DE69034104T2

DE69034104T2 - Herstellung von heteropolymeren Proteinen

Info

Publication number: DE69034104T2
Application number: DE69034104T
Authority: DE
Inventors: Christie A. Hopkinton Kelton; Noreen P. Framingham Nugent; Scott C. Chappel
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Merck Serono SA
Priority date: 1989-06-20
Filing date: 1990-06-20
Publication date: 2004-04-08
Anticipated expiration: 2010-06-21
Also published as: EP0735139B1; EP0404546A2; JP3402604B2; ES2203653T3; DE69034104D1; ATE159544T1; DE69031611T2; DK0735139T3; CA2018676C; ATE251216T1; DE69031611D1; JPH0365194A; EP0735139A1; EP0404546B1; JP3814156B2; ES2108688T3; EP0404546A3; CA2018676A1; JP2001299374A

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Erzeugung von heteropolymeren dimeren Proteinen ausgewählt aus luteinisierendem Hormon, Follikel stimulierendem Hormon oder Choriongonadotropin, aus transformierten Säugetierzellen.
Die Transfektion von cDNA-Klonen der α- und β-Untereinheit in gezüchtete Säugetierzellen hat charakteristischerweise zu niedrigen Gonadotropinexpressionspegeln geführt. Dies hat die Erzeugung dieser Hormone in kommerziellem Maßstab stark beeinträchtigt.
Es ist ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, kommerziell durchführbare Methoden zur Herstellung solcher Hormone bereitzustellen.
Während einige Gene, wie β-Globin (1, 2) und Immunoglobulingene (3 bis 5), Introns für eine optimale mRNA-Produktion erfordern, ist dies bei anderen Genen, wie Thymidinkinase (6) nicht der Fall. Ein intronabhängiger Anstieg der Genexpression kann entweder durch nicht transkriptionale (z. B. Globingene) oder transkriptionale (z. B. Immunoglobulingene) Mechanismen entstehen.
Die Isolierung der Gene, die dem Menschen und Rind gemeinsame α-, FSH β-, LH β- und Human-TSH β-Untereinheiten codieren, wurde berichtet (8 bis 14). Ramabhadran et al. (15) beschrieben zuerst die Transfektion mit und anschließende Expression von cDNA der humanen α-Untereinheit in Mauszellen. Seitdem wurde von verschiedenen Gruppen eine erfolgreiche Expression von dimeren Glycoproteinhormonen durch Transfektion von gezüchteten Säugetierzellen berichtet. Einige dieser Gruppen (16, 17) wendeten cDNA- Klone an , während andere (14, 18, 19) intronhaltige cDNA oder genomische Sequenzen verwendeten.
WO 85/01958 beschreibt die Verwendung von cDNA-Klonen (ohne Introns), um Gonadotropine in gezüchteten Säugetierzellen zu erzeugen. Während diese Expressionssysteme biologisch aktive Moleküle liefern, ist die Ausbeute der transformierten Säugetierzellen im Allgemeinen geringer als beschrieben.
Es ist ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, verbesserte Expressionssysteme bereitzustellen, die z. B. für Gonadotropine nützlich sind, die zu höherer Ausbeute führen.
Matzuk und Boime (18a) erwähnen, dass ein Intron, das in den die cDNA für menschliche α-Untereinheit codierenden Bereich insertiert wurde, die Expressionsergebnisse verbesserte im Vergleich zur Verwendung von cDNA-Klonen, lieferten aber keine Daten, um diese Vermutung zu stützen, oder eine spezifische Beschreibung ihrer Methoden. In einer kürzlich erschienenen Veröffentlichung berichteten Kaetzel und Nilson (7) relativ hohe Pegel von Rinder-LH-Expression in CHO-Zellen. Ihr System wendete genomische Sequenzen für die Expression sowohl der α- als auch LHβ-Untereinheiten an. Die Wirkung genomischer Sequenzen im Vergleich zu cDNA-Sequenzen auf die LH-Expression wurde in dieser Veröffentlichung jedoch nicht angesprochen.
Es ist noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung, die Konfusion, die im vorliegenden Stand der Technik vorhanden ist, zu überwinden und die kritische Lehre bereitzustellen, die notwendig ist, um verbesserte Vektoren, die dimere Glycoproteine codieren, abzuleiten und Produktionsmethoden unter Verwendung solcher Vektoren.
Introns wurden mit einer verbesserten mRNA-Anreicherung in Gewebekulturzellen für β-Globin vom Kaninchen (1, 2, 20), E. coli-gpt (20) und Maus-DHFR (20, 21) verbunden. Beispiele für Gene, die Introns mit Enhancer-Elementen enthalten, die die Transkription erhöhen, sind Immunglobulingene (3 bis 5), das Cytochrom-c-Gen der Ratte (22) und das humane pro-α1(I)-Kollagengen (23). Es wurde auch gezeigt, dass Introns zu einer erhöhten Transkriptionseffizienz bei transgenen Mäusen für die folgenden Gene führen: Rattenwachstumshormon, Metallothionein I von der Maus und Human-β-Globin (24). Introns haben jedoch keine Wirkung auf die Expression dieser letzten drei Gene, wenn sie in gezüchtete Säugetierzellen transfiziert werden.
Es wurde gezeigt, dass Expressionspegel durch verschiedene 3'-untranslatierte und Polyadenylierungsregionen beeinflusst werden können (24, 25). Z. B. entstehen höhere Expressionspegel eines galK-Markergens, wenn die Polyadenylierungsregion von Rinderwachstumshormon verwendet wird für die Termination der Transkription statt dem frühen SV40 oder den Polyadenylierungsregionen von humanem Kollagen (24).
