DE69031939T2

DE69031939T2 - Osteoinduktive zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69031939T2
Application number: DE69031939T
Authority: DE
Inventors: Anthony J. Hudson Ma 01479 Celeste; Vicki A. Brookline Ma 02146 Rosen; Elizabeth A. Carlisle Ma 01741 Wang; John M. Hudson Ma 01749 Wozney
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 1989-03-28
Filing date: 1990-03-27
Publication date: 1998-09-10
Anticipated expiration: 2010-03-28
Also published as: EP0429570B1; WO1990011366A1; DE69031939D1; KR100214740B1; CA2030518A1; ATE162223T1; KR920700291A; DK0429570T3; CA2030518C; EP0429570A1; ES2113857T3

Description

OSTEOINDUKTIVE ZUSAMMENSETZUNGEN

Die vorliegende Erfindung betrifft Proteine, die sich zur Knochenund/oder Knorpelbildung verwenden lassen. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Reihe von Familien aufgereinigter Proteine, die als BMP-5-, BMP-6- und BMP-7-Proteinfamilien bezeichnet werden (wobei BMP knochenmorphogenetisches Protein bedeutet), und Verfahren zu ihrer Gewinnung. Diese Proteine zeigen die Fähigkeit, Knorpel- und/oder Knochenbildung zu induzieren. Sie können zur Induktion von Knorpel- und/oder Knochenbildung und bei der Wundheilung und Gewebewiederherstellung verwendet werden.
WO 89/09787 offenbart eine partielle Nucleinsäuresequenz und eine partielle Aminosäuresequenz für ein als "OP-1" bezeichnetes Protein. Es werden zwei unterschiedliche Formen der OP-1-Sequenz offenbart, nämlich die genomische DNA mit Introns (Figur 1A), wobei ein offenes Leseraster oder die Positionen der Introns oder Exons nicht gezeigt sind und zwischen den Positionen 1880 und 1920 ein undefinierter Sequenzbereich liegt, und in Figur 1B eine Sequenz mit einer Gesamtlänge von 314 Nucleotiden, die einem Teil der cDNA-Sequenz entsprechen sollte. Die partielle Aminosäuresequenz von OP-1 ist auf Seite 9 offenbart.
WO 91/05802 offenbart die genomische Sequenz von OP-1 von Position 1 bis 1822 und die abgeleitete Aminosäuresequenz, die das Protein voller Länge, das eine länge von 431 Aminosäuren aufweist, codiert. Darüberhinaus ist in Figur 2 und auch auf Seite 26 der Bereich gezeigt, der der reifen Form des Proteins entspricht, die als Op1-18 bezeichnet wird.
Die Erfindung stellt eine Familie von BMP-5-Proteinen bereit. Aufgereinigte BMP-5-Proteine vom Menschen sind im wesentlichen frei von anderen Proteinen, mit denen sie gemeinsam produziert werden, und sind durch eine in Tabelle III dargelegte Aminosäuresequenz gekennzeichnet, die die Aminosäuren #323 bis #454 umfaßt. Die Aminosäuresequenz von #323 bis #454 wird von der DNA-Sequenz codiert, die die Nucleotide #1665 bis #2060 in Tabelle III umfaßt. BMP-5-Proteine lassen sich darüberhinaus durch ein scheinbares Molekulargewicht von 28 000 - 30 000 Dalton charakterisieren, wie mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt. Unter reduzierenden Bedingungen wandert das Protein in einer SDS- PAGE mit einem Molekulargewicht von etwa 14 000-20 000 Dalton. Es ist zu erwarten, daß diese Proteine die Knorpel- und/oder Knochenbildung stimulieren, fördern oder in anderer Weise induzieren können.
Erfindungsgemäße menschliche BMP-5-Proteine können durch Züchtung einer Zelle produziert werden, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die die Nucleotidsequenz enthält, die gleich oder im wesentlichen gleich der Nucleotidsequenz ist, die in Tabelle III gezeigt ist und die Nucleotide #699 bis #2060 umfaßt. BMP-5-Proteine, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die gleich oder im wesentlichen gleich der in Tabelle III gezeigten ist und die Aminosäuren #323 bis #454 umfaßt, werden aus Kulturmedium gewonnen, isoliert und aufgereinigt.
Die Erfindung stellt eine Familie von BMP-6-Proteinen bereit. Aufgereinigte menschliche BMP-6-Proteine, die im wesentlichen frei von anderen Proteinen sind, die bei ihrer Herstellung anfallen, sind durch eine in Tabelle IV dargelegte Aminosäuresequenz gekennzeichnet, die die Aminosäuren #382 bis #513 umfaßt. Die Aminosäuresequenz von Aminosäure #382 bis #513 wird von der von Nucleotid #1303 bis #1698 reichenden DNA- Sequenz der Tabelle Iv codiert. Diese Proteine lassen sich darüberhinaus durch ein scheinbares Molekulargewicht von 28 000 - 30 000 Dalton charakterisieren, wie mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacryl-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt. Unter reduzierenden Bedingungen wandert das Protein bei der SDS- PAGE mit einem Molekulargewicht von etwa 14 000 - 20 000 Dalton. Es ist zu erwarten, daß diese Proteine die Knorpel- und/oder Knochenbildung stimulieren, fördern oder in anderer Weise induzieren können.
Erfindungsgemäße menschliche BMP-6-Proteine werden durch Züchtung einer Zelle produziert, die mit einer DNA-Sequenz, die wie in Tabelle III gezeigt, die Nucleotide #160 bis #1698 umfaßt, oder einer im wesentlichen ähnlichen Sequenz transformiert ist. BMP-6-Proteine, die die Aminosäuren #382 bis #513 oder eine im wesentlichen ähnliche Sequenz umfassen, werden aus dem Kulturmedium gewonnen, isoliert und aufgereinigt.
Die Erfindung stellt eine Familie von BMP-7-Proteinen bereit. Diese umfaßt aufgereinigte menschliche BMP-7-Proteine, die im wesentlichen frei sind von anderen Proteinen, mit denen sie gemeinsam produziert werden. Menschliche BMP-7-Proteine sind durch eine in Tabelle V dargelegte Aminosäuresequenz gekennzeichnet, die die Aminosäuren #300 bis #431 umfaßt. Diese Aminosäuresequenz von #300 bis #431 wird von der in Tabelle V gezeigten, von Nucleotid #994 bis #1389 reichenden DNA-Sequenz codiert. BMP-7-Proteine lassen sich darüberhinaus durch ein scheinbares Molekulargewicht von 28 000 - 30 000 Dalton charakterisieren, wie mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt. Unter reduzierenden Bedingungen wandert das Protein bei einer SDS-PAGE mit einem Molekulargewicht von etwa 14 000 - 20 000 Dalton. Es ist zu erwarten, daß diese Proteine die Knorpel- und/oder Knochenbildung stimulieren, fördern oder in anderer Weise induzieren können.
Erfindungsgemäße menschliche BMP-7-Proteine können durch Züchtung einer Zelle produziert werden, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die die Nucleotidsequenz enthält, die gleich oder im wesentlichen gleich der in Tabelle V gezeigten Sequenz ist und die Nucleotide # 97 bis #1389 umfaßt. Die BMP-7-Proteine, die von der Aminosäuresequenz umfaßt werden, die gleich oder im wesentlichen gleich der in Tabelle V gezeigten, von Aminosäure #300 bis Aminosäure #431 reichenden ist, werden aus dem Kultumiedium gewonnen, isoliert und aufgereinigt.
Die Erfindung stellt darüberhinaus ein Verfahren bereit, bei dem die vorstehend beschriebenen Proteine zur Gewinnung eines verwandten menschlichen Proteins bzw. verwandter menschlicher Proteine oder eines anderen Säuger-Proteins bzw. anderer Säugerproteine zur Knorpel- und/oder Knochenbildung verwendet werden. Solche Verfahren sind dem Fachmann für Gentechnik bekannt. Ein Verfahren zur Gewinnung solcher Proteine umfaßt die Verwendung von menschliches BMP-5, BMP-6 und BMP-7 codierenden Sequenzen oder von Teilen davon zum Entwerfen von Sonden zum Screenen menschlicher genomischer und/oder cDNA-Genbanken, um menschliche genomische und/oder cDNA-Sequenzen zu isolieren. Bei weiteren auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren können erfindungsgemäße BMP-Proteine von Rind und Mensch eingesetzt werden, um BMP-Proteine zur Knorpelund/oder Knochenbildung anderer Säuger zu erhalten.
Nach Bestimmung der Nucleotidsequenzen werden die Proteine durch Züchtung einer mit der Nucleotidsequenz transformierten Zelle produziert.
Diese Sequenz oder Teile davon hybridisiert/hybridisieren unter stringenten Bedingungen mit der Nucleotidsequenz entweder vom BMP-5-, BMP-6- oder BMP-7-Protein und codiert/codieren ein Protein, das Knorpel- und/oder Knochenbildungs-Aktivität zeigt. Das exprimierte Protein wird aus dem Kulturmedium gewonnen und aufgereinigt. Die aufgereinigten BMP-Proteine smd sowohl von anderen proteinartigen Substanzen, die bei der Herstellung mit anfallen, als auch von anderen Verunreinigungen im wesentlichen frei.
BMP-5-, BMP-6- und BMP-7-Proteine können durch die Fähigkeit charakterisiert werden, Knorpelbildung und/oder Knochenbildung zu fördern, zu stimulieren oder in anderer Weise zu induzieren. Darüberhinaus ist zu erwarten, daß man die Fähigkeit dieser Proteine zur Induktion von Knorpelund/oder Knochenbildung durch die Fähigkeit zur Knorpel- und/oder Knochenbildungs-Aktivität in dem nachstehend beschriebenen Ratten- Knochenbildungstest nachweisen kann. Weiter ist zu erwarten, daß die erfindungsgemäßen Proteine in diesem Ratten-Knochenbildungstest Aktivität bei einer Konzentration von 10 ug - 500 ug/Gramm gebildeter Knochen zeigen. Insbesondere ist zu erwarten, daß diese Proteine dadurch charakterisiert werden können, daß man in dem nachstehend beschriebenen Ratten- Knochenbildungstest mit 1 ug Protein ein Ergebnis von mindestens +2 erzielt, wobei entweder das ursprüngliche Auswertungsverfahren oder ein modifiziertes Auswertungsverfahren verwendet wird.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung von Arzneimitteln, die eine therapeutisch wirksame Menge eines BMP-5-, BMP-6- oder BMP-7- Proteins in einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel oder Träger enthalten. Weitere Zusammensetzungen umfassen mindestens ein BMP-5-, BMP- oder BMP-7-Protein. Es ist deshalb zu erwarten, daß die Zusammensetzungen mehr als ein erfindungsgemäßes BMP-Protein enthalten können, da die BMP-5-, BMP-6- oder BMP-7-Proteine zusammen oder möglicherweise synergistisch wirken können. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden zur Induktion von Knorpel- und/oder Knochenbildung verwendet. Diese Zusammensetzungen können auch zur Wundheilung und zur Gewebewiederherstellung verwendet werden.
Darüberhinaus können erfindungsgemäße Zusammensetzungen neben einem erfindungsgemäßen BMP-5-, BMP-6- oder BMP-7-Protein mindestens ein anderes therapeutisch nützliches Mittel umfassen, wie die Proteine, die als BMP-1, BMP-2 (in der Vergangenheit auch als BMP-2A, BMP-2 Klasse I bezeichnet), BMP-3 und BMP-4 (in der Vergangenheit auch als BMP-28 und BMP-2 Klasse II bezeichnet) bezeichnet werden und die in der am 14. Januar 1988 veröffentlichten Internationalen Veröffentlichung W088/00205 derselben Anmelderin und der am 2. November 1989 veröffentlichten Internationalen Veröffentlichung W089/10409 offenbart sind. Andere therapeutisch nützliche Mittel umfassen Wachstumsfaktoren wie dein epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β) und den von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF).
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können auch eine geeignete Matrix umfassen, beispielsweise zur Abgabe und/oder als Träger der Zusammensetzung und/oder zur Bereitstellung einer Oberfläche für die Knochen- und/oder Knorpelbildung. Die Matrix kann das BMP-Protein langsam freisetzen und/oder eine geeignete Umgebung zur Präsentation des erfindungsgemäßen BMP-Proteins bieten.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können bei Verfahren zur Behandlung einer Reihe von Knochen- und/oder Knorpelschäden und von Parodontose eingesetzt werden. Sie können auch bei Verfahren zur Behandlung verschiedener Wundtypen und bei der Gewebewiederherstellung eingesetzt werden. Erfindungsgemäß beinhalten diese Verfahren die Verabreichung einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung an einen Patienten, der eine solche Knochen- und/oder Knorpelbildung, Wundheilung oder Gewebewiederherstellung benötigt. Das Verfahren umfaßt daher die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Proteins. Diese Verfahren können auch die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Proteins in Verbindung mit muidestens einem der "BMP"-Proteine umfassen, die in den vorstehend beschriebenen Patentanmeldungen derselben Anmelderin offenbart sind. Außerdem können diese Verfahren auch die Verabreichung eines erfindungsgemäßen Proteins mit anderen Wachstumsfaktoren einschließlich EGF, FGF, TGF-α, TGF-β und PDGF umfassen.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung sind DNA-Sequenzen, die die I-ression eines erfindungsgemäßen Proteins codieren. Solche Sequenzen ui-assen die in den Tabellen III - V veranschaulichten Nucleotidsequenzen in 5'- 3'-Richtung oder DNA-Sequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit deii DNA-Sequenzen der Tabellen III- V hybridisieren und ein Protein codieren, das die Fähigkeit zur Induktion von Knorpel- und/oder Knochenbildung zeigt. Eine solche Knorpel- und/oder Knochenbildung läßt sich in dem nachstehend beschriebenen Ratten-Knochenbildungstest zeigen. Es ist zu erwarten, daß diese Proteine in diesem Test Aktivität bei einer Konzentration von 10 ug - 500 ug/Gramm gebildeter Knochen zeigen. Insbesondere ist zu erwarten, daß diese Proteine die Fähigkeit zeigen, daß 1 ug Protein in dem Ratten-Knochenbildungstest ein Ergebnis von mindestens +2 erreicht. Schließlich umfaßt die vorliegende Erfindung auch Allele oder andere Variationen der Sequenzen der Tabellen III- V, unabhängig davon, ob solche Nucleotidveränderungen zu Veränderungen in der Peptidsequenz führen oder nicht.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung von Vektoren, die eine vorstehend beschriebene DNA-Sequenz in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressions-Kontrollsequenz dafür enthalten. Diese Vektoren können in einem neuartigen Verfahren zur Produktion eines erfindungsgemäßen Proteins eingesetzt werden, bei dem in einem geeigneten Kulturmedium eine Zellinie gezüchtet wird, die mit einer die Expression eines erfindungsgemäßen Proteins steuernden DNA-Sequenz in funktioneller Verbindung mit einer entsprechenden Expressions-Kontrollsequenz transformiert ist, und aus dem Kulturmedium ein erfindungsgemäßes Protein gewonnen und aufgereinigt wird. Bei diesem beanspruchten Verfahren kann eine Reihe bekannter prokaryontischer als auch eukaryontischer Zellen als Wirtszellen zur Expression des Polypeptids eingesetzt werden. Die gewonnenen BMP-Proteine werden aufgereinigt, indem sie sowohl von anderen proteinartigen Substanzen, die bei der Herstellung mit anfallen, als auch von anderen Verunreinigungen befreit werden.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden durch die folgende genaue Beschreibung und deren bevorzugte Ausführungsformen verdeutlicht.

