GEBIET DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine
neuartige Fettemulsion, die ein pilzbekämpfendes Antibiotikum mit
Polyen als Hauptingrediens enthält.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Seit der Entwicklung von durch Amphotericin B
vertretenen pilzbekämpfenden Antibiotika mit Polyen sind ungefähr 30
Jahre verstrichen; selbst heute noch sind pilzbekämpfende
Antibiotika mit Polyen als wichtige pilzbekämpfende Mittel
zweckmäßig, die allgemein verabreicht (werden können) und durch
welche verläßliche Wirkungen erwartet werden können.
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Indessen ist ihre klinische Verwendung durch
ernsthafte Nebenwirkungen, wie hämolytische Toxizität und
Nierenschädlichkeit, extrem eingeschränkt, und folglich sind diese
pilzbekämpfenden Mittel mit einem Problem verbunden, welches
die Chemotherapie nicht befriedigend lösen kann.
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Zusätzlich muß bei der Verwendung von in Form einer
Injektion verabreichten pilzbekämpfenden Antibiotika mit Polyen
ein oberflächenaktives Mittel verwendet werden, nämlich
Natriumdeoxycholat, welches reizfördernd und hämolytisch ist, und
es wurde eine Verbesserung bei der medizinischen Präparation
gewünscht.
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In den letzten Jahren wurden zur Milderung dieser
Nebenwirkungen pilzbekämpfende Antibiotika mit Polyen entweder
als Phospholipide enthaltende Liposomen-Präparate oder als
Fettemulsions-Präparate verabreicht, die durch Emulgierung von
Sojabohnenöl mit einer kleinen Menge an Phospholipiden erhalten
werden (Szoka, F.C., Jr., et al., Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 31, 421-429, 1987 [im folgenden als
"Veröffentlichung Nr. 1" bezeichnet], Kirsh, R. et al., Journal of
Infectious Diseases, 158, 1065-1070, 1988 [im folgenden als
"Veröffentlichung Nr. 2" bezeichnet], die japanische
Patentoffenlegungsschrift Nr. 66123/89 [im folgenden als "Veröffentlichung
Nr. 3" bezeichnet].
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Diese verschiedenen Liposomen-Präparate und
Fettemulsions-Präparate beinhalten jedoch insofern einen ernsthaften
Mangel, als die Präparate bei der Milderung der Nephrotoxizität
kaum wirksam sind, die im klinischen Gebrauch das ernsthafteste
Problem darstellt, obwohl diese Herstellungsarten die den
pilzbekämpfenden Antibiotika mit Polyen innewohnende hämolytische
Toxizität erfolgreich reduzieren und die akute Toxizität
mildern.
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Zusätzlich sind diese verschiedenen
Liposomen-Präparate und Fettemulsions-Präparate durch das Auftreten einer
Phagozytose mit an der infizierten Stelle angesammelten
Makrophagen etc. gekennzeichnet. Jedoch wird bei der Auswertung auf
einem allgemeinen Niveau der Mangel angetroffen, daß beim
größten Teil des verabreichten Arzneimittels durch eine Phagozytose
durch reticulo-endotheliale Zellen, welche von der Leber und
der Milz zur Migration erzeugt werden, eine wirkliche
Beförderung des Arzneimittels zur infizierten Stelle nicht
notwendigerweise wirksam ist.
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Anderseits sind Liposomen-Präparate bei der Produktion
in einem industriellen Maßstab im Hinblick auf die Herstellung
der medizinischen Präparate und die Sicherheit der Präparate
fragwürdig. Die Liposomen-Präparate beinhalten auch auf Grund
der Zunahme der Partikelgröße infolge Aggregation ein
ernsthaftes Problem bezüglich ihrer Stabilität während der Lagerung.
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Fettemulsionen, die bisher klinisch als ein die
Nahrung zulieferndes Fluid verwendet wurden, wurden als
Injektionspräparte verschiedener Arzneimittel verwendet, und die
Nützlichkeit dieser Präparate ist bekannt. Es war jedoch
schwierig, Fettemulsions-Präparate bei pilzbekämpfenden
Antibiotika mit Polyen zu verwenden, da solche Präparate bei der
Herstellung von Emulsionen, und was ihre Stabilität betrifft,
auf Grund der amphiphatischen Eigenschaft der Arzneimittel und
ihrer geringen Löslichkeit in Sojabohnenöl etc. auf ernsthafte
Probleme stoßen. Es war somit schwierig, dieses Problem zu
lösen.
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Im allgemeinen migriert ein verabreichtes Arzneimittel
und wird im Körper je nach den dem Arzneimittelmolekül
innewohnenden
Eigenschaften verteilt. Wenn ein Teil des Arzneimittels
die Stelle erreicht, auf die eingewirkt werden soll, zeigt sich
seine pharmazeutische Wirkung. In diesem Falle ist es
bevorzugt, daß das Arzneimittel lediglich an jener Stelle
konzentriert werden soll, die zum Nachweis der pharmazeutischen
Wirkung notwendig ist. Im allgemeinen jedoch wird ein Arzneimittel
weit über den ganzen Körper hinweg verstreut und migriert auch
zu jenen Stellen, die das Arzneimittel nicht erfordern; dies
verursacht manchmal Nebenwirkungen. Deshalb ist es wichtig und
notwendig, die Anordnung des Arzneimittels im Körper zu
verbessern.
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Im Hinblick auf die oben beschriebenen Situationen führten
die vorliegenden Erfinder aufwendige Untersuchungen über die
Präparatformen zur Verabreichung durch, welche die hämolytische
Toxizität und Nephrotoxizität reduzieren und eine
ausgezeichnete Migration eines Arzneimittels in Richtung auf infizierte
Stellen erleichtern können, ohne den Mechanismus selbst der
pharmakologischen Wirkung (pilzbekämpfende Wirkung) des
pilzbekämpfenden Antibiotikums mit Polyen auf einem molekularen
Niveau zu beeinträchtigen. Als eine Folge davon kamen die
vorliegenden Erfinder schließlich zur vorliegenden Erfindung.
