DE69013446T2

DE69013446T2 - Alkalische Pullulanase, Mikroorganismus der sie produziert und Verfahren zur Herstellung dieses Enzyms.

Info

Publication number: DE69013446T2
Application number: DE69013446T
Authority: DE
Inventors: Katsutoshi Ara; Kazuaki Igarashi; Susumu Ito; Katsuhisa Saeki
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1989-08-31
Filing date: 1990-08-29
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2010-08-30
Also published as: CA2024194A1; NO180642C; DK0415397T3; FI95481B; NO903801D0; NO903801L; DE69013446D1; US5147795A; EP0415397A1; CA2024194C; NO180642B; HK154695A; EP0415397B1; FI95481C; ES2065449T3; FI904277A0

Description

Hintergrund der Erfindung:

Gebiet der Erfindung:

Die Erfindung betrifft eine neue alkalische Pullulanase, einen Mikroorganismus, der die alkalische Pullulanase erzeugt, und ein Verfahren zur Herstellung der alkalischen Pullulanase.

Beschreibung des technischen Hintergrundes:

Pullulanase ist ein Enzym, das nur α-1,6-glycosidische Bindungen von Pullulan hydrolysiert und schließlich Maltotriose erzeugt. Pullulanase wurde zuerst in einem Stamm, zugehörig zu Aerobacter aerogenes, von Bender und Wallenfels 1961 entdeckt [Biochem. Z., 334, 79, (1961)]. Kürzlich wurde über verschiedene Mikroorganismen berichtet, die in der Lage sind, Pullulanase zu erzeugen. Diese Mikroorganismen sind beispielsweise: Bacillus sp. [J. Jpn. Soc. Starch Sci., 30, 200, (1983)]; Bacillus acidopullulyticus [Agric. Biol. Chem., 52, 2293, (1984)]; Bacillus stearothermophilus [Eur. J. Appl. Micrcbiol. Biotechnol., 17, 24, (1983)]; Streptococcus mitis [Biochem. J., 108, 33, (1968)]; und Lactobacillus [Denpun Kagaku, 28, 72, (1981)].
Es ist bekannt, daß Pullulanasen nicht nur vorstehende Aktivität gegen Pullulan aufweisen, sondern ebenfalls Aktivität besitzen gegen α-1,6-glycosidische Bindungen von Stärke, Glykogen, Amylopektin sowie gegen verzweigte Oligosaccharide, die durch teilweisen Abbau dieser Verbindungen erzeugt werden. Aufgrund dieser Eigenschaft wird Pullulanase als "verzweigungenspaltendes Enzym" bezeichnet.
Des weiteren wurde gefunden, daß Pullulanase in Kombination sowohl mit endo-Typ-Amylase als auch exo-Typ- Amylase, Glucose oder Maltooligosaccharide, wie Maltose, Maltotriose, Maltotetraose, Maltopentaose oder Maltohexaose aus Stärke in hoher Ausbeute liefern kann. Dieser Eigenschaft wurde seit kurzem beträchtliches Interesse gewidmet.
Es gibt eine Mitteilung, daß Pullulanase mit diesen Eigenschaften in Kombination mit Amylase als Additiv für Geschirrspülmittel oder Waschmittel verwendet wurde, wodurch eine bemerkenswerte Verbesserung der Waschkraft, hauptsächlich gegen Stärkeverschmutzung, erreicht wurde (Japanische Patentanmeldung Nr. 285424/1988). Weitere Anwendung von Pullulanase wird auf diesen Gebieten erwartet.
Fast alle natürlich vorkommenden Pullulanasen werden jedoch in neutrale oder saure Pullulanasen eingeteilt, die eine maximale und stabile enzymatische Aktivität bei neutralen oder sauren Bedingungen zeigen. Es gibt weniger alkalische oder alkalibeständige Pullulanasen mit einer besseren Stabilität und die eine maximale Aktivität bei einem alkalischen pH-Bereich aufweisen, bei dem Textilwäsche oder Geschirrwäsche ausgeführt wird. Eine alkalische Pullulanase hierin bedeutet, daß diese einen optimalen pH-Wert im alkalischen Bereich aufweist. Eine alkalibeständige Pullulanase bedeutet, daß diese einen optimalen pH-Bereich im neutralen oder sauren Bereich aufweist, jedoch einen ausreichenden Aktivitätsgrad im alkalischen Bereich besitzt während sie ihre gute Stabilität beibehält. Der Begriff "neutral" bedeutet hierin einen pH-Bereich 6-8 und der Begriff "alkalisch" bedeutet einen pH-Bereich von nicht weniger als 8.
Kein Verfahren zur Herstellung alkalischer Pullulanasen, noch alkaliresistente Pullulanasen, sind bislang bekannt mit Ausnahme eines Berichtes von Horikoshi et al., die ein Verfahren zur Herstellung von alkalischer Pullulanase durch Züchten eines alkalophilen Mikroorganismus, zugehörig zur Gattung Bacillus offenbaren [Biochem. Biophys. Acta, 397, 188, (1975), und Japanische Patentveröffentlichung Nr. 27786/1978].
Die Pullulanase von Horikoshi et al. ist ein Enzym mit einem pH-Optimum im alkalischen Bereich, das eine breitere Substratspezifität aufweist als übliche bekannte Pullulanasen. Da sein pH-Optimum jedoch in schwach alkalischem Bereich von 8-9 liegt, ist es nicht für Waschmittel verwendbar. Außerdem weist das Verfahren von Horikoshi et al. den Nachteil geringerer Produktivität des Enzyms auf. Diese Verfahrensart ist daher für industrielle fermentative Produktion ungeeignet. Aus diesen Gründen wurde die Entwicklung von Pullulanasen mit einem optimalen pH-Wert in höher alkalischem Bereich wünschenswert.
Geschirrspülen oder Textilwaschen wird gewöhnlich in einem breiten pH-Bereich ausgeführt, von neutral bis zum stark alkalischen Bereich. Es ist daher lohnenswert, natürliche Mikroorganismen zu finden und zu gewinnen, die Pullulanasen mit einem optimalen pH-Wert im stark alkalischen Bereich erzeugen und für Geschirrspül- und Textilwaschmittel nutzbar sind.
Unter diesen Umständen führten die Autoren der vorliegenden Erfindung ausgedehnte Untersuchungen aus, um natürliche Mikroorganismen zu gewinnen, die in der Lage sind, alkalische Pullulanase zu erzeugen und im Ergebnis fanden sie eine neue alkalische Pullulanase mit einem optimalen pH-Wert in einem stark alkalischen Bereich von 9,5 bis 11, gewonnen durch Züchten eines speziellen Mikroorganismus, zugehörig zur Gattung Bacillus. Diese Erkenntnis führte zur Ausführung der vorliegenden Erfindung.