Gemäß den verschiedenen Prinzipien und Aspekten der vorliegenden Erfindung werden neue Methoden bereitgestellt, die die Verwendung von genomischen Sequenzen der α-Untereinheit oder α-Untereinheit-cDNA-Konstruktionen mit zugefügtem Intron anwenden, die signifikant und überraschend die dimere Glycoproteinhormonproduktion in Säugetierzellen verbessern. Diese Erkenntnis erleichtert die Entwicklung von Verfahren zur Erzeugung von dimeren Glycoproteinhormonen in hoher Ausbeute, die die gemeinsame α-Untereinheit teilen. Dies schließt Choriongonadotropin (CG), Follikel stimulierendes Hormon (FSH) und luteinisierendes Hormon (LH) ein.
Bevorzugte Ausführungsformen und Beispiele der vorliegenden Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, worin:
1A und B die Strategie zeigt, die verwendet wurde, um menschliches α-Gen zur Expression in Gewebekulturzellen gentechnisch herzustellen, Wichtige Restruktionsendonuclea sestellen sind angezeigt. Gefüllte Kästchen zeigen α-Gen-Exons; dicke durchgezogene Linien α-Genintrons; dünne durchgezogene Linien pBR322- oder pUC18-Vektor und Zickzacklinien pUC18-Polylinkerregionen.
2 den Grundexpressionsvektor CLH3AXSV2[DHFR, ODC oder TPA] zeigt, der für stabile oder vorübergehende Transfektionen verwendet wurde. Die Position der XhoI-Stelle, die zur Insertion von Sequenzen der α- oder β-Untereinheit verwendet wird, ist gezeigt.
Eine doppelte durchgezogene Linie bedeutet Sequenzen, die für die Säugetierzellexpression notwendig sind. Die relativen Positionen von Promotor, Polyadenylierung und Markergenregionen sind angezeigt. Die einzelne durchgezogene Linie zeigt die von pBR322 stammende pML-1-Region, die in E. coli zur Vermehrung und Selektion (durch Ampicillinresistenz) notwendig ist.
3: Teil A zeigt das TSH β-Gen in voller Länge. Die Positionen der drei Exons (I, II und III), von zwei Introns (a, b), des Start-ATGs und des Stoppcodons (TAA) sind gezeigt. Die PvuII-Stellen, die verwendet wurden, um das Fragment zu isolieren, aus dem die Teilkonstruktionen abgeleitet waren, sind auch gezeigt. Schraffierte Kästchen zeigen nicht codierende Exonsequenzen. Teil B zeigt die teilgenomischen Konstruktionen, die verwendet wurden, um die TSH β-mRNA-Ansammlung in vorübergehend transfizierten COS-7-Zellen zu vergleichen. TSH β 0,9 besteht aus zwei codierenden Exons, die durch endogene IVS getrennt sind, wobei alle Sequenzen stromaufwärts des Start-ATGs und stromabwärts von TAA entfernt sind (Sequenz in Tabelle 9 gezeigt). TSH β 1.2 und TSH β 2.0 enthalten zusätzlich etwa 300 Basenpaare von Intron a und wurden konstruiert, indem ein synthetischer Spleiß-Donor
zugefügt wurde, um ein Spleißen des trunkierten Introns zuzulassen. TSH β 2.0 behielt das endogene Polyadeny lierungssignal (Δ) und etwa 0,8 kb der zusätzlichen 3'flankierenden Sequenz.
4: beschreibt CLH3AXSV2DHFR. Dieser Vektor wurde aus den folgenden Komponenten konstruiert: (i) der Transkriptionseinheit für Dehydrofolatreduktase (DHFR) (Nucleotide Nr. 1 bis 1925 von 4), die aus dem Promotor der frühen Region von SV40 (33, 34), dem Maus-DHFR-Gen (REFS) und dem kleinen T-Intron von SV40 und den Polyadenylierungssignalsequenzen der frühen Region (33, 34) besteht; (ii) den bakteriellen Plasmidvektorsequenzen von pML (Nucleotide Nr. 2201 bis 4542 von 4), abgeleitet aus dem pBR322-Vektor (29), aus dem eine Sequenz mit 1370 Basenpaaren entfernt wurde (32) und (iii) dem Metallothioneinpromotor (Nucleotide Nr. 4542 bis 7514 von 4) abgeleitet aus dem Mausmetallothionein-1-Gen (30, 31), aus dem die Introns und Polyadenylierungssignalsequenzen entfernt wurden und (iv) den Polyadenylierungssignalsequenzen der frühen Region von SV40 (Nucleotide Nr. 7514 bis 7751 von 4) (33, 34). Die tPA-Analoga wurden in den Vektor insertiert als SaII-Fragment an der einzigen XhoI-Stelle. Die Orientierung des Inserts bezogen auf den Promotor und die Polyadenylierungssequenzen wurde durch Restriktionsenzymanalyse bestimmt.