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Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung liegt in der
Verringerung der Nephrotoxizität von pilzbekämpfenden
Antibiotika mit Polyen, welche entschieden das ernsthafteste
Problem im klinischen Bereich darstellt, sowie in der Schaffung
von medizinischen Präparaten, die es ermöglichen, eine wirksame
Dosis des Arzneimittels zu verabreichen, ohne befürchten zu
müssen, eine ernsthafte nephrotische Störung zu verursachen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Ein charakteristisches Merkmal der vorliegenden
Erfindung liegt darin, den relativen Anteil eines jeden
Bestandteils, nämlich eines pilzbekämpfenden Antibiotikums, eines
einfachen Lipids, eines Phospholipids und von Wasser in der
Zusammensetzung bei der Herstellung einer das pilzbekämpfende
Antibiotikum als Hauptbestandteil enthaltenden Fettemulsion zu
begrenzen.
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Bei der vorliegenden Erfindung ist das pilzbekämpfende
Antibiotikum mit Polyen in einer Menge von 0,005 bis 5%
(Gew./Vol.), basierend auf dem Gesamtgewicht der Fettemulsion,
eingefügt.
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Bei der vorliegenden Erfindung ist das einfache Lipid
in einer Menge von 0,5 bis 30% (Gew./Vol.), basierend auf dem
Gesamtgewicht der Fettemulsion, eingefügt.
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Bei der vorliegenden Erfindung ist das Phospholipid in
einem auf dem oben beschriebenen einfachen Lipid basierenden
Gewichtsverhältnis in einer 0,15- bis 2-fachen Menge vorhanden.
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Wasser, welches ein Ingrediens der vorliegenden
Erfindung ist, ist in einer zweckmäßigen Menge eingefügt.
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Die Fettemulsion nach der vorliegenden Erfindung ist
im Vergleich zu den herkömmlicherweise bekannten
Liposomen-Präparaten oder Fettemulsionen durch seine Ingredienzien und den
Anteil der Ingredienzien gekennzeichnet. Das heißt, die
Fettemulsion nach der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich in
ihrem Aufbau und ihrer Struktur insofern stark von einem
Liposom, als die Emulsion durch Emulgierung eines einfachen Lipids,
wie Sojabohnenöl etc., mit einem Phospholipid, erhalten wird.
Ferner unterscheidet sich ihr Gehalt an Phospholipid stark von
herkömmlichen Fettemulsionen, die als Präparatformen von
verschiedenen Arzneimitteln für eine intravenöse Verabreichung
verwendet werden.
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Durch den obigen Aufbau können die Wirkungen, die
durch herkömmliche Liposomen-Präparate und Fettemulsionen nicht
erhalten werden können, erreicht werden. Im folgenden wird die
Fettemulsion im einzelnen beschrieben.
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Die Fettemulsion nach der vorliegenden Erfindung
enthält keine Emulsionsteilchen, die 1 µm oder größer sind.
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Der durchschnittliche Partikeldurchmesser der
Fettemulsion nach der vorliegenden Erfindung liegt in einem
Bereiche von einschließlich 10 nm bis weniger als 200 nm. Dies
verhält sich so, weil die Emulsionsteilchen an jenen Stellen, wo
die vaskuläre Durchlässigkeit infolge einer durch eine
Infektion mit Pilzen etc. verursachte Entzündungswirkung verstärkt
ist, von den Blutgefäßen her leicht in das Fokusgewebe
migrieren.
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An solchen infizierten Stellen migrieren viele
Emulsionsteilchen nach der vorliegenden Erfindung selektiv von den
Blutgefäßen in das Fokusgewebe.
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Gleichzeitig migriert das in den Emulsionsteilchen
eingeschlossene Arzneimittel ebenfalls in den Fokus. Durch eine
solche Migration migriert das Arzneimittel selektiv leicht in
den Fokus, so daß sich die Konzentration des Arzneimittels an
der Fokusstelle erhöht, wodurch sich die Wirkung des
Arzneimittels verstärken läßt.
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Der durchschnittliche Teilchendurchmesser der
Fettemulsion gemäß der vorliegenden Erfindung beträgt vorzugsweise
100 nm oder weniger. Die Fettemulsion mit einem solchen
Durchmesserbereich zeichnet sich durch ein Vermeiden der Aufnahme
durch das reticulo-endotheliale System aus.
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Zusätzlich kennt man dort, wo die Fettemulsion nach
der vorliegenden Erfindung verabreicht wird, die bei dem
pilzbekämpfenden Antibiotikum mit Polyen festgestellte Störung der
Nierenfunktion überhaupt nicht mehr. Bei einem Einsatz der
Fettemulsion nach der vorliegenden Erfindung kann die Menge des
in die Nieren migrierenden pilzbekämpfenden Antibiotikums mit
Polyen extrem minimiert werden, und als Folge davon wird
erwogen, daß eine Milderung der Nierenschädigung erzielt werden
kann.
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Ein weiteres Kennzeichen der vorliegenden Erfindung
liegt in der Verwendung von fein verteilten stabilen
Emulsionsteilchen als Präparatform des pilzbekämpfenden Antibiotikums
mit Polyen.
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Durch Aufteilung des Antibiotikums in feine Teilchen
kann nicht nur die oben beschriebene Wirkung, sondern auch die
Wirkung des Aufrechterhaltens der Blutkonzentration des
Arzneimittels durch Hemmung der nichtspezifischen Aufnahme des
Arzneimittels durch das reticulo-endotheliale Gewebe od.dgl.
erhalten werden.
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Das pilzbekämpfende Antibiotikum mit Polyen ist ein
relativ unstabiles Arzneimittel, und es ist bekannt, daß das
pilzbekämpfende Antibiotikum mit Polyen sich in einer wäßrigen
Lösung allmählich zersetzt. Bei der vorliegenden Erfindung ist
das pilzbekämpfende Antibiotikum mit Polyen jedoch in
Öltröpfchen des Lipids vorhanden und ist folglich in solch einem
Zustand vorhanden, daß das Antibiotikum von der Umgebung
abgeschirmt wird. Aus diesem Grunde kann eine enzymatische oder
nicht-enzymatische Zersetzung verhindert werden, so daß die
Stabilität des Arzneimittels auch verbessert wird.