Genaue Beschreibung der Erfindung

Aufgereinigte menschliche BMP-5-Proteine können durch Züchtung einer Wirtszelle produziert werden, die mit der DNA-Sequenz von Tabelle III transformiert ist. Die exprimierten BMP-5-Proteine werden aus dem Kulturmedium isoliert und aufgereinigt. Es ist zu erwarten, daß aufgereinigte menschliche BMP-5-Proteine durch eine Aminosäuresequenz gekennzeichnet sind, die die in Tabelle III gezeigten Aminosäuren #323 bis #454 umfaßt. Erfindungsgemäße aufgereinigte menschliche BMP-5-Knorpel/Knochen-Proteine werden daher produziert, indem eine Wirtszelle gezüchtet wird, die mit einer DNA-Sequenz, die die in Tabelle III gezeigten Nucleotide #699 bis #2060 umfaßt, oder mit im wesentlichen homologen Sequenzen transformiert ist, die mit einer heterologen Regulations-Kontrollsequenz operativ verbunden sind, und aus dem Kulturmedium ein Protein gewonnen und aufgereinigt wird, das die in Tabelle III gezeigte Aminosäuresequenz von Aminosäure #323 bis Aminosäure #454 oder eine im wesentlichen homologe Sequenz umfaßt.
In weiteren Ausführungsformen umfaßt die DNA-Sequenz die Nucleotide, die die Aminosäuren #323 - #454 codieren. BMP-5-Proteine können daher produziert werden, indem eine Wirtszelle gezüchtet wird, die mit einer DNA- Sequenz, die die in Tabelle III gezeigten Nucleotide #1665 bis #2060 umfaßt, oder mit im wesentlichen homologen Sequenzen transformiert ist, die mit einer heterologen Regulations-Kontrollsequenz operativ verbunden sind, und aus dem Kulturmedium ein Protein gewonnen und aufgereinigt wird, das die in Tabelle III gezeigten Aminosäuren #323 bis #454 oder eine im wesentlichen homologe Sequenz umfaßt. Die aufgereinigten menschlichen BMP-5-Proteine sind sowohl von anderen proteinartigen Substanzen, die bei der Herstellung mit anfallen, als auch anderen Verunreinigungen im wesentlichen frei.
Aufgereinigte menschliche BMP-6-Proteine können durch Züchtung einer Wirtszelle produziert werden, die mit der DNA-Sequenz von Tabelle IV transformiert ist. Die exprimierten Proteine werden aus dem Kulturmedium isoliert und aufgereinigt. Es ist zu erwarten, daß erfindungsgemäße aufgereinigte menschliche BMP-6-Proteine durch eine Aminosäuresequenz gekennzeichnet sind, die die in Tabelle IV gezeigten Aminosäuren #382 bis #513 umfaßt. Diese erfindungsgemäßen aufgereinigten menschlichen BMP-6- Knorpel/Knochen-Proteine werden daher produziert, indem eine Wirtszelle gezüchtet wird, die mit einer DNA-Sequenz, die die in Tabelle IV dargelegten Nucleotide #160 bis #1698 umfaßt, oder mit einer im wesentlichen homologen Sequenz transformiert ist, die mit einer heterologen Regulations- Kontrollsequenz operativ verbunden ist, und aus dem Kulturmedium ein Protein gewonnen, isoliert und aufgereinigt wird, das die in Tabelle IV dargelegten Aminosäuren #382 bis #513 oder eine im wesentlichen homologe Sequenz umfaßt.
In weiteren Ausführungsformen kann die DNA-Sequenz verwendet werden, die die Nucleotide umfaßt, die die Aminosäuren #382 - #513 codiert. Aufgereinigte menschliche BMP-6-Proteine können daher produziert werden, indem eine Wirtszelle gezüchtet wird, die mit der DNA-Sequenz, die die in Tabelle IV aufgeführten Nucleotide #1303 bis #1698 umfaßt, oder mit im wesentlichen homologen Sequenzen transformiert ist, die mit einer heterologen Regulations-Kontrollsequenz operativ verbunden sind, und aus dem Kulturmedium ein Protein gewonnen und aufgereinigt wird, das die in Tabelle IV aufgeführten Aminosäuren #382 bis #513 oder eine im wesentlichen homologe Sequenz umfaßt. Die aufgereinigten menschlichen BMP-6-Proteine sind sowohl von anderen proteinartigen Substanzen, die bei der Herstellung mit anfallen, als auch von anderen Verunreinigungen im wesentlichen frei.
Aufgereinigte menschliche BMP-7-Proteine können durch Züchtung einer mit der DNA-Sequenz von Tabelle V transformierten Wirtszelle produziert werden. Die exprimierten Proteine werden aus dem Kulturmedium isoliert und aufgereinigt. Es ist zu erwarten, daß aufgereinigte BMP-7-Proteine vom Menschen durch eine Aminosäuresequenz gekennzeichnet sind, die die in Tabelle V gezeigten Aminosäuren #300 bis #431 umfaßt. Diese erfindungsgemäßen aufgereinigten menschlichen BMP-7-Knorpel/Knochen-Proteine werden daher produziert, indem eine CHO-Zelle, die mit einer DNA- Sequenz, die die in Tabelle V gezeigten Nucleotide #97 bis #1389 umfaßt, oder mit im wesentlichen homologen Sequenzen transformiert ist, die mit einer heterologen Regulations-Kontrollsequenz operativ verbunden ist, und aus dem Kulturmedium ein Protein gewonnen, isoliert und aufgereinigt wird, das die in Tabelle V gezeigte, von Aminosäure #300 bis #431 reichende Aminosäuresequenz oder eine im wesentlichen homologe Sequenz umfaßt.
In weiteren Ausführungsformen kann die DNA-Sequenz verwendet werden, die die Nucleotide umfaßt, die die Aminosäuren #300 - #431 codiert. Aufgereinigte BMP-7-Proteine können daher produziert werden, indem eine Wirtszelle gezüchtet wird, die mit einer DNA, die die in Tabelle V gezeigte DNA- Sequenz von Nucleotid #994 bis Nucleotid #1389 umfaßt, oder mit im wesentlichen homologen Sequenzen transformiert ist, die mit einer heterologen Regulations-Kontrollsequenz operativ verbunden sind, und aus dem Kulturmedium ein Protein gewonnen und aufgereinigt wird, das die in Tabelle V gezeigte Aminosäuresequenz von Aminosäure #300 bis Aminosäure #431 oder eine im wesentlichen homologe Sequenz umfaßt. Die aufgereinigten menschlichen BMP-7-Proteine sind sowohl von anderen proteinartigen Substanzen, die bei der Herstellung mit anfallen, als auch von anderen Verunreinigungen im wesentlichen frei.
BMP-5-, BMP-6- und BMP-7-Proteine sind darüberhinaus dadurch gekennzeichnet, daß sie Knorpel- und/oder Knochenbildungs-Aktivität zeigen können. Diese Aktivität läßt sich z.B. in dem in Beispiel III beschriebenen Ratten-Knochenbildungstest nachweisen. Darüberhinaus ist zu erwarten, daß diese Proteine in dem Test Aktivität bei einer Konzentration von 10 ug - 500 lg/Gramm gebildeter Knochen zeigen. Die Proteine lassen sich darüberhinaus dadurch kennzeichnen, daß 1 ug davon in diesem Test ein Ergebnis von mindestens +2 erreicht, wobei entweder das ursprüngliche Auswertungs-verfahren oder ein modifiziertes Auswertungsverfahren verwendet wird, das im vorliegenden Text nachstehend näher beschrieben ist.
BMP-5-, BMP-6- und BMP-7-Proteine sind darüberhinaus durch ein scheinbares Molekulargewicht von 28 000-30 000 Dalton gekennzeichnet, wie mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) bestimmt. Unter reduzierenden Bedingungen wandert das Protein bei einer SDS-PAGE mit einem Molekulargewicht von etwa 14 000- 20 000 Dalton.
Die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten Proteine umfassen auch Faktoren, die von Sequenzen codiert werden, die denen der Tabellen III - V ähnlich sind, die jedoch von Natur aus Modifikationen (z.B. Allel-Variationen in der Nucleotidsequenz, die zu Aminosäure-Veränderungen im Polypeptid führen können) aufweisen oder gezielt verändert wurden. Die Erfindung umfaßt ebenso synthetische Polypeptide, bei denen zusammenhängende Sequenzen der Aminosäurereste der Tabellen III - V ganz oder teilweise wiederholt sind. Aufgrund der gleichen primären, sekundären und tertiären Struktur- und Konformationsmerkmale wie andere erfindungsgemäße Knorpel/Knochen- Proteine können diese Sequenzen auch die gleichen biologischen Knochen- und Knorpel-Wachstumsfaktor-Eigenschaften wie diese besitzen. Daher können sie bei therapeutischen Verfahren als biologisch aktive Ersatzmittel für natürlich vorkommende Proteine eingesetzt werden.
Andere spezifische Mutationen der im vorliegenden Text beschriebenen erfindungsgemäßen Proteinsequenzen umfassen Modifikationen an einer Glykosylierungsstelle. Diese Modifikationen können O-verknüpfte oder N- verknüpfte Glykosylierungsstellen umfassen. Beispielsweise führt das Fehlen von Glykosylierung oder eine nur partielle Glykosylierung zu einer Aminosäure-Substitution oder -Deletion an den mit Asparagin verknüpften Glykosylierungs-Erkennungsstellen, die in den in den Tabellen III - V gezeigten Sequenzen der erfindungsgemäßen Proteine vorhanden sind. Die mit Asparagin verknüpften Glykosylierungs-Erkennungsstellen umfassen Tripeptid-Sequenzen, die durch geeignete zelluläre Glykosylierungsenzyme spezifisch erkannt werden. Diese Tripeptid-Sequenzen sind entweder Asparagin-X-Threonin oder Asparagin-X-Serin, wobei X meistens eine beliebige Aminosäure ist. Verschiedene Aminosäure-Substitutionen oder -Deletionen an der ersten oder dritten Aminosäureposition einer Glykosylierungs- Erkennungsstelle oder an beiden Positionen (und/oder eine Aminosäure- Deletion an der zweiten Position) führen zur Nichtglykosylierung an der modifizierten Tripeptidsequenz. Die Expression solcher veränderten Nucleotidsequenzen erzeugt Varianten, die an dieser Stelle nicht glykosyliert sind.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die neuartigen DNA-Sequenzen, die nicht mit andere proteinartige Substanzen codierenden DNA-Sequenzen in Verbindung stehen und bei Expression die erfindungsgemäßen Proteine codieren. Diese DNA-Sequenzen umfassen die in den Tabellen III - V in 5'- 3'- Richtung dargestellten Sequenzen. Darüberhinaus sind die Sequenzen einbezogen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen [vgl. T. Maniatis et al., Molecular Cloning (A laboratory Manual) (1982), Seiten 387-389, Cold Spring Harbor Laboratory] mit der DNA-Sequenz der Tabellen III - V hybridisieren und im Ratten-Knochenbildungstest Knorpel- und/oder Knochenbildungs-Aktivität zeigen. Bin Beispiel für solche stringenten Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung bei 6 4 x SSC bei 65ºC, der ein einstündiges Waschen in 0,1 x SSC bei 65ºC folgt. Ein Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen in einer anderen Ausführungsform ist die Hybridisierung in 50% Formamid, 4 x SSC bei 42ºC.
Die im vorliegenden Text beschriebenen erfindungsgemäßen Proteine werden auch von DNA-Sequenzen codiert, die Proteine codieren, die dem durch die Sequenzen der Tabellen III - V codierten Protein ähnlich sind, die sich jedoch aufgrund der Degeneration des genetischen Codes oder aufgrund von Allelvariationen (natürlich vorkommenden Basenveränderungen in der Population einer Art, die zu einer Aminosäureveränderung führen können oder auch nicht) in der Codonsequenz unterscheiden. Die Erfindung umfaßt auch Variationen in den DNA-Sequenzen der Tabellen III - V, die durch Punktmutationen oder induzierte Modifikationen (einschließlich Insertion, Deletion und Substitution) verursacht werden, die zur Erhöhung der Aktivität, der Halbwertszeit oder der Produktion der dadurch codierten Polypeptide führen.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zum Erhalt verwandter menschlicher Proteine oder von BMP-5-, BMP-6- und BMP-7-Proteinen anderer Säuger. Ein Verfahren zum Erhalt solcher Proteine ist beispielsweise mit der Verwendung der in der vorliegenden Erfindung offenbarten, menschliches BMP-5, BMP-6 und BMP-7 codierenden Sequenzen verbunden, um eine menschliche genomische Genbank unter Verwendung von Standardtechniken im Hinblick auf das menschliche Gen oder Fragmente davon abzusuchen. So identifizierte Sequenzen können auch als Sonden zur Bestimmung einer menschlichen Zellinie oder eines menschlichen Gewebes verwendet werden, die/das das analoge Knorpel/Knochen-Protein synthetisiert. Es wird eine cDNA-Bank synthetisiert und mit Sonden abgesucht, die von codierenden Sequenzen von Mensch oder Rind stammen. Mit der so identifizierten menschlichen Sequenz wird eine Wirtszelle transformiert, die Wirtszelle wird gezüchtet und das Protein wird aus dem Kulturmedium gewonnen, isoliert und aufgereinigt. Es ist anzunehmen, daß das aufgereinigte Protein in dem Ratten-Knochenbildungstest von Beispiel III Knorpel- und/oder Knochenbildungs-Aktivität zeigt.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuartigen Verfahrens zur Produktion der erfindungsgemäßen BMP-5-, BMP- 6- und BMP-7-Proteine. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt die Züchtung einer geeigneten Zelle oder Zellinie, die mit einer vorstehend beschriebenen DNA-Sequenz transformiert worden ist, die die Expression eines erfindungsgemäßen Proteins unter der Kontrolle bekannter Regulationssequenzen codiert. Regulationssequenzen umfassen Promotorfraginente, Terminatorfragmente und andere geeignete Sequenzen, die die Expression des Proteins in einer geeigneten Wirtszelle steuern. Verfahren zur Züchtung geeigneter Zellinien gehören zum allgemeinen Fachwissen. Die transformierten Zellen werden gezüchtet und die dadurch exprimierten BMP- Proteine werden unter Verwendung von Reinigungsverfahren, die dem Fachmannn bekannt sind, aus dem Kulturmedium gewonnen, isoliert und aufgereinigt. Die aufgereinigten BMP-Proteine sind sowohl von anderen proteinartigen Substanzen, die bei der Herstellung mit anfallen, als auch von anderen Verunreinigungen im wesentlichen frei. Erfindungsgemäße aufgereinigte BMP-Proteine sind im wesentlichen frei von Substanzen, mit denen sie in der Natur vorkommen.
Geeignete Zellen oder Zellinien können Säugerzellen sein, wie Ovarialzellen vom Chinesischen Hamster (CHO). Die Auswahl geeigneter Säuger-Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, zur Züchtung, zur Vermehrung, zum Screenen und zur Produktion und Aufreinigung des Produktes sind auf dem Fachgebiet bekannt (vgl. z.B. Gething und Sambrook, Nature 293 (1981), 620-625, oder alternativ Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 5(7) (1985), 1750-1759, oder Howley et al., US-Patent 4,419,446). Andere geeignete Säuger-Zellinien umfassen die Affen-Zellinie COS-1 und die Zellinie CV-1, sind aber nicht darauf beschränkt.
Geeignete Wirte können auch Bakterienzellen sein. Beispielsweise sind die verschiedenen Stämme von E. coli (z.B. HB101, MC1061) auf dem Gebiet der Biotechnologie als Wirtszellen wohlbekannt. Bei diesem Verfahren können auch verschiedene Stämme von B. subtilis, Pseudomonas, anderen Bacilli und ähnlichen Bakterien eingesetzt werden.
Als Wirtszellen zur Expression der erfindungsgemäßen Polypeptide sind auch viele dem Fachmann bekannte Hefe-Zellen verfügbar. Außerdem können auf Wunsch Insektenzellen als Wirtszellen bei dem erfindungsgemäßen Verfahren genutzt werden (vgl. z.B. Miller et al., Genetic Engineering 8 (1986), 277-298, Plenum Press, und darin zitierte Literaturstellen).