Beispiel 1
Plasmidkonstruktionen für die Expression der gemeinsamen α- und FSH β-Untereinheiten
A. Der vollständige genomische Klon für die humane α-Untereinheit kann geeigneterweise aus einer Anzahl von Quellen erhalten werden als 17-Kilobasenpaar (kb) EcoRI-Insert in pBR322. Da gezeigt wurde, dass der α-Promotor gewebespezifisch ist und wahrscheinlich nicht effizient in Gewebekulturzellen funktionieren würde, die allgemein für heterologe Genexpression verwendet werden, wurden Schritte unternommen, um alle 5'-flankierenden Sequenzen zu entfernen. Die Gegenwart von internen EcoRI-Stellen erforderte verschiedene Subklonierungsschritte vor dem Zusammenbau der zugeschnittenen genomischen Sequenz. Die gentechnische Strategie, die vorteilhafterweise verwendet wurde, ist schematisch in 1 dargestellt. Zwei pUC18-Subklone wurden konstruiert, der erste mit dem 8,0-kb-BamHI-SacI-5'-Stück (pUCbs8.0), und der zweite mit dem 3'-2,7-kb-SacI-EcoRI-Stück (pUCse2.7). Um ein Ende zu erzeugen, das mit den XhoI-Klonierungsstellen in unseren Expressionsvektoren kompatibel war, wurde pUCse2.7 mit EcoRI verdaut, die Enden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment von E. coli-DNA-Polymerase I glatt gemacht und dann SalI-Linker in einer Ligierungsreaktion angehängt. Ein nachfolgender Verdau der Reaktionsmischung mit SalI-Restriktionsendonuclease lieferte ein 2,7-kb-Human-α-SalI-Stück zusätzlich zu dem 2,6-kb-Vektorfragment. Das 2,7-kb-Human-α-SalI-Stück wurde auf Gel gereinigt und wieder in die SalI-Stelle von pUC18 (pUCss2.7) insertiert. Ein Klon wurde ausgewählt, der das SalI-Insert in der Orientierung enthielt, die die Isolierung des 2,7-kb-α-Fragments als SacI-Stück zuließ. Dieses wurde auf einem Gel gereinigt und dann in die SacI-Stelle von pUCbs8.0 insertiert, um die vollständige codierende Sequenz des Human-α-Gens als 11-kb-Insert in pUC18 zusammenzusetzen. Das Insert könnte als SalI-Fragment mit Hilfe einer bereits bestehenden SalI-Stelle in dem pUC18-Polylinker am 5'-Ende des Gens und der umgewandelten SalI-Stelle (aus EcoRI) am 3'-Ende des Gens herausgeschnitten werden. Die fertige genomische α-Expressionskonstruktion, im Folgenden als "genomische α-Sequenz voller Länge" bezeichnet, enthielt einen Teil von Exon I (ohne die ersten 35 Nucleotide, die die 5'-untranslatierte Region der mRNA aufweisen), die gesamten Exons II, III und IV ebenso wie die dazwischenliegenden Sequenzen und ungefähr 2 Kilobasenpaare (kb) 3'-flankierende Sequenz. Diese wurde in die XhoI-Stelle des CLH3AXSV2DHFR-Expressionsvektors (2) so insertiert, dass die Transkription durch den Metallothionein-I-(MT-I)-Promotor der Maus gesteuert wurde. Der Expressionsvektor enthielt auch das Mausdihydrofolatreduktase-(DHFR)-Gen als selektierbaren und amplifizierbaren Marker.
B. Die cDNA der menschlichen α-Untereinheit wurde gentechnisch zur Expression erzeugt durch Verdau des Klons voller Länge mit NcoI, was das Start-ATG überspannt, und HindIII, das die 3'-untranslatierte Region 215 Basenpaare (bp) stromabwärts des TAA-Stoppcodons spaltet. Eine 5'-SalI-Stelle und Kozak-Konsensussequenz (27) wurde vorgesehen durch synthetische Oligonucleotide und eine 3'-SalI-Stelle, indem Linker, wie oben beschrieben, angefügt wurden. Die DNA-Sequenz des rekombinanten cDNA-Klons für die α-Untereinheit, der ungefähr 600 Basenpaare lang ist, ist in Tabelle 7 gezeigt. Dieser wurde in die XhoI-Stelle des CLH3AXSV2DHFR-Expressionsvektors (2) insertiert. Die endogene 5'-untranslatierte Region und das 3'-Polyadenylierungssignal wurden aus dem cDNA-Klon bei dem Verfahren der Rekombination entfernt und daher durch Vektorsequenzen geliefert: der MT-I-Promotor bzw. das frühe Polyadenylierungssignal von Simian-Virus 40 (SV40).
C. Der in dieser Untersuchung verwendete genomische Klon für Human-FSH β war ein 2,0-kb-DdeI-Sau3A-Segment, das die Protein codierende Region von Exon II zusätzlich zu 40 bp der Sequenz stromaufwärts des Start-ATGs, die Protein codierende Region von Exon III und das 1,6-kb-Intron enthielt, das die zwei Exons trennt (Tabelle 7). Die 5'-DdeI- und die 3'-Sau3A-Stellen wurden vorher in EcoRI- bzw. BamHI-Stellen umgewandelt und waren daher nicht mit den vorliegenden Expressionsvektoren kompatibel. Der Teil-FSH β-Genomklon wurde daher mit SalI-Enden versehen, indem wie oben beschrieben glatt gemacht wurde und im Handel verfügbare SalI-Linker angehängt wurden. Das SalI-Stück wurde dann in die XhoI-Stelle von CLH3AXSV20DC (2) insertiert, einen Expressionsvektor, der CLH3AXSV2DHFR strukturell ähnlich ist, außer dass die DHFR codierende Region ersetzt wurde durch die für Mausornithindecarboxylase (ODC).