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Wie oben beschrieben, sind die Fettemulsionsteilchen
gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich zu eine
hochkalorienhaltige Zulieferflüssigkeit anwendenden konventionellen
Fettemulsionen, welche Zulieferflüssigkeit zum Stande der
Technik gehörendes Sojabohnenöl und Eidotter-Lecithin enthält,
durch die Verwendung der Oberflächenschicht (beispielsweise
raffiniertes Eidotter-Lecithin) in großen Mengen im Verhältnis
zum Kern der Emulsionsteilchen (beispielsweise Sojabohnenöl)
gekennzeichnet. Durch eine solche Rezeptierung kann erstmals
eine das pilzbekämpfende Antibiotikum mit Polyen enthaltende
stabile Fettemulsion von feinen Teilchen erhalten werden.
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Bei der Fettemulsion nach der vorliegenden Erfindung
ist es notwendig, Phospholipide in einer 0,15 bis 2 Mal
größeren Menge als derjenigen des einfachen Lipids zu verwenden.
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Durch die Verwendung des Phospholipides in einer
solchen Menge vergrößert sich die Oberfläche an jenem Teil, der
durch die feine Zerteilung der Emulsion zum Kern des
Emulsionsteilchens wird, um den Kern als Oberflächenschicht der
Emulsionsteilchen zu bedecken, wodurch die Menge an erforderlichen
Phospholipiden zur Stabilisierung der Emulsion ausreichend
geliefert werden kann.
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Dies bedeutet ferner, daß die Menge an Phospholipiden,
die erforderlich ist, um das pilzbekämpfende Antibiotikum mit
Polyen in den Emulsionsteilchen stabil zu halten, ausreichend
geliefert werden kann.
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Bei einer Menge, die niedriger ist als der untere oben
beschriebene Grenzwert, ist es unvermeidlich, daß sich grobe
Partikel dazugesellen, so daß keine das Arzneimittel
enthaltende stabile Emulsion erhalten werden kann. Wofern das
Phospholipid in einer Menge verwendet werden, welche den oberen
Grenzwert übersteigt, ist es unvermeidlich, daß sich
Liposomenteilchen
dazugesellen, so daß keine das Arzneimittel enthaltende
einheitliche Emulsion erhalten werden kann.
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Es ist erforderlich, daß der Gehalt an
pilzbekämpfendem Antibiotikum mit Polyen bei der vorliegenden Erfindung 5%
(Gew./Vol.) oder weniger betrage.
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Beispiele für die bei der vorliegenden Erfindung
verwendeten einfachen Lipide schließen neutrale Lipide, wie
raffiniertes Sojabohnenöl, Baumwollöl, Rapsöl, Sesamöl, Maisöl,
Erdnußöl, Safloröl, Triolein, Trilinolein, Tripalmitin,
Tristearin, Trimyristin, Triarachidonin etc., ein. Zusätzliche
Beispiele umfassen auch Sterolderivate, wie Cholesteryloleat,
Cholesteryllinolat, Cholesterylmyristat, Cholesterylpalmitat,
Cholesterylarachidat etc.
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Neutrale Lipide werden durch verschiedene im
vaskulären Endothelium etc. vorhandene Lipasen relativ leicht
zersetzt, wohingegen Cholesterolderivate durch diese Enzyme nur
unter Schwierigkeiten eine Zersetzung durchmachen, so daß die
Stabilität in vivo weiter zunimmt. Aus diesem Grunde sind die
neutralen Lipide als Ingredienzien der vorliegenden Erfindung
bevorzugt.
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Beispiele für die Phospholipide, die bei der
vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen
Phospholipide ein, die aus Eidotter, Sojabohnen, Rindfleisch,
Schweinefleisch etc. abgeleitet sind, sowie Phospholipide, die rein
synthetisch oder halbsynthetisch erhalten wurden. Das heißt,
die Beispiele umfassen Phosphatidylcholin,
Phosphatidyläthanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol,
Phosphatidylglycerol etc.
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Zusätzliche Beispiele schließen
Eidotter-Phosphatidylcholin, Sojabohnen-Phosphatidylcholin,
Dipalmitoyl-Phosphatidylcholin, Dimyristoyl-Phosphatidylcholin,
Distearoyl-Phosphatidylcholin, Dioleoyl-Phosphatidylcholin,
Dipalmitoyl-Phosphatidylglycerol etc. ein. Hydrierte Produkte derselben können
auch verwendet werden. Unter denselben ist raffiniertes
Eidotter-Lecithin ein bevorzugter Vertreter.
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Um den Emulsionsteilchen eine Oberflächenladung zu
verleihen, können Lipide mit einer Ladung, wie Stearylamin,
Dicetylphosphat,
Phosphatidsäure; Phosphatidylglycerol etc., auch
verwendet werden.
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Bei der Herstellung der Fettemulsion nach der
vorliegenden Erfindung können verschiedene bisher verwendete
Verfahren zur Herstellung von Emulsionen, so wie sie bestehen,
ebenfalls benutzt werden. Es ist zum Beispiel üblich, daß alle
Ingredienzien, einschließlich des Arzneimittels, unter Verwendung
eines Homogenisierapparats mit Druckstrahl, wie ein Manton-
Gaulin-Typ, eines Mikrofluidisiergerätes, eines
Ultraschall-Homogenisierapparates etc., ausreichend fein gemahlen werden, um
die Fettemulsion nach der vorliegenden Erfindung zu bilden.
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Bei der Herstellung können Sterole, Fettsäuren oder
Derivate derselben, die allgemein als Emulgierhilfen oder
Stabilisatoren bekannt und physiologisch akzeptabel sind,
ebenfalls eingefügt werden. Repräsentative Beispiele dieser
Substanzen schließen Cholesterol, Oleinsäure etc. ein.
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Die Gestalt und der Partikeldurchmesser der
Fettemulsion gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch ein
Elektronenmikroskop, durch ein Gerät zur Analyse des
Partikeldurchmessers der mit Lichtstreuung arbeitenden Art, durch Filtration
durch einen Membranfilter hindurch etc. leicht verifiziert
werden.
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Um einen höheren Gebrauchswert zu erhalten, können der
Fettemulsion nach der vorliegenden Erfindung andere
Ingredienzien ebenfalls zugegeben werden. Als solche Ingredienzien
können Additive, Hilfssubstanzen u.dgl., die allgemein für
Injektionen verwendet werden, zu Veranschaulichungszwecken
aufgezeigt werden. Als Beispiele seien ein Antioxydans, ein
Konservierungsmittel, ein Stabilisator, ein isotonisches Mittel, ein
Puffermittel u.dgl. genannt. Die erforderlichen Mengen und die
optimalen Mengen dieser Additive, Hilfssubstanzen etc. können
je nach Zweck variiert werden.
