DE69005270T2

DE69005270T2 - Verfahren zur optischen analyse.

Info

Publication number: DE69005270T2
Application number: DE69005270T
Authority: DE
Inventors: John Worthington Weybridge Surrey Kt13 0Ua Attridge
Original assignee: ARS HOLDING 89 NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1989-06-22
Filing date: 1990-06-21
Publication date: 1994-07-07
Anticipated expiration: 2010-06-22
Also published as: ATE98773T1; AU619120B2; EP0429612B1; WO1990015985A1; EP0429612A1; US5166515A; JP2612641B2; CA2033168A1; DK0429612T3; JPH04501612A; ES2047334T3; DE69005270D1; AU5827790A; CA2033168C

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur optischen Analyse von dämpfungsgekoppelten Signalen und eine Vorrichtung zur Verwendung solcher Verfahren.
Insbesondere betrifft die Erfindung Verfahren und eine Vorrichtung zum Nachweis von dämpfungsgekoppelten Signalen, erzeugt während Bestimmungsverfahren für Liganden/spezifische Bindungspartner, insbesondere bei Immunoassays.
Der Stand der Technik offenbart verschiedene analytische Vorrichtungen zur Handhabung und Messung geringer Probenvolumina und die Verwendung solcher Vorrichtungen wie Verfahren zur optischen Analyse.
Zum Beispiel beschreibt die US-Patentschrift 3 939 350 die optische Messung von fluoreszierendem Material, das an der Oberfläche eines festen transparenten Prismas gebunden ist, durch ein Verfahren, das die Einzeltotalreflektion und die Wechselwirkung der dämpfungsgekoppelten Welle an der Oberfläche des Prismas mit dem gebundenen Material einbezieht.
EP-A-75 353 bezieht sich auf die exponentielle Dämpfung (evanescent) äußerer Strahlung aufgrund von Licht, das sich longitudinal in einer Phase ausbreitet und auf dessen Wechselwirkung mit Beschichtungen.
EP-A-170 376 beschreibt unter anderem Verfahren der optischen Analyse von Fluoreszenz, die aus einem Wellenleiter austritt, der einen Teil einer chemischen Testvorrichtung darstellt, während EP-A-171 148 im einzelnen bestimmte chemische Testvorrichtungen, nämlich Fluoreszenz-Kapillarfüllvorrichtungen beschreibt und Verfahren zu deren Herstellung.
Wie in EP-A-171 148 beschrieben, besteht eine Fluoreszenz-Kapillarfüllvorrichtung (forthin FCFD genannt) typischerweise aus zwei Teilen transparenten Materials, zum Beispiel Glas, getrennt durch einen engen Spalt. Eine Platte wirkt als optischer Wellenleiter und trägt ein immobilisiertes Reagenz, das zur Ausführung des Tests in der Vorrichtung geeignet ist. Zur Verwendung in einem Immunoassay kann das immobilisierte Reagenz zum Beispiel ein Antikörper zu einem Antigen sein, das detektiert werden soll und eine der Platten kann ein auflösbares Reagenz tragen, das mit Fluoreszenzfarbstoff markiertes Antigen umfaßt. Wenn eine Probe an einem Ende des FCFD vorliegt, wird es in den Spalt durch Kapillarwirkung hineingezogen und löst das Reagenz. Bei einer Konkurrenzbestimmung tritt das fluoreszierend markierte Antigen mit dem Probenantigen für eine begrenzte Zahl an Antikörperbindungsstellen, die auf dem Wellenleiter immobilisiert sind, in Konkurrenz. Aufgrund dessen, daß der Kapillarspalt eng ist (typischerweise etwa 100 µm) führt die Reaktion im allgemeinen in kurzer Zeit zur Vollständigkeit, möglicherweise in weniger als 5 Minuten. Bei einem Sandwichassay trägt der Wellenleiter einen spezifischen Bindungspartner für den zu bestimmenden Liganden und eine der Platten trägt ein unlösliches Reagens, umfassend einen weiteren speziellen Bindungspartner, der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist. Bei einem Sandwichimmunoassay für ein Antigen bildet ein Probenantigen einen Sandwichkomplex mit einem fluoreszierend markierten Antikörper und einen Antikörper, der auf dem Wellenleiter immobilisiert ist. Somit ist die Menge an fluoreszierend markiertem Antikörper, der indirekt an den Wellenleiter aufgrund Komplexbildung gebunden wird, eine Funktion der Konzentration an Antigen in der Probe.
Unter dem hier verwendeten Ausdruck "Antigen" werden sowohl Antigenarten (zum Beispiel Proteine, Bakterien, Bakterienfragmente, Zellen, Zellfragmente und Viren) als auch Haptene, die unter bestimmten Bedingungen antigenisch werden, verstanden.
Wenn ein FCFD in einem Assay verwendet wird, vermeidet Dämpfungswellenkopplung das Erfordernis für einen Trennungs- oder Waschschritt. Wenn das markierte Reagenz durch eine Lichtquelle geeigneter Wellenlänge angeregt wird, tritt Fluoreszenzemission sowohl von Fluorophoren in der flüssigen Phase als auch von Fluorophoren, die direkt oder indirekt an den Wellenleiter gebunden sind, auf. die optischen Eigenschaften der daran beteiligten Medien sind derart beschaffen, daß die meiste Fluoreszenz, die von den oberflächengebundenen Fluorophoren herrührt, aus der Querkante des Wellenleiters in einem Winkel zur Normalen austritt, dessen Größe geringer ist als die Größe eines Winkels a, während im wesentlichen die gesamte von den Fluorophoren herrührende Fluoreszenz in der Flüssigphase aus der Kante des Wellenleiters mit einem Winkel zur Normalen austritt dessen Größe größer ist als die Größe von α (α ist -1/2π< α< 1/2π). Der Wert a hängt zwar von den Brechungsindices der flüssigen Lösung in der Vertiefung und von dem Material des Wellenleiters und von der Wellenlänge des einbezogenen Lichts ab, wird jedoch annähernd wiedergegeben durch
α arcsin (n&sub2;² - n&sub1;²)¹/²,