Beispiel 2
Vergleich von genomischen α- und cDNA-α-CLH3AXSV2DHFR-Transkriptionseinheiten voller Länge in stabilen Transfektionen
Die genomischen α- und cDNAa-CLH3AXSV2DHFR-Konstruktionen wurden verglichen durch Co-Transfektion jedes α-Expressionsplasmids mit dem Human-FSHβ-CLH3AXSV20DC-Expressionsplasmid und Messung der FSH-Dimerproduktion.
A. 24 Stunden, bevor die Transfektionen erfolgten, wurden 100-mm-Schalen mit 7 × 10⁵ DUKX CHO-Zellen (DHFR-minus) geimpft. Calciumphosphatniederschläge wurden erhalten durch Zugabe von 31 μl 2 molar (M) CaCl₂ zu der Plasmid-DNA, die in 500 μl Transfektionspuffer [14 millimolar (mM) NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na₂HPO₄, 5,5 mM Dextrose und 20 mM HEPES (pH 7,5)] suspendiert war. Plasmid-DNA-Mengen, die verwendet wurden, waren α (cDNA oder genomisch): 10 μg und FSHβ: 30 μg. Die Niederschläge wurden sich 45 Minuten lang bei Raumtemperatur bilden gelassen. Das Kulturmedium wurde von den Zellen entfernt und durch den DNA-Niederschlag ersetzt. Nachdem die Zellen 20 Minuten bei Raumtemperatur absetzen gelassen worden waren, wurden 5 ml Kulturmedium zu jeder Schale zugegeben und die Inkubation 4 Stunden lang bei 37°C fortgesetzt. Die Zellen wurden dann 3,5 Minuten lang in 15% Glycerin bei 37°C geschockt. Nach 48-stündiger Inkubation bei 37°C in Kulturmedium wurden die Zellen 1 : 10 aufgeteilt und Selektionsmedium, das 0,02 Methotrexat (MTX) enthielt, wurde zugegeben. Das verwendete Selektionsmedium war α-minus modifiziertes Eagle's Medium, das mit 10% dialysiertem fötalen Rinderserum und 1% L-Glutamin ergänzt war. 10 bis 14 Tage später waren Foci sichtbar und wurden in 24-Napfplatten überführt. Kulturmedien davon wurden auf FSH-Dimerexpression untersucht unter Verwendung eines spezifischen auf monoklonalen Antikörpern basierenden Radioimmunoassays (Serono Diagnostics, Randolph, MA). Positive Klone wurden in T-25-Kolben in Selektionsmedium überführt, das eine erhöhte MTX-Konzentration von 0,1 μM enthielt. Als die Kulturen zusammenfließend wurden, wurden die Medien wiederum auf FSH-Dimer untersucht und die Zellen wurden gezählt, um Expressionspegel in Picogramm pro Zelle pro 24 Stunden zu berechnen.
B. Human-FSH-Dimersekretionspegel, die in sieben statistisch ausgewählten Klonen gemessen wurden von jeder der Human-αgenomischen/FSHβ- und Human-α-cDNA/FSHβ-Co-Transfektionen, sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Die Ergebnisse zeigen, dass die FSH-Dimerexpression stark verstärkt wird in Zellen, die mit einer Sequenz für die genomische α-Untereinheit voller Länge transfiziert sind. Die durchschnittlichen Expressionspegel zeigen, dass die überraschend hohe Größenordnung der Verbesserung, die in diesem speziellen Versuch gesehen wurde, annähernd 30-fach war.
C. Um weiter die Überlegenheit der voll genomischen α-Sequenz zu zeigen, wurden stabile Zelllinien mit dem CLH3AXSV2DHFR-Expressionsvektor transfiziert, der entweder Human-α-cDNA oder Human-α-Genomklon enthielt. Expressionsraten der freien α-Untereinheit wurden verglichen. In allen Fällen war die Expression von Human-α-Untereinheit, was durch empfindlichen und spezifischen Radioimmunoassay bestimmt wurde, nie größer als 0,05 pg/Zelle/24 h für cDNAhaltige Zelllinien. Wie im Detail in Tabelle 2 angegeben, exprimierten Zellen, die mit dem genomischen α-Klon transfiziert waren, 5- bis 20-mal höhere Pegel des Proteins:
Tabelle 2
Beispiel 3
Thyreotropin-Konstruktionen
Um die Effektivität und breite Anwendung der Erfindung zu zeigen, wurden stabil transfizierte CHO-Zelllinien hergestellt durch Co-Transfektion der Sequenz für humanes genomisches α voller Länge in CLH3AXSV2DHFR mit einem Teil der genomischen Sequenz des TSH β in CLH3AXSV20DC. Das genomische Teilfragment von TSH β, das in diesem Versuch verwendet wurde, bestand aus den Protein codierenden Regionen von Exon II und III und dem 0,5-kb-Intron, das die zwei Exons trennt (Tabelle 9). Alle 5'- und 3'-Regionen, die die Protein codieren de Sequenz von TSH β flankieren, wurden in dieser speziellen Konstruktion entfernt. Nach Co-Transfektion mit den zwei Expressionsvektoren wurden stabile Zelllinien gezüchtet und auf ihre Fähigkeit, TSH zu exprimieren, analysiert. Die Expressionspeget des Dimers, was mit einem empfindlichen und spezifischen Radioimmunoassay bestimmt wurde, sind in Tabelle 3 aufgeführt. Frühere Untersuchungen der Transfektion der cDNA für die α-Untereinheit mit dem genomischen TSHβ-Klon hatten gezeigt, dass Expressionspegel gewöhnlich unterhalb der Empfindlichkeit des Radioimmunoassays lagen, gewöhnlich weniger als 0,02 pg/Zelle/24 h.
