DE69019609T2

DE69019609T2 - Proteine und deren Herstellung.

Info

Publication number: DE69019609T2
Application number: DE69019609T
Authority: DE
Inventors: Yukio Fujisawa; Shuji Hinuma; Aki Mayumi
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1989-07-07
Filing date: 1990-07-05
Publication date: 1995-11-30
Anticipated expiration: 2010-07-06
Also published as: DE69019609D1; CA2020668C; EP0406857A1; CA2020668A1; US5556946A; US5728552A; ATE123065T1; EP0406857B1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Fusionsproteinen, die ein Antigen für Vakzin und ein Lymphokin zur Herstellung eines Vakzins umfassen, und Techniken zur Herstellung von Fusionsproteinen, die als Immunogene therapeutischer und präventiver Vakzine nützlich sind, indem Gene für Fusionsproteine von Virus-Antigenen exprimiert werden, die für Vakzine mit Interleukin-2 in Eukaryonten und Prokaryonten verwendet werden, unter Verwendung von rekombinanten DNA- Techniken. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung Techniken zur Herstellung von Hybrid-Proteinen, die als Immunogene für therapeutische und präventive Vakzine nützlich sind, indem für Vakzine verwendete Antigene mit Interleukin-2 chemisch kombiniert werden.
Eine Substanz zur Stimulierung von Immunantworten auf ein Antigen wird als ein Adjuvans bezeichnet, das Vakzinen oft als ein Hilfsmittel zugegeben wird. Als die am allgemeinsten verwendeten Adjuvantien sind Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat und das Freund'sche Adjuvans bekannt. Zur Zeit werden Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat für den Menschen verwendet, und Freund'sche Adjuvantien können aufgrund ihrer starken Nebenwirkungen nicht beim Menschen verwendet werden. Als alternative Substanzen für Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat sind Muramyldipeptid- (MDP-) Derivate, verschiedene Lymphokine, Lipid-A-Derivate, Cholera-Toxine und dergleichen untersucht worden.
Die meisten der durch Methoden der Gentechnologie hergestellten Antigene weisen im allgemeinen eine schwache Immunogenität auf. Es ist daher erwünscht, ein starkes Adjuvans mit verminderten Nebenwirkungen anstelle von Aluminiumhydroxid und Aluminiumphosphat zu entwickeln oder ein Antigen mit einer verbesserten Immunogenität herzustellen, um die Immunogenität dieser Antigene zu verbessern.

KURZBESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben Untersuchungen mit der Aufgabe der Herstellung eines Antigens mit einer stärkeren Immunogenität durchgeführt. Als ein Ergebnis haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, daß Fusionsproteine, die durch das Kombinieren von Antigen-Proteinen mit Lymphokinen durch Methoden der Gentechnologie und Hybrid- Proteine, die durch deren chemische Kombination erhalten werden, diese Aufgabe lösen können.
In Einklang mit der vorliegenden Erfindung werden (1) eine Verwendung eines Fusionsproteins, umfassend ein Antigen für Vakzin und ein Lymphokin zur Herstellung eines Vakzins, (2) ein Fusionsprotein, das durch das Kombinieren eines für ein Vakzin verwendeten Virus-Antigens mit einem Lymphokin, das Interleukin 2 ist, durch Gentechnologie-Techniken erhalten wird, (3) eine rekombinante DNA, die eine Nucleotid-Sequenz enthält, die für das in (1) beschriebene Fusionsprotein codiert, (4) eine Transformante, die die in (3) beschriebene rekombinante DNA trägt, (5) ein Verfahren zur Herstellung des Fusionsproteins, umfassend das Kultivieren der in (4) beschriebenen Transformante, das Herstellen und Akkumulieren des in (2) beschriebenen Fusionsproteins in einer Kultur und das Sammeln des Fusionsproteins, und (6) ein Hybrid-Protein, erhalten durch das chemische Kombinieren eines Virus-Antigens, das für ein Vakzin verwendet wird, mit einem Lymphokin, das Interleukin 2 ist, verfügbar gemacht.

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Darstellung, die ein Beispiel für eine Aminosäure-Sequenz eines Oberflächen-Protein-Gens gD des HSV-1-Stamms Miyama darstellt;
Fig. 2 ist eine Darstellung, die ein Beispiel für eine Nucleotid-Sequenz darstellt, die der in Fig. 1 dargestellten Aminosäure-Sequenz entspricht;
Fig. 3 ist eine Darstellung, die ein Beispiel für eine Aminosäure-Sequenz eines Oberflächen-Protein-Gens gB des HSV-1- Stamms Miyama darstellt;
Fig. 4 ist eine Darstellung, die ein Beispiel für eine Nucleotid-Sequenz darstellt, die der in Fig. 3 dargestellten Aminosäure-Sequenz entspricht;
Fig. 5 zeigt ein Beispiel für eine Nucleotid-Sequenz eines Oberflächen-Proteins gb des HSV-1-Stamms KOS und eine daraus abgeleitete Aminosäure-Sequenz;
Fig. 6 zeigt ein Beispiel für eine Nucleotid-Sequenz eines Oberflächen-Proteins des HSV-1-Stamms F und eine daraus abgeleitete Aminosäure-Sequenz;
Fig. 7 ist eine Darstellung, die eine Aminosäure-Sequenz einer interleukin-2-aktiven Substanz darstellt;
Fig. 8 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau des Plasmids pHSG396SgD zeigt;
Fig. 9 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau eines truncierten Gens gD von HSV-1 darstellt;
Fig. 10 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau eines Expressions-Plasmids eines erfindungsgemäßen Fusions- Protein-Gens darstellt;
Fig. 11 ist eine Darstellung, die eine Nucleotid-Sequenz des in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Gens des Fusions- Proteins darstellt;
Fig. 12 ist eine Darstellung, die eine aus der in Fig. 11 dargestellten Nucleotid-Sequenz hergeleitete Aminosäure-Sequenz darstellt;
Fig. 13 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau eines Expressions-Plasmids des truncierten Gens gD von HSV-1 für tierische Zellen zeigt;
Fig. 14 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau eines Expressions-Plasmids des erfindungsgemäßen Fusions- Protein-Gens für tierische Zellen darstellt;
Fig. 15 ist eine graphische Darstellung, die den Anteil der Überlebenden Mäuse als Funktion des Zeitraumes nach der Inokulation von HSV darstellt;
Die Fig. 16-1, 16-2, 16-3, 16-4, 16-5, 16-6 und 16-7 sind schematische Darstellungen, die den Aufbau der in Bezugsbeispiel 2 verwendeten Plasmide zeigen;
Fig. 17 ist eine Darstellung, die eine Nucleotid-Sequenz und eine Aminosäure-Sequenz darstellt, die von der Nucleotid- Sequenz des in das Plasmid pUC18 in Bezugsbeispiel 2 insertierten Gens gpI abgeleitet ist;
Fig. 18 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau eines Expressions-Plasmids des erfindungsgemäßen Fusions- Protein-Gen für tierische Zellen zeigt;
Fig. 19 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau eines Expressions-Plasmids des erfindungsgemäßen Fusions- Protein-Gens für tierische Zellen zeigt;
Fig. 20 zeigt die Western-Blotting-Analyse des erfindungsgemäßen Fusions-Proteins;
Fig. 21 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau eines Expressions-Plasmids des erfindungsgemäßen Fusions- Protein-Gens für tierische Zellen zeigt und
Fig. 22 ist eine schematische Darstellung, die den Aufbau eines Expressions-Plasmids des erfindungsgemäßen Fusions- Protein-Gens für tierische Zellen zeigt.

BESCHEIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Bevorzugte Lymphokine zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen Interleukin (hiernach bezeichnet als IL) -1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, koloniestimulierender Faktor für Granula (G-CSF), koloniestimulierender Faktor für Granula-Makrophagen (GM-CSF), koloniestimulierender Faktor für Makrophagen (M-CSF) und Interferon-γ.
Die für Vakzine verwendeten Antigene (Proteine oder Polypeptide) in Einklang mit der vorliegenden Erfindung umfassen Antigene von Viren, deren Gäste Tiere sind, wie Antigene von Herpes-Viren, einschließlich des Herpes-simplex-Virus (HSV), des Varicella-zoster-Virus (VZV) und des Cytomegalovirus (CMV); Antigene von Retroviren einschließlich des Menschliche- Immunschwäche-Virus (HIV) und dem Virus der adulten T-Zell- Leukämie des Menschen (HTLV-1); Antigene von Hepatitisviren einschließlich des Hepatitis-B-Virus (HBV); Antigene von Togaviren einschließlich von Hepatitis-non-A-non-B-Viren (HCV und HEV) und des Japanische-Enzephalitis-Virus; Antigene von Picornaviren einschließlich des Hepatitis-A-Virus (HAV); Antigene von Orthomyxoviren einschließlich von Influenzaviren;
Antigene von Parvoviren; Antigene von Papovaviren; Antigene von Adenoviren; Antigene von Pockenviren; Antigene von Reoviren; Antigene von Paramyxoviren; Antigene von Rhabdoviren; Antigene von Arenaviren und Antigene von Coronaviren; Antigene von pathogenen Protozoen wie ein Malaria-Antigen und Antigene pathogener Bakterien wie ein Antigen von Bordetella pertussis.
Beispiele für solche Antigene umfassen das Oberflachen-Antigen gD oder gB des Herpes-simplex-Virus (HSV) vom Typ 1 oder Typ 2, das Oberflächen-Antigen gpI oder gpIII des Varecellazoster-Virus (VZV), das Antigen gag oder das Antigen env des Menschliche-Immunschwäche-Virus (HIV), das Antigen gag oder das Antigen env des Virus der adulten T-Zell-Leukämie des Menschen (HTLV-I), das Antigen C, das Antigen M oder das Antigen E des Hepatitis-C-Virus (HCV) und das Kern-Antigen, das Oberflachen-Antigen von Protein L, das Oberflächen-Antigen von Protein M oder das Oberflächen-Antigen von Protein S des Hepatitis-B-Virus (HBV).
In einigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kann das für Vakzin verwendete Antigen mit dem Lymphokin durch einen Linker fusioniert werden. In anderen Ausführungsformen wird ein Hybrid-Protein, das ein als Vakzin verwendetes Antigen und ein Lymphokin umfaßt, durch chemische Verfahren hergestellt.
Linker zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest, der 2 bis etwa 30 Aminosäurereste (vorzugsweise einen Aminosäurerest oder einen Peptidrest, der 2 bis etwa 10 Aminosäurereste umfaßt) umfaßt, ausgewählt aus G, A, V, L, I, S, T, C, M, E, D, K, R, H, F, Y, W, P, N und Q.
Als ein Beipiel wird hiernach ein Fusionsprotein eines HSV- Oberflächenproteins, das ein HSV-Antigen ist, mit IL2 beschrieben.
Als das HSV-Oberflächen-Protein werden vorteilhaft die Glycoproteine gD und gB verwendet, denen Transmembran-Domänen fehlen.
Die vorliegende Erfindung macht insbesondere (1) ein Fusionsprotein (I) aus Glycoprotein gD, dem die Transmembran-Domäne fehlt, mit IL-2 oder ein Fusionsprotein (II) aus Glycoprotein gb, dem die Transmembran-Domäne fehlt, mit IL-2; (2) die rekombinanten DNA (III) und (IV), die für die Fusions-Proteine (I) bzw. (II) kodierende Nucleotid-Sequenzen enthalten; (3) Transformanten, die die rekombinanten DNA (III) bzw. (IV) tragen; und (4) ein Verfahren zur Herstellung des Fusionsproteins (I) oder (II), umfassend das Kultivieren der transformant-tragenden rekombinanten DNA (III) oder (IV), das Produzieren und Akkumulieren des Fusions-Proteins (I) oder (II) in einer Kultur und das Sammeln des Fusions-Proteins (I) oder (II), verfügbar.
Als Oberflächen-Protein-Gene des HSV können zum Beispiel die Gene gD und gB verschiedener HSV-1-Stämme wie des HSV-1-Stammes Miyama verwendet werden. Beispiele für die gd-Gene umfasden ein Gen, das für die in Fig. 1 dargestellte Aminosäure- Sequenz (Oberflächer-Protein gD des HSV-1-Stamms Miyama, japanische Patentanmeldung Nr. 63-180114/1988) codiert. Der essentielle Teil dieser Aminosäure-Sequenz geht von Lys der Nr. 26, bis Ala der Nr. 302. Beispiele für die DNA, welche die für dieses gD codierende Nucleotid-Sequenz enthalten, umfassen eine DNA mit der in Fig. 2 dargestellten Nucleotid-Sequenz. Der Teil von Nr. 186 bis Nr. 1016 derselben entspricht dem essentiellen Teil. Beispiele für gD umfassen ein Polypeptid mit der in Fig. 3 dargestellten Aminosäuresequenz (Oberflächen-Protein gB des HSV-1-Stamms Miyama, japanische Patentanmeldung Nr. 1-158238/1989, eingereicht am 22. Juni 1989, und japanische Patentanmeldung Nr. 1-308941/1989, eingereicht am 30. November 1989). Deren essentieller Teil geht von Ala der Nr. 1 bis Asp der Nr. 293. Beispiele für DNA, die die für diesen gB codierende Nucleotid-Sequenz enthalten, umfassen eine DNA mit der in Fig. 4 dargestellten Nucleotid-Sequenz. Der Teil von Nr. 341 bis Nr. 1219 derselben entspricht dem essentiellen Teil. Die gB-Gene umfassen weiterhin zum Beispiel Gene mit Nucleotid-Sequenzen und den daraus abgeleiteten Aminosäure-Sequenzen, wie sie in Fig. 5 [Oberflächen-Protein gB des HSV-1-Stamms KOS, D. J. Bzik et al., Virol. 133, 301 (1984)) und Fig. 6 [Oberflächen-Protein gB des HSV-1-Stamms F, P. E. Pellet et al., J. Virol. 53, 243 (1985)] dargestellt sind. Die IL-2-Gene werden mit diesen Genen kombiniert, vorzugsweise mit dem truncierten gD und/oder gB-Gen, dem die codierenden Bereiche der Transmembran-Domänen fehlen, wodurch die Gene des Fusions-Proteins konstruiert werden können.
Aminosäurereste in einem Protein können durch Oxidation, Reduktion oder andere Derivatisierungen ohne Aktivitätsverlust modifiziert werden. Weiterhin können Modifikationen der Primärstruktur von Proteinen durch Deletion, Hinzufügung oder Modifizierung der Aminosäuren gemacht werden, ohne die Aktivität des Proteins zu zerstören. Solche Modifikationen sind in der Definition des "essentiellen Teils", wie sie hier verwendet wird, eingeschlossen, solange die biologische Aktivität des Proteins nicht zerstört wird. Es wird erwartet, daß solche Modifikationen qualitativ oder quantitativ die biologische Aktivität des Proteins in den Vakzinen der vorliegenden Erfindung beeinflussen.
IL-2 ist ein besonders bevorzugtes Lymphokin zur Verwendung in den Vakzinen der vorliegenden Erfindung. Es kann ein beliebiges IL-2-Gen verwendet werden, solange es für eine IL-2- aktive Substanz codiert. Die IL-2-aktive Substanz kann ein beliebiges IL-2 sein, solange es eine IL-2-Aktivität aufweist, nämlich die Aktivität des Ermöglichens der Passagen-Erhaltung von T-Zellen. Beispiele für solche Substanzen umfassen natürliches IL-2, das in Tierkörpern oder Tierzellen produziert wird, rekombinantes IL-2, das durch Rekombinationstechnik produziert wird, und deren verwandte Substanzen. Insbesondere ist menschliches IL-2 bevorzugt und insbesondere ist das rekombinante menschliche IL-2 bevorzugter. Wenn das oben beschriebene IL-2 und die damit verwandten Substanzen Proteine sind, können sie Zuckerketten enthalten oder nicht.
Im einzelnen können zum Beispiel Polypeptid (A), hergestellt durch Gentechnologie-Technik und mit der in Fig. 7 dargestellten Aminosäure-Sequenz (siehe die Veröffentlichung der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 61-78799/1986), und ein Fragment mit einem Teil der Aminosäure-Sequenz, die für deren biologische oder immunologische Aktivität erforderlich ist, verwendet werden.
Beispiele für die Fragmente umfassen ein Fragment, dem ein Aminosäurerest am Aminoterminus fehlt (siehe die europäische Patent-Veröffentlichung Nr. 91539), ein Fragment, dem 4 Aminosäurereste am aminoterminalen Teil fehlen (siehe die Veröffentlichung der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 60-126088/1985), und ein Fragment, dem mehrere Aminosäurereste am carboxylterminalen Teil fehlen. Weiterhin kann ein Teil des obigen Polypeptids (A) deletiert oder durch (eine) unterschiedliche Aminosäure(n) substituiert werden. Zum Beispiel kann der Cystinrest in Position 125 durch einen Serinrest ersetzt werden (siehe die Veröffentlichung der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 59-93093/1984).
Das durch eine Gentechnologie-Technik produzierte rekombinante IL-2 kann ein Polypeptid sein, in dem weiterhin ein Met-Rest an den Amino-Terminus von Polypeptid (A) hinzugefügt ist (siehe die Veröffentlichung der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 61-78799/1986), oder eine Mischung aus Polypeptid (A) und dem Polypeptid, in dem weiterhin ein Met-Rest dem Amino-Terminus von Polypeptid (A) hinzugefügt ist (siehe die Veröffentlichung der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 60- 115528/1985).
Die rekombinante DNA (Expressions-Plasmid), die die Nucleotid- Sequenz zum Codieren für das kondensierte Protein (I) oder (II) der vorliegenden Erfindung umfaßt, kann zum Beispiel durch die folgenden Verfahren hergestellt werden.
(a) Aus einem Plasmid wird ein erwunschtes trunciertes Gen, in dem das Gen gD oder gB des HSV-1-Stamms Miyama geklont worden ist, ausgeschnitten.
(b) Dazu wird nach Bedarf ein geeigneter Linker gegeben, gefolgt vom Aufbau eines Fusionsgens, in dem ein IL-2-Gen an den 3'-terminalen Teil der DNA gekoppelt ist.
(c) Das resultierende Fusionsprotein wird stromabwärts von einem Promoter in einem Expressions-Vektor ligasiert.
In der vorliegenden Erfindung kann ein beliebiger Vektor (zum Beispiel Plasmid) verwendet werden, solange er in einer eucaryontenzelle als Wirt repliziert werden kann. Wenn Hefe der Wirt ist, umfassen Beispiele für solche Vektoren pSH19 [S. Harashima et al., Mol. Cell. Biol. 4, 771 (1984)] und pSH19-1 (Europäische Patent-Veröffentlichung Nr. 0 235 430), und ein Vehikel zur Expression von Fremdgenen wird durch das Insertieren eines Promotors darin erhalten. Wenn eine tierische Zelle der Wirt ist, wird das Vehikel zur Expression von Fremdgenen zum Beispiel durch das Insertieren eines von SV40 abstammenden Promotors, eines Retrovirus-Promotors oder dergleichen in pBR322 erhalten.
Als der in dieser Erfindung verwendete Promotor ist jeder Promotor verwendbar, solange der Promotor zum Exprimieren im Wirt, der zur Gen-Expression verwendet wird, geeignet ist. Wenn Hefe der Wirt ist, ist bevorzugt, daß ein GLD- (GAPDH-) Promotor, ein PHO5-Promotor, ein PGK-Promotor, ein ADH-Promotor, ein PH081-Promotor und dergleichen verwendet werden. Wenn eine tierische Zelle der Wirt ist, werden ein von SV40 abstammender Promotor, ein Retrovirus-Promotor und dergleichen vorzugsweise verwendet.
Die Promotoren können enzymatisch aus den entsprechenden Genen hergestellt werden. Sie können auch chemisch synthetisiert werden.
Durch Verwendung des Vektors, der die so aufgebaute rekombinante DNA enthält, wird die eukaryontische Zelle transformiert.
Der Wirt umfaßt zum Beispiel Hefe und tierische Zellen.
Beispiele für die Hefe umfassen Saccharomyces cerevisiae AH22R&supmin;, NA87-11A und DKD-5D und Schizosaccharomyces pombe ATCC38399 (h&supmin; leul-32) und TH168(h&sup9;&sup0; ade6-M210 ural leul) [M. Kishida et al., Current Genetics, 10, 443 (1986)].
Beispiele für die tierischen Zellen umfassen angewachsene Zellen wie die Affenzelle COS-7, die Vero-Zelle, die Eierstock-Zelle des chinesischen Hamsters (CHO), die Mauszelle L und die Humanzelle FL und nicht angewachsene Zellen wie die Maus-Myelomzelle (wie SP2/0), die Mauszelle YAC-1, die Mauszelle MethA, die Mauszelle P388 und die Mauszelle EL-4.
Die Transformation der Hefe wird in Einklang zum Beispiel mit dem Verfahren, wie es in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 75, 1929 (1978) beschrieben ist, durchgeführt. Die Transformation der tierischen Zelle wird in Einklang zum Beispiel mit dem Verfahren, wie es in Virology, 52, 456 (1973) beschrieben ist, durchgeführt.
Die so erhaltenen Transformanten (Rekombinanten) werden durch an sich bekannte Verfahren kultiviert.
Wenn die Transformanten, in denen Hefe der Wirt ist, kultiviert werden, wird zum Beispiel Burkholder-Minimalmedium [K. L. Bostian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 77, 4505 (1980)] als Medium verwendet. Der PH-Wert des Mediums wird vorzugsweise auf etwa 5 bis 8 eingestellt. Die Kultivierung wird normalerweise bei ungefähr 20 bis 35 ºC etwa 24 bis 72 Stunden lang durchgeführt, falls erforderlich, mit Belüftung oder Rühren.
Wenn die Transformanten, in denen eine tierische Zelle der Wirt ist, kultiviert werden, kann zum Beispiel etwa 5 bis 20 % fötales Kalbserum enthaltendes MEM-Medium [Science, 122, 501 (1952)], DMEM-Medium [Virology, 8, 396 (1959)], RPMI1640- Medium [Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)] und das Medium 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] verwendet werden. Der pH- Wert beträgt vorzugsweise etwa 6 bis 8. Die Kultivierung wird normalerweise bei etwa 30 bis 40 ºC etwa 15 bis 60 Stunden lang durchgeführt, falls erforderlich, mit Belüftung oder Rühren.
In der gegenwärtigen Erfindung können die Fusions-Proteine mit sowohl der HSV-Oberflächen-Antigenität als auch der IL-2- Aktivität durch geeignete Kombinationen von an sich bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren getrennt und gereinigt werden. Diese bekannten Trenn- und Reinigungsverfahren umfassen Verfahren, die Löslichkeit verwenden, wie eine Salz-Ausfällung und eine Lösungsmittel-Ausfällung, Verfahren, die hauptsächlich einen Unterschied im Molekulargewicht ausnutzen, wie Dialyse, Ultrafiltration, Gelfiltration und SDS-Polyacrylamid- Gelelektrophorese, Verfahren, die einen Unterschied in der elektrischen Ladung ausnutzen, wie Tonenaustausch-Säulenchromatographie, Verfahren, die spezifische Affinitäten ausnutzen, wie Affinitäts-Chromatographie, Verfahren, die einen Unterschied der Hydrophobie ausnutzen, wie Reversed-Phase- Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie, und Verfahren, die einen Unterschied der isoelektrische Punkte ausnutzen, wie isoelektrische Fokussierungs-Elektrophorese.
Das Fusionsprotein eines vom HSV-Oberflächenprotein verschiedenen Antigens und IL-2 kann nach den oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung eines für das Antigen codierenden Gens (DNA) anstelle des HSV-Oberflächen-Protein-Gens hergestellt werden.
Das Fusions-Protein des für das Vakzin verwendeten Antigens und eines von IL-2 verschiedenen Lymphokins kann unter Verwendung eines für das Antigen codierenden Gens und eines für das Lymphokins codierenden Gens nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt werden.
Wenn der Virus ein teilweise oder vollständig einzelsträngiger Virus ist, kann eine durch Konversion mit DNA-Polymerase erhaltene doppelsträngige DNA verwendet werden. Wenn der Virus ein RNA-Virus ist, kann eine doppelsträngige DNA verwendet werden, die durch das Synthetisieren einer einsträngigen DNA durch das Verwenden einer reversen Transcriptase und das anschließende Konvertieren der einsträngigen BNA mit DNA- Polymerase erhalten wird.
Der zum Exprimieren der rekombinanten DNA verwendete Wirt kann eine prokaryontische Zelle wie Escherichia coli oder Bacillus sein. Um jedoch die Immunogenität der erhaltenen Antigen- Lymphokin-Fusionsproteine zu verbessern, wird vorteilhaft eine eukaryontische Zelle wie oben beschrieben verwendet.
Das gleichzeitig das für Vakzin verwendete Antigen und das Lymphokin enthaltende Protein kann erhalten werden, indem 2 Proteinarten durch chemische Verfahren wie unten beschrieben kombiniert werden, zusätzlich zu den obigen Techniken der Gentechnologie.
Zum Zweck der chemischen Kombination des für Vakzin verwendeten Antigens mit dem Lymphokin können nämlich in diesen Proteinen existierende Substituentengruppen wie Amino-, Carboxyl-, Hydroxyl- und Sulfhydryl-Gruppen verwendet werden. Es werden zum Beispiel die folgenden Verfahren verwendet.
(1) Eine reaktive Aminogruppe des einen Proteins wird mit einer reaktiven Carboxylgruppe des anderen Proteins durch Dehydratisierung in einem wasserlöslichen Lösungsmittel kondensiert, wobei ein wasserlösliches Carbodiimid-Reagens wie 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino-Propyl)-carbodiimid oder 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-p- toluolsulfonat verwendet wird.
(2) Eine reaktive Aminogruppe des einen Proteins wird mit einem reaktiven Ester von N-Hydroxysuccinimid wie p- Maleinsäureimidomethylcyclohexan-1-carboxyl-N-hydroxysuccinimidester oder N-(&epsi;-Maleinsäureimidocaproyloxy)- succinimidester umgesetzt, um das Protein zu maleinimidieren, und dann wird das resultierende Produkt mit einer Sulfhydrylgruppe (i) eines Proteins, das durch das Reduzieren des anderen Proteins mit Dithiothreit (DTT) oder (ii) eines Proteins, das durch das Einführen einer Sulfhydrylgruppe in das andere Protein mit N- Succinimidyl-3-(2-pyridylthio)-Propionat (SPDP) erhalten wird, um sie durch eine Thioether-Bindung zu kombinieren.
(3) Die beiden reaktiven Aminogruppen zweier Proteinarten werden durch Verwendung eines Dialdehyd-Reagenzes wie Succindialdehyd oder Glutaraldehyd miteinander kombiniert.
(4) Sulfhydrylgruppen werden durch Reduktion mit DTT oder durch SPDP in zwei Proteinarten eingeführt, gefolgt von der Reoxidation zur Herstellung eines Heterodimers.
Ein erwünschtes heterodimeres Protein kann darüber hinaus wirksam durch verschiedene Kombinationen dieser Verfahren hergestellt werden, so daß die Aktivitäten zweier Proteinarten nicht vermindert werden.
Nach Vervollständigung der oben beschriebenen Kombinierungs- Reaktionen können die resultierenden Hybrid-Proteine gereinigt und durch Gelchromatographie gereinigt und getrennt werden, wobei Sephadex G100 oder G200, Sepharose 6B oder 4B, Ultrogel AcA44 oder 34 oder Sephacryl S200 verwendet wird. Weiterhin können die Proteine auch durch eine Kombination mit Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung einer Antikörper- Säule getrennt werden.
Die Antigen-Lymphokin-Fusions-Proteine oder die Antigen- Lymphokin-Hybrid-Proteine, die in Einklang mit der vorliegenden Erfindung erhalten werden, weisen eine stärkere Immunogenität auf als die Antigene, die mit den Lmphokinen nicht fusionsiert oder kombiniert sind. Dies folgt aus der Tatsache, daß das Antigen und das Lymphokin gleichzeitig Lymphocyten dazu stimulieren, die Differenzierung und die Proliferation der Lymphocyten wirksam aufgrund der Anwesenheit des Antigens und des Lymphokins im selben Molekül zu fördern. Als ein Ergebnis wird die Produktion von Antikörpern auf die antigene signifikant verstärkt. Zusätzlich können die Antigen- Lymphokin-Proteine auch zellgebundene Immunität induzieren. Folglich sind diese Proteine als therapeutische Vakzine für Virus-Infektionskrankheiten, die bei Patienten beobachtet werden, deren immunologische Funktion vermindert ist (zum Beispiel Krebspatienten und AIDS-Patienten) und als therapeutische Vakzine zur Prävention erneut auftretender Krankheiten aufgrund von Viren, die persistente Infektionen induzieren (zum Beispiel Herpes-Viren, Retroviren und Hepatitis-Viren), besonders nützlich. Natürlich können die Antigen-Lymphokin- Proteine auch vorteilhaft als Präventiv-Vakzine zur Vermeidung der Infektion mit Viren, pathogenen Protozoen und pathogenen Bakterien verwendet werden.
Die in Einklang mit der Erfindung erhaltenen Antigen- Lymphokin-Proteine können (intramuskulär, subkutan oder intrakutan) in Einklang mit den Verabreichungs-Verfahren für verschiedene Vakzine, die zur Prävention der Infektion mit Viren, pathogenen Protozoen und pathogenen Bakterien verwendet werden, verabreicht werden. Zusätzlich können diese Proteine auch intravenös verabreicht werden. Weiterhin können die Antigen-Lymphokin-Proteine als solche allein, als Mischungen mit herkömmlichen pharmazeutisch verträglichen Trägern und als Liposomen-Präparat verwendet werden.
Wenn Basen, Aminosäuren und so weiter in dieser Beschreibung und in den Zeichnungen durch Abkürzungen bezeichnet werden, werden die von der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur eingeführten oder die im Fachgebiet üblicherweise benutzten Abkürzungen verwendet. Zum Beispiel werden die folgenden Abkürzungen verwendet. Wenn mit Bezug auf die Aminosäuren das optische Isomer existieren kann, wird, solange nichts anderes angegeben ist, die L-Form dargestellt.
DNA : Desoxyribonukleinsäure
cDNA : komplementäre Desoxyribonukleinsäure
RNA : Ribonukleinsäure
mRNA : Boten-RNA
A : Adenin
T : Thymin
G : Guanin
C : Cytosin
dATP : Desoxyadenosintriphosphat
dTTP : Desoxythymidintriphosphat
dGTP : Desoxyguanosintriphosphat
dCTP : Desoxycytidinphosphat
ATP : Adenosintriphosphat
EDTA : Ethylendiamintetraessigsäure
SDS : Natriumdodecylsulfat
DTT : Dithiothreit
Gly : Glycin (G)
Ala : Alanin (A)
Val : Valin (V)
Leu : Leucin (L)
Ile : Isoleucin (I)
Ser : Serin (S)
Thr : Threonin (T)
Cys : Cystein (C)
1/2 Cys: Halbes Cystein
Met : Methionin (M)
Glu : Glutaminsäure (E)
Asp : Asparaginsäure (D)
Lys : Lysin (K)
Arg : Arginin (R)
His : Histidin (H)
Phe : Phenylalanin (F)
Tyr : Tyrosin (Y)
Trp : Tryptophan (W)
Pro : Prolin (P)
Asn : Asparagin (N)
Gln : Glutamin (Q)
Apr ampicillin-resistentes Gen
Tcr : tetracyclin-resistentes Gen
ARS 1: Autonome Replikations-Sequenz 1
Mit Bezug auf die Proteine der vorliegenden Erfindung kann ein Teil der Aminosäure-Sequenz modifiziert werden, es kann nämlich eine Addition, Eliminierung oder Substitution durch (eine) andere Aminosäure(n) vorliegen, solange die Immunogenität nicht verloren geht.
Die vorliegende Erfindung wird hiernach durch die folgenden Beispiele und Bezugsbeispiele ausführlich beschrieben. Es ist natürlich anzumerken, daß diese Bezugsbeispiele und Beispiele lediglich veranschaulichend sind und eine Einschränkung des Rahmens der Erfindung nicht beabsichtigt ist.
Der in Beispiel 3 erhaltene, unten beschriebene und das Plasmid pHDLdhfrl tragende Transformant CHO-HDL-1-5 wurde beim Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan (FRL) unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2506 am 7. Juli 1989 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wurde darüber hinaus beim Institute for Fermantation, Osaka, Japan (IFO), unter der Hinterlegungsnummer IFO 50192 am 26. Juni 1989 hinterlegt.
Der im unten aufgeführten Bezugsbeispiel beschriebene, das Plasmid pHSD BJ-1 tragende Transformant Escherichia coli DH1/pHSD BJ-1 wurde beim FR1 unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1784 am 9. März 1988 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wurde darüber hinaus beim IFO unter der Hinterlegungsnummer IFO 14730 am 23. Februar 1988 hinterlegt.
Der im unten aufgeführten Beispiel 1 beschriebene, das Plasmid pGFE213 tragende Transformant Saccharomyces cerevisiae NA74-3A (p&supmin;)/pGFE213) wurde beim FRI unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2095 am 11. Oktober 1988 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wurde darüber hinaus beim IFO unter der Hinterlegungsnummer IFO 10460 am 19. September 1988 hinterlegt.
Die im unten aufgeführten Beispiel 6 beschriebene tierische Zelle SP-neo-HSD-39 wurde beim FRI unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2809 am 16. März 1990 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wurde darüber hinaus beim IFO unter der Hinterlegungsnummer IFO 50231 am 1. März 1990 hinterlegt.
Die im unten aufgeführten Beispiel 8 beschriebene tierische Zelle SP-neo-HLD-245 wurde beim FRI unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2810 am 16. März 1990 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wurde darüber hinaus beim IFO unter der Hinterlegungsnummer IFO 50232 am 1. März 1990 hinterlegt.
Der im unten aufgeführten Beispiel 5 beschriebene, das Plasmid pTB652 tragende Transformant Escherichia coli K12 DH1/pTB652 wurde beim FRI unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-1373 am 5. September 1986 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wurde darüber hinaus beim IFO unter der Hinterlegungsnummer IFO 14539 am 29. August 1986 hinterlegt.
Der im unten aufgeführten Beispiel 15 beschriebene, das Plasmid pVGL4 tragende Transformant Escherichia coli JM109/pVGL4 wurde beim FRI unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-2977 am 20. Juni 1990 hinterlegt. Dieser Mikroorganismus wurde darüber hinaus beim IFO unter der Hinterlegungsnummer IFO 15049 am 13. Juni 1990 hinterlegt.

