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DE69103406T2 - Verfahren und zusammensetzungen zur hemmung der bräunung von nahrungsmitteln. - Google Patents

Verfahren und zusammensetzungen zur hemmung der bräunung von nahrungsmitteln.

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DE69103406T2
DE69103406T2 DE69103406T DE69103406T DE69103406T2 DE 69103406 T2 DE69103406 T2 DE 69103406T2 DE 69103406 T DE69103406 T DE 69103406T DE 69103406 T DE69103406 T DE 69103406T DE 69103406 T2 DE69103406 T2 DE 69103406T2
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formula
browning
resorcinol
derivative
foods
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Akiva Newton Ma 02167 Gross
Radha Belmont Ma 02178 Iyengar
Arthur J. Weston Ma 02193 Mcevily
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Opta Food Ingredients Inc
Original Assignee
Opta Food Ingredients Inc
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Description

    Hintergrund:
  • Die Bräunung von Nahrungsmitteln ist ein größeres Problem in der Nahrungsmittel- und Getränkeindustrie. Die Bräunung oder die oxidative Dunkelung kann das Resultat der Einwirkung eines Enzyms wie Polyphenoloxidase (PPO) oder das Resultat von nicht enzymatischen chemischen Reaktionen, beispielsweise der Polymerisation von phenolischen Verbindungen sein, die in einigen Nahrungsmitteln vorhanden sind. Hohe PPO-Aktivität ist in Nahrungsmitteln vorhanden, die der Bräunung zugänglich sind, beispielsweise Krabben, Bananen und Pilzen. Die Bräunung verursacht schädliche Veränderungen im Aussehen und in der Textur der Nahrungsmittel und Getränke. Sowohl die enzymatische als auch die nicht enzymatische Bräunung stellen ernste Probleme für die Nahrungsmittelindustrie dar und führen dazu, daß Millionen Pfund Nahrungsmittel pro Jahr weggeworfen werden.
  • Die enzymatische Bräunung insbesondere ist Gegenstand umfangreicher Forschung gewesen, insbesondere im Hinblick auf das verursachende Mittel für die Krabbenmelanosis, die gekennzeichnet ist durch die Bildung von schwarzen Flecken auf Krabben. Faulkner et al., Advanced Food Research, 19: 302 - 310 (1953). Die enzymatische Bräunung ist das Ergebnis der PPO-katalysierten Oxidation von Mono- und Diphenolen zu o- Chinonen, welche spontan unter Bildung dunkelgefärbter, hochmolekularer Polymere polymerisieren, was zu der charakteristischen Bräunung oder Bildung der schwarzen Flecke führt.
  • Es sind verschiedene Methoden entwickelt worden, um Bräunung zu verhindern, einschließlich der Hitzeinaktivierung von PPO und verschiedenen chemischen Behandlungen, wie der Veränderung des PH-Wertes von Nahrungsmitteln. Die Hitzeinaktivierung ist nicht für frische Nahrungsmittel, wie Früchte und eßbare Seetiere geeignet, da die hohen Temperaturen, die für die Inaktivierung des PPO notwendig sind, die Qualität und Textur der Nahrungsmittel verändern. In gleicher Weise führt die Verminderung des pH-Wertes durch Zugabe einer Säure (beispielsweise Zitronensäure oder Phosphorsäure) zu schädlicher Beeinträchtigung des Aussehens und der Qualität von einigen Nahrungsmitteln.
  • Die Steuerung der PPO-katalysierten enzymatischen Bräunung in Pilzen unter Verwendung von Zitronensäure wurde von McCord und Kilara in dem Journal of Food Science, 48, 1479 - 1483 (1983) beschrieben. Die Verhinderung der Polyphenoloxidaseaktivität in einem Extrakt aus Jerusalem Artischocken unter Verwendung verschiedener Sulfitverbindungen, wurde von Zawistowski et al. in Can. Inst. Food Sci. Tech. J., 20(3), 162 - 164 (1987) beschrieben. Die Verwendung von Zimtsäure, p-Cumarinsäure und Ferulasäure zur Steuerung der enzymatischen Bräunung in Fruchtsäf ten wurde von J. R. L. Walker in Food Technology, 11, 341 - 345 (1976) beschrieben. T. C. Wong et al.berichten in Plant. Physiol., 48, 24 - 30 (1971), daß Phloroglucinol und Resorcinol sowie ihre Derivate, D-Catechin und Orcinol mit 4-Methyl-o-chinon reagieren, welches durch PPO in Pfirsichen gebildet wird, obgleich diese Verbindungen keine Substrate für PPO darstellen. R. Kuttner und H. Wagreich berichten in Arch. Biochem. Biophys. 43, 80 - 87 (1952), daß Pilz-PPO (Catecholase) durch Benzoesäure und ausgewählte Benzoesäurederivate unterdrückt wird. Keines dieser Verfahren hat sich indessen aufgrund der Kosten, des Mangels an Verfügbarkeit oder der schlechten Leistung als völlig zufriedenstellend erwiesen.
  • Labuza beschreibt in Cereal Foods World, 34(4), 353 (1989) die Verwendung von Proteasen insbesondere Ficin bei der Steuerung der enzymatischen Bräunung verschiedener Nahrungsmittel. Der Autor schreibt diesen Effekt der Einwirkung der Protease auf das PPO zu.
  • Ein anderes Verfahren zur Verringerung der Bräunung, welches in der Nahrungsmittelindustrie vorherrschend ist, besteht in der Zugabe von Sulfitsalzen zu Nahrungsmitteln und Getränken. Einige Formen dieser enzymatischen Bräunung wie der Krabbenmelanosis werden in traditioneller Weise dadurch behandelt, daß die Krabbe oder das andere Nahrungsmittel in eine Sulfitlösung wie Natriumbisulfit eingetaucht oder damit behandelt werden. Sulfite werden ebenfalls Weinen zur Verhinderung der Oxidation zugesetzt. Die Sulfite reduzieren o-Chinone zu den Mono- und/oder Diphenolen und verhindern dadurch die Bräunungsreaktion. Die Verwendung von Sulfit in Nahrungsmitteln ist indessen beschränkt worden aufgrund der nachteiligen gesundheitlichen Wirkungen auf gewisse Individuen und sie kann weiter beschränkt oder gar vollständig eliminiert werden.
  • Dumbroff et al. (WO&sub8;8/02602) beschreiben ein Verfahren zur Verhinderung der Ehylenproduktion und der Lipoxygenese in Früchten, Pflanzenkost und Blumen unter Verwendung phenolischer Verbinddungen.
  • Sagi et al (Acta Allimentaria, 12, 143 - 148, 1983) untersuchten den Gehalt an 5-Alkylresorcinolen in Kleie, Weizengries und Mehlfraktionen. Sie stellten eine negative Korrelation zwischen Pastabraun und Getreidekorn in bezug auf 5-Alkylresorcinol fest.
    • Zusammenfassung der Erfindung:
  • Die Erfindung bezieht sich auf Verbindungen und Verfahren zur Verhinderung der oxidative Bräunung von Nahrungsmitteln und Getränken, insbesondere der enzymatischen Bräunung, die durch PPO-Aktivität verursacht wird. Die Verbindungen sind Resorcinolderivate mit der allgemeinen Formel: Formel I
  • worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: H, CH&sub3;, COR', CR', PO&sub3;R'R'' und 50&sub3;R'R'', worin R' und R'' unabhängig voneinander H oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen linearer, verzweigter oder zyklischer Konfiguration darstellen oder eine substituierte aromatische Verbindung; und R&sub3; ein organischer oder anorganischer Substituent ist, der so ausgewählt ist, daß die erhaltene Verbindung Hemmaktivität besitzt. Beispielsweise kann R&sub3; ein Heteroatom oder eine Gruppe darstellen, die ein Heteroatom aufweist, eine gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe, eine substituierte aromatsiche Verbindung oder eine organische funktionelle Gruppe, die so ausgewählt ist, daß die Verbindung Hemmaktivität besitzt. Das Heteroatom kann beispielsweise Sauerstoff (O), Stickstoff (N), Schwefel (S), Phosphor (P) oder Halogene, wie Chlor (Cl), Brom (Br), Iod (J) oder Fluor (F), umfassen. Die gesättigte oderungesättigte Alkylgruppe kann 1 bis 30 Kohlenstoffatome in linearer, verzweigter oder zyklischer Konfiguration aufweisen.
  • Die Alyklsubstituenten oder die organischen funktionellen Gruppen können ein Heteroatom oder Heteroatome, beispielsweise Sauerstoff (O), Stickstoff (N), Schwefel (S), Phosphor (P) oder Halogene, wie Chlor (Cl), Brom (Br), Iod (J) oder Fluor enthalten. 4-Alkyl-resorcinolverbindungen sind besonders wirksam zur Verhinderung der Melanosis in den meisten Nahrungsmitteln.
  • Beispielsweise ist 4-Hexylresorcinol (worin R&sub1; und R&sub2; beide H und R&sub3; C&sub6;H&sub1;&sub3; ist), welches die folgende Formel aufweist:
  • hochwirksam für diesen Zweck.
  • In einer Ausführungsform hat R&sub3; die allgemeine Struktur:
  • worin n 1 oder 2 ist und Z ein Alkyl oder eine andere organische funktionelle Gruppe ist, die so ausgewählt ist, daß die Verbindung Hemmaktivität besitzt. Z kann ein Alkylsubstituent sein, der wenigstens ein Heteroatom, wie Stickstoff (N), Sauerstoff (O), Schwefel (S) oder Phosphor (P) oder Halogene, wie Chlor (Cl), Brom (Br), Iod (J) oder Fluor (F) enthält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist Z ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: OH, NH&sub2;, O(CH&sub2;)xCH&sub3;, NHCO&sub2;(CH&sub2;)xCH&sub3;, NH(CH&sub2;)xCH&sub3;, Aminosäuren, Polyaminmetaboliten, wie NH (CH&sub2;)xNH&sub2;; NH(CH&sub2;)xNH(CH&sub2;)yNH&sub2;; NH(CH&sub2;)xNHR&sub4;; und NH(CH&sub2;)xNH(CH&sub2;)yNHR&sub4;, worin x und y unabhängig voneinander sind und eine beliebige ganze Zahl von 0 bis 5 darstellen und höhere Polyaminoligomere oder substituierte Oligomere aus wenigstens 3 Monomeren bestehend, worin das Monomer ein 1,α-Diaminoalkan und R&sub4; die folgende Formel aufweist:
  • worin n, R&sub1; und R&sub2; die vorstehend gegebene Definition besitzen. Verbindungen, die besonders wirksame Inhibitoren für die oxidative Bräunung darstellen, sind Resorcinolderivate mit der allgemeinen Formel:
  • worin n 1 oder 2 ist und R&sub1; und R&sub2; sowie Z die vorstehend gegebene Definition besitzen.
  • Besonders brauchbare Resorcinolderivate für die Inhibierung der enzymatischen Bräunung werden erhalten, wenn n gleich 2, R&sub1; und R&sub2; beide H und Z OH, NH(CH&sub2;)&sub4;NH&sub2;, NH(CH&sub2;)&sub4;NHR&sub4; (d.h. worin x gleich 4 und R&sub4; die vor stehend gegebene Definition besitzt) oder NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;NHR&sub4; ist (worin x gleich 4, y gleich 3 und R&sub4; die vorstehend gegebene Definition besitzt). Diese Verbindungen sind als Formelbilder IV, V, VI und VII entsprechend dargestellt.
  • Die durch die allgemeine Formel I repräsentierten substituierten Resorcinole umfassen eine Klasse von Verbindugen, die zur Hemmung der Bräunung von Nahrungsmitteln in hohem Maße wirksam sind. 4-Hexylresorcinol, welches eine kommerziell erhältliche Verbindung darstellt, ist für diesen Zweck besonders wirksam. Von den Derivaten, die durch die Formel III repräsentiert werden, wurden 3 Verbindungen aus einer natürlichen Quelle isoliert und ihre Strukturen zweifelsfrei durch analytische organisch-chemische Standardverfahren bestimmt, speziell ¹H und ¹³C NMR und massenspektrographische Verfahren. Diese 3 spezifischen Derivate hatten Strukturen, die durch die Formel IV, V, und VII wiedergegeben werden. Die Formeln V, VI und VII repräsentieren Polyaminderivate, die bisher noch nicht isoliert und/oder charakterisiert worden sind, während die Formel IV ein Resorcinolderivat darstellt, welches bisher noch nicht in der Natur aufgefunden wurde.