Tabelle 3
Die TSH-Produktion kann dann, wie die FSH-Produktion, stark verstärkt werden durch Verwendung einer vollständigen genomischen α-Sequenz statt der α-cDNA-Sequenz bei Säugetierzelltransfektionen. In diesem Versuch war der Bereich der TSH-Produktionsverbesserung 6- bis 100-fach.
Beispiel 4
Introns und Expressionsverstärkung
Eine Human-α-Genomkonstruktion unterschied sich von der humanen α-cDNA-Konstruktion nicht nur darin, dass sie Introns enthielt, sondern auch darin, dass sie eine endogene 5' untranslatierte Sequenz, das endogene Polyadenylierungssignal, und zusätzliche 3'-flankierende Sequenzen enthielt. Daher kann man aus den Ergebnissen der vorherigen Versuche nicht ableiten, welche genomischen Regionen zu der verstärkten Expression beitrugen.
A. Um zu bestimmen, ob die Introns innerhalb der genomischen α-Sequenz für die erhöhten Anteile an α-Untereinheit verantwortlich waren, wurde ein 2-kb-XbaI-PstI-Teil des menschlichen α-Introns A zwischen die MT-I 5'-untranslatierte Region der Maus und die α-cDNA-Sequenz in dem CLH3AXSV2TPA-Vektor insertiert (2). Das trunkierte Intron behielt den endogenen Spleiß-Akzeptor, aber der Spleiß-Donor wurde durch ein synthetisches Oligonucleotid geliefert.
B. Ein weiteres Plasmid wurde konstruiert, um die Wirkung eines heterologen Introns auf die Expression der α-Untereinheit zu testen. Bei dieser Konstruktion wurde ein 130-bp-Intron aus dem MOPC41-Immunglobulin-κ-Gen (5) zwischen die 5'-untranslatierte Region von Maus-MT-I und die α-cDNA-Sequenz insertiert. Es waren keine Transkriptions-Enhancer-Elemente in dieser speziellen zwischengeschalteten Sequenz enthalten.
C. Die intronhaltigen α-cDNA-Konstrukte wurden mit dem ursprünglichen α-cDNA-Konstrukt und der genomischen α-Sequenz voller Länge verglichen durch vorübergehende Transfektion von COS-7-Zellen mit der Plasmid-DNA und Analyse der mRNA-Pegel durch Northern Blotting. Bei diesem Versuch diente die cDNA des Gewebeplasminogenaktivators (tPA) als innerer Standard und wurde verwendet, um Variationen der Transfektionseffizienz verschiedener Plasmidkonstruktionen zu korrigieren und dadurch die gemessenen Pegel für die mRNA der α-Untereinheit zu normalisieren. Die Transfektionen erfolgten jeweils doppelt unter Verwendung des DEAE-Dextranprotokolls von Seed und Aruffo (28). Zwei Tage nach der Transfektion wurde die gesam te zelluläre RNA aus den Zellen isoliert. Die RNA (5 μg) wurde auf Formaldehydgelen fraktioniert und dann auf Nylonmembranen überführt unter Verwendung von Standard-Northern-Blotting-Techniken. Die Membranen wurden dann entweder mit einer ³²P-markierten Human-α- oder ³²P-markierten tPA-Sonde hybridisiert und die entstehenden Signale wurden quantitativ ausgewertet an einem Betascope Modell 603-Blotanalysegerät (Betagen Corp., Waltham, MA). Normalisierte α-mRNA-Werte für die relativen Vergleiche wurden berechnet, indem die Anzahl der α-Zählimpulse durch die Anzahl der tPA-Zählimpulse dividiert wurde und dann für die für doppelte Proben erhaltenen Zahlen der Durchschnitt gebildet wurde. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Die Ergebnisse zeigten, dass die cDNA-Konstruktionen, die entweder Human-α-Intron (Nr. 2) oder das Immunglobulinintron (Nr. 3) enthielten, effizienter waren als die genomische Sequenz voller Länge (Nr. 1) bei der Ansammlung von mRNA der α-Untereinheit. Spezifisch waren die normalisierten Pegel für die mRNA der α-Untereinheit 7- bis 21-fach höher als die, die durch das cDNA-Konstrukt (Nr. 4) ohne ein Intron er zeugt wurden. Es wurde daher unerwarteterweise gefunden, dass Introns und nicht die 5'- oder 3'-Regionen, die die das Protein der α-Untereinheit codierende Sequenz flankieren, hauptsächlich für die erhöhten Expressionspegel verantwortlich sind und dass die Wirkung zumindest teilweise auf einer erhöhten Ansammlung von mRNA der α-Untereinheit beruht.
