DE69107209T2

DE69107209T2 - Menschliches macrophageentzündungsprotein-2-beta.

Info

Publication number: DE69107209T2
Application number: DE69107209T
Authority: DE
Inventors: Carol Gallegos; Patricia Tekamp-Olson
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1990-06-22
Filing date: 1991-06-24
Publication date: 1995-05-24
Anticipated expiration: 2011-06-25
Also published as: JPH06501244A; IE66227B1; DE69107209D1; ATE118018T1; CA2086088A1; IE912193A1; EP0535150A1; PT98073B; DK0535150T3; WO1992000326A1; ES2069303T3; PT98073A; GR3015284T3; EP0535150B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Makrophagenentzündungsproteine (MIPs) sind eine Klasse von Proteinen, die durch bestimmte Zellen (beispielsweise Makrophagen oder Lymphocyten) als Antwort auf invasive Stimuli, beispielsweise Gram-negative bakterielle Lipopolysaccharide, produziert werden. Sie können somit an der Antwort der Zelle (Wirtsorganismus) auf derartige Stimuli wesentlich beteiligt sein. Diese Moleküle können von sich aus ein therapeutisches Potential zur Behandlung von Infektionen, Krebs, funktionsgestörter Knochenmarkbildung und Autoimmunkrankheiten aufweisen. Zwei unterscheidbare MIP-Formen sind in Kulturen von Maus-Makrophagen-Tumorzellen gefunden worden: MIP-1 und MIP-2.

Maus-MIP-1

Maus-(m)MIP-1 ist ein von Lipopolysaccharid (LPS)- stimulierten RAW 264.7-Zellen einer Maus-Makrophagen-Tumorzellinie sezerniertes Hauptprotein. Nach seiner Reinigung wurde festgestellt, daß es aus zwei verwandten Proteinen, mMIP-1α und mMIP-1β bestand (Wolpe et al., J. Exp. Med. 167 (1987), 570, und Sherry et al., J. Exp. Med. 168 (1988), 2251).
Die cDNAs sowohl von mMIP-1α als auch von mMIP-1β sind cloniert und sequenziert worden (Davatelis et al., J. Exp. Med. 167 (1988), 1939, und Sherry et al., s. o.). Über die Clonierung und Sequenzierung der cDNAs von mMIP-1α und mMIP-1β berichten auch Brown et al. (J. Immunol. 142 (1989), 679) und Kwon und Weissman (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 1963) bzw. Brown et al., s. o.. Von beiden Gruppen konnten Homologe von mMIP-1α und/oder mMIP-1β aus cDNA- Banken, die aus RNA von Concanavallin A-aktivierten Maus-T- Helferzellen hergestellt worden waren, isoliert werden. Diese Ergebnisse lassen den Schluß zu, daß mMIP-1α und mMIP- 1β bei der Aktivierung von T-Zellen eine Rolle spielen.

Menschliche MIP-1-Homologe

Menschliche Homologe von mMIP-1α und mMIP-1β sind wahrscheinlich von mehreren Arbeitsgruppen cloniert worden. Die cDNAs wurden jeweils aus Banken, die RNA von aktivierten menschlichen T-Zellen enthielten, isoliert. Dementsprechend beschreiben sowohl Obaru et al. (J. Biochem. 99 (1986), 885), als auch Zipfel et al. (J. Immunol. 142 (1989) , 1582) die Clonierung einer cDNA, die ein davon abgeleitetes Protein mit einer großen Homologie zu mMIP-1α (76 %) codiert. Auch Brown et al., s. o., Zipfel et al., s. o., Lipes et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 9704) und Miller et al. (J. Immunol. 143 (1989), 2907) beschreiben die Clonierung und Sequenzierung von menschlichen cDNAs, die ein davon abgeleitetes Protein mit einer großen Homologie zu mMIP-1β (75 %) codieren. MIP-1α und MIP-1β gehören zu einer erst kürzlich beschriebenen Familie von verwandten Proteinen mit immunmodulatorischen Aktivitäten (vgl. die Zusammenfassung von Sherry et al., s. o.).

Maus-MIP-2

Maus-MIP-2 (mMIP-2) ist ein induzierbares Protein, das ebenfalls aus dem konditionierten Medium von LPS-stimulierten RAW 264.7-Zellen gereinigt wurde (Wolpe et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989), 3121). Die Maus-MIP-2 codierende cDNA ist cloniert und sequenziert worden.
mMIP-2 ist ebenfalls ein Mitglied einer homologen Multigen-Familie. Beispiele für Mitglieder dieser Familie sind gro/MGSA, Thrombozytenfaktor 4 "platelet factor 4", Thrombozyten-Basisprotein "platelet basic Protein", der Vorläufer eines Bindegewebe-aktivierenden Peptids (CTAP-III) und B-Thromboglobulin, ein durch Gamma-Interferon induzierbares Protein, IP-10 und Interleukin 8 (IL-8), das auch als 3-10C, MDNCF, NAP-1 und NAF bezeichnet wird. Beispiele für Mitglieder dieser Familie, die Proteinsequenzen (die üblicherweise von der clonierten cDNA abgeleitet sind) mit höchster Homologie aufweisen, sind MGSA und KC. MGSA (Richmond et al., EMBO J. 7 (1988), 2025) ist ein autokriner Wachstumsfaktor mit einer mitogenen Aktivität, der von menschlichen Melanomzellen sezerniert wird und Produkt des menschlichen gro-Gens ist (Anisowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 7188). Die Aminosäuresequenzen von MGSA und Maus-MIP-2 sind zu 57,9 % identisch, und die abgeleitete Proteinsequenz des vermeintlichen Hamster-Homologen von MGSA (ebenda) ist mit mMIP-2 zu 68,3 % identisch. Das Maus-KC-Genprodukt (Oquendo et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 4233) wird durch den von Thrombozyten stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) induziert und für das Maus-Homologe des menschlichen MGSA/gro-Gens gehalten (die Aminosäuresequenz ist mit der von mMIP-2 zu 63,0 % identisch).

Rekombinante Expression von MIP

Es gibt im Stand der Technik kein Verfahren zur Expression von rekombinantem MIP-2 oder menschlichem MIP-2α und MIP-2β, obwohl Mitglieder der MIP-2-Gen-Familie, sowie Mitglieder der verwandten MIP-1-Gen-Familie exprimiert worden sind. Die Relevanz dieser Ergebnisse im Hinblick auf die Expression von Maus-MIP-2 oder menschlichem MIP-2 ist fraglich, wenn die idiosynkratische Natur der Expression in heterologen Systemen bedacht wird. Eine Zusammenfassung diesbezüglicher Veröffentlichungen wird trotzdem gegeben.
mMIP-1α und mMIP-1β sind unabhängig voneinander in COS-Zellen exprimiert worden (Graham et al., Nature 344 (1990), 442). LD78-cDNA (Obaru et al., s. o.), die ein Protein cadiert, daß wahrscheinlich das menschliche Homologe zu Maus-MIP-1α ist, ist in E. coli als carboxyterminale Fusion an menschliches Interleukin-2, sowie in COS-Zellen exprimiert worden (Yamamura et al., J. Clin. Invest. 84 (1989), 1707). Menschliches I-309, eine cDNA, die ein zu Mitgliedern der MIP-1-Proteinfamilie homologes Protein codiert, ist in COS-1-Zellen exprimiert worden, wobei nachgewiesen wurde, daß es ein Protein codiert, das sezerniert wird (Miller et al., s. o.). Lipes et al. (s. o.) beschreiben die Expression von Act-2-cDNA, die ein menschliches Homologe von Maus-MIP- 1β ist, in Baculoviren, wobei gezeigt wurde, daß das codierte Protein sezerniert wird, und die reife N-terminale Sequenz identifiziert wurde. JE, eine Maus-cDNA, die ein zu MIP-1α und MIP-1β homologes Protein codiert, wurde in COS-1- Zellen exprimiert, wobei gezeigt wurde, daß es einen Polypeptid-Kernbereich von etwa 12 kD codiert (Rollins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 3738).
KC, eine Maus-cDNA, die ein zu mMIP-2 homologes Protein codiert, wurde in COS-1-Zellen exprimiert, wobei gezeigt wurde, daß sie ein Protein codiert, das sezerniert wird (Oquendo et al., s. o.). Das Bindegewebe-aktivierende Peptid III (CTAP, Mullenbach et al., J. Biol. Chem. 261 (1986), 719) und IP-10 (Luster und Ravetch, J. Exp. Med. 166 (1987), 1084), die beide zur MIP-2-Gen-Familie gehören, wurden in Hefe nach einer Fusion mit dem α-Faktor bzw. in E. coli exprimiert. Maione et al. (Science 247 (1990), 77) exprimierten den menschlichen Thrombozytenfaktor 4 (MIP-2- Familie) in E. coli als ein Peptid, das an ein Peptidfragment der E. coli-β-Glucuronidase mit einer Länge von 35 Aminosäuren fusioniert ist. Das unlösliche Fusionsprotein muß mit Bromcyan gespalten werden, um biologisch aktives Material zu erzeugen. Lindley et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 9199) exprimierten NAF (IL-8), das zur MIP-2- Familie gehört, in E. coli. Es wurde festgestellt, daß dieses rekombinante Protein nach einer Reinigung und Renaturierung die gleiche biologische Aktivität wie das native Molekül aufwies. Furuta et al. (J. Biochem. 106 (1989), 436) exprimierten in E. coli auch IL-8 (MDNCF). Schließlich exprimierten Gimbrone et al. (Science 246 (1989), 1601) endotheliales IL-8 in menschlichen 293-Zellen und wiesen nach, daß das rekombinante und natürliche Material die gleiche biologische Aktivität aufweisen.

Biologische Aktivität von MIP

Es finden zur Zeit noch Untersuchungen über die biologischen Aktivitäten von MIP-1 und -2 statt, und natives Maus-MIP-1 oder -MIP-2 und seit kurzem rekombinantes Maus- (rm)-MIP-1α, rmMIP-1β und rmMIP-2 werden dazu verwendet. Beispiele für biologische Aktivitäten, die sowohl für rekombinante als auch native mMIP-1 und mMIP-2 nachgewiesen wurden, sind die Förderung der Aktivität des Kolonie-stimulierenden Faktors, sowie eine Beteiligung an Entzündungen.
Es wurde gezeigt, daß Maus-MIP-2 eine lokale Entzündung bewirkt, wenn es subcutan in die Fußballen von C3H/HeJ-Mäusen injiziert wird, eine starke chemotaktische Aktivität für menschliche polymorphkernige Leukocyten (PMN) aufweist und die PMN-Degranulierung von Lysozym, jedoch nicht von β-Glucuronidase (Wolpe et al., 1989) induziert. Ferner wurde gezeigt, daß mMIP-2 eine die Knochenmarkbildung fördernde Aktivität für CFU-GM aufweist (Broxmeyer et al., J. Exp. Med. 170 (1989), 1583). Aufgrund der verschiedenen biologischen Aktivitäten dieser Faktoren ist es wünschenswert, ihre menschlichen Homologen zu isolieren. Da größere Mengen der gereinigten Faktoren zur Definition der biologischen Aktivitäten erforderlich sind und die Isolierung dieser Faktoren aus Zellkulturflüssigkeiten kostspielig ist, ist es wünschenswert, diese Materialien unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren zu produzieren.

Zusammenfassung der Erfindung

Bei einem Versuch zur Identifizierung des menschlichen Pendants zu mMIP-2 wurden überraschenderweise nicht eine, sondern zwei mögliche Sequenzen gefunden. Diese beiden Sequenzen erhielten die Bezeichnungen hu-MIP-2α bzw. hu-MIP- 2β.
Ein Zweck dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines menschlichen MIP-2β (hu-MIP-2β)-Polypeptids, das im wesentlichen frei von anderen menschlichen Proteinen ist und die Bereitstellung einer hu-MIP-2β-codierenden Nucleinsäuresequenz.
Ein weiterer Zweck dieser Erfindung ist die Bereitstellung von mit hu-MIP-2β reagierenden Antikörpern.
Ein weiterer Zweck dieser Erfindung ist die Bereitstellung von hu-MIP-2β-nachweisenden Diagnoseverfahren oder von hu-MIP-2β-codierenden Nucleinsäuresequenzen.
In Übereinstimmung mit diesen und weiteren Zwecken, die in dieser Beschreibung erläutert sind, betrifft ein erfindungsgemäßer Gesichtspunkt eine hu-MIP-2β-Polypeptideumfassende Proteinzusammensetzung, die im wesentlichen frei von menschlichem Gewebe und vorzugsweise im wesentlichen frei von anderen menschlichen Proteinen ist.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein DNA-Molekül, das einen ein hu-MIP-2β-Polypeptid codierenden heterologen Bereich umfaßt. Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft ein rekombinantes Produktionssystem, das Zellen umfaßt, die mit einem DNA-Molekül, das einen ein hu-MIP-2β-Polypeptid codierenden heterologen Bereich umfaßt, transformiert sind.
Die Erfindung umfaßt außerdem mit hu-MIP-2β-Polypeptiden reagierende Antikörper. Weitere erfindungsgemäße Gesichtspunkte betreffen Immuntestverfahren zur Bestimmung von hu-MIP-2β in Geweben oder Flüssigkeiten und Nucleinsäure- Sonden verwendende Verfahren zum Nachweis von hu-MIP-2β- codierenden Polynucleotidsequenzen in biologischen Proben.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft Polypeptide und kleine organische Moleküle, die mit dem (den) hu-MIP-2β-Rezeptor(en) interagieren und agonistische oder antagonistische Aktivitäten aufweisen.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft hu-MIP-2β-Polypeptide, die agonistische oder antagonistische Wirkungen auf alle Mitgliedern der homologen Multigen-Familie zeigen.
Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Induzierung der Wundheilung, ein Verfahren zur Modulierung der Knochenmarkbildung und ein Verfahren zur Induzierung von Adjuvans-Aktivität durch Verabreichung einer wirksamen Menge an hu-MIP-2β-Polypeptiden.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Behandlung von malignen Tumoren, Autoimmunkrankheiten und entzündlichen Erkrankungen, beispielsweise einer pathologischen Neutrophileninfiltration, beispielsweise Schuppenflechte, rheumatische Arthritis und Lungenkrankheiten, durch Verabreichung einer wirksamen Menge an hu-MIP-2β-Antagonisten oder hu-MIP-2β-Polypeptiden mit einer antagonistischen Wirkung auf die Mitglieder der homologen Multigen- Familie.
Unter Verwendung der DNA-Sequenzen und des von dieser Erfindung bereitgestellten rekombinanten Systems können große Mengen eines der beiden menschlichen Homologen von mMIP-2 im wesentlichen frei von anderem menschlichen Protein produziert werden, da im rekombinanten System nur ein menschliches Protein exprimiert wird. Derartige Zusammensetzungen, die nur ein MIP-2-Homologes enthalten, sind durch Reinigung aus natürlichen Quellen schwer zu erhalten.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1. Nucleotidsequenz und abgeleitete Proteinsequenz von Maus-MIP-2.
Figur 2. Nucleotidsequenz und abgeleitete Proteinsequenz von hu-MIP-2α.
Figur 3. Nucleotidsequenz und abgeleitete Proteinsequenz von hu-MIP-2β.
Figur 4. Homologie der Nucleotidsequenz von MIP-2- Homologen. Prozentuale Identität der Nucleotidsequenz von mMIP-2, hu-MIP-2α, hu-MIP-2β, hu-gro/MGSA und Maus-KC bezüglich der cDNA (A), des codierenden Bereichs (B) und des nichttranslatierten 3'-Terminus (C).
Figur 5. Aminosäure-Homologie und Ausrichtung von MIP-2-Homolagen und menschlichem IL-8. (A) Prozentuale Identität zwischen den abgeleiteten Aminosäuresequenzen von MIP-2-Homologen, sowie menschlichem IL-8. (B) Die ausgerichteten Aminosäuresequenzen.
Figur 6. Eine Southern-Analyse von genomischer DNA mit Maus-MIP-2-cDNA und menschlicher MIP-2-cDNA, die mit BamHI, 'B', EcoRI, 'E' oder EcoRV, 'R' gespalten worden waren. (A) Maus-DNA, die mit mMIP-2-cDNA hybridisiert wurde. Ein Blot aus gespaltener menschlicher DNA wurde zunächst mit markierter hu-MIP-2β-cDNA hybridisiert (C) und anschließend wurden die hybridisierenden Moleküle vom Filter entfernt und die DNA mit markierter hu-MIP-2α-cDNA erneut hybridisiert (B).