Zusammenfassung der Erfindung

Folglich ist es Aufgabe der Erfindung, eine neue alkalische Pullulanase mit nachstehenden enzymologischen Eigenschaften bereitzustellen:

(1) Wirkung

Hydrolyse der α-1,6-Bindung von Pullulan unter Herstellung von Maltotriose und Hydrolyse der α-1,6-glycosidischen Bindung von Stärke, Amylopektin, Glykogen oder deren Teilabbauprodukten;

(2) Arbeits-pH-Bereich und optimaler pH-Bereich

weist einen aktiven pH-Bereich von 4-12 auf, mit einem optimalen pH-Bereich von 9,5 - 11;

(3) pH-Wert-Stabilität

ist in einem pH-Bereich von 7-10 stabil und behält relative Aktivität von 50 % oder mehr der Aktivität beim optimalen pH-Bereich, auch in einem pH-Bereich von 6 - 11,5, bei, wenn bei 45ºC für 10 Minuten behandelt;

(4) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur

ist in einem breiten Temperaturbereich von 10 bis 60ºC mit einer optimalen Temperatur von etwa 55ºC wirksam;

(5) Thermische Stabilität

ist bis zu 45ºC sehr stabil, wenn es in 10 mM Glycin- NaCl-NaOH-Puffer (pH 9,5) für 30 Minuten behandelt wird;

(6) Molekulargewicht

etwa 110000 ± 10000, gemessen durch Gelfiltration unter Verwendung von Bio-Gel A 0,5 m.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer neuen gereinigten alkalischen Pullulanase Z-1 mit den nachstehenden enzymologischen Eigenschaften:

(1) Wirkung

Hydrolysiert α-1,6-Bindung von Pullulan unter Herstellung von Maltrotriose und hydrolysiert α-1,6-glycosidische Bindungen von Stärke, Amylopektin, Glykogen oder deren Teilabbauprodukten;

(2) Substratspezifität

besitzt hydrolytische Wirkung gegen α-1,6-glycosidische Bindung von Zucker mit einem größeren Polymerisationsgrad als von Maltose;

(3) Arbeits-pH-Wert und optimaler pH-Bereich

weist einen aktiven pH-Bereich von 5-11 auf, mit einem optimalen pH-Bereich von 9,5-11;

(4) pH-Stabilität

ist im pH-Bereich von 8-10 stabil und behält die relative Aktivität von 50 % oder mehr der Aktivität vom optimalen pH-Bereich auch in einem pH-Bereich von 7 - 10,5 bei, wenn es bei 45ºC für 10 Minuten behandelt wird;

(5) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur

ist über einem breiten Temperaturbereich von 10-60ºC mit einer optimalen Temperatur von etwa 50ºC aktiv;

(6) Thermische Stabilität

ist sehr stabil bei 40ºC, wenn es in 10 mM Glycin- NaCl-NaOH-Puffer (pH 9,5) für 30 Minuten behandelt wird;

(7) Molekulargewicht

etwa 120000 ± 5000, gemessen durch Elektrophorese unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat;

(8) Wirkung von Metallionen

nachteilig beeinträchtigt durch Hg²&spplus;-, Cd²&spplus;-, Mn²&spplus;und Pb²&spplus;-Ionen;

(9) Wirkungen von Waschmitteln

kaum beeinflußt von Tensiden, wie linearem Alkylbenzolsulfonat (LAS), Natriumalkylsulfat (AS), Natriumpolyoxyethylenalkylsulfat (ES), Natrium-α-olefinsulfonat (AOS), Natrium α-sulfonierter Fettsäureester (α-SFE), Natriumalkylsulfonat (SAS), Natriumdodecylsulfat (SDS), Seifen und Softanol;

(10) Wirkungen von chelatbildenden Mitteln

kaum beeinflußt durch EDTA, EGTA, Zitronensäure und Zeolith;

(11) Beständigkeit gegen Proteasen

hochbeständig gegen alkalische Proteasen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung stellt die Bereitstellung eines Mikroorganismus, zugehörig zur Gattung Bacillus, der in der Lage ist, alkalische Pullulanase mit vorstehenden Eigenschaften zu erzeugen, bereit.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Pullulanase mit den vorstehenden Eigenschaften, bereit.
Weitere Aufgaben, Merkmale und Vorteile der Erfindung werden leicht aus nachstehender Beschreibung ersichtlich.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Figur 1 ist eine Darstellung, die die Beziehung der relativen Aktivität gegenüber dem Reaktions-pH-Wert der alkalischen Pullulanase der Erfindung zeigt.
Figur 2 ist eine Darstellung, die die Beziehung von pH-Wert gegenüber der Restaktivität von alkalischer Pullulanase der Erfindung zeigt.
Figur 3 ist eine Darstellung, die die Beziehung von Reaktionstemperatur (pH 9,5) gegenüber relativer Aktivität der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase zeigt.
Figur 4 ist eine Darstellung, die die Beziehung der Reaktionstemperatur (pH 9,5) gegenüber der Restaktivität der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase zeigt.
Figur 5 ist eine Darstellung, die die Beziehung der relativen Aktivität gegenüber dem Reaktions-pH-Wert der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Z-1 zeigt.
Figur 6 ist eine Darstellung, die die Beziehung des pH-Werts gegenüber der Restaktivität der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Z-1 zeigt.
Figur 7 ist eine Darstellung, die die Beziehung der Reaktionstemperatur (pH 9,5) gegen die relative Aktivität der alkalischen Pullulanase Z-1 der vorliegenden Erfindung zeigt.
Figur 8 ist eine Darstellung, die die Beziehung der Reaktionstemperatur (pH 9,5) gegenüber der Restaktivität der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Z-1 zeigt.
Figur 9 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse der Elektrophorese der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Z-1 zeigt.
Figur 10 ist eine Darstellung, die die Ergebnisse der SDS-Elektrophorese der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase Z-1 zeigt.