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Die so erhaltene Fettemulsion nach der vorliegenden
Erfindung wird nötigenfalls sterilisiert (beispielsweise
Sterilisation durch Filtrierung, Sterilisation durch Hochdruckdampf
etc.), und zusammen mit Stickstoffgas in einer Ampulle
verschlossen. Zusätzlich kann die Fettemulsion nötigenfalls
gefriergetrocknet werden. Die gefriergetrocknete Fettemulsion
nach der vorliegenden Erfindung kann durch Zugabe einer
zweckmäßigen Lösung an dieselbe aufgetaut werden.
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Die Fettemulsion nach der vorliegenden Erfindung wird
im allgemeinen zu Behandlungszwecken oder zur Verhütung von
antimykotischen Infektionen oder viralen Infektionen intravenös
an Menschen oder verschiedene Tiere verabreicht. In diesem
Falle ist es nötig, den Partikeldurchmesser etc. der
Emulsionsteilchen ausreichend unter Kontrolle zu halten.
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Bei Injektionen für intravenöse Anwendungen ist
bekannt, daß bei einer Beimischung von Teilchen von 1 µm oder
mehr im allgemeinen verschiedene toxische Bedingungen
auftreten. Die Fettemulsion nach der vorliegenden Erfindung kann, wie
bei herkömmlichen Fettemulsionen, als Injektion intraarteriell,
intramuskulär, intramedullär und subkutan verabreicht werden.
Zusätzlich kann die Fettemuslion nach der vorliegenden
Erfindung zu Augentropfen, Nasentropfen, oralen Mitteln,
Inhalationen, Injektionen in die Harnblase, Suppositorien, Salben etc.
hergestellt und als diese verwendet werden. Auch in diesen
Fällen können Additive, die pharmazeutisch akzeptable Grundlagen,
Exzipienten etc. sind, der Fettemulsion nach der vorliegenden
Erfindung zugegeben werden.
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Eine zu verabreichende Dosis der Fettemulsion gemäß
der vorliegenden Erfindung kann je nach dem Weg der
Verabreichung, der Präparatform, den Bedingungen und dem Zwecke
variiert werden, aber die Dosis von 1 bis 1000 ml/Zeit ist im
allgemeinen als Emulsion ausreichend. Eine Dosis des verabreichten
pilzbekämpfendem Antibiotikums mit Polyen liegt für einen
Erwachsenen im Bereiche von 1 zu 200 mg/Zeit.
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Als pilzbekämpfendes Antibiotikum mit Polyen, das bei
der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann, kommen
Amphotericin-B-Methylester, Nystatin, Trichomycin, Pimaricin etc.
zusätzlich zu Amphotericin B in Betracht.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung kann der klinische
Gebrauchswert des pilzbekämpfendem Antibiotikums mit Polyen
deutlich erhöht werden. Als Auswirkungen der vorliegenden
Erfindung werden die Probleme des Standes der Technik überwunden,
und es zeigen sich die folgenden Effekte: (1) nicht nur die dem
pilzbekämpfenden Antibiotikum mit Polyen innewohnende
hämolytische Toxizität, sondern auch die Nephrotoxizität, welche das
ernsthafte zu lösende Problem darstellt, können deutlich
reduziert werden; (2) die Migration der Arzneimittel in den Fokus
wird verbessert; (3) die Aufnahme durch das
reticulo-endotheliale System wird verhindert; (4) es wird ein Andauern der
Blutkonzentration der enthaltenen Arzneimittel realisiert; (5)
die Stabilität während der Lagerung wird sichergestellt; (6)
die Produktionskosten werden verringert, etc. Diese Wirkungen
werden durch die vorliegende Erfindung erstmals erhalten.
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Die Ingredienzien der Fettemulsion gemäß der vorliegenden
Erfindung sind hauptsächlich medizinisch akzeptable Lipide, die
bisher in klinischen Bereichen praktisch als medizinische
Arzneimittel verwendet wurden. Aus diesem Grunde kann die
Fettemulsion nach der vorliegenden Erfindung extrem sicher
verwendet werden.
BESTE AUSÜBUNGSART DER ERFINDUNG
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Im folgenden wird die vorliegende Erfindung unter
Bezugnahme auf Beispiele, die sich auf die Herstellung der
Fettemulsion gemäß der vorliegenden Erfindung beziehen, in größerer
Ausführlichkeit beschrieben. Es ist jedoch ersichtlich, daß die
vorliegende Erfindung nicht ausschließlich auf diese Beispiele
beschränkt ist.
Herstellungsbeispiel 1
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Nach dem Mischen von 3 mg Amphotericin B, 0,5 g
raffinierten Sojabohnenöls und 0,5 g raffinierten Eidotter-Lecithins
und deren Auflösung in 100 ml eines Gemisches von
Chloroform/Methanol (1/1, Vol./Vol.) wird das Lösungsmittel unter
reduziertem Drucke unter Verwendung eines Drehverdampfers
vollständig entfernt. Danach werden 8 ml einer isotonischen
Phosphatpufferlösung dazugegeben. Das Gemisch wird mit einem
Homogenisierapparat gerührt, um eine grobe Emulsion zu bilden. Die
isotonische Phosphatpufferlösung wird der Emulsion zugegeben, um
das Volumen auf 10 ml zu bringen. Danach wird das Gemisch 60
Minuten lang unter Eiskühlung emulgiert, wobei ein Ultraschall-
Homogenisierapparat (Branson Modell 185) verwendet wird, um
eine feine Mikrofettemulsion zu erhalten, die Amphotericin B
mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 45 nm
enthält.
Herstellungsbeispiel 2
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Nach dem Erhitzen von 3 g Amphotericin B, 50 g
raffinierten Sojabohnenöls und 15 g raffinierten Eidotter-Lecithins
auf ungefähr 60ºC und ihrem Durchmischen werden dem Gemisch 500
ml einer isotonischen Phosphatpufferlösung zugegeben, um eine
grobe Emulsion zu bilden. Die grobe Emulsion wird unter
Verwendung eines Homogenisierapparats eines Manton-Gaulin-Typs unter
hohem Druck emulgiert, um eine feine Mikrofettemulsion zu
erhalten, die Amphotericin B mit einem durchschnittlichen
Partikeldurchmesser von 70 nm enthält.