Detaillierte Beschreibung

Die vorliegende Erfindung wird, sofern nicht anders angegeben, unter Verwendung von üblichen im Stand der Technik bekannten molekularbiologischen und mikrobiologischen Verfahren und DNA-Rekombinationsverfahren durchgeführt. Derartige Verfahren werden in der Literatur ausführlich erläutert. Vgl. beispielsweise Maniatis, Fritsch & Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (1982), "DNA Cloning: A Practical Approach" Band I und II (D. N. Glover, Hrsg., 1985), "Oligonucleotid Synthesis" (M. J. Gait, Hrsg., 1984), "Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg., 1985), "Transcription and Translation" (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg., 1984), "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, Hrsg., 1986), "Immobilized Cells and Enzymes" (IRL Press, 1986) und B. Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning" (1984).

Definitionen

In der Beschreibung der vorliegenden Erfindung wird die nachstehend beschriebene Terminologie gemäß den nachstehenden Definitionen verwendet.
Ein "Replikon" ist jedes genetische Element (z. B. Plasmid, Chromosom oder Virus), das als eine autonome Einheit der DNA-Replikation in vivo funktioniert, d. h., unter seiner eigenen Kontrolle replizieren kann.
Ein "Vektor" ist ein Replikon, beispielsweise ein Plasmid, Phage oder Cosmid, mit dem ein anderes DNA-Segment so verknüpft werden kann, daß das verknüpfte Segment replizieren kann.
Ein "doppelsträngiges DNA-Molekül" betrifft die polymere Form von Desoxyribonucleotiden (Adenin, Guanin, Thymin oder Cytosin) als normale, doppelsträngige Melix. Dieser Begriff bezeichnet nur die Primär- und Sekundärstruktur des Moleküls und schränkt die Struktur nicht auf bestimmte tertiäre Formen ein. Daher schließt dieser Begriff eine doppelsträngige DNA von beispielsweise linearen DNA-Molekülen (z. B. Restriktionsfragmenten), Viren, Plasmiden und Chromosomen ein. Zur Erläuterung der Struktur der jeweiligen doppelsträngigen DNA-Moleküle können die Sequenzen hier nachstehend standardmäßig so beschrieben werden, daß Angaben zur Sequenz nur in der Richtung vom 5' zum 3'-Terminus entlang des nichttranskribierten DNA-Strangs (d. h., des Strangs, der eine zur mRNA homologe Sequenz aufweist) erfolgen.
Eine "codierende DNA-Sequenz" ist eine DNA-Sequenz, die in vivo unter der Kontrolle von geeigneten regulatorischen Sequenzen transkribiert und in ein Polypeptid translatiert wird. Die Grenzen der codierenden Sequenz werden durch ein Startcodon am 5'-(Amino)-Terminus und ein Translationsstoppcodon am 3'-(Carboxy)-Terminus festgelegt. Eine codierende Sequenz kann, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, prokaryotische Sequenzen, cDNA von eukaryotischer mRNA, genomische DNA-Sequenzen von eukaryotischer (z. B. Säuger-) DNA und selbst synthetische DNA-Sequenzen einschließen. Ein Polyadenylierungssignal und eine Transkriptionsterminationssequenz liegen üblicherweise 3'-seitig zur codierenden Sequenz.
Eine "Promotorsequenz" ist ein regulatorischer DNA- Bereich, der in einer Zelle die RNA-Polymerase binden und die Transkription einer stromabwärts (3'-seitig) liegenden, codierenden Sequenz initiieren kann. Zur Definition der vorliegenden Erfindung ist an den 3'-Terminus der Promotorsequenz das Translationsstartcodon einer codierenden Sequenz gebunden, und die Promotorsequenz reicht so weit stromaufwärts (5'-seitig), daß die minimale Zahl von Basen oder Elementen, die zur Initiierung der Transkription in über dem Hintergrund nachweisbaren Mengen erforderlich ist, vorhanden ist. Innerhalb der Promotorsequenz liegen eine Transkriptionsinitiationsstelle (üblicherweise durch eine Kartierung mit der Nuclease S1 definiert), sowie Proteinbindende Domänen (Konsensussequenzen), die für die Bindung der RNA-Polymerase verantwortlich sind. Eukaryotische Promotoren enthalten häufig, aber nicht immer, "TATA"-Boxen und "CAT"-Boxen. Prokaryotische Promotoren enthalten Shine-Dalgarno-Sequenzen zusätzlich zu den -10 und -35-Konsensussequenzen.
Eine codierende Sequenz steht in einer Zelle "unter der Kontrolle" der Promotorsequenz, wenn eine an die Promotorsequenz bindende RNA-Polymerase die codierende Sequenz in mRNA transkribiert, die dann wiederum in das von der codierenden Sequenz codierte Protein translatiert wird.
Eine Zelle ist mit exogener DNA "transformiert", wenn sich eine derartige eingeführte exogene DNA innerhalb der Zellwände befindet. Exogene DNA kann in die chromosomale DNA, aus der das Genom der Zelle besteht, integriert (kovalent an sie gebunden) sein oder auch nicht. In Prakaryoten und Hefe kann die exogene DNA beispielsweise in ein episomales Element, beispielsweise ein Plasmid, eingeschlossen sein. In stabil transformierten eukaryotischen Zellen ist die exogene DNA in ein Chromosom integriert, so daß sie durch Replikation des Chromosoms auf Tochterzellen vererbt wird. Diese Stabilität zeigt sich durch die Fähigkeit der eukaryotischen Zelle zur Etablierung von Zellinien oder Clonen, die aus einer Population von exogene DNA enthaltenden Tochterzellen bestehen. Ein "Clon" ist eine Zellpopulation, die von einer einzelnen Zelle oder einem gemeinsamen Vorfahren durch Mitose abstammt. Eine "Zellinie" ist ein Clon einer primären Zelle, die in vitro viele Generationen stabil wachsen kann.
Zwei DNA-Sequenzen sind "im wesentlichen homolog", wenn sich mindestens etwa 85 % (vorzugsweise mindestens etwa 90 % und am meisten bevorzugt mindestens etwa 95 %) der Nucleotide über die definierte Länge der DNA-Sequenzen entsprechen. Im wesentlichen homologe Sequenzen können in einem Southern-Hybridisierungsexperiment beispielsweise unter stringenten, für das jeweilige System definierten Bedingungen identifiziert werden. Die Definition geeigneter Hybridisierungsbedingungen ist im Stand der Technik bekannt. Vgl. z. B. Maniatis et al., a. a. O., DNA Cloning, Bd. I und II, a. a. O., Nucleic Acid Hybridization, a. a. O..
Ein "heterologer" Bereich oder eine "heterologe" Domäne eines DNA-Konstrukts ist ein identifizierbares DNA- Segment innerhalb eines größeren DNA-Moleküls, das in der Natur nicht in Assoziation mit dem größeren Molekül vorkommt. Wenn der heterologe Bereich ein Säugergen codiert, wird das Gen daher üblicherweise durch DNA flankiert sein, die die genomische DNA im Genom des Quellorganismus nicht flankiert. Ein weiteres Beispiel eines heterologen Bereichs ist ein Konstrukt, dessen codierende Sequenz in der Natur nicht vorkommt (z. B. eine cDNA, die von einer Introns enthaltenden, codierenden, genomischen Sequenz abgeleitet ist, oder synthetische Sequenzen, deren Codons sich vom nativen Gen unterscheiden). Durch allele Variationen oder natürlich vorkommende Mutationsereignisse wird kein heterologer DNA- Bereich, wie hier definiert, erhalten.
Die Begriffe "Analyt-Polynucleotid" und "Analyt- Strang" betreffen ein einzel- oder doppelsträngiges Nucleinsäuremolekül, von dem angenommen wird, daß es eine Zielsequenz enthält und in einer biologischen Probe vorhanden sein kann.
Der Begriff "Sonde" bezeichnet eine Struktur, die ein Polynucleotid umfaßt, das mit einer Zielsequenz eine Hybridstruktur bildet, aufgrund einer Komplementarität mindestens einer Sequenz in der Sonde mit einer Sequenz im Zielbereich. Die Polynucleotidbereiche der Sonden können aus DNA und/oder RNA und/oder synthetischen Nucleotidanalogen bestehen.
Der Begriff "Zielbereich" bezeichnet einen Nucleinsäurebereich, der amplifiziert und/oder nachgewiesen werden soll. Der Begriff "Zielsequenz" bezeichnet eine Sequenz, mit der eine Sonde oder ein Primer unter den gewünschten Bedingungen ein stabiles Hybrid bildet.
Der Begriff "Zielpolynucleotidsequenz" bezeichnet eine Polynucleotidsequenz, die aus Nucleotiden, die zur Zielnucleotidsequenz komplementär sind, besteht. Die Sequenz ist von ausreichender Länge und mit der Zielsequenz so komplementär, daß sich eine Duplex bilden kann, die für den Verwendungszweck eine ausreichende Stabilität aufweist.
Der Begriff "Bindungspartner" bezeichnet ein Molekül, das ein Ligandenmolekül mit einer hohen Spezifität binden kann, beispielsweise ein Antigen und einen spezifischen Antikörper dagegen. Üblicherweise müssen die spezifischen Bindungspartner mit ausreichender Affinität binden, um den Analyt-Strang (oder die Duplex aus Kopie/komplementärer Strang bei Einfangsonden) unter den Isolierungsbedingungen zu immobilisieren. Spezifische Bindungspartner sind im Stand der Technik bekannt, und Beispiele dafür sind Biotin und Avidin oder Streptavidin, IgG und Protein A, die zahlreichen bekannten Rezeptor-Liganden-Paare und komplementäre Polynucleotidstränge. Bei komplementären Polynucleotid-Bindungspartnern sind die Partner üblicherweise mindestens etwa 15 Basen bis etwa 40 Basen lang. Ferner enthalten sie üblicherweise mindestens etwa 40 % bis etwa 60 % G und C. Die Polynucleotide können aus DNA, RNA oder synthetischen Nucleotidanalogen bestehen.
Der Begriff "gekuppelt" bezeichnet die Verknüpfung durch kovalente Bindungen oder durch starke nicht-kovalente Wechselwirkungen (z. B. hydrophobe Wechselwirkungen, Wasserstoffbindungen, etc.). Kovalente Bindungen können beispielsweise Ester-, Ether-, Phosphoester-, Amid-, Peptid-, Imid-, Kohlenstoff-Schwefel-, Kohlenstoff-Phosphorbindungen und ähnliche Bindungen sein.
Der Begriff "Träger" bezeichnet jede feste oder halbfeste Oberfläche, an der ein gewünschter Bindungspartner befestigt werden kann. Geeignete Träger sind beispielsweise Glas, Plastik, Metall, Polymergele und ähnliches und können die Form von Kügelchen, Vertiefungen, Eintauchstreifen, Membranen und ähnlichem aufweisen.
Der Begriff "Marker" bezeichnet jedes Atom oder jede Einheit, die zur Bereitstellung eines nachweisbaren (vorzugsweise quantifizierbaren) Signals verwendet werden und an das Polynucleotid oder Polypeptid binden können.
Der Begriff "Markersonde" bezeichnet ein Polynucleotid, das eine an die Zielsequenz bindende Polynucleotidsequenz umfaßt, das heißt, eine Sequenz, die zu einer im Analyt-Polynucleotid nachzuweisenden Zielsequenz komplementär ist. Dieser komplementäre Bereich weist eine ausreichende Länge und Komplementarität zur Zielsequenz auf, damit sich eine Duplex bilden kann, die aus der "Markersonde" und der durch den Marker nachzuweisenden "Zielsequenz" besteht. Er ist entweder direkt oder indirekt über einen Satz von Ligandenmolekülen mit hoher Spezifität füreinander an den Marker gekuppelt. Sätze von Ligandenmolekülen mit hoher Spezifität sind vorstehend beschrieben (vgl. "Bindungspartner")
Der Begriff "biologische Probe" bezeichnet eine Probe aus Gewebe oder Flüssigkeit, die aus einem Individuum isoliert wird, wobei beispielsweise Plasma, Serum, Rückenmarksflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, die äußeren Bereche der Haut, die Atemwege, der Darmkanal und Urogenitaltrakt, Tränen, Speichel, Milch, Blutzellen, Tumore, Organe und außerdem Proben von in-vivo-Zellkulturbestandteilen (einschließlich eines konditionierten Mediums, jedoch ohne Beschränkung darauf, das durch Züchtung von Zellen, vermutlich von Virusinfizierten Zellen, rekombinanten Zellen und Zellbestandteilen, in einem Zellkulturmedium erhalten wird), jedoch ohne Beschränkung darauf, eingeschlossen sind.
"Menschliches Gewebe" ist eine Gefüge von menschlichen Zellen, die eine feste Masse bilden können. Dieser Begriff umfaßt ferner eine Suspension von menschlichen Zellen, beispielsweise Blutzellen, oder eine menschliche Zellinie.
Eine Zusammensetzung, die einen gewählten Bestandteil A umfaßt, ist "im wesentlichen frei" von einem weiteren Bestandteil B, wenn der Bestandteil A mindestens etwa 75 Gew.-% des Gesamtgewichts der Bestandteile A und B ausmacht.
Der gewählte Bestandteil A umfaßt vorzugsweise mindestens etwa 90 Gew.-% des Gesamtgewichts, am meisten bevorzugt mindestens etwa 99 Gew.-% des Gesamtgewichts. Gelegentlich wird es vorgezogen, daß die die Aktivität des gewünschten Proteins aufweisende Zusammensetzung, die ein gewünschtes biologisch aktives Protein umfaßt, das im wesentlichen frei von verunreinigenden Proteinen ist, Moleküle mit nur einem einzigen Molekulargewicht (d. h. eine "homogene" Zusammensetzung) enthält.
Zwei Aminosäuresequenzen sind "im wesentlichen homolog", wenn mindestens etwa 90 %, vorzugsweise mindestens etwa 92 % und stärker bevorzugt mindestens etwa 95 % der Aminosäuren über die definierte Länge der Aminosäuresequenzen übereinstimmen.