Beschreibung der Erfindung im einzelnen und bevorzugte Ausführungsformen

Es gibt keine Beschränkungen hinsichtlich der Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung, sofern sie zur Gattung Bacillus gehören und in der Lage sind, Pullulanase mit einem pH-Optimum von 9,5 - 11 zu erzeugen. Ein typisches Beispiel ist ein alkalophiler Mikroorganismus, Bacillus sp. KSM- AP1876, der von den Autoren der vorliegenden Erfindung in Böden bei Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan, gefunden wurde.
Es werden nun die mykologischen Eigenschaften von Bacillus sp. KSM-AP1876, nämlich einem Mikroorganisinus der vorliegenden Erfindung, erörtert. Die nachstehenden Züchtungsmedien von 21 Sorten (Medium 1 bis 21) werden zur Klassifizierung des Stammes verwendet. Sie enthalten alle 0,5 Gewichtsprozent sterilisiertes Natriumcarbonat (Na&sub2;CO&sub3;).

Zusammensetzungen des verwendeten Züchtungsmediums (Gewichtsprozent)

Medium 1: Nährbrühe, 0,8; Agarpulver (hergestellt von Wako Pure Chemical Co.), 1,5
Medium 2: Nährbrühe, 0,8
Medium 3: Nährbrühe, 0,8; Gelatine, 20,0; Agarpulver (hergestellt von Wako Pure Chemical), 1,5
Medium 4: Bactolackmusmilch, 10,5
Medium 5: Nährbrühe, 0,8; KNO&sub3;, 0,1
Medium 6: Bactopepton, 0,7; NaCl, 0,5; Glucose, 0,5
Medium 7: SIM Agarmedium (hergestellt von Eiken Kagaku), in ausgewiesener Menge
Medium 8: TSI Agar (hergestellt von Eiken Kagaku), in ausgewiesener Menge
Medium 9: Hefeextrakt, 0,5; Bactopepton, 1,5; K&sub2;HPO&sub4;, 0,1; MgSO&sub4;x7H&sub2;O, 0,02; lösliche Stärke, 2,0; Agarpulver (hergestellt von Wako Pure Chemical), 1,5
Medium 10: Koser's Medium (hergestellt von Eiken Kagaku), in ausgewiesener Menge
Medium 11: Christensen's Medium (hergestellt von Eiken Kagaku), in ausgewiesener Menge
Medium 12: Medium aus den nachstehenden Zusammensetzungen (1) und (2), zu denen Stickstoffquellen, bestehend aus Natriumnitrat, Natriumnitrit, Ammoniumchlorid und Ammoniumphosphat in den betreffenden Mengen von 0,25 %, 0,2025 %, 0,158 % und 0,195 %, auf das Gewicht in dem Medium bezogen, gegeben werden.
(1) Hefeextrakt 0,05; Na&sub2;SO&sub4; 0,1; KH&sub2;PO&sub4; 0,1; Glucose 1,0
(2) Hefeextrakt 0,05; Na&sub2;SO&sub4; 0,1; KH&sub2;PO&sub4; 0,1; Glucose 1,0; CaCl&sub2;x2H&sub2;O, 0,05; MnSO&sub4;x4-6H&sub2;O, 0,01; FeSO&sub4;x7H&sub2;O, 0,001; MgSO&sub4;x7H&sub2;O, 0,02
Medium 13: King A Medium "Eiken" (hergestellt von Eiken Kagaku), in ausgewiesener Menge
Medium 14: King B Medium "Eiken" (hergestellt von Eiken Kagaku), in ausgewiesener Menge
Medium 15: Harnstoffmedium "Eiken" (hergestellt von Eiken Kagaku), in ausgewiesener Menge
Medium 16: Cytochromoxidasetestfilterpapier (hergestellt von Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.)
Medium 17: 3 % wässeriges Wasserstoffperoxid
Medium 18: Bactopepton, 0,5; Hefeextrakt, 0,5; K&sub2;HPO&sub4;, 0,1; Glucose, 1,0; MgSO&sub4;x7H&sub2;O, 0,02
Medium 19: Bactopepton, 2,7; NaCl, 5,5; K&sub2;HPO&sub4;, 0,3; Glucose, 0,5; Bromthymolblau, 0,06; Agarpulver (hergestellt von Wako Pure Chemical), 1,5
Medium 20: (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 0,1; KCl, 0,02; MgSO&sub4;x7H&sub2;O, 0,02; Hefeextrakt, 0,05; Zucker, 1,0
Medium 21: Casein, 0,5; Hefeextrakt, 0,5; Glucose, 1,0; K&sub2;HPO&sub4;, 0,1; MgSO&sub4;x7H&sub2;O, 0,02; Agarpulver (hergestellt von Wako Pure Chemical), 1,5

Mykologische Eigenschaften

(1) Beobachtung unter dem Mikroskop

Die Zellen sind Stäbchen einer Größe von 1,0 - 2,2 um x 2,2 -4,4 um mit elliptischen Endosporen (0,8 - 1,0 um x 1,0 - 1,8 um), die sich an den Subtermini bilden. Sie haben Geißeln und sind beweglich. Gram's-Färbung ist positiv. Säureechtheit: negativ

(2) Wachstum in verschiedenen Kulturmedien

(a) Nährbrühe-Agarplatte (Medium 1)

Wachstum der Zellen ist gut. Die Kolonie hat kreisförmige Form mit glatter Oberfläche und die peripheren Enden sind glatt oder wellig. Die Farbe der Kolonie ist milchig, halb durchsichtig und glänzend.