Beispiel 5
Expressionsverstärkung nicht aufgrund erhöhter Transkriptionsraten
Nucleare Runoff-Transkriptionsassays wurden verwendet, um zu bestimmen, ob der hohe Pegel der durch genomisches α induzierten mRNA-Ansammlung auf einer erhöhten Transkriptionsrate beruhte. Eine vorübergehende Transfektion von COS-7-Zellen mit α-genomischen und α-cDNA-haltigen CLH3AXSV2TPA-Plasmiden erfolgte, wie in Beispiel 4 beschrieben. Es wurden Standardmethoden zur Herstellung der Nuclei bzw. Kerne und für den Runoff-Transkriptionsassay (Current Protocols in Molecular Biology; F. M. Ausubel et al., Herausgeber; John Wiley & Sons, NY, NY) verwendet. Die DNA-Sonden für α, DHFR und tPA waren auf einem Gel gereinigte Insertsequenzen und es wurden jeweils ungefähr 0,25 μg Slot-geblottet im Doppelversuch auf Nitrocellulosemembranen. Die Membranen wurden mit [³²P-UTP] markierter nuclearer Runoff-RNA hybridisiert, die aus COS-7-Zellen hergestellt worden war, die ohne DNA (Blindversuch), dem Human-α-Genomklon voller Länge in CLH3AXSV2TPA oder dem Human-α-cDNA-Klon in CLH3AXSV2TPA transfiziert worden waren. Das Hybridisierungssignal wurde auf einem Betascope Modell 603-Blotanalysegerät quantitativ ausgewertet (Betagen Corp., Waltham, MA). Es wurden normalisierte Werte für die Transkriptionsrate erhalten, indem die durchschnittlichen α-Zählimpulse durch die durchschnittlichen tPA-Zählimpulse dividiert wurden. Die Affen-DHFR-Kern-Runoff-RNA sollte nicht mit der Maus-DHFR-DNA-Sondensequenz hybridisieren unter den für diesen Versuch verwendeten Bedingungen und dient daher als negative Kontrolle. Die Ergebnisse für die relative Transkriptionsrate sind in Tabelle 5 unten zusammengefasst.
Tabelle 5 Kern-Runoff-RNA
In diesem speziellen Versuch war die Runoff-Transkriptionsrate der α-cDNA (0,12) überraschend höher als die der genomischen α-Sequenz (0,07). Eine erhöhte Transkriptionsrate ist daher nicht der Mechanismus, mit dem die genomische α-Sequenz höhere Expressionsgrade der α-Untereinheit erzeugt.
Beispiel 6
Expression der TSHβ-Untereinheit ist intronabhängig
A. Das genomische TSHβ-Gen voller Länge (14a) ist schematisch in Tabelle 3, Teil A, dargestellt. Die Positionen der drei Exons (I, II und III), zwei Introns (a, b), von Start-ATG und Stoppcodon (TAA) sind gezeigt. Die PvuII-Stellen wurden durch ungefähr 2 kb einer DNA-Sequenz getrennt, die Exons II und III einschloss und die vollständige Protein codierende Se quenz für TSHβ enthielt. Die Konstruktionen mit einem Teil des TSHβ-Genoms, die in dieser Untersuchung verwendet wurden, stammten von dem 2-kb-PvuII-Fragment und sind schematisch in Tabelle 3B dargestellt. TSHβ 0,9 (0,9 kb) war das gleiche Konstrukt, das in stabilen Transfektionen in Beispiel 1 verwendet wurde und bestand aus den zwei codierenden Exons, getrennt durch die endogene dazwischengeschaltete Sequenz, wobei alle Sequenzen stromaufwärts des Start-ATGs und stromabwärts des TPA entfernt waren. TSHβ 1.2 (1,2 kb) und TSHβ 2.0 (2,0 kb) enthielten zusätzlich etwa 300 Basenpaare von Intron A und waren konstruiert, indem ein synthetischer Spleiß-Donor zugefügt wurde, um ein Spleißen am trunkierten Intron zuzulassen. TSHβ 2.0 behielt das endogene Polyadenylierungssignal und etwa 0,8 kb der zusätzlichen 3'-flankierenden Sequenz.
B. Doppelte Kulturen (A, B) von COS-7-Zellen wurden transfiziert unter Verwendung des in Beispiel 4 beschriebenen Protokolls mit CLH3AXSV2DHFR-Plasmiden, die eines der folgenden anteiligen genomischen Fragmente enthielten: (1) TSHβ 0.9, (2) TSHβ 1.2 oder (3) TSHβ 2.0. Die Gene wurden in die XhoI-Klonierungsstelle so insertiert, dass die Transkription durch den MT-I-Promotor gestartet würde und im Fall von TSHβ 0.9 und TSHβ 1.2 durch das frühe Polyadenylierungssignal von SV40 beendet würde. Nach 48 Stunden Inkubation wurde die gesamte zelluläre RNA aus den Zellen isoliert. Die RNA (9 μg) wurde auf Formaldehydgelen fraktioniert und dann auf Nylonmembranen überführt unter Verwendung von Standard-Northern-Blotting-Techniken. Die Membranen wurden entweder mit einer ³²Pmarkierten Maus-MT-I-Sonde (um TSHβ-mRNA nachzuweisen, die auch etwa 50 Basenpaare MT-I 5'-untranslatierte Sequenz enthält) oder einer ³²P-markierten DHFR-Sonde (um die Transfektionseffizienz zu vergleichen) hybridisiert. Die entstehenden Signale wurden auf einem Betascope Modell 603-Blotanalysegerät quantitativ ausgewertet (Betagen Corp., Waltham, MA). Normalisierte TSHβ-mRNA-Werte für die relativen Vergleiche wurden berechnet, indem die MT-I-Zählrate durch die DHFR- Zählrate dividiert wurde. Für normalisierte Werte, die durch doppelte Transfektionen erhalten wurden, wurde dann der Durchschnitt gebildet und sie wurden durch die Anzahl, die für TSHβ 0.9 erhalten worden war, dividiert. Die Vergleichsergebnisse, die für die Ansammlung von mRNA erhalten wurden, sind in Tabelle 6 zusammengefasst.