Bezugsbeispiel 1

Herstellung des Plasmids pHSG396SgD

Eine für die 20 Aminosäurereste vom N-Terminus von gD codierende DNA, nämlich das in Fig. 8 dargestellte DNA-Fragment 73- bp, wurde chemisch synthetisiert und in den mit BamHI und HindIII aufgeschlossenen Vektor pUC8 insertiert.
Das entstehende pUC8 BamHI-HindIII73 wurde mit BamHI und NcoI aufgeschlossen, um ein Fragment 73-bp zu erhalten. Andererseits wurde ein DNA-Fragment NcoI-SacI mit etwa 1,28 kb durch das Klonieren des Plasmids pUC18gD mit einem Fragment HindIII- NruI [Plasmid pHSD BJ-1 (Herkunft: IFO 14730, FERM BP-1784], mit etwa 1,4 kb, erhalten, das den gD-codierenden Bereich des HSV enthielt. Das obige Fragment 73-bp und das obige Fragment NcoI-SacI-DNA-Fragment wurden mit einem BamHI-SacI-Aufschluß des Plasmid-Vektors pHSG396 (Takara Shuzo) umgesetzt, um das Subklonierungs-Plasmid pHSG396SgD herzustellen.

Bezugsbeispiel 2

(1) Herstellung von Virus-DNA des Varicella-zoster-Virus, Kuzuhara-Stamm

Flow-2000-Zellen (Herkunft menschliche fötale Lunge), die mit dem Varicella-zoster-Virus, Kuzuhara-Stamm (VZV, KY-Stamm) infiziert waren, wurden mit 10 : 1 auf eine Einzelzellschicht (1575 cm²) von Flow-2000-Zellen inokuliert, gefolgt von der Inkubation in GIT-Medium (Nihon Pharmaceutical) bei 37 ºC. Wenn wenigstens 50 % der Zellen einen cytopathischen Effekt zeigten, wurden die Zellen mit Trypsin-EDTA behandelt und die infizierten Zellen wurden gesammelt, gefolgt vom Zentrifugieren bei niedriger Geschwindigkeit (1500 U/min, 10 Minuten), um den Überstand zu entfernen. Zu Tabletten der entstandenen infizierten Zellen wurden 0,3 ml PBS (0,8 % NaCl, 0,02 % KCl, 0,115 % Na&sub2;HPO&sub4;, 0,02 % KH&sub2;PO&sub4;, pH-Wert 7,2) gegeben, wodurch 0,66 ml einer Suspension erhalten wurden.
Zu der Suspension wurden 0,66 ml einer Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt [1 % Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt (FMC), 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 1 mM EDTA) gegeben und die Mischung wurde in eine Matrize gegossen (57 mm x 2 mm x 9 mm), wodurch ein die infizierten Zellen enthaltender Agarose-Block erhalten wurde. Der Agarose-Block wurde in 15 ml Lysis-Puffer [1 % SDS, 100 mM EDTA, 20 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 1 mg/ml Proteinase K] bei 37 ºC über Nacht inkubiert. Der Agarose-Block wurde in einen Puffer übertragen, der durch das Entfernen von SDS und Proteinase K aus dem obigen Lysis-Puffer hergestellt wurde, und wiederum über Nacht inkubiert. Dann wurde die Kultur bei 4 ºC in TE-Puffer stehen gelassen (50 mM Tris-HCl, 500 mM EDTA, pH-Wert 8,0), bis sie der Elektrophorese unterworfen wurde.
Der obige, Virus-DNA enthaltende Agarose-Block wurde in ein 1 %iges Agarose-Gel [1 % GTC-Agarose (FMC), 89 mM Trisborat, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA (pH-Wert 8,0)] eingebettet und Elektrophorese wurde unter Verwendung eines Gel-Elektrophorese-Apparats mit gepulstem Feld (LKB) bei 240 V mit einem Puls von 60 sec 18 Stunden lang durchgeführt.
Nach der Elektrophorese wurde das Gel in einer Lösung von 0,5 ug/ml Ethidiumbromid angefärbt und die Virus-DNA, die neben 120 kb erschien, wurde zusammen mit dem Agarose-Gel ausgeschnitten. Das Agarose-Gel wurde in 30 ml TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) eingetaucht und 2 Stunden lang bei 4 ºC stehen gelassen. Dann wurde der TE-Puffer durch frischen Puffer ersetzt. Nach einem zweistündigen Stehen wurde der Puffer noch einmal durch frischen Puffer ersetzt, gefolgt vom Stehen über Nacht. Das Agarose-Gel wurde einmal mit TE-Puffer gewaschen und dann in 30 ml einer Reaktionslösung für Restriktions-Enzyme [10 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5), 7 mM MgCl&sub2;, 100 mM NaCl, 7 mM 2-ME (Mercaptoethanol), 0,01 % BSA (Rinderserum Albumin) eingetaucht, gefolgt vom 2stündigem Stehen bei 4 ºC. Danach wurde die Reaktionslösung durch frische Lösung ersetzt (10 ml), es wurden 1200 Einheiten des Restriktions-Enzyms HindIII (Takara Shuzo) dazugegeben, gefolgt vom 5stündigen Stehen bei 37 ºC.
Nach der Reaktion wurde die mit HindIII aufgeschlossene Virus- DNA in einem Dialyserohr elektrisch aus dem Agarose-Gel eluiert. Ungefähr 2 ml des entstandenen Eluats wurden durch ein Centricon (Amicon) auf 200 ul aufkonzentriert und Ethanol wurde dazugegeben, um die DNA auszufällen. Der Niederschlag wurde in 20 ul des Restriktionsenzym-Puffers (demselben, wie oben als Zusammensetzung angegeben) gelöst und 10 Einheiten XbaI und 10 Einheiten HindIII (Takara Shuzo) wurden dazugegeben, gefolgt von einer 2stündigen Reaktion bei 37 ºC. Die entstandene Reaktionslösung wurde so, wie sie war, einer Elektrophorese in 0,7 %igem GTG-Agarose-Gel (FMC) unterworfen. Als ein Ergebnis wurden Fragmente mit einer Größe, die mit der von Davidson et al. berichteten [J. Gen. Virol. 67, 1759 (1986)] vergleichbar sind, nachgewiesen.