  • Die Verfahren zur Herstellung von Antibräunungszusammensetzungen, welche die Resorcinolderivate enthalten, sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Gewisse Resorcinolderivate können durch Synthese hergestellt oder aus natürlichen Quellen, wie Pflanzen isoliert werden. Gemäß einer Ausführungsform werden die Derivate aus der Homogenität einer botanischen Quelle isoliert und gereinigt, beisPielsweise aus Feigen-Latex durch die Stufen der Wasserextraktion, der Ultrafiltration, der Ionenaustauschchromatographie und reversiblen Phasen HPLC.
  • Ein Verfahren zur Hemmung der Bräunung von Nahrungsmitteln unter Verwendung der vorliegenden Erfindung wird beschrieben. In diesem Verfahren werden die Nahrungsmittel, die der Bräunung unterliegen, einschließlich beispielsweise gewisser Schellfische, Schalentiere, Früchte, Gemüse, Getränke, wie Fruchtsäfte und Weine, mit einer Zusammensetzung behandelt, die eine solche Menge der vorliegenden Resorcinolderivate aufweisen, daß sie ausreicht, um die Bräunungsreaktion zu unterbinden.
  • Die vorliegenden Resorcinolderivate, die durch die allgemeine Formel I und III und speziell durch die Formeln II und IV repräsentiert werden und die Resorcinol-Polyaminderivate, die durch die Formeln V, VI und VII dargestellt werden, sind sehr wirksam in ihrer Hemmwirkung in bezug auf Bräunung von Nahrungsmitteln. Die vorliegende Zusammensetzungen und die Verfahren sind wesentlich wirksamer als rohe Latexpräparationen und Natriumbisulfit in bezug auf die Hemmung der oxidativen Bräunung. Kleinere Mengen der vorliegenden Zusammensetzungen werden benötigt, um Bräunung in den meisten Nahrungsmitteln in dem Maße zu unterbinden wie Natriumbisulfit, welches zur Zeit benutzt wird, um den gleichen Hemmgehalt zu erreichen. Die vorliegenden Verbindungen ergeben eine wirksame Behandlung zur Hemmung oder Verhinderung der Bräunung in ausgewählten Nahrungsmitteln und Getränken, ohne daß das Aussehen, der Geschmak, die Textur oder die Qualität der Nahrungsmittel oder Getränke nachteilig beeinflußt wird.
    • Kurze Beschreibung der Figuren
  • Figur 1 ist eine graphische Darstellung, in der die Wirkungen von Natriumbisulfit und verschiedenen Konzentrationen eines YM5-Extraktes (F100) auf die Bildung von Melanosis in Krabben verglichen wird.
  • Figur 2 ist eine graphische Darstellung, in der die Wirkungen von Natriumbisulfit mit verschiedenen Konzentrationen von Ficin und einem YM5-Extrakt (F100) auf die Bildung von Melanosis auf Krabben verglichen wird.
  • Figur 3 ist eine graphische Darstellung, in der die Wirkungen von Natriumbisulfit, einem YM5-Extrakt (1 Gew.-%) und der Verbindung der Formel V (0,1 Gew.-%) auf die Bildung von Melanosis auf Krabben verglichen werden.
  • Figur 4 ist eine graphische Darstellung, in der die Wirkungen von Natriumbisulfit und verschiedenen Konzentrationen der Verbindung der Formel V auf die Bildung von Melanosis auf Krabben verglichen wird.
  • Figur 5 ist eine schematische Darstellung , welche die Synthesestufen für die Verbindungen der Formel V und der Formel VII zeigt.
  • Figur 6 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkungen verschiedener Konzentrationen der Verb indungen gemäß Formel V auf die Bildung von Melanosis auffrischen rosa Krabben vergleicht, das heißt Krabben, die vor der Behandlung nicht gefroren waren.
  • Figur 7 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung von fehlendem Spülen und einer Nachbehandlung mit Seewasserspülen auf die Hemmwirkung von Krabben-Melanosis durch 0,025% der Verbindung der Formel V vergleicht.
  • Figur 8 ist eine graphische Darstellung, welche die Hemmung der Krabben-Melanosis durch Seewasser oder Frischwasserlösung mit 0,01% der Verbindung gemäß Formel V vergleicht.
  • Figur 9 ist eine graphische Darstellung, die die Hemmung der Krabben-Melanosis durch wiederholtes Eintauchen verschiedener ein Pfund Chargen von unbehandelten Krabben in die gleiche ein Liter Menge mit 0,01% der Verbindung der Formel V-Lösung in Seewasser vergleicht.
  • Figur 10 ist eine graphische Darstellung, welche die Wirkung von Natriuinbisulfit, Seewasser und verschiedenen Konzentrationen der Verbindung gemäß Formel II auf die Bildung von Melanosis in rosaroten Krabben vergleicht.
  • Figur 11 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von Natriumbisulfit, Seewasser und verschiedenen Konzentrationen der Verbindung nach Formel II auf die Bildung von Melanosis in rosaroten Krabben vergleicht.
  • Figur 12 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von Natriumbisulfit, Seewasser und verschiedenen Konzentrationen der Verbindung nach Formel IV auf die Bildung von Melanosis in rosaroten Krabben vergleicht.
  • Figur 13 ist eine graphische Darstellung, die die Wirkung von Natriumbisulfit, Seewasser und verschiedenen Konzentrationen der Verbindung nach Formel V auf die Bildung von Melanosis in Texas-braunen Krabben vergleicht.
    • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, daß eine Klasse von Resorcinolderivaten, von denen einige in natürlichen Pflanzen auftreten, die Braunfärbung von Nahrungsmitteln verhindert. Die vorliegenden Verbindungen sind Resorcinolderivate, welche die allgemeine Formel, wie sie in der Formel I gezeigt ist, aufweisen:
  • worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, CH&sub3;, COR', CR', PO&sub3;R'R'' und 50&sub3;R'R'', worin R' und R'' unabhängig Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit etwa 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen in einer linearen, verzweigten oder zyklischen Konfiguration oder einer substituierten aromatischen Verbindung darstellen, R&sub3; kann ein Heteroatom oder eine Gruppe sein, welche ein Heteroatom enthält, oder eine gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe, eine substituierte aromatische Verbindung oder eine organische funktionelle Gruppe, ausgewählt in der Weise, daß die Verbindung Hemm- Aktivität aufweist, sein. Das Heteroatom kann beispielsweise Sauerstoff (O), Stickstoff (N), Schwefel (S), Phosphor (P), Halogen wie Chlor (Cl), Brom (Br) oder Fluor (F) umfassen. Die gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe kann 1 bis 30 Kohlenstoffatome in einer linearen, verzweigten oder zyklischen Konfiguration oder einer substituierten aromatischen Verbindung aufweisen. Die Alkylsubstituenten oder die organische funktionelle Gruppe kann ein Heteroatom oder Heteroatome, beispielsweise Sauerstoff (O), Stickstoff (N), Schwefel (S), Phosphor (P) oder ein Halogen wie Chlor (Cl), Brom (Br), Jod (J) oder Fluor (F) enthalten.
  • Alkyl-Resorcinolverbindungen sind besonders wirksam zur Hemmung von Melanosis in den meisten Nahrungsmitteln. Beispielsweise ist 4-Hexylresorcinol, welches die folgende Formel aufweist:
  • sehr wirkungsvoll für diesen Zweck.
  • In einer Ausführungsform R&sub3; hat die allgemeine Struktur nachfolgende Formel
  • worin n 1 oder 2 ist und Z ein Alkyl oder eine organische funktionelle Gruppe ist, ausgewählt in der Weise, daß die Verbindung Hemm-Aktivität besitzt. Z kann ein Alkylsubstituent sein, der wenigsteins ein Heteroatom enthält, beispielsweise Stickstoff (N), Sauerstoff (O), Schwefel (S) und Phosphor (P) oder Halogen wie Chlor (Cl), Brom (Br), Jod (J) oder Fluor (F). In einer bevorzugten Ausführungsform ist Z ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: OH, NH&sub2;, O(CH&sub2;)xCH&sub3;, NHCO&sub2;(CH&sub2;)xCH&sub3;, NH(CH&sub2;)xCH&sub3;, Aminosäuren (wie Lysin, Ornithin, Serin oder Cystein); ein Polyaminmetabolit wie NH(CH&sub2;)xNH&sub2;, NH(CH&sub2;)xNH(CH&sub2;)yNH&sub2;, NH(CH&sub2;)xNHR&sub4; und NH(CH&sub2;)xNH(CH&sub2;)yNHR&sub4;, worin x und y eine ganze Zahl von 0 bis 5 sein können und Polyamin-Oligomere oder substituierte Polyamin-Oligomere, bestehend aus wenigstens drei Monomeren, worin das Monomer ein 1,ω-Diaminoalkan ist und R&sub4; die folgende Formel aufweist:
  • worin n, R&sub1; und R&sub2; die vorstehend gegebene Definition besitzen.
  • Verbindungen, die ebenfalls sehr wirksame Hemmittel für die oxidative Bräunung darstellen, sind Resorcinolderivate mit der folgenden allgemeinen Formel:
  • worin n 1 oder 2 ist und R&sub1;, R&sub2; und Z die vorstehend gegebene Definition besitzen.
  • Besonders brauchbare Resorcinolderivate für die Hemmung der enzymatischen Bräunung werden erhalten, wenn n=2, R&sub1; und R&sub2; H und Z gleich OH, NH(CH&sub2;)&sub4;NH&sub2;, NH(CH&sub2;)&sub4;NHR&sub4; (x=4 und R&sub4; die oben gegebene Definition besitzt) oder NH(CH&sub2;)&sub4;NH(CH&sub2;)&sub3;- NHR&sub4; (x=4, y=3 und R&sub4;die vorstehend gegebene Definition besitzt). Diese Verbindungen haben die Formeln, wie sie nachfolgend als IV, V, VI bzw. VII aufgeführt sind:
  • Die Erfindung umfaßt funktionelle Äquivalente dieser Formeln (Formeln I-VII). Die Bezeichnung "funktionelle Äquivalente" bedeutet chemische Derivate oder Analoge der Verbindungen, die ähnliche Antibräunungsaktivität aufweisen.In der vorliegenden Anmeldung bedeutet ein "Derivat" eines anderen Moleküls, wenn dasselbe zusätzliche oder unterschiedliche chemische Anteile enthält, die nicht normalerweise Teil des Moleküls sind.
  • Die Analysen der Strukturen der Formeln V, VI und VII ergeben, daß die Resorcinol-Anteile durch eine Amidbindung an Diaminobutan (V und VI) und bzw. Spermidin (III) gebunden sind. Das Diamin-Diaminobutan und das Polyamin-Spermidin sind Aminosäuren, die von aliphatischen stickstoffhaltigen Verbindungen abgeleitet sind und in der Pflanzen-und Tierwelt weit verbreitet sind. Flores, H.E., Protacio, C.M. und Signs, M.W. (1989) in Pflanzen-Stickstoff-Metabolismen. In: Recent Advances in Phytochemistry, Band 23 (E.E. Conn, Ed.) Plenum Press, New York. Die Hydroxyzinnsäureamid-Derivate (HCA) von Diaminobutan: p- Cumaryldiaminobutan, Ferulyldiaminobutan, Caffeoyldiaminobutan und Di-p- cumaryldiaminobutan; und von Spermidin: p-cumarylspermidin, haben sich in 13 Familien höherer Pflanzen gefunden (Martin-Tanguy, J. (1985) Plant Growth Regul. 3, 381-400) und es wird angenommen, daß sie mit der Pflanzenentwicklung befaßt sind. Die HCA-Verbindungen sind in ihrer Struktur den Formeln V, VI und VII eng verwandt. Obgleich umfangreiche Forschungsarbeiten auf HCA- Verbindungen gerichtet waren, so finden sich doch in der Literatur keine Hinweise auf die Anwesenheit von Verbindungen der Formeln V, VI und VII. Die Formeln V und VII sind daher neue natürlich vorkommende Polyaminderivate. Die Verbindung der Formel VI wurde bisher in der Natur noch nicht gefunden, und sie stellt weiterhin auch ein bisher unbekanntes Polyaminderivat dar. Neben ihrer Wirksamkeit als Hemmstoff für die PPO-katalysierte Melanosis stellen die durch die Formeln V, VI und VII repräsentierten Verbindungen eine neue Klasse von Polyaminderivaten dar, deren Verteilung, Metabolismus und physiologische Wirkungen unbekannt sind.