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Vektoren zur Verwendung in dem Verfahren zur Expression der erfindungsgemäßen Proteine. Die Vektoren enthalten die neuartigen DNA- Sequenzen, die die erfindungsgemäßen BMP-5-, BMP-6- und BMP-7-Proteine codieren. Die Vektoren enthalten außerdem geeignete Expressions-Kontrollsequenzen, die die Expression der Proteinsequenzen erlauben. Vektoren, die die vorstehend beschriebenen verkürzten oder modifizierten Sequenzen enthalten, sind alternative Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung und eignen sich zur Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. Die Vektoren lassen sich im Verfahren zur Transformation von Zellinien einsetzen und enthalten in operativer Verknüpfung mit den erfindungsgemäßen codierenden DNA-Sequenzen ausgewählte Regulationssequenzen, die in ausgewählten Wirtszellen deren Replikation und Expression steuern können. Nützliche Regulationssequenzen für solche Vektoren sind dem Fachmann bekannt und können je nach den ausgewählten Wirtszellen ausgewählt werden. Eine solche Auswahl gehört zur Routine und bildet keinen Teil der vorliegenden Erfindung. Die Erfindung stellt auch mit solchen Vektoren transformierte Wirtszellen und deren Nachkommenschaft zur Verwendung bei der Produktion von BMP-5-, BMP-6- und BMP-7-Proteinen bereit.
Unter Verwendung der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und bekannter Vektoren, wie pCD [Okayama et al., Mol. Cell Biol. 2 (1982), 161-170] und pJL3, pJL4 [Gough et al., EMBO J. 4 (1985), 645-653], kann der Fachmann Säuger- Expressionsvektoren konstruieren. Ebenso könnte der Fachmann die erfindungsgemäßen Sequenzen verändern, indem die die codierende Sequenz flankierenden Säuger-Regulationssequenzen beseitigt oder durch bakterielle Sequenzen ersetzt werden, um bakterielle Vektoren zur intrazellulären oder extrazellulären Expression durch Bakterienzellen zu erzeugen. Beispielsweise könnten die codierenden Sequenzen weiter verändert werden (z.B. Ligierung an andere bekannte Linker oder Modifikation durch Deletion nichtcodierender Sequenzen oder Veränderung darin enthaltener Nucleotide mittels anderer bekannter Verfahren). Die modifizierte codierende Sequenz könnte dann unter Verwendung von Verfahren, wie den in T. Taniguchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 5230-5233 beschriebenen, in einen bekannten bakteriellen Vektor insertiert werden. Dieser beispielhafte bakterielle Vektor könnte danach in Bakterien-Wirtszellen transformiert werden und dadurch könnte ein erfindungsgemäßes Protein exprimiert werden. Vgl. z.B. die Europäische Patentanmeldung EPA 177,343 im Hinblick auf eine Strategie zur Erzeugung einer extrazellulären Expression eines erfindungsgemäßen Knorpel-und/oder Knochen-Proteins in Bakterienzellen.
Ähnliche Veränderungen können zur Konstruktion eines Insekten-Vektors zur Expression in Insektenzellen durchgeführt werden [vgl. z.B. die in der veröffentlichten Europäischen Patentanmeldung 155,476 beschriebenen Verfahren]. Unter Verwendung von Hefe-Regulationssequenzen könnte auch ein Hefe-Vektor konstruiert werden, mit dem die erfindungsgemäßen Faktoren intrazellulär oder extrazellulär in Hefezellen exprimiert werden [vgl. z.B. die in der veröffentlichten PCT-Anmeldung W086/00639 und in der Europäischen Patentanmeldung EPA 123,289 beschriebenen Verfahren].
Ein Verfahren zur Produktion eines erfindungsgemäßen Proteins in hohen Mengen in Säugerzellen umfaßt die Konstruktion von Zellen, die mehrere Kopien des heterologen Gens enthalten, das die erfindungsgemäßen Proteine codiert. Das heterologe Gen kann an einen amplifizierbaren Marker gebunden sein, z.B. an das Dihydrofolat-Reductase (DHFR)-Gen. Zellen, die mehrere Genkopien enthalten, können auf dieses Gen hin selektiert werden, indem sie nach den Verfahren von Kaufman und Sharp, J. Mol. Biol. 159 (1982), 601-629, in steigenden Konzentrationen von Methotrexat (MTX) vermehrt werden. Diese Verfahrensweise kann bei zahlreichen unterschiedlichen Zelltypen eingesetzt werden.
Ein Plasmid, das eine DNA-Sequenz für ein erfindungsgemäßes Protein in operativer Verknüpfung mit anderen Plasmidsequenzen enthält, die dessen Expression ermöglichen, und das DHFR-Expressionsplasmid pAdA26SV(A)3 [Kaufman und Sharp, Mol. Cell. Biol. 2 (1982), 1304] können beispielsweise mittels Calciumphosphat-Copräzipitation und Transfektion, flektroporation oder Protoplastenfusion gemeinsam in die DHFR-freien CHO-Zellen DUKX-BII eingeführt werden. DHFR exprimierende Transformanten werden im Hinblick auf Wachstum in alpha-Medien mit dialysiertem fötalem Kälberserum und anschließend im Hinblick auf Amplifikation durch Wachstum in steigenden M-IX-Konzentrationen (aufeinanderfolgende Schritte in 0,02 uM, 0,2 uM, 1,0 uM und 5 uM MTX) selektiert, wie in Kaufman et al., Mol. Cell. Biol. 5 (1983), 1750 beschrieben. Mit steigendem MTX-Resistenz-Ausmaß sollte sich die Proteinexpression erhöhen.
Die Transformanten werden doniert und die erfindungsgemäßen Proteine werden aus dem Kulturmedium gewonnen, isoliert und aufgereinigt. Unter Verwendung von Standardverfahren kann eine Charakterisierung der exprimierten Proteine durchgeführt werden. Eine Charakterisierung kann beispielsweise eine Pulsmarkierung mit [³&sup5;S]-Methionin oder -Cystein oder eine Polyacrylamid-Gelelektrophorese umfassen. Die Expression biologisch aktiver Proteine wird mit Hilfe des nachstehend in Beispiel III beschriebenen, von Rosen modifizierten Ratten-Knochenbildungstestes von Sampath-Reddi kontrolliert. Zur Produktion anderer verwandter Proteine kann man nach ähnlichen Verfahren arbeiten.
Ein erfindungsgemäßes Protein, das die Knorpel- und/oder Knochenbildung in Fällen induziert, wo sich ein Knochen und/oder Knorpel normalerweise nicht bildet, findet Anwendung bei der Heilung von Knochenbrüchen und Knorpelschäden bei Mensch und Tier. Ein Präparat, bei dem ein erfindungsgemäßes Protein eingesetzt wird, kann bei der Einrichtung sowohl nicht offener als auch offener Brüche und auch bei der verbesserten Fixierung künstlicher Gelenke prophylaktische Verwendung finden. Eine durch ein osteogenes Mittel induzierte de novo-Knochenbildung trägt zur Wiederherstellung angeborener, Trauma-induzierter oder durch onkologische Resektion induzierter Gesichtsschädel-Schäden bei und eignet sich auch zur kosmetischen plastischen Chirurgie. Ein erfindungsgemäßes Protein kann zur Behandlung von Parodontose und bei anderen Zahnwiederherstellungs- Verfahren verwendet werden. Solche Mittel können eine Umgebung zur Anregung knochenbildender Zellen, zur Stimulation des Wachstums knochenbildender Zellen oder zur Induktion der Differenzierung von Vorläufern knochenbildender Zellen schaffen. Verschiedene osteogene Knorpel-induzierende und Knochen-induzierende Faktoren sind beschrieben worden (vgl. z.B. die Europäischen Patentanmeldungen 148,155 und 169,016, in denen sie diskutiert sind).
Die erfindungsgemäßen Proteine können auch bei der Wundheilung und Wiederherstellung verwandter Gewebe verwendet werden. Die Wundtypen umfassen Verbrennungen, Schnittverletzungen und Geschwüre, sind aber nicht darauf beschränkt (vgl. z.B. die PCT-Veröffentlichung W084/01 106 im Hinblick auf Wundheilung und Wiederherstellung verwandter Gewebe).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung umfaßt Arzneimittel, die vorzugsweise zur Heilung von Brüchen und anderen Zuständen, die mit Knochen- und/oder Knorpel-Schäden oder periodontalen Erkrankungen verbunden sind, verwendet werden. Die Erfindung umfaßt außerdem Arzneimittel zur Wundheilung und Gewebewiederherstellung. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge von mindestens einem der erfindungsgemäßen BMP-Proteine BMP-5, BMP-6 und BMP-7 im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Vehikel oder Träger oder einer pharmazeutisch verträglichen Matrix.
Es ist zu erwarten, daß die erfindungsgemäßen Proteine miteinander oder mit anderen verwandten Proteinen und Wachstumsfaktoren zusammenwirken oder möglicherweise synergistisch wirken. Erfindungsgemäße therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen umfassen ein oder mehrere der erfindungsgemäßen Proteine. Weitere erfindungsgemäße therapeutische Verfahren und Zusammensetzungen umfassen deshalb eine therapeutische Menge von mindestens einem erfindungsgemäßen Protein zusammen mit einer therapeutischen Menge von mindestens einem der anderen "BMP"-Proteine BMP-1, BMP-2, BMP-3 und BMP-4, die in den vorstehend erwähnten veröffentlichten Internationalen Anmeldungen W08 8/00205 und W089/ 10409 der selben Anmelderin offenbart sind. Solche erfindungsgemäßen Verfahren und Zusammensetzungen können erfindungsgemäße Proteine oder Teile davon in Kombination mit den vorstehend erwähnten "BMP"-Proteinen oder Teilen davon umfassen.
Solche Kombinationen können einzelne getrennte Proteinmoleküle oder Heteromoleküle umfassen, wie Heterodimere, die durch Teile der jeweiligen Proteine gebildet werden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren und eine erfindungsgemäße Zusammensetzung können beispielsweise ein erfindungsgemäßes BMP-Protein oder einen Teil davon umfassen, das/der mit einem Teil eines anderen "BMP"-Proteins verbunden ist, wobei ein Heteromolekül gebildet wird.
Weitere erfindungsgemäße Arzneimittel umfassen die erfindungsgemäßen Proteine oder Teile davon in Kombination mit anderen Mitteln, die für die Behandlung des fraglichen Knochen- und/oder Knorpeischadens, der fraglichen Wunde oder des fraglichen Gewebes vorteilhaft sind. Diese Mittel umfassen verschiedene Wachstumsfaktoren wie den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF), den von Blutplättchen stammenden Wachstumsfaktor (PDGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF-α und TGF-β), den K-Fibroblasten-Wachstumsfaktor (kFGF), das Nebenschilddrüsenhormon (PTH), den Leukämie-Hemmfaktor (LIF/HILDA, DIA) und die insulinähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF-I und IGF- II). Teile dieser Mittel können auch in erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet werden.
Die Herstellung und Formulierung solcher physiologisch verträglichen Protein-Zusammensetzungen mit dem entsprechenden pH-Wert, isotonischen Druck, Stabilität und dergleichen gehört zum allgemeinen Fachwissen. Aufgrund des offensichtlichen Fehlens einer Artspezifität der Knorpel- und Knochen-Wachstumsfaktor-Proteine sind die therapeutischen Zusammensetzungen derzeit auch für tiermedizinische Anwendungen wertvoll. Neben dem Menschen sind Haustiere und Rassepferde erwünschte Patienten für eine solche Behandlung mit den erfindungsgemäßen Proteinen.
Die Zusammensetzung kann topisch, systemisch oder lokal als Implantat oder Depot verabreicht werden. Die therapeutische Zusammensetzung zur erfindungsgemäßen Verwendung liegt bei Verabreichung natürlich in pyrogen-freier physiologisch verträglicher Form vor. Darüberhinaus kann die Zusammensetzung zur Abgabe an die Stelle eines Knorpel- und/oder Knochenoder Gewebeschadens wünschenswerterweise in Kapseln abgefüllt oder in viskoser Form injiziert werden. Zur Wundheilung und Gewebewiederherstellung kann eine topische Verabreichung geeignet sein.
Zur Knochen- und/oder Knorpelbildung umfaßt die Zusammensetzung vorzugsweise eine Matrix, die die erfindungsgemäßen BMP-Proteine an den Ort eines Knochen- und/oder Knorpelschadens abgeben, eine Struktur zur Entwicklung eines Knochens und Knorpels bereitstellen und optimal vom Körper resorbiert werden kann. Die Matrix kann die langsame Freisetzung der BMP-Proteine oder andere Faktoren umfassenden Zusammensetzung erlauben. Solche Matrizes können aus Materialien gebildet werden, die derzeit für andere medizinische Implantat-Anwendungen verwendet werden.
Die Wahl des Matrix-Materials basiert auf der biologischen Verträglichkeit, der biologischen Abbaubarkeit, den mechanischen Eigenschaften, dem kosmetischen Erscheinungsbild und den Grenzflächen-Eigenschaften. Eine geeignete Formulierung wird durch die spezifische Anwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen festgelegt. Potentielle Matrizes für die Zusammensetzungen lassen sich biologisch abbauen und sind chemisch definiert, wie Calciumsulfat, Tricalciumphosphat, Hydroxyapatit, Polymilchsäure und Polyanhydride. Andere potentielle Materialien sind biologisch abbaubar und biologisch gut definiert, wie Knochen- oder Hautkollagen. Weitere Matrizes bestehen aus reinen Proteinen oder extrazellulären Matrix-Bestandteilen. Andere potentielle Matrizes sind biologisch nicht abbaubar und chemisch definiert, wie gesintertes Hydroxyapatit, Bioglass, Aluminate oder andere keramische Werkstoffe. Matrizes können Kombinationen von beliebigen der vorstehend erwähnten Materialtypen umfassen, wie Polymilchsäure und Hydroxyapatit oder Kollagen und Tricalciumphosphat. Zur Veränderung der Porengröße, Partikelgröße, Partikelforrn und biologischen Abbaubarkeit können die Zusammensetzung und Verarbeitung der Biokeramikwerkstoffe, wie bei Calciumaluminatphosphat, verändert werden.
Das Dosierungsschema wird durch den behandelnden Arzt bestimmt, der verschiedene Faktoren berücksichtigt, die die Wirkung der erfindungsgemäßen Proteine modifizieren. Zu den Faktoren, die die Wirkung der erfindungsgemäßen Proteine modifizieren können, gehören das gewünschte Maß an Knochenbildung, die Stelle des Knochenschadens, der Zustand des geschädigten Knochens, die Größe einer Wunde, der Typ eines geschädigten Gewebes, Alter, Geschlecht und Ernährungszustand des Patienten, die Schwere einer Infektion, der Zeitpunkt einer Verabreichung und andere klinische Faktoren. Die Dosierung kann je nach dem zur Rekonstitution verwendeten Matrix-Typ und dem Typ oder den Typen der in der Zusammensetzung vorhandenen Knochen- und/oder Knorpel-Proteine geändert werden. Die Zugabe anderer bekannter Wachstumsfaktoren wie EGF, PDGF, TGF-α, TGF-β und IGF-I und IGF-II zur endgültigen Zusammensetzung kann sich auch auf die Dosis auswirken.
Eine Verbesserung des Zustandes kann durch regelmäßige Beurteilung des Wachstums und/oder der Wiederherstellung des Knorpels und/oder Knochens kontrolliert werden. Die Zustandsverbesserung kann beispielsweise unter Verwendung von Röntgenstrahlen, histomorphometrischen Bestimmungen und einer Tetracyclin-Markierung kontrolliert werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die praktische Umsetzung der vorliegenden Erfindung bei der Gewinnung und Charakterisierung erfindungsgemäßer Rinder-Knorpel- und/oder Knochen-Proteine und bei der Verwendung dieser Proteine zur Gewinnung des entsprechenden menschlichen Proteins oder der entsprechenden menschlichen Proteine und bei der Expression der Proteine mittels Rekombinationstechniken.

