykoxidations-Produkt Carboxymethyllysin (CML) ein dominantes Antigen für einige Antikörper sein kann (Reddy et al., 1995, Biochem. 34: 10872–10878). Frühere Studien schafften es nicht, eine ELISA-Reaktivität mit Modell-CML-Verbindungen zu zeigen (Makita et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5133–5138).
ELISA-Detektion von AGE-Produkten Das allgemeine Verfahren von Engvall (1981, Methods Enzymol. 70: 419–439) wurde verwendet, um den ELISA durchzuführen. Typischerweise wurden glykierte Proteinproben auf etwa 1,5 ug/ml in 0,1 M Natriumcarbonat-Puffer mit einem pH-Wert von 9,5–9,7 verdünnt. Mit dem Protein wurden über Nacht bei Raumtemperatur 96-Well-Polystyrol-Platten dadurch beschichtet, dass 200 μl der Proteinlösung in jedes Well (0,3 μg/Well) pipettiert wurden. Nach dem Beschichten wurde das Protein von den Wells mit einer Salzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. Die Wells wurden sodann mit 200 μl 1% Kasein in Carbonatpuffer 2 Stunden bei 37°C geblockt, gefolgt von Waschen. Kaninchen-anti-AGE-Antikörper wurden bei einem Titer von etwa 1 : 350 in Inkubationspuffer verdünnt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert, gefolgt von Waschen. Um den Hintergrund zu minimieren, wurden Antikörper R479, die zum Detektieren von glykierter RNase verwendet wurden, gegen glykiertes BSA eingesetzt und Antikörper R618, die zum Detektieren von glykiertem BSA und glykiertem Hb verwendet wurden, wurden gegen glykierte RNase eingesetzt. Ein alkalische Phosphatasekonjugierter Antikörper gegen Kaninchen-IgG wurde sodann als zweiter Antikörper bei einem Titer von 1 : 2000 oder 1: 2500 (abhängig von der Charge) hinzugegeben und 1 Stunde bei 37°C inkubiert, gefolgt von Waschen. Die p-Nitrophenylphosphat-Substratlösung wurde sodann zu den Platten (200 μl/Well) zugefügt, wobei die Absorption des freigesetzten p-Nitrophenolats bei 410 nm mit einem Dynatech MR 4000-Mikroplatten-Lesegerät gemessen wurde.
Unmodifiziertes Protein enthaltende Kontrollen waren routinemäßig umfasst und deren Messwerte wurden subtrahiert, wobei die Korrekturen gewöhnlich vernach lässigbar waren. Die Validität der Verwendung des ELISA-Verfahrens beim quantitativen Untersuchen der Kinetiken der AGE-Bildung hängt von der Linearität des Tests ab (Kemeny und Challacombe, 1988, ELISA and Other Solid Phase Immunoassays, John Wiley & Sons, Chichester, U. K.). Kontrollexperimente erfolgten, die z. B. zeigten, dass der lineare Bereich für RNase unterhalb einer Beschichtungskonzentration von etwa 0,2–0,3 mg/Well liegt.
Ergebnisse
1A–D sind Diagramme, die die Wirkung von Vitamin-B6-Derivaten auf die Post-Amadori-AGE-Bildung in mit Glucose glykiertem Rinder-Serumalbumin zeigen. BSA (10 mg/ml) wurde mit 1,0 M Glucose in Gegenwart und Abwesenheit der verschiedenen angegebenen Derivate in 0,4 M Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 bei 37°C 6 Wochen inkubiert. Aliquots wurden durch ELISA unter Verwendung von R618-anti-AGE-Antikörpern untersucht. Konzentrationen der Inhibitoren betrugen 3, 15 und 50 mM. Der in (1A) verwendete Inhibitor war Pyridoxamin (PM), in (1B) Pyridoxalphosphat (PLP), in (1C) Pyridoxal (PL) und in (1D) Pyridoxin (PN).
1 (Kontrollkurven) zeigt, dass die Reaktion von BSA mit 1,0 M Glucose langsam und nach 40 Tagen unvollständig ist, sogar bei der hohen Zuckerkonzentration, die verwendet wurde, um die Reaktion zu beschleunigen. Das gleichzeitige Einbringen von verschiedenen Konzentrationen von verschiedenen B6-Vitameren beeinflusst die Bildung von antigenischen AGEs erheblich. (1A–D) Pyridoxamin und Pyridoxalphosphat unterdrückten stark eine antigenische AGE-Bildung sogar bei den niedrigsten getesteten Konzentrationen, während Pyridoxal oberhalb 15 mM wirksam war. Pyridoxin war bei den höchsten getesteten Konzentrationen etwas wirksam.
2A–D sind Diagramme, die die Wirkung von Vitamin-B 1-Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf die AGE-Bildung in Rinder-Serumalbumin zeigen. BSA (10 mg/ml) wurde mit 1,0 M Glucose in Gegenwart und Abwesenheit der verschiedenen angegebenen Derivate in 0,4 M Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 bei 37°C 6 Wochen inkubiert. Aliquots wurden durch ELISA unter Verwendung von R618-anti-AGE-Antikörpern untersucht. Konzentrationen der Inhibitoren betrugen 3, 15 und 50 mM. Der in (2A) verwendete Inhibitor war Thiaminpy rophosphat (TPP}, in (2B) Thiaxninmonophosphat (TP), in (2C) Thiamin (T) und in (2D) Aminoguanidin (AG).
Von den verschiedenen ähnlich getesteten B1-Vitameren (2A–D) war Thiaminpyrophosphat bei allen untersuchten Konzentrationen wirksam (2C), während Thiamin und Thiaminmonophosphat nicht hemmend waren. Am erstaunlichsten ist der Abfall bei den Endmengen der gebildeten AGEs, beobachtet mit Thiaminpyrophosphat, Pyridoxalphosphat und Pyridoxamin. Aminoguanidin ( 2D) ergab eine gewisse Hemmung der AGE-Bildung in BSA, aber weniger als die vorstehenden Verbindungen. Ähnliche Studien erfolgten mit humanem Methämoglobin und Rinder-Ribonuklease A.
3A–D sind Diagramme, die die Wirkung von Vitamin-B6-Derivaten auf die AGE-Bildung in humanem Methämoglobin zeigen. Hb (1 mg/ml) wurde mit 1,0 M Glucose in Gegenwart urd Abwesenheit der verschiedenen angegebenen Derivate in 0,4 M Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 bei 37°C 3 Wochen inkubiert. Aliquots wurden durch ELISA unter Verwendung von R618-anti-AGE-Antikörpern untersucht. Konzentrationen der Inhibitoren betrugen 0,5, 3, 15 und 50 mM. Der in (3A) verwendete Inhibitor war Pyridoxamin (PM), in (3B) Pyridoxalphosphat (PLP), in (3C) Pyridoxal (PL) und in (3D) Pyridoxin (PN}.
Es wurde kürzlich beschrieben, dass Hb eines diabetischen Patienten eine Komponente enthält, die an anti-AGE-Antikörper bindet, und es wurde vorgeschlagen, dass dieses glykierte Hb (als Hb-AGE bezeichnet, nicht zu verwechseln mit Hb_Alc) geeignet sein könnte, eine Langzeitexposition gegenüber Glucose zu messen. Die in vitro-Inkubation von Hb mit Glucose erzeugt antigene AGEs bei einer scheinbar schnelleren Geschwindigkeit als mit BSA beobachtet. Nichtsdestotrotz wiesen die verschiedenen B6 (3A–D)- und B1 (4A–C)-Vitamere die gleichen Hemmungsverläufe bei Hb auf, wobei Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat die effektivsten Inhibitoren in jeder ihrer entsprechenden Familien waren. Signifikanterweise hemmte bei Hb Aminoguanidin nur die Geschwindigkeit der AGE-Bildung und nicht die Endmengen des gebildeten AGE (4D)., Mit RNase lag die Geschwindigkeit der Antigen-AGE-Bildung durch Glucose zwischen der von Hb und BSA, aber der Grad der Hemmung innerhalb jeder Vitamer-Reihe wurde beibehalten. Wiederum waren Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat wirksamer als Axninoguanidin (5).
4A–D sind Diagramme, die die Wirkung von Vitamin-B 1-Derivaten und Aminoguanidin (AG) auf die AGE-Bildung bei humanem Methämoglobin zeigen. Hb (1 mg/ml) wurde mit 1,0 M Glucose in Gegenwart und Abwesenheit der verschiedenen angegebenen Derivate in 0,4 M Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 bei 37°C 3 Wochen inkubiert. Aliquots wurden mit ELISA unter Verwendung von R618-anti-AGE-Antikörpern untersucht. Konzentrationen der Inhibitoren betrugen 0,5, 3, 15 und 50 mM. Der in (4A) verwendete Inhibitor war Thiaminpyrophosphat (TPP), in (4B) Thiaminmanophosphat (TP), in (4C) Thiamin (T) und in (4D) Aminoguanidin (AG).
5 ist ein Balkendiagramm, das einen Vergleich der Hemmung der Glykierung von Ribonuklease A durch Thiaminpyrophosphat (TPP), Pyridoxamin (PM) und Aminoguanidin (AG) zeigt. RNase (1 mg/ml) wurde mit 1,0 M Glucose (GLC) in Gegenwart und Abwesenheit der verschiedenen angegebenen Derivate in 0,4 M Natriurnphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 bei 37°C 6 Wochen inkubiert. Aliquots wurden mit ELISA unter Verwendung von R479-anti-AGE-Antikörpern untersucht. Die angegebene prozentuale Hemmung wurde aus ELISA-Messwerten in Gegenwart und Abwesenheit der Inhibitoren bei dem 6 Wochen-Zeitpunkt berechnet. Konzentrationen der Inhibitoren betrugen 0,5, 3, 15 und 50 mM.
Diskussion
Diese Ergebnisse zeigen, dass bestimmte Derivate von B1- und B6-Vitaminen fähig sind, eine "späte" AGE-Bildung zu hemmen. Einige dieser Vitamere hemmten erfolgreich die Endmengen von hergestelltem AGE im Gegensatz zu Aminoguanidin, was andeutet, dass sie mit Amadori- oder Post-Amadori-Vorläufern von Antigen-AGEs stärker wechselwirken. Die Amadori- und Post-Amadori-Zwischenprodukte stellen einen entscheidenden Verbindungspunkt dar, bei dem der "klassische" Weg der nicht-enzymatischen Glykierung im Wesentlichen irreversibel zu werden beginnt (30A). In früheren Hemmungsstudien wurde die "Glykierung" gewöhnlich entweder als gebildete Schiff Base (nach Reduktion mit markiertem Cyanoborhydrid) oder als gebildetes Amadori-Produkt (nach Säureausfällung unter Verwendung von markiertem Zucker) gemessen. Solche Tests ergeben keine Information über eine Hemmung von Post-Amadori-Umwandlungsschritten zu "späten" AGE-Produkten, da solche Schritte zu keiner Veränderung in der Menge eines markierten Zuckers führen, der an die Proteine gebunden ist. Andere "Glykie rungs"-Tests basierten auf der Zucker-induzierten Zunahme von nicht-spezifischer Proteinfluoreszenz, aber dies kann auch durch oxidative Dicarbonyl-Fragmente von einem freien Zucker wie Glykoaldehyd oder Glyoxal (Hunt et al., 1988, Biochem. 256: 205–212) unabhängig von einer Amadori-Produktbildung induziert werden.
Im Fall von Pyridoxal (PL) und Pyridoxalphosphat (PLP) belegen die Daten den einfachen Mechanismus einer Hemmung, der eine kompetitive Schiff-Base-Kondensation von diesen Aldehyden mit Proteinaminogruppen bei Glykierungsstellen beinhaltet. Aufgrund einer inneren Hemiactal-Bildung in Pyridoxal, aber nicht Pyridoxalphosphat, wird eine stärkere Hemmung einer Post-Amadori-AGE-Bildung durch PLP durch diesen kompetitiven Mechanismus erwartet. Dies wird in der Tat in den Daten beobachtet (1B, 1C, 38, 3C). Die Hemmung durch Pyridoxamin ist notwendigerweise unterschiedlich, da Pyridoxamin eine Aldehydgruppe fehlt. Jedoch ist Pyridoxamin ein Kanditat-Amin, das potentiell fähig ist, eine Schiff-Base-Bindung mit den Carbonylen von offenkettigen Zuckern, mit Dicarbonyl-Fragmenten, mit Amadori-Produkten oder mit Post-Amadori-Zwischenprodukten zu bilden. Der Mechanismus der Hemmung von B1-Verbindungen ist nicht offensichtlich. All diese Formen enthalten eine Amino-Funktionalität, so dass die beachtliche Effizienz von nur der Pyrophosphat-Form als wichtige Voraussetzung eine starke negative Ladung nahe legt.
Eine signifikante unerwartete Beobachtung ist diejenige, dass der Grad der Hemmung durch Aminoguanidin und einige der anderen Verbindungen wesentlich geringer bei späten Stufen der Reaktion als während der frühen Anfangsphase ist. Dies legt einen Wirkmechanismus nahe, der unterschiedlich zu dem von Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat ist, was vermuten lässt, dass das therapeutische Potential von diesen Verbindungen durch Co-Verabreichung mit Aminoguanidin erhöht werden wird.
Beispiel 2
Kinetiken einer nicht-enzymatischen Glykierung: Paradoxe Hemmung durch Ribose und leichte Isolierung eines Protein-Zwischenprodukts für eine schnelle Post-Amadori-AGE-Bildung
Während hohe Konzentrationen von Glucose verwendet werden, um die nichtenzymatische Glykierung von Proteinen zu verursachen, wurde paradoxerweise festgestellt, dass Ribose bei hohen Konzentrationen eine Post-Amadori-AGE-Bil dung bei der Ribonuklease dadurch hemmt, dass sie auf die Post-Amadori-"späten"-Stufen der Glykierungsreaktion einwirkt. Diese unerwartete hemmende Wirkung legt nahe, dass sich die "frühen" reaktiven Zwischenprodukte, wahrscheinlich Amadori-Produkte, mit einer geringen Bildung von "späten" Post-Amadori-AGE-Produkten (AGEs; Maillard-Produkte) anhäufen können. Eine Untersuchung dieses Phänomens zeigte: (1) die Fähigkeit, die Bedingungen für die kinetische Isolierung von (einem) Amadori (oder Post-Amadori)-glykierten Zwischenprodukten) zu definieren; (2) die Fähigkeit, die schnellen Kinetiken einer Bildung eines solchen Zwischenprodukts zu untersuchen; (3) die Fähigkeit, die überraschend schnellen Kinetiken einer Umwandlung solcher Zwischenprodukte zu AGE-Produkten in Abwesenheit eines freien oder reversibel gebundenen Zuckers zu untersuchen; (4) die Fähigkeit, diese Zwischenprodukte zu verwenden, um eine Hemmung von Post-Amadori-Schritten einer AGE-Bildung zu untersuchen und zu charakterisieren, wodurch somit ein neues System bereitgestellt wird, um den Mechanismus der Reaktion und die Wirksamkeit von potentiellen Mitteln, die eine AGE-Bildung blockieren könnten, zu untersuchen; und (5) mit diesem Wissen ist es auch ferner möglich, ^l3C-NMR zu verwenden, um die reaktiven Zwischenprodukte zu untersuchen und deren Umwandlung zu verschiedenen Kandidat-AGEs zu beobachten (Khalifah et al., 1996, Biochemistry 35(15): 4645–4654).
Chemikalien und Materialien Wie vorstehend in Beispiel 1.
Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen AGEs
Wie vorstehend in Beispiel 1.
ELISA-Detektion von AGE-Produkten Wie vorstehend in Beispiel 1.
Aminosäureanalyse Aminosäureanalysen erfolgten bei der Biotechnology Support Facility des Kansas University Medical Center. Analysen erfolgten nach Hydrolyse eines glykierten Proteins (reduziert mit Natriumcyanoborhydrid) mit 6 N HCl bei 110°C für 18–24 Stunden. Phenylisothiocyanat wurde für eine Derivatisierung verwendet und PTH-Derivate wurden durch Umkehrphasen-HPLC auf einem Applied Biosystems-Aminosäureanalysator (420A Derivatisator, 130A Trennsystem, 920A Datenanalysesystem) analysiert.
Pentosidin-Umkehrphasen-HPLC Analyse Eine Pentosidin-Herstellung bei RNase wurde durch HPLC quantifiziert (Sell & Monnier, 1989, J. Biol. Chem. 264: 21597–21602; Odetti et al., 1992, Diabetes 41: 153–159). Ribose-modifiziierte Proteinproben wurden in 6 N HCl 18 Stunden bei 100°C hydrolysiert und sodann in einer Speed Vac getrocknet. Die Proben wurden sodann wieder gelöst und Aliquots wurden in 0,1% Trifluoressigsäure aufgenommen und durch HPLC auf einem Shimadzu-System unter Verwendung einer Vydac C-18-Säule, die mit 0,1% TFA äquilibriert wurde, analysiert. Ein Gradient von 0-6% Acetonitril (0,1% in TFA) lief in 30 min bei einer Flussrate von etwa 1 ml/min. Pentosidin wurde durch Fluoreszenz bei 335 nm Anregung/ 385 nm Emission detektiert und seine Elutionszeit wurde durch Laufenlassen eines synthetisierten Standards bestimmt. Aufgrund der extrem kleinen erwarteten Mengen an Pentosidin (Grandhee & Monnier, 1991, J. Biol. Chem. 266: 11649–11653; Dyer et al., 1991, J Biol. Chem. 266: 11654– 11660) wurde kein Versuch unternommen, die absoluten Konzentrationen zu quantifizieren. Nur relative Konzentrationen wurden aus Peak-Flächen bestimmt.
Glykierungsmodifikationen Eine Modifizierung mit Ribose oder Glucose wurde im Allgemeinen bei 37°C in 0,4 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 und 0,02% Natriumazid durchgeführt. Die hohe Pufferkonzentration wurde immer mit 0,5 M Ribose-Modifikationen verwendet. Die Lösungen wurden in Röhrchen mit Deckeln gehalten und nur geöffnet, um zeitlich festgelegte Aliquots zu entnehmen, die sofort für ein späteres Durchführen der verschiedenen Analysen eingefroren wurden. "Unterbrochene Glykierung"-Experimente erfolgten dadurch, dass zuerst ein Protein mit der Ribose bei 37°C 8 oder 24 Stunden inkubiert wurde, gefolgt durch sofortige und ausgedehnte Dialyse gegen häufig ausgetauschten kalten Puffer bei 4°C. Die Proben wurden sodann dadurch wieder inkubiert, dass sie schnell auf 37°C ohne externe Ribose erwärmt wurden. Aliquots wurden bei verschiedenen Zeitintervallen für eine spätere Analyse entnommen und eingefroren. Aufgrund der niedrigen molekularen Masse von RNase wurden die Proteinkonzentrationen nach einer Dialyse wieder gemessen, selbst wenn eine Dialyseschlauch mit einer Begrenzung für niedriges Molekulargewicht verwendet wurde. Ein alternatives Verfahren wurde auch entworfen (siehe nachstehend), in dem eine Unterbrechung durch einfache 100-fache Verdünnung der Reaktionsgemische mit 0,5 M Ribose erreicht wurde. Proteinkonzentrationen wurden aus UV-Spektren abgeschätzt. Die Differenz der molaren Extinktion zwischen dem Peak (278 nm} und dem Tiefpunkt (250 nm) wurde für Bestimmungen der RNase-Konzentration verwendet, um die allgemeine Zunahme in der UV-Absorption, die eine Glykierung begleitet, zu kom pensieren. Zeitabhängige UV-Differenz-Spektraluntersuchungen erfolgten, um die Glykierungsbeiträge des UV-Spektrums zu charakterisieren.
Datenanalyse und numerische Simulationen der Kinetiken Kinetische Daten wurden routinemäßig an monoexponentielle oder biexponentielle Funktionen unter Verwendung von nicht-linearen Verfahren der kleinsten Fehlerquadrate angepasst. Die kinetischen Mechanismen der Schemata 5–6 (30F) wurden durch numerische Simulationen der Differenzialgleichungen der Reaktion untersucht. Sowohl Simulationen als auch eine Anpassung an die beobachteten kinetischen Daten erfolgte mit dem SCIENTIST 2.0 Softwarepaket (Micromath, Inc.). Eine Bestimmung der scheinbaren Halbwertszeiten (6B) aus einer Anpassung von kinetischen Daten an Exponentialfunktionen mit der Basis 2 (6A) erfolgte mit der "Lösungs"-Funktion der MathCAD 4.0 Software (MathSoft, Inc.).
ERGEBNISSE
Vergleich der Glykierung durch Glucose und Ribose
Die Reaktion von RNase A mit Ribose und Glucose wurde primäx mit einem ELISA-Test verfolgt, wobei R479-Kaninchen-AGE-spezifische Antikörper, die gegen Glucose modifiziertes BSA entwickelt würden, verwendet wurden. Zu einem niedrigeren Grad wurde die Herstellung von Pentosidin, dem einzig bekannten säurestabilen fluoreszierenden AGE, durch HPLC nach Säurehydrolyse quantifiziert. Vorläufige Untersuchungen unter Verwendung von 0,05 M Ribose bei 37°C zeigten, dass die Geschwindigkeit einer Bildung von Antigen-AGE scheinbar moderat erhöht wird (etwa 2–3-fach, wie durch die scheinbare Halbwertszeit bestimmt), wenn der pH-Wert von 5,0 auf 7,5 erhöht wird, wobei ein scheinbar kleiner Induktionszeitraum am Anfang der Kinetiken in allen Fällen auftritt. Die Glykierung von RNase mit 0,05 M Ribose bei einem pH-Wert von 7,5 (Halbwertszeit nahe 6,5 Tagen) scheint beinahe eine Größenordnung schneller zu sein als die der Glykierung mit 1,0 M Glucose (Halbwertszeit über 30 Tage; siehe 7B, durchgezogene Linie). Die letzteren Kinetiken zeigten auch einen kürzeren Induktionszeitraum, aber auch ein unvollständiges Einpendeln sogar nach 60 Tagen, wodurch es schwierig gemacht wurde, eine wahre Halbwertszeit zu bestimmen.
Wenn die Abhängigkeit der Kinetiken von der Ribosekonzentration bei einem pH-Wert von 7,5 untersucht wurde, wurde ein vollkommen unerwartetes Ergebnis erhalten. Die Geschwindigkeit der Reaktion erhöhte sich anfangs mit einer zunehmenden Ribosekonzentration, aber bei Konzentrationen oberhalb von 0,15 M pendelte sich die Geschwindigkeit der Reaktion ein und nahm sodann signifikant ab (6A). Eine Auftragung der Abhängigkeit der reziproken Halbwertszeit gegen die Ribosekonzentration (6B) zeigt, dass hohe Ribosekonzentrationen paradoxerweise eine Posi-Amadori-Antigen-AGE-Bildung hemmen. Es wurde festgestellt, dass dieser ungewöhnliche, aber einheitliche Effekt abhängig von Änderungen in der Konzentration entweder des Puffers (2-fach) oder der RNase (10-fach) ist und dass er nicht durch Affinitätsreinigung des R479-Antikörpers auf einer Säule von immobilisierter AGE-RNase verändert wurde. Er ist auch nicht auf Wirkungen der Ribose auf den ELISA-Test selbst zurückzuführen. Die gemessene Hemmwirkung durch Ribose auf eine Post-Amadori-AGE-Bildung ist wahrscheinlich nicht auf eine Ribose-Beeinflussung mit einer Antikörper-Erkennung der AGE-Antigen-Stellen auf einem Protein in dem ELISA-Test zurückzuführen. Vor dem ersten Kontakt mit dem anti-AGE-Primärantikörper auf den ELISP-Platten wurde das glykierte Protein über 1000-fach verdünnt, extensiv mit Tween-20 nach Adsorption gewaschen und mit einer 1%igen Kaseinbeschichtung blockiert, gefolgt von weiterem Waschen mit Tween-20.
Kinetiken einer Bildung von Post-Amadori-Antigen-AGEs durch "unterbrochene Glykierung"
Hinsichtlich des geringen beobachteten Induktionszeitraums wurde ein Versuch unternommen, zu bestimmen, ob es eine gewisse Anhäufung während der Reaktion eines frühen Vorläufers wie eines Amadori-Zwischenprodukts gab, der fähig ist, die ELISA-detektierbaren Post-Amadori-Antigen-AGEs herzustellen. RNase wurde bei einem pH-Wert von 7,5 und 37°C mit einer hohen Ribosekonzentration von 0,5 M glykiert und die Reaktion wurde nach 24 Stunden durch sofortiges Abkühlen auf 4°C und Dialyse gegen häufig ausgetauschten kalten Puffer über einen Zeitraum von 24 Stunden unterbrochen, um freie und reversibel gebundene (Schiff-Base) Ribose zu entfernen, Eine solche Ribose-freie Probe wurde sodann schnell auf 37°C ohne einen erneuten Zusatz von Ribose erwärmt und Stichproben wurden für eine Post-Amadori-AGE-Bildung über mehrere Tage genommen. Die AGE-Antigen-Herstellung dieser 24 Stunden "unterbrochenen Glykierungs"-Probe ist durch die gestrichelte Linie und offene Dreiecke in 7A gezeigt, wobei die in der kalten Dialyse verbrachte Zeit nicht eingeschlossen ist. Eine nicht-unterbrochene Kontrolle (durchgezogene Linie und ausgefüllte Kreise) ist zum Vergleich ebenfalls gezeigt. Dramatisch unterschiedliche Kinetiken einer Post-Amadori-Antigen-AGE-Bildung sind in den zwei Proben offensichtlich. Die Kinetiken einer AGE-Antigen-Herstellung der Ribose-freien unterbrochenen Probe zeigen nun (1) monoexponentielle Kinetiken ohne einen Induktionszeitraum, (2) eine stark erhöhte Geschwindigkeit einer Antigen-AGE-Bildung mit beachtlichen Halbwertszeiten in der Größenordnung von 10 Stunden und (3) eine Herstellung von Mengen von Antigen, vergleichbar zu denen, die bei langen Inkubationen in der fortgesetzten Gegenwart von Ribose zu sehen sind (siehe 6A). Gleichsam signifikant zeigen die Daten auch, dass vernachlässigbares AGE-Antigen während des kalten Dialyse-Zeitraums gebildet wurde, wie durch die kleine Differenz zwischen dem unausgefüllten Dreieck und den gefüllten Kreispunkten am Zeitpunkt 1 Tag in 7A gezeigt. Sehr wenig, falls überhaupt, an AGE wurde durch das "Unterbrechungs"-Verfahren selbst gebildet. Diese Beobachtungen zeigen, dass ein vollständig kompetentes isolierbares Zwischenprodukt oder ein Vorläufer zum Antigen-AGE während des 24-stündigen Kontakts mit Ribose vor dem Entfernen des freien und reversibel gebundenen Zuckers gebildet wurde.
Proben, die nach nur 8 Stunden unterbrochen wurden, ergaben eine Endmenge an AGE-Antigen, die etwa 72% der nach 24 Stunden unterbrochenen Probe betrug. Proben von RNase, die mit nur 0,05 M Ribose glykiert wurden und bei 8 Stunden durch kalte Dialyse und Reinkubation bei 37°C unterbrochen wurden, zeigten weniger als 5% Herstellung eines ELISA-reaktiven Antigens nach 9 Tagen. Eine Unterbrechung bei 24 Stunden ergab jedoch einen schnellen Anstieg eines ELISA-Antigens (ähnlich zu 7A) auf eine Menge von etwa 50% derjenigen, die in der nicht-unterbrochenen Gegenwart von 0,05 M Ribose erzeugt wurde.