  • Die in den Formeln IV, V und VII gezeigten Moleküle können aus Pflanzen gereinigt werden. Die Präparationen aus verschiedenen botanischen Quellen sind wirksame Hemmstoffe für gewisse enzymatische Reaktionen. Beispielsweise Latex, welches Von dem Feigenbaum abgeleitet ist, Ficus sp. (F.sp.) enthält eine Protease, Ficin. P.T. Englund und andere, Biochemistry, 7:163 (1963). Extrakte, die Ficin enthalten und aus dem Feigen-Latex hergestellt worden sind, haben sich als wirksame Hemmittel für die enzymatische Bräunung erwiesen. Labuza und andere, Cereal Foods World, 34(4) :353 (1989). Die Ficin-Behandlung ist jedoch schädlich für die Textur und die Qualität der Nahrungsmittel, weil die proteolytische Aktivität des Ficin Protein in den Nahrungsmitteln abbaut. So kann beispielsweise ein im Handel erhältlicher Latex- Extrakt, der aus Fig-Latex hergestellt worden ist, als Ausgangsmaterial verwendet werden. Feigen-Latex-Extrakte enthalten Ficin und andere Verbindungen und werden als "rohes Ficin" oder "rohe Ficin-Extrakte" bezeichnet. Rohe Ficin-Extrakte sind als Quelle zur Erzielung der Formeln IV, V und VII brauchbar, weil diese Extrakte im Handel erhältlich sind. Rohe Ficin-Extrakte sind im allgemeinen in fester Form verfügbar als Pulver oder Tabletten. Die rohen Ficin-Präparate sind dadurch gekennzeichnet, daß die größere Protease-Komponente Ficin ist, ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 20000 Dalton . Die Anwesenheit von Ficin kann durch ein Verfahren nachgewiesen werden, welches Materialien auf der Basis des Molekulargewichtes trennt, wie beispielsweise Gelpermeations-Hochleistungschromatografie (GPC-HPLC), sowie durch die Ficin-katalysierte Hydrolyse von Benzoyl-L-Arginin- p-nitroanilid (L-BAPNA), welches ein empfindlicher Nachweis der Ficin-Aktivität ist. Ein Verfahren zur Erzielung der Formeln IV, V und der Formel VII aus rohem Latex oder einem rohen Latex-Extrakt wird in den Beispielen 2, 3 und bzw. 4 beschrieben.
  • Die Formel I stellt mehrere im Handel erhältliche Verbindungen dar, wie Alkylresorcinole, die für andere Anwendungen verwendet worden sind. Die Anmelder haben nun festgestellt, daß Verbindungen mit der Struktur, wie sie in Formel I beschrieben ist, wirksame Hemmstoffe für die oxidative Bräunung in zahlreichen Nahrungsmitteln sind, welche einer solchen Bräunung unterliegen. Zum Beispiel wurde 4-Hexylresorcinol mit der Formel II als eine Medikation verwendet und ist in dem Merck Index, 10.Auflage, Seite 681 beschrieben (Merck & Co., Inc., Rahway, NH (1983)).
  • Die Antibräunungsverbindungen, die durch die Formeln II und IV-VII repräsentiert werden, können durch synthetische Verfahren hergestellt werden.
  • In einer Ausführungsform wird die Verbindung der Formel V nach dem folgenden allgemeinen Verfahren synthetisiert, welches im einzelnen in Beispiel 5 beschrieben ist: 7-Hydroxycumarin wird zu 7-Hydroxydihydrocoumarin hydriert, gefolgt von der Reaktion mit einem Überschuß an Diaminobutan zur Erzielung der Verbindung der Formel V (2,4-Dihydroxyphenylpropionyldiaminobutan). Die synthetisierte Verbindung ist identisch mit der Verbindung, die aus dem rohen Ficin- Extrakt isoliert worden ist, was durch ¹H und ¹³C NMR Massenspektralanalyse, Elementaranalyse und TLC bestimmt wurde.
  • In einer anderen Ausführungsform können die Verbindungen der Formel V und VII nach dem folgenden allgemeinen Verfahren synthetisiert werden, welches schematisch in Figur 5 gezeigt ist: Resorcinol (1,3-Dihydroxybenzol) wird durch Behandlung mit einem Reagenz derivatisiert, was zu einer Addition eines C-Atoms an den aromatischen Ring führt, d.h. Gatterman- Reagenz (Zn(CN)&sub2;.HCl) oder Villsmeier-Reagenz (POCl&sub3;/DMF), um so eine Aldehydgruppe an den Ring zu addieren und dadurch 2,4-Dihydroxybenzaldehyd zu bilden. Diese Verbindung wird weiter mit Malonsäure (CH&sub2;(C00H)&sub2;) in einem basischen organischen Lösungsmittel wie Pyridin und Piperidin bei einer erhöhten Temperatur (beispielsweise etwa 100º bis 140ºC) umgesetzt, um 2,4-Dihydroxyzinnsäure zu ergeben. Die Doppelbindung in der Seitenkette von 2,4-Dihydroxyzinnsäure wird hydriert, beispielsweise unter Verwendung von Wasserstoff und Palladium, um 2,4-Dihydroxyphenylpropionsäure zu bilden. Die Reaktion dieser Verbindung mit einem Überschuß an Diaminobutan ergibt die Verbindung mit der Formel V (2,4-Dihydroxyphenylpropionyldiaminobutan), während die Reaktion mit Spermidin (im korrekten molaren Verhältnis) zu der Bisphenol-Verbindung mit der Formel VII führt (Bis-2,4-dihydroxyphenylpropionylspermidin).
  • Die vorliegenden Resorcinolderivate können verschiedenen Nahrungsmitteln und Getränken zugesetzt werden, um die Bräunung zu verhindern oder zu hemmen, insbesondere die enzymatische Bräunung. Die Bezeichnung "enzymatische Bräunung", wie sie in der vorliegenden Anmeldung verwendet wird, betrifft das oxidative Verdunkeln oder Verfärben, das aus der Bildung von o-Chinon und Chinonpolymeren resultiert und aus der Einwirkung von PPO bei der Bildung von Chinonen oder aus der Polymerisation von Chinonen und anderen Komponenten resultiert, was natürlicherweise in Nahrungsmitteln auftritt.
  • Zur Verhinderung der Bräunung werden Resorcinolderivate verwendet, um Nahrungsmittel oder Getränke in einer Menge oder Konzentration zu behandeln-die ausreicht, um die Bräunung zu verhindern oder zu hemmen. Die Art der Behandlung hängt von dem Nahrungsmittel oder dem Getränk ab, welches behandelt werden soll und von dem gewünschten Ergebnis und kann beispielsweise das Eintauchen, das Sprühen, das Bestäuben, das Anfeuchten, das Benetzen, das Mischen und/oder das Aufsaugen umfassen. Die Verbindungen können einem wäßrigen Verdünnungsmittel zugesetzt werden, beispielsweise Wasser, Salzwasser oder Pufferlösung und auf das Nahrungsmittel aufgebracht werden, oder sie können unverdünnt zugesetzt werden, beispielsweise dem Fruchtsaft. Die benötigte Menge hängt von der Zugänglichkeit des Nahrungsmittels oder Getränks der Bräunung, dem Zustand des Nahrungsmittels und den Lagerbedingungen ab Die Menge, die ausreicht, um das Braunwerden zu verhindern oder zu hemmen, kann von dem Fachmann auf dem Lebensmittelgebiet empirisch bestimmt werden.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden rosa Krabben mit einer wäßrigen Lösung der Verbindung der Formel II behandelt. Die Verbindung der Formel II wurde verwendet in Konzentrationen im Bereich von 0,0001 bis 0,005%, und die Krabben wurden verglichen mit anderen Krabben, die mit Natriumbisulfit und mit Seewasser behandelt worden waren. Die Ergebnisse sind in Figur 10 gezeigt. Die Seewasser behandelten Krabben entwickelten Melanose-Flecken innerhalb von 1 bis 2 Tagen. Die Verbindung nach Formel II war wirksamer auf Gewichtsbasis bezogen als Natriumbisulfit in Bezug auf die Hemmung der Bräunung bei Krabben. Beispielsweise war eine Lösung, die nur 0,005 Gew.-% Verbindung nach Formel II enthielt, praktisch so wirksam in der Hemmung von Krabben-Melanosis wie eine Lösung aus 1,25 Gew.-% Bisulfit. Eine Konzentration von bis zu etwa 0,1% Verbindung der Formel II kann zur Hemmung der Bräunung verwendet werden.
  • In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurden rosa Krabben mit einer wäßrigen Lösung der Verbindung nach Formel V behandelt, die wie hierin beschrieben hergestellt worden war. Die Verbindung der Formel V wurde in Konzentrationen verwendet, die von etwa 0,1 Gew.-% bis etwa 0,001 Gew.-% betrugen, und die Ergebnisse wurden mit Krabben verglichen, die mit Natriumbisulfit behandelt worden waren sowie mit unbehandelten Krabben. Die Ergebnisse sind in Figur 4 dargestellt. Die unbehandelte Krabbe entwickelte schnell schwarze Flecken (innerhalb von 1-2 Tagen). Die Verbindung nach Formel V war auf Gewichtsbasis wirksamer als Natriumbisulfit in Bezug auf die Hemmung der Bräunung bei Krabben. Beispielsweise war eine Lösung, die nur etwa 0,005 Gew.-% der Verbindung nach Formel V enthielt genau so wirksam in Bezug auf die Hemmung der Krabben-Melanosis wie eine Lösung aus 1,25 Gew.-% Natriumbisulfit. Eine Konzentration von nur 0,1 Gew.-% der vorliegenden Resorcinolderivate war praktisch besonders wirksam für diesen Zweck.
  • Die Zusammensetzungen und die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind brauchbar, um die Bräunung in zahlreichen Nahrungsmitteln und Getränken, die der Bräunung unterliegen, zu verhindern oder ganz wesentlich zu hemmen. Solche Nahrungsmittel und Getränke umfassen, ohne indessen darauf beschränkt zu sein, Krabben, Kartoffeln, Äpfel, Bananen, Salat, Pfirsiche, Wein und einige Fruchtsäfte. Die vorliegende Zusammensetzung bewirkt keinen Abbau der Nahrungsmittel, insbesondere der Krabben. Das Braunwerden wird "verhindert" wenn es völlig eliminiert wird. Das Braunwerden wird "wesentlich gehemmt", wenn die Bräunung mit einer wesentlich geringeren Rate, verglichen mit den unbehandelten Nahrungsmitteln in der gleichen Zeitspanne, stattfindet.
  • Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele weiter erläutert.
    • BEISPIELE Beispiel 1 Herstellung von YM5 Eluat durch Ultrafiltration von rohem Ficin
  • Eine 50 mg/ml Lösung aus rohem EDC Ficin (Enzeco Ficin, Enzyme Development Corp., (EDC) New York, NY) wurde in 50 mM Natriumphosphat hergestellt, PH 6,5 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Ein 5 ml aliquoter Anteil wurde mit einem 0,45 p Filter filtriert um so ein klares Filtrat zu ergeben. Ein unteraliquoter Anteil (2,5 ml) des Filtrats wurde der Ultrafiltration unterworfen unter Verwendung einer Amicon 5000 MWCO YM5 Membran (Amicon Corp., Danvers, MA). Das ultrafiltrierte Eluat wurde als "YM5 Eluat" bezeichnet. Das 0,45 p Filtrat und das YM5 ultrafiltrierte Material wurden durch Gel-Hochleistungspermeations-Flüssigchromatografie (GPC- HPLC) analysiert und es zeigte sich, daß das Material in dem verbleibenden Zeitbereich frei von Absorption bei 214 nm war, die dem Ficin entspricht. Es wurde ebenfalls keine Ficin- Aktivität in dem YM5-Eluat festgestellt unter Verwendung des chromophoren Substrats von Benzoyl-L-arginin-p-nitro-anilid (L-BAPNA).