BEISPIEL I

Isolierung eines Knortel/Knochen-induzierenden Rinder-Proteins

Gemahlenes Rinderknochenpulver (Korngröße 20 - 120, Helitrex) wird entsprechend den Verfahren von M. R. Urist et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70 (1973), 3511, hergestellt, wobei wie nachstehend angegeben, einige Extraktionsschritte ausgelassen wurden. 10 kg gemahlenes Pulver werden in 0,6 N HCl unter schrittweisem Wechseln der Säure bei 4ºC und kräftigem Rühren über eine Zeitspanne von 48 Stunden entmineralisiert. Die erhaltene Suspension wird mit 50 Liter 2 M CaCl&sub2; und 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure [EDTA] 16 Stunden bei 4ºC extrahiert und anschließend 4 Stunden in 50 Liter 0,5 M EDTA extrahiert. Der Rückstand wird dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen, bevor er in 20 l 4 M Guanidinhydrochlond [GuCl], 20 mM Tris (pH 7,4), 1 mM N-Ethylmaleimid, 1 mM Jodacetamid, 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorin resuspendiert wird, wie in Clin. Orthop. Rel. Res. 171 (1982), 213, beschrieben. Nach 16 bis 20 Stunden wird der Überstand entfernt und durch weitere 10 l GuCl-Puffer ersetzt. Der Rückstand wird 24 Stunden weiter extrahiert.
Die GuCl-Rohextrakte werden vereinigt, auf einem Pellicon-Apparat mit einem Molekulargewichts-Rückhaltevermögen von 10 000 etwa 20mal konzentriert und dann in 50 mM Tris, 0,1 M NaCl, 6 M Harnstoff (pH 7,2), dem Ausgangspuffer für die erste Säule, dialysiert. Nach ausgiebiger Dialyse wird das Protein auf eine 4 1-DEAE-Cellulose-Säule gegeben und die nichtgebundenen Fraktionen werden gesammelt.
Die nicht-gebundenen Fraktionen werden konzentriert und gegen 50 mM NaAc, 50 mM NaCl (pH 4,6) in 6 M Harnstoff dialysiert. Die nicht-gebundenen Fraktionen werden auf eine Carboxymethylcellulose-Säule gegeben. Nicht an die Säule gebundenes Protein wird durch ausgiebiges Waschen mit dem Ausgangspuffer entfernt und das Material, das das Protein enthält, das Knochen- und/oder Knorpelbildungs-Aktivität aufweist, wie mit Hilfe des nach Rosen modifizierten Sampath-Reddi-Tests (nachstehend in Beispiel III beschrieben) bestimmt, wird mit 50 mM NaAc, 0,25 mM NaCl, 6 M Harnstoff (pH 4,6) von der Säule desorbiert. Das Protein aus diesem Elutionsschritt wird 20fach - 40fach konzentriert und danach 5mal mit 80 mM KPO&sub4;, 6 M Harnstoff (pH 6,0) verdünnt. Der pH-Wert der lösung wird mit 500 mM K&sub2;HPO&sub4; auf 6,0 eingestellt. Die Probe wird auf eine Hydroxyapatit-Säule (IKB) aufgetragen, die in 80 mM KPO&sub4;, 6 M Harnstoff (pH 6,0) äquilibriert wurde, und das gesamte nichtgebundene Protein wird durch Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer entfernt. Protein, das Knochen- und/oder Knorpelbildungs-Aktivität aufweist, wird mit 100 mM KPO&sub4; (pH 7,4) und 6 M Harnstoff eluiert.
Das Protein wird etwa 10mal konzentriert und festes NaCl wird bis zu einer Endkonzentration von 0,15 M zugegeben. Dieses Material wird auf eine Heparin- Sepharose-Säule gegeben, die mit 50 mM KPO&sub4;, 150 mM NaCl, 6 M Harnstoff (pH 7,4) äquilibriert worden war. Nach ausgiebigem Waschen der Säule mit dem Ausgangspuffer wird ein Protein mit Knochen- und/oder Knorpelinduzierender Aktivität mittels 50 mM KPO&sub4;, 700 mM NaCl, 6 M Harnstoff (pH 7,4) eluiert. Diese Fraktion wird auf das kleinstmögliche Volumen konzentriert und 0,4 ml-Aliquots werden auf eine Superose-6- und Superose-12-Säule aufgetragen, die in Reihe verbunden sind und mit 4 M GuCl, 20 mM Tris (pH 7,2) äquilibriert wurden, und die Säulen werden bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 0,25 ml/min entwickelt. Das Protein, das Knochenund/oder Knorpel-induzierende Aktivität zeigt, entspricht einem Protein von etwa 30 000 Dalton.
Die vorstehenden Fraktionen aus den Superose-Säulen werden vereinigt, gegen 50 mM NaAc, 6 M Harnstoff (pH 4,6) dialysiert und auf eine Pharmacia- Monos-HR-Säule aufgetragen. Die Säule wird mit einem Gradienten bis 1,0 M NaCl, 50 mM NaAc, 6 M Harnstoff (pH 4,6) entwickelt. Aktive Knochen- und/oder Knorpelbildungs-Fraktionen werden vereinigt. Das Material wird in 0,1% TFA auf eine 0,46 x 25 cm-Vydac-C4-Säule aufgetragen und die Säule wird mit einem Gradienten bis 90% Acetonitril, 0,1% TFA (31,5% Acetonitril, 0,1% TFA bis 49,5% Acetonitril, 0,1% TFA in 60 Minuten bei einer Laufgeschwindigkeit von 1 ml pro Minute) entwickelt. Aktives Material wird bei etwa 40% - 44% Acetonitril eluiert. Die Fraktionen werden auf Knorpel- und/oder Knochenbildungs- Aktivität hin getestet. Das aktive Material wird auf einer MonoQ-Säule weiter fraktioniert. Das Protein wird gegen 6 M Harnstoff, 25 mM Diethanolamin, pH- Wert 8,6 dialysiert und dann auf eine 0,5 x 5 cm MonoQ-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die mit einem Gradienten von 6 M Harnstoff, 25 mM Diethanolamin, pH-Wert 8,6, bis 0,5 M NaCl, 6 M Harnstoff, 25 mM Diethanolamin, pH-Wert 8,6, entwickelt wird. Die Fraktionen werden mit 10% Trifluoressigsäure (TFA) auf einen pH-Wert von 3,0 gebracht. Aliquots geeigneter Fraktionen werden mit Hilfe eines der folgenden Verfahren jodiert: P. J. Mcconahey et al., Int. Arch. Allergy 29 (1966), 185-189; A. E. Bolton et al., Biochem. J. 133 (1973), 529, und D. F. Bowen-Pope, J. Biol. Chem. 237 (1982), 5161. Die in diesen Fraktionen vorhandenen jodierten Proteine werden mittels SDS- Gelelektrophorese analysiert.

BEISPIEL II

Charakterisierung eines Knochen/Knorpel-induzierenden Rinder-Faktors

A. Molekulargewicht

Eine Lösung von etwa 5 ug Protein von Beispiel I in 6 M Harnstoff, 25 mM Diethanolamin, pH-Wert 8,6, etwa 0,3 M NaCl, wird auf 0,1% SDS eingestellt und 16 h gegen 50 mM Tris/HCl, 0,1% SDS, pH-Wert 7,5, dialysiert. Zusammen mit einer kleinen Menge eines ¹²&sup5;J-markierten Gegenstücks wird das dialysierte Material danach durch Elektrophorese gegen eine Dialysemembran konzentriert [Hunkapillar et al., Meth. Enzymol. 91 (1983), 227-236]. Dieses Material (etwa 100 ul Volumen) wird auf ein 12%-iges Polyacrylamidgel aufgetragen und einer SDS-PAGE unterworfen [Laemmli, U. K., Nature 227 (1970), 680-685], ohne daß die Probe mit Dithiothreit reduziert wird. Das Molekulargewicht wird im Vergleich zu vorher angefärbten Molekulargewichts-Standards (Bethesda Research Labs) bestimmt. Nach einer Autoradiographie des nicht-fixierten Gels wird die Bande von etwa 28 000- 30 000 Dalton herausgeschnitten und das Protein wird elektrophoretisch aus dem Gel eluiert (Hunkapillar et al., vorstehend). Auf der Basis ähnlicher aufgereinigter Knochenfraktionen, die in den vorstehend beschriebenen gleichfalls anhängigen "BMP"-Anmeldungen beschrieben sind und bei denen die Knochen- und/oder Knorpel-Aktivität in dem 28 000 - 30 000-Bereich zu finden ist, wird die Schlußfolgerung gezogen, daß diese Bande Knochenund/oder Knorpel-induzierende Fraktionen umfaßt.

B. Charakterisierung von Untereinheiten

Die Untereinheiten-Zusammensetzung des isolierten Rinder-Knochenproteins wird auch bestimmt. Das vorstehend beschriebene eluierte Protein wird in 2% SDS unter Verwendung von Jodacetat und Standardverfahren vollständig reduziert und alkyliert und mittels elektrophoretischer Verdichtung wieder konzentriert. Die vollständig reduzierte und alkylierte Probe wird ferner einer SDS-PAGE auf einem 12%-igen Gel unterworfen und der erhaltene Bereich von etwa 14 000 - 20 000 Dalton, der das Aussehen einer Doppelbande aufweist, wird mittels Autoradiographie des nicht-fixierten Gels lokalisiert. Im 28 000 - 30 000-Bereich verbleibt eine schwache Bande. Das 28 000 - 30 000 Dalton-Protein ergibt somit einen breiten Bereich von 14 000 - 20 000, der sich im übrigen auch so interpretieren und beschreiben läßt, daß er zwei breite Banden von etwa 14 000 - 16 000 Dalton und 16 000 - 20 000 Dalton umfaßt.

Beispiel III

Nach Rosen modifizierter Sampath-Reddi-Test

Zur Beurteilung der Knochen- und/oder Knorpel-Aktivität der erfindungsgemäßen Proteine wird eine modifizierte Version des in Sampath und Reddi, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80 (1983), 6591-6595, beschriebenen Ratten-Knochenbildungstests verwendet. Dieser modifizierte Test wird in der vorliegenden Erfindung als nach Rosen modifizierter Sampath-Reddi-Test bezeichnet. Der Ethanolpräzipitations-Schritt des Sampath-Reddi-Verfahrens wird durch eine Dialyse (wenn die Zusammensetzung eine Lösung ist) oder Diaflitration (wenn die Zusammensetzung eine Suspension ist) der zu testenden Fraktion gegen Wasser ersetzt. Die Lösung oder Suspension wird dann erneut in 0,1% TFA gelöst und die erhaltene Lösung wird 20 mg Ratten-Matrix zugegeben. Eine nicht mit dem Protein behandelte Pseudo-Rattenmatrixprobe dient als Kontrolle. Dieses Material wird eingefroren und lyophilisiert und das erhaltene Pulver wird in #5-Gelatine-Kapseln eingekapselt. Die Kapseln werden in den Abdomen-Thorax-Bereich von 21 - 49 Tage alten männlichen Long-Evans- Ratten subcutan implantiert. Die Implantate werden nach 7-14 Tagen entfernt. Die Hälfte jedes Implantats wird zur Analyse der alkalischen Phosphatase verwendet [vgl. A. H. Reddi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 69 (1972), 1601].
Die andere Hälfte jedes Implantats wird fixiert und zur histologischen Analyse bearbeitet. Zur Auswertung der durch Induktion gebildeten Knochenund Knorpelmenge, die in jedem Implantat vorhanden ist, werden Glykolmethacrylat-Schnitte (1 um) mit Von Kossa- Fuchsin und saurem Fuchsin oder Toluidinblau gefärbt. Die Ausdrücke "+1" bis "+5" bedeuten den Bereich jedes histologischen Schnittes eines Implantats, der von neuen Knochenund/oder Knorpelzellen und neu gebildetem Knochen und der Matrix eingenommen wird. In der vorliegenden Erfindung sind zwei Auswertungsverfahren beschrieben. Bei dem ersten Auswertungsverfahren zeigt ein Ergebnis von +5, daß mehr als 50% des Implantats aus neuem Knochen und/oder Knorpel besteht, der als direkte Folge des Proteins im Implantat erzeugt wurde. Ein Ergebnis von +4, +3, +2 und +1 würde zeigen, daß mehr als 40%, 30 %, 20% bzw. 10% des Implantats neuen Knorpel und/oder Knochen enthält. Das zweite Auswertungsverfahren (nachstehend als modifiziertes Auswertungsverfahren bezeichnet) ist wie folgt: drei nicht-benachbarte Schnitte aus jedem Implantat werden ausgewertet und daraus wird der Durchschnittswert ermittelt. "+/-" zeigt eine vorläufige Bestimmung eines Knorpels oder Knochens an, "+1" zeigt an, daß> 10% jedes Schnittes aus neuem Knorpel oder Knochen besteht; "+2"> 25%; "+3"> 50%;" +4" 75%; "+5"> 80%. Die Ergebnisse für die einzelnen Implantate sind tabellarisch dargestellt, um die Test-Variabilität zu zeigen.
Es ist zu erwarten, daß die Dosis-Wirkungs-Kurve der das Knorpel- und/oder Knochen-induzierende Protein enthaltenden Matrix-Proben zeigt, daß sich die gebildete Knochen- und/oder Knorpel-Menge mit der Menge des Knorpel/Knochen-induzierenden Proteins in der Probe erhöht. Es ist zu erwarten, daß die Kontrollproben nicht zur Knochen- und/oder Knorpelbildung führen.
Wie bei anderen Knorpel- und/oder Knochen-induzierenden Proteinen, wie den vorstehend erwähnten "BMP"-Proteinen, ist zu erwarten, daß sich der gebildete Knochen und/oder Knorpel physikalisch auf den von der Matrix eingenommenen Raum beschränkt. Die Proben werden auch mittels SDS- Gelelektrophorese und isoelektrischer Fokussierung und anschließend mittels Autoradiographie analysiert. Die Aktivität wird mit den Proteinbanden und dem pI-Wert korreliert. Zur Bestimmung der Reinheit des Proteins in einer bestimmten Fraktion wird ein Extinktionskoeffizient von 1 OD/mg-cm als Protein-Schätzwert verwendet. Man läßt das Protein auf einer SDS-PAGE laufen und anschließend wird eine Silberfärbung oder eine Radiojodierung und Autoradiographie durchgeführt.

BEISPIEL IV

A. Zusammensetzung von Rinder-Proteinen

Die Gelscheibe des in Beispiel IIB beschriebenen Bereichs von etwa 14 000 - 20 000 Dalton wird mit Methanol-Essigsäure-Wasser unter Verwendung von Standardverfahren fixiert, kurz mit Wasser gespült und dann mit 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat neutralisiert. Nachdem die Gelscheibe mit einer Rasierklinge in Würfel geschnitten wurde, wird das Protein aus der Gelmatrix durch Zugabe von 0,2 ug TPCK-behandeltem Trypsin (Worthington) und 16- stündige Inkubation des Gels bei 37ºC gespalten. Die erhaltene Spaltung wird danach unter Verwendung einer C4-Vydac-RPHPLC-Säule und eines Gradienten von 0,1% TFA-Wasser bis 0,1% TFA-Wasser-Acetonitril einer RPHPLC (Umkehrphasen-HPLC) unterworfen. Die erhaltenen Peptid-Peaks werden mittels UV-Extinktion bei 214 nm und 280 nm kontrolliert und unter Verwendung einer Gasphasen--Sequenziervorrichtung von Applied Biosystems (Modell 470A) einer direkten Amino-terminalen Aminosäure-Sequenzanalyse unterworfen. Mit Hilfe von Standardverfahren wird ein tryptisches Fragment isoliert, das die folgende Aminosäuresequenz aufweist, welche durch die Dreibuchstaben-Standardsymbole für Aminosäuren dargestellt ist und in der "Xaa" eine unbekannte Aminosäure anzeigt und die Aminosäure in Klammern bedeutet, daß die Sequenz unsicher ist:
Xaa-His-Glu-Leu-Tyr-Val-Ser-Phe-(Ser)
Auf der Basis der Aminosäuresequenz des vorstehend bestimmten tryptischen Fragments werden die folgenden vier Oligonucleotid-Sonden entworfen und auf einer automatischen DNA-Synthesevorrichtung synthetisiert.
Sonde #1: GTRCTYGANATRCANTC
Sonde #2: GTRCTYGANATRCANAG
Sonde #3: GTRCTYAAYATRCANTC
Sonde #4: GTRCTYAAYATRCANAG
Die Nucleotid-Standardsymbole in den vorstehend bestimmten Sonden sind wie folgt: A - Adenosin, C - Cytosin, G - Guanin, T - Thymin, N - Adenosin oder Cytosin oder Guanin oder Thymin, R - Adenosin oder Guanin, und Y - Cytosin oder Thymin.
Jede der Sonden besteht aus einem Oligonucleotid-Pool. Da der genetische Code degeneriert ist (die gleiche Aminosäure kann von mehr als einem Codon codiert werden), wird ein Oligonucleotid-Gemisch synthetisiert, das alle möglichen Nucleotidsequenzen enthält, die die Aminosäuresequenz des tryptischen Fragments codieren. Diese Sonden werden radioaktiv markiert und, wie nachstehend beschrieben, zum Screenen einer Rinder-cDNA-Genbank eingesetzt.

B. Rinder-BMP-5

Aus Gesamt-RNA, die aus fötalen Rinder-Knochenzellen mit Hilfe des Verfahrens von Gehron-Robey et al. in Current Advances in Skeletogenesis (1985), Elsevier Science Publishers, isoliert wurde, wird Poly(A)-enthaltende RNA mittels Oligo(dT)-Cellulose-Chromatographie isoliert. Die Gesamt-RNA wurde von Dr. Marion Young, National Instittite of Dental Research, National Institutes of Health, erhalten. In Lambda gt10 (Toole et al, vorstehend) wurde eine cDNA-Genbank hergestellt und auf 50 Platten in einer Dichte von 8000 Rekombinanten pro Platte auspiattiert. Unter Verwendung des Tetramethylammoniumchlorid (TMAC)-Hybridisierungsverfahrens [vgl. Wozney et al., Science 242 (1988), 1528-1534] wurden diese Rekombinanten (400 000) auf Nitrocellulosefilter in Doppelbestimmung einem Screening mit einer Kombination der Sonden 1, 2, 3 und 4 unterworfen. Es wurden 28 Positive erhalten und für nachfolgende Experimente erneut ausplattiert. Es wurden erneut Nitrocellulose-Replicas in Doppelbestimmung hergestellt. Ein Filtersatz wurde mit den Sonden #1 und #2 abgesucht, der andere mit den Sonden #3 und #4. Bei ersterem wurden sechs Positive erhalten, bei letzterem 21 Positive. Von den sechs positiven Proben wird eine als HEL5 bezeichnete Probe plaquegereinigt, es wird eine Phagen-Plattenstammkultur hergestellt und Bakteriophagen-DNA wird isoliert. Diese DNA wird mit EcoRI gespalten und in Ml 3 und pSP65 (Promega Biotec, Madison, Wisconsin) subcloniert [Melton et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 7035-7056]. Die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz dieses Fragments sind in Tabelle I gezeigt.
Die DNA-Sequenzanalyse dieses Fragments in M13 zeigt, daß es die vorstehend dargelegte gewünschte tryptische Peptidsequenz codiert und sich vor der abgeleiteten Aminosäuresequenz ein basischer Rest (Lys) befindet, wie aufgrund der Trypsin-Spezifität vorhergesagt wurde. Der unterstrichene Sequenzteil in Tabelle I von Aminosäuren #42 bis #8 entspricht dem vorstehend bestimmten tryptischen Fragment, von dem die entworfenen Oligonucleotid-Sonden abgeleitet wurden. Man beachte, daß die abgeleitete Aminosäuresequenz Ser-Gly-Ser-His-Gln-Asp-Ser-Ser-Arg der in Tabelle I dargelegten Aminosäuren #15 bis #23 der Sequenz Ser-Thr-Pro-Ala-Gln-Asp- Val-Ser-Arg eines tryptischen Fragmentes ähnlich ist, das in dem gereinigten 28 000 - 30 000 Dalton-Knochenpräparat gefunden wurde, das in den vorstehend erwähnten "BMP"-Veröffentlichungen W088/00205 und W089/ 10409 beschrieben ist. Das in Tabelle 1 dargelegte Fragment ist ein Teil der DNA- Sequenz, die ein Rinder-BMP-5-Protein codiert. Die in Tabelle 1 gezeigte DNA- Sequenz zeigt ein offenes Leseraster vom 5'-Ende des 420 Basenpaare großen Clons, der ein partielles Peptid von 140 Aminosäurereste codiert (die ersten 7 Nucleotide stammen von den bei den Clonierungsverfahren verwendeten Adaptoren). Ein Stop-Codon im Leseraster (TAA) zeigt, daß dieser Clon den Carboxyl-terminalen Teil von Rinder-BMP-5 codiert. TABELLE 1