Menschliche Homologe von Maus-MIP-2

Die Maus-MIP-2-cDNA ist unter Verwendung eines degenerierten Oligonucleotidsonden-Pools cloniert worden, der einem Teil der N-terminalen Aminosäuresequenz, die auf dem gereinigten Protein ermittelt wurde, entsprach. Wenn Nucleotidsonden, die den codierenden Bereich von Maus-MIP-2- cDNA enthalten, zur Sondierung einer cDNA-Bank aus einer LPS-stimulierten menschlichen Makrophagen-Zellinie (vgl. Beispiel 2) verwendet wurden, wurden zwei unterschiedliche relevante cDNA-Sequenzen identifiziert. Die Proteine, die von diesen beiden cDNA-Sequenzen codiert wurden, erhielten die Bezeichnungen hu-MIP-2α bzw. hu-MIP-2β. Beispiele für die Nucleinsäure- und Aminosäuresequenzen dieser drei Proteine sind in den Figuren dargestellt: Figur 1 = Maus-MIP-2, Figur 2 = menschliches MIP-2α und Figur 3 = menschliches MIP-2β.
"Menschliche Makrophagen-Entzündungsprotein-2β-Polypeptide" (hu-MIP-2β-Polypeptide) umfassen hu-MIP-2β und hu- MIP-2β-Analoge.
"Hu-MIP-2β" ist das menschliche Makrophagen-Entzündungsprotein 2β, ein natürlich vorkommendes, reifes menschliches Protein, das sezerniert wird, beispielsweise durch LPS-stimulierte Makrophagen. Es umfaßt ferner alle Vorläufer und allele Varianten von hu-MIP-2β und außerdem Formen mit heterogenem Molekulargewicht, das durch uneinheitliches Prozessieren in vivo verursacht wird. Ein Beispiel der hu- MIP-2β-Sequenz ist in Figur 2 dargestellt.
"Hu-MIP-2β-Analoge" sind eine Klasse von Peptiden, die umfassen:
1) "Hu-MIP-2β-Muteine", die zu hu-MIP-2β im wesentlichen homologe Polypeptide sind. Die Aminosäuresequenz des "Muteins" unterscheidet sich vorzugsweise von der von hu- MIP-2β durch 8 oder weniger Aminosäurereste, vorzugsweise 7 oder weniger Reste, stärker bevorzugt etwa 5 oder weniger Reste und am stärksten bevorzugt etwa 2 oder weniger Reste. Es wird gelegentlich vorgezogen, daß alle Unterschiede in den Aminosäuresequenzen der beiden Proteine lediglich konservative Aminosäuresubstitutionen betreffen. Konservative Aminosäuresubstitutionen erfolgen, wenn eine Aminosäure im wesentlichen die gleiche Ladung wie die substituierte Aminosäure aufweist und die Substitution keine signifikante Auswirkung auf die lokale Konformation des Proteins aufweist. Alternativ können Veränderungen, beispielsweise die Entfernung von Cystein, die die Aktivität oder Stabilität des Proteins verändern, bevorzugt sein.
2) "Verkürzte hu-MIP-2β-Peptide", die entweder Fragmente von "hu-MIP-2β" oder von "hu-MIP-2β-Muteinen" einschließen, die vorzugsweise entweder (i) eine für hu-MIP-2β einzigartige Aminosäuresequenz, (ii) ein für hu-MIP-2β einzigartiges Epitop oder (iii) eine MIP-2-Aktivität aufweisen,
3) "Hu-MIP-2β-Fusionsproteine", die heterologe Polypeptide einschließen, bestehen aus einem der vorstehend beschriebenen Polypeptide (hu-MIP-2β, hu-MIP-2β-Muteine oder verkürzte hu-MIP-2β-Peptide), die an eine beliebige heterologe Aminosäuresequenz fusioniert sein können. Derartige heterologe Sequenzen sind vorzugsweise an den N-Terminus der hu-MIP-Sequenz fusioniert und umfassen eine Leadersequenz zur Steuerung der Sekretion.
"Einzigartige" hu-MIP-2β-Sequenzen, die entweder Aminosäuresequenzen oder sie codierende Nucleinsäuresequenzen sein können, sind Sequenzen, die mit einer Sequenz eines hu-MIP-2β-Polypeptids identisch sind, die sich jedoch in mindestens einer Aminosäure oder einem Nucleotidrest von den Sequenzen von hMGSA, hu-MIP-2α, mMIP-2 und Maus-KC unterscheiden, und sie sind vorzugsweise sonst im menschlichen Genom nicht zu finden. In ähnlicher Weise ist ein Epitop "einzigartig" für hu-MIP-2β-Polypeptide, wenn es auf hu-MIP- 2β-Polypeptiden, jedoch nicht auf einem anderen Mitglied der homologen Genfamilie gefunden wird.

Merkmale der abgeleiteten Aminosäuresequenz

Die offenen Leserahmen von mMIP-2, hu-MIP-2α und hu- MIP-2β codieren Polypeptide mit 100, 107 bzw. 107 Aminosäuren. Die etwa 30 Aminosäuren am Anfang von jedem der drei Polypeptide weisen die charakteristischen Merkmale einer Signalsequenz auf (Perlman et al., J. Mol. Biol. 167 (1983), 391, von Heijne, J. Mol. Biol. 173 (1984), 243, und von Heijne, Nucleic Acids Res. 14 (1986), 4683). Die N-terminale Aminosäuresequenz, die von sezerniertem mMIP-2 ermittelt wurde, das aus dem konditionierten Medium von LPS- stimulierten RAW 264.7 Zellen (Wolpe et al., 1989) gereinigt wurde, definiert den Beginn des reifen mMIP-2-Proteins in der abgeleiteten Aminosäuresequenz. Der Anfang der abgeleiteten reifen Peptidsequenz für hu-MIP-2α und hu-MIP-2β entspricht dem von mMIP-2 und weist eine Konsensus-Signalpeptid-Spaltungsstelle auf (Perlman et al., 1983, und von Heijne, 1984, 1986). Die abgeleitete Länge der reifen Peptidsequenz für alle drei Proteine ist 73 Aminosäuren. Maus- MIP-2 ist ein basisches Protein und die menschlichen MIP-2- Polypeptide sind ausgehend von abgeleiteten isoelektrischen Punkten von 9,9 und 9,7 für hu-MIP-2α bzw. hu-MIP-2β ebenfalls basisch. Die nativen oder rekombinanten Proteine können O-glycosyliert sein. Keines der drei abgeleiteten Polypeptide weist ein Konsensussignal für die N-gebundene Glykosylierung auf.

Merkmale von Maus-MIP-2- und menschlichen MIP-2-cDNAs

Die Nucleotidsequenzen in cDNAs für mMIP-2, hu-MIP-2α und hu-MIP-2β codieren jeweils einen einzelnen offenen Leserahmen. Die Umgebung der Nucleotidsequenz des initiierenden ATG-Codons von mMIP-2 entspricht der Konsensussequenz, die viele mRNAs von höheren Eukaryoten enthalten (Kozark, Cell 44 (1986), 283, und Kozark, Nucleic Acid Res. 15 (1987), 8125). Den Konsensussequenzen von menschlichem MIP-2α und MIP-2β fehlt das stark konservierte Purin an der Position -3, sie zeigen jedoch viele Merkmale der Konsensussequenz, wie zum Beispiel C-Reste an den Positionen -1, - 2 und -4 und einen G-Rest an der Position +4.
Der nichttranslatierte 3'-Bereich von mMIP-2 enthält das eukaryotische Konsensus-Polyadenylierungssignal AATAAA (Birnstiel et al., Cell 41 (1985), 349) an Position +719 bis 724, worauf eine am Nucleotid +735 beginnende Poly-A-Sequenz folgt. Kein AATAAA-Polyadenylierungssignal wurde im nichttranslatierten 3'-Bereich der Clone hu-MIP-2-4a oder hu-MIP- 2-7d der hu-MIP-2β-cDNA oder in Clonen der hu-MIP-2α-cDNA gefunden. Dies ist höchstwahrscheinlich auf die Tatsache zurückzuführen, daß diese Clone einen verkürzten nichttranslatierten 3'-Bereich aufweisen, da keine Poly-A-Sequenz vorhanden war.
Die Konsensussequenz TTATTTAT, die am nichttranslatierten 3'-Ende von vielen Cytokin-Genen gefunden wird (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 (1986), 1670) und an der Stabilität der mRNA (Shaw et al., Cell 46 (1986), 659) und Translationseffizienz (Kruys et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 6030, und Han et al., J. Exp. Med. 171 (1990), 465) beteiligt ist, ist in allen drei cDNAs in vielen Kopien vorhanden. Diese Sequenz gibt es im nichttranslatierten 3'-Bereich von mMIP-2 an vier Positionen (Positionen +122, +126, +142 und +146), von denen sich zwei überlappen, und in den nichttranslatierten 3'-Bereichen von menschlichem MIP-2β bzw. MIP-2α zweimal (Positionen +158 und +471) bzw. fünfmal (Positionen +148, +152, +156, +160 und +492), von denen sich zwei überlappen.

Homologe von Maus-MIP-2 und menschlichem MIP-2

Die prozentuale Identität der Nucleotidsequenz der drei MIP-2-cDNAs, von denen eine von Mäusen und zwei von Menschen stammen, sowie die der menschlichen gro/MGSA-cDNA (Anisowicz et al., 1987, und Richmond et al., 1988) und der Maus-KC-cDNA (Oquendo et al., 1989, und Cochran et al., Cell 33 (1983), 939) ist in Figur 4A dargestellt. Die menschliche gro/MGSA-cDNA codiert ein Protein mit einer das Melanomwachstum stimulierenden Aktivität (Richmond et al., J. Cell. Physiol. 129 (1986), 375). Maus-KC ist ein durch einen von Thrombozyten-stammenden Wachstumsfaktor (PDGF) induzierbares Gen, das vermutlich das Maus-Homologe von menschlichem MGSA ist. Beachtenswert ist der hohe Grad an Homologie der Nucleotide zwischen den drei menschlichen cDNAs, besonders zwischen hMGSA und hu-MIP-2α. Es gibt eine noch bemerkenswertere Identität der Nucleotidsequenz der drei menschlichen Homologen im codierenden Bereich, wie in Figur 4B dargestellt ist. Die Identität der Nucleotidsequenz in den nichttranslatierten 3'-Bereichen der menschlichen MIP-2- Homologen ist beträchtlich geringer, als die, die in den codierenden Bereichen festgestellt wird, ausgenommen der jeweiligen Bereiche von hu-MIP-2α und hMGSA. Diese beiden cDNAs zeigen auch einen hohen Prozentsatz an Sequenzhomologie über den gesamten nichttranslatierten 3'-Bereich.
Vergleiche der Homologie und eine Ausrichtung der abgeleiteten Aminosäuresequenzen der Vorläuferproteine von MIP-2-Homologen, die hu-MIP-2α, hu-MIP-2β, menschliches gro/MGSA, das Hamsterhomologe von gro/MGSA (ha-gro), mMIP-2 und mKC einschließen, sind in Figur 5(A,B) dargestellt. Die drei menschlichen Proteine sind stark homolog (87 bis 90 %), Aminosäureunterschiede gibt es jedoch überall in den abgeleiteten Sequenzen, besonders an den Carboxytermini der reifen Proteinsequenzen. Auf der Grundlage von abgeleiteten Aminosäurehomologien allein kann hu-MIP-2α, hu-MIP-2β oder menschliches gro/MGSA nicht als menschliches Homologe von mMIP-2 oder Maus-KC nachgewiesen werden.
Die prozentuale Identität der Nucleotidsequenz ist zwischen hu-MIP-2α und hMGSA am größten, und erstreckt sich über die gesamte cDNA. Die Gegenwart sowohl von hu-MIP-2α als auch hu-MIP-2β in einer U937-cDNA-Bank, die unter Verwendung von Poly-A&spplus;-RNA von sowohl mit LPS als auch Phorbolmyristylacetat (PMA) stimulierten Zellen hergestellt worden war, führte dazu, daß auch auf hMGSA abgesucht wurde.
Durch ein Screening von 5 x 10&sup5; Plaques aus der Bank nach der Amplifikation mit Oligonucleotiden, die für hMGSA (und nicht für hu-MIP-2α/β) spezifisch sind, wurden keine positiven Signale nachgewiesen. Es wurden allerdings 56 hu-MIP- 2α-positive Signale nachgewiesen. Dies läßt den Schluß zu, daß die Transkription von gro/MGSA in mit PMA und LPS stimulierten U937-Zellen im Gegensatz zur Transkription des hu-MIP-2α-Gens nicht induziert wird.