  • Im Anschluß an die Ultrafiltration wurden das rohe Ficin, das O,45 u Filtrat und das YM5-Eluat auf die Hemmwirkung der Polyphenoloxidase (PPO) unter Verwendung des nachfolgend beschriebenen Modellsystems untersucht.
  • Das Untersuchungsmodell-System bestand aus den folgenden Reagenzien:
  • 50 mM Natriumphosphat, PH 6,5 (Sigma Chemical Co.);
  • 0,5 mM L-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA; Sigma Chemical Co.);
  • PPO (Pilze, Sigma Chemical Co.);
  • +/- variierende Konzentrationen des rohen EDC Ficin; und
  • YM5 Präparationen in einem Gesamtvolumen von 1 ml.
  • Diese Reagenzien wurden vereinigt und die Reaktionsrate durch Beobachtung der Veränderung in der optischen Dichte pro Minute (OD/min) bei 475 nm in einer Küvette mit 1 cm Pfadlänge unter Verwendung eines Perkin Elmer UV-VIS Spektrophotometers, welches auf 25ºC thermostatisiert war, bestimmt. Die Hemmung der PPO Aktivität wurde durch Variieren der Konzentration des rohen Ficin und der YM5 Präparate durch Zugabe variierender Mengen der Testlösungen zu einer Küvette, die PPO und Puffer- Lösungen enthielt, untersucht. Die Küvette wurde bei 25ºC 1 Minute lang vorinkubiert und die Reaktion durch Zugabe von L-DOPA in Gang gesetzt. Die PPO-Untersuchungen wurden in Abwesenheit und in Anwesenheit von jeder der Ficin-Präparationen und dem Ficin-freien YM5-Eluat durchgeführt. Alle drei Präparationen zeigten vergleichbare Hemmwirkungsgrade. Die Hemmwirkung der PPO-Aktivität konnte daher nicht auf die Wirkung von Ficin auf PPO zurückzuführen sein.
    • Beispiel 2 Reinigung von Melanosis-Inhibitor (Formel IV) aus rohem Ficin
  • Das rohe EDC-Ficin (50 g) wurde mit 400 ml Methanol extrahiert. Das überstehende Material wurde durch Rotationsverdampfung bis zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Feststoff wurde teilweise gereinigt durch Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC).
  • Die Umkehrphasen-HPLC ist eine Reinigungsmethode, die auf der Trennung der Moleküle gemäß ihrer Einwirkung auf eine hydrophobe stationäre Phase innerhalb der HPLC-Kolonne beruht, in dem Maße, wie die Hydrophobizität der mobilen Phase ansteigt.
  • In diesem Falle war die stationäre Phase (Säulenpackung) ein Harz, welches mit Octadecylgruppen (C&sub1;&sub8;) beschichtet war und die mobile Phase (das Lösungsmittel, welches durch die Kolonne floß) war 0,1 %ige Trifluoressigsäure (TFA) mit variierenden Mengen von Acetonitril. Das Reinigungsprotokoll wurde auf einer analytischen Skala entwickelt und dann der präparativen Skala angepaßt unter Verwendung eines Waters DeltaPrep HPLC-Systems. (Waters Associates Millipore Corp., Milford, MA).
  • Ein linearer Gradient der ansteigenden Acetonitrilkonzentration wurde entwickelt und die Verbindung mit etwa 20% Acetonitril eluiert. Die Peak-Inhibitorfraktion wurde gesammelt und weiter durch HPLC unter Verwendung einer Waters Delta Pak Säule gereinigt (15 u 7,8 x 30 cm). Das Eluat wurde bei 214 nm überwacht und die Fraktionen wurden untersucht, um die Anwesenheit des Inhibitors zu bestätigen. Die Peak-Fraktionen wurden dann gesammelt und konzentriert. Die Proben der Verbindung der Formel IV (isoliert wies vorstehend beschrieben oder synthetisiert) wurden nach verschiedenen analytischen Verfahrenstechniken analysiert: ¹H und ¹³C NMR sowie Massenspektral-Analyse ergaben Resultate, die mit der Struktur, welche der Verbindung der Formel IV zugeschrieben wurde übereinstimmten.
  • ¹H NMR (CD&sub3;CN) 300 MHz δ 6,89 (d, J=8Hz, 1H, C&sub6;), δ 6,27 (d, J=2,81 Hz, 1H, C&sub3;) , δ 6,24 (d von d, J=8,24, 2,59 Hz, 1H, C&sub5;) , δ 2,716 (t, J=7,4 Hz, 2H, C&sub8;), δ 2,515 (t, J=7,24 Hz, 2H, C&sub7;).
  • ¹³C NMR (CD&sub3;CN) 75,47 MHz (J-moduliertes Spin-Echoverfahren) δ 176,20 (C&sub9;), δ 157,35 (C&sub2;), δ 156,41 (C&sub4;), δ 131,69 (-ve Intensität, C&sub6;), δ 119,43 (C&sub1;), δ 107,83 (-ve Intensität, C&sub5;), δ 103,57 (-ve Intensität, C&sub3;), δ 34,83 (C&sub8;) , δ 25,50 (C&sub7;).
  • Massenspektren EI m/s M&spplus; 182, 164 (M&spplus; - H&sub2;O), 136, 123. Schnelles Atombombardement (FAB m/z M+H+ 183, 165 (M+-H&sub2;O).
    • Beispiel 3 Reinigung des Melanosis-Hemmstoffes (Formel V) aus rohem Ficin.
  • Das in Beispiel 1 erhaltene YM5-Eluat wurde durch Ionenaustausch-Chromatografie und RP-HPLC weiter gereinigt. Eine Lösung des YM5 Eluats, die wie in Beispiel 1 beschrieben in 2 mM Natriumphosphat (PH 6,5) erhalten worden war, wurde auf eine Säule von SP-Sephadexharz (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gegeben. Das an dem Harz nicht adsorbierte Material wurde durch Umpumpen von zwei Volumen von 2 mM Natriumphosphat (PH 6,5) durch die Säule ausgewaschen. Ein linearer Natriumchlorid-Gradient (0-0,2 M) wurde an die Säule angelegt, der als Funktion ihrer Stärke durch Wechselwirkung mit dem Harz die Moleküle eluierte und dabei eine Trennung der vorher adsorbierten Moleküle bewirkte. Das eluierte Material wurde auf seine Absorptionsfähigkeit bei 214 und 280 nm untersucht und in 20 ml Fraktionen gesammelt. Der gesamte Volumen-Gradient betrug zwei Liter. Die Fraktionen wurden auf die Anwesenheit des Hemmstoffes unter Verwendung des in Beispiel 1 beschriebenen Untersuchungssystem-Modells getestet. Bei der Analyse wurden fünf Peaks des Hemmstoffes festgestellt. Die Fraktionen unter diesen Peaks wurden gesammelt, eingefroren und lyophilisiert. Zwei Peaks mit der Bezeichnung Pool IV und Pool V erwiesen sich als die potentiellsten Hemmstoffe, basierend auf der prozentualen Hemmung in Bezug auf die Peakgröße und sie wurden für die weitere Reinigung mit RP-HPLC ausgewählt, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist.
  • Das lyophilisierte Material aus SP-Sephadex Pool IV wurde in der mobilen Phase aufgelöst, zentrifugiert zur Entfernung der Teilchenmaterialien und auf eine HPLC-Säule gegeben. Ein linearer Gradient der aufsteigenden Acetonitrilkonzentration wurde entwickelt und der Hemmstoff mit etwa 15 %igem Acetonitril eluiert. Das Eluat wurde bei 214 und 280 nm mit einem Mehrkanal-UV-Vis-Detektor überwacht und in gewissen Versuchsabläufen wurden die Fraktionen untersucht, um die Anwesenheit des Hemmstoffes zu bestätigen. Die Peak-Hemmstoff- Fraktionen wurden gesammelt, in einem SpeedVac konzentriert, gefroren und lyophilisiert. Die erneute Analyse durch RP-HPLC in einem TFA/Methanol-Gradientensystem zeigte bei dem gewonnenen Hemmstoff einen hohen Reinheitsgrad.
  • Der gereinigte Pool IV Hemmstoff wurde mit verschiedenen physikalischen Methoden und chemischen Tests analysiert. Ein UV-Vis-Spektrum des Hemmstoffes zeigte ein Absorptions-Maximum bei 280 nm, das typischerweise im Wellenlängenbereich einer aromatischen oder phenolischen Verbindung lag. Die Reaktion mit Bicinchonsäure und Ninhydrin zeigte die Anwesenheit einer Amidbindung bzw. eines primären Amins.
  • Es wurden Proben des Hemmstoffes nach verschiedenen analytischen Verfahrenstechniken analysiert: ¹H und ¹³C NMR und Massenspektralanalyse. Die Ergebnisse waren übereinstimmend mit der Struktur, die der Formel V zugeschrieben war:
  • ¹H MNR (CD&sub3;CN) 300 MHz δ 7,5-6,5 (breit, OH), δ 6,9-6,8 (b, CONH), δ 6,868 (d, J=8,1 Hz, 1H, C&sub6;), δ 6,304 (d,J=2,3 Hz, 1H, C&sub3;) δ 6,259 (d von d, J=2,4, 8,0 Hz, 1H C&sub5;), δ 5,5-4,8 (b, NH&sub2;), δ 3,115 (q, J=12,38, 6,23 Hz, 2H, C&sub1;&sub0;), δ 2,908 (b, 2H, C&sub1;&sub3;), δ 2,725 (t,J=6,8 Hz, 2H, C&sub8;), δ 2,439 (t, J=6,8 Hz, 2H, C&sub7;), δ 1,51, 1,46 (überlappende Multipletts, 4H, C&sub1;&sub1;, C&sub1;&sub2;).
  • ¹³C NMR (D&sub2;O) 75,47 MHz (J-moduliertes Spin-Echo-Verfahren) δ 176,68 (C=O), δ 155,74 (C&sub2;), δ 155,41 (C&sub4;), δ 132,O&sub9; (-ve Intensität, C&sub6;), δ 119,59 (C&sub1;), δ 107,97 (-ve Intensität, C&sub5;), δ 103,49 (-ve Intensität, C&sub3;), δ 39,81 (C&sub1;&sub3;) , δ 39,04 (C&sub1;&sub0;), δ 36,69 (C&sub8;) δ 26,33 (C&sub7;) δ 26,09 (C&sub1;&sub1;) , δ 24,69 (C&sub1;&sub2;).
  • Massen-Spektren DCI m/z M&spplus;H&spplus; 253, 165 (M-NH(CH&sub2;)&sub4;NH&sub2;) EI m/z M&spplus; 252, 164, (C&sub9;H&sub8;O&sub3;) 136, 123. Schnelles Atombombardement (FAB) m/z M&spplus;H&spplus; 253.
    • Beispiel 4 Reinigung des Melanosis-He=stoffes (Formel VII) aus rohem Ficin.
  • Das lyophilisierte Material, das nach dem in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren aus SP-Sephadex Pool V erhalten worden war, wurde weiter durch RP-HPLC gereinigt. Die Bedingungen für die Reinigung waren die gleichen, wie sie in Beispiel 2 verwendet wurden.Ein linearer Gradient der ansteigenden Acetonitril-Konzentration wurde entwickelt und die Verbindung mit der Formel VII bei etwa 30% Acetonitril eluiert. Das Eluat wurde bei 214 und 280 nm mit einem Mehrkanal-UV-Vis- Detektor überwacht und gewisse Probeläufe der Fraktionen wurden untersucht, um die Anwesenheit des durch die Formel VII repräsentierten Hemmstoffes zu bestätigen. Die Peak- Hemmstoff-Fraktionen wurden gesammelt und weiter durch HPLC unter Verwendung einer Waters Delta Pak Säule (15u, 7,8x30 cm) gereinigt. Das Eluat wurde dann bei 214 nm überwacht und die Fraktionen wurden untersucht, um die Anwesenheit des Hemmstoffes zu bestätigen. Die Peak-Fraktionen wurden gesammelt und konzentriert. Die erneute Analyse des RP-HPLC zeigte einen hohen Reinheitsgrad für den gewonnenen Hemmstoff.