(b) Nährbrühe-Agarschrägkultur (Medium 1)

Zellen können wachsen. Die Kolonie hat eine Form eines sich ausbreitenden Tuches mit einer glänzend milchigen Farbe und ist halb durchsichtig.

(c) Flüssige Nährbrühe (Medium 2)

Zellen können wachsen.

(d) Stabkultur in Nährbrühe-Gelatine (Medium 3)

Wachstum der Zellen ist gut, Verflüssigung der Gelatine wird beobachtet.

(e) Lackmusmilchmedium (Medium 4)

Milchkoagulation und Peptonisierung werden nicht beobachtet. Lackmusentfärbung ist nicht nachweisbar, da das Medium ein alkalisches Medium ist.

(3) Physiologische Eigenschaften

(a) Nitratreduktion und Denitrifizierung (Medium 5)

Nitratreduktion: positiv
Denitrifizierung: negativ

(b) MR-Test (Medium 6)

Nicht bestimmbar, da das Medium ein alkalisches Medium ist.
(c) V-P-Test (Medium 6) Negativ
(d) Herstellung von Indol (Medium 7) Negativ
(e) Herstellung von Schwefelwasserstoff (Medium 8) Negativ
(f) Hydrolyse von Stärke (Medium 9) Positiv

(g) Verwendung von Zitronensäure (Medium 10, Medium 11)

Negativ in Koser's Medium (Medium 10) und nicht bestimmbar in Christensen's Medium (Medium 11)

(h) Verwendung von anorganischen Stickstoffquellen (Medium 12)

Nitrat, Nitrit und Ammoniumsalze werden alle verbraucht
(i) Entfärbung (Medium 13, Medium 14) Negativ
(j) Urease (Medium 15) Negativ
(k) Oxidase (Medium 16) nicht bestimmbar
(l) Catalase (Medium 17) Positiv

(m) Wachstumsbereich (Medium 18)

Wachstumstemperatur: 20 - 40ºC,
optimale Wachstumstemperatur: 30 - 35ºC
Wachstums-pH-Bereich: 7 - 10,5
optimaler pH-Bereich: 10
(n) Verhalten bei Sauerstoff: aerob
(o) O-F-Test (Medium 19) Nicht bestimmbar, da das Medium ein alkalisches Medium ist. Zellen können lediglich unter aeroben Bedingungen wachsen.

(p) Zuckerverbrauch (Medium 20)

Die nachstehenden Zucker wurden verbraucht:
L-Arabinose, D-Xylose, D-Glucose, D-Mannose, D-Fructose, D-Galactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Trehalose, D- Sorbit, D-Mannit, Glycerin, Stärke, Salicin, D-Ribose und Dextrin.
(q) Wachstum in einem salzhaltigen Medium (Modifizierung von Medium 1) Zellen können in Gegenwart von 5 % Natriumchlorid wachsen, können jedoch nicht in Gegenwart von 7 % Natriumchlorid wachsen.
(r) Hydrolyse von Casein (Medium 21) Positiv
Auf Grundlage der vorstehenden mykologischen Eigenschaften wurden die erfindungsgemäßen Stämme mit Hinweis auf Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Bd. 8 und "The Genus Bacillus" Ruth, E. Gordon, Agriculture Handbook Nr.427, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture Washington D.C., (1973) untersucht und als Mikroorganismen zur Gattung Bacillus ascospore Stäbchen bestimmt. Die Stämme wachsen nicht im neutralen Bereich, sondern können vornehmlich in einem stark alkalischen Bereich wachsen. Aus dieser Tatsache wird der erfindungsgemäße Stamm des alkalophilen Mikroorganismus klassifiziert, wie demonstriert durch Horikoshi und Akiba, "Alkalophilic Microorganism", Japan Scientific Society Press (Tokyo), 1982. Der erfindungsgemäße Stamm unterscheidet sich von einer Gruppe von Mikroorganismen, die zur Gattung Bacillus gehören und die im neutralen Bereich wachsen.
Der erfindungsgemäße Stamm hat im Gegensatz zu den vorstehenden Eigenschaften mykologisch unterschiedliche Eigenschaften von jenen, die üblicherweise als alkalophile Bacillusstämme bekannt sind. Folglich wurde der erfindungsgemäße Stamm als ein neuer Stamm bestimmt und Bacillus sp. KSM- AP1876 bezeichnet, der beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology als FERM P-10887 hinterlegt wurde.
Die Erzeugung von alkalischer Pullulanase gemäß vorliegender Erfindung kann durch Überimpfen des Mikroorganismus der vorliegenden Erfindung und Züchten des Mikroorganismus gemäß üblicher Züchtungsverfahren ausgeführt werden. Einschluß einer geeigneten Menge von Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, die der Mikroorganismus in dem Medium verbrauchen kann, ist wünschenswert. Es gibt keine speziellen Einschränkungen hinsichtlich Kohlenstoff- und Stickstoffquellen. Eine Aufzählung von Stickstoffquellen sind organische Stickstoffquellen, wie Weizenglutenmehl, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Casaminosäure, Hefeextrakt, Pharmamedia, Fleischextrakt, Trypton, Sojaton, Hypro, Ajipower, Sojabohnenschrot, Baumwollsamenschrot, Cultivator, Ajipron, Zest, u.dgl. und anorganische Stickstoffquellen sind Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat, Natriumnitrat, Ammoniumacetat, u.dgl.. Als geeignete Kohlenstoffquellen können beispielhaft Stärke, unlösliche Stärke, Amylopektin, Glykogen, Pullulan und verzweigte Oligomere, hergestellt durch deren teilweisen Abbau, genannt werden und geeignete Kohlenstoffquellen sind Glucose, Maltose, Arabinose, Xylose, Ribose, Mannose, Fructose, Galactose, Saccharose, Lactose, Trehalose, Mannit, Sorbit, Glycerin und geeignete organische Säuren sind Essigsäure u.dgl.. Zusätzlich zu diesen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen können anorganische Ionen, wie Phosphate, Magnesium, Calcium, Mangan, Zink, Kobalt, Natrium, Kalium, u.dgl., falls erforderlich, andere organische oder anorganische Mikronährstoffe zu dem Kulturmedium zugegeben werden.
Alkalische Pullulanase der vorliegenden Erfindung kann aus der Kulturbrühe mit Hilfe üblicher Gewinnungs- und Reinigungsverfahren, allgemein angepaßt für Enzyme, hergestellt werden. Speziell werden Zellen aus der Kulturbrühe mit Hilfe üblicher Fest-Flüssig-Trennverfahren, wie Zentrifugieren, Filtrieren, o.dgl., abgetrennt unter Bereitstellung einer rohen Enzymflüssigkeit. Obwohl es möglich ist, die rohe Enzymflüssigkeit so zu verwenden, wie sie vorliegt, kann sie auch als gereinigtes Enzym, falls erforderlich, nach Abtrennung mit Hilfe von Abtrennungsverfahren Verwendung finden, beispielsweise durch Aussalzen, Fällen, Ultrafiltration, u.dgl., unter Bereitstellung von Rohenzym und Reinigung und Kristallisation des Rohenzyms durch übliche Verfahren. Geeignete Reinigungsverfahren sind beispielsweise DEAE-Cellulose- (hergestellt von Whatman Co.) Absorption, DEAE-Cellulosechromatographie, Sephacrylchromatographie (hergestellt von Pharmacia Co.), DEAE-Toyopearlchromatographie (Hersteller Tosoh) und Butyltoyopearlchromatographie.
Enzymologische Eigenschaften des neuen Enzyms der erfindungsgemäßen alkalischen Pullulanase werden nun erörtert. Enzymatische Aktivitäten werden unter Verwendung der nachstehenden Pufferlösungen gemessen (50 mM jeweils), gemäß den nachstehend aufgeführten Verfahren.
Die Pufferbedingungen:
pH 4 - 6: Acetatpuffer
pH 6 - 8: Phosphatpuffer
pH 8 - 11: Glycin-NaCl-NaOH-Puffer
pH 11 - 12: KCl-NaOH-Puffer