Die gleichen allgemeinen Unterbrechungswirkungen wurden auch mit anderen Proteinen (BSA und Hämoglobin) beobachtet. Ausgenommen eines gewissen unterschiedlichen absoluten Werts der Geschwindigkeitskonstanten und der Menge von Antigen-AGEs, die während der 24-ständigen 0,5 M Ribose-Inkubation gebildet wurden, wurde die gleiche dramatische Zunahme in der Geschwindigkeit einer AGE-Antigen-Bildung nach Entfernung der 0,5 M Ribose beobachtet.
Eine Glykierung ist mit Glucose sehr viel langsamer als mit Ribose (vgl. die Differenz in den Zeitskalen zwischen 7A und 7B). Jedoch ergab, unterschiedlich zu dem Fall mit Ribose, eine Unterbrechung nach 3 Tagen der Glykie rung durch 1,0 M Glucose einen vernachlässigbaren Aufbau eines Vorläufers von ELISA-reaktiven AGE-Antigenen (7B, gestrichelte Kurve).
Kinetiken einer Pentosidin-Bildung
Die Proben, die einem ELISA-Untersuchen unterworfen wurden, wurden auch auf die Herstellung von Pentosidin, einem säurestabilen AGE, untersucht. Der Gehalt an Pentosidin wurde für die gleichen RNase-Proben gemessen, die auf eine Antikörperreaktivität durch ELISA analysiert wurden. Eine Glykierung durch Ribose in 0,4 M Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,5 ergab Pentosidin bei RNase A, das durch Fluoreszenz nach Säurehydrolyse quantifiziert wurde. 8A zeigt, dass unter nicht-unterbrochenen Bedingungen 0,05 M Ribose eine fortschreitende Zunahme an Pentosidin ergibt. Wenn jedoch eine Glykierung unter "unterbrochenen" Bedingungen unter Verwendung von 0,5 M Ribose erfolgt, wird ein dramatischer Anstieg in der Geschwindigkeit einer Pentosidin-Bildung sofort nach Entfernen von überschüssiger Ribose beobachtet (8B), der ähnlich zu der, aber etwas schneller als die Kinetiken des Auftretens von Antigen-AGEs ist (7A). Eine größere Menge an Pentosidin wurde auch mit einer 24 Standen-Unterbrechung, verglichen mit 8 Stunden, hergestellt. Reproduzierbare Unterschiede zwischen den Kinetiken einer Bildung von Pentosidin und Antigen-AGEs können auch beobachtet werden. Eine signifikante Menge an Pentosidin wird während der 24-stündigen Inkubation und auch während der kalten Dialyse gebildet, wodurch sich ein Sprung der gestrichelten vertikalen Linie in 8B ergibt. Unsere Beobachtungen zeigen somit, dass sich ein Pentosidin-Vorläufer während einer Ribose-Glykierung anhäuft, der schnell Pentosidin nach einer Ribose-Entfernung herstellen kann (vgl. Odetti et al., 1992, Diabetes 41: 153–159).
Aufbaugeschwindigkeit von dem/den reaktiven Zwischenprodukten)
Die vorstehend beschriebenen "unterbrochenen Glykierungs"-Experimente zeigen, dass ein Vorläufer oder Vorläufer zu sowohl Post-Amadori-Antigen-AGEs als auch Pentosidin sich während einer Glykierung mit Ribose anhäufen kann/können. Die Kinetiken einer Bildung dieses Zwischenprodukts können unabhängig durch eine Vielzahl von den vorstehend beschriebenen Experimenten verfolgt und quantifiziert werden. Die Menge des bei RNase bei verschiedenen Kontaktzeiten mit Ribose erzeugten Zwischenprodukts kann durch das maximale Ausmaß untersucht werden, zu dem es ein Antigen-RGE nach Unterbrechung erzeugen kann. Bei ver schiedenen Zeitpunkten nach Initiierung einer Glykierung wird die freie und reversibel gebundene Ribose durch Dialyse in der Kälte oder durch schnelle Verdünnung (siehe nachstehend) entfernt. Es wird sodann ein genügender Zeitraum (5 Tage, die mehreren Halbwertszeiten gemäß 7A entsprechen) nach Erwärmen auf 37°C für eine maximale Entwicklung von Post-Amadori-Antigen-AGEs verstreichen gelassen. Die ELISA-Messwerte 5 Tage nach jedem Unterbrechungspunkt, die einer maximalen AGE-Entwicklung entsprechen, würden sodann zu der Zwischenproduktkonzentration, die bei dem Zeitpunkt der Unterbrechung vorhanden ist, proportional sein.
9 zeigt ein Experiment, wobei die Kinetiken des Zwischenproduktaufbaus für RNase A in Gegenwart von 0,5 M Ribose (ausgefüllte Symbole und Kurve) gemessen sind. Zum Vergleich ist die Menge von AGE, die vor einer Ribose-Entfernung bei jedem Unterbrechungszeitpunkt vorhanden ist, aufgezeigt (unausgefüllte Symbole und gestrichelte Linien). Wie erwartet (vgl. 7A), wird wenig AGE vor einer Entfernung (oder Verdünnung) von Ribose gebildet, so dass die ELISA-Messwerte nach den 5-tägigen zweiten Inkubationszeiträumen hauptsächlich ein Maß für nach einer Ribose-Entfernung gebildetes AGE sind. Die Ergebnisse in 9 zeigen, dass die Aufbaugeschwindigkeit von Zwischenprodukt in 0,5 M Ribose exponentiell und sehr schnell verläuft, mit einer Halbwertszeit von etwa 3,3 Stunden. Dies ist etwa dreimal schneller als die beobachtete Umwandlungsgeschwindigkeit des Zwischenprodukts zu Antigen-AGEs nach einer Unterbrechung (unausgefüllte Symbole und gestrichelte Kurve in 7A).
In diesen Experimenten wurde die Entfernung von Ribose bei jedem Unterbrechungszeitpunkt durch eine 100-fache Verdünnung und nicht durch Dialyse erreicht. Ein einfache Verdünnung verringerte die Konzentration von Ribose von 0,05 M auf 0,005 M. Es wurde unabhängig bestimmt (6A), dass wenig AGE in diesem Zeitraum mit den restlichen 5 mM Ribose erzeugt wird. Dieser Verdünnungsansatz wurde primär durch die Notwendigkeit für eine quantitative Punktzu-Punkt-Genauigkeit diktiert. Eine solche Genauigkeit wäre nicht durch das Dialyseverfahren erreicht worden, das unabhängig für jede Probe bei jedem Unterbrechungszeitpunkt erfolgen würde. Unsere Ergebnisse zeigen, dass eine Verdünnung äquivalent zu einer Dialyse war.
Ein getrenntes Kontrollexperiment (siehe 10 nachstehend) zeigte, dass die beispielhafte 100-fache Verdünnung nahezu identische Ergebnisse zu dem Dialy severfahren ergab. Diese Kontrollexperimente zeigen, dass das reversible Ribose-Proteinbindungs (Schiff-Base)-Gleichgewicht auf dieser Zeitskala ziemlich schnell ist. Dies stimmt mit Daten von Bunn und Higgins (1981, Science 213: 222–224) überein, die zeigen, dass die Halbwertszeit einer Schiff-Base-Bildung mit 0,5 M Ribose in der Größenordnung von wenigen Minute sein sollte. Dieses 100-fache schnelle Verdünnungsverfahren, um Ribose zu reduzieren, ist ein geeignetes Verfahren, bei dem eine quantitative Genauigkeit essentiell ist und nicht durch vielfache Dialyse von vielen Proben erreicht werden kann.
Direkte Hemmung einer Post Amadori AGE-Bildung aus dem Zwischenprodukt durch Ribose und Glucose
Die Geschwindigkeitszunahme einer AGE-Bildung nach Unterbrechung und Zuckerverdünnung legt nahe, aber beweist es nicht, dass hohe Konzentrationen von Ribose die Reaktion bei oder nach dem ersten "stabilen" Zwischenprodukt, wahrscheinlich dem Amadori-Derivat (in 30A eingerahmt), hemmen. Ein Test hierfür wurde sodann dadurch durchgeführt, dass die Wirkung von direkt zugesetzter Ribose auf die Post-Amadori-Reaktion untersucht wurde. RNase wurde zunächst 24 Stunden in 0,5 M Ribose inkubiert, um das Zwischenprodukt herzustellen. Zwei Protokolle wurden sodann durchgeführt, um eine mögliche Hemmung der Post-Amadori-Bildung von Antigen-AGEs durch verschiedene Konzentrationen von Ribose zu messen. In dem ersten Experiment wurde die 24 Stunden-ribosilierte Probe einfach 100-fach in Lösungen verdünnt, die variierende Endkonzentrationen von Ribose von 0,005 M bis 0,505 M enthielten (10A). Es ist klar zu sehen, dass die Geschwindigkeit und das Ausmaß einer AGE-Bildung durch zunehmende Ribosekonzentrationen vermindert werden. Signifikanterweise scheinen bis zu der höchsten Konzentration von 0,5 M Ribose die Kinetiken exponentiell zu sein und keinen Induktionszeitraum zu zeigen, der mit einer nichtunterbrochenen Glykierung (6A und 7A) bei hohen Ribosekonzentrationen auftritt.
Ein zweites Experiment (10B) erfolgte, indem die 24 Stunden-unterbrochene Probe extensiv in der Kälte dialysiert wurde, um freie und reversibel gebundene Ribose als auch jegliche hemmende Produkte zu entfernen, die während der 24-stündigen Inkubation mit Ribose sich gebildet haben könnten. Danach wurden Aliquots 100-fach in variierende Konzentrationen einer frisch hergestellten Ribose verdünnt und die Bildung von Antigen-AGE-Produkten wurde wie vorstehend aufgezeichnet. Die Ergebnisse waren nahezu identisch zu dem Experiment von Figur 10A, wo der Dialyseschritt weggelassen wurde. In beiden Fällen waren die Geschwindigkeit und das Ausmaß einer AGE-Bildung durch zunehmende Konzentrationen an Ribose vermindert und die Kinetiken schienen exponentiell ohne einen Induktionszeitraum zu sein.
Die Frage, ob Glucose oder andere Zucker auch die Bildung von AGEs aus dem reaktiven Zwischenprodukt, das durch unterbrochene Glykierung in 0,5 M Ribose erhalten wurde, hemmen können, wurde auch untersucht. Die Wirkungen von Glucose bei Konzentrationen von 1,0–2,0 M wurden getestet (Daten nicht gezeigt). Glucose wies eindeutig keine derartige Hemmung wie Ribose auf. Wenn die 24 Stunden-Ribose-unterbrochene Probe 100-fach in diese Glucoselösungen verdünnt wurde, wurde die Menge von gebildetem Antigen-AGE um eiwa 30% vermindert, aber es gab eine geringe Abnahme in der scheinbaren Geschwindigkeitskonstante. Wiederum schienen die Kinetiken exponentiell zu sein.
Wirkung des pH-Werts auf Post Amadori-Kinetiken einer AGE-Bildung
Das unterbrochene Glykierungs-Verfahren wurde verwendet, um die pH-Abhängigkeit der Post-Amadori-Kinetiken einer AGE-Bildung aus dem reaktiven Zwischenprodukt zu untersuchen. In diesen Experimenten wurde RNase A zunächst 24 Stunden mit 0,5 M Ribose bei einem pH-Wert von 7,5 umgesetzt, um das reaktive Zwischenprodukt zu bilden. Die Kinetiken des Abbaus des Zwischenprodukts zu AGEs wurden sodann durch ELISA gemessen. 11 zeigt, dass ein extrem weiter pH-Bereich von 5,0 bis 9,5 erreichbar war, wenn die Kinetiken durch Anfangsgeschwindigkeiten gemessen wurden. Eine beachtliche glockenförmige Abhängigkeit wurde beobachtet, die zeigt, dass die Kinetiken einer Bildung von Antigen-AGEs sowohl bei sauren als auch bei alkalischen pH-Bereichen abnehmen, mit einem Optimum nahe einem pH-Wert von B.
Ein einziges "pH-Sprung"-Experiment erfolgte auch mit der vorstehend untersuchten pH 5,0-Probe, die die niedrigste Geschwindigkeit einer Antigen-AGE-Bildung aufwies. Nach 12 Tagen bei 37°C in einem pH 5,0-Puffer wurde der pH-Wert schnell auf 7,5 eingestellt und eine Antigen-AGE-Bildung wurde durch ELISA aufgezeichnet. Innerhalb eines experimentellen Fehlers zeigte die Probe identische Kinetiken (gleiche Geschwindigkeitskonstante erster Ordnung) einer AGE-Bildung zu dem unterbrochenen Glykierungsproben, die direkt bei einem pH-Wert von 7,5 untersucht wurden (12). In diesem Experiment konnten die relativen Mengen an Antigen-AGE nicht direkt auf der gleichen ELISA-Platte verglichen werden, aber die Probe mit pH-Sprung schien wesentlich, aber in gewisser Weise verringerte Mengen an Antigen-AGEs gebildet zu haben. Diese Ergebnisse zeigen, dass ein Zwischenprodukt frei von AGE hergestellt werden und bei einem pH-Wert von 5 für spätere Untersuchungen einer Umwandlung zu AGEs gelagert werden kann.
Hemmung einer Post-Amadori AGE-Bildung durch Aminoguanidin
Die Wirksamkeit von Aminoguanidin wurde durch dieses unterbrochene Glykierungsverfahren untersucht, d. h. durch Testen seiner Wirkung auf eine Post-Amadori-Bildung von Antigen-AGEs nach Entfernung von überschüssiger und reversibel gebundener Ribose. 20A zeigt, dass Aminoguanidin moderate Wirkungen auf ein Blockieren der Bildung von Antigen-AGEs bei RNase unter diesen Bedingungen aufweist, mit einer geringen Hemmung unterhalb von 50 mM. Etwa 50% Hemmung wird nur bei oder oberhalb von 100–250 mM erreicht. Man bemerke wieder, dass in diesen Experimenten das Protein Aminoguanidin nur nach Unterbrechung und Entfernung von freier und reversibel gebundener Ribose ausgesetzt war. Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit der unterbrochenen Glykierung von BSA erhalten (20B).
Aminosäureanalyse von unterbrochenen Glykierungsproben
Eine Aminosäureanalyse erfolgte für RNase nach 24-stündigem Kontakt mit 0,5 M Ribose (nicht dialysiert) nach extensiver Dialyse der 24 Stunden-glykierten Probe und nach 5 Tagen Inkubation der letzteren Probe bei 37°C. Diese Bestimmungen wurden nach Reduktion mit Natriumcyanoborhydrid durchgeführt, das Schiff-Basen, die an Lysinen oder der terminalen Aminogruppe vorhanden sind, reduziert. Alle drei Proben, normalisiert auf Alanin (12 Reste), zeigten den gleichen Restgehalt an Lysin (4,0 ± 0,5 aus den ursprünglichen 10 in RNase). Dies zeigt, dass nach einem 24-ständigen Kontakt mit 0,5 M Ribose die meisten der gebildeten Schiff-Base-Addukte zu Amadori- oder nachfolgenden Produkten umgewandelt wurden. Keine Arginin- oder Histidinreste wurden durch eine Modifikation verloren.
Diskussion
Die Verwendung von schnell reagierender Ribose und die Feststellung seiner reversiblen Hemmung von Post-Amadori-Schritten erlaubten die Analyse und Bestim mung der Kinetiken von verschiedenen Schritten einer Protein-Glykierung bei RNase. Die meisten vorhergehenden kinetischen Studien einer Protein-"Glykierung" waren tatsächlich auf die "frühen" Schritte einer Schiff-Base-Bildung und einer anschließenden Amadori-Umlagerung begrenzt. Einige kinetische Studien erfolgten ausgehend von synthetisierten Fructosylaminen, d. h. kleinen Modell-Amadori-Verbindungen von Glucose (Smith und Thornalley, 1992, Eur. J. Biochem. 210: 729–739, und darin zitierte Referenzen), aber solche Studien waren bisher mit wenigen Ausnahmen nicht mit Proteinen möglich. Eine bemerkenswerte Ausnahme ist die Darstellung durch Monnier (Odetti et al., 1992, supra), dass partiell mit Ribose glykosyliertes BSA schnell Pentosidin nach einer Ribose-Entfernung ergeben kann. Die größere Reaktivität von Ribose war erwiesenermaßen ein eindeutiger Vorteil beim quantitativen Definieren des Zeitverlaufs einer AGE-Bildung. Es wird bemerkt, dass Glucose und Ribose beide fähig sind, ähnliche AGE-Produkte, wie Pentosidin (Grandhee & Monnier, 1991, supra; Dyer et al., 1991, supra) zu erzeugen, und gewisse Arbeit mit 13C-NMR-Modell-Verbindungen wurde mit ADP-Ribose durchgeführt (Cervantes-Laurean et al., 1993, Biochemistry 32: 1528–1534). Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Antigen-AGE-Produkte von Ribose mit anti-AGE-Antikörpern, die gegen Glucose-modifizierte Proteine gerichtet sind, vollständig kreuzreagieren, was nahe legt, dass Ribose und Glucose ähnliche Antigen-AGEs erzeugen. Die primären kinetischen , Unterschiede, die zwischen diesen zwei Zuckern beobachtet werden, sind wahrscheinlich auf die relativen Unterschiede in den Geschwindigkeitskonstanten der Schritte, die zu einer Post-Amadori-AGE-Bildung führen, als auf den Mechanismus zurückzuführen.
Die vorgestellten Ergebnisse zeigen eine ausgeprägte und paradoxe Hemmung einer Gesamt-AGE-Bildung durch hohe Konzentrationen von Ribose (6), die nicht durch frühere Studien vorweggenommen wurde. Diese Hemmung ist schnell reversibel in der Weise, dass sie durch Dialyse des anfänglich modifizierten Proteins (7A) oder durch einfache 100-fache Verdünnung (wie in 11 verwendet) ausbleibt. Die Experimente von 10 zeigen, dass sie nicht auf die Anhäufung von dialysierbaren hemmenden Zwischenprodukten während der anfänglichen Glykierung zurückzuführen ist, da eine Dialyse eines 24 Stundenmodifizierten Proteins, gefolgt von einer Zugabe von verschiedenen Konzentrationen von frischer Ribose, die gleiche Hemmung induziert. Die Daten von 10A, B zeigen, dass die Hemmung durch eine reversible und schnelle Wechselwirkung von Ribose mit einem Proteinzwischenprodukt auftritt, das reaktive Amadori-Produkte enthält. Es ist unwahrscheinlich, dass die Hemmung in den frühen Schritt einer Bildung eines Amadori-Produkts eingreift, aufgrund der schnellen Geschwindigkeit einer Bildung des vermuteten Amadori-Zwischenprodukts, das in dem Experiment von 9 bestimmt wurde. Die Identifizierung des reaktiven Zwischenprodukts als ein Amadori-Produkt ist gut durch die erfolgte Aminosäureanalyse (nach Natriumcyanoborhydrid-Reduktion) vor und nach Dialyse bei dem 24 Stunden-Unterbrechungspunkt belegt. Der unveränderte Gehalt an Lysinresten zeigt, dass jegliche verdrängbare Schiff-Base bereits bei dem 24 Stunden-Zeitpunkt irreversibel umgewandelt wurde (wahrscheinlich durch Amadori-Umlagerung).
Die sekundäre Ribose-Unterdrückung von "späten", aber nicht "frühen" Glykierungsschritten fördert signifikant die Anhäufung eines vollständig kompetenten reaktiven Amadori-Zwischenprodukts, das wenig AGE enthält. Seine Isolierung durch das Unterbrechungsverfahren ist für kinetische und strukturelle Studien wichtig, da es einem erlaubt, Studien in Abwesenheit von freiem oder Schiff-Basegebundenem Zucker und deren begleitende Reaktionen und Komplikationen durchzuführen. Zum Beispiel wurden die Post-Amadori-Umwandlungsgeschwindigkeiten zu Antigen-AGE- und Pentosidin-AGE-Produkten gemessen (7A, unausgefüllte Symbole, und 8B) und es wurde gezeigt, dass sie sehr viel schneller sind (t ½ ~ 10 h) als sich in den Gesamtkinetiken unter nichtunterbrochenen Bedingungen widerspiegelt (6A und 8A). Die schnelle Bildung von Pentosidin, die gemessen wurde, scheint mit einem früheren unterbrochenen Ribose-Experiment auf BSA durch Odetti et al. (1992, supra) übereinzustimmen. Da Ribose und Derivate wie ADP-Ribose normale Metaboliten sind, legen die hier beobachteten sehr hohen Geschwindigkeiten einer AGE-Bildung nahe, dass sie ernsthafter als Quellen einer potentiellen Glykierung in verschiedenen zellulären Kompartimenten betrachtet werden sollten (Cervantes-Laurean et al., 1993, supra), selbst wenn deren Konzentrationen deutlich unterhalb derjenigen der weniger reaktiven Glucose liegen.
Eine weitere neue Anwendung der Isolierung eines Zwischenprodukts besteht im Untersuchen der pH-Abhängigkeit dieser komplexen Reaktion. Das ungewöhnliche glockenförmige pH-Profil, das für die Post-Amadori-AGE-Bildung (11) beobachtet wurde, steht im bemerkenswerten Gegensatz zu der milden pH-Abhängigkeit der Gesamtreaktion. Die letzteren Kinetiken spiegeln eine zusammengesetzte Wirkung des pH-Werts auf alle Schritte in der Reaktion wider, einschließlich Schiff-Base- und Amadori-Produktbildung, die jeweils eine einzigartige pH-Abhängigkeit aufweisen können. Diese Komplexizität ist insbesondere gut durch Untersuchun gen einer Hämoglobin-Glykierung gezeigt (Lowery et al., 1985, J. Biol. Chem. 260: 11611–11618). Das glockenförmige pH-Profil legt die Beteiligung von zwei ionisierenden Gruppen nahe, aber beweist sie nicht. Falls zutreffend, können die Daten die Beteiligung einer zweiten Aminogruppe, wie von einem benachbarten Lysin, bei der Bildung von dominanten Antigen-AGEs nahe legen. Das beobachtete pH-Profil und die beschriebenen pH-Sprung-Beobachtungen legen nahe, dass ein geeigneter Weg zum Isolieren und Beibehalten des reaktiven Zwischenprodukts darin bestehen könnte, dass der pH-Wert schnell auf nahe 5,0 nach 24 Stunden-Unterbrechung abgesenkt wird.
Die kinetischen Studien stellen neue Einblicke in die Mechanismen der Wirkung von Aminoguanidin (Guanylhydrazin) bereit, einem AGE-Inhibitor, der von Cerami und Mitarbeitern zum Mischen mit Amadori-Zwischenprodukten vorgeschlagen wurde (Brownlee et al., 1986, supra). Dieses vorgeschlagene pharmakologische Mittel ist nun in Phase III von klinischen Studien für mögliche therapeutische Wirkungen beim Behandeln von Diabetes (Vlassara et al., 1994, supra). Jedoch ist sein Mechanismus einer AGE-Hemmung wahrscheinlich ziemlich komplex, da er multifunktional ist. Als ein nukleophiles Hydrazin kann es reversibel an aktive Carbonyle, einschließlich Aldehyd-Carbonyle von offenkettiger Glucose und Ribose (Khatami et al., 1988, Life Sci. 43: 1725–1731; Hirsch et al., 1995, Carbohyd. Res. 267: 17–25), als auch an Keto-Carbonyle von Amadori-Verbindungen binden. Es ist auch eine Guanidiniumverbindung, die hochgradig reaktive Dicarbonyl-Glykierungszwischenprodukte wie Glyoxal und Glucosone beseitigen kann (Chen & Cerami, 1993, J. Carbohyd. Chem. 12: 731–742; Hirsch et al., 1992, Carbohyd. Res. 232: 125–130; Ou % Wolff, 1993, Biochem. Pharmacol. 46: 1139–1144). Das unterbrochene Glykierungsverfahren erlaubte eine Untersuchung einer Aminoguanidin-Wirksamkeit auf nur die Post-Amadori-Schritte einer AGE-Bildung. Genauso wichtig erlaubte sie Studien in Abwesenheit von freiem Zucker oder Dicarbonyl-reaktiven Fragmenten von freiem Zucker (Wolff % Dean, 1987, Biochem. J 245: 243–250; Wells-Knecht et al., 1995, Biochemistry 34: 3702–3709), die sich mit Aminoguanidin zusammenfügen können. Die Ergebnisse von 20 zeigen, dass Aminoguanidin bestenfalls nur eine moderate Wirkung auf Post-Amadori-AGE-Bildungsreaktionen aufweist, wodurch 50% Hemmung bei Konzentrationen oberhalb von 100–250 mM erreicht werden. Die Wirksamkeit von Aminoguanidin stammt somit vorherrschend entweder aus einem Hemmen von frühen Schritten einer Glykierung (Schiff-Base-Bildung) oder vom Abfangen hochgradig reaktiver Dicarbonyle, die während einer Glykierung gebildet werden. Entgegen den ursprünglichen Behauptungen scheint es nicht eine AGE-Bildung durch Komplexieren des Amadori-Zwischenprodukts zu hemmen.
Die Verwendung von unterbrochener Glykierung ist nicht auf kinetische Studien begrenzt. Eine unterbrochene Glykierung kann strukturelle Studien von glykierten Proteinen und ein Identifizieren von unbekannten AGEs unter Verwendung von Techniken wie ¹³C-NMR vereinfachen, das verwendet wurde, um Amadori-Addukte von RNase zu detektieren (Neglia et al., 1983, J Biol. Chem. 258: 14279–14283; 1985, J. Biol. Chem. 260: 5406–5410). Die kombinierte Verwendung von strukturellen und kinetischen Ansätzen sollte auch von besonderem Interesse sein. Zum Beispiel sollten, obwohl die Identität der dominanten Antigen-AGEs, die mit den polyklonalen Antikörpern reagieren, ungewiss verbleibt, Kandidaten-AGEs, wie das kürzlich vorgeschlagene (Carboxymethyl)lysin (Reddy et al., 1995, Biochemistry 34: 10872–10878; vgl. Makita et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5133–5138) die gleichen Kinetiken einer Bildung aus dem reaktiven Zwischenprodukt zeigen, die wir beobachtet haben. Die Verfügbarkeit des unterbrochenen Kinetiken-Ansatzes wird auch helfen, die Wichtigkeit des Amadori-Wegs zu der Bildung dieses AGE zu bestimmen. In ähnlicher Weise sollte ein Aufzeichnen der unterbrochenen Glykierungsreaktion durch Techniken wie 13C-NMR Resonanzen von anderen Kandidat-Antigen-AGEs als diejenigen identifizieren, die ähnliche Erscheinungskinetiken zeigen. Tabelle I führt die ¹³C-NMR-Peaks des Amadori-Zwischenprodukts von RNase auf, das durch Reaktion mit C-2 angereicherter Ribose hergestellt wurde. Der Tieffeld-Peak nahe 205 ppm ist wahrscheinlich auf das Carbonyl des Amadori-Produkts zurückzuführen. In allen Fällen wird die Fähigkeit, einen Überschuss an freien und Schiff-Base-Zuckern durch unterbrochene Glykierung zu entfernen, eine Isolierung, Identifizierung und strukturelle Charakterisierung beachtlich vereinfachen.
Tabelle I führt die Peaks auf, die dem Post-Amadori-Zwischenprodukt aufgrund ihrer unveränderten oder mit der Zeit abnehmenden Intensität zugewiesen wurden. Die Peak-Positionen sind in ppm im Tieffeld von TMS aufgeführt. Tabelle d 125 MHz C-13-NMR-Resonanzen eines Ribonuklease-Amadori-Zwischenprodukts, hergestellt durch 24-stündige Reaktion mit 99% [2-C13]Ribose