C. Rinder -BMP-6

Die übrigen positiven Clone (der zweite Satz, der 21 Positive enthält), die mit den vorstehend beschriebenen Sonden #1, #2, #3 und #4 isoliert wurden, werden mit HEL5 abgesucht und ein weiterer Clon wird identifiziert, der unter weniger stringenten Hybridisierungsbedingungen [Standard- Hybridisierungspuffer (SHB), enthaltend 5 x SSC, 0,1% SDS, 5 x Denhardt- Lösung, 100 ug/ml Lachs-Sperma-DNA, bei 65ºC, Waschen in 2 x SSC, 0,1% SDS bei 65ºC] hybridisiert. Dieser Clon wird plaque-gereinigt, es wird eine Phagen- Plattenstammkultur hergestellt und Bakteriophagen-DNA wird isoliert. Die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines Teils dieses Clons sind in Tabelle II gezeigt. Diese Sequenz stellt einen Teil der DNA-Sequenz dar, die ein erfindungsgemäßes BMP-6-Knorpel/Knochen-Protein codiert.
Der erste unterstrichene Teil der Sequenz in Tabelle II von Aminosäure #97 bis Aminosäure #105 entspricht dem tryptischen Fragment, das in dem aufgereinigten 28 000 - 30 000 Dalton-Rinder-Knochenpräparat (und dessen reduzierter Form von etwa 18 000 - 20 000 Dalton) gefunden wurde, das in den vorstehend erwähnten "BMP"-Veröffentlichungen W08 8/00205 und W089/ 10409 beschrieben ist. Die zweite unterstrichene Sequenz in Tabelle II von Aminosäure #124 bis Aminosäure #130 entspricht dem vorstehend identifizierten tryptischen Fragment, auf dem der Entwurf der Oligonucleotid- Sonden basiert.
Die DNA-Sequenz von Tabelle II zeigt ein offenes Leseraster von 666 Basenpaaren, das vom 5'-Ende der Sequenz von Tabelle II beginnt und ein partielles Peptid von 222 Aminosäureresten codiert. Ein Stop-Codon im Leseraster (TGA) zeigt, daß dieser Clon den Carboxyl-terrninalen Teil eines Rinder-BMP-6-Protein codiert. Aufgrund der Kenntnis anderer BMP-Proteine und anderer Proteine der TGF-β-Familie läßt sich vorhersagen, daß das Vorläufer-Polypeptid an den drei basischen Resten (Arg-Arg-Arg) gespalten wird, wobei ein reifes Peptid erhalten wird, das mit dem Rest 90 oder 91 der Sequenz von Tabelle II beginnt. TABELLE II TABELLE II (Seite 2 von 2)

BEISPIEL V

A. Zusammensetzung menschlicher Proteine

Menschliche Zellinien, die BMP-5- und/oder BMP-6-mRNAs synthetisieren, werden in folgender Weise identifiziert. Aus verschiedenen menschlichen Zellinien wird RNA isoliert, mittels Chromatographie an Oligo(dT)-Cellulose auf Poly(A)-enthaltende RNA selektiert, auf einem Formaldehyd-Agarose-Gel einer Elektrophorese unterworfen und auf Nitrocellulose übertragen. Ein Nitrocellulose-Duplikat des Gels wird mit einer einzelsträngigen ³²Pmarkierten M13-Sonde hybridisiert, die dem vorstehend erwähnten EcoRIBglII-Fragment von BMP-5 entspricht, das die Nucleotide 1 - 465 der Sequenz von Tabelle I enthält. In der Laufspur, die der RNA der menschlichen Osteosarkom-Zellinie U-20S entspricht, wird eine stark hybridisierende Bande nachgewiesen. Ein anderes Nitrocellulose-Duplikat des Gels wird mit einer einzelsträngigen ³²P-markierten M13-Sonde hybridisiert, die das PstI-SmaI- Fragment von Rinder-BMP-6 (entspricht den Nucleotiden 106 - 261 von Tabelle II) enthält. Es stellt sich heraus, daß mehrere RNA-Spezies in der U-205-RNA entsprechenden Laufspur mit dieser Sonde hybridisieren.
Unter Verwendung etablierter Techniken (Toole et al.) wird aus Poly(A)- enthaltender U-205-RNA in dem Vektor Lambda ZAP (Stratagene) eine cDNA- Genbank hergestellt. 750 000 Rekombinante dieser Genbank werden ausplattiert und es werden zwei Nitrocellulose-Duplikate hergestellt. Das Smai-Fragment von Rinder-BMP-6, das den Nucleotiden 259 - 751 von Tabelle II entspricht, wird mit Hilfe des "nick translation"-Verfahrens markiert und mit beiden Filtersätzen in SHB bei 65ºC hybridisiert. Ein Filtersatz wird unter stringenten Bedingungen (0,2 x SSC, 0,1% SDS bei 65ºC) gewaschen, der andere unter weniger stringenten Bedingungen (1 x SSC, 0,1% SDS bei 65ºC). Es wird festgestellt, daß viele Rekombinante auf beiden Duplikaten hybridisieren (etwa 162). 24 werden abgenommen und für weitere Untersuchungen erneut ausplattiert. Von jeder Platte werden drei Nitrocellulose-Duplikate hergestellt. Ein Duplikat wird mit der BMP-6-Smai-Sonde hybridisiert, ein Duplikat mit einem nick-translatierten PstI-SacI-Fragment von BMP-6 (Nucleotide 106 - 378 von Tabelle II) und das dritte Duplikat mit nick-translatierten Xbai-Fragmenten von BMP-5 (Nucleotide 1 - 76 von Tabelle 1). Die Hybridisierung und das Waschen werden unter stringenten Bedingungen durchgeführt.

B. Menschliche BMP-5-Proteine

17 Clone, die mit der dritten Sonde stärker hybridisieren als mit der zweiten Sonde, werden plaque-gereinigt. Eine DNA-Sequenzanalyse von U2-16, einem dieser Clone, zeigt, daß er menschliches BMP-5 codiert. U2-16 wurde bei American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, am 22. Juni 1989 unter der Eingangsnummer ATCC 68109 hinterlegt. Sowohl diese Hinterlegung als auch andere in der vorliegenden Erfindung beschriebene Hinterlegungen erfolgten gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages über Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den dazugehörenden Verordnungen (Budapester Vertrag). U2-16 enthält eine Insertion von etwa 2,1 Kb. Die DNA- Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von U2-16 sind nachstehend in Tabelle III gezeigt. Es ist zu erwarten, daß dieser Clon die gesamte Nucleotidsequenz enthält, die zur Codierung von menschlichen BMP-5- Proteinen erforderlich ist. Die cDNA-Sequenz von Tabelle III enthält ein offenes Leseraster von 1362 bp, das ein Protein von 454 Aminosäuren codiert und vor dem sich ein untransiatierter 5'-Bereich von 700 bp mit Stop-Codons in allen Leserastern befindet, und einen untransiatierten 3'-Bereich von 90 bp, der sich an ein Stop-Codon im Leseraster (TAA) anschließt.
Dieses Protein von 454 Aminosäuren weist ein Molekulargewicht von etwa 52 000 Dalton auf, wie es sich aus seiner Aminosäuresequenz vorhersagen läßt, wobei es sich vermutlich um das primäre Translationsprodukt handelt. Aufgrund der Kenntnis anderer BMP-Proteine und anderer Proteine innerhalb der TGF-β-Familie läßt sich vorhersagen, daß das Vorläufer-Polypeptid an dem basischen Tripeptid Lys-Arg-Lys gespalten wird, wobei ein reifes Peptid von 132 Aminosäuren erhalten wird, das mit der Aminosäure #323 "Asn" beginnt. Es ist zu erwarten, daß die Prozessierung von BMP-5 zu der reifen Form eine Dimerisierung und die Entfernung des N-terminalen Bereiches in einer Weise umfaßt, die zu der Prozessierung des verwandten Proteins TGF-β [L E. Gentry et al., Molec. & Cell. Biol. 8 (1988), 4162; R. Dernyck et al., Nature 316 (1985), 701] analog ist.
Deshalb nimmt man an, daß die reife aktive BMP-5-Art ein Homodimer von 2 Polypeptid-Untereinheiten umfaßt, wobei jede Untereinheit die Aminosäuren #323 - #454 mit einem prognostizierten Molekulargewicht von etwa 15 000 Dalton umfaßt. Weitere aktive BMP-5-Arten sind zu erwarten, beispielsweise Proprotein-Dimere oder an reife Untereinheiten gebundene Proprotein- Untereinheiten. Weitere aktive Arten können die Aminosäuren #329 - #454 umfassen, wobei solche Arten Homologe zu den tryptischen Sequenzen umfassen, die in dem aufgereinigtem Rinder-Material gefunden wurden. Es sind auch BMP-5-Proteine zu erwarten, die die Aminosäuren #353 - #454 umfassen, wodurch der erste konservierte Cystein-Rest einbezogen ist.
Die unterstrichene Sequenz Ser-Ser-Ser-His-Gln-Asp-Ser-Ser-Arg von Aminosäure #329 bis #337 in Tabelle III ist zu der Rinder-Sequenz in Tabelle I von Aminosäure #15 bis #23 homolog, wie vorstehend in Beispiel IV diskutiert. Jede dieser Sequenzen ist zu der Sequenz Ser-Thr-Pro-Ala-Gln-Asp-Val-Ser-Arg eines tryptischen Fragments homolog, das in dem aufgereinigten 28 000 - 30 000 Dalton-Knochenpräparat (und in dessen reduzierter Form von etwa 18 000 - 20 000 Dalton) gefunden wird, wie in den vorstehend erwähnten veröffentlichten "BMP"-Anmeldungen W088/00205 und W089/10409 beschrieben.
Die unterstrichene Sequenz His-Glu-Leu-Tyr-Val-Ser-Phe von Aminosäure #356 bis #362 in Tabelle III entspricht dem tryptischen Fragment, das in dem vorstehend beschriebenen Rinder-Knochenpräparat bestimmt wurde und auf dem der Entwurf der Oligonucleotid-Sonden basiert. TABELLE III TABELLE III (Seite 2 von 4) TABELLE III (Seite 3 von 4) TABELLE III (Seite 3 von 4)
Man beachte, daß die vorstehend beschriebene tryptische Sequenz His-Glu- Leu-Tyr-Val-Ser-Phe-(Ser) der Sequenz His-Pro-Leu-Tyr-Val-Asp-Phe-Ser ähnlich ist, die in der Sequenz des Knorpel/Knochen-Proteins BMP-2A von Rind und Mensch gefunden wurde, die z.B. in der Veröffentlichung W088/00205 beschrieben ist. Menschliches BMP-5 ist sowohl zu anderen BMP-Molekülen als auch zu anderen Mitgliedern der TGF-β-Molekülsuperfamilie homolog. Die 102 Cystein-reichen Garboxyl-terminalen Aminosäurereste von menschlichem BMP-5 zeigen zu den BMP-Proteinen, die in der vorliegenden Erfindung und in den vorstehend beschriebenen Veröffentlichungen W0 88/00205 und W0 89/10409 offenbart sind, die folgenden Homologien: zu 61% identisch mit BMP-2; zu 43% identisch mit BMP-3; zu 59% identisch mit BMP-4; zu 91 % identisch mit BMP-6; und zu 88% identisch mit BMP-7. Menschliches BMP-5 zeigt darüberhinaus die folgenden Homologien: zu 38% identisch mit TGF-β3; zu 37% identisch mit TGF-β2; zu 36% identisch mit TGF-β1; zu 25% identisch mit Müller-Hemmstoff (MIS), einem Testikel-Glykoprotein, das die Rückbildung des Müller-Ganges während der Entwicklung des männlichen Embryos verursacht; zu 25% identisch mit Inhibin Q; zu 38% identisch mit Inhibin βB; zu 45% identisch mit Inhibin βA; zu 56% identisch mit Vgl, einem Xenopus-Faktor, der möglicherweise an der Mesoderm-Induktion in der frühen Embryogenese beteiligt ist [Weeks und Melton, Cell 51 (1987), 861-867]; und zu 57% identisch mit Dpp, dem Produkt des "Decapentaplegic"-Locus von Drosophila, der zur dorsoventralen Entwicklung bei der frühen Embryogenese erforderlich ist und bei verschiedenen anderen Entwicklungsprozessen in späteren Stadien der Entwicklung beteiligt ist [Padgett et al., Nature 325 (1987), 81-84].