Herstellungsbeispiel 3
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Nach dem Mischen von 30 mg Amphotericin B, 0,5 g
raffinierten Sojabohnenöls und 0,5 g raffinierten
Eidotter-Lecithins und deren Auflösung in einem Gemisch von 100 ml
Chloroform/Methanol (1/1, Vol./Vol.) wird das Lösungsmittel unter
reduziertem Druck und unter Verwendung eines Drehverdampfers
vollständig entfernt. Anschließend werden 8 ml einer wäßrigen
Glycerinlösung von 0,24 M dazugegeben. Das Gemisch wird mit
einem Homogenisierapparat gerührt, um eine grobe Emulsion zu
bilden. Danach wird der Emulsion eine wäßrige Glycerinlösung
von 0,24 M zugegeben, um das Volumen auf 10 ml zu bringen, dann
wird das Gemisch 60 Minuten 60 Minuten lang unter Eiskühlung
emulgiert, wobei ein Ultraschall-Homogenisierapparat (Branson
Modell 185) verwendet wird, um eine feine Mikrofettemulsion zu
erhalten, die Amphotericin B mit einem durchschnittlichen
Partikeldurchmesser von 93 nm enthält.
Herstellungsbeispiel 4
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Nach dem Erhitzen von 2 g Amphotericin B, 20 g
raffinierten Sojabohnenöls und 30 g raffinierten Eidotter-Lecithins
auf ungefähr 60ºC und ihrer gegenseitigen Durchmischung werden
dem Gemisch 100 ml einer wäßrigen Glycerinlösung von 0,24 M
zugegeben. Das Gemisch wird mit einem Homogenisiergerät gerührt,
um eine grobe Emulsion zu erhalten. Die grobe Emulsion wird
unter Verwendung eines Mikrofluidisiergerätes unter hohem Druck
emulgiert, um eine feine Mikrofettemulsion zu erhalten, die
Amphotericin B mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser
von 20 nm enthält.
Herstellungsbeispiel 5
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Nach dem Mischen von 1 mg Amphotericin B, 0,5 g
Cholesteryloleat und 0,5 g raffinierten Eidotter-Lecithins und
deren Auflösung in einem Gemisch von 100 ml Chloroform/Methanol
(1/1, Vol./Vol.) wird das Lösungsmittel unter Verwendung eines
Drehverdampfers unter reduziertem Druck vollständig entfernt.
Dazu werden 8 ml einer wäßrigen Glycerinlösung von 0,24 M
zugegeben. Das Gemisch wird mit einem Homogenisierapparat gerührt,
um eine grobe Emulsion zu bilden. Nach der Zugabe einer
wäßrigen Glycerinlösung von 0,24 M an die Emulsion, um das Volumen
auf 10 ml zu bringen, wird das Gemisch 60 Minuten lang unter
Eiskühlung emulgiert, wobei ein Ultraschall-Homogenisierapparat
(Branson Modell 185) verwendet wird, um eine feine
Mikrofettemulsion zu erhalten, die Amphotericin B mit einem
durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 55 nm enthält.
Herstellungsbeispiel 6
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Nach dem Mischen von 3 mg Amphotericin B, 0,5 g
raffinierten Sojabohnenöls und 0,1 g
Dimyristoyl-Phosphatidylglycerol und deren Auflösung in einem Gemisch von 100 ml
Chloroform/Methanol (1/1, Vol./Vol.) wird das Lösungsmittel unter
Verwendung eines Drehverdampfers unter reduziertem Druck
vollständig entfernt. Dazu werden 8 ml einer 9%-igen wäßrigen
Lösung von Laktose zugegeben. Das Gemisch wird mit einem
Homogenisierapparat gerührt, um eine grobe Emulsion zu bilden. Nach
der Zugabe einer 9%-igen wäßrigen Lösung von Laktose an die
Emulsion, um das Volumen auf 10 ml zu bringen, wird das Gemisch
60 Minuten lang unter Eiskühlung emulgiert, wobei ein
Ultraschall-Homogenisierapparat (Branson Modell 185) verwendet wird,
um eine feine Mikrofettemulsion zu erhalten, die Amphotericin B
mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 48 nm
enthält.
Herstellungsbeispiel 7
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Nach dem Mischen von 3 mg Amphotericin B, 0,5 g
raffinierten Sojabohnenöls, 0,4 g hydrierten Eidotter-Lecithins und
0,1 g Cholesterol und deren Auflösung in einem Gemisch von 100
ml Chloroform/Methanol (1/1, Vol./Vol.) wird das Lösungsmittel
unter Verwendung eines Drehverdampfers unter reduziertem Druck
vollständig entfernt. Dazu werden 8 ml einer 9%-igen wäßrigen
Lösung von Laktose zugegeben. Das Gemisch wird mit einem
Homogenisierapparat gerührt, um eine grobe Emulsion zu bilden. Nach
der Zugabe einer 9%-igen wäßrigen Lösung von Laktose an die
Emulsion, um das Volumen auf 10 ml zu bringen, wird das Gemisch
60 Minuten lang unter Eiskühlung emulgiert, wobei ein
Ultraschall-Homogenisierapparat (Branson Modell 185) verwendet wird,
um eine feine Mikrofettemulsion zu erhalten, die Amphotericin B
mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 31 nm
enthält.
Herstellungsbeispiel 8
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Nach der Zugabe von 0,5 g Albumin an die Amphotericin
B enthaltenden Arzneimittelzusammensetzungen, die in den
Herstellungsbeispielen 1, 5 und 6 erhalten wurden, wird die
Zusammensetzung gefriergetrocknet, um ein gefriergetrocknetes
Präparat zu ergeben.
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Die Resultate, die durch die Auswertung der
Eigenschaften der Amphotericin B enthaltenden
Arzneimittelzusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wurden,
werden unten gezeigt. In jedem Test werden zu Vergleichszwecken
ein im Handel erhältliches Amphotericin-B-Präparat,
verschiedene Amphotericin B enthaltende Liposomen-Präparate, die zum
Stande der Technik gehören, sowie eine herkömmliche
Fettemulsion verwendet. Die Einzelheiten einer jeden Probe werden unten
beschrieben.