216,5 ppm 108,5 ppm

211,7 105,9

208 103,9

103

172 95,8

165

163,9 73,65

162,1 70,2

69,7
Ribonuklease A wurde 24 Stunden mit 0,5 M Ribose, 99% angereichert bei C-2, umgesetzt, gefolgt von einer Entfernung von überschüssiger und Schiff-Basegebundener Ribose durch extensive Dialyse in der Kälte. Die Probe wurde sodann erneut auf 37°C unmittelbar vor einem 2 Stunden-NMR-Scan erwärmt. Die Signale von RNase, die mit natürlichen Mengen an Ribose unter identischen Bedingungen umgesetzt worden war, wurden sodann von dem NMR-Spektrum subtrahiert. Folglich sind alle gezeigten Peaks auf angereichertes C-13, das ursprünglich an der C-2-Position lag, gezeigt. Einige der Peaks stammen von Abbauprodukten des Zwischenprodukts und diese können durch die Zunahme in der Peak-Intensität mit der Zeit identifiziert werden. 31 zeigt das erhaltene NMR-Spektrum.
Beispiel 3
In vitro-Hemmung der Bildung von Antigen-Endprodukten der fortgeschrittenen Glykierung (AGEs) durch Derivate von B1- und B6-Vitaminen und Aminoguanidin. Eine Hemmung von Post-Amadori-Kinetiken unterscheidet sich von der der Gesamt-Glykierung
Das unterbrochene Glykierungsverfahren zum Verfolgen von Post-Amadori-Kinetiken einer AGE-Bildung erlaubt die schnelle quantitative Untersuchung von "späten" Stufen der Glykierungsreaktion. Es ist wichtig, dass dieses Verfahren Hemmungsuntersuchungen erlaubt, die frei von Reaktionswegen einer AGE-Bildung sind, die aus glykoxidativen Produkten eines freien Zuckers oder einer Schiff-Base (Namiki-Reaktionsweg), wie in 30A dargestellt, stammen. Folglich erlaubt das unterbrochene Glykierungsverfahren eine rasche und einzigartige Identifizierung und Charakterisierung von Inhibitoren von "späten" Stufen einer Glykierung, die zu einer Antigen-AGE-Bildung führen.
Unter den untersuchten Vitamin-B 1- und B6-Derivaten sind Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat einzigartige Inhibitoren des Post-Amadori-Reaktionswegs einer AGE-Bildung. Es wurde wichtigerweise festgestellt, dass eine Wirksamkeit einer Hemmung einer Gesamt-Glykierung eines Proteins in Gegenwart von hohen Zuckerkonzentrationen nicht prognostisch für die Fähigkeit ist, die Post-Amadori-Schritte einer AGE-Bildung, bei denen freier Zucker entfernt wird, zu hemmen. Folglich, während Pyridoxamin, Thiaminpyrophosphat und Aminoguanidin potente Inhibitoren einer AGE-Bildung in der Gesamt-Glykierung eines Proteins durch Glucose sind, unterscheidet sich Aminoguanidin von den anderen zweien dadurch, dass es kein wirksamer Inhibitor einer Post-Amadori-AGE-Bildung ist. Aminoguanidin verlangsamt beachtlich die Anfangsgeschwindigkeit einer AGE-Bildung g durch Ribose unter nicht-unterbrochenen Bedingungen, weist aber keine Wirksamkeit auf die Endmengen von hergestellten Antigen-AGEs auf. Eine Untersuchung von verschiedenen Proteinen (RNase, BSA und Hämoglobin) bestätigte, dass die Hemmungsergebnisse im Allgemeinen nicht spezifisch für das verwendete Protein sind, selbst wenn es individuelle Variationen bei den Geschwindigkeiten einer AGE-Bildung und -Hemmung gibt.
Chemikalien und Materialien Wie vorstehend in Beispiel 1.
Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen AGEs
Wie vorstehend in Beispiel 1.
ELISA-Detektion von AGE-Produkten Wie vorstehend in Beispiel 1.
Nicht-unterbrochene Ribose-Glykierungs-Tests Rinder-Serumalbumin, Ribonuklease A und humanes Hämoglobin wurden mit Ribose bei 37°C in 0,4 M Natriumphosphat-Puffer mit einem pH-Wert von 7,5 und 0,02% Natriumazid inkubiert. Das Protein (10 mg/ml oder 1 mg/ml), 0,05 M Ribose und voraussichtliche Inhibitoren (bei 0,5, 3, 15 und 50 mM) wurden gleichzeitig in das Inkubationsgemisch eingebracht. Lösungen wurden im Dunkeln in Röhrchen mit Deckeln gehalten. Aliquots wurden entnommen und sofort eingefroren, bis sie durch ELISA beim Abschluss der Reaktion analysiert wurden. Die Inkubationen betrugen 3 Wochen (Hb) oder 6 Wochen (RNase, BSA). Glykierungsreaktionen wurden für einen konstanten pH-Wert über die Dauer der Experimente verfolgt.
Unterbrochene (Post Amadori)-Ribose-Glykierungstests
Eine Glykierung erfolgte zunächst durch Inkubieren eines Proteins (10 mg/ml) mit 0,5 M Ribose bei 37°C in 0,4 M Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7,5 und 0,2% Natriumazid für 24 Stunden in Abwesenheit von Inhibitoren. Eine Glykierung wurde sodann unterbrochen, um einen Überschuss an und reversibel gebundenen (Schiff-Base) Zucker durch eine extensive Dialyse gegen häufig gewechselten kalten Puffer bei 4°C zu entfernen. Die glykierten Zwischenproduktproben mit einer Maximalmenge an Amadori-Produkt und wenig AGE (abhängig vom Protein) wurden sodann schnell auf 37°C ohne weitere Zugabe von Ribose erwärmt. Dies startete eine Umwandlung von Amadori-Zwischenprodukten zu AGE-Produkten in Abwesenheit oder Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen (typischerweise 3, 15 und 50 mM) von voraussichtlichen Inhibitoren. Aliquots wurden bei verschiedenen Zeitintervallen für eine spätere Analyse entnommen und eingefroren. Die Lösungen wurden in Röhrchen mit Deckeln gehalten und nur geöffnet, um zeitlich festgelegte Aliquots zu entnehmen, die sofort für ein Durchführen von verschiedenen Analysen eingefroren wurden.
Numerische Analyse von kinetischen Daten Kinetische Daten (Zeitverlaufskurven) wurden routinemäßig an mono- oder biexponentielle Funktionen unter Verwendung von nicht-linearen Verfahren der kleinsten Fehlerquadrate angepasst, wobei entweder SCIENTIST 2.0 (MirocMath, Inc.)- oder ORIGIN (Microcal, Inc.)-Software verwendet wurde, um eine Wiederholung von anwenderdefinierten Funktionen und eine Kontrolle von Parametern zu erlauben. Standardabweichungen der Parameter der angepassten Funktionen (anfängliche und endgültige Ordinaten-Werte und Geschwindigkeitskonstanten) wurden als Messwerte der Genauigkeit der Anpassungen wiedergegeben. Scheinbare Halbwertszeiten für biexponentielle Kinetikanpassungen wurden mit der "Lösungs"-Funktion der MathCad-Software (MathSoft, Inc.) bestimmt.
ERGEBNISSE
Hemmung durch Vitamin-B6-Derivate der Gesamtkinetiken einer AGE-Bildung aus Ribose.
Die Hemmwirkungen von Vitamin-B1- und -B6-Derivaten auf die Kinetiken einer Antigen-AGE-Bildung wurden durch polyklonale für AGEs spezifische Antikörper untersucht. Anfangsstudien der Hemmung erfolgten bei der Glykierung. von Rinderribonuklease A (RNase) in der kontinuierlichen Gegenwart von 0,05 M Ribose, die diejenige Konzentration von Ribose ist, bei der die Geschwindigkeit einer AGE-Bildung nahezu maximal ist. 13 (Kontrollkurven, ausgefüllte Rechtecke) zeigt, dass die Bildung von Antigen-AGEs bei RNase, wenn sie mit 0,05 M Ribose inkubiert wird, relativ schnell ist, mit einer Halbwertszeit von etwa 6 Tagen unter diesen Bedingungen. Pyridoxal-5'-phosphat (13B) und Pyridoxal (13C) hemmten signifikant die Geschwindigkeit einer AGE-Bildung bei RNase bei Konzentrationen von 50 mM und 15 mM. Überraschenderweise hemmte Pyridoxin, die Alkoholform von Vitamin-B6, auch moderat eine AGE-Bildung bei RNase ( 13D). Von den untersuchten B6-Derivaten war Pyridoxamin bei 50 mM der beste Inhibitor der "endgültigen" Mengen von gebildetem AGE bei RNase über den bwöchigen untersuchten Zeitraum (13A).
Hemmung durch Vitamin-B1-Derivate der Gesamtkinetiken einer AGE-Bildung aus Ribose.
Alle B1-Vitamere hemmten eine Antigen-AGE-Bildung bei RNase bei hohen Konzentrationen, aber die Hemmung erschien komplexer als für die B6-Derivate ( 14A-C). In dem Fall von Thiaminpyrophosphat als dem Inhibitor (14A) schienen sowohl die Geschwindigkeit einer AGE-Bildung als auch die endgültigen Mengen an bei dem Plateau erzeugten AGE verringert. In dem Fall von Thiaminphosphat als dem Inhibitor (14B) und Thiamin (14C) gab es scheinbar eine geringe Wirkung "auf die Geschwindigkeit einer AGE-Bildung, aber eine wesentliche Abnahme an der endgültigen Menge an AGE, das in Gegenwart der höchsten Konzentration an Inhibitor gebildet wurde. Im Allgemeinen zeigte Thiaminpyrophosphat eine größere Hemmung als die zwei anderen Verbindungen bei den niedrigeren untersuchten Konzentrationen.
Hemmung durch Aminoguanidin der Gesamtkinetiken einer AGE-Bildung aus Ribose
Eine Hemmung einer AGE-Bildung durch Aminoguanidin (14D) war merklich unterschiedlich von der, die bei den B1- und B6-Experimenten gemessen wurde. Eine zunehmende Konzentration von Aminoguanidin verringerte die Geschwindig keit einer AGE-Bildung bei RNase, aber verminderte die endgültige Menge an gebildetem AGE nicht. Die endgültige Menge an nach den 6 Wochen gebildetem AGE war nahezu identisch zu derjenigen der Kontrolle für alle getesteten Konzentrationen von Aminoguanidin.
Hemmung der Gesamtkinetiken einer AGE-Bildung in Serumalbumin und Hämoglobin aus Ribose
Vergleichende Untersuchungen erfolgten mit BSA und humanem Methämoglobin (Hb), um zu bestimmen, ob die beobachtete Hemmung proteinspezifisch war. Die unterschiedlichen Derivate von Vitamin-B6 (15A-D) und Vitamin-B1 ( 16A-C) wiesen ähnliche Hemmungsverläufe auf, wenn sie mit BSA wie mit RNase inkubiert wurden, wobei Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat die wirksamsten Inhibitoren von jeder Familie waren. Pyridoxin schaffte es nicht, eine AGE-Bildung bei BSA zu hemmen (15D). Pyridoxalphosphat und Pyridoxal (15B-C) hemmten hauptsächlich die Geschwindigkeit einer AGE-Bildung, aber nicht die endgültigen Mengen an gebildetem AGE. Pyridoxamin (15A) wies eine gewisse Hemmung bei niederen Konzentrationen auf und bei der höchsten getesteten Konzentration schien es die endgültigen Mengen an gebildetem AGE wirksamer als jedes der anderen B6-Derivate zu hemmen. In dem Fall von B 1-Derivaten war das Gesamtausmaß einer Inhibierung einer AGE-Bildung mit BSA (16A-C) geringer als das mit RNase beobachtete (14A-C). Höhere Konzentrationen an Thiamin und Thiaminpyrophosphat hemmten die endgültigen Mengen an gebildeten AGEs, ohne dass die Geschwindigkeit einer AGE-Bildung stark. beeinflusst wurde (16C). Aminoguanidin zeigte wieder die gleichen Hemmungswirkungen mit BSA, die mit RNase erkannt wurden (16D), wobei es scheinbar die Geschwindigkeit einer AGE-Bildung verlangsamte, ohne dass die endgültigen Mengen an gebildetem AGE signifikant beeinflusst wurden.
Die Kinetiken einer AGE-Bildung wurden auch unter Verwendung von Hb in Gegenwart der B6- und B1-Vitamin-Derivate und Aminoguanidin untersucht. Die scheinbaren absoluten Geschwindigkeiten einer AGE-Bildung waren mit Hb signifikant höher als mit entweder RNase oder BSA. Jedoch zeigten die getesteten Inhibitoren im Wesentlichen ein ähnliches Verhalten. Die Wirkungen der Vitamin-B6-Derivate sind in 17 gezeigt. Pyridoxamin zeigte die stärkste Hemmung bei Konzentrationen von 3 mM und darüber (17A) und war am wirksamsten, verglichen mit Pyridoxalphosphat (17B), Pyridoxal (17C) und Pyridoxin (17D). In dem Fall der B1-Vitamin-Derivate (Daten nicht gezeigt) waren die Hemmwirkungen ähnlicher zu den BSA-Hemmungsverläufen als zu RNase. Die Hemmung war bei den höchsten getesteten Konzentrationen (50 mM) nur moderat und betrug nahezu 30–50% für alle drei B1-Derivate. Die primäre Manifestation einer Inhibierung lag in der Verminderung der endgültigen Mengen an gebildetem AGE.
Hemmung durch Vitamin-B6-Derivate der Kinetiken einer Post Amadori-Ribose AGE-Bildung
Unter Verwendung des unterbrochenen Glykierungsrnodells, um eine Hemmung der "späten" Post-Amadori-AGE-Bildung zu untersuchen, wurden Kinetiken durch Inkubieren von isolierten Amadori-Zwischenprodukten von entweder RNase oder BSA bei 37°C in Abwesenheit von freier oder reversibel gebundener Ribose untersucht. Ribose-Zucker, der anfangs verwendet wurde, um die Zwischenprodukte herzustellen, wurde durch kalte Dialyse nach einem Zeitraum von 24 Stunden der Anfangs-Glykierungsreaktion entfernt. Nachdem einer AGE-Bildung erlaubt wurde, sich fortzusetzen, ist eine Bildung von AGE in Abwesenheit eines jeglichen Inhibitors ziemlich schnell (Halbwertszeiten von etwa 10 Stunden). 18 zeigt die Wirkungen von Pyridoxamin (18A), Pyridoxalphosphat (18B) und Pyridoxal (18C) auf die Post-Amadori-Kinetiken von BSA. Pyridoxin erzeugte keinerlei Hemmung (Daten nicht gezeigt). Ähnliche Experimente erfolgten mit RNase. Pyridoxamin bewirkte eine nahezu vollständige Hemmung einer AGE-Bildung mit RNase bei 15 mM und 50 mM (18D). Pyridoxal zeigte keine signifikante Hemmung bei 15 mM (die höchste getestete), aber Pyridoxalphosphat zeigte eine signifikante Hemmung bei 15 mM. Pyridoxalphosphat ist bekannt dafür, fähig zu sein, die aktive Stelle von RNase affinitätszumarkieren (Raetz und Auld, 1972, Biochemistry 11: 2229–2236).
Im Unterschied zu RNase bildete sich mit BSA eine signifikante Menge an Antigen-AGE während der 24-ständigen Anfangsinkubation mit RNase (25–30%), wie durch die höheren ELISA-Messwerte nach Entfernen von Ribose beim Zeitpunkt 0 in 18A-C belegt. Für sowohl BSA als auch RNase scheint sich die Hemmung, wenn beobachtet, als ein Abfall in den endgültigen Mengen an gebildetem AGE zu offenbaren, eher als ein Abfall in der Geschwindigkeit einer Bildung von AGE.
Hemmung durch Vitamin-B1-Derivate der Kinetiken einer Post Amadori-Ribose AGE-Bildung
Thiaminpyrophosphat hemmte eine AGE-Bildung wirksamer als die anderen B 1-Derivate sowohl bei RNase als auch BSA (19). Thiamin zeigte keine Wirkung, während Thiaminphosphat eine gewisse dazwischenliegende Wirkung zeigte. Wie bei den B6-Tests offenbarte sich die Post-Amadori-Hemmung am deutlichsten als ein Abfall in den endgültigen Mengen an gebildetem AGE.
Wirkungen von Aminoguanidin und N^α-Acetyl-L-Lysin auf die Kinetiken einer Post-Amadori-Ribose-AGE-Bildung
20 zeigt die Ergebnisse eines Testens von Aminoguanidin bezüglich einer Hemmung von Post-Amadori-AGE-Bildungskinetiken sowohl bei BSA als auch RNase. Bei 50 mM betrug die Hemmung etwa 20% in dem Fall von BSA (20B) und weniger als 15% bei RNase (20A). Die Möglichkeit einer Hemmung durch einfache Amino-enthaltende Funktionalitäten wurde auch unter Verwendung von N^α-Acetyl-L-Lysin getestet (21), das nur eine freie N^ε-Aminogruppe enthält. N^α-Acetyl-L-Lysin bei bis zu 50 mM schaffte es nicht, eine jegliche signifikante Hemmung einer AGE-Bildung aufzuweisen.
Diskussion
Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass Aminoguanidin ein offensichtlich potenter Inhibitor von vielen Manifestationen einer nicht-enzymatischen Glykierung ist (Brownlee et al., 1986; Brownlee, 1992, 1994, 1995). Die Hemmwirkungen von Aminoguanidin auf verschiedene Phänomene, die durch reduzierende Zucker ausgelöst werden, werden weit verbreitet als ein Beweis der Beteilung einer Glykierung in vielen solchen Phänomenen angesehen. Aminoguanidin ist kürzlich in eine zweite Runde von Phase III-klinischen Studien zum Verbessern der Komplikationen von Diabetes eingetreten, von denen angenommen wird, dass sie durch Glykierung von Bindegewebsproteinen aufgrund hoher Zuckermengen verursacht werden.
Daten aus der Kinetikstudie einer nicht-unterbrochenen "langsamen" AGE-Bildung bei RNase, die durch Glucose induziert wurde (Beispiel 1), bestätigten, dass Aminoguanidin ein wirksamer Inhibitor ist, und identifizierten ferner eine Reihe von Derivaten der Vitamine B1 und B6 als gleichsam oder geringfügig wirksamere Inhibitoren. Jedoch schien sich die Hemmung durch Aminoguanidin unerwarteterweise in ihrer Wirkung bei den späteren Stufen der AGE-Bildungsreaktion zu verringern. Aufgrund der Langsamkeit der Glykierung eines Proteins mit Glucose konnte diese übenaschende Beobachtung nicht vollständig untersucht werden. Weiterhin wurde angedeutet, dass es Fragen über die Langzeitstabilität von Aminoguanidin geben kann (Ou und Wolff, 1993, supra).
Eine Analyse unter Verwendung der sehr viel schnelleren Glykierung durch Ribose erlaubte, dass der gesamte Zeitverlauf einer AGE-Bildung während einer nichtunterbrochenen Glykierung eines Proteins vollständig beobachtet und quantifiziert wird. Die Verwendung einer unterbrochenen Glykierung erlaubte in einzigartiger Weise ferner eine Isolierung und Untersuchung von ausschließlich der Post-Amadori-Artigen-AGE-Bildung in Abwesenheit von freier und reversibel gebundener (Schiff-Base) Ribose. Ein Vergleich der Daten aus diesen zwei Ansätzen mit früheren Glucose-Glykierungskinetiken stellte neue Einblicke in die Mechanismen und Wirksamkeiten von verschiedenen Inhibitoren bereit. 22 sind Balkendiagramme, die zusammengefasste Vergleichsdaten einer prozentualen Hemmung bei bestimmten Zeitpunkten unter Verwendung von verschiedenen Konzentrationen eines Inhibitors zeigen. 22A stellt die Daten für eine Hemmung nach unterbrochener Glykierung einer RNase-AGE-Bildung in Ribose dar. 22B stellt die Daten für eine Hemmung nach unterbrochener Glykierung einer BSA-AGE-Bildung. durch Ribose dar.
Die Gesamtergebnisse zeigen eindeutig, dass Aminoguanidin die Geschwindigkeit einer Antigen-AGE-Bildung in Gegenwart eines Zuckers verlangsamt, aber eine geringe Wirkung auf die endgültige Menge an gebildetem Post-Amadori-AGE aufweist. Folglich können Beobachtungen, die nur auf die anfänglichen "frühen" Stufen einer AGE-Bildung begrenzt sind, die eine Wirksamkeit als Inhibitor anzeigen, tatsächlich für die tatsächliche Wirksamkeit einer Hemmung einer Post-Amadori-AGE-Bildung irreführend sein. Folglich führt die Fähigkeit, einen Vollverlauf einer Reaktion unter Verwendung von Ribose und einer unterbrochenen Glykierung zu beobachten, zu einem vollständigeren Bild über die Wirksamkeit einer Hemmung einer Post-Amadori-AGE-Bildung.
Beispiel 4
Tiermodell und Testen von in vivo-Wirkungen von AGE-Bildung/Inhibitoren
Eine Hyperglykämie kann schnell (innerhalb von 1 oder 2 Tagen) in Ratten durch Verabreichung von Streptozocin (aka. Streptozotocin, STZ) oder Alloxan induziert werden. Dies wurde ein übliches Modell für Diabetes mellitus. Jedoch zeigen diese Ratten eine Nephropathie nur nach vielen Monaten einer Hyperglykämie und nur kurz vor dem Tod wegen eines Endstadiums einer Nierenerkrankung (ESRD). Es wird angenommen, dass diese Erkrankung durch die irreversible chemische Modifikation mit Glucose von langlebigen Proteinen wie Kollagen der Basalmembran verursacht wird. STZ-diabetische Ratten zeigen Albuminurie sehr spät nach Induktion einer Hyperglykämie bei etwa 40 Wochen gewöhnlich nur kurz vor dem Tod.
Aufgrund der dramatischen schnellen Wirkungen von Ribose, die in vitro in den vorstehenden Beispielen gezeigt wurden, wurde ein Versuch unternommen, die Wirkungen einer Ribose-Verabreichung an Ratten und die mögliche Induktion von AGEs durch die schnelle Ribose-Glykierung zu untersuchen. Aus dieser Studie wurde ein Rattenmodell für eine beschleunigte Ribose-induzierte Erkrankung enwickelt.
Wirkungen einer sehr kurzen Ribose-Verabreichtung in vivo
Phase I-Protokoll
Zwei Gruppen von jeweils 6 Ratten wurden jeweils an einem Tag entweder:

a. 300 mM Ribose (zwei intraperitoneale Infusionen 6–8 Stunden getrennt, jeweils 5% des Körpergewichts als ml), oder
b. 50 mM Ribose (eine Infusion) gegeben.