(2) Herstellung eines plasmidhaltigen DNA-Fragmentes von VZV, KY-Stamm

Fraktionen der in (1) erhaltenen, mit XbaI-HindIII aufgeschlossenen Fragmente der VZV-DNA, KY-Stamm, von 8 bis 10 kb wurden aus dem Agarose-Gel geschnitten und elektrisch eluiert, gefolgt von einer Phenol-Behandlung und einer Ethanol-Ausfällung. Etwa 50 ng der DNA-Fragmente wurden mit etwa 30 ng pUC18, gespalten mit XbaI und HindIII, vermischt, und die Mischung wurde in 25 ul einer Reaktionslösung [66 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,6, 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM Dithiothreitol, 1 mM ATP, 20 Einheiten T4-DNA-Ligase (Takara Shuzo)] bei 16 ºC über Nacht inkubiert. Dann wurde Escherichia coli JM109 unter Verwendung der Reaktionslösung transformiert. Plasmide, die in einer weißen Kolonie enthalten waren, die auf einer Agar-Platte erschien, die 100 ug/ml Ampicillin, 0,2 % X-gal und 10 mM IPTG enthielt, wurden durch das Alkali-Extraktionsverfahren (T. Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, U. S. A., 1982) isoliert, und die Größe der mit XbaI- HindIII aufgeschlossenen Fragmente aus geklonter VZV-DNA wurde durch Elektrophorese unter Verwendung eines Gels mit 0,7 % Agarose untersucht. Ein Klon (pVHX7), in den ein Fragment von etwa 8,5 kb insertiert war, wurde ausgewählt, und die Restriktionskarte des Fragmentes wurde hergestellt. Als ein Ergebnis war die Karte mit der von Davidson et al. angegebenen vergleichbar und es wurde erhofft, daß das Fragment ein Glycoprotein-Gen gpI enthalten würde (Fig. 16-1).
Ein aus den XbaI-SmaI-Aufschlüssen des obigen Fragmentes erhaltenes Fragment von 5,2 kb wurde in die Stelle XbaI/SmaI von pUC18 subkloniert, um pCU18gpI herzustellen (Fig. 16-1).
Mit Bezug auf das Insertieren von pUC18gpI wurde die Nucleotid-Sequenz des Bereiches von etwa 2,1 kb von der Stelle SmaI durch das synthetische Kettenterminierungs-Verfahren für Didesoxynucleotide bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, daß ein VZVgpI-Protein im obigen Bereich kodiert war (Fig. 17).
Eine aus der obigen Nucleotid-Sequenz abgeleitete Aminosäure- Sequenz ist in Fig. 17 dargestellt. Die Nucleotid-Sequenz des obigen Bereiches ist der von Davison et al. angegebenen sehr ähnlich. Es wurden jedoch bei vier Basen Mutationen beobachtet (T von Nr. 196 (diese Erfindung) T C (Davison); C von Nr. 276 T T; T von Nr. 1969 T C; und T von Nr. 2040 T fehlt] (Mutation bei einer Aminosäure: im Bericht von Davison ist Position 40 Thr, in dieser Erfindung aber Ile).

(3) Aufbau (I) des Plasmids zum Exprimieren des Gens VZVgpI: Aufbau des truncierten vorübergehenden Expressionsgens gpI

(i) pUCl8gpI (Fig. 16-1) wurde mit AvaI und NcoI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment von 0,35 kb von -53 bis +293 eines die Translation auslösenden Colons von gpI isoliert wurde. pUCl9Nco, das durch das Insertieren eines NcoI-Linkers (Pharmacia) in die Stelle SmaI von Vektor pUC19 erhalten wurde, wurde mit NcoI und BamHI gespalten. Der entstandene Vektor wurde einmal mit T4-DNA-Ligase an das obige 0,35-kb-Fragment NcoI-AvaI ligasiert, gefolgt von der Umsetzung mit BamHI, AvaI und T4-DNA-Ligase in dieser Reihenfolge. Schließlich wurde der Ringschluß mit T4-DNA-Ligase durchgeführt, um pUC19gpINco (Fig. 16-2) herzustellen.
pUC19gpINco wurde mit XbaI, Klenow-Fragment E. coli-DNA-Polymerase I (Klenow-Polymerase) und KpnI umgesetzt, um den Ring zu öffnen. Auf diese Weise wurde ein Fragment von 0,35 kb erhalten. Andererseits wurde pUC18Nhe, das durch das Insertieren eines Nhe-Linkers in pUC18 hergestellt wurde, mit EcoRI, Klenow-DNA-Polymerase und KpnI umgesetzt, um einen Vektor mit geöffnetem Ring zu erhalten. Der entstandene Vektor wurde mit T4-DNA-Ligase zum Fragment von 0,35 kb ligasiert, wodurch pUC18nhegpINco (Fig. 16-2) hergestellt wurde.
(ii) pUC18gpI wurde mit SmaI und NcoI aufgeschlossen, um ein Fragment von 1,8 kb zu erhalten, und pUC18NhegpINco wurde mit NheI, Klenow-DNA-Polymerase und NcoI umgesetzt, um einen Vektor von 3,1 kb zu erhalten. Das obige Fragment von 1,8 kb wurde an den obigen Vektor von 3,1 kb mit T4-DNA-Ligase ligasiert, um das Plasmid pUC18gpISma (Fig. 16-3) zu erhalten.
Das Plasmid pUC18gpISma wurde mit EcoT22I gespalten und die Termini des gespaltenen Fragmentes wurden in glatte Enden umgewandelt, gefolgt von der Insertion eines NheI-Linkers, wodurch das Plasmid pUC18NhegpIEcT (Fig. 16-3) erhalten wurde.
(iii) Das Plasmid pUC18NhegpIEcT wurde mit Xbai aufgeschlossen, wodurch ein Fragment von 2,1 kb erhalten wurde, und dieses Fragment wurde mit Klenow-DNA-Polymerase behandelt. Andererseits wurde pTB701 (ein Vektor, der durch das Entfernen eines Kinase-Gens c aus pTB652 erhalten wurde, Ono et al., Science 236, 1116 - 1120 (1987)] mit EcoRI gespalten, gefolgt von der Behandlung mit Klenow-DNA-Polymerase, wodurch ein Vektor erhalten wurde. Das obige mit Klenow-DNA-Polymerase behandelte Fragment wurde mit T4-DNA-Ligase an den entstandenen Vektor ligasiert, wodurch das Expressions-Plasmid pTBgpICcT (Fig. 16-4) hergestellt wurde.
(iv) pUC18gpI wurde mit SmaI und SacI gespalten und der Teil mit ungefähr 0,45 kb an der 3'-terminalen Seite des Gens gpI wurde mit Exonuclease III aufgeschlossen. Dann wurde das resultierende Fragment mit Mung-Bean-Nuclease und mit Klenow- DNA-Polymerase behandelt, um dessen Termini in glatte Enden umzuwandeln, gefolgt vom Ringschluß mit T4-DNA-Ligase, um pUC18SS60 (Fig. 16-5) herzustellen.
pUC18SS60 wurde mit KpnI gespalten und teilweise mit EcoRI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment von 2,3 kb erhalten wurde. Die Termini dieses Fragmentes wurden mit T4-DNA-Polymerase in glatte Enden umgewandelt, und ein NheI-Linker (New England Biolabs) wurde daran ligasiert, gefolgt vom Trimmen mit NcoI und NheI zur Herstellung eines Fragmentes mit 1,3 kb. Das resultierende Fragment wurde an einen Vektor ligasiert, der durch das Spalten von pUC18NhegpIEcT mit NcoI und NheI erhalten wurde, wodurch pUC18gpISS60 (Fig. 16-5) hergestellt wurde.
(v) pUC18gpISS60 wurde teilweise mit EcoRI aufgeschlossen und es wurden DNA-Fragmente gewonnen, von denen jedes nur an einem Teil gespalten war. Dann wurden die Fragmente mit Klenow-DNA- Polymerase behandelt, gefolgt vom Ringschluß mit T4-DNA-Ligase. Von diesen wurde der Klon pUC18SS60-E7 ausgewählt, in dem die von pUC18 abstammende Stelle EcoRI verschwand (Fig. 16-6).
Die Termini eines durch Behandeln von pUC18SS60-E7 mit XbaI erhaltenen Fragmentes mit 2,7 kb wurden mit Klenow-DNA-Polymerase in glatte Enden umgewandelt. Andererseits wurde pTB701 mit EcoRI gespalten und dann wurden die Termini des Fragmentes anschließend mit Klenow-DNA-Polymerase in glatte Enden umgewandelt, wodurch ein Vektor erhalten wurde. Das obige Fragment wurde an den resultierenden Vektor ligasiert, wodurch das Expressions-Plasmid pTBgpIE7-17 (Fig. 16-6) hergestellt wurde.

(4) Aufbau (II) des Plasmids zum Exprimieren des Gens VZVgpI: Aufbau des truncierten stabilen Expressions- Plasmids gpI

Das Expressions-Plasmid pTB564 einer Hamster-Dihydrofolat- Reduktase (hDHFR) wurde mit ClaI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment von 1,9 kb erhalten wurde. Die Termini des resultierenden Fragmentes wurden mit Klenow-DNA-Ligase in glatte Enden umgewandelt. Das Expressions-Plasmid pTB564 wurde hergestellt, indem ein Fragment von 0,9 kb, ein Fragment von 2,4 kb und ein Fragment von 0,8 kb mit T4-DNA-Ligase aneinanderligasiert wurden; diese wurden durch das Aufschließen von pTB348, pTB399 und pTB401 [R. Sasada et al., Cell Structure and Function 12, 205 (1987)] mit PstI und BamHI, SalI und BamHI bzw. SalI und PstI erhalten. Andererseits wurde pTBgpIE7-17 mit SalI gespalten, und anschließend wurden die Termini des Fragmentes mit Klenow-DNA-Polymerase in glatte Enden umgewandelt, wodurch ein Vektor erhalten wurde. Das obige Fragment wurde an den resultierenden Vektor ligasiert, wodurch das Expressions-Plasmid pTBE7dhfr4 (Fig. 16-7) hergestellt wurde.

Beispiel 1

Aufbau des aus HSV-1 truncierten Gens gD

Der Plasmid-Vektor pHSG396 SgD (Bezugsbeispiel) mit dem Gen gD des HSV-1-Stammes Miyama wurde mit den Restriktions-Enzymen XhoI und XbaI aufgeschlossen, wodurch ein DNA-Fragment mit etwa 1,35 kb erhalten wurde, gefolgt von einem weiteren Aufschluß mit dem Restriktions-Enzym HinfI, wodurch ein Fragment XhoI-HinfI mit etwa 0,91 kb erhalten wurde. Das in Fig. 9 dargestellte, ein Stop-Codon enthaltende DNA-Fragment mit 12 bp wurde chemisch synthetisiert und mit dem obigen Fragment XhoI-HinfI und einem XhoI-SacI-Aufschluß des Plasmid-Vektors pHSG397 (Takara Shuzo) umgesetzt, wodurch das Subklonierungs- Plasmid pHSG397SgDΔHinf hergestellt wurde. Das resultierende Plasmid wurde mit den Restriktions-Enzymen XhoI und SacI aufgeschlossen, wodurch ein DNA-Fragment XhoI-SacI mit etwa 0,92 kb erhalten wurde. Das so erhaltene Fragment wurde mit einem XhoI-SacI-Aufschluß des in der japanischen Patentanmeldung Nr. 63-180114/1988 und in Bezugsbeispiel 1 der japanischen Patentanmeldung Nr. 63-317546/1988 beschriebenen Plasmids pGFE213 (Herkunft: IFO 10460, FERM BP-2095) umgesetzt, wodurch das Expressions-Plasmid pHSD104ΔHinf erhalten wurde (siehe Fig. 9).