Aktivitäten von MIP-2

Maus-MIP-2, das aus dem konditionierten Medium von LPS-stimulierten RAW 264.7-Zellen gereinigt wurde, weist unterschiedliche Aktivitäten auf, die eine CSF-abhängige, die Knochenmarkbildung fördernde Aktivität auf CFU-GM (Broxmeyer et al., 1989), die Auslösung einer lokalen Entzündungsantwort nach einer subcutanen Verabreichung und eine potente chemotaktische Aktivität auf menschliches PMN (Wolpe et al., 1989) einschließen. Die zuletzt genannte Aktivität ist für menschliches IL-8 (hu-IL-8) charakteristisch. Nur von dieser funktionellen Äquivalenz ausgehend wurde angenommen, daß mMIP-2 das Maus-Homologe von hu-IL-8 sein kann. Unter der Voraussetzung jedoch, daß die Aminosäurehomologie von mMIP-2 zu hu-IL-8 im Vergleich zur mMIP-2-Homologie zu hu-MIP-2α, hu-MIP-2β oder hu-MGSA (Figur 5) gering ist, sind mMIP-2 und hu-IL-8 anscheinend keine Maus/Mensch-Homologe. Eine Redundanz der Funktion unter Cytokinen ist nicht ungewöhnlich. Cachectin/TNF-a und Interleukin-1 weisen ein überlappendes Aktivitätsprofil auf (Manogue et al., in: "Cellular and Molecular Aspects of Inflammation", Poste et al., Hrsg., Plenum, NY, S. 123). MIP-2 und IL-8 stellen ein weiteres Beispiel dieser funktionellen Redundanz dar.
Ausgehend von seiner cDNA-Sequenz kann hu-MIP-2β als ein Mitglied der homologen Multigenfamilie, die Maus-MIP-2 einschließt, eingestuft werden. Die Mitglieder dieser Genfamilie weisen in vitro biologische Aktivitäten auf, die eine Aktivierung von Neutrophilen, Chemotaxis von Neutrophilen, MGSA-ähnliche mitogene Wirkung, mitogene Wirkung auf Fibroblasten, Aktivität als CSF-Cofaktor, Chemotaxis von Monocyten, gefäßbildende Wirkung und Aktivität im Zusammenhang mit Entzündungen einschließen. Es können Hu-MIP-2β- Polypeptide gewählt werden, die eine oder mehrere biologische Aktivitäten, die von jedem der Mitglieder der Multigenfamilie gezeigt werden, aufweisen. hu-MIP-2β-Polypeptide können zur Stimulierung der Knochenmarkbildung, als Adjuvans in Impfstofformulierungen und zur Wundheilung therapeutisch verwendet werden.
Die biologische Aktivität von hu-MIP-2β kann durch Tests, die von Wolpe et al. (1989) oder Broxmeyer et al. (1989) (beide sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen) beschrieben werden, gemessen werden. Weitere Tests der hu- MIP-2β-Aktivitäten, beispielsweise der Aktivierung oder Chemotaxis von Neutrophilen, kann in vitro gemessen werden, wie von Waltz et al., J. Exp. Med. 170 (1989), 1745, Clark- Lewis et al., Biochem. 30 (1991), 3128, und Dernyck et al., Biochem. 29 (1990), 10225, (alle sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen) beschrieben wird. Dernyck et al. beschreiben ferner einen biologischen Test mit MGSA. Tests auf eine Wirkung als CSF-Cofaktor werden von Broxmeyer et al., Blood 76 (1990), 1110, und Broxmeyer et al., J. Exp. Med. 170 (1989), 158, (beide sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen) beschrieben.
Einzelne hu-MIP-2β-Polypeptide dienen als Agonisten oder Antagonisten von einer oder mehreren Aktivitäten von allen Mitgliedern der vorstehend beschriebenen Multigenfamilie. Die vorstehend beschriebenen biologischen Aktivitätstests und Rezeptorbindungstests mit Rezeptoren für die Mitglieder der MIP-2-Multigenfamilie werden zum Screenen von hu-MIP-2β-Polypeptiden auf antagonistische oder agonistische Aktivitäten verwendet. Hu-MIP-2β-Polypeptide, die eine antagonistische Aktivität zeigen, konkurrieren mit dem gewünschten Mitglied der Multigenfamilie um eine Bindung an einen Rezeptor, hemmen jedoch auch eine biologische Aktivität des gewünschten Mitglieds. Hu-MIP-2β-Polypeptide mit einer agonistischen Aktivität weisen eine erhöhte biologische Aktivität oder Aktivitäten auf, die mit dem gewünschten Mitglied der Multigenfamilie vergleichbar sind. Einige hu-MIP-2β-Polypeptide mit einer agonistischen Aktivität wirken als Cofaktoren zur Erhöhung der Aktivität eines anderen Mitglieds der Multigenfamilie. Weitere hu-MIP-2β- Polypeptide zeigen zwei oder mehr nicht-überlappende Aktivitäten auf unterschiedliche Mitglieder der Multigenfamilie. Einige hu-MIP-2β-Polypeptide wirken als Agonisten auf eine Aktivität und Antagonisten auf eine andere Aktivität, z. B. wenn ein Polypeptid die Aktivierung von Neutrophilen hemmt und eine erhöhte Aktivierung von Monocyten bewirkt.
Als Therapeutika können hu-MIP-2β-Polypeptide mit einer agonistischen Aktivität für die gleichen therapeutischen Anwendungen wie hu-MIP-2β, sowie für therapeutische Anwendungen von anderen Mitgliedern der Multigenfamilie wirksam verwendet werden. Hu-MIP-2β-Polypeptide mit einer antagonistischen Aktivität unterdrücken eine Malignität und verhindern Entzündungszustände und Autoimmunerkrankungen, beispielsweise eine pathologische Infiltration von Neutrophilen, wobei die Schuppenflechte, rheumatische Arthritis und Lungenkrankheiten eingeschlossen sind.
Ein Beispiel für einen gewünschten Satz von hu-MIP- 2β-Polypeptiden sind die Polypeptide, die die Rezeptorbindungsstelle von IL-8 binden. Hu-MIP-2β kann mit IL-8 wirksam um den IL-8-Rezeptor konkurrieren. Hu-MIP-2β-Polypeptide, die IL-8-Agonisten sind, weisen eine dreidimensionale Struktur auf, die dem Teil von IL-8 gleicht, der den Rezeptor bindet. Kürzliche Untersuchungen der NMR- und Röntgenstrukturen von IL-8 sind zur Ermittlung der Rezeptorbindungsstelle nützlich. (Clore et al., J. Biol. Chem. 264 (1989), 18907, Clore et al., Biochem. 29 (1990), 1689, Clore et al., J. Mol. Biol. 217 (1991), 611, und Baldwin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 502).
Eine Menge des hu-MIP-2β-Polypeptids, die "eine wirksame Menge" zur Stimulierung der Knochenmarkbildung in myelopoetischen Zellen ist, ist die Menge, die eine nachweisbare Erhöhung der Knochenmarkbildung bewirkt (vgl. z. B. den von Broxmeyer et al. (1989) beschriebenen Test). Eine wirksame Menge an hu-MIP-2β-Polypeptid ist im Bezug auf andere Aktivitäten derartiger Peptide dementsprechend die Menge, die eine nachweisbare Antwort im geeigneten Test, wie vorstehend beschrieben, produziert.

Herstellung von hu-MIP-2β-enthaltenden Zusammensetzungen

Zusammensetzungen, die im wesentlichen von anderem menschlichen Protein freie hu-MIP-2β-Polypeptide enthalten, können durch Reinigung aus natürlichen Quellen, durch chemische Synthese oder DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden. Ein Rohextrakt von natürlich produziertem hu-MIP-2β kann aus jeder geeigneten Quelle für das native Protein hergestellt werden. Eine bevorzugte Quelle ist eine LPS- stimulierte menschliche Makrophagenzellinie Ein zellfreier Extrakt, der hu-MIP-2β enthält, wie beispielsweise durch einen nachstehend beschriebenen Immuntest ermittelt werden kann, wird als Ausgangsmaterial für eine weitere Reinigung verwendet. Diese Reinigung kann gemäß Verfahren, die dem Fachmann für Proteinreinigung vertraut sind, durchgeführt werden. Es können beispielsweise verschiedene Chromatographieverfahren verwendet werden. Beispiele für verwendbare Säulen sind eine DEAE-Cellulosesäule oder eine Anionenaustauschersäule, sowie eine Gelpermeationssäule. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren ist das von Wolpe et al. (1989) beschriebene. Das Reinigungsverfahren kann beispielsweise durch einen Immuntest, wie nachstehend beschrieben, oder durch Tests der MIP-2-Aktivität gemäß Wolpe et al. (1989) oder Broxmeyer et al. (1989), die hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen sind, überwacht werden.
Das hu-MIP-2β oder Peptidfragmente davon können auch unter Verwendung von Immunaffinitätsverfahren gereinigt werden. Die Verwendung von erfindungsgemäßen Antikörpern zur Reinigung der erfindungsgemäßen Proteine ermöglicht eine gute Trennung von den Proteinen, die ihnen am ähnlichsten sind. Weitere Reinigungsverfahren sind im Stand der Technik selbstverständlich auch bekannt und können zur Reinigung der erfindungsgemäßen Peptide verwendet werden.
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen hu-MIP-2β-Polypeptide durch chemische Synthese hergestellt werden. Es kann beispielsweise das Merrifield- Verfahren (Journal of American Chemical Society Bd. 85 (1968), 2149-2154) verwendet werden.
Hu-MIP-2β kann aus einer geeigneten Gewebe/Flüssigkeitsquelle gereinigt werden. Es wird jedoch vorzugsweise durch eine hu-MIP-2β codierende DNA-Sequenz, die chemisch synthetisiert oder durch verschiedene Vorgehensweisen isoliert werden kann, durch rekombinante Verfahren hergestellt. Die zu synthetisierende DNA-Sequenz kann mit geeigneten Codons für die hu-MIP-2β-Aminosäuresequenz ausgestattet werden. Üblicherweise werden bei einer Verwendung der Sequenz zur Expression vom gewünschten Wirt bevorzugte Codons ausgewählt. Die vollständige Sequenz wird aus überlappenden Oligonucleotiden, die durch Standardverfahren hergestellt werden, konstruiert und zu einer vollständig codierenden Sequenz zusammengefügt. Vgl. z. B. Edge, Nature 292 (1981), 756, Nambair et al., Science 223 (1984), 1299, und Jay et al., J. Biol. Chem. 259 (1984), 6311. Die Isolierungsverfahren beruhen teilweise auf Nucleinsäurehybridisierung unter Verwendung von geeigneten Oligonucleotidsonden. Derartige Sonden können ausgehend von den hier beschriebenen DNA- oder Aminosäuresequenzen synthetisiert oder aus den ebenfalls hier beschriebenen genomischen oder cDNA-Clonen isoliert werden.

Herstellung von Nucleinsäurebanken

Die Grundstrategien zur Herstellung von Oligonucleotidsonden und DNA-Banken, sowie ihr Screening durch Nucleinsäurehybridisierung, sind dem Durchschnittsfachmann vertraut. Vgl. z. B. "DNA Cloning" Bd. I (D. P. Glover, Hrsg., 1985), "Nucleic Acid Hybridization" (B. D. Hames & S. J. Higgins, Hrsg., 1985), "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gate, Hrsg., 1984), T. Maniatis et al., "Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (1982), B. Perbal, "A Practical Guide To Molecular Cloning" (1984). Zunächst wird eine DNA-Bank hergestellt. Die Bank kann aus einer genomischen DNA-Bank aus einer menschlichen Quelle bestehen. Menschliche genomische Banken sind im Stand der Technik bekannt. Vgl. z. B. Maniatis et al., Cell 15 (1978), 687-701, und Lawn et al., Cell 15 (1978), 1157-1174. Stärker bevorzugt sind DNA- Banken, die aus durch eine reverse Transkription aus Poly-A- RNA (mRNA) hergestellter cDNA konstruiert werden. Vgl. z. B. die US-Patente mit den Nrn. 4,446,325, 4,440,859, 4,443,140, 4,431,7400, 4,370,417 und 4,363,877. Die mRNA wird aus einer Zellinie oder einem Gewebe, das hu-MIP-2β vermutlich exprimiert, beispielsweise einer Makrophagen-Zellinie, isoliert. Eine geeignete mRNA-Quelle für die Konstruktion von cDNA- Banken ist die Zellinie U937. Die genomische DNA oder cDNA wird in einen zur Konstruktion einer Bank geeigneten Vektor cloniert. Ein bevorzugter Vektor ist ein Bacteriophagen- Vektor, beispielsweise einer der Lambda-Phagen. Die Konstruktion einer geeigneten Bank ist im Stand der Technik bekannt. Vgl. z. B. B. Perbal, a. a. O..

Herstellung von Nucleinsäuresonden

Nach der Konstruktion der Bank werden Oligonucleotide zum Absuchen der Bank verwendet, um das eine hu-MIP-2β- Polypeptid codierende Sequenz tragende Segment zu identifizieren. Die Sonden werden üblicherweise chemisch synthetisiert, indem vorzugsweise von bekannten Nucleinsäuresequenzen oder alternativ von abgeleiteten Aminosäuresequenzen von cDNA-Clonen ausgegangen wird.
Alternativ kann es in Abwesenheit einer guten Gewebequelle für die mRNA erforderlich sein, Sequenzen aus dem Protein zu erhalten. Die N-terminale Sequenz kann durch eine Analyse der N-terminalen Sequenz erhalten werden. Die Ermittlung der internen Sequenz kann beispielsweise durch eine Staph-V8-Proteolyse von in üblicher Weise gereinigtem Protein mit einer anschließenden reduktiven Alkylierung und Trennung der Spaltprodukte durch HPLC durchgeführt werden. Die Elutionspeaks, die diskreten Enzymfragmenten entsprechen, können anschließend durch Standardverfahren sequenziert werden. Von der Aminosäuresequenz können Oligonucleotide abgeleitet werden und zur Verwendung als Hybridisierungssonden zur Lokalisierung entweder von cDNA-Sequenzen oder den Exons in der genomischen DNA hergestellt werden. Schließlich werden die isolierten Exons so zusammen ligiert, daß sie der das reife Protein codierenden Nucleinsäuresequenz entsprechen.
Nucleotidsequenzen werden so ausgewählt, daß sie den die Aminosäuresequenz codierenden Codons entsprechen. Da der genetische Code redundant ist, ist es üblicherweise erforderlich, mehrere Oligonucleotide zu synthetisieren, um alle oder eine vernünftige Zahl von Nucleotidsequenzen, die einen bestimmten Bereich des Proteins codieren, abzudecken. Es wird daher üblicherweise vorzugsweise ein Sequenzbereich für die Sonden gewählt, der keine Aminosäuren von stark degenerierten Codons enthält. Es ist jedoch nicht erforderlich, Sonden mit Codons herzustellen, deren Verwendung bei Menschen (auf denen die Herstellung der Bank beruht) selten ist.
Zur Immunpräzipitation eines beliebigen gewünschten Proteins, das in einem ausgewählten Gewebe, Zellextrakt oder einer Körperflüssigkeit vorhanden ist, können Antikörper dagegen verwendet werden. Gereinigte MIP-2 aus dieser Quelle können sequenziert werden und als Grundlage zur Entwicklung von spezifischen Sonden, wie vorstehend beschrieben, verwendet werden.
Ein Fachmann kann die Herstellung von Sonden für erforderlich halten, die ziemlich lang sind und/oder Bereiche der Aminosäuresequenz umfassen, die ein großes Maß an Redundanz in den entsprechenden Nucleinsäuresequenzen aufweisen. Sonden, die das vollständige Gen oder einen wesentlichen Teil des Gens umfassen, können aufgrund des erwarteten Grads an Homologie ebenfalls geeignet sein. Die Sequenz ist über die Artgrenzen hinaus stark konserviert, und daher können Sonden, die die codierende Sequenz von anderen Arten, beispielsweise der Maus, enthalten, zum Screening von aus menschlicher DNA hergestellten Banken leicht verwendet werden. In anderen Fällen kann es erforderlich sein, zwei Sätze von Sonden für jeweils einen anderen Bereich des Gens gleichzeitig zu verwenden. Während die exakte Länge der einzelnen verwendeten Sonde nicht kritisch ist, sind übliche Sondensequenzen nicht länger als 1 000 Nucleotide, vorzugsweise nicht länger als 500 Nucleotide und stärker bevorzugt nicht länger als 250 Nucleotide. Sie können auch nicht länger als 100 Nucleotide und sogar nicht länger als 75 Nucleotide sein. Es ist im Stand der Technik allgemein bekannt, daß Sonden von etwa 14 bis etwa 20 Basenpaaren üblicherweise wirksam sind. Da hu-MIP-2β zu einer Gruppe von stark homologen Proteinen gehört, werden Sonden, die für hu- MIP-2β einmalige Sequenzen enthalten, zur Unterscheidung zwischen verwandten Sequenzen bevorzugt. Längere Sondensequenzen sind gegebenenfalls erforderlich, um einmalige Polynucleotidbereiche mit zur Unterscheidung von verwandten Zielsequenzen ausreichenden Unterschieden einzubeziehen. Daher weisen die Sonden eine Länge von etwa 10 bis etwa 100 Nucleotide und stärker bevorzugt von etwa 20 bis etwa 50 Nucleotide auf.