  • Die Proben der Verbindung gemäß Formel VII wurden durch verschiedene analytische Verfahrenstechniken analysiert (¹H, Massenspektral-Analyse) und sie stimmten mit der zugeordneten Struktur überein:
  • ¹H NMR (CD&sub3;OD) 300 MHz δ 6,861, 6,845 (d, J=8,16 Hz, 2H, C&sub6;, C&sub2;&sub5;), δ 6,276 (überlappende Doubletts, J=2,56, 2H, C&sub3;, C&sub2;&sub2;), δ 6,208, 6,197 (überlappende d von d, J=8,1, 2,57 Hz, 2H, C&sub5;, C&sub2;&sub4;) , δ 3,241, 3,180 (Tripletts, J=6,30, 4H, C&sub1;&sub0;, C&sub1;&sub6;), δ 2,893 - 2,711 (gut aufgelöst, m, 8H, C&sub8;, C&sub1;&sub3;, C&sub1;&sub8;), δ 2,51, 2,44 (t, J=7,34, 4H, C&sub7;, C&sub1;&sub9;), δ 1,761 (Quintett, 2H,C&sub1;&sub5;), δ 1,601 - 1,604 (nicht aufgelöst m, 4H, C&sub1;&sub1;, C&sub1;&sub2;)
  • Massen-Spektren DCI m/z schwach 310 (M-C&sub9;H&sub8;O&sub3;), 165 (C&sub9;H&sub8;O&sub3;H&spplus;) 146 (C&sub7;H&sub1;&sub9;N&sub3;H&spplus;) EI (hohe Auflösung) m/z 309 (M-C&sub9;H&sub8;O&sub3;) , FAB m/z M H 474,310 (M-C&sub9;H&sub8;O&sub3;).
    • Beispiel 5 Synthese der Verbindung gemäß Formel V
  • Die durch Formel V repräsentierte Verbindung (2,4-Dihydroxy phenylpropionyldiaminobutan):
  • wurde nach dem folgenden Verfahren synthetisiert:
  • Eine Lösung aus 7-Hydroxycumarin (5,0 g, 0,031 Mol; Aldrich Chemical Company) in absolutem Ethanol (200 ml) wurde unter Druck in einer Parr-Apparatur über 10% Pd/C (Katalysator; 500 mg, 50% Wasser; Kodak, Inc., Rochester, NY) 24 Stunden lang bei 55ºC hydriert. Die Dünnschicht-Chromatografie (TLC; Silica-Gel: EtOAc/Hexan: 1:1) zeigte den vollständigen Verlauf der Reaktion. Die Reaktionsmischung wurde dann über einem Celite-Bett (Rohm und Haas Co., Philadelphia, PA) filtriert und im Vakuum verdampft, um das rohe Produkt (4,5 g) zu liefern. Ein Teil dieses Materials (2,5 g) wurde aus Toluol umkristallisiert und unter Vakuum getrocknet, um 7-Hydroxydihydrocumarin zu ergeben. Ausbeute: 1,83 g;
  • Schmelzpunkt 133º bis 135,5ºC.
  • ¹H NMR (CD&sub3;CN) 300 MHz δ 7,01 (d, J=8,3 Hz, 1H, C&sub5;), δ 6,55 (d von d, J=4,1, 2,4 Hz, 1H, C&sub6;), δ 6,48 (d,J=2,4 Hz, 1H, C&sub8;), δ 2,847 (t,J=7,2 Hz, 2H, C&sub3;), δ 2,685 (d von d, J= 7,7, 6,o Hz, 2H, C&sub6;).
  • ¹³C NMR (CD&sub3;CN) 75,47 MHz (J-moduliertes Spin-Echo-Verfahren) δ 169,85 (C&sub2;, +ve Intensität), δ 157,57 (C&sub7;, +ve Intensität), δ 153,61 (C&sub9;, +ve Intensität), δ 129,72 (C&sub5;, -ve Intensität), δ 157,57 (C&sub1;&sub0;, +ve Intensität), δ 112,21 (C&sub6;, -ve Intensität), δ 104,42 (C&sub8;, -ve Intensität), δ 30,01 (C&sub3;, +ve Intensität), δ 23,3S (C&sub4;, +ve Intensität).
  • Diaminobutan (3,0 ml: 0,3 Mol; Aldrich Chemical Co.) wurde auf 55ºC unter Stickstoff in einem Dreihalskolben erwärmt, der mit einem Zugabetrichter versehen war. 7-Hydroxydihydroumarin (1,0 g, 0,006 Mol) in Methanol (15 ml) wurde tropfenweise zugegeben. Nach Vervollständigung der Zugabe wurde die Reaktionsmischung zur Trockne eingedampft und der Rückstand wurde wiederholt mit Ethylacetat zerrieben. Das verbleibende Gummi wurde unter Hoch-Vakuum getrocknet. Das Material wurde durch Flash-Säulenchromatografie gereinigt (Silica; Eluierungsgradient von 20% MeOH/EtOAc/NH&sub4;OH (5%) bis 30% MeOH/EtOAc/NH&sub4;OH (5%)). Die Fraktionen wurden auf der Basis von TLC vereinigt, um die Verbindung der Formel V zu ergeben (1,0 g) ¹H-NMR, ¹³C NMR, Massenspektren und analytische Analyse zeigten, daß die synthetisierte Verbindung mit der aus YM5 Eluat in Beispiel 3 isolierten Verbindung identisch war.
  • ¹H NMR (CD&sub3;CN) 300 MHz δ 7,5-6,5 (breit, OH), δ 6,9-6,8 (b, CONH), δ 6,868 (d,J = 8,1 Hz, 1H, C&sub6;), 6,304 (d,J=2,3 Hz, 1H, C&sub3;) , δ 6,259 (d von d, J = 2,4, 8,0 Hz, 1H C&sub5;) , δ 5,5-4,8 (b,NH&sub2;), δ 3,11s (q, J=12,38, 6,23 Hz, 2H, C&sub1;&sub0;) , δ 2,908 (b, 2H, C&sub1;&sub3;), δ 2,725 (t, J = 6,8 Hz, 2H, C&sub8;) , δ 2,439 (t, J = 6,8 Hz, 2H, C&sub7;), δ 1,51, 1,46 (überlappende Multipletts, 4H, C&sub1;&sub1;, C&sub1;&sub2;).
  • ¹³C NMR (D&sub2;O) 75,47 MHz (J-moduliertes Spin-Echo-Verfahren) δ 176,68 (C=O), δ 155,74 (C&sub2;), 155,41 (C&sub4;), δ 132,09 (-ve Intensität, C&sub6;), δ 119,59 (C&sub1;), K107,97 (-ve Intensität, C&sub5;), δ 103,49 (-ve Intensität, C&sub3;), δ 39,81 (C&sub1;&sub3;), δ 39,04 (C&sub1;&sub0;), δ 36,69 (C&sub8;), δ 26,33 (C&sub7;), δ 26,088 (C&sub1;&sub1;), δ 24,69 (C&sub1;&sub2;).
  • Analyse C&sub1;&sub3; H&sub2;&sub0;N&sub2; O&sub3; Berechnet C 61,88, H 7,99, N 11,11
  • Gefunden C 61,97, H 7,96, N 11,OI.
  • Massen-Spektren DCI m/z M+H+253, 165 (M-NH&sub2;(CH&sub2;)4NH&sub2;) EI m/z M&spplus;252, 164, 136, 123, FAB m/z M&spplus;H&spplus; 253.
    • Beispiel 6 Synthese der Verbindung der Formel VI
  • Die durch Formel VI repräsentiert Verbindung (Bis-2,4-dihydroxyphenylpropionyldiaminobutan) wurde durch eine Modifikation des in Beispiel 5 beschriebenen Verfahrens synthetisiert. Diaminobutan (1,09 ml, 5,48 mM) wurde in 30 ml absolutem Ethanol aufgelöst. Hierzu wurden langsam 4,5 g 7-Hydroxydihydrocumarin zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde bei Raumtemperatur eine Stunde lang gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann durch Rotationsverdampfung entfernt, was zu einem rötlichen Gummi führte. Die Zugabe von überschüssigem Ethylacetat gefolgt von der Rotationsverdampfung führte zu einem rötlichen Feststoff, der mit überschüssigem Ethylacetat gewaschen und dann in einem Vakuum-Exsikkator getrocknet wurde, um 4,6 g (82% Ausbeute) der Verbindung gemäß Formel VI zu ergeben. Die isolierte Verbindung wurde nach mehreren analytischen Verfahrenstechniken analysiert: ¹H und ¹³C NMR und Massenspektral-Analyse. Die Ergebnisse stimmten mit der Struktur überein, die der Formel VI zugewiesen worden war.
  • ¹H NMR (CD&sub3;OD) 300 MHz. δ 6,841 (d,J=8,1 Hz, 2H, C&sub6;, C&sub2;&sub2;) , δ 6,277 (d,J=2,4 Hz, 2H, C&sub3;, C&sub1;&sub9;), δ 6,204 (d von d, J=8,1, 2,4 Hz, 2H, C&sub5;, C&sub2;&sub1;), δ 3,089 (b,4H, C&sub1;&sub0;, C&sub1;&sub3;), δ 2,779 (t,J=7,4 Hz, 4H, C&sub8;, C&sub1;&sub5;), δ 2,422 (t,J=7,4 Hz, 4H, C&sub7;, C&sub1;&sub8;), δ 1,35 (b, 4H, C&sub1;&sub1;, C&sub1;&sub2;).
  • ¹³C NMR (CD&sub3;OD) 75,47 MHz 75,47 MHz (J-moduliertes Spin-Echo- Verfahren). δ 176,05 (C&sub9;, C&sub1;&sub4;, +ve Intensität), δ 157,74 (C&sub2;, C&sub1;&sub8;, +ve Intensität), δ 157,02 (C&sub4;, C&sub2;&sub0; +ve Intensität), δ 131,58 (C&sub6;, C&sub2;&sub2;, -ve Intensität), δ 119,55 (C&sub1;, C&sub1;&sub7;, +ve Intensität) , δ 107,47 (C&sub5;,C&sub2;&sub1;, -ve Intensität), δ 103,59 (C&sub3;, C&sub1;&sub9;, -ve Intensität), δ 39,49 (C&sub8;, C&sub1;&sub5;, +ve Intensität), δ 37,73 (C&sub1;&sub0;, C&sub1;&sub3;,+ve Intensität), δ 27,54 (C&sub1;&sub1;, C&sub1;&sub2; +ve Intensität), 27,01 (C&sub7;, C&sub1;&sub6;, +ve Intensität).
  • Massenspektren FAB m/z M&spplus;H&spplus; 417, 309 (M&spplus; - C&sub6;H&sub5;O&sub2;), 253 (M&spplus;-C&sub9;H&sub9;O&sub3;).
    • Beispiel 7 Hemmung des PPO durch verschiedene Resorcinolderivate
  • Um die Wirkung verschiedener Resorcinolverbindungen auf die Hemmung von PPO (Pilze) zu bestimmen, wurde ein lineares spektrophotometrisches Versuchssystem ähnlich dem in Beispiel 1 beschriebenen verwendet. Die Untersuchungsmischung bestand aus:
  • 5 mM Natriumphosphat, PH 6,5;
  • 0,133 mM L-Dihydroxyphenylalanin (L-DOPA);
  • PPO (Pilze) und
  • +/- variierende Konzentrationen der zu testenden Verbindung.