Ratten wurden sodann 4 Tage ohne weitere Ribose-Verabreichung gehalten und an diesem Zeitpunkt wurden sie getötet und die nachstehenden physiologischen Messungen wurden bestimmt: (i) anfängliches und endgültiges Körpergewicht, (ii) Nierengewicht beim endgültigen Stadium, (iii) anfänglicher und endgültiger Schwanzmanschetten-Blutdruck und (iv) Creatinin-Clearance pro 100 g Körpergewicht.
Albumin-Filtrationsgeschwindigkeiten wurden nicht gemessen, da keine schnellen Veränderungen anfangs angenommen wurden. Eine frühere Erfahrung mit STZdiabetischen Ratten zeigte, dass sich eine Albuminurie sehr spät (vielleicht 40 Wochen) nach der Induktion einer Hyperglykämie und gerade bevor Tiere sterben entwickelt.
Nierenphysiologie-Ergelnisse

a. Das endgültige Körpergewicht und endgültige einfache Nierengewicht war für niedrige und hohe Ribose-Behandlungsgruppen gleich.
b. Der Schwanzmanschetten-Blutdruck erhöhte sich von 66 ± 4 auf 83 ± 3 bei Ratten, die mit wenig Ribose (1 × 50 mM) behandelt wurden, und von 66 ± 4 auf 106 ± 5 für Ratten, die mit viel Ribose (2 × 300 mM) behandelt wurden. Diese Ergebnisse sind in dem Balkendiagramm von 23 gezeigt.
c. Die Creatinin-Clearance, als cm³ pro 100 g Körpergewicht, war (normaler erwarteter Bereich etwa 1,0–1,2) in einer dosisabhängigen Weise auf 0,87 ± 0,15 für die Niedrig-Ribose-Gruppe verringert und verringerte sich ferner weiter um 30% auf 0,62 ± 0,13 für die Hoch-Ribose-Gruppe. Diese Ergebnisse sind in dem Balkendiagramm von 24 gezeigt.

Phase I-Schlussfolgerung
Eine eintägige Ribose-Behandlung verursachte einen dosisabhängigen Bluthochdruck und einen dosisabhängigen Abfall in der glomerulären Clearance-Funktion, die sich 4 Tage später offenbarte. Dies sind signifikante metabolische Veränderungen von Diabetes, die nur sehr viel später in STZ-diabetischen Ratten beobachtet werden. Es kann angenommen werden, dass diese Phänomene auf eine irreversible chemische Modifikation (Glykierung) eines Proteins in vivo durch Ribose zurückzuführen sind.
Wirkung einer Einwirkung von höheren Ribose-Konzentrationen für einen längeren Zeitraum
Phase 17-Protokoll.
Gruppen von Ratten (3–6) wurden intraperitoneal 0,3 M einer "Niedrig-Ribose-Dosis" (LR) oder 1,0 M einer "Hoch-Ribose-Dosis" (HR) durch zweimal tägliche Injektionen für entweder (i) einen Tag, (ü) einen "kurzen Zeitraum" (S) von 4 Tagen oder (iii) einen "langen Zeitraum" (L) von 8 Tagen gegeben. Zusätzlich waren diese Konzentrationen an Ribose im Trinkwasser eingeschlossen.
Niernphysioiogie-Ergebnisse

a. Der Schwanzmanschetten-Blutdruck erhöhte sich in allen Gruppen von Ribose-behandelten Ratten, wodurch die Phase I-Ergebnisse bestätigt wurden (23).
b. Die Creatinin-Clearance verringerte sich in allen Gruppen in einer Ribose-Dosis-abhängigen und zeitabhängigen Weise (24).
c. Die Albumin-Ausströmgeschwindigkeit (AER) erhöhte sich signifikant in einer Ribose-abhängigen Weise bei eintägigen und viertägigen Expositionen. Jedoch zeigte sich eine gewisse Wiederherstellung bei Tag 8 relativ zu Tag 4 in der Hochdosisgruppe, aber nicht in der Niedrigdosisgruppe. Diese Ergebnisse sind in dem Balkendiagramm von 25 gezeigt.
d. Die Creatinin-Clearance pro 100 g Körpergewicht verminderte sich für sowohl die Niedrig- als auch die Hoch-Ribose-Gruppe um etwa das gleiche Ausmaß in einer zeitabhängigen Weise (24).

Phase II-Schlussfolgerung
Eine Ribose-Exposition für so wenig wie 4 Tage führte zu Bluthochdruck und Nierenfunktionsstörung, wie sie sich sowohl durch eine verminderte Creatinin-Clearance als auch erhöhte Albumin-Filtration zeigt. Diese Veränderungen sind typisch für Diabetes und werden bei viel späteren Zeitpunkten in STZ-diabetischen Ratten beobachtet.
Intervention durch zwei neue therapeutische Verbindungen und Aminoguanidin
Phase III-Protokoll
60 Ratten wurden zufällig auf 9 verschiedene Gruppen, einschließlich derjenigen, die 1 M Ribose für 8 Tage in Gegenwart und Abwesenheit von Aminoguanidin, Pyridoxamin und Thiaminpyrophosphat ausgesetzt wurden, wie folgt aufgeteilt:
Kontrollgruppen:

(i) keine Behandlung,
(ii) hohe Dosis (250 mg/kg Körpergewicht) an Pyridoxamin ("Verbindung-P"),
(iii) hohe Dosis (250 mg/kg Körpergewicht) Thiaminpyrophosphat ("Verbindung-T" oder "TPP"), und
(iv) niedrige Dosis (25 mg/kg Körpergewicht) an Aminoguanidin ("AG").

Testgruppen:

(i) nur 1 M Ribose-Salzlösung (2 × 9 cm3 täglich IP für 8 Tage),
(ii) Ribose plus niedrige Dosis ("LP") an Pyridoxamin (25 mg/kg Körpergewicht injiziert als 0,5 ml mit 9 cm3 Ribose),
(iii) Ribose plus hohe Dosis ("HP") an Pyridoxamin (250 mg/kg Körpergewicht injiziert als 0,5 ml mit 9 cm3 Ribose),
(iv) Ribose plus hohe Dosis ("HT") an Thiaminpyrophosphat (250 mg/kg Körpergewicht injiziert als 0,5 ml mit 9 cm3 Ribose) und
(v) Ribose plus Niedrigdosis an Aminoguanidin (25 mg/kg Körpergewicht injiziert als 0,5 ml mit 9 cm3 Ribose).

Im Gegensatz zu Phase II wurde Ribose nicht im Trinkwasser verabreicht. Interventionsverbindungen wurden für 1 Tag vor ihrem Einbringen zusammen mit Ribose vorverabreicht.
Nierenphysiologie-Ergebnisse

a. Der Blutdruck war durch die drei Verbindungen allein (Kontrollgruppe) sehr leicht erhöht; Ribose-erhöhter BP wurde nicht durch die Co-Verabreichung von Verbindungen verbessert. Diese Ergebnisse sind in dem Balkendiagramm von 26 gezeigt.
b. Die Creatinin-Clearance in den Kontrollen war unverändert, ausgenommen für TPP, das sie verringerte.
c. Die Creatinin-Clearance wurde normalisiert, wenn Ribose mit einer niedrigen Dosis (25 mg/kg) von entweder Aminoguanidin oder Pyridoxamin co-verabreicht wurde. Diese Ergebnisse sind in dem Balkendiagramm von 27 gezeigt.
d. Hohe Konzentrationen (250 mg/kg) an Pyridoxamin und TPP zeigten nur einen Teilschutz gegen den Ribose-induzierten Abfall in der Creatinin-Clearance (27).
e. Die Albumin-Ausströmgeschwindigkeit (AER) wurde durch Ribose erhöht als auch durch eine hohe Dosis an Pyridoxamin und TPP und eine niedrige Dosis an Aminoguanidin in Abwesenheit von Ribose. Diese Ergebnisse sind in dem Balkendiagramm von 28 gezeigt.
f. Die Albumin-Ausströmgeschwindigkeit wurde durch die Co-Verabreichung einer niedrigen Dosis von sowohl Aminoguanidin als auch Pyridoxamin auf einen normalen Wert wiederhergestellt. Diese Ergebnisse sind in dem Balkendiagramm von 29 gezeigt.

Phase III-Schlussfolgerungen
Wie durch zwei Anzeichen einer Nierenfunktion bestimmt, waren Pyridoxamin und Aminoguanidin, beide bei 25 mg/kg, anscheinend wirksam und äquivalent bei einer Prävention des Ribose-induzierten Abfalls in der Creatinin-Clearance und Ribose-induzierten milden Anstiegs in der Albuminurie.
(i) Thiaminpyrophosphat wurde nicht bei 25 mg/kg getestet; (ii) Thiaminpyrophosphat und Pyridoxamin bei 250 mg/kg waren bei einer Prävention eines Creatinin-Clearance-Abfalls teilweise wirksam, aber möglicherweise nicht bei einer Prävention einer milden Proteinurie; (iii) bei diesen sehr hohen Konzentrationen und in Abwesenheit von Ribose erzeugte Thiaminpyrophosphat allein einen Abfall in der Creatinin-Clearance und beide ergaben einen kleinen Anstieg in der Albuminurie.
Zusammenfassung
Nierenfunktion und Diabetes
Persistente Hyperglykämie in Diabetes mellitus führt zu diabetischer Nephropathie in vielleicht einem Drittel der menschlichen Patienten. Klinisch ist eine diabetische Nephropathie durch das Vorhandensein von:

1. einem Abfall in der Nierenfunktion (verminderte glomeruläre Clearance)
2. einem Anstieg von Protein im Urin (verminderte Filtration)
3. dem gleichzeitigen Vorhandensein von Bluthochdruck definiert.