worin n&sub1; den Brechungsindex der flüssigen Phase bedeutet und n&sub2; den Brechungsindex des festen Wellenleiters darstellt. Somit ist unter idealen Bedingungen die Winkeldiskriminierung von aus der Kante des Wellenleiters austretender Fluoreszenz ausreichend, um die unterschiedlichen Emissionsignale zu trennen.
Obwohl die Diskussion hierin mit Hinweis auf die Winkel zur Normalen ausgeführt wird, deren Größe mit der Größe von α, wie hier definiert, verglichen wird, ist es selbstverständlich, daß diese Winkel von der Normalen entweder im positiven oder negativen Sinne abweichen können.
In der Praxis ist jedoch die Empfindlichkeit von Assays, die einfach selektive Winkelunterscheidungen von Fluoreszenzemission anwenden, durch eine Anzahl experimenteller Faktoren begrenzt, einschließlich unter anderem: nicht vollständig wirksames Ausfiltern des Lichtes mit der Anregungswellenlänge und sekundäre Fluoreszenz in allen Richtungen aus dem optischen Filter (typischerweise ein kolloidales Glas) und Aberration der Linsen, die zum Bündeln der Fluoreszenzemission auf die Detektoren verwendet werden.
Überraschenderweise haben wir gefunden, daß Assayverfahren, wie jene vorstehend beschriebenen, ausgeführt werden können ohne das Erfordernis übermäßigen Ausfilterns oder kostenaufwendiger oder komplexer Linsensysteme, unter Verwendung anstelle dessen einer zusätzlichen optischen Struktur, eng angeordnet an der Kante des Wellenleiters unter Bereitstellung wirksamer selektiver Winkelunterscheidung der Fluoreszenzemission oder analoger Phosphoreszenz- oder Lumineszenzemission.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung stellen wir daher ein Verfahren zur optischen Analyse einer Testprobe mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder lumineszierenden Eigenschaften bereit, wobei die Probe teilweise in einer flüssigen Phase vorliegt und teilweise direkt oder indirekt an eine benachbarte Festkörperoberfläche gebunden ist, umfassend die Schritte
(i) Bereitstellen, als Festkörperoberfläche, eine Oberfläche eines festen optischen Wellenleiters, durchlässig zumindest bei Wellenlängen der mit der Analyse verbundenen Strahlung;
(ii) Messen des aus dem an der festen Oberfläche gebundenen Probenmaterial stammenden Lichts, das sich durch den Wellenleiter ausbreitet und aus ihm mit einer Winkelabweichung von der optischen Achse des Wellenleiters in einem Winkel kleiner als die Größe von α austritt, mit
α arcsin (n&sub2;² - n&sub1;²)¹/²,
worin n&sub2; der Brechungsindex des Materials des Wellenleiters ist und n&sub1; der Brechungsindex der benachbarten Flüssigkeit; und
(iii) Ausschluß von der Messung im wesentlichen allen Lichtes, das aus dem Wellenleiter in einem Winkel austritt, der von der optischen Achse mit α oder mehr abweicht, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß eine optische Struktur, umfassend eine Schicht transparenten Materials mit dem Brechungsindex n&sub3; direkt angeordnet zwischen zwei Schichten transparenten Materials mit dem Brechungsindex n&sub4; - die Materialien der Brechungsindices n&sub3; und n&sub4; so ausgewählt sind, daß
n&sub3;² - n&sub4;² n&sub2;² - n&sub1;²,
und die Material schichten mit dem Brechungsindex n&sub4; derart angepaßt sind, daß der Hauptanteil des in sie aus der Schicht mit dem Brechungsindex n&sub3; geleiteten Lichtes nicht zurückgeführt wird in die Schicht mit dem Brechungsindex n&sub3; - eng an der Kante des Wellenleiters angeordnet ist, so daß im wesentlichen alles dämpfungsgekoppelte Licht, austretend aus der Kante des Wellenleiters in die Schicht mit dem Brechungsindex n&sub3; überführt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die äußeren Oberflächen nur der Schichten des Materials mit dem Brechungsindex n&sub4; mit einem lichtabsorbierenden Material beschichtet, so daß Licht, das durch die Schichten geleitet wird, in bedeutendem Maße an der Grenzschicht des lichtabsorbierenden Materials und des Materials mit dem Brechungsindex n&sub4; abgeschwächt wird. Im allgemeinen ist die Abschwächung an der Grenzfläche derart, daß mindestens 80 % des auf die Grenzfläche auftreffenden Lichtes absorbiert werden. Andere Ausführungsformen werden nachstehend beschrieben.
Es versteht sich aus vorstehender Diskussion, daß der Brechungsindex n&sub2; größer ist als n&sub1; und folglich n&sub3; größer ist als n&sub4;.
Obwohl aus Gründen praktischer Zweckmäßigkeit die äußeren Oberflächen der Schichten des Materials mit dem Brechungsindex n&sub4; der optischen Struktur im wesentlichen parallel sind, ist dies nicht wesentlich und die optische Struktur kann verschiedene geometrische Formen zum Beispiel mit einem trapezförmigen Querschnitt annehmen.
In einem weiteren Aspekt umfaßt die Erfindung eine Vorrichtung, geeignet zur Ausführung eines Verfahrens der optischen Analyse, wie vorstehend definiert, umfassend
(i) ein Testobjekt für eine Scheibe oder eine Zelle, befestigt an der Testobjektanordnung, ausgestaltet ein Probenmaterial mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder lumineszierenden Eigenschaften aufzunehmen, wobei das Testobjekt einen transparenten Festkörper, zum Beispiel eine Platte oder Faser darstellt, der als Wellenleiter wirkt und an dessen Oberfläche das Probenmaterial aus einer Lösung oder der Flüssigkeitsdispersion, die mit dem Festkörper in Kontakt steht, gebunden werden kann und