  • Die Reaktionsrate wurde durch Messung der Veränderung der Absorption pro Minute bei 475 nm bei 25ºC gemessen. Die scheinbaren Hemmungskonstanten (I&sub5;&sub0;) sind in Tabelle 1 dargestellt. Tabelle 1 Verbindung I&sub5;&sub0;, uM Resorcinol Formel 4-Ethylresorcinol 4-n-Propylresorcinol 4-Dodecylresorcinol 4-Cyclohexylresorcinol 4-Hexanoylresorcinol 4-Carboxyresorcinol (2,4-Dihydroxybenzoesäure)
  • I&sub5;&sub0; stellt die Konzentration des Hemmstoffes dar, die notwendig ist, um eine fünfzig (50%) prozentige Hemmung des Enzyms zu erhalten. Die Ergebnisse zeigen, daß viel geringere Konzentrationen der Resorcinolderivate benötigt werden, um, verglichen mit Resorcinol, den gleichen Hemmgrad zu erreichen.
    • Beispiel 8 Wirkung des YM5 Eluats auf rosa Krabben-Melanosis
  • Rosa Krabben (Penaeus duorarum) in Key West, Florida gefangen und eingefroren und vor der Behandlung aufgetaut. Die Melanosis in den Krabben wurde nach der Skala beurteilt, die zur Beschreibung der Melanosis entwickelt worden war und in Tabelle 2 dargestellt ist. Tabelle 2 - Skala, die zur Beschreibung und zur Bewertung des Auftretens von Melanosis (schwarze Flecke) auf rosa Krabben verwendet wird. Melanosis-Skala Abwesend Leicht bemerkbar auf einigen Krabben Leicht bemerkbar auf den meisten Krabben Mäßig, bemerkbar auf den meisten Krabben Starker Befall, bemerkbar auf den meisten Krabben Starker Befall, völlig unakzeptabel
  • Die Melanosis-Skala kann auf bestehende Empfehlungen bezogen werden, die von dem National Marine Fisheries Service für die Beurteilung roher Krabben entwickelt worden sind. Code of Federal Regulations (1982) Title 50, Part 265, Subpart A, United States General standards for Grades of Shrimp, Seiten 262-268. Eine Bewertung mit 4 oder mehr stellt einen meßbaren Defekt der Produktqualität dar. Eine Bewertung von 8 oder mehr stellt einen schweren Defekt dar, der einem nicht akzeptablen Produkt entspricht.
  • Die Ernten wurden so arrangiert, daß frische, noch mit Kopf versehene Krabben in weniger als 12 Stunden nach der Ernte am Dock ankamen. Alle Krabben wurden routinemäßig an Bord gewaschen und temporär in Eis gelagert. Das Basisverfahren bestand darin, 400 bis 600 Gramm Krabben in 2,5 Liter verschiedener Tauchzusammensetzungen und Konzentrationen 1 Minute lang zu spülen, dann zu entwässern und in Kunststofftüten abzupacken und in Eis zu lagern. Die Tüten wurden als notwendig angesehen, um die verschiedenen Einflüsse des schmelzenden Eises zu eliminieren. Eisgekühlte Container mit den abgepackten Krabben wurden bei 35ºF (1,7ºC) gelagert, wobei die Eiszugabe jeden anderen Tag erfolgte.
  • Die Entwicklung der Melanosis wurde zwei Wochen lang routinemäßig markiert und fotografiert. Die Beutel mit den Krabben waren numeriert, so daß der Kontrolleur unter ihnen die verschiedenen Behandlungen nicht unterscheiden konnte. Alle Markierungen entsprechend der vorerwähnten Skala (Tabelle 2) wurden von einem erfahrenen Kontrolleur vorgenommen. Die Skala wurde durch vorentwickelte Farbprints ergänzt, die allgemeine Beispiele fortgeschrittener Stufen der Melanosis darstellen. Die Absicht war, offensichtliche Unterschiede zwischen den Behandlungen festzustellen, so daß die besten Behandlungen für die nachfolgenden Tests zur statistischen Auswertung ausgewählt wurden.
  • Die verschiedenen Tauchmaßnahmen oder chemischen Behandlungen umfassen Leitungswasser als Kontrollversuch, Natriumbisulfit in einer Konzentration von 1,25%, rohes EDC Ficin und das YM5 Eluat, welches gemäß dem Verfahren nach Beispiel 1 hergestellt wurde, und welches als "F100" bezeichnet wird. Die Eintauchlösung war frisches Leitungswasser.
  • Die Behandlung (Eintauchen) und die Verhältnisse von Krabben zur Eintauchlösung sind in Tabelle 3 zusammengestellt. Tabelle 3 Eintauchlösung Verhältnis Krabben zur Eintauchlösung Volumen/Volumen Kontrollversuch I (Leitungswasser) Kontrollversuch II (Leitungswasser) Bis(natriumbisulfit) Ficin, Tablettenform F1p, Ficin-Pulver, Ampulle I F2p, Ficin-Pulver, Ampulle II F100, YM5 Eluat (1/5 bis 1/20 Verdünnung mit oder ohne Puffer B
  • Die Behandlungen umfaßten variierende Zugaben zu Leitungswasser, sofern nichts anderes in Bezug auf die Chargen mit destilliertem Wasser gesagt wurde. Alle Behandlungen sahen ein vollständiges Eintauchen der Krabben für 60 bis 80 Sekunden vor und anschließend kurzes (5-10 Sekunden langes) Entwässern mit mäßiger Bewegung.
  • Die Ergebnisse sind in den Figuren 1 und 2 gezeigt. Figur 1 zeigt,daß das YM5 Eluat F100 genau so wirksam oder besser wirksam war als Natriumbisulfit in Bezug auf die Verminderung der Melanosis. Figur 2 zeigt, daß F100 genau so wirksam war wie rohes Ficin und wirksamer war als Natriumbisulfit in Bezug auf die Reduzierung der Melanosis.
    • Beispiel 9 Hemmung der enzymatischen Bräunung von Äpfeln durch YM5 Eluat
  • Frische, ganze McIntosh Äpfel, die bei Umgebungstemperatur (22 bis 24ºC) aufgewahrt waren, wurden durch und durch zu Vierteln aufgeschnitten und dann zu 1/4 Inch dicken Scheiben geschnitten. Die Apfelscheiben wurden durch Bürsten der aufgeschnittenen Oberflächen oder Eintauchen der Scheiben insgesamt für mehrere Zeiträume behandelt: weniger als 5 Sekunden, 10 Sekunden, 1 Minute, 2 1/2 Minuten und 5 Minuten, und zwar mit den Lösungen, wie sie in Tabelle 4 gezeigt sind. Im Anschluß an die Behandlung wurden die Apfelscheiben bei Umgebungstemperatur der Luft ausgesetzt stehen gelassen. Die Scheiben wurden dann visuell auf Bräunung untersucht und zwar nach 0, 1, 2, 3, 4 und 24 Stunden. Tabelle 3 - Apfelbehandlungen Kontrollversuch 1) Keine Flüssigkeit, d.h. nur in Luft 2) Entionisiertes Wasser, pH 5,8 3) 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,7 4) 50 mM Phosphatpuffer, pH 2,7 (unter Verwendung von 4,0 N NaOH wurde der pH-Wert von 2,O auf 2,7 gesteigert. Experimentelle Versuche 5) YM5 Eluat, pH 6,3, etwa 100 mg/ml, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben aus (200 mg/ml) rohem Ficin in Natriumphosphat 6) YM5 Eluat, endgültiger pH-Wert 4,6, etwa 100 mg/ml, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben aus(200 mg/ml) rohem Ficin in Phosphatpuffer, (50 mM) , pH 2,7 (unter Verwendung von 4,0N NaOH von pH 2,0 auf pH 2,7 gesteigert).
  • Die Ergebnisse zeigten, daß die Behandlungen 5 und 6 (Tabelle 4) unter Verwendung von YM5 Eluat das Ausmaß der Braunfärbung von Apfelscheiben minimalisierten. Alle Proben waren anfänglich (Zeit 0) von weißer Farbe. Die Braunfärbung der Kontrollproben (Behandlungen 1 bis 4 in Tabelle 4) wurde nach 1 Stunde beobachtet, wobei maximale Braunfärbung nach etwa 3 Stunden auftrat. Nach 3 Stunden wurde indessen keine wesentliche Braunfärbung beobachtet in den Scheiben, welche die Behandlungen 5 und 6 erfahren hatten. Nach 24 Stunden waren die Scheiben, welche die Behandlungen 5 und 6 erfahren hatten, leicht gebräunt, sie wiesen indessen wesentlich weniger Bräunung auf als die Kontrollversuche.
    • Beispiel 10 Hemmung der Braunfärbung von Äpfeln durch die Verbindung mit der Formel V und YM5 Eluat.
  • Zwei frische und ungequetschte ganze McIntosh Äpfel, die bei Umgebungstemperatur aufbewahrt waren, wurden mit einem Edelstahlmesser in Vierteln durch und durch geschnitten und dann in 1/4 Inch Scheiben aufgeteilt. Ein Volumen von 0,8 ml einer jeden der Behandlungslösungen, die in Tabelle 5 aufgeführt sind, wurde bei Umgebungstemperatur auf die obere Fläche der frisch geschnittenen weißen Scheiben aufgetragen, wobei eine dreifache Probe pro Behandlung Anwendung fand. Die Verbindung mit der Formel V wurde wie in Beispiel 5 beschrieben synthetisiert. Bei der folgenden Anwendung standen die Scheiben bei Umgebungstemperatur und waren der Luft und dem Licht für die Dauer von 15 Minuten bis 4 Stunden ausgesetzt, und die Bräunung wurde in dieser Zeitspanne visuell beobachtet. Tabelle 5 - Apfelbehandlungen Bei einem eingestellten pH-Wert von 6,7 bis 7,0 1) Natriumphosphatpuffer 2) Natriumphosphatpuffer (5mM) + Lactose&spplus; (9.0%) 3) Natriumphosphatpuffer (5mM) + Lactose&spplus; (9.0%) + YM5 (1,0%; ohne Lactose) 4) Natriumphosphatpuffer (5mM) + Lactose&spplus; (9,0%) + Formel V, 0,5 Gew.-% (2OmM) 5) Natriumphosphatpuffer (5mM) + Lactose&spplus; (9,)%) + 1,4-Diaminobutan, 50 ml/100 ml, (5mM) 6) Natriumphosphatpuffer (5mM) + Formel V, 0,5%, (20mM) 7) Allein der Luft ausgesetzt. &spplus;) Lactose wurde zugegeben aufgrund ihrer Anwesenheit in den rohen Ficin-Präparaten, welche vom Lieferanten her mit Lactose-Feststoffen verdünnt waren.
  • Alle frisch geschnittenen Äpfel waren anfänglich von weißer Farbe. Innerhalb von 15 Minuten nach der Behandlung traten in allen Proben Bräunungen auf, ausgenommen solcher, die mit den Lösungen 3, 4 und 6 behandelt waren und die weiß blieben. Nach einer Stunde waren die Proben, die mit 4 und 6 behandelt waren noch weiß, während die anderen Proben ein variierendes Ausmaß von Bräunung zeigten. Das Ausmaß der Bräunung der anderen Proben ergab in der Reihenfolge der weniger Gebräunten zu den am meisten Gebräunten folgende Aufstellung: 3 2, 5 1, 7. Nach etwa 3 Stunden ergab sich eine maximale Bräunung in den Proben 1, 2, 3, 5 und 7 in der Reihenfolge, wie sie vorstehend aufgeführt ist. Die Proben, die mit den Lösungen 4 und 6 behandelt worden waren, blieben weiß und im wesentlichen unverändert in der Farbe.
  • Unter den Prüfbedingungen hemmte die Verbindung mit der Formel V bei einer Konzentration von 20 mM die Bräunung der Äpfel in wirksamerer Weise als YM5 Eluat und rohes Ficin. Lactose und/oder 1,4-Diaminobutan verhinderten die Bräunung nicht.
    • Beispiel 11 Wirkung des YM5 Eluats und der Verbindung gemäß Formel V auf rosa Krabben-Melanosis
  • Rosa Krabben wurden in Key West, Florida, gefangen und eingefroren und vor der Behandlung aufgetaut. Die Melanosis wurde in den Krabben entsprechend der in Beispiel 8, Tabelle 2, gegebenen Skala bewertet, um die Melanosis zu beschreiben.