Eine Nierenfunktion hängt vom Blutfluss (nicht gemessen) und der glomerulären Clearance ab, die entweder durch Inulin-Clearance (nicht gemessen) oder Creatinin-Clearance gemessen werden kann. Die glomeruläre Permeabilität wird durch die Albumin-Filtrationsgeschwindigkeit gemessen, aber dieser Parameter ist ziemlich variabel. Sie ist auch eine Log-Verteilungsfunktion: eine hundertfache Erhöhung in der Albumin-Ausscheidung entspricht nur einer zweifachen Abnahme in der Filtrationskapazität.
Ribose-diabetisches Rattenmodell
Durch die vorstehenden Kriterien scheint Ribose sehr schnell Manifestationen einer diabetischen Nephropathie, wie sie sich in Bluthochdruck, Creatinin-Clearance und Albuminurie widerspiegelt, selbst wenn letzteres nicht groß ist, zu induzieren. In der etablierten diabetischen STZ-Ratte bildet sich eine Hyperglykämie schnell in 1–2 Tagen, aber klinische Manifestationen einer diabetischen Nephropathie stellen sich sehr spät ein, vielleicht so viel wie 40 Wochen bei der Albuminurie. Im Allgemeinen ist eine Albuminurie hochgradig variabel von Tag zu Tag und von Tier zu Tier, obwohl im Gegensatz zum Menschen die meisten STZ-Ratten eventuell eine Nephropathie entwickeln.
Intervention durch Verbindungen
Unter Verwendung der Ribose-behandelten Tiere scheint Pyridoxamin bei 25 mg/kg Körpergewicht effektiv zwei von den drei Manifestationen, die gewöhnlich Diabetes zugeschrieben werden, nämlich die Verschlechterung der Creatinin-Clearance und Albumin-Filtration, zu verhindern. Es tat dies genauso wirksam wie Aminoguanidin. Die Wirksamkeit von Thiaminpyrophosphat war nicht offensichtlich, aber es sollte betont werden, dass dies auf seine Verwendung bei erhöhten Konzentrationen von 250 mg/kg Körpergewicht zurückzuführen sein könnte. Pyridoxamin wäre wesentlich weniger wirksam erschienen, wenn nur die Ergebnisse bei 250 mg/kg Körpergewicht berücksichtigt worden wären.
Wirkung von Verbindungen allein
Im Gesamten schienen die Ratten die Verbindungen gut zu tolerieren. Nierengewichte waren nicht beachtlich und es entwickelte sich nur ein geringer Bluthochdruck. Die physiologischen Wirkungen der Verbindungen wurden nur bei 250 mg/kg getestet. Thiaminpyrophosphat, aber nicht Pyridoxamin, schien die Creatinin-Clearance bei dieser Konzentration zu verringern. Beide schienen Albuminurie leicht zu erhöhen, aber diese Messungen waren vielleicht die am wenigsten verlässlichen.
Verabreichung an Menschen
Ein typischer erwachsener Mensch von durchschnittlicher Größe wiegt 66–77 kg. Typischerweise können diabetische Patienten zu Übergewicht neigen und können über 112 kg aufweisen. Die empfohlene tägliche Zufuhr für einen männlichen Erwachsenen von 66–77 kg, wie 1989 korrigiert, verlangte 1,5 mg pro Tag an Thiamin und 2,0 mg pro Tag an Vitamin B6 (Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 16. Auflage (Merck & Co., Rathaway, N. J., 1992), Seiten 938–939).
Basierend auf dem Rattenmodellansatz würde ein Bereich von Dosen zur Verabreichung von Pyndoxamin oder Thiaminpyrophosphat, von dem vorausgesagt wird, dass er zum Hemmen einer Post-Amadori-AGE-Bildung und somit zum Hemmen von verwandten Erkrankungen wirksam sei, in den Bereich von 1 mg/100 g Körpergewicht bis 200 mg/100 g Körpergewicht fallen. Der geeignete Bereich, falls mit Aminoguanidin co-verabreicht, wird ähnlich sein. Berechnet für einen durchschnittlichen Erwachsenen von 75 kg kann der Bereich (bei 10 mg/1 kg Körpergewicht) etwa 750 mg bis zu 150 g (bei 2 g/1 kg Körpergewicht) betragen. Dies wird natürlicherweise gemäß dem jeweiligen Patienten variieren.
Beispiel 5
In vivo-Hemmung der Bildung von Endprodukten der fortgeschrittenen Glykierung (AGEs) durch Derivate von B1- und B6-Vitaminen und Aminoguanidin. Hemmung einer diabetischen Nephropathie.
Das unterbrochene Glykierungsverfahren, wie in den vorstehenden Beispielen beschrieben, erlaubt eine schnelle Bildung von stabilen gut definierten Protein-Amadori-Zwischenprodukten aus Ribose und anderen Pentosezuckern zur Verwendung in in vivo-Untersuchungen.
Die Wirkungen von 25 mg/kg/Tag Pyridoxamin (PM) und Aminoguanidin (AG) auf eine Nierenerkrankung, dadurch induziert, dass Sprague-Dawley-Ratten täglich mit 50 mg/kg/Tag an Ribose-glykierten Amadori-Ratten-Serumalbumin (RSA), AGE-RSA und unmodifizierten RSA für o Wochen injiziert wurden. Eine Hyperfiltration (erhöhte Creatinin-Clearance) wurde vorübergeherd bei Ratten beobachtet, die Amadori-RSA und AGE-RSA erhielten, ungeachtet des Auftretens von PM und AG.
Individuen von jeder Gruppe, die Amadori-RSA und AGE-RSA erhielten, wiesen Mikro-Albuminune auf, aber keine wurde beobachtet, falls PM co-verabreicht wurde. Ein Immunanfärben mit anti-RSA zeigte ein Glomerulus-Anfärben in Ratten, die mit AGE-RSA und mit Amadori-RSA behandelt wurden; und dieses Anfärben war vermindert durch eine Behandlung mit PM, aber nicht durch eine AG-Behandlung. Eine Abnahme in glomerulären sulfatierten Glykosaminglykanen (Alcianblau pH 1,0-Färbung) wurde auch in Ratten festgestellt, die mit glykiertem (Amadori- und AGE-) RSA behandelt wurden. Dies scheint auf die verminderten Heparansulfat-Proteoglykane (HSPG) zurückzuführen zu sein, wie durch eine verminderte Anfärbung mit mAb JM-403 belegt, der spezifisch für die HSPG-Seitenkette ist. Diese HSPG-Veränderungen wurden durch Behandlung mit PM, aber nicht durch eine AG-Behandlung verbessert.
Folglich schließen wir, dass Pyridoxamin sowohl einen diabetesartigen glomerulären Verlust an Heparansulfat als auch eine glomeruläre Ablagerung von glykiertem Albumin in SD-Ratten, die chronisch mit Ribose-glykiertem Albumin behandelt wurden, verhindern kann.
Materialien und Verfahren
Chemikalien
Ratten-Serumalbumin (RSA) (Fraktion V, im Wesentlichen fettsäurefrei, 0,005%; A2018), D-Ribose, Pyridoxamin und Ziegen-alkalische Phosphatase-konjugiertes anti-Kaninchen-IgG waren alle von Sigma Chemicals. Aminoguanidin-Hydrochlorid wurde von Aldrich Chemicals bezogen.
Herstellung von ribosiliertem RSA
Ratten-Serumalbumin wurde durch eine Affi-Gel-Blau-Säule (Bio-Rad), eine Heparin-Sepharose CL-6B-Säule (Pharmacia) und eine Endotoxin-bindende Affinitätssäule (Detoxigel, Pierce Scientific) geleitet, um jegliche mögliche Verunreinigungen zu entfernen. Das gereinigte Ratten-Serumalbumin (RSA) wurde sodann in 0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5) dialysiert. Ein Teil des RSA (20 mg/ml) wurde sodann mit 0,5 M Ribose 12 Stunden bei 37°C im Dunkeln inkubiert. Nach der 12-stündigen Inkubation wurde das Reaktionsgemisch in kaltem 0,2 M Natriumphosphatpuffer über einen 36-stündigen Zeitraum bei 4°C dialysiert (diese Dialyse entfernt nicht nur die freie Ribose, sondern auch die Schiff-Base-Zwischenprodukte). Auf dieser Stufe des Glykierungsverfahrens wird das ribosilierte Protein als Amadori-RSA klassifiziert und ist für Antigen-AGEs negativ, wie durch Antikörper bestimmt, die mit AGE-Protein reaktiv sind (wie vorher beschrieben; R618, Antigen: Glucosemodifizierte AGE-RNase). Das ribosilierte Protein wird sodann in Portionen aufgeteilt, die entweder als: a) Amadori-RSA, b) NaBH₄-reduziertes Amadori-RSA, c) AGE-RSA injiziert werden.
Das ribosilierte Protein, das als Amadori-RSA injiziert werden soll, wird einfach gegen kaltes PBS bei 4°C 24 Stunden dialysiert. Ein Teil des Amadori-RSA in 0,2 M Natriumphosphat wird mit NaBH₄ reduziert, um NaBH₄-reduziertes Amadori-RSA zu bilden. Kurz gesagt werden Aliquots durch Zusetzen von 5 μl NaBH₄-Stammlösung (100 mg/ml in 0,1 M NaOH) pro mg des Proteins reduziert, 1 Stunde bei 37°C inkubiert, mit HCl behandelt, um einen Überschuss an NaBH₄ zu entfernen, und sodann extensiv in kaltem PBS bei 4°C 36 Stunden dialysiert. Das AGE-RSA wurde dadurch gebildet, dass das Amadori-RSA in Abwesenheit von Zucker 3 Tage wieder inkubiert wurde. Das Gemisch wurde sodann gegen kaltes PBS bei 4°C 24 Stunden dialysiert. Alle Lösungen wurden filtriert (22 μm-Filter), sterilisiert und auf Endoto xine durch einen Limulus-Amöbozytenlysat-Test (E-Toxate, Sigma Chemical) überprüft und sie enthielten < 0,2 ng/ml, bevor sie in einzelne Aliquots bis zum Zeitpunkt der Injektion eingefroren wurden (–70°C).
Tiersudien
Männliche Sprague-Dawley-Ratten (Sasco, 100 g) wurden verwendet. Nach einem 1-wöchigen Anpassungszeitraum wurden Ratten in Stoffwechselkäfige gegeben, um eine 24-stündige Urinprobe für 2 Tage vor Verabreichung von Injektionen zu erhalten. Ratten wurden sodann in Experiment- und Kontrollgruppen aufgeteilt und Schwanzveneninjektionen mit entweder Salzlösung, unmodifiziertem RSA (50 mg/kg), Amadori-RSA (50 mg/kg), NaBH₄-reduziertem Amadori-RSA (50 mg/kg) oder AGE-RSA (50 mg/kg) gegeben.
Ratten, denen Amadori-RSA und AGE-RSA injiziert wurde, warden sodann entweder unbehandelt gelassen oder ferner durch die Verabreichung von entweder Aminoguanidin (AG; 25 mg/kg), Pyridoxamin (PM; 25 mg/kg) oder durch eine Kombination von AG und PM (jeweils 10 mg/kg) über das Trinkwasser behandelt. Körpergewicht und Wasseraufnahme der Ratten wurden wöchentlich überwacht, um die Dosen anzupassen. Am Abschluss der experimentellen Studie wurden die Ratten in Stoffwechselkäfige gegeben, um eine 24-stündige Urinprobe für 2 Tage vor dem Töten der Tiere zu erhalten.
Gesamtprotein in den Urinproben wurde durch einen Bio-Rad-Test bestimmt. Albumin im Urin wurde durch einen kompetitiven ELISA unter Verwendung von Kaninchen-anti-Ratten-Serumalbumin (Cappell) als Primärantikörper (1% 2000) und Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (Sigma Chemical) als Sekundärantikörper (1 / 2000) bestimmt. Der Urin wurde mit Multistix 8 SG (Miles Laboratories) auf Glucose, Keton, spezifisches Gewicht, Blut, pH-Wert, Protein, Nitrit und Leukozyten getestet. Nichts bemerkenswertes außer etwas Protein wurde detektiert.
Creatinin-Messungen erfolgten mit einem Beckman-Creatinin-Analysator II. Blutproben wurden durch Herzpunktion vor dem Ende gesammelt und wurden bei der Bestimmung von Creatinin-Clearance, Blutglucose (Glucoseoxidase, Sigma Chemical), Fructosamin (Nitroblau-Tetrazolium, Sigma Chemical) und glykiertem Hb (Säulen, Pierce Chemicals) verwendet. Aorta, Herz, beide Nieren und der Rattenschwanz wurden mit dem unbewaffneten Auge untersucht und sodann schnell nach Perfundieren mit Salzlösung durch die rechte Herzkammer entfernt. Eine Niere, die Aorta, der Rattenschwanz und die unteren zwei Drittel des Herzens wurden schnell eingefroren und sodann dauerhaft bei –70°C gelagert. Die andere Niere wurde durch Entfernen beider Enden (Cortex) unterteilt, um schnell eingefroren zu werden, wobei die verbleibenden Teile der Niere in Drittel unterteilt wurden, wobei zwei Teile in neutral gepuffertes Formalin gegeben wurden und das verbleibende Drittel zerhackt und in 2,5% Glutaraldehyd/2% Paraformaldehyd gegeben wurde.
Lichtmikroskop
Nach Perfundieren mit Salzlösung wurden die Nierenschnitte in eiskaltem 10%igem neutral gepuffertem Formalin fixiert. Paraffin-eingebettete Gewebeschnitte für alle Rattengruppen (n = 4 pro Gruppe) wurden für ein Anfärben mit Harris' Alaun-Hämatoxylin und Eosin (H & E), Periodsäure/Schiff-Reagenz (PAS) und Alcianblau (pH 1,0 und pH 2,5)-Färbungen für eine histologische Untersuchung weiter verarbeitet. Die Alcianblau-Schnitte wurden von zwei Forschern in einer blindstudienartigen Weise bewertet.
Elektronenmikroskop
Gewebe wurden in 2,5% Glutaraldehyd/2% Paraformaldehyd (0,1 M Natriumcacodylat, pH 7,4) fixiert, 1 Stunde in gepuffertem Osmiumtetroxid (1,0%) nachfixiert, in 0,5% Uranylacetat 1 Stunde vorgefärbt und in Effapoxyharz eingebettet. Ultradünne Schnitte wurden mittels Elektronenmikroskop untersucht.
Immunfluoreszenz
Paraffin-eingebettete Schnitte wurden entparaffinisiert und sodann mit 10% Ziegenserum in PBS 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Die Schnitte wurden sodann 2 Stunden bei 37°C mit einem Primärantikörper, entweder einem affinitätsgereinigten polyklonalen Kaninchen-anti-AGE-Antikörper oder einem polyklonalen Schaf-anti-Ratten-Serumalbumin-Antikörper (Cappell), inkubiert. Die Schnitte wurden sodann 30 Minuten mit PBS gespült und mit Sekundärantikörper, entweder einem affinitätsgereinigten FITC-Ziege-anti-Kaninchen-IgG (H + L) von doppelter Färbungsgüte (Zymed) oder einem Rhodamin-Kaninchen-anti-Schaf-IgG (vollständig) (Cappell), 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Schnitte wurden sodann 30 Minuten mit PBS im Dunkeln gespült, in wässrigen Fixiermedien für Immuncytochemie (Biomeda) fixiert und mit einem Objektträger bedeckt. Schnitte wurden in einer blindstudienartigen Weise bewertet. Nierenschnitte wurden nach der Anzahl und Intensität der Glomerulus-Anfärbung in 5 Regionen um die Peripherie der Niere bewertet. Bewertungen wurden für die Immunfluoreszenzbewertung pro 100 Glomeruli mit einem Bewertungssystem von 0–3 normalisiert.
Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen AGE-Proteine
Ein Immunogen wurde durch Glykierung von BSA (R479-Antikörper) oder RNase (R618-Antikörper) bei 1,6 g Protein in 15 ml für 60–90 Tage unter Verwendung von 1,5 M Glucose in 0,4 M Phosphat mit 0,05% Natriumazid bei einem pH-Wert von 7,4 und 37°C hergestellt. Weiße männliche Neuseeland-Kaninchen von 8–12 Wochen wurden durch subkutane Verabreichung von 1 ml Lösung mit 1 mg/ml glykiertern Protein in Freund'schem Adjuvans immunisiert. Die primäre Injektion verwendete das vollständige Adjuvans und drei Auffrischimpfungen wurden bei 3-wöchigen Intervallen mit Freund'schem unvollständigem Adjuvans durchgeführt. Die Kaninchen wurden 3 Wochen nach der letzten Auffrischimpfung zur Ader gelassen. Das Serum wurde durch Zentrifugation von geronnenem Gesamtblut gesammelt. Die Antikörper waren AGE-spezifisch, wobei sie gegenüber entweder nativen Proteinen oder Amadori-Zwischenprodukten unreaktiv waren.
ELISA-Detektion von AGE-Produkten
Das allgemeine Verfahren von Engvall (21) wurde verwendet, um den ELISA durchzuführen. Glykierte Proteinproben wurden auf etwa 1,5 ug/ml in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer mit einem pH-Wert von 9,5 bis 9,7 verdünnt. Mit dem Protein wurde über Nacht bei Raumtemperatur eine 96-Well-Polystyrol-Platte dadurch beschichtet, dass 200 μl der Proteinlösung in jedes Well (etwa 0,3 μg/Well) pipettiert wurden. Nach dem Beschichten wurde der Überschuss an Protein von den Wells mit einer Salzlösung mit 0,05% Tween-20 gewaschen. Die Wells wurden sodann mit 200 μl 1% Kasein in Carbonatpuffer 2 Stunden bei 37°C blockiert, gefolgt von Waschen. Kaninchen-anti-AGE-Antikörper wurden bei einem Titer von 1 : 350 in Inkubationspuffer verdünnt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert, gefolgt von Waschen. Um Hintergrundauslesungen zu minimieren, wurde ein Antikörper R618, der zum Detektieren von glykiertem RSA verwendet wird, durch Immunisierung gegen glykierte RNase gebildet. Ein alkalische Phosphatase-konjugierter Antikörper gegen Kaninchen-IgG wurde sodann als Sekundärantikörper bei einem Titer von 1 : 2000 hinzugefügt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert, gefolgt von Waschen. Das para-Nitrophenolat wurde bei 410 nm mit einem Dynatech MR4000-Mikroplatten-Lesegerät überwacht.
Ergebrnisse
Die Ratten in dieser Studie überlebten die Behandlungen und zeigten keine äußerlichen Anzeichen für irgendeine sichtbare Erkrankung. Einige der Ratten zeigten gewisse geringe Gewichtsschwankungen und Schwanzverkrustungen.
Ein Anfangs-Screenen von Nierenschnitten mit PAS- und H & sE-Färbungen zeigte keinerlei offensichtliche Änderungen und einige EM-Schnitte zeigten keinerlei sichtbare Änderungen in der glomerulären Basalmembran (GBM). Jedoch wurden bei der Alcianblau-Färbung beachtliche Unterschiede beobachtet. Eine Alcianblau-Färbung ist auf negativ geladene Gruppen in Geweben gerichtet und kann für Veränderungen in dem pH-Wert von Färbungen selektiv gemacht werden. Bei einem pH-Wert von 1,0 ist Alcianblau selektiv für Mucopolysaccharide und bei einem pH-Wert von 2,5 detektiert es Glucoronsäuregruppen. Folglich werden negative Ladungen abhängig von dem pH-Wert der Färbung detektiert.
Bei einem pH-Wert von 2,5 zeigte eine Alcianblau-Färbung, dass Amadori-RSA (p < 0,05) und AGE-RSA (p < 0,01) eine erhöhte Anfärbung für saure Glykosaminoglykaue (GAG) oberhalb von Kontrollmengen induzierte (33). Für sowohl AGE-RSA als auch Amadori-RSA verhinderte eine Behandlung mit Pyridoxamin (PM) den Anstieg bei der Färbung (p < 0,05 verglichen mit Kontrollen). Im Gegensatz dazu verhinderte eine Behandlung mit Aminoguanidin (AG) oder mit kombinierten PM und AG bei jeweils 10 mg/kg den Anstieg nicht.
Bei einem pH-Wert von 1,0 war die Alcianblau-Färbung signifikant durch AGE-RSA (p ^< 0,001) vermindert (34). Jedoch wurde kein signifikanter Unterschied mit Amadori-RSA beobachtet. Aufgrund der schwachen Anfärbung konnte eine Behandlung mit PM, AG und kombiniert nicht quantifiziert werden.
Immunfluoreszenz-Glomerulus-Anfärbung für RSA zeigte eine erhöhte Anfärbung mit Amadori-RSA und AGE-RSA, die den Tieren injiziert wurden (35). Eine signifikante Verminderung dieser Wirkung wurde in den Ratten beobachtet, die mit PM und nicht mit AG oder kombiniert AG und PM behandelt wurden.
Eine Immunfluoreszenz-Glomerulus-Färbung für ein Heparansulfat-Proteoglykan-Kern-Protein zeigte eine leicht verminderte Anfärbung mit Amadori-RSA und AGE-RSA, die den Tieren injiziert wurden, aber sie waren nicht statistisch signifikant (36). Eine Verminderung dieser Wirkung wurde in den Ratten beobachtet, die mit PM und nicht mit AG oder kombiniert AG und PM behandelt wurden. Jedoch zeigte eine Immunfluoreszenz-Glomerulus-Färbung für eine Heparansulfat-Proteoglykan-Seitenkette eine hochgradig verminderte Färbung mit Amadori-RSA und AGE-RSA, die den Tieren injiziert wurden (37). Eine signifikante Verminderung dieser Wirkung wurde in den Ratten beobachtet, die mit PM und nicht mit AG oder kombiniert AG und PM behandelt wurden.