C. Menschliche BMP-6-Proteine

Sechs Clone, die mit der in Beispiel V.A. beschriebenen zweiten Sonde stärker hybridisieren als mit der dritten Sonde, werden abgenommen und in Plasmide transformiert. Restriktionsenzymkartierung, Southern-Blot-Analyse und DNA-Sequenzanalyse dieser Plasmide zeigen, daß es zwei Klassen von Clonen gibt. Aufgrund ihrer stärkeren Hybridisierung mit der zweiten Sonde und der stärkeren DNA-Homologie zu der Rinder-BMP-6-Sequenz von Tabelle II im Vergleich zu den anderen 4 Glonen enthalten die Clone U2-7 und U2-10 eine menschliches BMP-6 codierende Sequenz. Von diesen Clonen stammende DNA- Sequenzdaten zeigen, daß sie ein partielles Polypeptid von 132 Aminosäuren codieren, das den Carboxyl-Terminus des menschlichen BMP-6-Proteins umfaßt. U2-7 wurde bei American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, am 23. Juni 1989 unter der Eingangsnummer 68021 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt.
Aus U-2OS-MRNA wurde eine Primer-verlängerte cDNA-Genbank unter Verwendung des Oligonucleotids GGAATCCAAGGCAGAATGTG hergestellt, wobei die Sequenz auf der vom Clon U2-10 stammenden untranslatierten 3'-Sequenz von menschlichem BMP-6 basiert. Diese Genbank wird mit einem Oligonucleotid der Sequenz CAGAGTCGTAATCGC abgesucht, die von der BMP-6 codierenden Sequenz von U2-7 und U2-10 stammt. In Standard-Hybridisierungspuffer (SHB) erfolgt eine Hybridisierung bei 42ºC, wobei die Waschbedingungen 42ºC, 5 x SSC, 0,1% SDS sind. Es werden positiv hybridisierende Clone isoliert. Die DNA- Insertion eines dieser Clone, PEH6-2, zeigt, daß er in 5'-Richtung weiter reicht als U2-7 oder U2-10. Eine Primer-verlängerte cDNA-Genbank, die wie vorstehend beschrieben aus U-205-MRNA konstruiert wurde, wird mit einem Oligonucleotid der Sequenz GCCTCTCCCCCTCCGACGCCCCGTCCTCGT abgesucht, die von der Sequenz nahe des 5'-Endes von PEH6-2 stammt. Die Hybridisierung wird bei 65ºC in SHB durchgeführt, wobei das Waschen bei 65ºC in 2 x SSC, 0,1% SDS erfolgt. Positiv hybridisierende Rekombinante werden isoliert und mittels Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzanalyse untersucht.
Die 5'-Sequenz der Insertion von PE5834#7, einem der positiv hybridisierenden Rekombinanten, wird zum Entwurf eines Oligonucleotids der Sequenz CTGCTGCTCCTCCTGCTGCCGGAGCGC verwendet. Eine mit Hilfe des Zufallsprimer-Verfahrens hergestellte cDNA-Genbank [synthetisiert wie eine mit einem Oligo(dT)-Primer hergestellte Genbank, wobei allerdings (dN)&sub6; als Primer verwendet wurde] wird mit diesem Oligonucleotid durch Hybridisierung bei 65ºC in SHB und Waschen bei 65ºC in 1 x SSC, 0,1% SDS abgesucht. Ein positiv hybridisierender Clon, RP10, wird identifiziert, isoliert und die DNA-Sequenz vom 5'-Ende seiner Insertion wird bestimmt. Diese Sequenz wird zum Entwurf eines Oligonucleotids der Sequenz TCGGGCTTCCTGTACCGGCGGCTCAA- GACGCAGGAGAAGCGGGAGATGCA verwendet. Eine menschliche Plazenta-cDNA- Genbank (Stratagene-Katalog #936203) wird mit diesem Oligonucleotid durch Hybridiserung in SHB bei 65ºC und Waschen bei 65ºC mit 0,2 x SSC, 0,1%SDS abgesucht. Eine als BMP6C35 bezeichnete positiv hybridisierende Rekombinante wird isoliert. Eine DNA-Sequenzanalyse der Insertion dieser Rekombinante zeigt, daß sie das vollständige menschliche BMP-6-Protein codiert. BMP6C35 wurde bei American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, USA, am 1. März 1990 unter der Eingangsnummer 68245 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt.
Die DNA-Sequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz des größten Teils der BMP6C35-Insertion sind in Tabelle IV wiedergegeben. Diese DNA-Sequenz enthält ein offenes Leseraster von 1539 Basenpaaren, das das Vorläuferprotein von menschlichem BMP-6 von 513 Aminosäuren codiert. Vor dem vermutlichen Methionin-Initiationscodon befindet sich eine untranslatierte 5'-Sequenz von 159 Basenpaaren mit Stop-Codons in allen drei Leserastem. Dem Stop-Codon bei den Nucleotiden 1699 - 1701 schließen sich mindestens 1222 Basenpaare einer untranslatierten 3'-Sequenz an. Es ist zu beachten, daß U2-7 einen C-Rest an der Position aufweist, die dem T-Rest an Position 1221 von BMP6C35 entspricht. U2-7 weist auch einen C-Rest an der Position auf, die dem G-Rest an Position 1253 von BMP6C35 entspricht. Dadurch werden keine Aminosäure-Unterschiede in den codierten Proteinen verursacht und es handelt sich vermutlich um Allel- Variationen.
Das Oligonucleotid TCGGGCTFCCTGTACCGGCGGCTCAAGACGCAGGAGAAGCGGGAGATGCA wird zum Screenen einer menschlichen genomischen Genbank (Toole et al., vorstehend) verwendet, indem Nitrocellulose-Duplikate von 1 x 10&sup6; Rekombinanten mit dem Oligonucleotid in SHB bei 65ºC hybridisiert und bei 65ºC mit 0,2 x SSC, 0,1% SDS gewaschen werden. Es werden positiv hybridisierende Clone aufgereinigt. Der mit dem Oligonucleotid hybridisierende Bereich wird auf einem etwa 1,5 kb großen Pst I-Fragment lokalisiert. Eine DNA-Sequenzanalyse dieses Fragments bestätigt die in Tabelle IV angebene 5'-Sequenz.
Der erste unterstrichene Teil der Sequenz Ser-Thr-Gln-Ser-Gln-Asp-Val- Ah-Arg von Aminosäure #388 bis #396 in Tabelle IV entspricht der ähnlichen Sequenz Ser-Thr-Pro-Ala-Gln-Asp-Val-Ser-Arg der vorstehend beschriebenen und in Tabelle II aufgeführten Rindersequenz. Die zweite unterstrichene Sequenz His-Glu-Leu-Tyr-Val-Ser-Phe von Aminosäure #415 bis #421 in Tabelle W entspricht dem vorstehend identifizierten tryptischen Fragment, auf dem der Entwurf der Oligonucleotid-Sonden basiert. Man beachte, daß die tryptische Sequenz His-Glu-Leu-Tyr-Val-Ser-Phe-(Ser) einer Sequenz ähnlich ist, die in anderen BMP-Proteinen gefunden wurde, z.B. der Sequenz His-Pro- Leu-Tyr-Val-Asp-Phe-Ser, die in der in der Veröffentlichung W0 88/00205 beschriebenen Sequenz des Knorpel/Knochen-Proteins BMP-2 von Rind und Mensch gefunden wurde. BMP-6 stellt daher ein neues Mitglied der BMP- Unterfamilie von TGF-β-ähnlichen Molekülen dar, die sowohl die in den Veröffentlichungen W0 88/00205 und W0 89/10409 beschriebenen Moleküle BMP-2, BMP-3 und BMP-4 als auch die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Moleküle BMP-5 und BMP-7 umfaßt.
Aufgrund der Kenntnis sowohl anderer BMP-Proteine als auch anderer Proteine der TGF-α-Familie läßt sich vorhersagen, daß BMP-6 als ein Vorläufermolekül synthetisiert wird und das Vorläufer-Polypeptid zwischen der Aminosäure #381 und der Aminosäure #382 gespalten wird, wobei ein reifes Polypeptid von 132 Aminosäuren mit einem berechneten Molekulargewicht von etwa 15 Kd erhalten wird. Wie BMP-5 enthält die reife BMP-6-Form drei potentielle N-verbundene Glykosylierungstellen pro Polypeptidkette.
Es ist zu warten, daß die Prozessierung von BMP-6 zur reifen Form eine Dimerisierung und die Entfernung des N-terminalen Bereiches in einer Weise umfaßt, die zur Prozessierung des verwandten Proteins TGF-β [L. E. Gentry et al., (1988); R. Dernyck et al., (1985), vorstehend] analog ist. Es ist zu erwarten, daß das aktive BMP-6-Proteinmolekül ein Dimer ist. Darüberhinaus ist zu erwarten, daß die reife aktive Art des BMP-6-Proteinmoleküls ein Homodimer ist, das zwei Polypeptid-Untereinheiten umfaßt, wobei jede Untereinheit die in Tabelle IV aufgeführten Aminosäuren #382 - #513 umfaßt. Weitere aktive BMP-6-Arten sind zu erwarten, wie Proprotein-Dimere oder eine Proprotein-Untereinheit und eine reife Untereinheit. Weitere aktive BMP-6-Proteine können die Aminosäuren #388 - #513 umfassen, wozu die in aufgereinigtem Rinder- Material gefundenen tryptischen Fragmente gehören. Ein anderes erfindungsgemäßes BMP-6-Protein umfaßt die Aminosäuren #412 - #513, wodurch der erste konservierte Cystin-Rest einbezogen ist. TABELLL IV TABELLE IV (Seite 2 von 6) TABELLE IV (Seite 3 von 6) TABELLE IV (Seite 4 von 6) TABELLE IV (Seite 5 von 6) TABELLE IV (Seite 5 von 6)
Ein Vergleich der Sequenz von Maus-Vgr-1 [Lyons et al., PNAS 86 (1989), 4554] mit menschlichem BMP-6 offenbart, daß die Identität der Aminosäuresequenz 92% übersteigt. Maus-Vgr-1 ist wahrscheinlich das Maus-Homolog von BMP-6. Menschliches BMP-6 zeigt sowohl Homologie zu anderen BMP-Molekülen als auch zu anderen Mitgliedern der TGF-β-Molekül-Superfamilie. Die 102 Cysteinreichen Carboxyl-terminalen Aminosäurereste von menschlichem BMP-6 zeigen zu BMP-Proteinen, die in der vorliegenden Erfindung und in den Veröffentlichungen W0 88/00205 und W0 89/10409 offenbart sind, die folgenden Homologien: zu 61% identisch mit BMP-2; zu 44% identisch mit BMP- 3; zu 60% identisch mit BMP-4; zu 91% identisch mit BMP-5 und zu 87% identisch mit BMP-7. Menschliches BMP-6 zeigt darüberhinaus die folgenden Homologien: zu 41% identisch mit TGF-β3; zu 39% identisch mit TGF-β2; zu 37% identisch mit TGF-β1; zu 26% identisch mit Müller-Hemmstoff (MIS), einem Testikel-Glykoprotein, daß die Rückbildung des Müller-Ganges während der Entwicklung des männlichen Embryos verursacht; zu 25% identisch mit Inhibin α; zu 43% identisch mit Inhibin βB; zu 49% identisch mit Inhibin βA; zu 58% identisch mit Vgl, einem Xenopus-Faktor, der möglicherweise an der Mesoderm-Induktion in der frühen Embryogenese beteiligt ist (Weeks und Melton, (1987), vorstehend), und zu 59% identisch mit Dpp, dem Produkt des "decapentaplegic"-Locus von Drosophila, das zur dorsoventralen Entwicklung in der frühen Embryogenese erforderlich ist und an verschiedenen anderen Entwicklungsprozessen in späteren Stadien der Entwicklung beteiligt ist [Padgett et al., (1987), vorstehend].

D. Menschliche BMP-7-Proteine

Die anderen vier Clone des vorstehend beschriebenen Beispiels V.C., die eine zweite Klasse von Glonen darzustellen scheinen, codieren ein neuartiges Polypeptid, das die Erfinder der vorliegenden Erfindung als BMP-7 bezeichnen. Einer dieser Clone, U2-5, wurde bei ATCC am 22. Juni 1989 unter der Eingangsnummer ATCC 68020 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt. Es wurde festgestellt, daß dieser Clon nicht die ganze codierende Sequenz für BMP-7 enthält. Ein Oligonucleotid der Sequenz GCGAGCAATGGAGGATCCAG (entworfen auf der Basis der nicht-codierenden 3'- Sequenz von U2-5) wurde zur Herstellung einer Primer-verlängerten cDNA- Genbank aus U-2OS-MRNA verwendet (Toole et al.). 500 000 Rekombinante dieser Genbank wurden mit dem Oligonucleotid GATCTCGCGCTGCAT (entworfen auf der Basis der BMP-7-codierenden Sequenz) durch Hybridisierung in SHB bei 42ºC und Waschen in 5 x SSC, 0,1% SDS bei 42ºC abgesucht. Mehrere hybridisierende Clone wurden erhalten. Das Ergebnis der DNA-Sequenzanalyse und die abgeleitete Aminosäuresequenz eines dieser Clone, PEH7-9, sind in Tabelle V wiedergegeben. PEH7-9 wurde bei American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, am 17. November 1989 unter der Eingangsnummer ATCC 68182 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt. PEH7-9 enthält eine Insertion von 1448 Basenpaaren. Es ist zu erwarten, daß der Clon PEH7-9 die gesamte Nucleotidsequenz enthält, die zur Codierung der BMP-7- Proteine erforderlich ist. Die cDNA-Sequenz von Tabelle V enthält ein offenes Leseraster von 1292 Basenpaaren, das ein Protein von 431 Aminosäuren codiert, vor dem sich ein untranslatierter 5'-Bereich von 96 Basenpaaren mit Stop- Codons in allen Leserastern befindet, und einen untranslatierten 3'-Bereich von 60 Basenpaaren, der sich an das Stop-Codon TAG im Leseraster anschließt.
Dieses Protein von 431 Aminosäuren weist ein Molekulargewicht von 49 000 Dalton auf, wie es sich aus seiner Aminosäuresequenz vorhersagen läßt, und stellt vermutlich das primäre Translationsprodukt dar. Aufgrund der Kenntnis sowohl anderer BMP-Proteine als auch anderer Proteine innerhalb der TGF-β- Familie läßt sich vorhersagen, daß das Vorläufer-Polypeptid zwischen den Aminosäuren #299 und #300 gespalten wird, wobei ein reifes Peptid von 132 Aminosäuren erhalten wird.
Es ist zu erwarten, daß die Prozessierung von BMP-7 zur reifen Form eine Dimerisierung des Proproteins und die Entfernung des N-terminalen Bereiches in einer Weise umfaßt, die zu der Prozessierung des verwandten Proteins TGF-β analog ist [.L E. Gentry et al., (1988), vorstehend; und R. Dernyck et al., (1985), vorstehend]. Es ist deshalb zu erwarten, daß die reife aktive BMP-7-Art ein Homodimer von 2 Polypeptid-Untereinheiten umfaßt, wobei jede Untereinheit die in Tabelle V gezeigten Aminosäuren #300 - #431 mit einem berechneten Molekulargewicht von 15 000 Dalton umfaßt. Andere aktive BMP-7-Arten sind zu erwarten, z.B. Proteindimere oder Proprotein-Untereinheiten, die an reife Untereinheiten gebunden sind. Weitere aktive Arten können die Aminosäuren #309 - #431 von Tabelle V umfassen, wobei solche Arten die tryptischen Sequenzen umfassen, die in dem aufgereinigten Rinder-Material gefunden wurden. Es sind auch BMP-7-Proteine zu erwarten, die die Aminosäuren # 330 - #431 umfassen, wodurch der erste konservierte Cystein-Rest einbezogen ist.
Die unterstrichene Sequenz Asn-Gln-Glu-Ala-Leu-Arg von Aminosäure #309 - #314 in Tabelle V ist die gleiche Sequenz wie die des tryptischen Fragmentes #5, das in dem aufgereinigten 28 000 - 30 000 Dalton-Knochen- Präparat gefunden wurde, wie in den vorstehend erwähnten "BMP"- Veröffentlichungen W0 88/00205 und W0 89/10409 beschrieben. Die unterstrichene Sequenz His-Glu-Leu-Tyr-Val-Ser-Phe von Aminosäure # 333 - #339 in Tabelle V entspricht dem tryptischen Fragment, das in dem vorstehend beschriebenen Rinder-Knochenpräparat bestimmt wurde und auf dem der Entwurf der Oligonucleotid-Sonden basiert. TABELLE V TABELLE V (Seite 2 von 3) TABELLE V (Seite 3 von 3)
Wie BMP-5 und BMP-6 zeigt BMP-7 Homologien sowohl zu anderen BMP- Molekülen als auch zu anderen Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie von Molekülen. Die 102 Cystein-reichen Carboxyl-terminalen Aminosäurereste von menschlichem BMP-7 zeigen zu BMP-Proteinen, die in der vorliegenden Erfindung und in den vorstehend erwähnten Veröffentlichungen W088/00205 und W0 89/10409 beschrieben sind, die folgenden Homologien: zu 60% identisch mit BMP-2; zu 43% identisch mit BMP-3; zu 58% identisch mit BMP-4; zu 87% identisch mit BMP-6 und zu 88% identisch mit BMP-5. Menschliches BMP-7 zeigt darüberhinaus die folgenden Homologien: zu 40% identisch mit TGF-β3; zu 40% identisch mit TGF-β2; zu 36% identisch mit TGF-β1; zu 29% identisch mit Müller- Hemmstoff (MIS), einem Testikel-Glykoprotein, das die Rückbildung des Müller- Ganges wahrend der Entwicklung des männlichen Embryos verursacht; zu 25% identisch mit Inhibin-α; zu 44% identisch mit Inhibin-βB; zu 45% identisch mit Inhibin-βA; zu 57% identisch mit Vgl, einem Xenopus-Faktor, der möglicherweise an der Mesoderm-Induktion in der frühen Embryogenese beteiligt ist [Weeks und Melton, (1987), vorstehend], und zu 58% identisch mit Dpp, dem Produkt des "decapentaplegic-1-Locus von Drosophila, das zur dorsoventralen Entwicklung in der frühen Embryogenese erforderlich ist und bei verschiedenen anderen Entwicklungsprozessen in späteren Stadien der Entwicklung beteiligt ist [Padgett et al., (1987), vorstehend].
Die Erfindung umfaßt die genomischen Sequenzen von BMP-5, BMP-6 und BMP-7. Zum Erhalt dieser Sequenzen werden die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen cDNA-Sequenzen als Sonden zum Screenen genomischer Genbanken unter Verwendung von Techniken verwendet, die dem Fachmann bekannt sind.
Unter Verwendung der Proteine von Rind und Mensch als Sondenquelle können die vorstehend beschriebenen Verfahren und weitere Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, zur Isolierung anderer verwandter Proteine von Interesse eingesetzt werden. Solche anderen Proteine können u.a. eine ähnliche Verwendung bei der Heilung von Knochenbrüchen, Wundheilung und Wiederherstellung von Geweben finden.

BEISPIEL VI

Expression von BMP-Proteinen

Zur Produktion erfindungsgemäßer BMP-5-, BMP-6- oder BMP-7-Proteine von Rind, Mensch oder anderen Säugern wird die DNA, die diese codiert, mittels herkömmlicher gentechnischer Verfahren in einen geeigneten Expressionsvektor transfiziert und in Säugerzellen oder andere bevorzugte eukaryontische oder prokaryontische Wirte eingeführt. Es ist zu erwarten, daß stabil transformierte Säugerzellen das bevorzugte Expressionssystem für die erfindungsgemäßen biologisch aktiven, rekombinanten, menschlichen Proteine sind. Zur kurzzeitigen Expression sind die mit SV40 transformierten Nierenzellen COS-1 oder COS-7 der afrikanischen grünen Meerkatze die Zellinien der Wahl, die typischerweise über einen Zeitraum von 1 - 4 Tagen akzeptable Mengen des vom Plasmid codierten Proteins produzieren. Zur stabilen Expression von BMP-5, BMP-6 oder BMP-7 in hohen Mengen sind Ovarialzellen vom Chinesischen Hamster (CHO) die bevorzugte Zellinie. Es ist deshalb zu erwarten, daß CH-Zellen die bevorzugten Säugerzellen darstellen.
Die transformierten Wirtszellen werden gezüchtet und die dadurch exprimierten erfindungsgemäßen BMP-Zellen werden gewonnen, isoliert und aufgereinigt. Eine Charakterisierung exprimierter Proteine wird unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt. Eine Charakterisierung kann beispielsweise eine Pulsmarkierung mit [³&sup5;S]-Methionin oder -Cystein und eine Polyacrylamid-Gelektrophorese-Analyse umfassen. Die mittels rekombinanter Verfahren exprimierten BMP-Proteine sind sowohl von proteinartigen Substanzen, die bei der Herstellung mit anfallen und mit denen sie gewöhnlich in der Natur vorkommen, als auch von anderen Verunreinigungen, wie in den Kulturmedien gefundenen Substanzen, frei.