Messung von enzymatischer Aktivität:

0,1 ml einer Enzymlösung wurde zu 0,9 ml jeweils Substratlösung, hergestellt aus einer jeweiligen Pufferlösung mit Pullulan, zugegeben (Endkonzentration in dem Reaktionssystem: 0,25 %, Gewicht/Volumen) und das Gemisch wurde bei 40ºC für 30 Minuten umgesetzt. Nach der Umsetzung wurden die reduzierenden Zucker quantitativ mit Hilfe des 3,5-Dinitrosalicylsäure-Verfahrens (DNS) bestimmt.
Insbesondere wurde 1,0 ml DNS-Reagenz zu 1,0 ml Reaktionsgemisch gegeben und das Gemisch auf 100ºC unter Farbentwicklung erhitzt. Nach dem Kühlen wurden 4,0 ml desionisiertes Wasser zu dem Gemisch gegeben. Dieses wurde colorimetrischer quantitativer Analyse bei einer Wellenlänge von 535 nm unterzogen. Eine Einheit (1 U) Enzymaktivität wurde als die Menge Enzym definiert, die 1 uMol reduzierenden Zucker zu Glucose pro Minute unter Standardbedingungen freisetzte.

Enzymologische Eigenschaften der rohen alkalischen Pullulanase

(1) Wirkung

Hydrolysiert α-1,6-Bindung von Pullulan unter Herstellung von Maltotriose und - wie in Tabelle 1 dargestellt -hydrolysiert α-1,6-glycosidische Bindungen von Stärke, Amylopektin, Glykogen oder deren Teilabbauprodukten. Tabelle 1 Substrat Konzentration relative Aktivität (%) Pullulan Glykogen (Auster) Glykogen (Rattenleber) Amylopektin

(2) Arbeits-pH-Wert und optimaler pH-Bereich

Hat einen aktiven pH-Bereich von 4 - 12 mit einem optimalen pH-Bereich von 9,5 - 11 und behält relative Aktivität von 50 % oder mehr der Aktivität bei einem optimalen pH-Bereich, auch im pH-Bereich von 8,5 - 11,5, bei.
Pullulanaseaktivitäten bei verschiedenen pH-Werten wurden unter Verwendung eines jeweiligen Reaktionssystems, bestehend aus 0,25 % (Gewicht/Volumen) Pullulan und einer Pufferlösung von 10 mM Acetat (pH 4-6), Phosphat (pH 7-8), Glycin-NaCl-NaOH (pH 8,5-10,5) oder KCl-NaOH (pH 11-12) gemessen. Jede Reaktion wurde bei 40ºC für 30 Minuten ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 1 dargestellt.

(3) pH-Stabilität

Ist in einem pH-Bereich von 7-10 stabil und behält relative Aktivität von 50 % oder mehr der Aktivität bei einem optimalen pH-Bereich auch in einem pH-Bereich von 6 - 11,5 bei.
Pullulanaseaktivitäten mit verschiedenen pH-Werten wurden unter Verwendung eines jeweiligen Reaktionssystems, bestehend aus 0,25 % (Gewicht/Volumen) Pullulan und einer Pufferlösung von 10 mM Acetat (pH 4-6), Phosphat (pH 7-8), Glycin-NaCl-NaOH (pH 8,5-10,5) oder KCl-NaOH (pH 11-12) gemessen. Jede Reaktion wurde bei 45ºC für 10 Minuten ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt.