Verwendung von Sonden zur Selektion von Clonen

Wie im Stand der Technik bekannt ist, werden Oligonucleotidsonden unter Verwendung von Standardverfahren mit einem Marker, beispielsweise einem Radionucleotid oder Biotin, markiert. Der markierte Satz von Sonden wird anschließend im Screening-Schritt verwendet, der darin besteht, daß die einzelsträngige Sonde an eine isolierte einzelsträngige DNA der Bank gemäß Standardverfahren hybridisieren kann. Es können entweder stringente oder permissive Hybridisierungsbedingungen geeignet sein, deren Wahl von mehreren Faktoren abhängt, unter anderem, jedoch ohne Beschränkung darauf, von der Länge der Sonde und davon, ob die Sonde und die Bank von der gleichen Art stammen und die Arten evolutionär nahe oder entfernt verwandt sind. Der Fachmann weiß die Hybridisierungsbedingungen zu optimieren, so daß homologe Sequenzen isoliert werden können und vor Hintergrundhybridisierungen nachweisbar sind. Die Grundvoraussetzung ist, daß die Hybridisierungsbedingungen ausreichend stringent sind, so daß eine selektive Hybridisierung erfolgt, d. h., die Hybridisierung wird durch ein Mindestmaß an Nucleinsäurehomologie (z. B. mindestens etwa 75 %) bewirkt, im Gegensatz zu einer nicht-spezifischen Bindung oder Hybridisierung aufgrund eines geringeren Grads an Homologie. Vgl. allgemein: "Nucleic Acid Hybridization", a. a. O.. Aufgrund der Zahl der mit mMIP-2 eng verwandten Sequenzen werden sowohl eine einzigartige Sondensequenz als auch stringente Hybridisierungsbedingungen bevorzugt. Nach der Identifizierung eines Clons aus der abgesuchten Bank durch positive Hybridisierung kann er zur Bestätigung, daß der bestimmte Clon eine codierende Sequenz für das gewünschte Protein enthält, durch eine Restriktionsenzymanalyse und DNA-Sequenzierung weiter charakterisiert werden.

Genomische Clone

Partielle genomische Clone können durch ein beliebiges Verfahren zu vollständigen Clonen verlängert werden. Ein Clon kann entweder 5'- oder 3'-seitig unter Verwendung des Verfahrens des "chromosome walking" verlängert werden, um den Einschluß des gesamten Gen-codierenden Bereichs sicherzustellen. Die Restriktionsfragmente dieser Clone können anschließend beispielsweise mit das gewünschte Protein codierenden cDNA-Sonden abgesucht werden. Wenn zwischen diesen Exons eine ausreichende Homologie besteht, können weitere Exons mit dem gleichen cDNA-Clon identifiziert werden.
Weitere codierende Bereiche in genomischen Clonen können durch direkte Sequenzierung der DNA stromabwärts eines clonierten Exons unter Verwendung von modernen M13-Didesoxy-Sequenzierungsverfahren schnell identifiziert werden. Alle drei Leserahmen der Sequenz werden anschließend untersucht, um einen offenen Leserahmen nachzuweisen. Es werden auch noch weitere Exons gefunden, da sie an beiden Seiten von Intron-Spleißsignalen begrenzt sind und Aminosäuren codieren, die für MIP-2-Mitglieder von unterschiedlichen Arten identisch sind.
Wenn die korrekte, das Gen codierende Sequenz von mindestens einem Exon von hu-MIP-2β bekannt ist, kann sie somit verwendet werden, um durch ein oder mehrere der nachstehend beschriebenen Verfahren den das gesamte Protein codierenden Bereich des Enzyms zu erhalten. Das gewünschte Sequenzfragment kann aus dem Clon entfernt und in einen geeigneteren Vektor, beispielsweise pBR322, inseriert werden, so daß große Mengen der DNA, die nur das Fragment selber enthalten, erhalten werden und als Hybridisierungssonde verwendet werden können. Alternativ kann ein Oligonucleotid, das einmaligen Bereichen des codierenden Bereichs entspricht, synthetisiert werden. Jedes kann als Hybridisierungssonde für eine genomische DNA-Bank verwendet werden.

cDNA-Clone

Genomische Clone von Säugern (partiell oder vollständig), die die längsten Insertionen des Gens enthalten, können in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters (CHO) zusammen mit einer Plasmid-DNA, die einen Marker, beispielsweise Neomycin- und Metallothionin-Resistenzgene, enthält, tranfiziert werden. Überlebende Zellen, die in Gegenwart des Antibiotikums G418 und Cd&spplus;&spplus; selektiert werden, können auf vorhandene RNA-Transkripte analysiert werden, die in einem Northern-Blot von extrahierter RNA an die das Protein codierende Sequenz hybridisieren. Clone, die die gewünschten Transkripte enthalten, können anschließend als mRNA-Quelle zur Konstruktion einer cDNA-Bank verwendet werden. Alternativ können Northern-Blots von mRNA, die aus verschiedenen Quellen, beispielsweise von peritonealen Zellen und Eiter, endothelialem Gewebe und Leukocyten des peripheren Bluts, Lymphocyten und Makrophagen, erhalten werden, auf eine Hybridisierung mit der Sonde getestet werden. Ferner kann auch mRNA von verschiedenen Zellinien, beispielsweise von LPS-stimulierten U937 und HL60, getestet werden. Jedes Gewebe oder jede Zellquelle, die nachweisbare Mengen an hybridisierender mRNA enthält, kann anschließend zur Herstellung einer cDNA-Bank verwendet werden, die mit den gleichen Sonden abgesucht wird, um eine das gewünschte Protein codierende cDNA mit vollständiger Länge nachzuweisen.

Ortsspezifische Mutagenese

Wie vorstehend beschrieben, wird bei der Herstellung einer MIP-2-codierenden DNA-Sequenz eine synthetische Herstellung einer Clonierung vorgezogen. Synthetische DNA- Sequenzen ermöglichen eine leichte Konstruktion von Genen, die hu-MIP-2β-Analoge, besonders "Muteine", exprimieren. Alternativ kann Muteine codierende DNA durch ortsspezifische Mutagenese von nativen MIP-2-Genen oder cDNAs hergestellt werden, und Muteine können unter Verwendung von Standardverfahren der Polypeptidsynthese direkt hergestellt werden.
Eine ortsspezifische Mutagenese wird vorzugsweise durch Polymerase-Kettenreaktionsverfahren unter Verwendung eines synthetischen Primer-Oligonucleotids durchgeführt, das mit Ausnahme einer die gewünschte Mutation enthaltenden begrenzten Fehlpaarung zu einer einzelsträngigen Phagen-DNA komplementär ist, die die zu mutierende Sequenz enthält. Das synthetische Oligonucleotid wird also als Primer verwendet, um die Synthese eines zum Phagen komplementären Strangs zu steuern, und die erhaltene doppelsträngige DNA wird in ein Phagen-unterstützendes Wirtsbakterium transformiert. Kulturen der transformierten Bakterien werden auf Top-Agar, der eine Plaquebildung aus einzelnen, den Phagen enthaltenden Zellen ermöglicht, plattiert. Theoretisch enthalten 50 % der neuen Plaques den Phagen, der als Einzelstrang die mutierte Form aufweist. 50 % weisen die ursprüngliche Sequenz auf. Die erhaltenen Plaques werden mit einem Kinase-behandelten synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die eine Hybridisierung bei einer exakten Übereinstimmung ermöglicht, bei der jedoch die Fehlpaarungen mit dem ursprünglichen Strang ausreichen, um eine Hybridisierung zu verhindern. Plaques, die mit der Sonde hybridisieren, werden anschließend abgenommen, gezüchtet, und die DNA wird gewonnen.

Clonierung zur Expression

Nach deren Herstellung oder Isolierung kann eine codierende Sequenz für hu-MIP-2β in einen geeigneten Vektor oder ein geeignetes Replikon cloniert werden und so eine Zusammensetzung behalten, die im wesentlichen frei von Vektoren ist, die keine MIP-2 codierende Sequenz enthalten (z. B. frei von anderen Clonen der Bank). Zahlreiche Clonierungsvektoren sind dem Fachmann bekannt, der auch einen geeigneten Clonierungsvektor auswählen kann. Beispiele für rekombinante DNA-Vektoren zur Clonierung und Wirtszellen, die sie transformieren können, sind die verschiedenen Vektoren des Bacteriophagen Lambda (E. coli), pBR322 (E. coli), pACYC177 (E. coli), pkT230 (Gram-negative Bakterien), pGV1106 (Gram-negative Bakterien), pLAFR1 (Gram-negative Bakterien), pHV14 (E. coli und Bacillus subtilis), pBD9 (Bacillus), pIJ61 (Streptomyces), pUC6 (Streptomyces), Actinophage, dC31 (Streptomyces), YIp5 (Saccharomyces), YCp19 (Saccharomyces) und Rinder-Papillomavirus (Säugerzellen). Vgl. allgemein: "DNA Cloning" Bd. I & II, a. a. O., T. Maniatis et al., a. a. O., und B. Perbal, a. a. O..
Die erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen und DNA-Moleküle können unter Verwendung eines breiten Spektrums von Wirt/Vektor-Kombinationen exprimiert werden. Geeignete Vektoren können beispielsweise chromosomale und nicht-chromosomale Segmente umfassen (beispielsweise verschiedene bekannte Derivate von SV40 und bekannte bakterielle Plasmide, z. B. Plasmide von E. coli, einschließlich colE1, pcR1, pBR322, pMB9 und RP4) oder synthetische DNA-Sequenzen, Phagen-DNAs (M13), einschließlich Phagenderivate (z. B. NM 989) und filamentöse einzelsträngige DNA-Phagen, in Hefen verwendbare Vektoren (beispielsweise das 2 Micron-Plasmid), in eukaryotischen Zellen verwendbare Vektoren (beispielsweise in Tierzellen verwendbare Vektoren, z. B. die Vektoren, die von SV40-Adenovirus und Retrovirus stammende DNA-Sequenzen enthalten) und Vektoren, die von Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs (beispielsweise Plasmide, die zur Verwendung von Phagen-DNA modifiziert worden sind) oder von anderen Derivaten davon stammen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die codierende Sequenz für das hu-MIP-2β-Polypeptid unter die Kontrolle eines Promotors, einer Ribosomen-Bindungsstelle (für bakterielle Expression) und gegebenenfalls eines Operators (hier nachstehend zusammen als "Kontroll"-Elemente bezeichnet) gestellt, so daß die das hu-MIP-2β-Polypeptid codierende Sequenz in der Wirtszelle, die mit einem diese Expressionskonstruktion enthaltenden Vektor transformiert ist, in RNA transkribiert wird. Die codierende Sequenz kann gegebenenfalls ein Signalpeptid oder eine Leadersequenz enthalten. Wenn die codierende Sequenz ein Signalpeptid enthält, kann es gegebenenfalls die natürlich mit hu-MIP-2β assoziierte Signalsequenz sein. Reifes hu-MIP-2β wird beispielsweise in Bakterien vorzugsweise durch Expression einer codierenden Sequenz produziert, die das Säuger-Signalpeptid nicht enthält, sondern eine Leadersequenz, die durch den bakteriellen Wirt in einer posttranslationalen Prozessierung entfernt wird. Vgl. z. B. die US-Patente mit den Nrn. 4,431,739, 4,425,437 und 4,338,397.
Der Expressionsvektor enthält vorzugsweise bereits mindestens eine Expressionskontrollsequenz, die mit der codierenden DNA-Sequenz funktionell verbunden werden kann, wenn sie zur Kontrolle und Regulierung der Expression der clonierten DNA-Sequenz in den Vektor inseriert wird. Beispiele für geeignete Expressionskontrollsequenzen sind das lac-System, trp-System, tac-System, trc-System, die Hauptoperator- und Promotorbereiche des Phagen Lambda, der Kontrollbereich des fd-Hüllproteins, die glykolytischen Promotoren der Hefe (z. B. der Promotor für die 3-Phosphoglyceratkinase), Promotoren der sauren Phosphatase der Hefe (z. B. Pho5), Promotoren des alpha-Paarungsfaktors der Hefe und Promotoren, die von Polyoma, Adenovirus, Retrovirus oder Simianvirus (z. B. die frühen und späten Promotoren von SV40) und weiteren Sequenzen stammen, von denen bekannt ist, daß sie die Expression von Genen von prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen und ihrer Viren oder Kombinationen davon kontrollieren.
In einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor sind die hu-MIP-2β-codierende Sequenz und die geeigneten Kontrollsequenzen so angeordnet, daß die codierende Sequenz unter der "Kontrolle" der Kontrollsequenzen transkribiert werden kann (d. h., eine RNA-Polymerase, die an den Kontrollsequenzen an die DNA-Moleküle bindet, transkribiert die codierende Sequenz). Die Kontrollsequenzen können vor der Insertion in einen Vektor, beispielsweise in die vorstehend beschriebenen Clonierungsvektoren, an die codierende Sequenz ligiert werden. Alternativ kann die codierende Sequenz direkt in einen Expressionsvektor, der bereits Kontrollsequenzen und eine geeignete Restriktionsstelle enthält, cloniert werden. Zur Expression des gewünschten Proteins in Prokaryoten und Hefe sind die Kontrollsequenzen zur codierenden Sequenz notwendigerweise heterolog. Wenn die Wirtszelle prokaryotisch ist, muß die codierende Sequenz außerdem frei von Introns sein (z. B. cDNA). Wenn die gewählte Wirtszelle eine Säugerzelle ist, können die Kontrollsequenzen zur hu-MIP-2β codierenden Sequenz heterolog oder homolog sein, und die codierende Sequenz kann entweder aus genomischer DNA (Introns enthaltend) oder cDNA bestehen. Codierende Sequenzen, die entweder aus genomischer DNA oder cDNA bestehen, können in Hefe exprimiert werden.
Innerhalb eines bestimmten Expressionsvektors können verschiedene Stellen zur Insertion der erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen gewählt werden. Diese Stellen werden üblicherweise nach der sie spaltenden Restriktionsendonuclease bezeichnet. Sie sind dem Fachmann vertraut. Es ist natürlich selbstverständlich, daß ein geeigneter erfindungsgemäßer Expressionsvektor keine Restriktionsendonucleasestelle zur Insertion des gewählten DNA-Fragments aufweisen muß. Stattdessen kann der Vektor durch alternative Verfahren mit dem Fragment verbunden werden. Für die Wahl des Expressionsvektors und besonders der Stelle, die zur Insertion eines gewählten DNA-Fragments und zur funktionellen Verbindung mit einer Expressionskontrollsequenz darin ausgewählt wird, sind mehrere Faktoren maßgebend, z. B. die Zahl der für ein bestimmtes Restriktionsenzym empfindlichen Stellen, Größe des Proteins und Expressionscharakteristika, beispielsweise die relative Lage von Start- und Stoppcodons zum Vektor. Eine Insertionsstelle für eine DNA-Sequenz wird durch ein Abwägen dieser Faktoren gewählt, wobei nicht jede Wahl jeweils gleich effektiv ist.
Es gibt im Stand der Technik mehrere prokaryotische Expressionsvektoren. Vgl. z. B. die US-Patente mit den Nrn. 4,440,859, 4,436,815, 4,431,740, 4,431,739, 4,428,941, 4,425,437, 4,418,149, 4,411,994, 4,366,246, 4,342,832, vgl. ferner die veröffentlichte U.K.-Anmeldung mit den Nrn. GB 2 121 054, GB 2 008 123, GB 2 007 675 und die veröffentlichte europäische Anmeldung mit der Nr. 103,395. Bevorzugte prokaryotische Expressionssysteme werden in E. coli verwendet. Weitere bevorzugte Expressionsvektoren sind die in eukaryotischen Systemen verwendeten. Für ein bevorzugtes eukaryotisches Expressionssystem wird das Vacciniavirus, das im Stand der Technik bekannt ist, verwendet. Vgl. z. B. Mackett et al., J. Virol. 49 (1984), 857, "DNA Cloning" Bd. II, S. 191-211, a. a. O., und die PCT-Veröffentl. WO 86/07593. Hefe-Expressionsvektoren sind im Stand der Technik bekannt. Vgl. z. B. die US-Patente mit den Nrn. 4,446,235, 4,443,539 und 4,430,428, vgl. ferner die veröffentlichten europäischen Anmeldungen mit den Nrn. 103 409, 100 561 und 96 491. Ein weiteres Expressionssystem ist der Vektor pHS1, der Ovarialzellen des chinesischen Hamsters transformiert. Die Verwendung des Vektors wird in der PCT-Veröffentl. WO 87/02062 beschrieben.
Beispiele für geeignete Expressionswirte sind bekannte eukaryotische und prokaryotische Wirte, beispielsweise Stämme von E. coli, beispielsweise E. coli SG-936, E. coli HB 101, E. coli w3110, E. coli X1776, E. coli X2282, E. coli DHI und E. coli MRC1, Pseudomonas, Bacillus, beispielsweise Bacillus subtilis, Streptomyces, Hefen und andere Pilze, Tierzellen, beispielsweise CCS-Zellen und CHO- Zellen, und menschliche Zellen und Pflanzenzellen in Gewebekultur.
Nicht alle Wirt/Expressionsvektor-Kombinationen funktionieren natürlich mit gleicher Effizienz bei der Expression von erfindungsgemäßen DNA-Sequenzen oder der Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide. Eine bestimmte Wahl einer Wirt/Expressionsvektor-Kombination kann jedoch durch den Fachmann vorgenommen werden. Die Wahl beruht beispielsweise auf der Abwägung mehrerer Faktoren. Dazu gehören die Kompatibilität von Wirt und Vektor, Toxizität der von der DNA-Sequenz codierten Proteine für den Wirt, Leichtigkeit der Gewinnung des gewünschten Proteins, Expressionscharakteristika der DNA-Sequenzen und der funktionell mit ihnen verbundenen Expressions-Kontrollsequenzen, biologische Sicherheit, Kosten und die Faltung, Formung oder jede andere erforderliche Postexpressionsmodifikation des gewünschten Proteins. Die Wirtszelle exprimiert vorzugsweise keine Proteasen, die hu-MIP-2β abbauen.