(ii) eine wie vorstehend definierte optische Struktur, die bei Gebrauch derart angeordnet werden kann, daß wenn ein Testobjekt an der Testobjektanordnung sich befindet, die optische Struktur optisch an den transparenten Festkörper des Testobjektes gekoppelt ist, so daß Licht, das sich in dem transparenten Festkörper ausbreitet, von der optischen Struktur empfangen werden kann.
Um den Informationsabbau der mit dem Lichtsignalaustritt aus dem transparenten Festkörper zum Beispiel als Ergebnis von Verformungen der optischen Kante des Körpers zu minimieren, kann es für den Körper wünschenswert sein, mit Hilfe einer indexabstimmenden Technik an die optische Struktur optisch gekoppelt zu werden.
Um daher das Streuen des aus einer optischen Kante eines optischen Wellenleiters austretenden Lichtes zu vermindern, wird die optische Kante in engem Kontakt mit einer Brechungsindex-abstimmenden Substanz gehalten, die selbst ebenfalls einen weiteren optischen Bestandteil bildet oder einen weiteren optischen Bestandteil eng kontaktiert.
Mit "indexabstimmender Substanz" wird eine Substanz bezeichnet, die einen Brechungsindex ähnlich jenem des Materials des Wellenleiters aufweist, d.h. mit einem Brechungsindex, der von dem des Wellenleiters bis zu 20 % abweicht.
Enger Kontakt zwischen der optischen Kante und der indexabstimmenden Substanz kann erreicht werden zum Beispiel durch Auswahl einer indexabstimmenden Substanz, die als Flüssigkeit oder Gel vorliegt oder durch Anwenden einer Vorstufe für einen im wesentlichen transparenten Festkörper, der schichtweise auf die Oberfläche der optischen Kante aufgetragen wird vor anschließendem Härten oder anderweitigem Verfestigen. Beispiele geeigneter indexabstimmender Stoffe sind Zedernöl, Kanadabalsam, Silicone, Ethanol, Pentanol, Phenylamin, Benzol, Glycerin, Paraffinöl, Terpentin, Silicongele, Kunststoffe wie Silanelastomere, optische Kitte oder Klebstoffe, ausgewählt aus geeigneten Epoxid- oder Acrylatsystemen.
Das Testobjekt kann zum Beispiel eine Vorrichtung sein des allgemeinen in der EP-A-171 148 beschriebenen Typs.
Falls erwünscht, können das Testobjekt (i) und die optische Struktur (ii) zusammengekoppelt werden, so daß sie eine integrale Struktur bilden.
Die Vorrichtung kann des weiteren ein oder mehrere nachstehende Bestandteile umfassen: einen Photodetektor derart angeordnet, daß bei Verwendung die optische Struktur optisch an den Photodetektor gekoppelt ist, so daß Licht, das sich in der optischen Struktur ausbreitet, von dem Photodetektor nach seinem Austritt empfangen werden kann; eine Lichtquelle derart angeordnet, daß bei Verwendung das Testmaterial mit Licht bestrahlt werden kann (zum Beispiel in einem quer zur Hauptrichtung der Lichtausbreitung in dem Wellenleiter verlaufenden Winkel, zum Beispiel bei oder um 90º) so daß das Licht aus dem Testmaterial in und sowohl durch den transparenten Festkörper des Testobjekts als auch durch die optische Struktur über innere Totalreflektionen zu dem Photodetektor geleitet wird; ein optisches Filter (dessen enger Kontakt mit der optischen Struktur gesichert werden kann), um Differentialtransmission durch den optischen Gang der bei diesem Verfahren einbezogenen Wellenlängen des Lichts zuzulassen und ein Mikroprozessor oder eine ähnliche Verarbeitungsanlage, in gewünschter Weise angepaßt zur Analyse des aus dem Photodetektor austretenden elektrischen Signals.
Die Erfindung wird nun im einzelnen mit Bezug auf Fluoreszenz beschrieben, selbstverständlich gelten analoge Betrachtungen für Phosphoreszenz oder Lumineszenz.
Die Erfindung beruht auf der Winkelaufteilung des aus dem Wellenleiterteil des Testobjekts austretenden Lichtes, das von der Menge an Fluorophoren abhängig ist, die in der Lösung vorliegen und jenen, die an der Oberfläche des Wellenleiters adsorbiert sind. Geeignete Materialien für den Wellenleiter sind bekannt (siehe zum Beispiel EP-A-170 376 und EP-A-171 148) und schließen unter anderem Glas, Quarz und Kunststoffmaterialien ein; in diesen Fällen tritt Licht aus dem Material in eine Flüssigkeit, benachbart zum Wellenleiter, wobei die Flüssigkeit einen Brechungsindex nahe dem von Wasser hat, d.h. geringer als jener des Wellenleiters, das aus dem Wellenleiter in relativ großem Winkel zu dessen Achse austritt. Fluoreszierende, phosphoreszierende oder lumineszierende Moleküle, die an der Oberfläche des Wellenleiters gebunden sind, können zusätzlich Licht in Winkel emittieren, die gemäß klassischer Strahlenoptik als "verboten" gelten (d.h. Winkel, die größer sind als der kritische Winkel für die Wellenleiter/Probengrenzfläche), bekannt als dämpfungsgekoppeltes Wellenphänomen.
Im Fall eines Glaswellenleiters und einer wässerigen Lösung und Fluoreszenzlicht einer Wellenlänge von 510 nm, beträgt der Winkel α, wiedergegeben durch
α arcsin (n&sub2;² - n&sub1;²)¹/²,
etwa ±47º. Somit kann Licht von einer adsorbierten Schicht von dem, das aus der Flüssigkeit durch Austritt des ersteren Lichts aus dem Wellenleiter herrührt, über einen breiteren Winkelbereich unterschieden werden, einschließlich Winkeln, die von der Achse des Wellenleiters durch weniger als etwa 47º abweichen.