Beispiel 2

Aufbau eines Gen-Expressions-Plasmids für das aus HSV-1 trunciertem Gen gD und IL-2 bestehende Fusions-Protein

Das in Beispiel 1 aufgebaute Subklonierungs-Plasmid pHSG397SgDΔHinf wurde mit XhoI aufgeschlossen und ein Klenow- Fragment wurde mit dem Aufschluß reagieren gelassen, gefolgt von der Insertion eines Linkers EcoRI (pGGAATTCC) (NEB), wodurch pHSG397SgDΔHinfE erhalten wurde. Das resultierende Plasmid wurde mit HinfI aufgeschlossen, wodurch ein DNA-Fragment von etwa 0,95 kb erhalten wurde,das man mit einem Klenow- Fragment reagieren ließ, gefolgt von der Zugabe eines Linkers NheI (pCGCTAGCG) (Pharmacia) unter Verwendung von T4-DNA- Ligase (Takara Shuzo). Das resultierende Fragment wurde weiterhin mit EcoRI und NheI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment EcoRI-Nhel mit etwa 0,9 kb erhalten wurde, das für trunciertes gD, dem 94 Aminosäurereste vom C-Terminus fehlten, codierte.
Dann wurde das Tierzellen-Expressions-Plasmid pTB399 [Veröffentlichung der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 61- 63282/1986, R. Sasada et al., Cell Structure and Function 12, 205 (1987)] aus menschlichem Interleukin-2 mit EcoRI und HindIII aufgeschlossen, wodurch ein Fragment erhalten wurde, das weiter mit HgiAI aufgeschlossen wurde, wodurch ein Fragment von etwa 0,45 kb erhalten wurde. T4-DNA-Polymerase wurde mit dem so erhaltenen Fragment reagieren gelassen, gefolgt von der Zugabe des obigen Linkers NheI. Das resultierende Fragment wurde weiterhin mit BamHI und NheI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment NheI-BamHI mit etwa 0,43 kb erhalten wurde, das den Kodierungsbereich des reifen menschlichen Interleukin-2 enthielt.
Die beiden oben beschriebenen Fragmente wurden mit einem Fragment von etwa 3,9 kb, erhalten durch den Aufschluß von pTB399 mit EcoRI-BGlII umgesetzt, wodurch das Expressions- Plasmid pHDL201 erhalten wurde.
Weiterhin wurde, um das obige Fusions-Protein in CHO-Zellen zu exprimieren und um die Genamplifikation zu ermöglichen, ein DNA-Fragment, das das Fusions-Gen von IL-2 und das truncierte gD mit etwa 2,9 kb enthielt, das durch das Aufschließen des Plasmids pHDL201 mit ClaI erhalten wurde, in die Stelle ClaI des Gen-Expressions-Plasmids pTB348 von Dihydrofolat-Reduktase (siehe die Veröffentlichung der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 61-63282/1986) insertiert, wodurch das Plasmid pHDLdhfr1 (siehe Fig. 10) erhalten wurde.
Die Nucleotid-Sequenz des resultierenden Fusions-Gens ist in Fig. 11 dargestellt, und die daraus abgeleitete Aminosäure- Sequenz ist in Fig. 12 dargestellt.

Beispiel 3

Gen-Expression des aus HSV-1 trunciertem Gen gD und IL-2 bestehenden Fusions-Proteins in tierischen Zellen

Unter Verwendung des in Beispiel 2 aufgebauten Plasmids pHDLdhfr1 wurde der Stamm DHFR&supmin; der CHO-Zelle [G. Urlaub und L. A. Chasim, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4216 - 4220 (1980)] durch das Calciumphosphat-Verfahren [C. M. Gorman et al., Science 221, 551 - 553 (1983)] transformiert, wodurch ein Transformant erhalten wurde, der in DHFR&spplus; konvertiert wurde.
Der resultierende Transformant CHO-HDL-1-5 (IFO 50192, FERM BP-2506) wurde in Dulbecco-MEM-Medium (Gibco) kultiviert, das 10 % fötales Kalbserum enthielt (Whittaker M. A. Bioproducts), damit er konfluent wurde. Anschließend wurde das Medium gegen ein methioninfreies Medium ausgetauscht, und es wurden 25 uCi/ml ³&sup5;S-Methionin dazugegeben, gefolgt vom Kultivieren über Nacht.
Nach dem Gewinnen des Überstands der Lösung wurden 5 ul/ml des Überstands von Kaninchen-Anti-HSV-1- (Maclntyre-) Serum (Dakopatt) oder 10 ul/ml des Überstands von Kaninchen-Anti-Human- IL-2-Serum zum Überstand gegeben, gefolgt vom 2stündigen Kultivieren bei 4 ºC. Dann wurde Protein-A-Sepharose (Pharmacia) dazugegeben, und die Kultivierung wurde weiter 2 Stunden lang bei 4 ºC durchgeführt, gefolgt vom Zentrifugieren, wodurch ein Niederschlag gewonnen wurde. Der Niederschlag wurde mit einem Puffer gewaschen, der 0,05 % NP-40 enthielt, und dazu wurde Laemmli-Puffer gegeben, gefolgt vom 5minütigen Erhitzen bei 100 ºC. Nach dem Abkühlen wurde der Überstand durch Zentrifugieren gewonnen und einer Gelelektrophorese mit SDS- Polyacrylamid unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und der Autoradiographie unterworfen. Als ein Ergebnis wurde offenbart, daß ein Produkt mit etwa 45 bis 60 kDalton, das sowohl gegenüber Anti-HSV-1- als auch Anti- HSV-2-Antikörpern reaktiv war, hergestellt worden war.

Beispiel 4

Nachweis der IL-2-Aktivität im exprimierten Produkt eines Gens, das für ein aus HSV-1 trunciertem gD und IL-2 bestehenden Fusions-Protein kodiert

Mit Bezug auf die Kultur der Transformante, in der die Expression des aus trunciertem gD und menschlichem IL-2 bestehenden Fusions-Proteins in Beispiel 3 beobachtet worden war, wurde die IL-2-Aktivität durch das modifizierte MTT-Verfahren [H. Tada et al., J. Immunol. Methods 93, 157 (1986)] unter Verwendung des IL-2-abhängigen Zellstamms NKC3 gemessen.
Als ein Ergebnis wurde IL-2-Aktivität nur im Überstand der Kultur nachgewiesen, in den das Fusions-Gen eingeführt worden war.

Beispiel 5

Aufbau eines Plasmids zum Exprimieren des aus HSV-1 truncierten Gens gD in eine Myelomzelle

Das in Beispiel 2 aufgebaute Plasmid pHSG397SgDΔHinfE wurde mit dem Restriktions-Enzym EcoRI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment mit etwa 0,9 kb erhalten worden war, das für trunciertes gD kodiert. Das so erhaltene Fragment wurde in den Mutationsort EcoRI von pTB701 [ein durch das Entfernen eines C-Kinase-Gens aus dem in Ono et al, Science 236, 1116 - 1120 (1987) beschriebenen Plasmid pTB652 erhaltener Vektor] insertiert, wodurch ein trunciertes Expressions-Plasmid pHSD207 von gD mit einer langen Sequenzwiederholung und dem frühen Promotor von SV40 erhalten wurde.
Dann wurde das Plasmid pMAMneo (Clontec) mit einem gegen Neomycin resistenten Gen mit BamHI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment mit ungefähr 2,8 kb erhalten wurde, das den frühen Promotor von SV40, das gegen Neomycin resistente Gen und einen Polyadenylierungs-Mutationsort enthielt. Dieses Fragment wurde an den BamHI-Mutationsort von pHSG396 (Takara Shuzo) subkloniert, gefolgt von einem weitern Aufschluß mit den Restriktions-Enzymen ClaI und SalI, wodurch ein ClaI-SalI- Fragment mit etwa 2,8 kb erhalten wurde, das das gegen Neomycin resistente Gen enthielt. Das resultierende Fragment wurde mit einem ClaI-SalI-Aufschluß (etwa 5,1 kb) des obigen Plasmids pHSD207 umgesetzt, wodurch das Expressions-Plasmid pHSDneol mit etwa 7,9 kb (siehe Fig. 13) erhalten wurde.

Beispiel 6

Expression des aus HSV-1 truncierten Gens gD in eine Myelomzelle

Unter Verwendung des in Beispiel 5 aufgebauten Plasmids pHSDneol wurde die Maus-Myelomzelle Sp2/o-Ag14 (Dainippon Pharmaceutical) durch Elektroporation unter Verwendung eines Gene Pulser (Bio-Rad) transformiert, gefolgt von der Kultivierung im Medium RPMI1640 (Gibco), das 400 ug/ml G418 (Gibco) und 10 % fötales Kalbserum enthielt, wodurch gegen G418 resistente Transformanten erhalten wurden. Der Überstand der Transformanten-Kultur wurde in Einklang mit einem Enzym- Immunoassay durch ein Sandwich-Verfahren gescreent, das eine mit Kaninchen-Anti-HSV-1-Serum (Dakopatt) und Biotinyl-Anti- HSV-1 & 2-Antikörper (Chemicon) beschichtete Mikroplatte (Nunc) verwendete, wodurch Klone erhalten wurden, in denen trunciertes gD exprimiert wurde.
Der resultierende Klon SP-neo-HSD-39 mit hoher Expression wurde im Medium RPMI1640 (Gibco), das 10 % fötales Kalbserum (Whittaker M. A. Bioproducts) enthielt, kultiviert, und dann wurde das Medium gegen ein methioninfreies Medium ausgetauscht, und 25 uCi/ml ³&sup5;S-Methionin wurden dazugegeben, gefolgt von der Kultivierung über Nacht.
Nach der Gewinnung des Überstands der Kultur wurden 5 ul/ml eines Überstandes von Kaninchen-Anti-HSV-1-Serum (Dakopatt) zum Überstand gegeben, und die Mischung wurde 2 Stunden lang bei 4 ºC inkubiert, gefolgt vom Zentrifugieren, wodurch ein Niederschlag gewonnen wurde. Der Niederschlag wurde mit einem Puffer gewaschen, der 0,05 % NP-40 enthielt, und dazu wurde Laemmli-Puffer gegeben, gefolgt vom 5minütigen Erhitzen auf 100 ºC. Nach dem Abkühlen wurde der Überstand durch Zentrifugieren gewonnen und einer Gelelektrophorese mit SDS- Polyacrylamid-Gel unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel getrocknet und der Autoradiographie unterworfen. Als ein Ergebnis wurde offenbart, daß ein Produkt mit etwa 40 bis 50 kDalton hergestellt worden war, das gegenüber einem Anti- HSV-1-Antikörper reaktiv war.

Beispiel 7

Aufbau eines Gen-Expressions-Plasmids eines aus HSV-1 trunciertem gD und IL-2 bestehenden Fusions-Proteins in einer Myelomzelle

Das in Beispiel 2 aufgebaute Plasmid pHDL201 wurde durch die Restriktions-Enzyme SalI und EcoRI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment mit etwa 3,9 kb erhalten wurde, das ein aus trunciertem gD und IL-2 bestehendes Fusions-Gen enthielt. Andererseits wurde das Expressions-Plasmid pHSDneol aus trunciertem gD mit dem gegen Neomycin resistenten Gen in Beispiel 5 mit SalI und EcoRI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment von etwa 4,4 kb erhalten wurde, das das gegen Neomycin resistente Gen enthielt. Diese beiden Fragmente wurden miteinander umgesetzt, wodurch das Expressions-Plasmid pHDLneol des truncierten Fusions-Gens gD-IL-2 mit dem gegen Neomycin resistenten Gen (siehe Fig. 14) erhalten wurde.

Beispiel 8

Gen-Expression des aus HSV-1 trunciertem gD und IL-2 bestehenden Fusions-Proteins in eine Myelomzelle

Unter Verwendung des in Beispiel 7 aufgebauten Plasmids pHDLneol wurde die Maus-Myelomzelle Sp2/0-Ag14 (Dainippon Pharmaceutical) durch Elektroporation unter Verwendung eines Gene Pulser (Bio-Rad) transformiert, gefolgt von der Kultivierung im Medium RPMI1640 (Gibco), das 200 ug/ml G418 (Gibco) und 10 % fötales Kalbserum enthielt, wodurch gegen G418 resistente Transformanten erhalten wurden. Der Überstand der Transformanten-Kultur wurde in Einklang mit einem Enzym- Immunoassay durch ein Sandwich-Verfahren gescreent, das eine mit Kaninchen-Anti-HSV-1-Serum (Dakopatt) und Biotinyl-Anti- HSV-1 & 2-Antikörper (Chemicon) beschichtete Mikroplatte (Nunc) verwendete, wodurch Klone erhalten wurden, in denen trunciertes gD exprimiert wurde.
Von den Klonen wurde Sp-neo-HDL-245, dessen Expressions-Menge relativ groß war, in serumfreiem Medium ASF104 (Ajinomoto) kultiviert, und 1 ml des Überstandes davon wurde durch Ultrafree PF (Millipore) konzentriert. Dann wurde auf 50 ul Laemmli-Puffer dazugegeben, gefolgt vom 5minütigen Erhitzen bei 100 ºC. Nach dem Abkühlen wurde eine Gelelektrophorese mit SDS-Polyacrylamid-Gel durchgeführt, und weiterhin wurde das Western-Blotting-Verfahren unter Verwendung des Kaninchen- Anti-HSV-1-Serums (Dakopatt) und des Kaninchen-Anti-Human-IL-2-Serums (Genzyme) durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde eine Bande, die von allen Antikörpern erkannt wurde, spezifisch nachgewiesen.