Clonieren in einem Hefe-Expressionssystem

Ein bevorzugtes Expressionssystem ist Hefe. Hu-MIP-2β kann durch eine Hefezelle exprimiert werden, die mit einem Expressionsvektor, der eine hu-MIP-2β-codierende DNA-Sequenz unter der Kontrolle eines Hefepromotors enthält, transformiert ist. Derartige Expressionsvektoren können wie nachstehend beschrieben konstruiert werden.
Ein Hefepromotor ist jede DNA-Sequenz, die eine Hefe- RNA-Polymerase binden und die stromabwärts (3'-seitig) erfolgende Transkription einer codierenden Sequenz (z. B. eines Strukturgens) in mRNA initiieren kann. Ein Promotor weist einen Bereich zur Initiation der Transkription auf, der üblicherweise in der Nähe des 5'-Endes der codierenden Sequenz liegt. Dieser Bereich zur Initiation der Transkription schließt üblicherweise eine RNA-Polymerase-Bindungsstelle (die "TATA-Box") und eine Transkriptionsinitiationsstelle ein. Ein Hefe-Promotor kann auch eine zweite Domäne, die als stromaufwärts gelegene Aktivatorsequenz ("upstream activation sequence", UAS) bezeichnet wird, aufweisen, die, falls sie vorhanden ist, üblicherweise einen größeren Abstand zum Strukturgen aufweist. Die UAS ermöglicht eine regulierte (induzierbare) Expression. Eine konstitutive Expression erfolgt in Abwesenheit einer UAS. Die Regulierung der Expression kann entweder positiv oder negativ sein, wodurch die Transkription entweder erhöht oder reduziert wird.
Da Hefe ein fermentierender Organismus mit einem aktiven Stoffwechsel ist, liefern Sequenzen, die am Stoffwechsel beteiligte Enzyme codieren, besonders geeignete Promotorsequenzen. Beispiele dafür sind die Alkoholdehydrogenase (ADH) (veröffentlichte europäische Anmeldung Nr. 284 044), Enolase, Glucokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAP oder GAPDH), Hexokinase, Phosphofructokinase, 3-Phosphoglyceratmutase und Pyruvatkinase (PyK) (veröffentlichte europäische Anmeldung Nr. 329 203). Das saure Phosphatase codierende Hefe-PHCS-Gen liefert ebenfalls geeignete Promotorsequenzen [Miyanohara et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 1].
Synthetische Promotoren, die in der Natur nicht vorkommen, können ebenfalls als Hefe-Promotoren verwendet werden. UAS-Sequenzen eines Hefe-Promotors können beispielsweise mit dem Transkriptionsaktivierungsbereich eines anderen Hefe-Promotors verbunden werden, wodurch ein synthetischer Hybridpromotor entsteht. Ein Beispiel für derartige Hybridpromotoren ist die ADH-Kontrollsequenz, die mit dem GAP-Transkriptionsaktivierungsbereichs verbunden ist (US- Patente mit den Nrn. 4,876,197 und 4,880,734). Weitere Beispiele für Hybridpromotoren sind Promotoren, die aus den regulatorischen Sequenzen entweder der ADH2-, GAL4-, GAL10- oder der PHO5-Gene bestehen, die mit dem Transkriptionsaktivierungsbereich eines Gens eines glycolytischen Enzyms, beispielsweise GAP oder PyK, kombiniert sind (veröffentlichte europäische Anmeldung Nr. 164 556). Ein Hefe-Promotor kann ferner natürlich vorkommende, nicht von Hefe stammende Promotoren einschließen, die die Hefe-RNA-Polymerase binden und die Transkription initiieren können. Vgl. z. B. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 1078, Henikoff et al., Nature 283 (1981), 835, Hollenberg et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 96 (1981), 119, Hollenberg et al., "The Expression of Bacterial Antibiotic Resistance Genes in the Yeast Saccharomyces cerevisiae", in: Plasmids of Medical Environmental and Commercial Importance (Hrsg. K. N. Timmis und A. Puhler), Mercereau-Puigalon et al., Gene 11 (1980), 163, und Panthier et al., Curr. Genet. 2 (1980), 109.
Ein DNA-Molekül kann intrazellulär exprimiert werden. Eine Promotorsequenz kann mit dem DNA-Molekül direkt verbunden werden, wobei dann die erste Aminosäure am N-Terminus des rekombinanten Proteins immer ein vom ATG-Startcodon codiertes Methionin ist. Das Methionin am N-Terminus kann gegebenenfalls durch eine in vitro-Inkubation mit Bromcyan vom Protein abgespalten werden.
Fusionsproteine stellen eine Alternative zur direkten Expression dar. Üblicherweise wird eine DNA-Sequenz, die den N-terminalen Bereich eines endogenen Hefeproteins oder eines anderen stabilen Proteins codiert, mit dem 5'-Ende von heterologen codierenden Sequenzen fusioniert. Nach der Expression liefert diese Konstruktion zwei fusionierte Aminosäuresequenzen. Beispielsweise kann das Hefe- oder menschliche Superoxiddismutase (SOD)-Gen an den 5'-Terminus eines Fremdgens gebunden und in Hefe exprimiert werden. Die DNA-Sequenz am Verbindungsteil der beiden Aminosäuresequenzen kann gegebenenfalls eine Spaltstelle codieren. Vgl. z. B. die veröffentlichte europäische Anmeldung Nr. 196 056. Ein weiteres Beispiel ist ein Ubiquitin-Fusionsprotein. Ein derartiges Fusionsprotein wird aus dem Ubiquitin-"Leader"- oder "Pro"-Bereich hergestellt, der vorzugsweise eine Stelle für ein Prozessierungsenzym (z. B. eine Ubiquitin-spezifische Prozessierungsprotease) behält, um Ubiquitin vom Fremdprotein abzuspalten. Mit diesem Verfahren können daher native Fremdproteine isoliert werden (P.C.T. WO 88/024066 US-Patentanmeldung mit der Seriennr. 390,599 vom selben Inhaber, die am 7. August 1989 eingereicht wurde, oder ausländische Patente oder Anmeldungen, die deren Priorität beanspruchen (wie es im von Derwent Publications, Ltd., publizierten World Patents Index aufgeführt ist), wobei deren Offenbarung hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen ist).
Alternativ können Fremdproteine auch durch Erzeugung von chimeren DNA-Molekülen, die ein Fusionsprotein codieren, das aus einem Leadersequenzfragment, das in Hefe eine Sekretion bewirkt, und dem Fremdprotein besteht, aus der Zelle in das Nährmedium sezerniert werden. Es gibt vorzugsweise Prozessierungsstellen (in vivo oder in vitro), die zwischen dem Leaderfragment und dem Fremdgen codiert sind. Das Leadersequenzfragment codiert üblicherweise ein aus hydrophoben Aminosäuren bestehendes Signalpeptid, das die Sekretion des Proteins aus der Zelle steuert.
Geeignete Signalsequenzen codierende DNA kann von Genen für sezernierte Hefeproteine stammen, beispielsweise vom Hefe-Invertasegen (veröffentlichte europäische Anmeldung Nr. 12 873 und J.P.C.-Veröffentl. mit der Nr. 62,096,086) und vom A-Faktorgen (US-Patent Nr. 4,588,684). Alternativ gibt es Leader, die nicht von der Hefe stammen, beispielsweise ein Interferon-Leader, und trotzdem eine Sekretion in Hefe bewirken (veröffentlichte europäische Anmeldung Nr. 60 057).
Eine bevorzugte Klasse von Sekretionsleadern enthält ein Fragment des α-Faktorgens der Hefe, das sowohl eine "prä"-Signalsequenz als auch einen "pro"-Bereich enthält. Die Arten von geeigneten α-Faktorfragmenten schließen den vollständigen prä-pro-α-Faktorleader (etwa 83 Aminosäurereste), sowie verkürzte α-Faktorleader (üblicherweise etwa 25 bis etwa 50 Aminosäurereste) ein (US-Patente mit den Nrn. 4,546,083 und 4,870,008 und veröffentlichte europäische Anmeldung Nr. 324 274). Weitere Leader, die ein eine Sekretion bewirkendes α-Faktor-Leaderfragment enthalten, schließen Hybrid-α-Faktorleader, die aus einer prä-Sequenz einer ersten Hefe, jedoch mit einem pro-Bereich aus einem zweiten Hefe-α-Faktor hergestellt werden, ein. (Vgl. z. B. P.C.T. WO 89/02463).
Von der Hefe erkannte Transkriptionsterminationssequenzen sind üblicherweise regulatorische Bereiche, die 3- seitig zum Translations-Stopcodon liegen, und daher flankieren sie zusammen mit dem Promotor den codierenden Bereich. Diese Sequenzen steuern die Transkription einer mRNA, die in das DNA-codierte Polypeptid translatiert werden kann. Beispiele für eine Transkriptionsterminatorsequenz sind die Wildtyp-α-Faktor-Transkriptionsterminationssequenz und weitere von Hefe erkannte Terminationssequenzen, beispielsweise die für glycolytische Enzyme.
Die vorstehend beschriebenen Bestandteile, die einen Promotor, (gegebenenfalls) einen Leader, eine gewünschte codierende Sequenz und eine Transkriptionsterminationssequenz umfassen, werden in Expressionskonstrukten zusammengefügt. Expressionskonstrukte sind häufig in einem Replikon enthalten, beispielsweise in einem extrachromosomalen Element (z. B. Plasmide), das in einem Wirt stabil gehalten werden kann, beispielsweise in Hefe oder Bakterien. Das Replikon kann zwei Replikationssysteme aufweisen, so daß es beispielsweise in Hefe zur Expression und in einem prokaryotischen Wirt zur Clonierung und Amplifikation gehalten werden kann. Beispiele für derartige Hefe-Bakterien-Shuttle- Vektoren sind YEp24 [Botstein et al., Gene 8 (1979), 17-24], pCl/1 [Brake et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984), 4642-4646] und YRp17 [Stinchcomb et al., J. Mol. Biol. 158 (1982), 157]. Ferner kann ein Replikon ein Plasmid mit entweder hoher oder niedriger Kopienzahl sein. Ein Plasmid mit hoher Kopienzahl weist üblicherweise eine Kopienzahl im Bereich von etwa 5 bis etwa 200, vorzugsweise von etwa 10 bis etwa 150, auf. Ein Wirt, der ein Plasmid mit hoher Kopienzahl enthält, weist vorzugsweise mindestens etwa 10 und stärker bevorzugt mindestens etwa 20 Kopien auf. Es kann ein Vektor mit entweder einer hohen oder niedrigen Kopienzahl gewählt werden, je nach der Wirkung des Vektors und des Fremdproteins auf den Wirt. Vgl. z. B. Brake et al., a. a. O..
In einer anderen Ausführungsform können die Expressionskonstrukte mit einem integrierenden Vektor in das Hefegenom integriert werden. Integrierende Vektoren enthalten üblicherweise mindestens eine zu einem Hefechromosom homologe Sequenz, durch die der Vektor integrieren kann, und vorzugsweise zwei das Expressionskonstrukt flankierende homologe Sequenzen. Integrationen erfolgen anscheinend durch Rekombinationen zwischen homologer DNA im Vektor und dem Hefechromosom (Orr-Weaver et al., Methods in Enzymol. 101 (1983), 228-245). Ein integrierender Vektor kann durch die Einfügung einer geeigneten homologen Sequenz in den Vektor an einen bestimmten Ort in Hefe gelenkt werden. Vgl. Orr- Weaver et al., a. a. O.. Eine oder mehrere Expressionskonstrukte können integrieren, wobei gegebenenfalls die produzierten Mengen an rekombinantem Protein beeinflußt werden [Rine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983), 6750]. Der Vektor enthält die chromosomalen Sequenzen entweder als ein einzelnes Segment, wodurch die Integration des gesamten Vektors bewirkt wird, oder als zwei Segmente, die zu benachbarten Segmenten im Chromosom homolog sind und die Expressionskonstruktion im Vektor flankieren, wodurch eine stabile Integration nur des Expressionskonstrukts bewirkt werden kann.
Üblicherweise enthalten extrachromosomale und integrierende Expressionskonstrukte selektierbare Marker, damit auf transformierte Hefestämme selektiert werden kann. Selektierbare Marker schließen biosynthetische Gene, beispielsweise ADE2, HIS4, LEU2, TRP1 und URA3, ein. Selektierbare Marker können außerdem Gene für Arzneimittelresistenzen, beispielsweise das ALG7- und G418-Resistenzgen, die Hefezellen eine Resistenz gegen Tunicamycin bzw. G418 verleihen, einschließen. Ein geeigneter Selektionsmarker kann der Hefe ferner auch die Fähigkeit zum Wachstum in Gegenwart von toxischen Verbindungen, beispielsweise Metall, verleihen. Durch vorhandenes CUP1 kann die Hefe beispielsweise in Gegenwart von Kupferionen wachsen [Butt et al., Microbiol. Rev. 51 (1987), 351].
Expressionsvektoren, entweder extrachromosomale Replikons oder integrierende Vektoren, sind zur Transformation von vielen Hefen entwickelt worden. Expressionsvektoren sind beispielsweise unter anderem für die nachstehend beschriebenen Hefen entwickelt worden: Candida albicans [Kurtz et al., Mol. Cell Biol. 6 (1986), 142], Candida maltosa [Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25 (1985), 141], Hansenula polymorpha [Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132 (1986), 3459, und Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202 (1986), 302], Kluyveromyces fragilis [Das et al., J. Bacteriol. 158 (1984), 1165], Kluyveromycces lactis [De Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1983), 737, und Van den Berg et al., Bio/Technology 8 (1990), 135], Pichia guillerimondii [Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25 (1985), 141], Pichia pastoris [Cregg et al., Mol. Cell Biol. 5 (1985), 3376, und die US- Patente mit den Nrn. 4,837,148 und 4,929,555], Saccharomyces cerevisiae [Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1929, und Ito et al., J. Bacteriol. 153 (1983), 163], Schizosaccharomyces pombe [Beach und Nurse, Nature 300 (1981), 706] und Yarrowia lipolytica [Davidow et al., Curr. Genet. 10 (1985), 39-48, und Gaillardin et al., Curr. Genet. 10 (1985), 49].
Verfahren zur Einführung von exogener DNA in Wirtshefen sind im Stand der Technik gut bekannt und schließen üblicherweise entweder die Transformation von Spheroplasten oder intakten Hefezellen, die mit Alkalikationen behandelt worden sind, ein. Die Transformationsverfahren hängen üblicherweise von den transformierten Hefearten ab. Vgl. z. B. Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. 6 (1986), 142, Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25 (1985), 141, für Candida; Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132 (1986), 3459, Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202 (1986), 302, für Hansenula; Das et al., J. Bacteriol. 158 (1984), 1165, De Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154 (1983), 1165, Van den Berg et al., Bio/Technology 8 (1990), 135, für Kluyveromyces; Cregg et al., Mol. Cell Biol. 5 (1985), 3376, Kunze et al., J. Basic Microbiol. 25 (1985), 141, US-Patente mit den Nrn. 4,837,148, und 4,929,555, für Pichia; Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978), 1929, Ito et al., J. Bacteriol. 153 (1983), 163, für Saccharomyces; Davidow et al., Curr. Genet. 10 (1985), 39, Gaillardin et al., Curr. Genet. 10 (1985), 49, für Yarrowia.