  • Das Grundverfahren bestand darin, die Krabbe in verschiedene Eintauchzusammensetzungen und Konzentrationen 1 Minute lang zu spülen (bei den Testlösungen, die die beiden höchsten Konzentrationen der Formel V Verbindung enthielten, d.h. 0,1% und 0,05%, wurde wegen Mangel an ausreichender Menge Material die Testlösung auf 6 einzelne Krabben aufgetragen), dann entwässern und in Plastikbeuteln abzupacken, um auf Eis gelagert zu werden. Die Beutel wurden als notwendig angesehen, um den variierenden Einfluß des schmelzenden Eises zu eliminieren. Die eisgekühlten Behälter mit den abgepackten Krabben wurden bei 35ºF (1,7ºC) gelagert und jeden zweiten Tag erneut eisgekühlt. Die Entwicklung der Melanosis wurde routinemäßig während 7 Tagen der Lagerung notiert und fotografiert, wie es in Beispiel 8 beschrieben ist.
  • Die verschiedenen Eintauchlösungen und die chemischen Behandlungen umfaßten Leitungswasser als Kontrollversuch, Natriumbisulfit in einer Konzentration von 1,25%, YM5 Eluat (hergestellt nach Beispiel 1) in einer Konzentration von 1%, und variierende Konzentrationen der Formel V Verbindung, wie es in den Figuren 3 und 4 angegeben ist. Die in Figur 3 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Verbindung der Formel V bei einer Konzentration von 0,1 Gew.-% in Bezug auf die Verminderung der Melanosis so wirksam war wie Bisulfit. Figur 4 zeigt, daß nur 0,005% der Verbindung der Formel V in Bezug auf die Verringerung der Melanosis so wirksam war wie Natriumbisulfit.
    • Beispiel 12 Wirkung dar Verbindung nach Formel V auffrische rosa Krabben-Melanosis
  • Rosa Krabben (Penaeus duorarum) wurden wie in Beispiel 8 beschrieben behandelt und ausgewertet ausgenommen, daß die Versuche auf einem Krabben-Fangboot mit frisch gefangenen Krabben durchgeführt wurden. Die Krabben waren vor der Behandlung mit verschiedenen Konzentrationen der Verbindung nach Formel V nicht gefroren. Alle Lösungen wurden mit Seewasser zubereitet. Die Ergebnisse sind in Figur 6 gezeigt. Die Verbindung gemäß Formel V ist zur Verhinderung von frischer rosa Krabben-Melanosis wirksam.
    • Beispiel 13 Wirkung der Nachbehandlungsspülung auf die Leistung der Verbindung der Formel V.
  • Frische rosa Krabben wurden behandelt und wie in Beispiel 12 beschrieben beurteilt. Die Krabben, die mit 0,025% der Verbindung nach Formel V behandelt worden waren, wurden direkt oder im Anschluß an eine Seewasserspülung gelagert, Nachbehandlung. Das Ergebnis ist in Figur 7 dargestellt und eine Nachbehandlungsspülung hat keinen merklichen Effekt auf die Hemmung der Krabben-Melanosis durch die Verbindung der Formel V.
    • Beispiel 14 Wirkung der Verwendung von Seewasser oder frischem Wasser als Lösungsmittel für Lösungen aus der Verbindung nach Formel V.
  • Frische rosa Krabben wurden behandelt und wie in Beispiel 12 beschrieben beurteilt. Die Krabben wurden in eine 0,01%ige Lösung der Verbindung nach Formel V eingetaucht, wobei die Lösung entweder mit Seewasser oder frischem Wasser hergestellt wurde. Die Daten sind in Figur 8 dargestellt und zeigen, daß keine wesentliche Wirkung in Bezug auf die Hemmung der Krabben-Melanosis durch die Verbindung gemäß Formel V erreicht wird, wenn die Lösungen mit frischem oder mit Seewasser bereitet werden.
    • Beispiel 15 Die Wirkung von wiederholtem Eintauchen der Krabben in eine 0,01%ige Lösung der Verbindung nach Formel V.
  • Frische rosa Krabben wurden wie in Beispiel 12 beschrieben behandelt und beurteilt. In diesem Beispiel wurden unterschiedliche ein Pfund Chargen der Krabben in die gleichen ein Liter Lösungen aus 0,01% Verbindung der Formel V jeweils eine Minute lang eingetaucht. Es wurden insgesamt acht Tauchmaßnahmen durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Figur 9 dargestellt und zeigen, daß die Verbindung der Formel V selbst nach acht Tauchvorgängen in die gleiche 0,01%ige Lösung ein wirksamer Melanosis-Hemmstoff ist.
    • Beispiel 16 Die Wirkung von 4-Hexylresorcinol auf die Entwicklung von Krabben-Melanosis
  • Rosa Krabben wurden wie in Beispiel 8 beschrieben behandelt und beurteilt mit der Ausnahme, daß die Verbindung der Formel II (4-Hexylresorcinol, Sigma Chemical Co.) anstelle der Verbindung der Formel V verwendet wurde. Rosa Krabben wurden in Lösungen aus 0,0001 bis 0,005% der Verbindung nach Formel II eingetaucht und wie vorstehend beschrieben gelagert. Die Daten sind in Figur 10 graphisch dargestellt und zeigen, daß die Verbindung mit der Formel II ein potenter Hemmstoff für die Bildung von Krabben-Melanosis bei Konzentrationen von nur 0,0005% ist.
    • Beispiel 17 Die Wirkung der Verbindung nach Formel VI auf die Entwicklung von Krabben-Melanosis
  • Rosa Krabben wurden wie in Beispiel 8 beschrieben behandelt und beurteilt mit der Ausnahme, daß die Verbindung der Formel VI (siehe Beispiel 6) anstelle der Verbindung der Formel V verwendet wurde. Die rosa Krabben wurden in Lösungen aus 0,001 bis 0,025% Verbindung nach Formel VI eingetaucht und wie vorstehend beschrieben gelagert. Die Daten sind in Figur 11 graphisch dargestellt und zeigen, daß die Verbindung nach Formel VI ein potenter Hemmstoff für die Bildung von Krabben-Melanosis bei Konzentrationen von nur 0,005% darstellt.
    • Beispiel 18 Die Wirkung dar Verbindung nach Formel IV auf die Entwicklung von Krabben-Melanosis
  • Rosa Krabben wurden wie in Beispiel 8 beschrieben behandelt und beurteilt mit der Ausnahme, daß die Verbindung nach Formel IV (2,4-Dihydroxyphenylpropionsäure) anstelle der Verbindung der Formel V verwendet wurde. Rosa Krabben wurden in Lösungen aus 0,001 bis 0,1% der Verbindung nach Formel IV eingetaucht und wie vorstehend beschrieben gelagert. Die Daten sind in Figur 12 graphisch dargestellt und zeigen, daß die Verbindung der Formel IV ein Hemmstoff für die Bildung von Krabben-Melanosis bei Konzentrationen von nur 0,05% darstellt.
    • Beispiel 19 Wirkung der Verbindung nach Formel V auffrische braune Krabben-Melanosis
  • Braune Krabben wurden wie für rosa Krabben in Beispiel 8 beschrieben behandelt und beurteilt. Die Ergebnisse, die in Figur 13 dargestellt sind, zeigen, daß die Verbindung der Formel V ein wirksamer Hemmstoff für die Melanosis-Entwicklung sowohl in braunen als auch in rosa Krabben darstellt.
    • Beispiel 20 Wirkung der Verbindung nach Formel V auf PPO, welches aus Tiger-Krabben isoliert war
  • PPO wurde aus taiwanesischen schwarzen Tiger-Krabben (Penaeus monodon) nach dem folgenden Verfahren isoliert: Tiger-Krabbenköpfe wurden in flüssigem Stickstoff gefroren und dann zu einem feinen Pulver gemahlen. Die gepulverten Krabbenköpfe wurden dann durch Rühren in einem Phosphatpuffer extrahiert. Die rohen Extrakte wurden einer Ammoniumsulfat-Ausfällung mit einer 0 bis 40%igen Ammoniumsulfat-Sättigung unterworfen und anschließend durch präparative hydrophobe interaktive Phenyl-Sepharose CL-4B (auf Pharmacia) bei 4ºC gereinigt. Die gereinigten PPO-Fraktionen wurden dann durch Ultrafiltration konzentriert. Die Reinheit des Enzyms wurde unter Verwendung von Gel-Elektrophorese beurteilt (Laemmli, U.K., Nature, 227:680-685 (1970)).
  • Ein Kontrollversuch wurde wie folgt durchgeführt: Ein 50 ul Anteil von 5 mM Natriumphosphat (pH 6,5) wurde zu 880 ul von 5 mM L-DOPA, 5 mM Natriumphosphat (PH 6,5) gegeben. 7O ul von Tiger-Krabben PPO (6,3 mg Gesamtprotein-Stammlösung) wurden zugegeben und die Reaktion wurde sofort unter Verwendung eines Beckman DU Spektrophotometers bei 475 nm 10 Minuten lang bei 35ºC überwacht.
  • Zum Testen des Hemmstoffes wurde ein 50 ul Anteil der Verbindung der Formel V (20 mM) wie in Beispiel 5 beschrieben hergestellt und zu 880 ul von L-DOPA zugegeben. 70 ul der Tiger- Krabben PPO (6,3 mg Gesamprotein in der Stammlösung) wurden zugegeben und die Reaktion wurde sofort wie vorstehend für den Kontrollversuch beschrieben spektrophotometrisch überwacht. Jeder Test wurde dreifach durchgeführt.
  • Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt. Tabelle 6 Behandlung Reaktionsrate (Δ 475 nm/min) Aktivität Kontrollversuch 1mM Formel
  • Die Ergebnisse zeigen eine wesentliche Hemmung der PPO-Aktivität durch die Verbindung der Formel V.
    • Beispiel 21 Wirkung der Verbindung der Formel V auf die enzymatische Bräunung von Avocados
  • Avocados unterliegen der PPO-katalysierten Bräunung bei Beschädigung, beim Einschneiden oder beim Mischen von Avocado- Brei (Kahn, V., Journal of the Science of Food and Agriculture, 42:38-43 (1975)), welches einen schwerwiegenden beschränkenden Faktor für die Vermarktung von verarbeiteten Avocado-Produkten darstellt. Die Wirkung der Verbindung der Formel V als Hemmstoff für die Adocado-Bräunung wurde in der folgenden Weise untersucht:
  • Avocados wurden halbiert und in einem Nahrungsmittelprozessor in Anwesenheit verschiedener Testlösungen, einschließlich 0,1%iger Verbindung der Formel V (w/w), 1% Zitronensaft (w/w), der Kombination von 0,1% Verbindung der Formel V und 1% Zitronensaft sowie - Wasser als negativer Kontrollversuch,gemischt. Die dargestellte Konzentration ist die Endkonzentration der gemischten Avocado-Zubereitung. Die Verbindung nach der Formel V wurde als eine 2%ige Stammlösung in Wasser hergestellt. Die Testlösungen wurden während der Verarbeitung, die unmittelbar nach dem Aufschneiden der Avocado stattfand, zu dem Avocado-Mark gegeben. Ungefähr 100 g der gemischten Avocado wurden für jede Testprobe verwendet.