Die optische Struktur des erfindungsgemäßen Verfahrens führt bei Verwendung zu einer erhöhten Diskriminierung durch Führen im wesentlichen allen von den oberflächengebundenen Fluorophoren herrührenden dämpfungsgekoppelten Lichtes, während Strahlung, die aus dem Wellenleiter des Testobjekts mit größeren Winkeln austritt, beseitigt wird. Die optische Struktur kann nahe dem Ende des Wellenleiters des Testobjekts angeordnet werden, wodurch ein Verlust an fluoreszierender Strahlung vermindert wird. Die selektive Winkelunterscheidung der Fluoreszenz wird erreicht unter Verwendung einer optischen Struktur, deren Schichten aus Materialien mit geeignet ausgewähltem Brechungsindex bestehen.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung ergeht nun ein Hinweis auf die beigefügten Zeichungen, worin:
Figur 1 schematisch eine Anordnung des Standes der Technik für ein Analysenverfahren darstellt, wobei die Anordnung als solche in EP-A-170 376 beschrieben ist.
Figur 2 (a) zeigt mit Hilfe eines schematischen Schnittes wie bei Verwendung die optische Kopplung zwischen dem Testobjekt, wie zuvor beschrieben, und einer Ausführungsform einer optischen Struktur, wie zuvor beschrieben, zur Winkeldiskriminierung der Fluoreszenz führt. Figur 2 (b) zeigt eine alternative Ausführungsform einer optischen Struktur.
Figur 3 zeigt (a) einen senkrechten Querschnitt und (b) einen Längsschnitt durch eine alternative optische Struktur, die gemäß der Erfindung angewendet werden kann.
Figur 4 zeigt im einzelnen eine optische Struktur, angefertigt zur Verwendung gemäß vorliegender Erfindung.
Figur 5 zeigt grafisch die Ergebnisse einer Bestimmung, ausgeführt gemäß der Erfindung.
Mit Bezug auf Figur 1 ist die Probenflüssigkeit 1 in dem Testobjekt 2 enthalten, in diesem Fall einer Fluoreszenzkapillarfüllvorrichtung. Während des Versuchsverlaufs können Fluorophoren innerhalb der Probenflüssigkeit an eine dünne Materialschicht (nicht gezeigt) als Oberfläche des Wellenleiters 3 des Testobjekts gebunden werden. Die Probenflüssigkeit 1 ist in dem Volumen zwischen der Schicht von Material 4 und Wellenleiter 3 enthalten. In der in Figur 1 gezeigten Ausführungsform wird die Bestrahlung mit einer Lichtquelle 5 ausgeführt, deren Output unter Verwendung der Linsen 6 und 7 gebündelt werden kann und mit Hilfe eines Stapelfilters 8 gefiltert werden kann, um Licht geeigneter Anregungswellenlänge bereitzustellen. Wellenleiter 3 hat eine Kante 9, die im wesentlichen sowohl glatt als auch senkrecht zur Längsausstreckung ist. Licht aus Flüssigkeit 1 und aus der Oberflächenschicht kann sich durch den Wellenleiter mit inneren Mehrfachreflektionen ausbreiten und tritt aus der Kante 9 aus. Licht, das direkt aus der Vorrichtung austritt und von der Flüssigprobe herrührt, wird mit Hilfe einer Maske 11 mit einer Blende beseitigt. Ein Photodetektor 10 wird derart angeordnet, daß er Licht, das aus der Kante 9 austritt und das von der Längsachse des Wellenleiters in einem Winkel abweicht, der nicht größer ist als vorstehend definierter Winkel α, empfängt. Dies wird erreicht durch Ausblenden, zum Beispiel mit einer Schlitzblende 15, mit der eine oder mehrere konvexe Linsen 12 und 13 verbunden sind, um das über den gewünschten Winkelbereich zu dem Photodetektor ausgesendete Licht zu sammeln. Licht, das aus der Kante 9 austritt, kann mit Hilfe eines Filters 14 gefiltert werden, so daß Licht der Anregungswellenlänge von dem ausgeschlossen werden kann, das Detektor 10 erreicht.
Es sollte betont werden, daß Figur 1 die Anordnung der Vorrichtung schematisch darstellt. Als praktische Mabnahme wird es in dieser Anordnung des Standes der Technik für eine effiziente Detektierung bevorzugt sein ein 45º-Prisma (nicht dargestellt) in Kontakt mit der Kante 9 als erstes Element in den optischen Detektionsgang einzubeziehen.
Figur 2 zeigt, wie die vorliegende Erfindung zur verstärkten selektiven Unterscheidung zwischen Licht, das von Oberflächen-gebundenen Fluorophoren herrührt, und Licht, das von Fluorophoren in der Probenflüssigkeit herrührt, führen kann und der optische Gang qrößtenteils vereinfacht wird. Wie in Figur 1 ist die Flüssigprobe 21 mit dem Brechungsindex n&sub1; in der Schicht 23 des festen durchsichtigen Materials mit dem Brechungsindex n&sub2; und der Schicht 22 enthalten, wobei Schicht 23 geeigneterweise als Wellenleiter wirkt. Eine optische Struktur 24 wird eng an der Kante 25 des Wellenleiters angeordnet, so daß im wesentlichen das gesamte Licht, das auf die Kante 25 des Wellenleiters auftrifft, in die Schicht 27 des zwischen der optischen Struktur befindlichen Festkörpermaterials mit dem Brechungsindex n3 über den Endschlitz 26 geleitet wird. Im allgemeinen sollte für eine optimale optische Kopplung die Dicke der Schicht 27 größer sein oder gleich der Dicke von Schicht 23.
Unter bestimmten Umständen kann es wünschenswert sein, die opaque Beschichtung 30 über den Enden 31 und 32 der optischen Struktur 24 auszudehnen, um die Blende in gleichen Ausmessungen wie oder geringer als die optische Kante 25 zu gestalten.
Das Material der Schicht 27 hat im allgemeinen einen Brechungsindex n&sub3;, der größer ist als n&sub2;, jedoch ist dies nicht ausschlaggebend. Geeignete Materialien für Schicht 27 sind zum Beispiel optisches Glas, Quarz, Phosphatgläser und polymere Materialien wie kristallines Styrol. In einigen Ausführungsformen kann es wünschenswert sein, daß die Schicht 27 eine Flüssigkeit darstellt, eingeschlossen in der optischen Struktur 24 durch geeignete Vorrichtungen (z.B. dünne Schichten eines stark transparenten Materials an den Enden). Angeordnet an jeder Seite der Schicht 27 sind die Schichten 28 und 29 des transparenten festen Materials, wobei beide Schichten gewöhnlich einen Brechungsindex n4 aufweisen, deren äußere Oberflächen in dieser Ausführungsform mit einer lichtabsorbierenden Beschichtung 30 versehen sind. Alternativ dazu können Schichten 28 und/oder 29 eine Flüssigkeit, eingeschlossen innerhalb der optischen Struktur 24 durch geeignete Mittel darstellen, vorausgesetzt, dar keine innere Totalreflektion an der Grenzfläche zwischen Flüssigkeit und deren einschließendes Mittel auftritt.