(4) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur

Wirkt über einen breiten Temperaturbereich von 10 bis 60ºC mit einer optimalen Temperatur von 55ºC (siehe Figur 3).

(5) Thermische Stabilität

Restaktivitäten des Enzyms, wenn es bei verschiedenen Temperaturen für 30 Minuten in Glycin-NaCl-NaOH-Puffer (pH 9,5) behandelt wurde, wurden gemessen. Das erfindungsgemäße Enzym verlor kaum seine Aktivität bei 45ºC und hatte eine Restaktivität von etwa 50 % auch bei 52ºC (siehe Figur 4).

(6) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des Enzyms der vorliegenden Erfindung wurde mit Hilfe von Gelfiltration unter Verwendung von Biogel A 0,5 m gemessen. Das erfindungsgemäße Enzym hatte ein Molekulargewicht von etwa 110000 ± 10000.

(7) Wirkung von Metallionen

Zugabe von Hg²&spplus;-, Pb²&spplus;- und Cd²&spplus;-Ionen (1 mM jeweils) ergeben eine nachteilige Wirkung und Zugabe von Mn²&spplus;-Ionen (1 mM) ergibt eine leicht nachteilige Wirkung.

(8) Wirkungen von Detergentien

0,05 Gewichtsprozent Tenside, wie lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), Natriumalkylsulfat (AS), Natriumpolyoxyethylenalkylsulfat (ES), Natrium-α-olefinsulfonat (AOS), Natrium α-sulfonierte Fettsäureester (α-SFE), Natriumalkylsulfonat (SAS), Natriumdodecylsulfat (SDS), Seifen und Softanol wurden bei 40ºC für 15 Minuten untersucht und bestätigten keine nachteilige Wirkung auf die enzymatischen Aktivitäten.

(9) Wirkung von chelatbildenden Mitteln

Chelatbildende Mittel, wie EDTA (10 mM), EGTA (10 mM), Zitronensäure (0,05 Gew.-%) und Zeolith (0,05 Gew.-%) geben keine nachteilige Wirkung auf die enzymatischen Aktivitäten.

(10) Beständigkeit gegen Protease

In Gegenwart von alkalischer Protease, beispielsweise API-21 (Showa Denko), Maxatase (IBIS) und Sabinase, Alkalase und Esperase (Novo) in einer Menge von 0,2 AU/l wurden die Aktivitäten gemessen unter Bestätigung, daß das erfindungsgemäße Enzym eine starke Beständigkeit zu den Proteasen aufweist.

Enzymologische Eigenschaften von gereinigter alkalischer Pullulanase Z-1

(1) Wirkung

Hydrolysiert α-1,6-Bindung von Pullulan unter Herstellung von Maltotriose und hydrolysiert α-1,6-glycosidische Bindungen von Stärke, Amylopektin, Glykogen oder deren Teilabbauprodukten.

(2) Substratspezifität

Besitzt hydrolytische Aktivität gegen α-1,6-glycosidische Bindungen von Zuckern mit einem höheren Polymerisationsgrad als jener von Maltose, wie in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2 Substrat Konzentration (M) relative Aktivität (%) Pullulan Glykogen (Austern) Glykogen (Rattenleber) Amylopektin Amylose Maltose Maltotriose Panose Isomaltose Isomaltotriose Gentiobiose

(3) Arbeits-pH-Wert und optimaler pH-Bereich

Weist einen aktiven pH-Bereich von 5 - 11 mit einem optimalen pH-Bereich von 9,5 - 11 auf.
Pullulanaseaktivitäten bei verschiedenen pH-Werten wurden unter Verwendung des jeweiligen Reaktionssystems, bestehend aus 0,25 % (Gewicht/Volumen) Pullulan und einer Pufferlösung von 10 mM Acetat (pH 4-6), Phosphat (pH 6-8,5), Glycin-NaCl-NaOH (pH 8,5-11) oder KCl-NaOH (pH 11-12), gemessen. Jede Umsetzung wurde bei 40ºC für 30 Minuten ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.

(4) pH-Stabilität

Ist stabil in einem pH-Bereich von 8-10 und behält relative Aktivität von 50 % oder mehr der Aktivität bei optimalem pH-Bereich auch im pH-Bereich von 7 - 10,5 bei.
Pullulanaseaktivitäten mit verschiedenen pH-Werten wurden unter Verwendung eines jeweiligen Reaktionssystems, bestehend aus 0,25 % (Gewicht/Volumen) Pullulan und einer Pufferlösung von 10 mM Acetat (pH 4-6), Phosphat (pH 6-8,5), Glycin-NaCl-NaOH (pH 8,5-11) oder KCl-NaOH (pH 11-12) gemessen. Jede Reaktion wurde bei 45ºC für 10 Minuten ausgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 6 dargestellt.

(5) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur

Ist aktiv in einem breiten Temperaturbereich von 10 bis 60ºC mit einem optimalen Temperaturbereich von 50ºC (siehe Figur 7).

(6) Thermische Stabilität

Restaktivitäten des Enzyms, wenn es bei verschiedenen Temperaturen für 30 Minuten in Glycin-NaCl-NaOH-Puffer (pH 9,5) behandelt wurde, wurden gemessen. Das erfindungsgemäße Enzym zeigte kaum Aktivitätsverlust bei 40ºC und hatte eine Restaktivität von etwa 50 % auch bei 50ºC (siehe Figur 8).

(7) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms wurde mit SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (7,5 % Gel) ausgeführt. Das erfindungsgemäße Enzym hatte ein Molekulargewicht von etwa 120000 ± 5000.

(8) Wirkungen von Metallionen

Zugabe von Hg²&spplus;-, Cd²&spplus;- und Mn²&spplus;-Ionen (1 mM jeweils) ergaben nachteilige Wirkung und Zugabe von Pb²&spplus;-Ionen (1 mM) gab einen leicht nachteiligen Einfluß.