Tabelle 6
C. Die Ergebnisse zeigten, dass die zwei Konstrukte, die einen Teil des ersten Introns behielten (TSH β 1.2 und TSH 2.0) eine 5- bis 60-fach höhere mRNA-Ansammlung lieferten als das Konstrukt, das keine Sequenzen aus dem ersten Intron enthielt. Daher ist die TSH β-Genexpression, wie die Expression des Gens der α-Untereinheit intronabhängig. Von Interesse war die unerwartete Beobachtung, dass Intron B, das in allen Konstrukten vorhanden war und in der Protein codierenden Region war, keine optimale Verstärkung beitrug. Dies deutet entweder darauf hin, dass es spezifische Sequenzen im ersten Intron des TSH β-Gens gibt, die die mRNA-Ansammlung erhöhten, oder, wahrscheinlicher, dass die Position des Introns (nahe dem 5'-Ende der mRNA) der kritische Faktor ist. Dass die intronabhängige Genexpression beeinflusst werden kann durch Anordnung des Introns in der Transkriptionseinheit wird gestützt durch vorherige Versuche mit menschlicher α-cDNA. Die Insertion des κ-Immunoglobulingenintrons in die 3'-untranslatierte Region der mRNA zwischen die α-cDNA und die SV40-Polyadenylierungsregion führte nicht zu einer erhöhten mRNA-Ansammlung verglichen mit nicht veränderter α-cDNA.
D. Da TSH β 1.2 10-fach höhere Mengen an mRNA lieferte als TSH β 2.0, ist es wahrscheinlich, dass das endogene Polyadenylierungssignal und die 3'-flankierende Sequenz, die auf TSH β 2.0 vorhanden ist, nicht für eine effiziente mRNA-Bildung erforderlich sind und tatsächlich schädlich sein können. Alternativ kann die Disparität der mRNA-Ansammlung zwischen TSH β 1.2 und TSH β 2.0 mit den verschiedenen Abständen zwischen MT-I-Promotor und SV40-frühem Promotor (der DHFR treibt) in den zwei Plasmidkonstruktionen zusammenhängen. Die größere Nähe (0,8 kb) der zwei Promotoren in der TSH β-1.2-Konstruktion könnte eine verbesserte Wechselwirkung zwischen den SV40-Enhancer-Elementen und dem MT-I-Promotor zulassen, wodurch die Transkriptionsrate von letzterem erhöht würde.
Wegen der Ähnlichkeit von α- und TSH β-Genstruktur bei verschiedenen Säugetieren wird erwartet, dass die vorliegenden Erkenntnisse auf Basis der menschlichen α-Untereinheit und TSH β-Untereinheit in gleicher Weise auf die von anderen Arten zutreffen, wie Rind, Pferd, Schwein, Pavian und Affe. In gleicher Weise können Gene für die LH β- und FSH β-Untereinheit eine Abhängigkeit von der genomischen DNA-Struktur für eine optimale Expression zeigen und diese Erfordernisse sollten über die Arten zutreffen.
Die Konstruktion von Expressionsvektoren wird vorteilhafterweise vereinfacht durch Anwendung des Wissens, dass bestimmte genomische Regionen, wie Introns, für die mRNA-Ansammlung bzw. m-RNA-Anreicherung wichtig sind und dass die Position dieser Regionen in der Transkriptionseinheit wichtig sein kann. Diese genomischen Regionen können z. B. subkloniert oder synthetisiert werden und in Konstruktionen mit den cDNA- Sequenzen für α- und β-Untereinheit enthalten sein. Die cDNA-Klone können oft leichter erhalten werden und gentechnisch bearbeitet werden als die viel größeren genomischen Klone. Daher wird diese Erkenntnis die Entwicklung von Zelllinien vereinfachen, die hohe Pegel an Hormon produzieren und schließlich die Produktion dieser Proteine in großem Maßstab bei geringen Kosten zulassen. Diese und weitere Aspekte und Variationen der vorliegenden Erfindung werden nun für den Fachmann auf diesem Gebiet leicht ersichtlich und liegen nicht außerhalb der Idee oder des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung.
Literaturstellen
1. D. H. Hamer und P. Leder (1979), Cell 17, 737–747
2. D. H. Hamer und P. Leder (1979), Cell 18, 1299–1302
3. J. Banerji et al. (1983), Cell 33, 729–740
4. S. D. Gillies et al. (1983), Cell 33, 717–728
5. C. Queen und D. Baltimore (1983), Cell 33, 741–748
6. M. K. Gross et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7, 4576–4581
7. D. M. Kaetzel und J. H. Nilson (1988), J. Biol. Chem. 263, 6344–6351
8. J. C. Fiddes und H. M. Goodman (1981), J. Mol. Appl. Genetics 1, 3–18
9. R. G. Goodwin et al. (1983), Nucl. Acids Res. 11, 6873-6882
10. J. Virgin et al. (1985), J. Biol. Chem. 260, 7072–7077
11. K. Talmadge et al. (1984), Nature 307, 37–40
12. K. E. Kim et al. (1988), DNA 7, 227–233
13. P. C. Watkins et al. (1987), DNA 6, 205–212
14. F. E. Wondisford et al. (1988), Mol. Endo. 2, 32–39
14a. F. E. Wondisford et al. (1988), J. Biol. Chem. 263, 12538–12542
15. T. V. Ramabhadran et al. (1984), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6701–6705
16. V. B. Reddy et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3644–3648
17. S. Watanabe et al. (1987), Biochem. Biophys. Res. Comm. 149, 1149–1155
18. M. M. Matzuk et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 6354–6358
18a. M. Matzuk und I. Boime (1988), J. Cell Biol. 106, 1049-1059
19. D. M. Kaetzel et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7280–7283
20. A. R. Buchman und P. Berg (1988), Mol. Cell. Biol. 8, 4395–4405
21. F. Lee et al. (1981), Nature 294, 228–232
22. M. J. Evans und R.C. Scarpulla (1988), Mol. Cell. Biol. 8, 35–41
23. C. M. S. Rossouw et al. (1987), J. Biol. Chem. 262, 15151-15157
24. R. L. Brinster et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 836–840
25. D. S. Pfarr et al. (1986), DNA 5, 115–122
26. J. Ross und G. Kobs (1986), J. Mol. Biol. 188, 579–593
27. M. Kozak (1984), Nucl. Acids Res. 12, 857–872
28. B. Seed und A. Aruffo (1987), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3365–3365
29. F. Bolivar, R. L. Rodriguez, P. J. Green, M. C. Betlach, H. L. Heynecker, H. W. Boyer, G. F. Crosa und S. Falkow (1977) , Gene 2: 95
30. N. Glanville, D. M. Durnham und R. D. Palmiter (1981), Nature 292: 267–269
31. D. H. Hamer und M. Walling (1982), J. Mol. Appl. Gen. 1: 273–288
32. M. Lusky und M. Botchan (1981), Nature 283: 79–81
33. V. B. Reddy, B. Thimmapaya, R. Dhar, K. N. Subramanian, B. S. Zain, J. Pan, P. K. Ghosh, M. L. Celma und S. M. Weissman (1978), Science 200: 494
34. J. Tooze (Herausgeber), DNA Tumor Viruses; Molecular Biology of Tumor Viruses; 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, New York 1981.