Expression des Proteins

In Abhängigkeit vom gewählten Expressionssystem und Wirt wird das Protein durch Züchtung von Wirtszellen, die durch einen die codierende Sequenz für hu-MIP-2β enthaltenden Expressionsvektor transformiert wurden, unter Bedingungen, bei denen das Protein exprimiert wird, produziert. Das Protein wird anschließend aus den Wirtszellen isoliert und gereinigt. Die Wahl geeigneter Wachstumsbedingungen und Gewinnungsverfahren sind im Stand der Technik bekannt.
In einem bevorzugten Verfahren zum Erhalt der erfindungsgemäßen Präparate werden die Zellen, die mit einem Expressionsvektor, der die dem hu-MIP-2β entsprechende, Intron-freie DNA umfaßt, transfiziert sind, unter geeigneten Kulturbedingungen gezüchtet. Die Zellen werden anschließend geerntet und die Zellfraktion durch Standardverfahren, beispielsweise Zentrifugation, getrennt. Wenn das Expressionssystem das Polypeptid in das Nährmedium sezerniert, kann das Polypeptid aus den zellfreien Medien direkt gereinigt werden. Wenn das Protein nicht sezerniert wird, wird es aus Zellysaten isoliert. Nach dem Erhalt eines hu-MIP-2β enthaltenden Rohextrakts kann eine Reinigung, wie vorstehend beschrieben, unter Verwendung von Standardverfahren durchgeführt werden.
Eine rekombinante Produktion des hu-MIP-2β-Polypeptids kann Zusammensetzungen dieses Cytokins liefern, die im wesentlichen frei von anderen menschlichen Proteinen sind. Der erhaltene hohe Reinheitsgrad wird durch Verwendung von rekombinanten Expressionssystemen, die im Vergleich zu in vivo-Quellen außerdem signifikante Mengen an hu-MIP-2β- Polypeptid produzieren, erreicht. Daher können hu-MIP-2β- Polypeptidzusammensetzungen durch Verwendung von üblichen Verfahren für rekombinante Kulturen einfacher produziert werden. Der Durchschnittsfachmann kann unter den vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung der im wesentlichen reinen erfindungsgemäßen Peptide wählen.

Pools von hu-MIP-2β-Analogen

Zusammensetzungen, die Pools von im wesentlichen von anderen menschlichen Proteinen freien hu-MIP-2β-Analogen enthalten, können ebenfalls, vorzugsweise durch DNA-Rekombinationsverfahren oder chemische Synthese, hergestellt werden. Diese Pools können unter Verwendung eines Rezeptor- Bindungstests oder eines biologischen Aktivitätstests, die vorstehend für hu-MIP-2β-Analoge mit den gewünschten Aktivitäten beschrieben werden, abgesucht werden.
Parmley und Smith, Gene 73 (1988), 305, (hier durch Bezugnahme mit eingeschlossen) beschreiben beispielsweise ein Protokoll zur Produktion und zum Screenen von Proteinpools unter Verwendung von DNA-Rekombinationsverfahren. Dieses Protokoll, in dem ein Rezeptor für ein Mitglied der MIP-2-Multigenfamilie verwendet wird, kann zum Screenen von Pools von hu-MIP-2β-Muteinen, verkürzten hu-MIP-2β-Peptiden oder hu-MIP-2β-Fusionsproteinen verwendet werden. Zunächst können Pools von DNA-Fragmenten, die unterschiedliche hu- MIP-2β-Analoge codieren, hergestellt werden. Anschließend kann der Pool von DNA-Fragmenten in das Genom des filamentösen Phagen, der von Parmley und Smith beschrieben wird, inseriert werden. Diese Phagenbank liefert Kolonien, deren Expressionsprodukte abgesucht werden können. Die DNA der gewünschten Kolonien kann isoliert und zur Identifizierung des (der) gewünschten hu-MIP-2β-Analogen verwendet werden.
Pools von hu-MIP-2β-Analogen können auch synthetisiert werden. Zur Verwendung in einem Rezeptor-Bindungstest können hu-MIP-2β-Analoge auf Polyethylennadeln, die auf einer Platte in einer Anordnung von 96 Nadeln angeordnet sind (in den Abmessungen einer Standardmikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen), synthetisiert werden. Vgl. beispielsweise Geyesen, US-Patent Nr. 4,708,871 (hier durch Bezugnahme vollständig eingeschlossen), das ein derartiges Verfahren zur Synthese von Polypeptiden, die beim VP1-Protein des Maul- und Klauenseuchevirus verwendet werden, beschreibt. Weitere Verfahren zur Herstellung von Banken von Polypeptiden und zur Selektion von Polypeptiden mit bestimmten Eigenschaften sind im US-Patent Nr. 5,010,175 (hier durch Bezugnahme vollständig eingeschlossen) und der US-Patentanmeldung Nr. 07/652,194, die am 6. Februar 1991 eingereicht wurde, (hier durch Bezugnahme vollständig eingeschlossen) oder in ausländischen Patenten oder Anmeldungen, die eine Priorität davon beanspruchen (wie es im von der Derwent Publishing Ltd. publizierten World Patents Index aufgeführt ist) beschrieben.
Pools von mit hu-MIP-2β nicht verwandten Polypeptiden können unter Verwendung der vorstehend beschriebenen DNA- Rekombinationsverfahren und chemischen Syntheseverfahren hergestellt werden und auf ihre Fähigkeit zur Bindung von Rezeptoren von Mitgliedern der MIP-2-Genfamilie abgesucht werden. Anschließend können die Polypeptide, die den (die) Rezeptor(en) binden, zur Ermittlung ihrer agonistischen und antagonistischen Aktivitäten in den vorstehend beschriebenen biologischen Aktivitätstests untersucht werden. Derartige Polypeptide sind in den gleichen therapeutischen Anwendungen wie hu-MIP-2α-Polypeptide wirksam. Ein weiteres Verfahren zum Screenen von Peptidpools ist in Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 6378, beschrieben (hier durch Bezugnahme eingeschlossen)
Zur einfacheren pharmazeutischen Verabreichung können diesen Polypeptidagonisten und -antagonisten kleine organische Moleküle vorgezogen werden. Aus den Strukturen der Polypeptide können kleine organische Moleküle, die der Form und den Aktivitäten dieser Polypeptide entsprechen, entwickelt werden. Verfahren zur Ermittlung der Strukturen dieser hu-MIP-2β-Agonisten und -Antagonisten sind im Stand der Technik bekannt und schließen Röntgen-Kristallographie und zweidimensionale Kernspinresonanz ein.

Antikörperherstellung

Ein natives, rekombinantes oder synthetisches hu-MIP- 2β-Polypeptid (mit vollständiger Länge oder Fragmente davon, die ein oder mehrere Epitope enthalten) können zur Herstellung sowohl von polyclonalen als auch monoclonalen Antikörper verwendet werden. Wenn polyclonale Antikörper gewünscht sind, wird ein hu-MIP-2β-Polypeptid zur Immunisierung eines gewählten Säugers (z. B. Maus, Kaninchen, Ziege, Pferd etc.) verwendet und später das Serum des immunisierten Tiers gesammelt und gemäß bekannten Verfahren behandelt. Das erfindungsgemäße hu-MIP-2β-Polypeptid kann zur Stimulierung der Antikörperproduktion in einem Säuger durch Immunisierung des Säugers mit dem Präparat verwendet werden. Für eine derartige Immunisierung kann gegebenenfalls eine Kupplung des Polypeptids an eine größere immunogene Substanz, beispielsweise Napfschnecken-("keyhole limpet")- Hämocyanin, durchgeführt werden. Eine Immunisierung von Säugern, beispielsweise Kaninchen, Mäuse, Ziegen etc., zur Antikörperproduktion ist im Stand der Technik gut bekannt.
Polyclonale Antikörperpräparate können unter Verwendung von Immunaffinitätsverfahren unter Verwendung eines erfindungsgemäßen synthetischen oder rekombinanten Polypeptids partiell gereinigt werden. Derartige Reinigungsverfahren sind im Stand der Technik gut bekannt. Besonders Zusammensetzungen, die polyclonale Antikörper gegen mehrere Antigene zusätzlich zum gewünschten Protein enthalten, können durch Immunaffinitätschromatographie so gereinigt werden, daß sie im wesentlichen frei von gegen andere Antigene gerichteten Antikörpern sind. Das erfindungsgemäße im wesentlichen reine Polypeptidpräparat kann zur Affinitätsreinigung von hu-MIP-2β-Polypeptid-spezifischen Antikörpern verwendet werden. Zur Affinitätsreinigung von Antikörpern kann das Polypeptid an eine inerte Matrix, beispielsweise Agarosekügelchen, gekuppelt werden. Verfahren für eine derartige Kupplung sind im Stand der Technik gut bekannt.
Ein Polypeptidpräparat kann außerdem zum Nachweis oder zur quantitativen Bestimmung von für hu-MIP-2β spezifischen Antikörpern in einem Antikörperpräparat oder einer anderen biologischen Probe verwendet werden. Dann wird das synthetische Peptid üblicherweise an eine größere Substanz, beispielsweise Rinderserumalbumin oder einen festen Träger, gekuppelt. Die Verfahren zur Kupplung von Polypeptiden an derartige Matrizen sind wiederum im Stand der Technik gut bekannt.

Monoclonale Antikörper

Mit hu-MIP-2β-reagierende monoclonale Antikörper können durch einen Fachmann, der sich an die hier gegebene Beschreibung hält, ebenfalls leicht hergestellt werden. Das grundsätzliche Verfahren zur Herstellung von monoclonalen Antikörpern durch Hybridome ist gut bekannt. Es können monoclonale Antikörper, die einzelne hu-MIP-2β-Epitope binden, erzeugt werden. Üblicherweise wird eine Ratte oder Maus mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid immunisiert, das Nagetier später getötet und Milzzellen zur Fusion mit Myelomzellen werden gewonnen. Die Hybridzellen können durch im Stand der Technik bekannte Verfahren selektiert werden. Die Antikörperproduktion jeder Hybridzelle kann zur Selektion von Antikörpern, die Epitope auf hu-MIP-2β binden, einzeln abgesucht werden.
Zum Screenen auf Antikörper, die mit für hu-MIP-2β- Polypeptide spezifischen Epitopen immunologisch reagieren, kann eine einfache Abfolge von Tests durchgeführt werden. Antikörper können auf eine Immunreaktivität mit einem hu- MIP-2β-Polypeptid unter Verwendung eines im wesentlichen reinen Präparats des erfindungsgemäßen hu-MIP-2β-Polypeptids getestet werden. Die gewünschten spezifischen Antikörper müssen in diesem Test positiv sein. Der Antikörper kann anschließend auf eine Immunreaktivität mit anderen Mitgliedern der MIP-Multigenfamilie getestet werden. Üblicherweise reagieren die Antikörper, die in diesem Test negativ sind, mit spezifischen hu-MIP-2β-Epitopen.
Unsterbliche Antikörper-produzierende Zellinien können auch durch andere Verfahren als der Fusion, beispielsweise durch eine direkte Transformation von B-Lymphocyten mit onkogener DNA oder Transfektion mit dem Epstein- Barrvirus, hergestellt werden. Vgl. z. B. M. Schreier et al., "Hybridoma Techniques" (1980), Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas" (1981), Kennett et al., "Monoclonal Antibodies" (1980). Vgl. ferner die US- Patente mit den Nrn. 4,341,761, 4,399,121, 4,427,783, 4,444,887, 4,451,570, 4,466,917, 4,472,500, 4,491,632 und 4,493,890.
Spektren von gegen hu-MIP-2β hergestellten monoclonalen Antikörpern können auf verschiedene Eigenschaften, d. h., Isotyp, Epitop, Affinität etc., getestet werden. Von besonderem Interesse sind monoclonale Antikörper, die die Aktivität von MIP-2 oder hu-MIP-2β-Peptiden neutralisieren. Derartige monoclonale Antikörper können unter Verwendung von MIP-2-Aktivitätstests, wie die von Wolpe et al. (1989) und Broxmeyer et al. (1989) beschriebenen, die hier durch Bezugnahme eingeschlossen sind, leicht identifiziert werden. Antikörper mit hoher Affinität sind außerdem bei der Immunaffinitätsreinigung von nativem oder rekombinantem hu- MIP-2β nützlich.
Beispiele für erfindungsgemäße Antikörper sind (polyclonale und monoclonale) Antikörper von Wirbeltieren, besonders von Säugern, Hybridantikörper, chimere Antikörper, humanisierte Antikörper, veränderte Antikörper, monovalente Antikörper, Antikörper mit einer einzigen Domäne, sowie funktionelle Antikörperfragmente, beispielsweise Fab-Proteine, sofern sie ein Epitop selektiv binden. Für eine allgemeine Zusammenfassung siehe Winter & Milstein, Nature 349 (1991), 293, Riechmann et al., Nature 332 (1988), 323, Ward et al., Nature 341 (1989), 544, US-Patent Nr. 4,816,467 und Glennie et al., Nature 295 (1982), 712.
Epitope sind antigene Determinanten eines Polypeptids. Ein Epitop kann 3 oder mehr Aminosäuren in einer für das Epitop einzigartigen räumlichen Konformation umfassen. Üblicherweise besteht ein Epitop aus mindestens 5 und vorzugsweise aus mindestens 8 bis 10 derartiger Aminosäuren. Verfahren zur Ermittlung der räumlichen Konformation von Aminosäuren sind im Stand der Technik bekannt und schließen beispielsweise Röntgen-Kristallographie und zweidimensionale Kernspinresonanz ein.