Beispiel 9

Exprimieren des aus HSV-1 truncierten Gens gD in eine tierische Zelle

Das Expressions-Plasmid pHSDdhfr1 des aus HSV-1 truncierten Gens gD für tierische Zellen wurde wie in den Bezugsbeispielen 1 und 2 und Beispiel 1 der japanischen Patentanmeldung Nr. 1- 233728/1989 hergestellt, und der Transformant CHO-HSD-1-7 wurde wie in Beispiel 2 derselben Anwendung beschrieben erhalten. Die Einzelheiten dazu werden hiernach beschrieben.
Das in Beispiel 1 dargestellte Plasmid pHSG397SgDΔHinf wurde mit XhoI und SacI aufgeschlossen und dann wurde T4-DNA-Polymerase mit dem Aufschluß reagieren gelassen, so daß ein Fragment von etwa 0,9 kb, das das truncierte Gen gD enthielt, erhalten wurde, wobei beide Enden des Fragments glatt waren.
Dann wurde das Plasmid pTB399 [Veröffentlichung der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 61-63282/1986; R. Sasada et al., Cell Structure and Function 12, 205 (1987)] mit den Restriktions-Enzymen EcoRI und BglII aufgeschlossen und anschließend wurde T4-DNA-Polymerase mit dem Aufschluß reagieren gelassen, wodurch ein Fragment von etwa 3,9 kb erhalten wurde, dessen beide Enden glatt waren. Das resultierende Fragment wurde mit dem obigen, truncierte gD enthaltenden Fragment in Gegenwart von T4-DNA-Ligase reagieren gelassen, wodurch das Expressions-Plasmid pHSD209 erhalten wurde.
Dann wurde zum Exprimieren des Gens in CHO-Zellen und zum Ermöglichen der Genamplifikation ein Fragment von etwa 2,4 kb, das durch Aufschließen des Plasmids pHSD209 mit dem Restriktions-Enzym ClaI erhalten wurde, in der Stelle ClaI des Plasmids pTB348 (siehe die Veröffentlichung der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 61-63282/1986) insertiert, wodurch die Plasmide pHSDdhfr1 und pHSDdhfr2 erhalten wurden.
Unter Verwendung des Plasmids pHSDdhfr1 wurde der CHO-Zellstamm DHFR&supmin; [G. Urlaub und L. A. Chasim, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 77, 4216 - 4220 (1980)] durch das Calciumphosphat- Verfahren [C. M. Gorman et al, Science 221, 551 - 553 (1983)] transformiert, wodurch ein Transformant erhalten wurde, der in DHFR&spplus; konvertiert wurde.

Beispiel 10

Reinigung des aus HSV-1 truncierten gD (t-gD)

Der in Beispiel 9 erhaltene Transformant CHO-HSD-1-7 wurde in serumfreiem Medium ASF104 (Ajinomoto) kultiviert, so daß sich ein konfluenter Zustand ergab. Dann wurden 5 l des Kultur- Überstandes gegen 20 mM Tris-HCl- (pH-Wert 8,0) Puffer dialysiert, gefolgt von der Zugabe von Ammoniumsulfat, so daß eine zu 20% gesättigte Konzentration erhalten wurde. Die resultierende Lösung wurde auf eine Butyl-Toyopearl-Säule (100 ml Bett-Kapazität, 2,6 x 19 cm), die mit Ammoniumsulfat mit einer Sättigung von 20 %/20 mM Tris-HCl- (pH-Wert 8,0) Puffer äquilibriert war, gegeben, und anschließend wurde die Säule mit demselben Puffer gewaschen. Anschließend wurde t-gD durch einen Konzentrations-Gradienten von 20 % bis 0 % Ammoniumsulfat eluiert (insgesamt 800 ml). t-gD-Fraktionen (70 ml), die bei Ammoniumsulfat-Konzentrationen von etwa 3 bis 5 % Sättigung eluiert wurden, wurden mit einer Ultrafiltrations-Membran (DIAFLO; Amicon) auf 4 ml konzentriert. Die resultierende Lösung wurde auf eine mit PBS äquilibrierte Sephacryl-S-300- Säule aufgegeben (198 ml Bettkapazität, 1,6 x 98,5 cm), und t-gD-Fraktionen wurden als eine gereinigte Probe (3,5 mg/16 ml) gesammelt.

Beispiel 11

Reinigung des aus HSV-1 trunciertem gD und IL-2 bestehenden Fusions-Proteins (t-gD-IL-2)

Der in Beispiel 3 erhaltene Transformant CHO-HDL-1-5 wurde in serumfreiem Medium ASF104 (Ajinomoto) kultiviert, so daß ein konfluenter Zustand erhalten wurde. Dann wurden 5 l des Kultur-Überstandes gegen 20 mM Tris-HCl- (pH-Wert 8,0) Puffer dialysiert, gefolgt von der Zugabe von Ammoniumsulfat, wodurch eine zu 20 % gesättigte Lösung erhalten wurde. Die resultierende Lösung wurde auf eine Butyl-Toyopearl-650-Säule (100 ml Bettkapazität, 2,6 x 19 cm), die mit Ammoniumsulfat mit einer Sättigung von 20 %/20 mM Tris-HCl- (pH-Wert 8,0) Puffer äquilibriert war, gegeben, und anschließend wurde die Säule mit demselben Puffer gewaschen. Anschließend wurde t-gD-IL-2 durch einen Konzentrations-Gradienten von 20 % bis 0 % Ammoniumsulfat eluiert (insgesamt 800 ml). t-gD-Fraktionen (70 ml), die bei gesättigten Ammoniumsulfat-Konzentrationen von etwa 0 % eluiert wurden, wurden mit einer Ultrafiltrations-Membran (Amicon) auf 4 ml konzentriert. Die resultierende Lösung wurde auf eine mit PBS äquilibrierte S-300-Sephacryl-Säule aufgegeben (198 ml Bettkapazität, 1,6 x 98,5 cm), und t-gD-IL-2- Fraktionen wurden als eine gereinigte Probe (2,8 mg/14 ml) gesammelt.

Beispiel 12

Immunogenität des aus HSV-1 trunciertem gD und IL-2 bestehenden Fusions-Proteins (t-gD-IL-2)

(1) Bestimmung der Anti-HSV-Antikörper

Jedes der in Beispiel 10 erhaltenen truncierten gD (t-gD) und in Beispiel 11 erhaltenen T-gD-IL-2, allein oder an Alaun- Adjuvans adsorbiert (Endkonzentration 0,5 mg/ml, pH-Wert 7,0) wurde abdominal subkutan in einer Menge von 0,2 ml/Maus an BALB/c-Mäuse (weiblich, 6 Wochen alt, Charles River) verabreicht. Nach 5 Wochen wurde Blut gesammelt und es wurden Serumproben hergestellt. Die Anti-HSV-Antikörper wurden durch das folgende Verfahren bestimmt.
Eine mit inaktiviertem HSV beschichtete Mikroplatte eines Bestimmungssatzes für menschliche Anti-HSV-Antikörper (Herpes Stat, Whittaker Bioproducts, Charge Nr. 002706) wurde 2 Stunden lang mit 20 % FCS enthaltendem PBS bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt vom 3maligen Waschen mit 0,05 % Tween 20 enthaltendem PBS (PBS-Tween). Zu dieser Platte wurden 100 ul/Vertiefung der mit 20 % FCS/40 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) /5 % NaCl/0,05 % Tween 20 verdünnten Serumprobe gegeben, gefolgt vom 1stündigen Inkubieren bei Raumtemperatur. Die Platte wurde 6mal mit PBS-Tween gewaschen, und dann wurden 100 u1 einer 1000fachen Verdünnung eines mit Peroxidase markierten Anti-Maus-IgG-Antikörpers (HPR-konjugiertes Kaninchen- X-Maus-IgG [H + L], Zymed Laboratories, Charge Nr. 80801651) in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer 30minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Die Platte wurde 6mal mit PBS- Tween gewaschen und dann wurden 100 ul einer Substrat-Lösung [2 mg/ml o-Phenylendiamin/0,02 % H&sub2;O&sub2;/0,1 M Citrat-Puffer (pH- Wert 4,5)] in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer 10minütigen Reaktion. Nach der Zugabe von 200 ul einer 2 N Schwefelsäure in jede Vertiefung zur Beendigung der Farbentwicklung wurde die Extinktion bei 492 nm gemessen.

(2) Vergleich der Antikörper-Produktivität von t-gD mit der von t-gD-IL-2

Der Titer des Anti-HSV-Antikörpers in der Serumprobe wurde unter Verwendung des monoklonalen Maus-Anti-gd-Antikörpers M42 [Koji Inoue, Osaka University Medical Magazine 36 (Nr. 4), 69 (1987)] als einem Standard-Antikörper auf die folgende Weise berechnet. Der Antikörper-Titer des Antikörpers M42 (1,9 mg/ml) wurde willkürlich als 1900 mU/ml definiert, und der Titer des Anti-HSV-Antikörpers wurde aus dem Verhältnis der Verdünnung von M42, die den 50-%-Wert (ungefähr 1) der maximalen Extinktion (≥ 2,0) ergab, gegeben durch die 4fache Verdünnung von M42, zu dem der Serumprobe bestimmt. Mittelwerte für Gruppen, von denen jede aus 10 Mäusen bestand, sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Antikörper-Titer (mU/ml) Antigen Dosis (ug) Alaun (-) Alaun (+) Kontrolle
Wie aus Tabelle 1 offensichtlich ist, konnte t-gD, wenn das Antigen allein verabreicht wurde, kaum den Antikörper induzieren. t-gD-IL-2 zeigte jedoch signifikant eine Antikörper- Produktivität. Diese Ergebnisse offenbarten, daß mit t-gD kombiniertes IL-2 eine starke Adjuvans-Aktivität erreichte. Wenn das Alaun-Adjuvans verwendet wurde [Alaun (+)], wurde beobachtet, daß t-gD den Antikörper (228 mU/ml bei einer Verarbeichung von 1,7 ug) produzierte. Der hohe Antikörper- Titer wurde jedoch durch t-gD-IL-2 (513 mU/ml bei Verabreichung von 1,0 ug) erhalten, und die Auswirkung der Hinzufügung von IL-2 wurde beobachtet.

Beispiel 13

(1) Bestimmung der Anti-HSV-Antikörper
Jedes der in Beispiel 10 erhaltenen truncierten gD (t-gD) und in Beispiel 11 erhaltenen t-gD-IL-2, allein, äquimolar mit menschlichem Rekombinanten IL-2 (rIL-2; 1,21 mg/ml, Takeda Chemical Industries, Charge Nr. H-609-035) vermischt oder an Alaun-Adjuvans adsorbiert (Endkonzentration 0,5 mg/ml, pH-Wert 7,0) wurde abdominal subkutan in einer Menge von 0,2 ml/Maus an BALB/c-Mäuse (weiblich, 6 Wochen alt, Charles River) verabreicht. Nach 5 Wochen wurde Blut zur Herstellung von Serumproben gesammelt. Wenn die Immunisierung zweimal durchgeführt wurde, wurde das Antigen wiederum 4 Wochen nach der ersten Verabreichung verabreicht, und Blut wurde 2 Wochen nach der zweiten Verabreichung gesammelt. Die Anti-HSV-Antikörper wurden durch das folgende Verfahren bestimmt.
Eine mit inaktiviertem HSV beschichtete Mikroplatte eines Bestimmungssatzes für menschliche Anti-HSV-Antikörper (Herpes Stat, Whittaker Bioproducts, Charge Nr. 002706) wurde 2 Stunden lang mit 20 % FCS enthaltendem PBS bei Raumtemperatur blockiert, gefolgt vom 3maligen Waschen mit 0,05 % Tween 20 enthaltendem PBS (PBS-Tween). Zu dieser Platte wurden 100 ul/Vertiefung der mit 20 % FCS/40 mM Tris-HCl (pH-Wert 7,5) /5 % NaCl/0,05 % Tween 20 verdünnten Serumprobe gegeben, gefolgt vom 1stündigen Inkubieren bei Raumtemperatur. Die Platte wurde 6mal mit PBS-Tween gewaschen, und dann wurden 100 ul einer 1000fachen Verdünnung eines mit Peroxidase markierten Anti-Maus-IgG-Antikörpers (HPR-konjugiertes Kaninchen- X-Maus-IgG [H + L], Zymed Laboratories, Charge Nr. 80801651) in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer 30minütigen Inkubation bei Raumtemperatur. Die Platte wurde 6mal mit PBS- Tween gewaschen und dann wurden 100 ul einer Substrat-Lösung [2 mg/ml o-Phenylendiamin/0,02 % H&sub2;O&sub2;/0,1 M Citrat-Puffer (pH- Wert 4,5)] in jede Vertiefung gegeben, gefolgt von einer 10minütigen Reaktion. Nach der Zugabe von 200 ul einer 2 N Schwefelsäure in jede Vertiefung zur Beendigung der Farbentwicklung wurde die Extinktion bei 492 nm gemessen.

(2) Vergleich der Antikörper-Produktivität von t-gD mit der von t-gD-IL-2

Der Titer des Anti-HSV-Antikörpers in der Serumprobe wurde unter Verwendung des monoklonalen Maus-Anti-gd-Antikörpers M42 [Koji Inoue, Osaka University Medical Magazine 36 (Nr. 4), 69 (1987)] als einem Standard-Antikörper auf die folgende Weise berechnet. Der Antikörper-Titer des Antikörpers M42 (1,9 mg/ml) wurde willkürlich als 1900 mU/ml definiert, und der Titer des Anti-HSV-Antikörpers wurde aus dem Verhältnis der Verdünnung von M42, die den 50-%-Wert (ungefähr 1) der maximalen Extinktion (≥ 2,0) ergab, gegeben durch die 8fache Verdünnung von M42, zu dem der Serumprobe bestimmt. Mittelwerte für Gruppen, von denen jede aus 10 Mäusen bestand, sind in Tabelle 2 dargestellt. Der durch ± dargestellte Bereich stellt die Standard-Abweichung dar. Tabelle 2 Antigen (Dosis) Antikörper-Titer (mU/ml) Kontrolle [PBS]
Wie aus Tabelle 2 offensichtlich ist, konnte t-gD, wenn das Antigen allein verabreicht wurde (Alaun-), kaum den Antikörper induzieren. t-gD-IL-2 zeigte jedoch signifikant eine Antikörper-Produktivität, sogar, wenn es allein verabreicht wurde. Wenn Mischungen aus t-gD und äquimolarem rIL-2 einmal verabreicht wurden, wurde nur eine geringfügige Antikörper-Produktion beobachtet. Diese Ergebnisse offenbarten, daß mit t-gD kombiniertes IL-2 eine starke Adjuvans-Aktivität erreichte. Wenn das Alaun verwendet wurde [t-gD-Alaun], wurde beobachtet, daß t-gD den Antikörper (341 mU/ml bei einer Verarbeichung von 1 ug und 481 mU/ml bei einer Verabreichung von 5 ug) produzierte. Verglichen mit den Antikörper-Titern (400 mU/ml bei der Verabreichung von 1 ug und 692 mU/ml bei der Verabreichung von 5 ug), die von t-gD-IL-2 ergeben wurden, wurde gezeigt, daß die Adjuvans-Wirkung aufgrund der Zugabe von IL-2 nicht geringer als bei der von Alaun (125 ug/Maus) war.