(9) Wirkungen von Waschmitteln

0,05 Gew.-% Tenside, wie lineares Alkylbenzolsulfonat (LAS), Natriumalkylsulfat (AS), Natriumpolyoxyethylenalkylsulfat (ES), Natrium-α-olefinsulfonat (AOS), Natrium α-sulfonierter Fettsäureester (α-SFE), Natriumalkylsulfonat (SAS), Natriumdodecylsulfat (SDS), Seifen und Softanol wurden bei 40ºC für 15 Minuten unter Bestätigung, daß keine nachteilige Wirkung auf die enzymatischen Aktivitäten ausgeübt wurde, geprüft.

(10) Wirkungen von chelatbildenden Mitteln

Chelatbildende Mittel, wie EDTA (10 mM), EGTA (10 mM), Zitronensäure (0,05 Gew.-%) und Zeolith (0,05 Gew.-%) gaben keine nachteilige Wirkung auf die enzymatischen Aktivitäten.

(11) Beständigkeit gegen Protease

In Gegenwart von alkalischer Protease, wie beispielsweise API-21 (Showa Denko), Maxatase (IBIS), Sabinase, Alkalase und Esperase (Novo) in einer Menge von 0,2 AU/l, wurden die Aktivitäten gemessen, unter Bestätigung, daß das erfindungsgemäße Enzym eine starke Beständigkeit zu Proteasen aufweist.
Erfindungsgemäße alkalische Pullulanase hat einen höheren optimalen pH-Bereich (pH 9,5-11) als übliche alkalische Pullulanasen und eine ausgezeichnete Stabilität gegenüber einem breiteren pH-Bereich. Es hat ein Temperaturoptimum von mehr als 50ºC und ist thermisch stabil bis zu 40ºC. Des weiteren weist alkalische Pullulanase der vorliegenden Erfindung starke Beständigkeit zu fast allen Waschmittelverbindungen, wie Tensiden, chelatbildenden Mitteln, Proteasen für Waschmittel, u.dgl., auf. Folglich kann das erfindungsgemäße Enzym vorteilhafterweise als Waschmittelkomponente verwendet werden. Außerdem kann das erfindungsgemäße Enzym zur Herstellung von unterschiedlichen Arten von Oligosacchariden und auch zusammen mit α-Amylase zur Herstellung von verschiedenen Monosacchariden verwendet werden. Das erfindungsgemäße Enzym hat somit außerordentliche Bedeutung auf dem industriellen Gebiet.
Weitere Merkmale der Erfindung werden im Verlaufe der nachstehenden Beschreibung der beispielhaften Ausführungsformen ersichtlich, die zur Erläuterung der Erfindung angegeben sind und nicht vorgesehen sind, diese darauf zu beschränken.

Beispiele

Beispiel 1

Ein Löffel voll Boden (etwa 0,5 g) Yokohama-shi, Kanagawa-ken, Japan, wurde in sterilisierter Salzlösung suspendiert und das Gemisch wurde bei 80ºC für 15 Minuten wärmebehandelt. Der Überstand des wärmebehandelten Gemisches wurde geeigneterweise verdünnt, auf ein isoliertes Agarmedium (Medium A) angewendet und bei 30ºC für 3 Tage unter Bildung von Kolonien gezüchtet. Die Kolonien, die aufgrund der Pullulanauflösung durchsichtige Zonen an ihrer Peripherie bildeten, unter Bereitstellung von pullulanaseerzeugenden Stämmen wurden gesammelt. Diese Stämme wurden in das flüssige Medium B überimpft und als Schüttelkultur bei 30ºC für 3 Tage gehalten. Nach dem Züchten wurde die Brühe zentrifugiert unter Abtrennung eines Überstandes. Die Pullulanaseaktivität des Überstands wurde bei pH 10 gemessen, um alkalische pullulanaseerzeugende Stämme zu selektieren. Bacillus sp. KSM-AP1876 (FERM P 10887) wurde so erhalten. Medium A Gew.-% Pullulan gefärbtes Pullulan Polypepton Hefeextrakt Agar Medium B Gew.-% Pullulan Trypton Hefeextrakt

Beispiel 2

Alkalische pullulanaseerzeugende Stämme Bacillus sp. KSM-AP1876 wurden in das flüssige Medium B von Beispiel 1 überimpft und für 3 Tage bei 30ºC als Schüttelkultur gehalten. Nach dem Züchten wurden die Zellen durch Zentrifugieren entfernt unter Bereitstellung von roher Pullulanase. Das Rohenzym wurde gemäß üblichem Verfahren unter Herstellung von Ethanoltrockenpulver verarbeitet. Im Ergebnis wurde die Erzeugung von Enzympullulanase, wie in Tabelle 3 dargestellt, bestätigt. Die Enzymaktivität wurde bei pH 9 gemessen. Tabelle 3 Stamm Menge an Enzym pro 1 l Medium (g) enzymatische Aktivität (U/g)

Beispiel 3

Alkalische pullulanaseerzeugende Stämme von Bacillus sp. KSM-AP1876 wurden in ein Medium mit derselben Zusammensetzung wie das flüssige Medium in Beispiel 1 überimpft, mit der Abweichung, daß 1 % Maltose anstelle von Pullulan zugegeben wurde und für 2 - 3 Tage bei 30ºC unter Schütteln gezüchtet wurde. Die Pullulanaseaktivität eines Überstandes nach Zentrifugieren wurde gemessen und es wurden 211 U pro Liter Kulturbrühe gefunden.