In der dargestellten Ausführungsform ist es wesentlich, daß die äußeren Oberflächen der optischen Struktur, die im wesentlichen parallel sind zur Längsachse der Struktur mit der Beschichtung 30 aus Gründen, die hierin später erörtert werden, im wesentlichen total beschichtet sind. Es ist ebenfalls wünschenswert, jedoch nicht wesentlich, daß Beschichtung 30 weiter ausgedehnt wird, um die Enden 31 und 32 der Schichten 28 und 29 zu bedecken. Als Alternative kann eine Blendvorrichtung verwendet werden, die die Enden 31 und 32 der optischen Struktur bei Gebrauch bedeckt. Es ist in keiner Weise wesentlich, daß die äußeren Oberflächen der optischen Struktur parallel zur Längsachse davon sind. Beispielsweise wie in Figur 2 (b) gezeigt, kann eine optische Struktur hergestellt werden, deren Querschnitt die Form eines Trapezes aufweist.
Es ist ebenfalls wünschenswert, jedoch nicht wesentlich, daß die Beschichtung 30 sich über die Enden 37 und 39 der Schichten 28 und 29 ausdehnt, um diese zu bedecken. Als Alternative kann eine Blendenvorrichtung verwendet werden, um die Enden 37 und 39 der optischen Struktur bei Gebrauch zu bedecken.
Geeignete Materialien für die Schichten 28 und 29 sind Quarz, Magnesiumchlorid, Lithiumfluorid, optische Gläser (z.B. BK7 oder Kronglas), Phosphatgläser, polymere Materialien (z.B. acrylische oder Silicone) und Flüssigkeiten. Für geeignete Materialien (z.B. Phosphatgläser) können die Schichten 28 und 29, falls erwünscht, durch Spin-Coating aufgetragen werden. Die Dicke der Schichten 28 und 29 sollte größer sein als 2 µm.
Die Wahl der Materialien für die Schichten 27, 28 und 29 ist für den Erfolg des Verfahrens der Erfindung wichtig. Bei Verwendung wird selektive Winkelunterscheidung des Lichtes 35, herrührend von Fluorophoren, gebunden an Oberfläche 33, aus Licht 36, herrührend von der Probenflüssigkeit 21 durch sorgfältige Auswahl der Brechungsindices n&sub3; und n&sub4; erreicht. Im allgemeinen sind diese derart, daß n&sub3;² - n&sub4;² n&sub2;² - n&sub1;² ist.
In einigen Umständen jedoch ist es wünschenswert, daß die Größe (n&sub3;² - n&sub4;²) etwas geringer ist als durch die vorstehend genannte Gleichung vorgeschlagen; dies hat die Wirkung, daß weniger Licht, das vom Ende 25 austritt, durch den Photodetektor von der Struktur 24 erfaßt wird, insbesondere bei Winkeln nahe zu α, wie vorstehend definiert.
Geeignete Materialien für die lichtabsorbierende Beschichtung 30 sind ein schwarzer Anstrich, gegebenenfalls hitzehärtbar oder durch Infrarotstrahlung, Siliconanstrich, Farbstoff, usw., die durch übliche Verfahren wie Siebdruck oder, falls geeignet, Spin-coating oder Aufsprühen aufgebracht werden können. Solche Materialien sollten das Licht dämpfen oder absorbieren, zumindest bei denen in die Bestimmung einbezogenen Wellenlängen. Die minimale Dicke der Beschichtung 30 beträgt typischerweise 3 µm. Der optischen Struktur 24 kommt die gleiche Rolle wie den Bestandteilen 11 bis 15 von Figur 1 zu, jedoch ist sie viel zweckmäßiger zu verwenden. Darüberhinaus gibt es im Gegensatz zur Situation des Standes der Technik, bei dem ein Prisma in Kontakt mit der optischen Kante des Wellenleiters angeordnet wird, in der wie hier definierten vorliegenden Erfindung nicht das Erfordernis für die optische Struktur, daß sie mit der Kante in Kontakt steht. Ein überbrückender Spalt von einigen Millimetern kann vorliegen, ohne ernsthaften Verlust an Empfindlichkeit hervorzurufen (wenn die Vorrichtung wie im nachstehenden Beispiel 1 verwendet wird).
In einer weiteren Ausführungsform können die äußeren Oberflächen der Schichten 28 und 29 der optischen Struktur 24 aufgerauht werden, so daß Licht, das in die Schichten 28 und 29 durch Brechung eintritt, aus der optischen Struktur 24 herausgestreut wird. In einer solchen Ausführungsform ist es bevorzugt, dar die äußeren Oberflächen der Schichten 28 und 29 derart aufgerauht sind, das im wesentlichen das gesamte in die Schicht 28 und 29 durch Brechung eintretende Licht aus der optischen Struktur 24 herausgetreut wird. Bei solchen Umständen kann es wünschenswert sein, ist jedoch nicht wesentlich, eine Beschichtung 30 auf der optischen Struktur 24 anzubringen, wie bereits beschrieben wurde. In einer davon abweichenden Ausführungsform kann Licht, das durch Brechung in die Schichten 28 und 29 eintritt, aus der optischen Struktur 24 herausgestreut werden, unter der Voraussetzung, daß die äußeren Oberflächen der Schichten die Form geeigneter Beugungsgitter annehmen.
In einer weitergehenden Ausführungsform können die Dicken der Schichten 28 und 29 ausreichend groß sein, so daß im wesentlichen kein Licht, das sich in den Schichten 28 und 29 ausbreitet, wieder die Schicht 27 erreichen kann. In einer solchen Ausführungsform ist es bevorzugt, daß die Schichten 28 und 29 ausreichend dick sind, so daß sich darin ausbreitendes Licht nicht zur Schicht 27 zurückkehrt. In einem solchen Fall wird die Dicke h der Schicht 28 und/oder 29 beschrieben durch