A. Vektorkonstruktion

Wie vorstehend beschrieben, können zahlreiche auf dem Fachgebiet bekannte Expressionsvektoren zur Expression der erfindungsgemäßen BMP- Proteine verwendet werden. Der in den folgenden Beispielen verwendete Vektor ist pMT21, ein Abkömmling von pMT&sub2;, obwohl sich auch andere Vektoren zur praktischen Umsetzung der Erfindung eignen.
pMT&sub2; stammt von pMT2-VWF, der bei American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD (USA), unter der Eingangsnummer ATCC 67122 gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrages hinterlegt worden ist. Durch eine EcoRI-Spaltung wird die in pMT-VWF vorhandene cDNA-Insertion herausgeschnitten, wobei pMT&sub2; in linearer Form erhalten wird, die ligiert und zur Transformation von E. coli HB101 oder DH-5 bis zur Ampicillin-Resistenz verwendet werden kann. DNA des Plasmids pMT2 kann mittels herkömmlicher Verfahren hergestellt werden.
Unter Verwendung des "loopout/in"-Mutageneseverfahrens [Morinaga et al., Biotechnology 84 (1984), 636] wird dann pMT21 konstruiert. Dadurch werden die Basen 1075 bis (einschließlich) 1170 entfernt. Außerdem wird dadurch die folgende Sequenz 5'-TCGA-3' insertiert. Diese Sequenz vervollständigt eine neue XhoI-Restriktionsstelle. Dieses Plasmid enthält nun 3 nur einmal vorkommende PstI-, EcoRI und XhoI-Clonierungsstellen.
pMT21 wird außerdem mit EcoRV und XhoI gespalten, die gespaltene DNA wird mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I behandelt und mit Clal- Unkern (NEBio Labs, CATCGATG) ligiert. Dadurch werden ausgehend von der HINDIII-Restriktionsstelle in der Nähe des SV40-Replikationsstartpunktes und der pMT2-Enhancer-Sequenzen die Basen 2171 bis 2420 entfernt und eine nur einmal vorkommende ClaI-Stelle eingeführt, wobei das Adenovirus-VAI-Gen jedoch intakt bleibt.

B. Vektorkonstruktion für BMP-5

Es wird spezifisch ein Abkömmling der in Tabelle III dargelegten BMP-5- cDNA-Sequenz amplifiziert, der die Nucleotidsequenz von Nucleotid #699 bis #2070 umfaßt. Die Oligonucleotide CGACCTGCAGCCACCATGCATCTGACTGTA und TGCCTGCAGTTTAATATTAGTGGCAGC werden als Primer verwendet, um die Amplifikation der in Tabelle III gezeigten Nucleotidsequenz #699 bis #2070 der Insertion des vorstehend in Beispiel V beschriebenen Clons U2-16 zu ermöglichen. Durch dieses Verfahren wird unmittelbar vor dem Nucleotid #699 die Nucleotidsequenz CGACCTGCAGCCACC eingeführt und unmittelbar nach dem Nucleotid #2070 die Nucleotidsequenz CTGCAGGCA. Die Anlagerung dieser Sequenzen führt zur Erzeugung von PstI-Restriktionsendonuclease- Erkennungsstellen an beiden Enden des amplifizierten DNA-Fragmentes. Das durch dieses Verfahren erhaltene amplifizierte DNA-Produkt wird mit der Restriktionsendonuclease PstI gespalten und in die PstI-Stelle des vorstehend beschriebenen pMT2-Abkömmlings pMT21 subcloniert. Der erhaltene Clon wird als H5/5/pMT bezeichnet.
Die Insertion von H5/5/pMT wird durch PstI-Spaltung herausgeschnitten und in den Plasmidvektor PSP65 an der PstI-Stelle subcloniert, was zu BMP5/SP6 führt. BMP5/SP6 und U2-16 werden mit den Restriktionsendonucleasen NsiI und Ndei gespalten, um den Teil ihrer Insertion herauszuschneiden, der den Nucleotiden #704 bis #1876 von Tabelle III entspricht. Das erhaltene 1173 Nucleotide umfassende NsiI-NdeI-Fragment von Clon U2- 16 wird in die NsiI- NdeI-Stelle von BMP5/SP6 ligiert, aus dem das entsprechende 1173 Nucleotide umfassende NsiI-NdeI-Fragment entfernt worden war. Der erhaltene Clon wird als BMP5mix/SP64 bezeichnet.
Es wird eine direkte DNA-Sequenzanalyse von BMP5mix/SP64 durchgeführt, um die Identität der Nucleotidsequenzen zu bestätigen, die durch die Amplifikation der in Tabelle III dargelegten Nucleotide erzeugt wurden. Der Clon BMP5mix/SP64 wird mit der Restriktionsendonuclease PstI gespalten, was zum Herausschneiden einer Insertion führt, die die Nucleotide #699 bis #2070 von Tabelle III und die vorstehend beschriebenen zusätzlichen Sequenzen umfaßt, die die PstI-Erkennungsstellen enthalten. Das erhaltene 1382 Nucleotide enthaltende PstI-Fragment wird in die PstI-Stelle des pMT2- Abkömmlings pMT21 subcloniert. Dieser Clon wird als BMP5mix/pMT21#2 bezeichnet.

C. Vektorkonstruktion für BMP-6

Durch eine Reihe von Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, wird ein Abkömmling der in Tabelle IV aufgeführten BMP-6-cDNA-Sequenz erzeugt, der die Nucleotidsequenz von Nucleotid #160 bis #1706 umfaßt. Der vorstehend in Beispiel V beschriebene Clon BMP6C35 wird mit den Restriktionsendonucleasen ApaI und TaqI gespalten, was zum Herausschneiden eines 1476 Nucleotide umfassenden Teils der Insertion führt, die die Nucleotide #231 bis #1703 der in Tabelle IV dargelegten Sequenz umfaßt. Zum Austausch der Nucleotide, die #160 bis #230 und #1704 bis #1706 entsprechen und die in dem 1476 bp großen Apal- TaqI-Fragment der BMP-6-cDNA-Sequenz nicht enthalten sind, werden synthetische Oligonucleotide mit Convertern für Sall-Restriktionsendonudease-Stellen entworfen. Oligonucleotid/SalI-Converter, die zum Ersatz der fehlenden
und 3' (TCGACTGGTFT und CGAAACCAG)-Sequenzen gedacht sind, werden unabhängig voneinander zusammengelagert. Die zusammengelagerten 5'- und 3'-Converter werden dann an das vorstehend beschriebene 1476 Nucleotide umfassende ApaI-TaqI-Fragment ligiert, wobei ein 1563 Nucleotide umfassendes Fragment erzeugt wird, das die Nucleotidsequenz von #160 bis #1706 in Tabelle IV und die zusätzlichen Sequenzen umfaßt, die zur Erzeugung von Sall- Restriktionsendonuclease-Stellen an beiden Enden entworfen werden. Das erhaltene 1563 Nucleotid-Fragment wird in die SalI-Stelle von PSP64 subcloniert. Dieser Clon wird als BMP6/SP64#15 bezeichnet.
Zur Bestätigung, daß die durch die Converter ersetzten 5'- und 3'-Sequenzen mit der in Tabelle IV aufgeführten Sequenz identisch sind, wird eine DNA- Sequenzanalyse von BMP6/SP64#15 durchgeführt. Die Insertion von BMP6/SP64#15 wird durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease SalI herausgeschnitten. Das erhaltene 1563 Nucleotid-SalI-Fragment wird in die XhoI-Restriktionsendonuclease-Stelle des pMT2-Abkömmlings pMT21 subcloniert und der erhaltene Clon wird als BMP6/pMT21 bezeichnet.

D. Vektorkonstruktion für BMP-7

Es wird spezifisch ein Abkömmling der in Tabelle V dargelegten BMP-7- Sequenz amplifiziert, der die Nucleotidsequenz von Nucleotid #97 bis #1402 umfaßt. Die Oligonucleotide CAGGTCGACCCACCATGCACGTGCGCTCA und TCTGTCGACCTCGGAGGAGCTAGTGGC werden als Primer verwendet, um die Amplifikation der in Tabelle V gezeigten Nucleotidsequenz #97 bis #1402 der Insertion des vorstehend beschriebenen Clons PEH7-9 zu ermöglichen. Durch dieses Verfahren wird unmittelbar vor dem Nucleotid #97 die Nucleotidsequenz CAGGTCGACCCACC insertiert und unmittelbar nach dem Nucleotid #1402 die Nucleotidsequenz GTCGACAGA. Die Anlagerung dieser Sequenzen führt zur Erzeugung von Erkennungsstellen für die Restriktionsendonuclease Sall an beiden Enden des amplifizierten DNA-Fragmentes. Das bei diesem Verfahren erhaltene amplifizierte DNA-Produkt wird mit der Restriktionsendonuclease Sall gespalten und in die Sall-Stelle des Plasmidvektors PSP64 subcloniert, was zu BMP7/SP6#2 führt.
Die Clone BMP7/SP6#2 und PEH7-9 werden mit den Restriktionsendonudeasen NcoI und StuI zum Herausschneiden des Teils ihrer Insertionen gespalten, der den Nucleotiden #363 bis # 1081 von Tabelle V entspricht. Das erhaltene 719 Nucleotide große NcoI-StuI-Fragment von Clon PEH7-9 wird in die NcoI-StuI-Stelle von BMP7/SP6#2 ligiert, aus dem das entsprechende 719 Nucleotid-Fragment entfernt worden ist. Der erhaltene Clon wird als BMP7mix/SP6 bezeichnet.
Durch eine direkte DNA-Sequenzanalyse von BMP7mix/SP6 wurde bestätigt, daß der 3'-Bereich mit der Nucleotidsequenz von #1082 bis #1402 in Tabelle V identisch ist, der 5'-Bereich jedoch ein falsches Nucleotid enthielt.
Die Amplifikation der Nucleotidsequenz (#97 bis #1402 von Tabelle V) wurde wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von PEH7-9 als Matrize wiederholt. Das bei diesem Verfahren erhaltene amplifizierte DNA-Produkt wird mit den Restriktionsendonucleasen Sall und PstI gespalten. Die Spaltung führt zum Herausschneiden eines 747 Nucleotid-Fragmentes, das die Nucleotide #97 bis #833 von Tabelle V und die zusätzlichen Sequenzen des als 51-Primer eingesetzten Oligonucleotides umfaßt, das zur Erzeugung der vorstehend beschriebenen Erkennungsstelle für die Restriktionsendonuclease SalI verwendet wurde. Dieses 747 Nucleotide umfassende SalI-PstI-Fragment wird in den mit SalI und PstI gespaltenen Vektor PSP65 subcloniert, was zu 5'BMP7/SP65 führt. Eine DNA-Sequenzanalyse zeigt, daß die Insertion von 5'BMP7/SP65#1 eine Sequenz umfaßt, die mit den Nucleotiden #97 bis #362 von Tabelle V identisch ist.
Die Clone BMP7mix/SP6 und 5'BMP7/SP65 werden mit den Restriktionsendonucleasen SalI und NcoI gespalten. Das erhaltene 3'-NcoI-SalI- Fragment von BMP7mix/SP6, das die Nucleotide #363 bis #1402 von Tabelle V umfaßt, und das 5'-SalI-NcoI-Fragment von 5'BMP7/SP65, das die Nucleotide #97 bis #362 von Tabelle V umfaßt, werden an den NcoI-Restriktionsstellen ligiert, wobei ein 1317 Nucleotid-Fragment erzeugt wird, das die Nucleotide #97 bis #1402 von Tabelle V und die zusätzlichen Sequenzen umfaßt, die von den 5'- und 3'-Oligonucleotid-Primern stammen, was die Erzeugung von SalI- Restriktionsstellen an beiden Enden dieses Fragmentes ermöglicht. Dieses 1317 Nucleotide umfassende SalI-Fragment wird in die SalI-Stelle des pMT2- Abkömmlings pMT2Cla-2 ligiert. Dieser Clon wird als BMP7/pMT2 bezeichnet.
Die Insertion von BMP7/pMT2 wird durch Spaltung mit der Restriktionsendonuclease SalI herausgeschnitten. Das erhaltene 1317 Nucleotide umfassende SalI-Fragment wird in die SalI-Restriktionsstelle des Vektors pSP64 subcloniert. Dieser Clon wird als BMP7/SP64#2d bezeichnet. Die Insertion von BMP7/SP64#2d wird durch Spaltung mit SalI herausgeschnitten und das erhaltene SalI-Fragment, das die Nucleotide #97 bis #1402 von Tabelle V umfaßt, wird in die XhoI-Restriktionsendonuclease-Stelle des vorstehend beschriebenen pMT2-Abkömmlings pMT21 subcloniert.

BEISPIEL VII

Kurzzeitige Expression in COS-Zellen

Um eine kurzzeitige Expression der Proteine BMP-5, BMP-6 und BMP-7 zu erhalten, wird einer der die cDNA für BMP-5, BMP-6 oder BMP-7 enthaltenden Vektoren BMP5mix/pMT21#2, BMP6/pMT21#2 oder BMP7/pMT21 unter Verwendung des Elektroporations-Verfahrens in COS-1-Zellen transfiziert. Andere geeignete Transfektionsverfahren umfassen DEAE-Dextran und eine Upofektion. Mittels Stoffwechselmarkierung mit [³&sup5;S]-Methionin und Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden die Zellen etwa 48 Stunden später hinsichtlich der Expression von intrazellulärem und sezerniertem BMP-5-, BMP-6- oder BMP-7-Protein untersucht. Intrazelluläres BMP wird in Zellen analysiert, die mit Tunicamycin behandelt wurden, einem Inhibitor der N- verbundenen Glykosylierung. Bei mit Tunicamycin behandelten Zellen wandert das nicht-glykosylierte primäre Translationsprodukt als homogene Bande mit prognostizierbarem Molekulargewicht und ist in Polyacrylamid- Gelen oft leichter zu erkennen als die glykosylierte Proteinform. In jedem Fall wird intrazelluläres Protein von Zellen, die mit Tunicamycin behandelt wurden, mit einer zweiten Platte von transfizierten, aber unbehandelten COS-1-Zellen verglichen.

A. COS-Exdression von BMP-5

Die Ergebnisse zeigen, daß COS-Zellen intrazelluläre BMP-5-Formen von etwa 52 Kd und 57 Kd produzieren. Das 52 Kd-Protein besitzt die Größe, die aufgrund der Primärsequenz des BMP-5-cDNA-Clons prognostiziert wurde. Nach Behandlung der Zellen mit Tunicamycin wird nur die 52 Kd-Form von BMP-5 produziert, was nahelegt, daß das 57 Kd-Protein ein glykosyliertes Derivat des 52 Kd-Primärtranslationsproduktes darstellt. Das 57 Kd-Protein wird in das konditionierte Medium sezerniert und wird anscheinend von den COS-1-Zellen nicht effizient in das Propeptid und das reife Peptid prozessiert.

B. COS-Expression von BMP-6

Intrazelluläres BMP-6 kommt in unbehandelten CQS-1-Zellen als Doppelbande von etwa 61 Kd und 65 Kd vor. In Gegenwart von Tunicamycin wird nur das 61 Kd-Protein beobachtet, was zeigt, daß das 65 Kd-Protein das glykosylierte Derivat des 61 Kd-Primärtranslationsproduktes darstellt. Das entspricht ungefähr dem Molekulargewicht, das aufgrund des cDNA-Clons für BMP-6 prognostiziert wurde. In Abwesenheit von Tunicamycin ist die glykosylierte unprozessierte BMP-6-Kurzform von 65 Kd das vorherrschende Protein, das aus COS-1-Zellen sezerniert wird. Es gibt auch Peptide von 46 Kd und 20 Kd, die nicht so häufig vorkommen wie das 65 Kd-Peptid, und die wahrscheinlich das prozessierte Propeptid bzw. das reife Peptid darstellen.

C. COS-Expression von BMP-7

In mit Tunicamycin behandelten COS-1-Zellen wird intrazelluläres BMP-7- Protein als Doppelbande von 44 Kd und 46 Kd nachgewiesen. In Abwesenheit von Tunicamycin werden Proteine von 46 Kd und möglicherweise 48 Kd synthetisiert. Diese stellen wahrscheinlich glykosylierte Derivate des BMP-7- Primär-translationsproduktes dar. Das 48 Kd-Protein ist die BMP-Hauptart, die aus COS-1-Zellen sezerniert wird, was wieder eine ineffiziente Spaltung von BMP-7 an der aus zwei Basen bestehenden Propeptid-Spaltstelle nahelegt.