Eine Analyse des durchschnittlichen Glomerulus-Volumens durch Bewerten in einer blindstudienartigen Weise zeigte, dass Amadori-RSA und AGE-RSA eine signifikante Erhöhung des durchschnittlichen Glomerulus-Volumens verursachten (38). Eine signifikante Verminderung dieser Wirkung wurde mit einer Behandlung der Ratten mit PM beobachtet. Keine Wirkung wurde mit der Behandlung mit AG oder kombiniert AG und PM bei jeweils 10 mg/kg beobachtet.
Beispiel 6 Hemmung von Hyperglykämie-assoziierter Hyperlipidämie
In einem Versuch, die Bildung von AGEs und die Entwicklung von diabetischer Nephropathie zu hemmen, behandelten wir Streptozotocin-induzierte diabetische Ratten mit Pyridoxamin. Wir beschreiben nun, dass Pyridoxamin die Entwicklung von einer Nephropathie in der diabetischen Ratte hemmt, wie durch seine Wirkungen auf Albuminurie, Proteinurie und Plasma-Creatinin gemessen, dass es signifikant die Dyslipidämie in diabetischen Ratten korrigiert, wie durch Hemmung des Anstiegs von Plasma-Cholesterin und Triglyceriden gemessen, und dass es Redox-Ungleichgewichte korrigiert, die von entweder Hypoxie oder Pseudohypoxie herrühren, wie durch Änderungen in dem Plasmalactat zu Pyruvat-Verhältnis gemessen. Bei vergleichbaren Dosen war Pyridoxamin wirksamer als der Prototyp eines AGE-Inhibitors, Aminoguanidin, bei einem Schutz gegen diabetische Nephropathie und einer Umkehrung von Dyslipidämie und metabolischen Abnormitäten von Diabetes. Wie hierin verwendet, umfasst ein "diabetischer Säuger" sowohl diejenigen Säuger, die gegenwärtig diabetisch sind, als auch diejenigen, die Glucose-intolerant sind und/oder eine Pankreasinsuffizienz aufweisen, ungeachtet ihres Blutzuckerspiegels. Wir schließen daraus, dass AGE-Inhibitoren sowohl gegen diabeti sche Nephropathie schützen als auch weit reichende Wirkungen auf die/den Lipidund Kohlenhydrat-Chemie und -Metabolismus aufweisen.
Einleitung
Das Ziel dieser Studie war es, die Wirkung von PM und AG auf die Bildung von AGEs und Entwicklung einer Nephropathie in einer diabetischen Ratte zu beurteilen. Am Ende des 30-wöchigen Experiments beobachteten wir, dass das Plasma von diabetischen Ratten augenscheinlich mehr lipämisch war als das von Kontrollratten und dass anscheinend ein Lipämie-Abfall in sowohl PM- als auch AGbehandelten diabetischen Tieren auftrat. Wir beschreiben, dass sowohl PM als auch AG nicht nur die Entwicklung von Nephropathie in den STZ-diabetischen Ratten hemrrte, sondern auch den Anstieg an Plasma-Cholesterin und Triglyceriden in den diabetischen Ratten hemmte und den Anstieg des Plasmalactats und des Lactat/Pyruvat-Verhältnisses umkehrte, was ein Indikator eines veränderten Redox-Status bei Diabetes ist. Wir diskutieren auch den Ursprung der erhöhten chemischen Modifizierung von Kollagen in diabetischen Tieren und die relative Wichtigkeit von Substrat- und oxidativem Stress und Lipiden gegenüber Kohlenhydraten bei einer Bildung von AGEs. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass PM ein wirksames therapeutisches Mittel zum Hemmen der Entwicklung von sowohl Nephropathie als auch einer Gefäßkrankheit bei Diabetes sein kann.
Materialien und Verfahren
Wenn nicht anders angegeben, wurden Reagenzien und Enzyme von Sigma Chemical Co., St. Louis, bezogen.
Experimentelle Ausführung. Diese Experimente erfolgten in weiblichen Sprague-Dawley-Ratten, die durch Injektion von STZ diabetisch gemacht wurden. Diabetes wurde durch eine einzige Schwanzveneninjektion von 45 mg/kg STZ in 0,1 M Natriumcitratpuffer mit einem pH-Wert von 4,5 induziert. Kontrolltieren wurde zum Schein nur Puffer injiziert. Diabetes wurde dadurch bestätigt, dass Blutglucosespiegel 2 und 3 Tage nach der STZ-Injektion gemessen wurden. Die Tiere mit Plasmaglucosewerten über 16 mM wurden als diabetisch klassifiziert. Die diabetischen Ratten wurden willkürlich in eine unbehandelte diabetische Gruppe (n = 12) und zwei diabetische Behandlungsgruppen aufgeteilt, die entweder PM (n = 13) oder AG (n = 12) bei 1 g/l im Trinkwasser erhielten. Zwei nicht-diabetische Kontrollgruppen waren eingeschlossen, wobei eine keine Behandlung (n = 13) erhielt und die andere PM(HCl)₂ bei 2 g/l im Trinkwasser (n = 12) erhielt; die höhere Dosis von PM in der PM-behandelten Kontrollgruppe war darauf ausgelegt, teilweise die geringere Wasseraufnahme von nicht-diabetischen verglichen zu diabetischen Tieren zu kompensieren. Alle Tiere wurden bei einem Licht-Dunkel-Zyklus von jeweils 12 Stunden gehalten und hatten freien Zugang zu Nahrung und Wasser. Um das Körpergewicht beizubehalten und eine Hyperglykämie zu begrenzen, erhielten diabetische Tiere 3 IU Ultralente-Insulin (Humulin U, Eli Lilly) dreimal wöchentlich; dies wurde auf 5 IU nach Woche 15 erhöht, um es an die Zunahme des Körpergewichts anzupassen.
Nephropathie. Der Nephropathieverlauf wurde durch monatliche Messungen von Albumin und Gesamtprotein im Urin und von Creatinin im Plasma beurteilt. Fär Urinmessungen wurden Ratten in Stoffwechsel-Rattenkäfigen (Nalgene, Nalge Company, Rochester, NY) 24 Stunden gehalten. Mehrere Tropfen Toluol wurden dem Urinsammelbecher zugesetzt, um ein mikrobielles Wachstum zu verhindern. Alle Tests für Proteine und Metabolite in Plasma und Urin erfolgten durch Mikroplatten-Anpassungen von gegenwärtigen Verfahren unter Verwendung eines Wallac Victor Modell 1420-Multimarkierungsplatten-Auslesegeräts (Wallac, Inc., Gaithersburg, MD). Kontrollexperimente zeigten, dass weder PM noch P. G bei im Plasma oder Urin vorhandenen Konzentrationen eine Wechselwirkung in irgendeinem der Tests verursachten, ausgenommen für Protein im Urin (siehe nachstehend).
Albumin im Urin wurde durch einen ELISA-Test quantifiziert. Kaninchen-Antiserum gegen Rattenalbumin und Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertes Ziegenanti-Kaninchen-IgG wurden von ICN Biomedical Research Products, Costa Mesa, CA, bezogen. Kurz gesagt wurden Wells mit 50 ng Rattenalbumin (Sigma, St. Louis) in 0,1 M Natriumcarbonatpuffer, pH 10,4, über Nacht bei 4°C beschichtet. In dem Kompetitionsschritt wurden 100 μl eines Standards oder einer verdünnten Urinprobe mit 100 μl des Kaninchen-anti-Rattenalbumin-Antiserums 3 Stunden bei Raumtemperatur auf einem Mikroplattenschüttler inkubiert. Nach Waschen wurde Meerrettichperoxidase-konjugiertes Ziegen-anti-Kaninchen-IgG (200 μl) 1 Stunde bei 25°C unter Schütteln angewendet und die Platte wurde mit 200 μl ABTS-Reagenz (2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure)) 45 Minuten bei Raumtemperatur entwickelt und die Absorption bei 405 nm gemessen.
Gesamtprotein im Urin wurde am Ende des Experiments unter Verwendung des Sigma Microprotein-PR-Kits gemessen. Kurz gesagt wurde ein Aliquot der Probe oder des Standards zu der Reagenzlösung zugesetzt, die Pyrogallol-Rot und Natriummolybdat enthielt, 3 Minuten bei 37°C inkubiert und die Absorption bei 570 nm gemessen. Eine Korrektur (< 10%) wurde für den PM- oder AG-Gehalt der Probe verwendet. Die Plasma-Creatinin-Konzentration wurde durch das Jaffe-Picrinsäure-Verfahren unter Verwendung des Sigma-Kits Nr. 555-A gemessen. Kurz gesagt wurden 20 μl der Probe oder des Standards mit 200 μl Picratlösung gemischt. Die Absorption bei 490 nm wurde vor und nach Zugabe des Säurereagenz ausgelesen.
Cholesterin, Triglyceride, freie Fettsäuren und Glycerin im Plasma.
Gesamtcholesterin und Triglyceride wurden durch enzymatische kolorimetrische Endpunktstests unter Verwendung von Sigma-Kits für Gesamtcholesterin (Nr. 352) und Gesamttriglyceride (Nr. 37, GPO Trinder) einschließlich der Standards für beide Tests gemessen. Freie Fettsäuren wurden als die organischen löslichen Kupferkomplexe gemessen, wie durch Noma et al. (1973) beschrieben (Noma et al., 1973, Clin. Chim. Acta 43: 317–320). Glycerin wurde durch einen spektrometrischen enzymatischen. Test unter Verwendung von Glycerinkinase und Glycerin-3-phosphatdehydrogenase gemessen, wie von Bergman beschrieben (Bergman, 1974, Assay of glycerol-phosphate dehydrogenase, in Methods of Enzymatic Analysis, Bd. 3, Bergman, H. V., Berlin: Verlag Chemie, 1404–1408).
Lactat, Pyruvat und Ketonkörper. Lactat, Pyruvat und β-Hydroxybutyrat wurden spektrophotometrisch unter Verwendung von NADH/NAD⁺-gekoppelten Tests gemessen (Sigma Kits Nr. 826, 726 bzw. 310). Acetoacetat wurde durch Umkehr des β-Hydroxybutyrat-Tests unter Verwendung von Acetoessigsäurelithiumsalz, β-Hydroxybutyratdehydrogenase Typ II und NADH gemessen, wie durch Li et al. beschrieben (Li et al., 1980, Clin. Chem. 26: 1713–1717).
Nierenmorphometrie. Eine Seite der rechten Niere wurde in 2 mm dicke Scheiben unter Verwendung eines Sets von parallelen Rasierklingen geschnitten. Eine Hälfte der Scheiben wurde systematisch unvoreingenommen ausgewählt und in Formalin gegeben. Diese Scheiben wurden über eine Reihe von Alkoholen dehydratisiert und in JB-4^TM (Polysciences, Inc., Warrington PA) eingebettet. Von jedem JP-4^TM-Block wurde ein 5 um dicker Schnitt abgeschnitten, mit Toluidinblau gefärbt und für eine Bestimmung des glomerulären Volumens verwendet. Von den nicht-ausgewählten Scheiben wurden kleine Blöcke des Cortex in 2,5% Glutaral dehyd in Millonig-Puüer über eine Reihe von Alkoholen fixiert und in PolyBed 812® (Polysciences, Inc., Warrington PA) eingebettet. Um Glomeruli unvoreingenommen auszuwählen, wurden 1 um dicke Schnitte von den PolyBed 812^®-Blöcken abgeschnitten und mit Toluidinblau angefärbt. Das mittigste Glomerulus wurde für das Elektronenmikroskop ausgewählt. Silber-Gold-Schnitte wurden unter Verwendung eines Reichert-Ultracut E Ultramikrotoms ausgeschnitten, auf Formvar-beschichtete Probenkämme platziert und mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt. Bilder wurden unter Verwendung eines JEOL 1000X-Elektronenmikroskops erhalten. Drei Glomeruli von jedem Tier wurden zum Messen der Elektronenmikroskop-Parameter verwendet.
Für eine Messung des glomerulären Volumens wurde ein Olympus BH-2-Mikroskop, ausgestattet mit einem kleinen Spiegel, der an das Monookular angebracht war, verwendet, um ein Bild auf die Tischoberfläche zu projizieren. Gebiete von den JB-4^TM-Schnitten wurden systematisch unvoreingenommen dadurch ausgewählt, dass der Mikroskoptisch in 2,5 mm-Schritten bewegt wurde. Die Fläche von allen glomerulären Profilen innerhalb jedes Felds wurde dadurch gemessen, dass ein Gitter von Punkten über das projizierte Bild gelegt wurde. Die Anzahl von Punkten, die jedes glomeruläre Profil trafen, wurde gezählt. Die durchschnittliche glomeruläre Fläche wurde durch die Gleichung berechnet: Fläche = (ΣP/ΣG) × (5000/150)², worin ΣP die Summe der Punkte war, die die glomerulären Profile trafen, und FG die Anzahl von gemessenen Profilen war, 5000 der Abstand zwischen den Gitterpunkten in um war und 150 die Vergrößerung der projizierten Bilder war. Das Volumen wurde durch das Verfahren von Weibel und Gomez (Weibel und Gomez, 1962, J. Appl. Physiol. 17: 343–348) unter Verwendung der Gleichung: Volumen = Fläche^3/2 × 1,38/1,01 berechnet, worin 1,38 ein Korrekturfaktor für sphärische Partikel ist und 1,01 ein Korrekturfaktor für die Variation des Volumens unter den Glomeruli ist. Durchschnittlich wurden 65 Profile für die Bestimmung des glomerulären Volumens gemessen. Eine Standardscheibe wurde verwendet, um zu bestätigen, dass die Vergrößerung der projizierten Bilder 150-fach betrug.
Für eine Messung der Breite der glomerulären Basalmembran (GBM) wurden Bilder systematisch unvoreingenommen unter Verwendung von voreingestellten Positionen der Mikroskoptisch-Kontrollen erhalten. Etwa 25% jedes glomerulären Profils wurden bei einer abschließenden Vergrößerung von 15 000-fach abgelichtet. Die Breite der glomerulären Basalmembran wurde unter Verwendung des orthogonalen Abschnittverfahrens (Jensen et al., 1979, J. Microscopy 115: 19–33) gemessen.
Durchschnittlich 169 Messungen der glomerulären Basalmembran wurden pro Tier durchgeführt. Für eine Messung der Volumendichte des Mesangiums pro Glomerulus [Vv (Mes/Glom)] wurden Bilder erhalten und zusammengefügt, um eine Montage des gesamten glomerulären Profils bei einer endgültigen Vergrößerung von 3900-fach zu bilden. Ein Gitter von groben und feinen Punkten wurde über die Montage platziert. Die Anzahl von feinen Punkten, die auf das Mesangium fielen, und die Anzahl von groben Punkten, die auf den Glomerulus fielen, wurden gezählt (Weibel, E. R., 1979, Practical Methods for Biological Morphometry, Stereological Methods, Bd. I, New York, Academic Press, Seite 332 f . Vv (Mes/ Glom) = ΣFP/(ΣCP × 4), worin ΣFP die Anzahl von feinen Punkten ist, die auf das Mesangium fallen, und ΣCP die Anzahl von groben Punkten ist, die auf alle drei Glomeruli fallen. Das Gitter wurde derart hergestellt, dass es 4 feine Punkte für jeden groben Punkt gab. Durchschnittlich trafen 174 grobe Punkte einen Glomerulus und 164 feine Punkte trafen das Mesangium pro Tier. Ein Standardgitter wurde sowohl bei der hohen als auch niedrigen Vergrößerung für jede Rolle an Film photographiert, um die exakte Vergrößerung jedes gemessenen Bilds zu bestimmen. Das gesamte mesangiale Volumen wurde dadurch berechnet, dass das glomeruläre Volumen mit Vv (Mes/Glom) multipliziert wurde.
Statistische Anaflyse. Statistische Analysen erfolgten unter Verwendung von Sigma Stat für Windows V 1.00 (SPSS, Inc., Chicago, IL). P-Werte wurden durch eine nicht-parametrische Mann-Whitney-Rang-Summenanalyse berechnet. Korrelationsanalysen erfolgten durch das Pearson-Produkt-Moment-Verfahren.
Ergebnisse
Nephropathieuerlauf. Albumin und Proteinausscheidung im Urin und Plasma-Creatinin-Konzentrationen wurden als Maß einer diabetischen Nephropathie verwendet (39). PM-behandelte nicht-diabetische Kontrollen waren ununterscheidbar von unbehandelten, nicht-diabetischen Kontrollen über das gesamte Experiment, jedoch stieg die Albuminurie mit der Zeit in allen diabetischen Gruppen an, wobei unbehandelte diabetische Tiere die größte Zunahme bei der Albuminurie zeigten. Bei 23 Wochen Diabetes waren alle drei diabetischen Gruppen signifikant unterschiedlich zueinander und zu den nicht-diabetischen Kontrollen hinsichtlich der Albuminurie (39A). PM stellte einen signifikant größeren Schutz gegen Albuminurie bereit als AG. Wie in 39B gezeigt, begannen auch die Plasma-Creatininwerte über normal bei etwa der 17. Woche anzusteigen. Wie bei der Albuminune und Proteinurie beobachtet, schwächten sowohl PM als auch AG den Anstieg in Plasma-Creatinin ab, obwohl PM signifikant wirksamer war als AG. Wirkungen auf die Albuminurie spiegelten sich in den Unterschieden in der Proteinurie wider, die am Ende des Experiments gemessen wurde (39C), obwohl es schien, dass Albuminurie der sensitivere Indikator der Nephropathie ist.
Dyslipidämie. Bei der Autopsie beobachteten wir, dass das Blut von nichtbehandelten diabetischen Tieren augenscheinlich lipämischer war als das Blut von Kontroll- und PM- oder AG-behandelten Tieren. Tests der Plasmalipide (40) zeigten eine merkliche Zunahme in Lipämie in unbehandelten diabetischen Tieren und eine merkliche Korrektur von Hyperlipidämie durch sowohl PM als auch A. G. Triglyceride (40A) stiegen auf im Mittel 700 mg/dl in diabetischen Ratten an, verglichen zu 100 mg/dl in nicht-diabetischen Kontrollen, und waren im Mittel auf 220 bzw. 350 mg/dl durch PM bzw. AG vermindert. Plasma-Cholesterin ( 40B) wurde um etwa 50% erhöht und durch PM normalisiert und durch AG teilweise korrigiert. Obwohl die Zunahme in Lipämie auf eine verminderte Aufnahme van Lipoprotein mit niedriger Dichte in peripheren Geweben aufgrund eines Defekts in der Lipoproteinlipase-Aktivität bei Diabetes zurückzuführen sein könnte, gab es auch einen Hinweis auf eine erhöhte Lipolyse, basierend auf Zunahmen bei sowohl freien Fettsäuren als auch Glycerin im Plasma. Wie in 40C und 40D gezeigt, waren Plasma-freie Fettsäure- und Glycerinkonzentrationen 2–3-fach in diabetischen Ratten erhöht und waren etwa 50% durch Behandlung mit entweder PM oder AG normalisiert.
Redox-Ungleichgewichte. Änderungen im Lipidmetabolismus können von Glucose-induzierten Redox-Ungleichgewichten (Pseudohypoxie) (Williamson et al., 1993, Diabetes 42: 801–813) oder verminderter Gewebsoxygenierung (Mayrovitz und Larsen, 1996, Microvasc. Res. 52: 115–126; Tesfaye et al., 1994, Diabetologia 37: 847–854) (tatsächliche Hypoxie) bei Diabetes herrühren. Diese Änderungen spiegeln sich durch eine Änderung in dem cytosolischen Verhältnis von NADH/NAD⁺ wider, das indirekt durch Messen des Verhältnisses von Lactat zu Pyruvat im Plasma beurteilt werden kann. Wie in 41 gezeigt, wiesen diabetische Tiere signifikant höhere Spiegel an sowohl Lactat als auch Pyruvat im Plasma auf, als auch ein erhöhtes Lactat/Pyruvat-Verhältnis. PM und zu einem geringeren Ausmaß AG korrigierten teilweise diese Mängel in dem oxidativen Stoffwechsel von Kohlenhydraten. Wir haben auch Plasma-β-Hydroxybutyrat- und Acetoacetat-Konzentrationen gemessen, die manchmal als ein Indikator des mitochondrialen Redox-Status verwendet werden. Konzentrationen dieser Metabolite variierten stark bei den Tieren. Während es klare Trends hinsichtlich einer Erhöhung bei β-Hydroxybutyrat und Acetoacetat in diabetischen Tieren und einen Hinweis gab, dass sowohl PM als auch AG diese Änderungen korrigieren, erreichten diese Unterschiede keine statistische Signifikanz.