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Probe 1: Eine Amphotericin B enthaltende
Arzneimittelzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die im
Herstellungsbeispiel 1 erhalten wurde.
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Probe 2: Eine Amphotericin B enthaltende
Arzneimittelzusammensetzung gemäß der vorliegenden Erfindung, die im
Herstellungsbeispiel 3 erhalten wurde.
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Vergleichsprobe 1: Ein im Handel erhältliches
Amphotericin-Präparat für Injektionen [Marke: Fungizone (eingetragenes
Markenzeichen), Squibb Japan].
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Vergleichsprobe 2: Ein im Handel erhältliches,
Amphotericin B enthaltendes Liposomen-Präparat, das gemäß der
Veröffentlichung Nr. 1 hergestellt wird und aus
Dimyristoyl-Phosphatidylcholin zusammengesetzt ist :
Dimyristoyl-Phosphatidylglycerol = in einem molaren Verhältnis von 7 : 3, welches in
multilamellare Liposomen klassifiziert ist.
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Vergleichsprobe 3: Ein im Handel erhältliches,
Amphotericin B enthaltendes Liposomen-Präparat, das gemäß der
Veröffentlichung Nr. 1 hergestellt wird und aus
Dimyristoyl-Phosphatidylcholin zusammengesetzt ist :
Dimyristoyl-Phosphatidylglycerol = in einem molaren Verhältnis von 7 : 3, welches nach
einer Ultraschallbehandlung erhalten wurde und in kleine
unilamellare Liposomen klassifiziert ist.
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Vergleichsprobe 4: Ein im Handel erhältliches, gemäß
der Veröffentlichung Nr. 1 hergestelltes, Amphotericin B
enthaltendes, Liposomen-Präparat, das sich aus Eidotter-Lecithin
zusammensetzt, und welches nach einer Ultraschallbehandlung
erhalten wird und in kleine unilamellare Liposomen klassifiziert
ist.
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Vergleichsprobe 5: Ein Amphotericin B enthaltendes
Liposomen-Präparat, das gemäß Veröffentlichung Nr. 2
hergestellt wird und aus raffiniertem Sojabohnenöl und raffiniertem
Eidotter-Lecithin zusammengesetzt ist.
Testbeispiel 1: Test auf Hämolyse
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Im Hinblick auf Probe 1 und Vergleichsprobe 1 wurde
die hämolytische Wirkung auf gereinigte rote Blutkörperchen von
Ratten in vitro untersucht. Die Vergleichsprobe 1 zeigte eine
deutliche Hämolyse in einer extrem niedrigen Konzentration (0,1
µg/ml oder mehr) von Amphotericin B, aber die Probe 1 zeigte
kaum eine, nicht einmal bei einer 200 Mal größeren oder noch
größeren Konzentration. Somit ist klar, daß die Fettemulsionen
nach der vorliegenden Erfindung die dem Amphotericin B selbst
innewohnende hämolytische Toxizität, wie in herkömmlich
bekannten Liposomen-Präparaten und Fettemulsionspräparaten, stark
verringern.
Testbeispiel 2: Akute Toxizität (in vivo)
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Unter Verwendung von männlichen Mäusen vom Stamme ddY
als Versuchstiere (mit einem Gewicht von ungefähr 20 g) wurde
eine jede der Proben und Vergleichsproben intravenös in die
Schwanzvene verabreicht, um deren akute Toxizität zu ermitteln.
Die Fig. 2 und 3 zeigen die Überlebensrate der Mäuse 1 und 72
Stunden nach den einzelnen Verabreichungen.
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Die 1 Stunde nach der Verabreichung ermittelte
Überlebensrate, die in Fig. 2 gezeigt wird, weist auf toxische Werte
hin, vor allem auf Grund der dem Amphotericin B innewohnenden
Hämolyse. Die getesteten Proben nach der vorliegenden Erfindung
zeigten alle eine niedrige Toxizität. Unter den
Vergleichsproben wurde bei den Proben 2 und 3 eine Reduktion der Toxizität
auf Grund von Hämolyse festgestellt. Bei den Vergleichsproben
1, 4 und 5 wurde jedoch keine Milderung der akuten Toxizität
beobachtet.
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Die 72 Stunden nach Verabreichung ermittelte
Überlebensrate, die in Fig. 3 gezeigt wird, weist auf toxische Werte
hin, vor allem auf Grund der dem Amphotericin B innewohnenden
nephrotischen Toxizität. Die getesteten Proben nach der
vorliegenden Erfindung zeigten alle eine extrem niedrige Toxizität.
Hingegen erschien bei allen Vergleichsproben eine Toxizität,
was darauf hinweist, daß die Nephrotoxizität im Vergleich zu
den Proben nach der vorliegenden Erfindung bemerkenswert ist.
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Es ist ersichtlich, daß bei den Fettemulsionen nach
der vorliegenden Erfindung die Wirkungen der Reduzierung der
Toxizität nicht nur bezüglich der unmittelbar nach der
Verabreichung beobachteten hämolytischen Toxizität, sondern vor
allem
bezüglich der 72 Stunden nach Verabreichung festgestellten
Toxizität, welche auf die Nephrotoxizität zurückgeführt wird,
bemerkenswert sind.
Testbeispiel 3: Menge des Arzneimittels in den Nieren
(Verteilung in den Nieren)
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Unter Verwendung von männlichen Ratten des SD-Stammes
(mit einem Gewicht von ungefähr 250 g) als Versuchstiere wurde
jede der Proben nach der vorliegenden Erfindung sowie der
Vergleichsproben intravenös durch die Schwanzvene verabreicht. Die
Dosis betrug 1 mg/kg als Amphotericin B. 18 Stunden nach
Verabreichung wurden die Nieren entfernt und homogenisiert. Dann
wurde die Konzentration des Amphotericins B in den Nieren
mittels Hochleistungs-Flüssigchromatographie bestimmt. Die
Resultate werden in Tabelle 1 gezeigt.