(3) Bestimmung der Killer-Aktivität

Die Killer-Aktivität wurde durch das &sup5;¹Cr-Freisetzungs-Verfahren bestimmt. Die Herstellung von Effektor-Zellen und die Markierung von Zielzellen wurden in Einklang mit den Verfahren durchgeführt, wie sie in S. Hinuma et al., Immunology 159, 251 (1986) beschrieben sind. Sowohl t-gD (5 ug), die Mischung aus t-gD (5 ug) und rekombinantem menschlichem IL-2 (rIL-2) als auch t-gD-IL-2 (5 ug) wurde in 200 ul PBS gelöst, und die resultierenden Lösungen wurden abdominal subkutan BALB/c- Mäusen (4 Mäuse pro Gruppe) verabreicht. Nach 5 Wochen wurden die Milzen aus den Mäusen erhalten. Die Milzen wurden für jede Gruppe, die eine Kontrollgruppe enthielt, gesammelt, um eine Einzellen-Suspension herzustellen. Zur Stimulation in vitro mit HSV-1 wurde der HSV-1-Stamm Miyama mit einer Plaquebildungs-Einheit (PFU) von etwa 1 x 10&sup7; zu 1,25 x 10&sup8; Milzzellen gegeben, gefolgt von einer 1stündigen Inkubation bei 37 ºC. Die stimulierten Zellen wurden in 50 ml vollständigem, 10 % FCS enthaltenden Medium RPMI 1640 suspendiert, und 5 Tage lang bei 37 ºC in einem Kunststoffkolben (Nunc) in Gegenwart von 5 % CO&sub2; kultiviert. Wenn die Zellen nicht mit HSV-1 stimuliert waren, wurde die Kultivierung auf vergleichbare Weise ohne die Zugabe des HSV-1-Stamms Miyama durchgeführt. Nach der Kultivierung wurden die Zellen durch Zentrifugieren gewaschen. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde gezählt, und anschließend wurden die Zellen als die Effektorzellen verwendet.
Als Zielzellen wurde P388, eine Makrophagen-Zellinie der Maus BALB/c, verwendet. 3 x 10&sup6; P388-Zellen wurden mit dem HSV-1- Stamm Miyama mit einem PFU von etwa 3 x 10&sup6; 1 Stunde lang bei 37 ºC inkubiert, wodurch mit HSV-1 infizierte P388-Zellen hergestellt wurden. Anschließend wurde eine Natriumchromat- Lösung mit 0,1 mCi zur den mit HSV-1 infizierten und nicht infizierten Zellen gegeben, wodurch die Zellen mit &sup5;¹Cr markiert wurden.
Die Milzzellen wurden zu 1 x 10&sup4; mit &sup5;¹Cr markierten P388- Zellen gegeben, so daß sich zwischen Effektorzellen/Zielzellen ein Verhältnis (E/T-Verhältnis) von 25 zu 100 ergab, gefolgt vom 4stündigen Kultivieren auf einer Mikroplatte in U-Form mit 96 Vertiefungen (Nunc) bei 37 ºC. Die Killer-Aktivität wurde aus der Menge an &sup5;¹Cr berechnet, das in den Überstand (200 ul) freigesetzt wurde. Die Bestimmung wurde zweimal durchgeführt, und das Ergebnis wurde durch den Mittelwert der beiden Bestimmungen angezeigt. Weiterhin wurde die HSV-1-spezifische Freisetzung von &sup5;¹Cr (%) aus der folgenden Gleichung berechnet:
HSV-1-spezifische Freisetzung von &sup5;¹Cr (%) = [&sup5;¹Cr-Freisetzung aus mit HSV-1 infizierten P388-Zellen (%)] - [&sup5;¹Cr-Freisetzung aus mit HSV-1 nicht infizierten P388-Zellen (%)]
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. Die HSV-1-spezifischen und unspezifischen Killer-Aktivitäten wurden nur beobachtet, wenn die Milzzellen von Mäusen, denen t-gD-IL-2 verabreicht worden war, in vitro mit HSV-1 stimuliert wurden. Dies zeigt, daß die Zellimmunität gegenüber HSV-1 durch die Verabreichung von t-gD-IL-2 induziert wird. Tabelle 3 Induktion von HSV-1-spezifischen und unspezifischen Killer- Aktivitäten durch Verabreichung von t-gD-IL-2 Verabreichung in vivo HSV-1-Stimulation HSV-1-Infektion des Ziels % &sup5;¹Cr-Freisetzung Verhältnis E/T Kontrolle
a. ND: nicht durchgeführt
b. für HSV-1 spezifische Freisetzungsmenge an &sup5;¹Cr

(4) Schutz gegen den Angriff durch HSV-1

Mäuse wurden mit jeweils 1 ug t-gD, 1 ug t-gD-IL-2 und einer Mischung aus 1 ug t-gD und 0,25 ug rIL-2 immunisiert, und der Schutz gegen einen Angriff von HSV-1 in diesen Mäusen wurde untersucht. Es wurde nämlich jedes der obigen Antigene auf die im obigen Punkt (1) beschriebene Weise an 8 Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse (eine Gruppe bestand aus 6 bis 7 Mäusen) verabreicht. Nach 5 Wochen wurde 0, 1 ml/Maus HSV-1 (Stamm Miyama + GC) mit einem PFU von 2 x 10&sup5; intraperitoneal in die Maus inokuliert. Nach der Inokulation wurden 17 Tage lang Beobachtungen durchgeführt, um die Überlebensrate der Mäuse zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Fig. 15 dargestellt. Die Zahlen in Klammern zeigen die Anzahl der verwendeten Mäuse an und die Anzahl der Mäuse, in denen die Symptome aufgrund einer Infektion mit HSV-1 beobachtet wurden (die Symptome offenbarten sich in der Maus oder die Maus starb).
In der Kontrollgruppe (PBS) und der Verabreichungsgruppe t-gD wurden die Symptome infolge der HSV-1-Infektion an allen Mäusen beobachtet. Sogar in der Gruppe (gemischt), an die die Mischung aus t-gD und rIL-2 verabreicht wurde, starb etwa die Hälfte aller Mäuse. Im Gegensatz dazu starb in der Verabreichungsgruppe t-gD-IL-2 (fusioniert) nur eine Maus 11 Tage nach der Inokulierung von HSV-1.
Diese Ergebnisse zeigen die Auswirkung einer Hinzufügung von IL-2 zu t-gD nicht nur auf die Produktion von Antikörpern, sondern auch für den Schutz gegen einen Angriff von HSV-1.

Beispiel 14

Herstellung eines aus HSV-1 trunciertem gD und IL-2 bestehenden Hybrid-Proteins

(1) Maleinimidierung von aus HSV-1 trunciertem gD

1 mg des in Beispiel 11 erhaltenen aus HSV trunciertem gD wurde in 2 ml eines Acetatpuffers mit 5 mM (pH-Wert 5,0) gelöst, und anschließend wurden 50 ul einer zweimolaren N-(&epsi;- Maleinimidocaproyloxy) succinimidester-Lösung in Dimethylformamid hinzugegeben, gefolgt von einer 20minütigen Reaktion bei 30 ºC. Die Reaktionsmischung wurde auf eine mit 0,1 M Phosphatpuffer (pB, pH-Wert 6,5) äquilibrierte Sephadex G-25-Säule aufgegeben, um das Kombinationsreagens zu entfernen.

(2) Sulfhydrylierung von IL-2

1 mg des in der Veröffentlichung der japanischen Offenlegungsschrift Nr. 61-63282/1986 hergestellten rIL-2 wurde in 0,05 M PBS (pH-Wert 7,3) gelöst und dann wurden 50 ul einer bimolaren SPDf-Lösung in Methanol dazugegeben, gefolgt von einer 30minütigen Reaktion bei 30 ºC. Nach der Reduktion durch die Zugabe von 50 ul einer 0,1 M wässrigen Lösung von DTT wurde das resultierende Produkt auf die in obigem Punkt (1) beschriebene G-25-Sephadex-Säule gegeben, wodurch das überschüssige Reagenz entfernt wurde.

(3) Herstellung des Hybrid-Proteins Antigen-IL-2

0,8 ml des in obigem Punkt (2) hergestellten sulfhydrylierten IL-2 wurden langsam zu 0,8 mg des in obigem Punkt (1) hergestellten maleinimidierten truncierten Antigens gD gegeben, mit Rühren unter Eiskühlung, gefogt von der Reaktion über Nacht. Die Reaktionsmischung wurde auf eine Sephacryl-S-200- Säule aufgegeben, um nicht umgesetzte Proteine vom chemisch kombinierten Hybrid-Protein zu trennen und zu entfernen. Als ein Ergebnis wurden etwa 1,2 mg des truncierten gD und rIL-2, die chemisch miteinander vereinigt waren, bestehenden Hybrid- Proteins erhalten.

Beispiel 15

Aufbau des Gen-Expressions-Plasmids für das Fusions-Protein. bestehend aus trunciertem gpI von VZV (Stamm Kizuhara) und IL- 2

Das in Beispiel 7 aufgebaute Plasmid pHDLneol wurde teilweise durch das Restriktions-Enzym NheI aufgeschlossen, und ein DNA- Fragment von etwa 7,9 kb, das nur an einem Mutationsort von zwei NheI-Mutationsorten gespalten war, wurde isoliert. Dessen Terminus wurde mit DNA-Polymerase T4 in ein glattes Ende umgewandelt. Dann wurde das resultierende Fragment wiederum mit NheI aufgeschlossen, und ein Teil des Promotors und des gD-Bereiches wurden entfernt, wodurch ein Restfragment (Fragment (1)) isoliert wurde.
Ein Fragment, das durch das Aufschließen des das Gen VZVgpI enthaltenden Gens (Bezugsbeispiel 2-(3)-ii) Plasmids pUC18gpISma mit dem Restriktions-Enzym XbaI erhalten wurde, wurde mit Klenow-DNA-Polymerase glatt gemacht, und dann mit dem Restriktions-Enzym EcoRI in einen Vektor insertiert, der durch das Aufschließen von pTB701 (Bezugsbeispiel 2-(3)-iii) erhalten wurde, gefolgt von dessen Glätten durch Klenow-DNA- Polymerase. Auf diese Weise wurde das gpI-Expressions-Plasmid pTBgpISmal8 aufgebaut (Fig. 18). Dieses Plasmid wurde mit dem Restriktions-Enzym Eco52I aufgeschlossen, wodurch ein Fragment isoliert wurde, das für die Aminosäure-Sequenz bis zu der 515ten von gpI kodiert, und dessen Termini wurden mit T4-DNA- Polymerase in glatte Enden umgewandelt. Das resultierende Fragment wurde mit dem Restriktions-Enzym BglII aufgeschlossen, wodurch ein Fragment mit 1,04 kb (Fragment (2)) isoliert wurde.
Auf vergleichbare Weise wurde pTBgpISmal8 mit NheI und BglII aufgeschlossen, wodurch ein Fragment von etwa 2,1 kb isoliert wurde, das einen Teil des Promotors und einen Teil von gpI (Fragment (3)) enthielt.
Die obigen drei Fragmente (1), (2) und (3) wurden mit T4-DNA- Ligase aneinanderligasiert, wodurch das Gen-Expressions-Plasmid pVGL4 für das aus VZV trunciertem gpI und IL-2 bestehende Fusionsprotein erhalten wurde (Fig. 18).
Weiterhin wurden ein Fragment (einen ASVLTR-Promotor enthaltend) , das durch das Aufschließen des truncierten Expressions- Plasmids pTBE7dhfr4 mit der Hamster-Dihydrofolatreduktase (hDHFR) als einer ausgewählten Markierungssubstanz (Bezugsbeispiel 2-(4)) mit NheI und HindIII erhalten wurde, ein Fragment (ein Gen hDHFR enthaltend), das durch das Aufschließen des Plasmids pTBE7dhfr4 mit HindIII und SalI erhalten wurde, und ein Fragment, das durch das Aufschließen von pVGL4 mit NheI und SalI erhalten wurde, mit T4-DNA-Ligase aneinanderligasiert, wodurch das Plasmid pVGLdhfr11 (Fig. 19) aufgebaut wurde.