Anatomische Beobachtungen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, nahmen die durchschnittlichen Nieren- und Lebergewichte in diabetischen Ratten sowohl in absoluten Werten als auch als Teil der gesamten Körpermasse zu. Diese Änderungen im Gewebegewicht wurden teilweise durch PM und AG umgekehrt. Gelegentliche Zysten wurden in Nieren von diabetischen Tieren beobachtet, aber sie waren nicht in arzneimittelbehandelten Gruppen errötet. Es gab keinen Beweis für eine Zunahme von Tumoren in den Hauptorganen noch für andere ungewöhnliche Erkrankungen, die entweder mit einer PM- oder AG-Therapie assoziiert sind. Signifikante Veränderungen in der Nierenmorphologie waren innerhalb der 7-monatigen Dauer des Diabetes in der Ratte beobachtbar, einschließlich einer 30%igen Erhöhung der Dicke der glomeralären Basalmembran (GBM), einer 60%igen Zunahme beim glomerulären Volumen, einer 25%igen Zunahme des Mesangial-Volumenanteils und einer 100%igen Zunahme des Mesangial-Volumens (Tabelle 2). PM bewirkte eine signifikante, jedoch teilweise Korrektur der Zunahme des glomerulären Volumens und es gab einen Trend zu einer Verminderung der GBM-Dicke und des Mesangial-Volumens durch PM. Die Zunahme des Mesangial-Volumenanteils in PM-behandelten Ratten kann von einer unverhältnismäßigen Abnahme des glomerulären Volumens in PM-behandelten Tieren herrühren. Die Wirkungen von AG auf diese Parameter wurden nicht bestimmt.
Tabelle 1. Wirkungen von Diabetes und Arzneimittelbehandlung auf Leberund Nierengewicht
Tabelle 2. Wirkung von Diabetes und Arzneimittelbehandlung auf Nierenmorphometrie^A
Beziehung zwischen biochemischen Parametern und AGEs. Da Lipide signifikant in den diabetischen Ratten erhöht waren und auch durch PM und AG erniedrigt wurden und da Lipide als Quellen für CML (13), CEL (14) und fluoreszierende Produkte, z. B. in Lipofuscin, und Quervernetzungsstrukturen (ausgenommen Pentosidin) in Gewebeproteinen erkannt werden, untersuchten wir die Beziehung zwi schen Plasma-Lipiden, diabetischer Nephropathie und chemischer Modifikation von Proteinen in diabetischen Ratten. Wie in 42 gezeigt, gab es eine starke Korrelation zwischen CML in Hautkollagen und Plasma-Triglyceriden und sowohl CML als auch Triglyceride korrelierten auch mit Mikroalbuminurie. Andere Korrelationen sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Keine dieser Messungen korrelierte mit Glykämie oder Proteinglykierung, da diese Parameter unbeeinflusst waren oder in dem Fall der Glykierung von Kollagen nur leicht durch eine Arzneimitteltherapie beeinflusst waren.
Tabelle 3: Beziehungen zwischen verschiedenen Markern von oxidatativem Stress, Lipämie und Nierenfunktion^A
Diskussion
Wirkung von Pyridoxamin auf diabetische Nephropathie. Diese Studien waren darauf ausgelegt, die Wirksamkeit von PM auf die Bildung von AGEs und Entwicklung einer Nephropathie in STZ-diabetischen Ratten zu untersuchen. In dem vorliegenden Bericht zeigen wir, dass PM die Entwicklung einer Nephropathie in diabetischen Ratten verlangsamte, wie durch Abnahmen von sowohl der Albuminkonzentration im Urin als auch der Plasma-Creatininkonzentration gemessen. Proteinurie, die an dem Ende der Studie gemessen wurde, war auch signifikant in PM-behandelten Ratten vermindert. Ähnliche Wirkungen wurden für sowohl PM als auch AG beobachtet, obwohl PM signifikant wirksamer war, die Zunahmen der Mikroalbuminurie und Creatininämie zu hemmen und die Dyslipidämie und Redox-Ungleichgewichte in diabetischen Ratten zu korrigieren. Diese therapeutischen Wirkungen wurden ohne signifikante Änderungen von Glykämie oder glykiertem Hämoglobin in den diabetischen Ratten erreicht.
Alle diabetischen Tiere wiesen charakteristische Änderungen in der Nierenstruktur auf, einschließlich Nierenhypertrophie (Tabelle 1), beschleunigter Verdickung von glomerulären Basalmembranen (GBM), erhöhtem glomerulärem Volumen und mesangialer Ausdehnung (Tabelle 2). Obwohl PM (und AG) teilweise die Zunahme an Nierengewicht hemmten, wies PM begrenzte Wirkungen auf die ultrastrukturellen Veränderungen in der Niere auf (Tabelle 2). Wirkungen von AG auf die Nierenmorphologie wurden in dieser Studie nicht gemessen, aber andere Studien über eine AG-Behandlung von den STZ-diabetischen Ratten haben gemischte Ergebnisse ergeben. Eine Studie beschrieb eine Hemmung der GBM-Verdickung in den Lewis-Ratten (Ellis und Good, 1991, Metabolism 40: 1016–1019), während es zwei andere Berichte gibt, dass AG keine Wirkung auf eine GBM-Verdickung in Sprague-Dawley-Ratten aufwies (Oturai et al., 1996, APMIS 104: 259–264; Soulis-Liparota et al., 1991, Diabetes 40: 1328–1334).
In einer der letzteren Studien hemmte jedoch AG teilweise eine mesangiale Ausdehnung (Soulis-Liparota et al., 1991, Diabetes 40: 1328–1334). In einem verwandten Bericht hemmte AG die Zunahme der glomerulären Basalmembran-Verdickung und des mesangialen Teilvolumens in Otsuka Long-Evans Tokushima-Fettratten, einem Modell für Typ 2-Diabetes (Yamauchi et al., 1997, Diab. Res. Clin. Fract. 34: 127–133). Die starken Wirkungen von AGE-Inhibitoren auf eine diabetische Nephropathie, aber die unterschiedlichen Wirkungen auf die Nierenmorphologie legen nahe, dass die morphologischen Nierenveränderungen durch eine Hyperfiltration oder Hypertension (nicht gemessen) oder andere Aspekte von Hämodynamiken der Niere angetrieben werden könnten, die in diesen Experimenten nicht gemessen wurden. Zukünftige Studien hinsichtlich zellulärer Veränderungen in der diabetischen Niere, z. B. Veränderungen der Podozyten- und Mesangial-Zellzahl, können einen besseren Einblick in die Beziehung zwischen den strukturellen und funktionellen Veränderungen in der diabetischen Niere bereitstellen.
Metabolische Wirkungen von AGE-Inhibitoren. Obwohl Lipid-senkende Wirkungen von AG in diabetischen Menschen kürzlich beschrieben wurden (Bucala et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 9441–9445), war die Größenordnung der Wirkungen von PM und AG auf Plasma-Cholesterin und Triglyceride in den STZ-diabetischen Ratten überraschend. Diese Veränderungen zusammen mit den Wirkungen auf freie Fettsäuren und Glycerin im Plasma zeigen an, dass AG und PM zusätzlich zu ihrer AGE-hemmenden Aktivität zentrale Reaktionswege des Lipidmetabolismus beeinflussen. Da es eine geringe strukturelle Ähnlichkeit zwischen AG und PM gibt, ist es unwahrscheinlich, dass die Wirkungen von PM auf seine Umwandlung zu Pyridoxalphosphat oder anderen B6-Vitameren herrühren.
Hyperglykämie ist dafür bekannt, Verschiebungen der intrazellulären Verhältnisse von Redox-Co-Enzymen sowohl in vitro als auch in vivo zu induzieren, was zu einem Zustand der Pseudohypoxie führt (Williamson et al., 1993, Diabetes 42: 801– 813). Die Größenordnung der Zunahme in Plasma-Lactat und des Lactat zu Pyruvat-Verhältnisses in den diabetischen Ratten legt eine Redox-Verschiebung oder tatsächliche Hypoxie in den Hauptgeweben in dem Körper, z. B. Muskel oder Nerv, nahe. Diese Veränderungen können von einer verminderten Perfusion und Oxygenierung von peripherem Gewebe herrühren und spielen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von diabetischer Mikroangiopathie und Neuropathie in sowohl Menschen als auch Tiermodellen (Mayrovitz und Larsen, 1996, Microvasc. Res. 52: 115– 126; Tesfaye et al., 1994, Diabetologia 37: 847–854; Cameron und Cotter, 1994, Diab. Metab. Rev. 10: 189–224; Boulton und Malik, 1999, Organ specific vascular changes, in Diabetic Angiopathy, Tooke, J. E., Hrsg., New York, Oxford University Press, Seiten 267–275).
Ein kürzlicher Bericht (Pyke et al., 1999, Diabetes 48 (Suppl. 1) 593 (Abstr.)), dass die diabetische Niere auch hypoxisch ist, legt nahe, dass Hypoxie ein üblicher Mechanismus sein kann, der zu einem veränderten Metabolismus und Entwicklung einer Erkrankung bei Diabetes beiträgt. Die erhaltene Zunahme eines anaeroben Metabolismus von Kohlenhydraten legt nahe, dass der aerobe Metabolismus von Lipiden auch beeinträchtigt sein könnte, was zum Teil zu der Hyperlipidämie in den diabetischen Ratten beiträgt. Es ist möglich, dass alle diese Wirkungen sekundär zur Hemmung einer AGE-Bildung in dem Gefäßsystem sind, aber wir können vielfältige Wirkmechanismen der Arzneimittel nicht ausschließen. Eine Untersuchung der Kinetiken der Wirkungen von PM auf eine Gewebe-Sauerstoffspannung, einen peripheren Gefäßwiderstand, Lipidkonzentrationen und das Lactat : Pyruvat-Verhältnis im Plasma der diabetischen Ratten wird wichtige Einblicke in den Mechanismus einer Arzneimittelwirkung und die Rolle von Hypoxie in der Entwicklung von metabolischen und funktionellen Veränderungen in den STZ-diabetischen Ratten geben.
Wirkmechanismus von PM. Die Wirkungen von PM und AG stimmen mit der AGE-Hypothese über diabetische Komplikationen überein. Beide Arzneimittel hemmen die Bildung von CML und CEL theoretisch dadurch, dass reaktive Carbonyl-Zwischenprodukte abgefangen werden, die an einer AGE-Bildung beteiligt sind, und sie vermindern auch die Entwicklung einer diabetischen Nephropathie. Jedoch legt das Versagen von entweder PM oder AG, eine Pentosidin-Bildung zu beeinflussen, kombiniert mit den starken Korrelationen zwischen Triglyceriden und CML und zwischen Triglyceriden und Albuminurie oder Creatininämie nahe, dass Lipide sowohl bei der Bildung von AGEs als auch der Entwicklung von Nephropathie wichtig sein könnten. Tatsächlich werden sowohl CML als auch CEL während Lipid-Peroxidationsreaktionen gebildet (unveröffentlichte Ergebnisse und Fu et al., 1996, J Biol. Chem. 271: 9982–9986) und es könnte argumentiert werden, dass die Abnahme ihrer Konzentration in Kollagen ein direktes Ergebnis der Abnahme von Plasma-Triglyceriden ist, die durch die AGE-Inhibitoren bewirkt wird. Jedoch zeigt die Tatsache, dass Pentosidin, ein Produkt, das ausschließlich von Kohlenhydraten abstammt (Pyke et al., 1999, Diabetes 48 (Suppl. 1) 593 (Abstr.)), sowohl in Hautals auch Nierenkollagen von diabetischen Ratten erhöht ist, dass eine Kohlenhydrat-Autoxidation und eine Glykoxidation zur AGE-Bildung beitragen. Obwohl weder PM noch AG die Zunahme von Pentosidin in Hautkollagen hemmten, kann dies die Tatsache widerspiegeln, dass es schwieriger ist, eine Bildung von Pentosidin, verglichen zu CML, in vitro zu hemmen (Dyer et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 11654– 11660; Litchfield et al., 1999, Int. J. Biochem., im Druck). Die relativen Zunahmen von CML, CEL und Pentosidin sind auch in diabetischen Ratten ähnlich, verglichen zu Kontrollratten, übereinstimmend mit ihrer Abstammung aus einem gemeinsamen Vorläufer, der in dem Fall von Pentosidin eine Kohlenhydratgestalt aufweisen muss. Die relativen Spiegel von CML und Pentosidin in der Haut (Degenhardt et al., im Druck) und Nierenkollagen sind auch mit den relativen Ausbeuten dieser Verbindungen während einer Modifikation von Kollagen durch Glucose in vitro übereinstimmend (Dyer et al., 1991, J. Biol. Chem. 266: 11654–11660; Litchfield et al., 1999, Int. J. Biochem., im Druck), d. h. eine 50–100-fache höhere Konzentration von CML im Vergleich zu Pentosidin. Folglich scheint es am wahrscheinlichsten, dass alle drei dieser Produkte als auch die erhöhte Fluoreszenz und Quervernetzung von diabetischem Kollagen von Glykoxidationsreaktionen abstammen.
Dyslipidämie und diabetische Komplikationen. Dyslpidämie ist als ein Risikofaktor für eine Entwicklung von diabetischer Nephropathie erkannt worden (Oda und Keane, 1997, Kidney Internat. 52, Suppl. 2: S36–S38; Smulders et al., 1997, Eur. J. Clin. Inuest. 27: 997–1002), aber sie ist auch im Allgemeinen mit Nephropathie unabhängig von Diabetes assoziiert (Guijarro und Keane, 1993, Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2: 372–379; Salto, T., 1997, Tohoku J. Exp. Med. 131, 321–337). Es scheint am wahrscheinlichsten, dass sich die Abnormalitäten in dem Lipidmetabolismus früher bei Diabetes entwickelt hätten, im Zusammenspiel mit der Entwicklung von Hyperglykämie. In diesem Fall hätte eine Dyslipidämie die Entwicklung von Nephropathie beschleunigt, möglicherweise über eine lokalisierte Oxidation von Lipoproteinen, die in der Niere (oder dem Gefäßsystem) eingeschlossen sind, und eine anschließende Bildung von fortgeschrittenen Lipoxidations-Endprodukten (ALEs). Sowohl AG (Picard et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6876– 6880; Giardino et al., 1998, Diabetes 47: 1114–1120) als auch PM (unveröffentlichte Ergebnisse) sind dafür bekannt, eine Modifikation von Proteinen während Lipid-Peroxidationsreaktionen zu inhibieren, was einen Mechanismus zusätzlich zu einer Hemmung von Glykoxidationsreaktionen nahe legt, durch den diese Arzneimittel einen Schutz gegen diabetische Nephropathie bereitstellen. Eine gemeinsame Wirkung auf die Bildung von sowohl AGEs als auch ALEs kann zu einer vermindertem Modifikation (Verdickung, Versteifung) von vaskulärem Kollagen, verbesserter peripherer Perfusion und Oxygenierung, Normalisierung des Lipidmetabolismus und Korrektur der Dyslipidämie führen. Die Ursache-Wirkungs-Beziehungen zwischen diesen Erkrankungen können durch die vorliegenden Experimente und verfügbaren Daten nicht bestimmt werden, jedoch kann eine Messung von ALEs in Geweben von Kontroll-, diabetischen und PM-behandelten diabetischen Tieren einen breiteren Bereich von Wirkungen von AGE-Inhibitoren auf die chemische Modifikation von Proteinen und die Entwicklung von Komplikationen bei Diabetes aufdecken.
Es gibt vielfältige Ursachen für Dyslipidämie, einschließlich genetischen, Nahrungsfaktoren und Erkrankung als auch ein komplexes Zusammenspiel zwischen diesen verschiedenen Ursachen von Dyslipidämie. Verfahren zum Verhindern und/oder Behandeln von Dyslipidämie können sodann von ihren ursächlichen Faktoren abhängen. Es wurde kürzlich beschrieben, dass Pyridoxamin teilweise erhöhte Serumlipidspiegel senkt, die durch eine exzessive Lipidaufnahme (d. h. Ernährung mit viel Cholesterin) in einem Rattenmodell verursacht wurden (Speck, US-PS 5,288,716 ). Speck diskutiert nicht andere Ursachen von Hyperlipidämie wie Nierenversagen oder genetische Defekte des Lipidmetabolismus. Vor den in der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Daten existierten keine Daten für die Verwendung von Pyridoxamin, um Hyperlipidämie, die durch einen defekten Lipidmetabolismus verursacht wird, zu behandeln oder zu verhindern. Insbesondere stellten Speck et a1. keine Anleitung hinsichtlich der Wirkung von Pyridoxmin beim Behandeln oder Verhindern einer mit Diabetes assoziierten Hyperlipidämie bereit, eines Zustands, der dafür bekannt ist, vielzählige Stoffwechselwege dramatisch zu beeinflussen und weitreichende physiologische Wirkungen aufzuweisen.
Zusammenfassend haben wir gezeigt, dass die AGE-Inhibitoren PM und AG die chemische Modifikation von Gewebsproteinen hemmen, die Entwicklung von Nephropathie verlangsamen und Dyslipidämie in den STZ-diabetischen Ratten im Wesentlichen umkehren. Wir haben auch gezeigt, dass PM und AG im Wesentlichen Redox-Ungleichgewichte in den STZ-diabetischen Ratten umkehren. Systemische Redox-Ungleichgewichte sind ein Zeichen für Pseudohypoxie, Hypoxie und Ischämie in Geweben, Zustände, die eine wichtige Rolle in vielen Erkrankungsstadien spielen, eingeschlossen in nicht-begrenzender Weise diabetische Komplikationen, neurodegenerative Erkrankungett wie Alzheimer und amyotrophe Lateralsklerose, Schock, Entzündungsschäden und -erkrankungen, Altern und Gewebsischämie (siehe z. B. Andrus et al., J. Neurochem. 71: 2041–2048 (1998); Hall et al., J. Neurosci. Res. 53: 66–77 (1998); Smith et al., J. Histochem. Cytochem. 46: 731– 735 (1998); Smith et al., J. Neurochem. 70: 2212–2215 (1998); Russell et al., Arch. Biochem. Biophys. 370: 236–239 (1999); Flowers und Zimmerman, New Horizons 6: 169–180 (1998); Piedimonte et al., J. Infect. Disease 176: 655–664 (1997)). Folglich sind Verfahren zum Behandeln und Verhindern von Redox-Ungleichgewichten beim Behandeln dieser Zustände geeignet.
Im Allgemeinen schien PM vergleichbar zu AG bei einer Hemmung von nichtenzymatischen Modifikationen von Kollagen zu sein, aber es war signifikant wirksamer beim Hemmen der biochemischen und physiologischen Veränderungen in den diabetischen Ratten. Unsere Ergebnisse legen ein komplexes Netz von Wechselwirkungen zwischen der veränderten Chemie und Biochemie von sowohl Kohlenhydraten als auch Lipiden bei Diabetes nahe. Toxikologische Tierstudien haben gezeigt, dass PM eine niedrige Toxizität und ein gutes Sicherheitsprofil aufweist, und Phase I-klinische Studien sind in Arbeit in einem Versuch, die Wirksamkeit von PM für eine Behandlung von diabetischen Komplikationen zu untersuchen.
Die Plasmaspiegel von Cholesterin und Triglyceriden waren auch durch PM in Studien mit diabetischen Ratten gesenkt. Der Mechanismus, durch den PM Cholesterin und Triglyceride senken würde, ist nicht bekannt, legt aber nahe, dass PM bestimmte enzymatische Wege von Cholesterinsynthese und -abbau beeinflusst. Zum Beispiel kann PM die Hydroxymethylglutaryl-Coenzym A (HMG-CoA)-Reduktase oder Angiotensin-converting-Enzym (ACE) hemmen. Das Absenken von Plasma-Creatinin und Albumin im Urin, von einer AGE-Bildung in der Haut und von Gesamtcholesterin und Triglyceriden in einem diabetischen Tiermodell stützt die Hypothese, dass PM ein vielseitiges Arzneimittel ist, das fähig ist, verschiedene veränderte metabolische Prozesse und Proteinschäden, die mit der Entwicklung von Komplikationen assoziiert sind, die von sowohl Diabetes als auch Dyslipidämie herrühren, zu hemmen.
Wir haben auch Belege bereitgestellt, die nahe legen, dass sich eine Verabreichung von PM als geeignet für die Behandlung einer Gefäßerkrankung als auch für die Verhinderung von Komplikationen von Diabetes, die mit einer Gefäßfehlfunktion, einschließlich Neuropathie, Retinopathie und Wundheilungsmängeln in Diabetes, assoziiert sind, als auch für eine Behandlung einer Gefäßerkrankung, Gewebshypoxie und Ischämie in Patienten ohne Diabetes erweisen kann.