h > 1/2d(n&sub4;²-1)¹/²
worin d die Länge der optischen Struktur bedeutet und n&sub4; wie vorstehend definiert ist. Unter solchen Umständen kann es noch wünschenswert sein, jedoch nicht wesentlich, eine Beschichtung 30 auf der optischen Struktur 24, wie bereits beschrieben, aufzutragen.
Ein optisches Filter (z.B. ein kolloidales Glas) kann gegebenenfalls entweder in oder an der optischen Strukur 24 an dem Ende 26 angeordnet werden. Wenn das optische Filter in die optische Struktur 24 (wie in der besonderen Ausführungsform, erläutert in Figur 4) eingesetzt wird, dann sollte es vorzugsweise aus einem Material hergestellt werden, das den gleichen oder höheren Brechungsindexes wie Schicht 27 aufweist. Wenn ein Filterglas geeigneten Brechungsindex nicht gefunden werden kann, kann Filter 20 auf das Ende 26 von Schicht 27 befestigt werden, wie gezeigt in der Ausführungsform von Figur 2 (b). Als Ergebnis der Optik des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wird jede sekundäre Fluoreszenz, die von diesem Filter herrührt und zum Photodetektor weitergeleitet wird, minimiert. Alternativ dazu kann der optische Filter entweder in oder an der optischen Struktur am Ende 38 eingesetzt werden.
Wenn das Vorliegen von Interferenzfiltern wünschenswert würde in der Nachweisoptik zum Beispiel um Nebenfluoreszenz und/oder Fluoreszenz, die innerhalb der Vorrichtung auftritt, zu vermindern, könnten geeignete Mehrschichtfilter an der Fläche und/oder der Fläche 38 der optischen Struktur 24 zum Beispiel mit Hilfe von Vakuumabscheidungstechniken bekannter Art angeordnet werden. Alternativ dazu kann ein vorgefertigter Interferenzfilter optisch an die Fläche und/oder die Fläche 38 der optischen Struktur gekoppelt werden.
Figur 3 (a) zeigt einen Schnitt quer durch eine zylindrischen Variante der erfindungsgemäßen optischen Struktur. Eine zylindrische Schicht 40 eines Materials mit einem Brechungsindex n&sub3; ist umgeben von einer koaxialen Schicht 41 eines Materials mit einem Brechungsindex n&sub4;. Wie bereits beschrieben, sind die äußeren Oberflächen der Schicht 41 mit einem geeigneten opaquen Material beschichtet.
Figur 3 (b) zeigt einen Längs schnitt durch diese Variante, die mit der Struktur, gezeigt in Figur 2, übereinstimmt.
Zylindrische Strukturen, wie gezeigt in Figur 3 (a) und 3 (b), können vorteilhafterweise in Zusammenhang mit zylindrischen Biosensoren, wie sie zum Beispiel in US 4 447 546 beschrieben sind, verwendet werden.
Bei der Verwendung könnte der vorstehend beschriebene Photodetektor, zum Beispiel eine Photomultiplier-Röhre, eng an das Ende der optischen Struktur, aus der das Fluoreszenzlicht austritt, plaziert so werden, daß das aus der optischen Struktur austretende Licht direkt ohne das Erfordernis zusätzlicher Linsen bestimmt wird. Eine solche Anordnung würde das Signal aufgrund Reflektion vermindern. Falls jedoch erwünscht, können zusätzliche Linsen wie bei den üblichen Verfahren verwendet werden.
Als alternative Anordnung kann die optische Kopplung eines geeigneten Photodetektors (z.B. ein Siliciumphotodetektor) am Ende der Fläche 38 der optischen Struktur 24 erfolgen.
Die vorstehende Erörterung wurde mit besonderem Hinweis auf Fluoreszenzkapillarfüllvorrichtungen (FCFD) einbeziehende Immunoassays ausgeführt. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die Erfindung auch auf andere Verfahren und Vorrichtungen angewendet werden kann, die selektive Winkelunterscheidung von optischen Signalen, die aus Wellenleitern austreten, insbesondere auf jene, die dämpfungsgekoppelte Signale einbeziehen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist besonders für Bestimmungen zum Beispiel von Antigenen oder Antikörpern, nämlich Immunoassays, anwendbar. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Bestimmung von Antikörpern oder Antigenen beschränkt. Beispiele von Liganden, die im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren bestimmt werden können, sind in Tabelle I nachstehend angeführt, zusammen mit einer Angabe geeigneter, für jeden Fall spezifisch bindender Partner. Tabelle I Ligand spezifisch bindender Partner Antigen Antikörper Hormon Hormonrezeptor Polynucleotidstrang Avidin Biotin Protein A Immunoglobilin Enzymcofaktor (Substrat Enzym oder Inhibitor) Lectine spezifische Kohlenhydrate von Lectinen spezifischer Antikörper komplementärer Polynucleotid-Strang
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt eine sehr breite Anwendbarkeit, kann insbesondere aber verwendet werden im Zusammenhang mit Bestimmungen von Hormonen, einschließlich Peptidhormonen (z.B. Thyroid-stimulierendes Hormon (TSH), luteinisierendes Hormon (LH), menschliches Chorion-Gonadotropin (hCG), Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Insulin und Prolactin) oder nichtpeptidische Hormone (z.B. Steroidhormone wie Cortisol, Östradiol, Progesteron und Testosteron oder Thyroidhormone wie Thyroxin (T4) und Trijodothyronin), Proteine (z.B. carcinoembryonisches Antigen (CEA) und Alphafötoprotein (AFP)), Arzneistoffe (z.B. Digoxin), Zucker, Toxine, Vitamine, Proteine, Viren wie Grippeviren, grippeähnliche Viren, Adeno-, Hepatitis, respiratorische und AIDS-Viren oder Mikroorganismen.
Das nachstehende nichtbeschränkende Beispiel ist zur Erläuterung der Erfindung vorgesehen.