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Dort wo die Proben nach der vorliegenden Erfindung
verabreicht wurden, betrug die Konzentration des Amphotericins
B in den Nieren in jedem Falle weniger als der Meßgrenzwert.
Bei Verabreichung der Vergleichsproben jedoch wurde in allen
dieser Fälle eine hohe Konzentration an Amphotericin B
ermittelt.
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Die Fettemulsionen nach der vorliegenden Erfindung
erzielen im Vergleich zu den herkömmlich bekannten
Liposomen-Präparaten und Fettemulsions-Präparaten eine bemerkenswert klare
Verbesserung der Verteilung des Arzneimittels in den Nieren
(Senkung der Migration).
Tabelle 1. Menge an in den Nieren verteiltem Amphotericin B
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(Durchschnittswert ± Standardfehler, n = 3)
Testbeispiel 4: Bewertung der Nierenfunktion
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Unter Verwendung von männlichen Ratten des SD-Stammes
(die ungefähr 250 g wogen) als Versuchstiere wurde jede der
Proben nach der vorliegenden Erfindung und der Vergleichsproben
durch die Schwanzvene intravenös verabreicht. Die Dosis betrug
1 mg/kg als Amphotericin B, und das Arzneimittel wurde alle 24
Stunden insgesamt 3 mal verabreicht. 24 Stunden nach der
letzten Verabreichung wurde Blut aus der Halsvene gesammelt, um
Serum zu erhalten. Die als Index für die Nierenfunktionen
verwendete Menge an Blutharnstickstoff (BUN) wurde unter Verwendung
einer im Handel erhältichen Prüfausrüstung bestimmt. Die
Resultate werden in Tabelle 2 gezeigt. Zu Kontrollzwecken wurde eine
physiologische Kochsalzlösung auf dieselbe Weise verabreicht,
und das so erhaltene Serum wurde verwendet.
Tabelle 2. Serologische Bewertung der Nierenfunktion
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(Durchschnittswert ± Standardfehler, n = 3)
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Dort wo Proben nach der vorliegenden Erfindung
verabreicht wurden, bestand in keinem Falle ein Unterschied in der
BUN-Konzentration zwischen den Proben und dem Kontrollbeispiel,
was darauf hinweist, daß in den Nierenfunktionen keine Störung
festgestellt wurde. Wenn jedoch Vergleichsproben verabreicht
wurden, wurde in allen Fällen eine deutlich höhere
BUN-Konzentration festgestellt, was darauf hinweist, daß eine Störung der
Nierenfunktionen festgestellt wurde. Es ist ersichtlich, daß
bei den Fettemulsionen nach der vorliegenden Erfindung im
Vergleich zu den herkömmlich bekannten Liposomen-Präparaten und
Fettemulsions-Präparaten eine bemerkenswerte Besserung der
Störung der Nierenfunktionen erzielt werden kann.
Testbeispiel 5: Veränderung der Blutkonzentration
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Unter Verwendung von männlichen Ratten des SD-Stammes
(die ungefähr 250 g wogen) als Versuchstiere wurde jede der
Proben nach der vorliegenden Erfindung und der Vergleichsproben
durch die Schwanzvene intravenös verabreicht. Die verabreichte
Dosis betrug 1 mg/kg als Amphotericin B. Nach der Verabreichung
wurde eine kleine Menge Blut aus der Halsvene gesammelt, um
Serum zu erhalten. Die Amphotericin B-Konzentration in den Nieren
wurde durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie bestimmt. Die
Resultate werden in Fig. 4 gezeigt.
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Dort wo Proben nach der vorliegenden Erfindung
verabreicht wurden, war die Veränderung der
Amphotericin-B-Konzentration im Serum höher als in jedem Falle der Vergleichsproben.
Anderseits nahm bei der Verabreichung einer jeden
Vergleichsprobe die Amphotericin-B-Konzentration ab. Es ist ersichtlich,
daß die Fettemulsionen nach der vorliegenden Erfindung im
Vergleich zu den herkömmlich bekannten Liposomen-Präparaten und
Fettemulsions-Präparaten eine bemerkenswerte Blutkonzentration
von Amphotericin B aufrechterhalten.
Testbeispiel 6: Verteilung des Arzneimittels an der entzündeten
Stelle
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Es ist bekannt, daß mit Pilzen infizierte Stellen etc.
eine Entzündung verursachen. Die Verteilung des Arzneimittels
in den experimentell herbeigeführten entzündeten Stellen wurde
im Modellsystem bewertet.
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Unter Verwendung von männlichen Ratten des SD-Stammes
(die ungefähr 250 g wogen) als Versuchstiere wurden 0,1 ml von
2%-igem lambda-Carrageenin intrathoraxal verabreicht, um
versuchsweise eine Brustfellentzündung auszulösen. Zweieinhalb
Stunden später wurde eine jede der Proben nach der vorliegenden
Erfindung und der Vergleichsproben durch die Schwanzvene
intravenös verabreicht. Die als Amphotericin B verabreichte Dosis
betrug 1 mg/kg. Nach der Verabreichung wurde in jedem Fall
jedes Tier von der Unterleibsaorta zu Tode bluten gelassen, um
das Exudat im Thoraxhohlraum zu erhalten. Die Amphotericin-B-
Konzentration im Exudat wurde durch
Hochleistungs-Flüssigchromatographie
bestimmt. Die Resultate werden in Fig. 5 gezeigt.
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Es wurde gezeigt, daß in den Fällen, in denrn eine
beliebige Probe nach der vorliegenden Erfindung verabreicht
wurde, die Veränderung der Amphotericin-B-Konzentration höher war
als in jedem der Vergleichsbeispiele. Es ist ersichtlich, daß
die Fettemulsionen nach der vorliegenden Erfindung die
Eigenschaft besitzen, sich an der entzündeten Stelle (infizierten
Stelle) im Vergleich zu den herkömmlich bekannten Liposomen-
Präparaten und Fettemulsions-Präparaten in bemerkenswerter
Weise zu konzentrieren, und daß eine wirksame und sichere
Chemotherapie erreicht werden kann.