35. T.-R. Chiang und L. McConlogue (1988), Mol. Cell. Biol. 8: 764–769
Wenn nicht anders angegeben, sind alle verwendeten Verfahren und Techniken so wie berichtet und im Stand der Technik üblich, wie z. B. in Maniatis et al., A Cloning Manual, Cold Spring Harbor (1982) beschrieben. Alle oben oder in der Beschreibung zitierten Literaturstellen sind vollständig durch Bezugnahme miteingeschlossen.
Tabelle 7 (SEQ ID Nr. 1)
Gentechnische erzeugte cDNA-Sequenz der α-Untereinheit. Restriktionsendonucleasestellen und Kozak-Konsensusbereich, die durch synthetische Oligonucleotide geliefert wurden, sind gezeigt. Die Aminosäuresequenz der α-Untereinheit ist auch gezeigt.
Tabelle 8 (SEQ ID Nr. 2)
Gentechnisch erzeugte genomische Teilsequenz der Human-FSHβ-Untereinheit. Die Positionen der endständigen SalI-Stellen sind gezeigt. Nucleotide im unteren Bereich am 3'-Ende entstehen durch Anbindung der synthetischen Linker. Die Aminosäuresequenz für FSHβ markiert die codierenden Regionen der Exons II und III. Die gepunktete Linie zeigt eine uncharakterisierte dazwischenliegende Sequenz (IVS).
Tabelle 9 (SEQ ID Nr. 3)
Gentechnisch erzeugte genomische Teilsequenz der TSHβ-Untereinheit. SalI-Stellen und Kozak-Konsensussequenz, die durch synthetische Oligonucleotide beigetragen werden, sind gezeigt. Die Aminosäuresequenz von TSH β markiert die codierenden Regionen der Exons II und III.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung eines heteropolymeren dimeren Proteins ausgewählt aus luteinisierendem Hormon, follikelstimulierendem Hormon oder Choriongonadotropin, wobei das Verfahren die Stufen umfasst: a) dass mindestens ein Vektor mit einem Promotor, einem Strukturgen, das mindestens einen Teil der β-Untereinheit des Proteins und gegebenenfalls auch mindestens einen Teil der α-Untereinheit und eine terminierende Sequenz kodiert, bereitgestellt wird; wobei das Strukturgen ein Intron aufweist in einer Sequenz, die mindestens einen Teil der β-Untereinheit des Proteins kodiert und auch ein Intron aufweist, das 5' zur kodierenden Region für den mindestens einen Teil der α-Untereinheit des Proteins angeordnet ist (wenn DNA, die mindestens einen Teil der α-Untereinheit des Proteins kodiert, in dem Vektor vorhanden ist); b)wenn der Vektor nicht mindestens einen Teil der α-Untereinheit kodiert, ein zweiter Vektor bereitgestellt wird, der die α-Untereinheit oder einen Teil davon kodiert und ein Intron aufweist, das 5' zur kodierenden Region für die α-Untereinheit oder einen Teil davon angeordnet ist; c) Wirtszellen mit dem Vektor/den Vektoren transformiert wird/werden, um dadurch stabil transfizierte Zellen zu bilden und d) die transformierten Zellen unter solchen Bedingungen gezüchtet werden, unter denen das Protein erzeugt wird; mit dem Vorbehalt, dass das Protein nicht luteinisierendes Hormon vom Rind ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Vektor eine cDNA-Sequenz aufweist, die die α-Untereinheit kodiert.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die α-Untereinheit die in Tabelle 7 angegebene Sequenz aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei die β-Untereinheit Teil eines zweiten Vektors ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, wobei die cDNA, die die α-Untereinheit kodiert, eine Vielzahl von Introns, 3'- und 5'-flankierende Regionen, eine endogene 5'- untranslatierte Sequenz und ein Polyadenylierungssignal aufweist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Vektor genomische DNA aufweist, die die α-Untereinheit kodiert, und genomische DNA, die die β-Untereinheit kodiert.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei ein Teil der β-Untereinheit von FSH die in Tabelle 8 gezeigte Sequenz hat.