Beispiel 16

Gen-Expression eines aus trunciertem gpI und Il-2 bestehenden Fusions-Proteins in eine COS-7-Zelle

Die in Beispiel 15 aufgebauten Plasmide pVGL4 und pVGLdhfr11 wurden in COS-7-Zellen eingeführt, um ihre vorübergehende Expression zu untersuchen.
COS-7-Zellen (5 x 10&sup5; Zellen/10-cm-Schale) wurden in 10 ml des Dulbecco-Mediums MEM (Gibco), das 10 % FCS enthielt, inokuliert, und nach 18 Stunden wurden die Zellen mit den obigen Plasmiden (20 ug/Schale) in Einklang mit dem Verfahren von Wigler et al. [Cell 16, 777 - 785 (1979)] transfektiert. Nach 24 Stunden wurden die resultierenden Zellen 2 Tage lang in das Dulbecco-Medium MEM (Gibco) inkubiert, das 25 mM HEPES (Donin Chemical Laboratory) enthielt. Dann wurden 5 ml des Überstandes der Kultur mit einem Centricut (Centricut 20, Kurabo Industries) auf etwa 200 ul aufkonzentriert. 10 ul dieses Überstandes wurden mit 5 ul Laemmli-Puffer mit einer 3fachen Konzentration [Endkonzentrationen: 62,5 mM Tris-HCl (pH-Wert 8,0), 2 % SDS, 10 % Glycerin, 5 % 2-ME, 0,001 % BPB] vermischt, und die Mischung wurde 5 Minuten lang auf 95 ºC erhitzt. Die Probe wurde einer Elektrophorese unterworfen, wobei 10 % bis 20 % SDS-Polyacrylamid-Gele (Daiichi Kagaku) verwendet wurden. Nach der Elektrophorese wurde die Probe durch das Western-Blotting-Verfahren untersucht, wobei ein monoklonaler Maus-Antikörper anti-gpI (der aus einem Hybridom, das durch das Fusionieren einer Milzzelle einer BALB/c-Maus, die durch den Überstand von mit VZV infizierten, durch Ultraschallbehandlung zerstörten Zellen als einem Immunogen hergestellt wurde, und der Maus-Myelomzelle SP2 mit Polyethylenglycol erhalten wurde) und ein Kaninchen-Antikörper Anti-IL-2 (Genzyme) verwendet wurde. Als ein Ergebnis wurde in den Überständen der Zellen, in die pVGL4 und pVGLdhfr11 eingeführt worden war, eine Bande für jeden der anti-gpI-Antikörper und der Anti-IL- 2-Antikörper (Fig. 20) nachgewiesen. Andererseits wurde in den Überständen der Kontrollzellen, in die pTBE7dhfr4 und pTBgpIEcT (Bezugsbeispiel 2-(3)-iii) eingeführt worden war, nur eine Bande für den anti-gpI-Antikörper nachgewiesen.
Weiterhin wurde die biologische IL-2-Aktivität in jedem Überstand in Einklang mit dem Verfahren von Tada et al. [J. Immunol. Methods 93, 157 - 165 (1986)] untersucht. Als eine Konsequenz wurde nur dann, wenn pVGL4 und pVGLdhfr11 eingeführt worden waren, die IL-2-Aktivität im Überstand beobachtet. Dies offenbarte, daß mit gpI verschmolzenes IL-2 die biologische Aktivität aufwies (Tabelle 4). Tabelle 4 Plasmid IL-2-Aktivität (U/ml) Kontrolle Nicht nachgewiesen

Beispiel 17

Aufbau eines Gen-Expressions-Plasmids für das aus dem Menschliche-Immunschwäche-Virus- (HIV-) Protein gag und IL-2 bestehende Fusions-Protein

(1) Ein SalI-Linker wird zu einem AccII-SalI-Fragment von 5,1 kb, das den gag-Pol-Bereich des HIV-rekombinanten proviralen Klons pNL4-3 [Adachi et al., J. Virol. 59, 284 - 291 (1986); Gen-Bank R62,0, Dezember 1989, Genort HIVNL43] enthielt, gegeben, und anschließend wird das resultierende Fragment in den Mutationsort SalI von pBR322 insertiert, wodurch das Plasmid pTB770 hergestellt wurde.
(2) Das Plasmid pTB770 wird mit dem Restriktions-Enzym XmnI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment von 0,43 kb isoliert wird. Dieses Fragment wird mit BamHI gespalten, und dann wird das gespaltene Fragment in pUC8 insertiert, dessen Termini mit T4-DNA-Polymerase in glatte Enden umgewandelt wurden,wodurch der Subklon pUC8Xm3 erhalten wurde.
Der Subklon pUC8Xm3 wird mit EcoRI und EcoT22I aufgeschlossen, wodurch ein Fragment von 0,42 kb (Fragment (1)) isoliert wird.
Das Plasmid pTB770 wird mit BGlII aufgeschlossen, und anschließend werden die Termini des aufgeschlossenen Fragmentes mit T4-DNA-Polymerase in glatte Enden umgewandelt, gefolgt vom Aufschluß mit EcoT22I, wodurch ein Fragment von 0,85 kb isoliert wird (Fragment (2)).
Das Plasmid pTB505 [Sasada et al., Cell Structure and Function 13, 129 - 141 (1988)] zur sekretorischen Expression von EGF mit der Signalsequenz von IL-2 wird mit EcoRI und SalI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment von 1,9 kb (Fragment (3)) isoliert wird.
Das Plasmid pHDLneol (siehe Beispiel 5) wird mit NheI aufgeschlossen, und dann werden die Termini des aufgeschlossenen Fragmentes mit T4-DNA-Polymerase in glatte Enden umgewandelt, gefolgt vom Aufschluß mit SalI, wodurch ein Fragment von 3,0 kb isoliert wird (Fragment (4)).
Die obigen vier Fragmente (1), (2), (3) und (4) werden mit T4- DNA-Ligase aneinanderligasiert, wodurch das Expressionsplasmid pGAL2 erhalten wird, an das Gene, von denen jedes für die Signalsequenz IL-2 (die Aminosäure-Sequenz bis zu Gln¹¹ enthaltend), Ile¹&sup9; bis Ile&sup4;³&sup7; des HIV-Proteins gag und Ala¹ bis Thr¹³³ von IL-2 kodiert, stromabwärts von einem A-MuLV-Promotor LTR- SV40 ligasiert werden (Fig. 21).
(3) Weiterhin werden, um das in (2) erhaltene Plasmid in ein stabiles Expressions-Plasmid zu modifizieren, das Gen neo des Plasmids pHDLneol in pGAL2 insertiert.
Das Plasmid pHDLneol wird mit ClaI und SalI aufgeschlossen, wodurch ein Fragment von 2,8 kb erhalten wird. Dieses Fragment, ein Fragment von 3,6 kb, das durch das Aufschließen von pGAL2 mit ClaI und BglII erhalten wird, und ein Fragment von 2,5 kb, das durch das Aufschließen von pGAL2 mit SalI und BelII erhalten wird, werden mit T4-DNA-Ligase aneinanderligasiert, wodurch das Expressions-Plasmid pGALneo (Fig. 22) erhalten wird.
Mit Bezug auf die nach den obigen Verfahren erhaltenen Plasmide kann die biologische Aktivität des exprimierten Produktes auf dieselbe Weise wie in Beispiel 16 untersucht werden. Die Antigenität des exprimierten Produktes kann durch Western- Blotting unter Verwendung eines anti-gag-Antikörpers (Chemicon) bestätigt werden.
Es ist davon auszugehen, daß die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungsformen nur zu veranschaulichenden Zwecken dienen und daß verschiedene Modifikationen oder Änderungen in deren Licht, die Fachleuten naheliegen, im Geist und im Zuständigkeitsbereich dieser Anmeldung und dem Rahmen der zugelassenen Ansprüche eingeschlossen sind.

Claims

1. Verwendung eines ein Antigen für ein Vakzin und ein Lymphokin umfassenden Fusionsproteins zur Herstellung eines Vakzins.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Antigen mit dem Lymphokin mittels eines Linkers fusioniert ist.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Lymphokin Interleukin-2 ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, worin das Interleukin-2 vom Menschen stammendes Interleukin-2 ist.

5. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Antigen ein Virus-Antigen, ein pathogenes Protozoen-Antigen oder ein pathogenes Bakterien-Antigen ist.

6. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Antigen ein Herpes-Virus-Antigen ist.

7. Verwendung nach Anspruch 6, worin das Herpes-Virus- Antigen ein Herpes-simplex-Virus-Antigen oder ein Varizella-zoster-Virus-Antigen ist.

8. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Antigen ein Human-Retrovirus-Antigen ist.

9. Verwendung nach Anspruch 8, worin das Human-Retrovirus- Antigen ein Human-Immundefekt-Virus-Antigen ist.

10. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Antigen ein Herpes-simplex-Virus-Oberflächen-Antigen ist.

11. Verwendung nach Anspruch 10, worin das Herpes-simplex- Virus-Oberflächen-Antigen gD oder gB des Herpes- simplex-Virus vom Typ I oder Typ II ist.

12. Verwendung nach Anspruch 11, worin das gD oder das gB gD oder gB ist, dem eine Transmembran-Domäne fehlt.

13. Verwendung nach Anspruch 1, worin ein Herpes-simplex- Virus-Oberflächen-Antigen auf der Amino-terminalen Seite angeordnet ist und Interleukin 2 auf der Carboxyl-terminalen Seite angeordnet ist.

14. Fusionsprotein, umfassend ein Virus-Antigen für ein Vakzin und ein Lymphokin, das Interleukin 2 ist.

15. Fusionsprotein nach Anspruch 14, worin das Virus-Antigen mit dem Interleukin-2 mittels eines Linkers fusioniert ist.

16. Fusionsprotein nach Anspruch 14, worin das Interleukin-2 vom Menschen stammendes Interleukin-2 ist.

17. Fusionsprotein nach Anspruch 14, worin das Virus-Antigen ein Herpes-Virus-Antigen ist.

18. Fusionsprotein nach Anspruch 17, worin das Herpes- Virus-Antigen ein Herpes-simplex-Virus-Antigen oder ein Varizella-zoster-Virus-Antigen ist.

19. Fusionsprotein nach Anspruch 14, worin das Antigen ein Human-Retrovirus-Antigen ist.

20. Fusionsprotein nach Anspruch 19, worin das Human- Retrovirus-Antigen ein Human-Immundefekt-Virus-Antigen ist.

21. Fusionsprotein nach Anspruch 14, worin das Antigen ein Herpes-simplex-Virus-Oberflächen-Antigen ist.

22. Fusionsprotein nach Anspruch 21, worin das Herpes- simplex-Virus-Oberflächen-Antigen gD oder gB des Herpes-simplex-Virus vom Typ I oder Typ II ist.

23. Fusionsprotein nach Anspruch 22, worin das gD oder das gB gD oder gB ist, dem eine Transmembran-Domäne fehlt.

24. Fusionsprotein nach Anspruch 14, worin ein Herpes- simplex-Virus-Oberflächen-Antigen auf der Amino-terminalen Seite angeordnet ist und Interleukin 2 auf der Carboxyl-terminalen Seite angeordnet ist.

25. Rekombinante DNA, enthaltend eine für ein Fusionsprotein nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 24 codierende Nucleotid-Sequenz.

26. Transformante, die eine rekombinante DNA trägt, die eine für ein Fusionsprotein nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 24 codierende Nucleotid-Sequenz enthält.

27. Verfahren zur Herstellung eines Fusionsproteins nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 24, umfassend das Kultivieren einer Transformante, die eine rekombinante DNA trägt, die eine für ein Fusionsprotein codierende Nucleotid-Sequenz enthält, das Erzeugen und Ansammeln des Fusionsproteins in der Kultur und das Sammeln des Fusionsproteins.

28. Hybrid-Protein, erhalten durch chemisches Kombinieren eines für ein Vakzin verwendeten Virus-Antigens und eines Lymphokins, das Interleukin-2 ist.

29. Hybrid-Protein nach Anspruch 28, worin das Virus-Antigen ein Herpes-Virus-Antigen ist.

30. Hybrid-Protein nach Anspruch 28, worin das Virus-Antigen ein Herpes-simplex-Virus-Oberflächen-Antigen ist.

31. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Fusionsprotein nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 24 in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

32. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Hybrid- Protein nach irgendeinem der Ansprüche 28 bis 30 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

33. Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten DNA, die eine für ein Fusionsprotein nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 24 codierende Nucleotid-Sequenz enthält, umfassend das Einfügen der Nucleotid-Sequenz in einen Vektor.

34. Verfahren zur Herstellung einer Transformante, die eine rekombinante DNA trägt, die eine für ein Fusionsprotein nach irgendeinem der Ansprüche 14 bis 24 codierende Nucleotid-Sequenz enthält, umfassend das Transformieren eines Mikroorganismus mit der rekombinanten DNA.

35. Verfahren zur Erzeugung eines Hybrid-Proteins eines für ein Vakzin verwendeten Virus-Antigens mit einem Lympho-kin, das Interleukin-2 ist, nach irgendeinem der Ansprüche 28 bis 30, umfassend

(a) das Kondensieren einer reaktionsfähigen Amino- Gruppe eines der Proteine mit einer reaktionsfähigen Carboxyl-Gruppe des anderen Proteins, oder

(b) das Maleinimidieren eines der Proteine und die Umsetzung des maleinimidierten Proteins mit dem anderen Protein, in das eine Sulfhydryl-Gruppe eingeführt ist, oder

(c) das Kombinieren eines der Proteine, das eine reaktionsfähige Amino-Gruppe besitzt, mit dem anderen Protein, das eine reaktionsfähige Amino-Gruppe besitzt, unter Verwendung eines Dialdehyd-Reagens, oder

(d) das Einwirkenlassen einer Reoxidations-Reaktion auf die beiden Proteine, in die Sulfhydryl- Gruppen eingeführt sind.

36. Verwendung nach Anspruch 5, worin das Antigen ein Virus-Antigen ist.

37. Verwendung näch Anspruch 5, worin das Antigen ein Malaria-Antigen ist.