Beispiel 1

Optisches Immunoassay für menschliches Chorion-Gonadotropin Herstellung des Ausgangsmaterials

(1) Herstellung einer optischen Struktur

Figur 4 zeigt im einzelnen eine optische Struktur des in den Figuren 2 und 3 dargestellten Typs, hergestellt zur Verwendung im Einklang mit der Erfindung wie nachstehend:
Aus einer Platte aus optischem Glas Souriel B89/61 wird ein Teil 46 mit den Abmessungen 30,0 mm x 15,0 mm x 3,0 mm nach üblichen Verfahren ausgeschnitten. Nach Polieren aller Oberflächen des Glases wiederum mit üblichen Verfahren wird das Glas auf zwei Teile 47, 48 Quarz (33,0 mm x 15,0 mm x 1,0 mm) geklebt, die nach üblichen Verfahren geschnitten und poliert wurden. Der zum Verbinden der Schichten verwendete Klebstoff war der optische Kitt Lensbond (Brechungsindex 1,55). Ein Stück 49 des Filterglases (OG 515 Kolloidglas) wurde in die genauen Abmessungen geschnitten (15,0 mm x 3,0 mm x 3,0 mm) und in üblicher Weise poliert und wurde in die optische Struktur unter Verwendung des vorstehend genannten Klebstoffs eingesetzt. Schließlich wurden alle nach außen weisenden Siliciumoberflächen (jedoch nicht jene des optischen Glases oder des Filterglases) der optischen Struktur durch Sprühen mit einer schwarzen opaquen Beschichtung bedeckt (nicht gezeigt).

(ii) Herstellung von Anti-hCG-Antikörper konjugiert an Fluoreszeinisothiocyanat (FITC)

200 mg FITC (Sigma Chemical Company Ltd., UK) und 5 mg eines zweiten monoklonalen Antikörpers, hCG-spezifisch für eine andersartige antigene Determinante, wurden zusammen vermischt in 1,4 ml 0,2 M Natriumbicarbonatpufferlösung (pH 9,0). Das Gemisch wurde für 18 Stunden bei Raumtemperatur belassen, währenddessen Konjugation von FITC zu dem monoklonalen Antikörper auftrat. Das Gemisch wurde dann durch Gelfiltration an Sephadex G-50-superfine gereinigt.

(iii) Herstellung von hCG-Standardlösungen

Eine gefriergetrocknete Zubereitung von hCG, kalibiriert gegen die erste internationale Referenzzubereitung (75/537), wurde von Biodata SpA, Mailand, Italien, erhalten. Diese Probe wurde mit Pferdeserum (Serono Diagnostics, Ltd., Woking UK) unter Erhalt einer erforderlichen hCG-Standardreihe verdünnt.

(iv) Verwendete Vorrichtung bei der Messung der hCG-Bestimmung

Für die erfindungsgemäße Bestimmung wurden Bestandteile entsprechend Bezugszeichen 1-10 von Figur 1 verwendet. Testobjekt 2 war eine Fluoreszenzkapillarfüllvorrichtung eines Typs, offenbart in EP-A-171 148. An der Innenoberfläche des Wellenleiterteils 3 wurde durch übliche Verfahren ein monoklonaler Antikörper gegen hCG immobilisiert. Die Lichtquelle 5 war eine Heinmann Xenonblitzlampe. Der Stapelfilter 8 umfaßte 3 Filter: ein BG7 Schott-Glasfilter (Ealing Electro Optics UK Ltd., Watford UK), ein 450-480 nm FITC-Bandpass-Interferenzfilter (Optometrics Ltd., UK) und ein 475 nm-Short-Pass-Interferenzfilter (Comar Instruments Ltd., Cambridge UK).
Die wie in Paragraph (i) angefertigte optische Struktur wurde in die Nähe der Kante 9 des Wellenleiters plaziert (siehe auch Figur 2). Der Photodetektor 10 war eine Hamamatsu R931A Photomultiplier-Röhre (Hakuto UK Ltd.).
Zum Vergleich wurde auch eine übliche Messung unter Verwendung der mit den Bezugszeichen 11-15 in Figur 1 versehenen Bestandteile ausgeführt. Im letzteren Fall war das verwendete Filter 14 ein 515 nm Kolloidglasfilter Schott OG515.

Assay-Methodologie

Das αhCG-FITC-Konjugat wurde zu jedem der hCG-Standards unter Erhalt von etwa 0,5 ml Testlösung zugegeben. Die Konjugatkonzentration betrug 1 µg/ml. Die Testzellen wurden ausgewählt und jede wurde mit einer unterschiedlichen Testlösung gefüllt. Das Signal vom Photodetektor wurde nach 20- minütiger Inkubationszeit in einer feuchten Umgebung bei 20ºC aufgezeichnet.
Figur 5 zeigt grafisch die Ergebnisse einer unter Verwendung der Vorrichtung ausgeführten Untersuchung, einschließlich einer wie vorstehend beschriebenen optischen Struktur im Vergleich mit Ergebnissen einer üblichen Bestimmung unter Verwendung einer wie in Figur 1 schematisch gezeigten Vorrichtung. Die erfindungsgemäß ausgeführte Bestimmung verfügt über eine bedeutend bessere Präzision als die des Standes der Technik (5,1 % verglichen mit 9,0 %).