BEISPIEL VIII

Exdression in CHO-Zellen

DHFR-freie CHO-Zellen (DUKX B11) werden mittels Elektroporation mit einem der vorstehend beschriebenen Expressionsvektoren für BMP-5, BMP-6 oder BMP-7 transfiziert und durch Züchtung in Nucleosid-freien Medien auf Expression von DHFR hin selektiert. Es können auch andere Transfektionsverfahren eingesetzt werden, die CaPO&sub4;-Präzipitation, Protoplastenfusion, Mikroinjektion und Lipofektion umfassen, aber nicht darauf beschränkt sind. Zum Zwecke einer höheren Expression können Zellen in Nucleosid-freien Medien selektiert werden, die mit 5 nM, 20 nM oder 100 nM MTX angereichert sind. Da der selektierbare DHFR-Marker als zweites Gen eines dicistronischen codierenden Bereiches physisch mit der BMP-CDNA verbunden ist, sollten DHFR-exprimierende Zellen auch das BMP-Protein exprimieren, das innerhalb des stromaufwärts gelegenden Cistrons codiert wird. Entweder einzelne Clone oder Pools kombinierter Clone werden vermehrt und auf Expression eines BMP-Proteins hin untersucht. Zur Gewinnung von Zellinien, die aufgrund einer Genamplifikation mehrere Kopien der Expressionsvektor- DNA enthalten und daher große BMP-Proteinmengen sezernieren, werden Zellen in schrittweise erhöhten MTX-Konzentrationen (5 nM, 20 nM, 100 nM, 500 nM, 2 uM, 10 uM und 100 uM) selektiert.
Unter Verwendung von Standardverfahren werden Zellinien hinsichtlich der Expression von BMP-RNA, -Protein oder -Aktivität abgesucht und Zellinien mit hoher Expression werden bei einem geeigneten Selektionsgrad doniert oder redoniert, um eine homogenere Zellpopulation zu erhalten. Die erhaltene Zellinie wird dann weiter im Hinblick auf BMP-DNA-Sequenzen und die Expression von BMP-RNA und BMP-Protein charakterisiert. Geeignete Zellinien können dann zur Produktion eines rekombinanten BMP-Proteins verwendet werden.

A. BMP-5-Exoression in CHO

Der vorstehend beschriebene BMP-5-Vektor BMP5mix/pMT21 #2 wird mittels Elektroporation in CHO-Zellen transfiziert und die Zellen werden auf DHFR-Expression hin selektiert. Aus einzelnen Kolonien, die schrittweise auf Resistenz gegen MTX selektiert wurden, werden donierte Zellinien erhalten und im Hinblick auf die Sekretion von BMP-5-Proteinen analysiert. In einigen Fällen können die Zellinien als Pool gehalten und in späteren Stufen der MTX- Selektion doniert werden.
Wie in Beispiel V.B. beschrieben, codiert die BMP-5-CDNA ein Protein von etwa 52 Kd. Nach der Prozessierung innerhalb der Zelle, die Propeptidspaltung, Glykosylierung und Dimer- oder Multimerbildung umfaßt, aber nicht darauf beschränkt ist, werden mehrere BMP-5-Peptide produziert. Es gibt mindestens 4 Peptide, die Kandidaten für prozessierte Formen des BMP-5-Proteins sind und die nach SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen zu erkennen sind: ein 65 Kd-Peptid, ein 35 Kd-Peptid und eine Doppelbande mit einem Molekulargewicht von etwa 22 Kd. Andere weniger häufig vorkommende BMP- 5-Peptide können auch vorhanden sein. Aufgrund eines Vergleichs mit der Prozessierung anderer verwandter BMP-Moleküle und der des verwandten TGF- β-Proteins ist es wahrscheinlich, daß das 65 Kd-Protein unprozessiertes BMP-5- darstellt, die 35 Kd-Art das Propeptid ist und die 22 Kd-Doppelbande das reife Peptid darstellt.
Material aus einer BMP-5-Zellinie wird in einem zweidimensionalen Gelsystem analysiert. In der ersten Dimension werden die Proteine einer Elektrophorese unter nicht-reduzierenden Bedingungen unterworfen. Danach wird das Material reduziert und einer Elektrophorese in einem zweiten Polyacrylamidgel unterworfen. Proteine, die Dimere oder Multimere mit Disulfidbindungen bilden, wandern unter eine quer durch das zweite reduzierte Gel hindurchlaufende Diagonale. Die Ergebnisse aus der Analyse des BMP-5- Proteins zeigen, daß eine signifikante Menge der reifen BMP-5-Peptide Homodimere von etwa 30 - 35 Kd bilden können, die sich auf die in eindimensionalen reduzierten Gelen beobachtete 22 Kd-Doppelbande verkürzen. Eine Fraktion der reifen Peptide liegt anscheinend in einem über Disulfidbrücken verbundenen Komplex mit dem Propeptid vor. Im Vergleich zu dem reifen Homodimer ist die Menge dieses Komplexes unbedeutend. Außerdem kann anscheinend ein Teil des unprozessierten Proteins Homodimere oder Homomultimere bilden.

B. BMP-6-Expression in CHO

Der vorstehend beschriebene BMP-6-Expressionsvektor BMP6/pMT2 1 wird in CHO-Zellen übertragen und über die DHFR-Expression in einer Weise, die vorstehend in Teil A im Hinblick auf BMP-5 beschrieben ist, auf stabile Transformanten selektiert. Es ist zu erwarten, daß die reife aktive BMP-6-Art die Aminosäuren #382 - #513 von Tabelle V umfaßt. Es ist zu erwarten, daß sezerniertes BMP-6-Protein in einer Weise prozessiert wird, die ähnlich der ist, die vorstehend für BMP-5 und andere verwandte BMP-Moleküle beschrieben ist, und analog zur Prozessierung des verwandten TGF-β-Proteins ist [Gentry et al.; Dernyck et al., vorstehend].

C. BMP-7-Expression in CHO

Der vorstehend beschriebene BMP-7-Expressionsvektor BMP7/pMT21 wird in CHO-Zellen transfiziert und über die DHFR-Expression in einer Weise, die vorstehend im Hinblick auf BMP-5 beschrieben ist, auf stabile Transformanten selektiert. Es ist zu erwarten, daß die reife aktive BMP-7-Art die Aminosäuren #300 - #431 von Tabelle V umfaßt. Es ist zu erwarten, daß sezerniertes BMP-7- Protein in einer Weise prozessiert wird, die ähnlich der ist, die vorstehend für BMP-5 und andere verwandte BMP-Moleküle beschrieben ist, und analog zur Prozessierung des verwandten TGF-β-Proteins ist [Gentry et al.; Dernyck et al., vorstehend].

BEISPIEL IX

Biologische Aktivität exprimierter BMP-Proteine

Zur Bestimmung der biologischen Aktivität der vorstehend in den Beispielen VII und VIII erhaltenen exprimierten Proteine BMP-5, BMP-6 und BMP-7 werden die BMP-Proteine aus den Kulturmedien gewonnen und aufgereinigt, indem die BMP-Proteine sowohl von anderen proteinartigen Substanzen, die in der Herstellung mit anfallen, als auch von anderen Verunreinigungen abgetrennt werden. Die Proteine können auf einer Heparin-Sepharose-Säule partiell gereinigt und unter Verwendung von Standard-Reinigungsverfahren, die dem Fachmann bekannt sind, weiter aufgereinigt werden.
Beispielsweise wird ein von den Kulturen gesammelter Überstand eines nach Transfektion konditionierten Mediums mittels Ultrafiltration auf einer YM 10-Membran etwa lofach konzentriert und dann gegen 20 mM Tris, 0,15 M NaCl, pH-Wert 7,4 (Ausgangspuffer), dialysiert. Dieses Material wird danach in Ausgangspuffer auf eine Heparin-Sepharose-Säule aufgetragen. Ungebundene Proteine werden durch Waschen mit Ausgangspuffer entfernt und gebundene Proteine einschließlich der erfindungsgemäßen Proteine werden durch Waschen mit 20 mM Tris, 2,0 M NaCl, pH-Wert 7,4, desorbiert. Die durch die Heparin-Säule gebundenen Proteine werden beispielsweise auf einer Centricon 10-Vorrichtung etwa 10fach konzentriert und die Salzkonzentration wird mittels Diafiltration mit beispielsweise 0,1% Trifluoressigsäure vermindert. Eine geeignete Menge der erhaltenen Lösung wird mit 20 mg Ratten-Matrix gemischt und dann mit Hilfe des nach Rosen modifizierten Sampath-Reddi- Testes in vivo auf Knochen- und/oder Knorpel-Bildungsaktivität getestet. Als Kontrolle wird ein fraktionierter Scheintransfektions-Überstand verwendet.
Eine weitere Aufreinigung kann mittels präparativer NaDodSO&sub4;/PAGE [Laemmli, Nature 227 (1970), 680-685] erreicht werden. Beispielsweise werden etwa 300 ug Protein auf ein 1,5 mm dickes 12,5%-iges Gel aufgetragen: die gewonnene Menge wird durch Zugabe von L-[³&sup5;S]-Methionin-markiertem BMP-Protein geschätzt, das wie vorstehend beschrieben, über Heparin- Sepharose aufgereinigt wurde. Proteine können mittels Kupferfärbung einer benachbarten Laufspur sichtbar gemacht werden [Lee et al., Anal. Biochem. 166 (1987), 308-312]. Geeignete Banden werden herausgeschnitten und in 0,1% NaDodSO&sub4;/20 mM Tris, pH-Wert 8,0, extrahiert. Der Überstand kann mit 10% CF&sub3;COOH auf einen sauren pH-Wert von 3 eingestellt werden und die Proteine werden auf einer 5,0 x 0,46 cm großen Vydac C4-Säule (The Separations Group, Hesperia, CA) entsalzt, die mit einem Gradienten von 0,1% CF&sub3;COOH bis 90% Acetonitril/0,1% CF&sub3;COOH entwickelt wurde.
Die Implantate, die Ratten-Matrix enthalten, zu der spezifische Mengen erfindungsgemäßer menschlicher BMP-5-, BMP-6- oder BMP-7-Proteine zugegeben worden sind, werden nach etwa sieben Tage aus den Ratten entfernt und zur histologischen Auswertung weiterverarbeitet. Typische Schnitte von jedem Implantat werden im Hinblick auf das Vorliegen neuer Knochenmineralien mit von Kossa-Fuchsin und saurem Fuchsin und im Hinblick auf das Vorliegen einer Knorpel-spezifischen Matrixbildung unter Verwendung von Toluidinblau angefärbt. Sowohl die innerhalb des Schnittes vorhandenen Zelltypen als auch das Maß, in dem diese Zellen einen Phänotyp zeigen, werden wie in Beispiel III beschrieben, beurteilt und ausgewertet.
Auch Extrakte von Wirtszellen können im Hinblick auf das Ausmaß der Aktivität getestet werden. Eine Aufreinigung wird in ähnlicher Weise, wie vorstehend beschrieben, erreicht, wobei allerdings in allen Puffern 6 M Harnstoff enthalten ist.
In den vorangegangenen Beschreibungen sind die derzeit bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ausführlich erläutert. Nach eingehender Betrachtung dieser Beschreibungen rechnet der Fachmann damit, daß bei ihrer praktischen Umsetzung zahlreiche Modifikationen und Veränderungen erfolgen. Es ist davon auszugehen, daß die angefügten Patentansprüche diese Modifikationen und Veränderungen umfassen.

Claims

1. DNA-Sequenz, die ein BMP-Protein codiert, das die Fähigkeit besitzt, Knorpel- und/oder Knochenbildung zu induzieren, wobei die DNA-Sequenz

(a) eine DNA-Sequenz, die BMP-5 codiert, und die

(i) die Nucleotidpositionen #699 bis #2060 in Tabelle III umfaßt;

(ii) die Nucleotidpositionen #1665 bis #2060 in Tabelle III umfaßt;

(iii) Sequenzen umfaßt, die mit der Sequenz nach (i) unter stringenten Hybridisiemngsbedingungen hybridisieren und ein Protein codieren, das die biologischen Eigenschaften von BMP-5 besitzt;

(iv) degenerierte Sequenzen oder Allele einer Sequenz nach (i) bis (iii) umfaßt; oder

(v) BMP-5 codiert, das die Aminosäuresequenz von Position #323 bis #454 in Tabelle III besitzt;

(b) eine DNA-Sequenz, die BMP-6 codiert, und die

(i) die Nucleotidpositionen #160 bis #1698 in Tabelle IV umfaßt;

(ii) die Nucleotidpositionen #1303 bis #1698 in Tabelle IV umfaßt;

(iii) Sequenzen umfaßt, die mit der Sequenz nach (i) unter stringenten Hybridisiewngsbedingungen hybridisieren und ein Protein codieren, das die biologischen Eigenschaften von BMP-6 besitzt;

(v) BMP-6 codiert, das die Aminosäuresequenz von Position #382 bis #513 in Tabelle IV besitzt; oder

(c) eine DNA-Sequenz, die BMP-7 codiert, und die

(i) die Nucleotidpositionen #994 bis #1389 in Tabelle V umfaßt;

(ii) Sequenzen umfaßt, die mit der Sequenz nach (i) unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisieren, die eine Aminosäuresequenz codieren, deren N-Terminus der Aminosäure entspricht, die das Codon mit der Nucleotidposition #994 beginnend codiert, und die ein Protein codieren, das die biologischen Eigenschaften von BMP-7 besitzt;

(iii) degenerierte Sequenzen oder Allele einer Sequenz nach (i) bis (iii) umfaßt; oder

(iv) BMP-7 codiert, das die Aminosäuresequenz von Position #300 bis #431 in Tabelle V besitzt,

ist.

2. Vektor, der eine DNA-Sequenz nach Anspruch 1 in funktioneller Verknüpfung mit einer Expressionskontrollsequenz umfaßt.

3. Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 2 transformiert ist.

4. Wirtszelle nach Anspruch 3, die eine Säugerzelle ist.

5. Wirtszelle nach Anspruch 4, die eine CHO-Zelle ist.

6. Protein, das Eigenschaften von BMP-5, BMP-6 oder BMP-7 aufweist und das von einer DNA-Sequenz nach Anspruch 1 codiert wird.

7. Protein, das Eigenschaften von BMP-5, BMP-6 oder BMP-7 aufweist und durch folgende Schritte erhältlich ist:

(a) Züchtung einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 3 bis 5 in einem geeigneten Kulturmedium, und

(b) Gewinnung, Isolierung und Reinigung des Proteins aus dem Kulturmedium.

8. Protein nach Anspruch 6 oder 7, weiter gekennzeichnet durch die Fähigkeit, die Induktion von Knorpel- und/oder Knochenbildung zu bewirken.

9. Verfahren zur Herstellung eines BMP-Proteins, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Züchtung der transformierten Wirtszelle nach Anspruch 4 bis 6 in einem geeigneten Kulturmedium, und

(b) Gewinnung, Isolierung und Reinigung des Proteins aus dem Kulturmedium.

10. Protein, das Eigenschaften von BMP-7 aufweist und durch folgende Schritte erhältlich ist:

(a) Züchtung einer CHO-Zelle in einem geeigneten Kulturmedium, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die die Aminosäuren #1 bis #431 in Tabelle V codiert, oder mit einer DNA-Sequenz, die die Nucleotide #97 bis #1389 in Tabelle V umfaßt, und

(b) Gewinnung, Isolierung und Reinigung des BMP-7-Proteins aus dem Kulturmedium.

11. Verfahren zur Herstellung eines BMP-7-Proteins, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Züchtung einer CHO-Zelle in einem geeigneten Kulturmedium, die mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die die Aminosäuren #1 bis #431 in Tabelle V codiert, oder mit einer DNA-Squenz, die die Nucleotide #97 bis #1389 in Tabelle V umfaßt, und

12. Arzneimittel, das ein Protein nach einem der Ansprüche 6 bis 8 oder 10 in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger umfaßt.

13. Arzneimittel nach Anspruch 12, das weiter eine pharmazeutisch verträgliche Matrix umfaßt.

14. Arzneimittel nach Anspruch 13, wobei die Matrix Hydroxyapatit, Kollagen, Polymilchsäure oder Tricalciumphosphat umfaßt.

15. Verwendung eines Proteins gemäß der Definition in einem der Ansprüche 6 bis 8 oder 10 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten, der Knorpel- und/oder Knochenbildung benötigt.

16. Verwendung eines Proteins gemäß der Definition in einem der Ansprüche 6 bis 8 oder 10 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Wundheilung oder Wiederherstellung von Gewebe.

17. DNA-Sequenz, die die Nucleotide #1 bis #2153 wie in Tabelle III gezeigt umfaßt.

18. DNA-Sequenz, die die Nucleotide #1 bis #2923 wie in Tabelle IV gezeigt umfaßt.

19. DNA-Sequenz, die die Nucleotide #1 bis #1448 wie in Tabelle V gezeigt umfaßt.

20. DNA-Sequenz, die die BMP-7-DNA-Sequenz der ATCC-Hinterlegungsnummer 68020 umfaßt.