Testbeispiel 7: Messung des Partikeldurchmessers
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Die Partikeldurchmesser der Proben 1 und 2 nach der
vorliegenden Erfindung wurden unter Verwendung einer
Vorrichtung zum Messen des Partikeldurchmessers mittels dynamischer
Lichtstreuung durch Laserlicht bewertet. Als Ergebnis wies die
Probe 1 nach der vorliegenden Erfindung einen
Partikeldurchmesser von ungefähr 20 bis etwa 80 nm auf. Probe 1 enthielt keine
Partikel mit einem Durchmesser von 1 µm oder mehr. Der
Partikeldurchmesser der Probe 2 nach der vorliegenden Erfindung
zeigte einen Wert von etwa 70 bis ungefähr 200 nm. Probe 2
enthielt keine Partikel mit einem Durchmesser von 1 µm oder mehr.
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Es ist ersichtlich, daß die Fettemulsion nach der
vorliegenden Erfindung extrem feine und gleichmäßige
Emulsionsteilchen enthält. Ferner ist die Fettemulsion frei von
Partikeln mit einem Durchmesser von 1 µm oder mehr, was bei einer
intravenösen Verabreichung problematisch ist. Aus diesem Grunde
ist ersichtlich, daß eine wirksame und sichere Chemotherapie
erzielt werden kann.
Testbeispiel 8: Test auf Pilzbekämpfung (in vitro)
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Candida-Bakterien (C. Albicans) wurden in einem
Sabouraudschen Medium gezüchtet, und eine jede der Proben nach
der vorliegenden Erfindung und der Vergleichsproben wurden dem
Medium zugegeben. Die minimale Inhibitionskonzentration von
Amphotericin B zum Hemmen des Wachstums der Candida-Bakterien
wurde bestimmt, um die pilzbekämpfende Wirkung einer jeden
Probe zu bewerten. Die Resultate werden in Tabelle 3 gezeigt. Jede
Probe zeigte die pilzbekämpfende Wirkung bei extremer
spurenweiser Konzentration von Amphotericin B zur Hemmung des
Wachstums der Candida-Bakterien.
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Es wurde gezeigt, daß die Fettemulsionen nach der
vorliegenden Erfindung zu einer wirksamen und sicheren
Chemotherapie führen, ohne die dem Amphotericin B selbst innewohnende
pilzbekämpfende Wirkung in irgendeiner Weise nachteilig zu
beeinflussen.
Tabelle 3. Pilzbekämpfende Wirkung (in vitro)
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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Fig. 1 zeigt die Testresultate auf Hämolyse in vitro
von Probe 1 nach der vorliegenden Erfindung und der
Vergleichsprobe 1 unter Verwendung von roten Blutkörperchen von Ratten.
Die Abszisse bezeichnet die Amphotericin-B-Konzentration
(µg/ml), und die Ordinate bezeichnet das hämolytische Verhältnis in
%, wobei die durch Verbinden der schwarzen Kreise erhaltene
Kurve die Probe 1 nach der vorliegenden Erfindung anzeigt, und
die durch Verbinden der weißen Kreise erhaltene Kurve die
Vergleichsprobe 1 bezeichnet.
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Fig. 2 zeigt die Resultate der Bewertung der Toxizität
einer jeden Probe in Begriffen der Überlebensrate der Mäuse
eine Stunde nach Verabreichung einer jeden Probe nach der
vorliegenden Erfindung und der Vergleichsproben. Die Abszisse
bezeichnet die Dosis, bei einer Berechnung als Amphotericin B,
und die Ordinate bezeichnet die Überlebensrate der Mäuse eine
Stunde nach Verabreichung. Die jeweiligen Proben werden an der
durch Verbinden der jeweiligen schwarzen Kreise erhaltenen
Kurve
gezeigt.
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Fig. 3 zeigt die Resultate der Bewertung der Toxizität
einer jeden Probe in Begriffen der Überlebensrate der Mäuse 72
Stunden nach Verabreichung einer jeden Probe nach der
vorliegenden Erfindung und der Vergleichsproben. Die Abszisse
bezeichnet die Dosis, bei einer Berechnung als Amphotericin B,
und die Ordinate bezeichnet die Überlebensrate der Mäuse 72
Stunden nach Verabreichung. Die jeweiligen Proben werden an der
durch Verbinden der jeweiligen schwarzen Kreise erhaltenen
Kurve gezeigt.
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Fig. 4 zeigt die Veränderung der
Amphotericin-B-Konzentration im Serum nach Verabreichung einer jeden Probe nach
der vorliegenden Erfindung und der Vergleichsproben. Die
Abszisse bezeichnet das Fortschreiten der Zeit (in Stunden) nach
Verabreichung einer jeden Probe, und die Ordinate bezeichnet
die Amphotericin-B-Konzentration (µg/ml) im Serum. Die durch
Verbinden der jeweiligen weißen und schwarzen Kreise, schwarzen
Quadrate, schwarzen und weißen Dreiecke erhaltenen Kurven
bezeichnen jeweils den Fall der Probe 1 nach der vorliegenden
Erfindung, der Probe 2 nach der vorliegenden Erfindung, der
Vergleichsprobe 1, der Vergleichsprobe 2 und der Vergleichsprobe
5.
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Fig. 5 zeigt die Veränderung der
Amphotericin-B-Konzentration im Exudat der Thoraxhöhle von Ratten bei einer
experimentell herbeigeführten Brustfellentzündung nach
Verabreichung einer jeden Probe nach der vorliegenden Erfindung und der
Vergleichsprobe. Die Abszisse bezeichnet das Fortschreiten der
Zeit (in Stunden) nach Verabreichung einer jeden Probe, und die
Ordinate bezeichnet die Amphotericin-B-Konzentration (µg/ml) im
Exudat. Die durch Verbinden der jeweiligen weißen und schwarzen
Kreise, schwarzen Quadrate, schwarzen und weißen Dreiecke
erhaltenen Kurven bezeichnen jeweils den Fall der Probe 1 nach
der vorliegenden Erfindung, der Probe 2 nach der vorliegenden
Erfindung, der Vergleichsprobe 1, der Vergleichsprobe 2 und der
Vergleichsprobe 5.
INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
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Wie oben beschrieben, kann die Fettemulsion gemäß der
vorliegenden Erfindung eine sichere Verabreichung von
pilzbekämpfenden Antibiotika mit Polyen, wie Amphotericin B etc., in
einer wirksamen Dosis als pharmazeutisches Präparat bewirken.