Claims

Verwendung einer Menge, die zum Behandeln von Diabetes-assoziierter Hyperlipidämie wirksam ist, einer Verbindung der allgemeinen Forme!
worin R, eine CH₂NH₂-, CH₂SH-, COOH-, CH₂CH₂NH₂-, CH₂CH,SH- oder CH₂COOH-Gruppe ist, R₂ und R₆H-Atome, OH-, SH-, NH₂-, C_1-18-Alkyl-, Alkoxy- oder Alkengruppen sind, R₄ und R₅H-Atome, C_1-18-Alkyl-, Alkoxy- oder Alkengruppen sind, Y ein N- oder C-Atom ist, so dass, wenn Y ein N-Atom ist, R₃ nicht vorhanden ist, und, wenn Y ein C-Atom ist, R₃ eine NO₂- oder eine andere elektronenziehende Gruppe ist, und Salzen davon zum Herstellen eines Medikaments zum Behandeln von Diabetes-assoziierter Hyperlipidämie in einem Säuger.
Verwendung einer Menge, die zum Behandeln von zellulären Redox-Ungleichgewichten wirksam ist, einer Verbindung der allgemeinen Formel
worin R, eine CH₂NH₂-, CH₂SH-, COOH-, CH₂CH₂NH₂-, CH₂CH₂SH- oder CH₂COOH-Gruppe ist, R₂ und R₆ H-Atome, OH-, SH-, NH₂-, C_1-18-Alkyl-, Alkoxy- oder Alkengruppen sind, R₄ und R₅ H-Atome, C_1-18-Alkyl-, Alkoxy- oder Alkengruppen sind, Y ein N- oder C-Atom ist, so dass, wenn Y ein N-Atom ist, R₃ nicht vorhanden ist, und, wenn Y ein C-Atom ist, R₃ eine NO₂- oder eine andere elektronenziehende Gruppe ist, und Salzen davon zum Herstellen eines Medikaments zum Behandeln eines zellulären Redox-Ungleichgewichts in einem diabetischen Säuger.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das zelluläre Redox-Ungleichgewicht durch Hypoxie oder Pseudohypoxie verursacht wird.
Verwendung nach Anspruch 3; wobei. die Hypoxie oder Pseudohypoxie zu einem erhöhten NADH/NAD-Verhältnis führt.
Verwendung einer Menge, die zum Behandeln von Diabetes-assoziierter Nypercholesterinämie wirksam ist, einer Verbindung der allgemeinen Formel
worin R, eine CH₂NH₂-, CH₂SH-, COOH-, CH₂CH₂NH₂-, CH₂CH₂SH- oder CH₂COOH-Gruppe ist, R₂ und R₆ N-Atome, OH-, SH-, NH₂-, C_1-18-Alkyl-, Alkoxy- oder Alkengruppen sind, R₄ und R₅ H-Atome, C_1-18-Alkyl-, Alkoxy- oder Alkengruppen sind, Y ein N- oder C-Atom ist, so dass, wenn Y ein N-Atom ist, R₃ nicht vorhanden ist, und, wenn Y ein C-Atom ist, R₃ eine NO₂- oder eine andere elektronenziehende Gruppe ist, und Salzen davon zum Herstellen eines Medikaments zum Behandeln von Diabetes-assoziierter Hypercholesterinämie in einem Säuger.
Verwendung einer Menge, die zum Behandeln von Diabetes-assoziierter Hypertriglyceridämie wirksam ist, einer Verbindung der allgemeinen Formel
worin R, eine CH₂NH₂-, CN₂SH-, COOH-, CH₂CH₂NH₂-, CH₂CH₂SH- oder CN₂COOH-Gruppe ist, R₂ und R₆ N-Atome, OH-, SH-, NH₂-, C_1-18-Alkyl-, Alkoxy- oder Alkengruppen sind, R₄ und R₅ N-Atome, C_1-18-Alkyl-, Alkoxy- oder Alkengruppen sind, Y ein N- oder C-Atom ist, so dass, wenn Y ein N-Atom ist, R₃ nicht vorhanden ist, und, wenn Y ein C-Atom ist, R₃ eine NO₂- oder eine andere elektronenziehende Gruppe ist, und Salzen davon zum Herstellen eines Medikaments zum Behandeln von Diabetes-assoziierter Hypertriglyceridämie in einem Säuger.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Verbindung Pyridoxamin ist.