Beispiel 4

Zu dem Rohenzym, hergestellt in Beispiel 2, wurde DEAE Cellulosepulver gegeben und Pullulanase in dem Rohenzym wurde vollständig an der DEAE Cellulose absorbiert. Nachdem 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8) zum Waschen eines Harzes verwendet wurde, wurde Enzym unter Verwendung von 10 mM Tris-HCl- Puffer (pH 8), enthaltend 0,6 M Natriumchlorid, eluiert. Der 10 mM Tris-HCl-Puffer, in den das Enzym eluiert wurde, wurde Dialyse zur Konzentrierung des Puffers unterzogen. Das Enzym wurde dann an mit dem Puffer konditionierter DEAE-Cellulose DE52, absorbiert und mit einem Gradienten mit 10 mM Tris-HCl- Puffer (pH 8), enthaltend Natriumchlorid mit einer Konzentration von 0-1 M zur Gewinnung aktiver Fraktionen, eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran (10-kDa cut-off) konzentriert und über Nacht gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8), enthaltend 0,1 M Natriumchlorid, dialysiert. Nach Konzentrieren und Dialysieren wurde das Eluat Absorption unter Verwendung einer Sephacryl S-200 Säule, konditioniert mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8), enthaltend 0,1 M Natriumchlorid, unterzogen. Das Enzym wurde mit 0,1 M Natriumchlorid in 10 mM Tris-HCl-Puffer unter Gewinnung aktiver Fraktionen eluiert, die einem Absorptionsverfahren durch Verwendung einer DEAE Toyopearl-Säule 650S unterzogen wurden. Das absorbierte Enzym wurde als Gradient unter Verwendung von 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8), enthaltend Natriumchlorid mit einer Konzentration von 0-1 M, unter Gewinnung aktiver Fraktionen eluiert. Nach Konzentrieren auf einer Ultrafiltrationsmembran wurden die aktiven Fraktionen einem Absorptionsverfahren unter Verwendung einer Butyl-Toyopearl- Säule 650S unterzogen, die mit 10 mM Tris-HCl-Puffer, enthaltend 2 M Ammoniumsulfat, konditioniert wurde. Die Säule wurde mit einem Gradienten mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8), enthaltend Ammoniumsulfat mit einer Konzentration von 2 - 0 M, unter Gewinnung aktiver Fraktionen eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden an einer Ultrafiltrationsmembran konzentriert und über Nacht gegen 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8) dialysiert unter Erhalt eines gereinigten Enzyms von alkalischer Pullulanase Z-1. Das gereinigte Enzym wurde Polyacrylamidgelelektrophorese (Gelkonzentration 15 %) unterzogen, gemäß dem Verfahren von Davis [Davis D.J., Ann. N.Y. Acad. Sci., 121, 404, (1964)] und mit Coomassie Brilliant Blue gefärbt unter der Bestätigung, daß eine einzelne Bande vorlag(siehe Figur 9). Die Ausbeute an aktivem Enzym betrug etwa 4 %.

Beispiel 5

Die alkalische Pullulanase Z-1, erhalten in Beispiel 4, wurde SDS-Elektrophorese gemäß einem üblichen Verfahren unterzogen, unter Bestätigung, daß das Enzym ein Molekulargewicht von 120000 ± 5000 hatte.
Selbstverständlich sind verschiedene Modifizierungen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Licht vorstehender Lehren möglich. Es ist daher selbstverständlich, daß innerhalb des Schutzbereichs der beigefügten Ansprüche die Erfindung auch anderweitig ausgeführt werden kann als hierin speziell beschrieben.

Claims

1. Gereinigte alkalische Pullulanase Z-1 mit nachstehenden enzymologischen Eigenschaften:

(1) Wirkung

Hydrolysiert α-1,6-Bindung von Pullulan unter Herstellung von Maltotriose und hydrolysiert α-1,6-glycosidische Bindungen von Stärke, Amylopektin, Glykogen oder deren Teilabbauprodukten;

(2) Substratspezifität

besitzt hydrolytische Aktivität gegen α-1,6-glycosidische Bindungen von Zucker mit einem größeren Polymerisationsgrad als jener von Maltose;

(3) Arbeits-pH-Wert und optimaler pH-Bereich

hat einen aktiven pH-Bereich von 5 - 11 mit einem optimalen pH-Bereich von 9,5 - 11;

(4) pH-Stabilität

ist in einem pH-Bereich von 8-10 stabil und behält relative Aktivität von 50 % oder mehr der Aktivität bei dem optimalen pH-Bereich, auch in einem pH-Bereich von 7 - 10,5 bei, wenn bei 45ºC für 10 Minuten behandelt;

(5) Arbeitstemperatur und optimale Temperatur

ist über einen breiten Temperaturbereich von 10 -60ºC mit einem Temperaturoptimum um 50ºC aktiv;

(6) thermische Stabilität

ist sehr stabil bei 40ºC, wenn sie in 10 mM Glycin- NaCl-NaOH-Puffer (pH 9,5) für 30 Minuten behandelt wird;

(7) Molekulargewicht

etwa 120000 ± 5000, gemessen mit Hilfe von Elektrophorese unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat;

(8) Wirkungen von Metallionen

nachteilig beeinflußt durch Hg²&spplus;-, Cd²&spplus;-, Mn²&spplus;- und Pb²&spplus;-Ionen;

(9) Wirkungen von Waschmitteln

Kaum beeinflußt durch Tenside, wie LAS, AS, ES, AOS, α-SFE, SAS, SDS, Seifen und Softanol;

(10) Wirkung von chelatbildenden Mitteln

kaum beeinflußt von EDTA, EGTA, Zitronensäure und Zeolith;

(11) Beständigkeit gegen Protease

zeigt hohe Beständigkeit gegen alkalische Proteasen.

2. Mikroorganismus, der eine alkalische Pullulanase gemäß Anspruch 1 erzeugt, wobei der Mikroorganismus "Bacillus sp. KSM-AP1876" genannt wird und als FERM P-10887 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology hinterlegt wurde.

3. Verfahren zur Herstellung einer alkalischen Pullulanase nach Anspruch 1, wobei das Verfahren umfaßt: Züchten eines Mikroorganismus mit dem Namen Bacillus sp. KSM-AP1876 und hinterlegt als FERM P-10887 beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, und Gewinnen der alkalischen Pullulanase aus dem Kulturmedium.