  • Die Proben wurden bei Raumtemperatur vier Stunden stehen gelassen, gefolgt von längerer Lagerung bei 4ºC. Die Proben wurden der visuellen Beurteilung durch die Diskussionsteilnehmer unterworfen. Nach dreistündiger Lagerung bei Raumtemperatur zeigten die Kontrollproben mit Wasser und mit Zitronen-Fruchtsaft eine wesentliche Braunfärbung, während die Probe mit der Verbindung nach Formel V nur leicht braun war. Die Probe mit der Verbindung nach Formel V/Zitronensaft zeigte keine Anzeichen von Bräunung. Nach 24 Stunden hatten die Kontrollproben mit Wasser und Zitronensaft eine nicht akzeptable braune Färbung angenommen im Gegensatz zu den Proben mit der Verbindung nach Formel V und der Verbindung nach Formel V/Lemon-Fruchtsaft, die immer noch eine akzeptable gelb-grüne Farbe aufwies. Die Proben wurden nach 96 stündiger Lagerungszeit mit dem gleichen Ergebnis beurteilt, d.h. die Probe mit der Verbindung nach Formel V war nur leicht gefärbt und die Proben mit der Verbindung nach Formel V/Lemon-Fruchtsaft blieben im wesentlichen unverändert. Die Kontrollproben mit Wasser und mit Zitronensaft wiesen eine dunkelbraune Verfärbung auf. Daraus ist zu schließen, daß 0,1% der Verbindung nach Formel V ein wirksamer Hemmstoff gegen die Avocado-Bräunung darstellt und daß die Kombination von 0,1% der Verbindung nach Formel V und 1% Zitronensaft sogar noch größere Wirkung zeigt.
    • Beispiel 22 Die Wirkung variierender Konzentrationen der Verbindung nach Formel V auf die Hemmung der Avocado-Bräunung
  • Es wurden Avocado-Proben und Testlösungen hergestellt und die behandelten Proben wurden wie in Beispiel 21 beurteilt mit der Ausnahme, daß die Endkonzentration der Verbindung der Formel V in der Avocado-Mischung variiert wurde. Es wurden Konzentrationen der Verbindung nach Formel V mit O,05, 0,025, 0,005 und 0,001% verwendet. Alle Testproben und Kontrollproben wurden in Anwesenheit von 1%igem Zitronen- Fruchtsaft durchgeführt. Im Anschluß an das Mischen wurden alle Proben bei 4ºC gelagert. Nach 24 Stunden zeigten nur die Kontrollproben eine wesentliche Bräunung. Eine geringe Bräunung wurde bei den Proben nach 72 stündiger Kühlschranklagerung beobachtet, die 0,001 und 0,005% Verbindung der Formel V enthielten, während die Kontrollproben ein tiefdunkles Braun zeigten. Die 0,025 und 0,05% Verbindung der Formel V enthaltenden Proben zeigten noch eine akzeptable gelb-grüne Farbe. Nach 96 Stunden wiesen sowohl die Proben mit 0,025 und 0,05% Verbindung der Formel V keine Anzeichen von enzymatischer Bräunung auf, während die geringeren Konzentrationen eine wesentliche Bräunung zeigten und die Kontrollproben eine tief dunkelbraune Farbe aufwiesen. 0,025 und 0,05% der Verbindung nach Formel V erwiesen sich als wirksam zur Verhinderung der Avocado-Bräunung für wenigstens 96 Stunden unter den beschriebenen Bedingungen.

Claims (23)

1. Verfahren zur Verhinderung der enzymatischen Bräunung von Nahrungsmitteln oder Getränken, die einer solchen Bräunung zugänglich sind, umfassend die Einwirkung einer ausreichenden Menge 4-substituierten Resorcinolderivates auf die Nahrungsmittel oder Getränke zur Verhinderung der Bräunung der Nahrungsmittel, wobei das Resorcinolderivat die folgende allgemeine Formel aufweist:
worin R&sub1; und R&sub2; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: H, CH&sub3;, COR', CR', PO&sub3;R'R'' und SO&sub3;R'R'', worin R' und R'' unabhängig Wasserstoff oder eine AlkylgruPpe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in gerader, verzweigter oder zyklischer Konfiguration darstellen oder eine substituierte aromatische Verbindung, und:worin R&sub3; so ausgewählt ist, daß das Resorcinolderivat die enzymatische Bräunung verhindert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin R&sub3; ein Heteroatom, eine gesättigte oder ungesättigte Alkylgruppe, eine substituierte aromatische Gruppe oder eine organische funktionelle Gruppe, die ein Heteroatom enthält, umfaßt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, worin (a) R&sub3; wenigstens ein Heteroatom umfaßt, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor, Chlor, Brom, Iod und Fluor oder (b) R eine gesätzigte oder ungesättigte Alkylgruppe mit etwa bis etwa 30 Kohlenstoffatomen in gerader, verzweigter oder zyklischer Konfiguration darstellt oder (c) R&sub3; eine alkylgruppe oder organische funktionelle Gruppe, die ein Heteroatom aufweist, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor, Chlor, Brom, Iod oder Fluor.
4. Verfahren nach Anspruch 1, worin R&sub1;und R&sub2; beide Wasserstoff sind.
5. Verfahren zur Verhinderung der enzymatischen Bräunung von Nahrungsmitteln oder Getränken, die solcher Bräunung zugänglich sind, umfassend die Einwirkung einer ausreichenden Menge eines 4-substituierten Resorcinolderivates auf die Nahrungsmittel oder Getränke, um das Bräunen der Nahrungsmittel zu verhindern, worin das Resorcinolderivat die folgende Formel aufweist:
6. Verfahren nach Anspruch 5, worin die Menge der Formel II, die ausreichend ist eine Bräunung der Nahrungsmittel zu verhindern, von etwa 0,0001 bis etwa 0,1 Gewichtsprozent beträgt.
7. Verfahren zur Verhinderung der enzymatischen Bräunung von Nahrungsmitteln oder Getränken, die solcher Bräunung zugänglich sind, umfassend dit Einwirkuna einer aüsreichenden Menge eines 4-substituierten Resorcinolderivates kauf die Nahrungsmittel oder Getränke, um das Bräunen der Nahrungsmittel zu verhindern, worin das Resorcinolderivat die allgemeine Formel aufweist:
worin n 1 oder 2 ist, R&sub1; und R&sub2; unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: H, CH&sub3;, COR', CR', PO&sub3;R'R'' und SO&sub3;R'R'', worin R' und R'' unabhängig Wasserstoff, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in gerader, verzweigter oder zyklischer Konfiguration oder eine substituierte aromatische Verbindung umfaßt, und Z eine alkyl- oder organische funktionelle Gruppe ausgewählt aus dem Resorcinolderivat, welches die enzymatische Bräunung verhindert, umfaßt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, worin (a) Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: OH, NH&sub2;, O(CH&sub2;)xCH&sub3;1 NHCO&sub2;(CH&sub2;)xCH&sub3;, NH(CH&sub2;)xCH&sub3;, Aminosäuren, einem Polyaminsubstituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: NH(CH&sub2;)xNH&sub2;, NH(CH&sub2;)xNH(CH&sub2;)yNH&sub2;, NH(CH&sub2;)xNHR&sub4; und NH(CH&sub2;)xNH(CH&sub2;)yNHR&sub4;, worin x und y unabhängig eine ganze Zahl von 0 bis 5 sind und höhere Polyaminoligomere oder substituierte Oligomere bestehend aus wenigstens drei 1,ωDiaminoalkanmonomeren, worin R&sub4; die folgende Formel aufweist:
(b) das Resorcinolderivat die folgende Formel aufweist:
(c) das Resorcinolderivat die folgende Formel aufweist:
(d) das Resorcinolderivat die folgende Formel aufweist:
(e) das Resorcinolderivat die folgende Formel aufweist:
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Nahrungsmittel oder Getränke ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: Schalentieren, Schellfisch, Früchten, Gemüsen, Fruchtsäften und Weinen.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Enzym Polyphenoloxidase ist.
11. Verfahren nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, worin die Menge des zur Verhinderung der Bräunung ausreichenden Resorcinolderivates von 0,001 bis etwa 0,1 Gewichtsprozent beträgt.
12. Verfahren zur Erzeugung eines Resorcinol-Polyaminderivates mit der folgenden Formel:
welches die folgenden Schritte umfaßt:
a. Umsetzung von 7-Hydroxycumarin mit Wasserstoff unter Bedingungen, die ausreichend sind zur Durchführung der Hydrierung und Bildung von 7-Hydroxydihydrocoumarin und
b. Reaktion des 7-Hydroxydihydrocoumarins mit Diaminobutan unter Bedingungen, die ausreichend sind zur Bildung der Formel V.
13. Verfahren zur Erzeugung eines Resorcinol-Polyaminderivates mit der folgenden Formel:
welches die folgenden Schritte umfaßt:
a. Reaktion von Resorcinol mit einem Reagens, welches zur Additon von einem Kohlenstoffatom an einen aromatischen Ring unter Bedingungen führt, die ausreichend sind, um eine Aldehydgruppe an den aromatischen Ring anzulagern, unter Bildung von 2,4-Dihydroxybenzaldehyd;
b. Umsetzung des 2,4-Dihydroxybenzaldehyds mit Malonsäure unter Bedingungen, die ausreichend -sind, um 2-,4-Dihydroxyzimtsäure zu bilden;
c. Hydrierung der 2,4-Dihydroxyzimtsäure unter Bedingungen, die ausreichend sind, um 2,4-Dihydroxyphenylpropionsäure zu bilden und Umsetzung derselben mit Diaminobutan unter Bedingungen, die ausreichend sind, um Formel V zu bilden.
14. Resorcinol-Polyaminderivat mit der Formel:
15. Zusammensetzung zur Verhinderung der enzymatischen Bräunung von Nahrungsmitteln oder Getränken, die solcher Bräunung zugänglich sind, bestehend im wesentlichen aus einem Resorcinol-Polyaminderivat mit der folgenden Formel:
16. Verfahren zur Erzeugung eines Resorcinol-Polyaminderivates mit der folgenden Formel:
welches die folgenden Schritte umfaßt:
a. Reaktion von 7-Hydroxycumarin mit Wasserstoff unter Bedingungen, die ausreichend sind, um eine Hydrierung durchzuführen unter Bildung von 7-Hydroxydihydrocumarin und
b. Umsetzung von 7-Hydroxydihydrocumarin mit Diaminobutan unter Bedingungen, die ausreichend sind, um die Formel VI zu bilden.
17. Resorcinol-Polyaminderivat mit der Formel:
18. Zusammensetzung zur Verhinderung der enzymatischen Bräunung von Nahrungsmitteln oder Gertränken, die solcher Bräunung zugänglich sind, bestehend im wesentlichen aus einem Resorcinol-Polyaminderivat mit der folgenden Formel:
19. Verfahren zur Erzeugung eines P.esorcinol-Polyaminderivates mit der folgenden Formel:
welches die folgenden Schritte umfaßt:
a. Umsetzung von 2,4-Dihydroxybenzol mit einem Reagens, welches zur Additon eines Kohlenstoffatomes an einen aromatischen Ring führt, unter Bedingungen, die ausreichen, um eine Aldehydgruppe in der 1-Postion an den aromatischen fing zu addieren, um 2,4-Dihydroxybenzaldehyd zu bilden;
b. Umsetzung von 2,4-Dihydroxybenzaldehyd mit Malonsäure unter Bedingungen, die ausreichen, um 2,4-Dihydroxyzimtsäure zu bilden;
c. Hydrierung der 2,4-Dihydroxyzimtsäure unter Bedingungen, die ausreichen, um 2,4-Dihydroxyphenylpropionsäure zu bilden und
d. Umsetzung von 2,4-Dihydroxyphenylpropionsäure mit Spermidin unter Bedingungen, die ausreichen, um die Verbindung mit der Formel VII zu erzeugen.
20. Resorcinol-Polyaminderivat mit der Formel:
21. Zusammensetzung zur Verhinderung der enzymatischen Bräunung von Nahrungsmitteln oder Gertränken, die solcher Bräunung zugänglich sind, bestehend im wesentlichen aus einem Resorcinol-Polyaminderivat mit der folgenden Formel:
22. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 15, 16 und 21, die in einem wässerigen Medium gelöst wird, um eine wässerige Lösung zu bilden und worin beispielsweise die wässerige Lösung etwa 0,001 bis etwa 0,1 Gewichtsprozent des Resorcinolderivates enthält.
23. Nahrungsmittel oder Getränk, welches der enzymatischen Bräunung zugänglich ist, welches mit einer Menge eines 4-substituierten Resorcinolderivates in einer ausreichenden Menge behandelt worden ist, um die Bräunung des Nahrungsmittels oder des Getränkes zu verhindern, worin das Resorcinolderivat ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Formel I, Formel II, Formel IV, Formel V, Formel VI und Formel VII.
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