Claims

1. Verfahren zur optischen Analyse einer Testprobe mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder lumineszierenden Eigenschaften, wobei die Probe teilweise in einer flüssigen Phase vorliegt und teilweise direkt oder indirekt an eine benachbarte Festkörperoberfläche gebunden ist, umfassend die Schritte

(i) Bereitstellen, als Festkörperoberfläche, eine Oberfläche eines festen optischen Wellenleiters, durchlässig zumindest bei Wellenlängen der mit der Analyse verbundenen Strahlung;

(ii) Messen des aus dem an der festen Oberfläche gebundenen Probenmaterial stammenden Lichts, das sich durch den Wellenleiter ausbreitet und aus ihm mit einer Winkelabweichung von der optischen Achse des Wellenleiters in einem Winkel kleiner als die Größe von α austritt, mit

α arcsin (n&sub2;² - n&sub1;²)¹/²,

worin n&sub2; der Brechungsindex des Materials des Wellenleiters ist und n&sub1; der Brechungsindex der benachbarten Flüssigkeit ist; und

(iii) Ausschluß von der Messung im wesentlichen allen Lichtes, das aus dem Wellenleiter in einem Winkel austritt, der von der optischen Achse mit α oder mehr abweicht, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß eine optische Struktur, umfassend eine Schicht transparenten Materials mit dem Brechungsindex n&sub3;, direkt angeordnet zwischen zwei Schichten transparenten Materials mit dem Brechungsindex n&sub4; - die Materialien der Brechungsindices n&sub3; und n&sub4; sind so ausgewählt, daß

n&sub3;² - n&sub4;² n&sub2;² - n&sub1;²,

und die Materialschichten mit dem Brechungsindex n&sub4; derart angepaßt sind, daß der Hauptanteil des in sie aus der Schicht mit dem Brechungsindex n&sub3; geleiteten Lichtes nicht zurückgeführt wird in die Schicht mit dem Brechungsindex n&sub3; - eng an der Kante des Wellenleiters angeordnet ist, so daß im wesentlichen alles dämpfungsgekoppelte Licht, austretend aus der Kante des Wellenleiters in die Schicht mit dem Brechungsindex n&sub3; überführt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens eine nicht mit der Schicht des Materials mit dem Brechungsindex n&sub3; in Kontakt stehende Oberfläche einer Schicht des Materials mit dem Brechungsindex n&sub4; mit einem lichtabsorbierenden Material beschichtet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei mindestens 80 % des auf der Grenzfläche zwischen der Schicht des Materials mit dem Brechungsindex n&sub4; und der Beschichtung des lichtabsorbierenden Materials auftreffenden Lichts absorbiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei mindestens eine nicht mit der Schicht des Materials mit dem Brechungsindex n&sub3; in Kontakt stehende Oberfläche einer Schicht des Materials mit dem Brechungsindex n&sub4; aufgerauht ist, so daß auf der Oberfläche auftreffendes Licht aus der optischen Struktur heraus gestreut wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Oberfläche mit einem lichtabsorbierenden Material beschichtet ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Schicht des transparenten Materials mit dem Brechungsindex n&sub3; zylindrisch ist und die Schicht des transparenten Materials mit dem Brechungsindex n&sub4; ein darum angeordneter koaxialer Zylinder ist,

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Dicke h der oder jede Schicht des Materials mit dem Brechungsindex n4 wiedergegeben wird durch

h > 1/2d(n&sub4;²-1)¹/²

worin d die Länge der optischen Struktur ist.

8. Vorrichtung zur Verwendung bei einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, umfassend:

(i) ein Testobjekt, befindlich auf einer Testobjektanordnung, ausgestaltet zum Aufnehmen eines Probenmaterials mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder lumineszierenden Eigenschaften, wobei das Testobjekt einen transparenten Festkörper umfaßt, der als Wellenleiter wirkt und an dessen Oberfläche das Probenmaterial aus einer Lösung oder Flüssigkeitsdispersion heraus, die mit dem Festkörper in Kontakt stehen, gebunden werden kann; und

(ii) eine optische Struktur gemäß Anspruch 1, die bei Gebrauch so ausgerichtet werden kann, daß wenn ein Testobjekt sich an der Testobjektanordnung befindet, die optische Struktur zu dem transparenten Festkörper des Testobjektes optisch gekoppelt ist, so daß das Licht, das sich in dem transparenten Festkörper ausbreitet, von der optischen Struktur aufgenommen werden kann.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei des Testobjekt eine spezifisch-reaktive Probe-akkumulierende und analysierende Vorrichtung ist, die eine Vertiefung oder Vertiefungen aufweist, jeweils in einer Abmessung, die klein genug ist, um in der Lage zu sein, Flüssigkeitsproben durch Kapillarwirkung in die Vertiefungen aufzunehmen, wobei eine Oberfläche dieser oder jeder Vertiefung ein immobilisiertes Reagenz trägt, geeignet für den auszuführenden Test in der Vorrichtung, und wobei die Oberfläche eine Oberfläche einer transparenten Festkörperplatte darstellt, ausgestaltet um als lichtdurchlässiger Wellenleiter zu wirken, und wobei die Platte eine Kante aufweist, die im wesentlichen optisch glatt und quer zu der Plattenebene ist.

10. Vorrichtung nach Anspruch 8 oder 9, wobei das Testobjekt und die optische Struktur miteinander unter Bildung einer integralen Einheit gekoppelt sind.

11. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 10, wobei die optische Struktur an den transparenten Festkörper des Testobjektes über eine im Index abgestimmte Substanz, die im engen Kontakt mit der optischen Struktur und dem transparenten Festkörper steht, optisch gekoppelt ist.

12. Verfahren zur Bestimmung einer Testprobe mit fluoreszierenden, phosphoreszierenden oder lumineszierenden Eigenschaften, wobei die Probe teilweise in flüssiger Phase und teilweise direkt oder indirekt an eine benachbarte Festkörperoberfläche gebunden ist und wobei die Probe einem optischen Analysenverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 unterzogen wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Testprobe ein Antigen oder einen Antikörper umfaßt.

14. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 8 bis 11 bei einem Bestimmungsverfahren.