Diagnostische Tests auf hu-MIP-2β

Der Nachweis von hu-MIP-2β kann auf der Nucleotid- oder Peptid-Ebene erfolgen. Antikörper können erzeugt werden, indem Säuger, wie vorstehend beschrieben, mit Peptiden, die von hu-MIP-2β-Polypeptide codierenden Sequenzen exprimiert werden, immunisiert und unter Verwendung von dem Fachmann vertrauten Verfahren auf hu-MIP-2β spezifische Antikörper selektiert werden. Die bestimmten Verfahren für Tests mit Gensonden und Immuntests sind dem Fachmann vertraut.

Immuntestverfahren

Antikörper sind in diagnostischen Anwendungen nützlich. Antikörper, die für hu-MIP-2β spezifisch sind, können in jedes übliche Immuntestformat formuliert werden, z. B. in ein homogenes oder heterogenes, in einen Radioimmuntest oder ELISA. Die verschiedenen Formate sind dem Fachmann gut bekannt. Vgl. z. B. "Immunoassay: A Practical Guide" (D. W. Chan und M. T. Perlstein, Hrsg., 1987), dessen Beschreibung hier durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Erfindungsgemäße Antikörper können hu-MIP-2β binden, und binden vorzugsweise hu-MIP-2α nicht. Diese Antikörper ermöglichen außerdem die Verwendung einer Abbildungs-Analyse mit Isotopen, konjugierten Antikörpern oder anderen Liganden. Ein Beispiel eines geeigneten Abbildungs-Materials ist ¹²&sup5;I, das an die für hu-MIP-2β spezifischen Antikörper konjugiert wird.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können zum Nachweis von hu-MIP-2β-Epitopen in histologischen Gewebeschnitten, sowie im Serum verwendet werden. Die Antikörperbindung an Gewebeschnitte kann durch alle im Stand der Technik bekannte Nachweisverfahren, beispielsweise einen Radioimmuntest, Enzym-gebundenen Immunadsorptionstest, eine Komplementfixierung, einen nephelometrischen Test, eine Immundiffusion, einen immunelektrophoretischen Test und ähnliche, nachgewiesen werden.
In einem besonders nützlichen Färbeverfahren wird Peroxidase, Wasserstoffperoxid und eine chromogene Substanz, beispielsweise Aminoethylcarbazol, verwendet. Die Peroxidase (ein gut bekanntes Enzym, aus zahlreichen Quellen erhältlich) kann an den für hu-MIP-2β spezifischen Antikörper gekuppelt werden oder lediglich über einen oder mehrere Antikörper damit komplexiert sein. Es können auch andere chromogene Substanzen und Enzyme verwendet werden. Derartige Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt. Radiomarkierte Antikörper können für hu-MIP-2β spezifisch oder zweite Antikörper, die mit für hu-MIP-2β spezifischen Antikörpern immunologisch reagieren, sein. Auch diese Verfahren sind gut bekannt. Das genaue Nachweisverfahren für hu-MIP-2β ist für die Erfindung nicht kritisch.
Ein besonders bevorzugtes Verfahren zum Nachweis und/oder zur quantitativen Bestimmung von hu-MIP-2β in biologischen Proben ist ein kompetitiver Test. Ein Antikörper, der mit einem auf hu-MIP-2β, jedoch nicht auf hu-MIP-2α vorhandenen Epitop immunologisch reagiert, wird an einen festen Träger, beispielsweise eine Mikrotiterplatte aus Polystyrol oder Nitrozellulosepapier, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren gebunden. Der feste Träger wird anschließend in Gegenwart der Analyseprobe unter Bedingungen, bei denen sich Antikörper-Antigen-Komplexe bilden und stabil sind, inkubiert. Überschüssige und nicht gebundene Bestandteile der Probe werden entfernt und der feste Träger wird so gewaschen, daß die Antikörper-Antigen- Komplexe auf dem festen Träger erhalten bleiben. Eine bekannte Menge eines markierten Polypeptids, das ein auf hu- MIP-2β, jedoch nicht auf hu-MIP-2α vorhandenes Epitop enthält, wird anschließend mit dem festen Träger inkubiert. Das markierte Polypeptid wurde durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren an eine nachweisbare Einheit, beispielsweise Biotin, Peroxidase oder Radiomarker, gekuppelt. Das markierte Polypeptid bindet an einen mit hu-MIP-2β immunologisch reagierenden, an den festen Träger gebundenen Antikörper. Überschüssiges und nicht gebundenes Polypeptid wird entfernt und der feste Träger gewaschen, wie es vorstehend beschrieben ist. Die an den festen Träger gebundene nachweisbare Einheit wird quantitativ bestimmt. Da das hu-MIP-2β und das Polypeptid um die gleichen Antikörperbindungsstellen konkurrieren, kann das hu-MIP-2β in der Probe durch die Verringerung der Bindung des Polypeptids an den festen Träger quantitativ bestimmt werden. In einer anderen Ausführungsform können die Probe und das markierte Polypeptid mit dem festen Träger gleichzeitig inkubiert werden.

Tests mit Nucleotidsonden

Die erfindungsgemäß bereitgestellten Nucleotidsequenzen können zur Herstellung von Gensonden durch eines der bekannten Standardverfahren verwendet werden. Die Größe einer Sonde kann von weniger als etwa 20 Nucleotiden bis hunderten von Nucleotiden schwanken. Die Sonde kann radioktiv, mit fluoreszierendem Material oder ähnlichem markiert werden. Verfahren zur Herstellung und Markierung von Nucleotidsonden sind im Stand der Technik gut bekannt.
Der Diagnosetest mit einer Nucleotidsonde geht von einer biologischen Probe eines Individuums aus. Die Nucleinsäuren werden unter Verwendung von dem Fachmann vertrauten Standardverfahren aus der Probe gewonnen. Die Nucleinsäure wird anschließend mit der Sonde inkubiert und die Hybridisierung anschließend nachgewiesen.
Nachstehend sind Beispiele der vorliegenden Erfindung beschrieben, die lediglich der Veranschaulichung dienen. Sie sollen den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung nicht einschränken, da dem Durchschnittsfachmann angesichts der vorliegenden Beschreibung zahlreiche Ausführungsformen im Schutzbereich der Ansprüche offensichtlich sind. Es wird davon ausgegangen, daß der Durchschnittsfachmann vertraut ist mit den in der Anmeldung zitierten Verweisen (oder leichten Zugang dazu hat) und die Beschreibungen dazu sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen.

Beispiel 1

Isolierung und Clonierung von Maus-MIP-2-codierender cDNA

Konstruktion einer cDNA-Bank

Die Isolierung von Poly-A&spplus;-RNA aus E. coli-LPS- stimulierten Maus-RAW 264.7-Zellen und die Konstruktion einer cDNA-Bank sind bereits beschrieben worden (Davatelis et al., 1988).

Isolierung von Maus-MIP-2-cDNA

Ein Pool von degenerierten Oligonucleotidsonden, die den Aminosäuren 9 bis 14 der NH&sub2;-terminalen Sequenz von MIP- 2 entsprachen (Wolpe et al., 1989), wurde synthetisiert. Es wurde dieser Teil der partiellen Sequenz gewählt, da angenommen wurde, daß er in einem stark konservierten codierenden Bereich liegt und im Vergleich zu anderen Teilen der partiellen Sequenz eine geringere Codon-Degenerierung aufweist. Die erhaltene Sonde war ein 128fach degenerierter Pool an Oligomeren mit einer Länge von 17 Nucleotiden.
Zwei abgenommene Kopien der plattierten RAW 264.7- cDNA-Bank (5 x 10&sup5; Plaques) auf Nitrozellulosefilter wurden bei 42ºC in 5 x SSC, 2 x Denhardts, 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, 50 % Formamid, 0,2 % SDS und 0,25 mg/ml mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA vorhybridisiert und anschließend bei 42ºC über Nacht in 5 x SSC, 1 x Denhardts, 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 6,5, 50 % Formamid, 10 % Dextransulfat, 0,1 % SDS, 0,1 mg/ml mit Ultraschall behandelter Lachssperma-DNA und 5 x 10&sup4; Cpm pro ml pro Degenerierung des Pools aus mit ³²P-ATP am 5'-Ende markierten synthetischen Oligonucleotidsonden hybridisiert. Nach der Hybridisierung wurden die Filter mit TMAC gewaschen (Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 (1985), 1585). Auf den Filterduplikaten positive Plaques wurden zum zweitenmal einer Plattierung mit geringer Dichte und dem Screenen unterzogen. Positive Phagenclone wurden isoliert, aus denen die DNA für eine weitere Analyse hergestellt wurde.

Clonierung der Maus-MIP-2-cDNA

Durch ein Screening der cDNA-Bank, die von Poly-A&spplus;- RNA aus RAW 264.7-Zellen stammt, mit einem degenerierten oligonucleotidpool, der für die N-terminale Sequenz von Maus-MIP-2 spezifisch ist (Wolpe et al., 1989), wurde der Clon MIP-2-20α isoliert. Die inserierte cDNA (etwa 1100 bp) wurde isoliert, in M13 cloniert und die Nucleotidsequenz bestimmt. Die Nucleotidsequenz und die abgeleitete Proteinsequenz sind in Figur 1 dargestellt. Die an Position 1 beginnende, abgeleitete reife Proteinsequenz entspricht genau der N-terminalen Peptidsequenz, die zuvor für gereinigtes MIP-2 ermittelt worden war (Wolpe et al., 1989).

Beispiel 2

Isolierung und Clonierung von menschliches MIP-2α und β codierender cDNA

Zur Isolierung des (der) menschlichen Homologen der Maus-MIP-2-cDNA wurde ein den größten Teil des reifen mMIP- 2-Proteins codierendes Fragment isoliert und zur Sondierung einer U937-cDNA-Bank, die aus Poly-A&spplus;-RNA von PMA-behandelten und LPS-stimulierten Zellen hergestellt wurde, verwendet. DNA von Plaques, die bei Waschen unter geringer Stringenz positiv waren, wurde isoliert und einer Restriktionsendonuclease-Analyse unterzogen, die auf zwei Klassen von Clonen schließen ließ. Die inserierte cDNA aus den für jede Klasse repräsentativen Clonen wurde in M13 subcloniert, und die Nucleotidsequenzen wurden ermittelt.

Konstruktion einer cDNA-Bank

Die Stimulierung der menschlichen Monocyten-ähnlichen Zellinie U937 (Sundstrom et al., Int. J. Cancer 17 (1976), 565), die Isolierung der gesamten und der Poly-A&spplus;-RNA und die Konstruktion einer cDNA-Bank wurden, wie nachstehend beschrieben, durchgeführt. U937-Zellen (American Type Culture Collection, Rockville, MD) wurden bis zur Konfluenz gezüchtet und durch Zugabe von PMA zu einer Endkonzentration von 5 x 10&sup8; M die Differenzierung stimuliert. Nach 24 Stunden in Gegenwart von PMA wurde LPS (LPS W, E. coli 0127, B8, Difco Laboratories, Inc., Detroit, MI) zu einer Endkonzentration von 1 ug/ml zugesetzt und die Zellen wurden weitere 3 Stunden bei 37ºC inkubiert. Die Gesamt-RNA wurde im wesentlichen wie beschrieben (Cathala et al., DNA 2 (1983), 329) hergestellt. Poly-A&spplus;-RNA wurde im wesentlichen wie beschrieben (Maniatis et al., 1982) durch eine einzige Passage über Oligo-dT-Zellulose hergestellt. Doppelsträngige cDNA wurde unter Verwendung eines cDNA-Synthese-Kits (Pharmacia LKB Biotechnology, Inc., Pleasant Hill, Ca) hergestellt ünd in λgt10 cloniert und verpackt.

Isolierung von menschlichen Maus-MIP-2-Homologen

Die Plattierung der U937-cDNA-Bank, Vorhybridisierung der Nitrozellulosefilter und Hybridisierung der Filter erfolgte wie in Beispiel 1 für das Screenen der RAW 264.7cDNA-Bank beschrieben. Die DNA der Sonde war ein 186 bp- BalI-BglII-Fragment, das aus der mMIP-2-cDNA isoliert worden war. Die BglII-Stelle wurde durch in vitro-Mutagenese unter Verwendung des mutagenen Primers 5'-CAAAAGATCTTGAACAAAG-3' eingeführt. Das BalI-BglII-Fragment codiert den größten Teil der reifen mMIP-2-Aminosäuresequenz, der die Basenpaare, die die 3 N-terminalen und 8 C-terminalen Aminosäure codieren, fehlen. Dieses Fragment wurde durch "Nick-Translation" markiert und etwa 500 000 Cpm pro ml wurden in die Hybridisierungslösung gegeben.
Nach der Hybridisierung wurden die Filter 30 Minuten bei Raumtemperatur dreimal in jeweils 2 x SSC und 0,1 % SDS bei geringer Stringenz gewaschen. Auf den Filterduplikaten positive Plaques wurden zum zweitenmal einer Plattierung mit geringer Dichte und dem Screenen unterzogen. Positive Phagenclone, aus denen die DNA für eine weitere Analyse hergestellt wurde, wurden isoliert.

Clonierung und DNA-Sequenz-Analyse

cDNA-Insertionen wurden in M13-Phagenvektoren subcloniert, und die Sequenzierung der DNA wurde durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren von Sanger et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463) durchgeführt.
Die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von hu-MIP-2α ist in Figur 2 dargestellt. Diese Sequenz wurde durch vier unabhängige Clone bestätigt und ist für die häufigere der beiden Klassen von zu mMIP-2 homologer menschlicher cDNA repräsentativ. Die Nucleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz von hu-MIP-2β, die für eine zweite Klasse von zu mMIP-2 homologen menschlichen cDNAs repräsentativ ist, ist in Figur 3 dargestellt. Diese Sequenz wurde durch zwei unabhängige Clone bestätigt.

Beispiel 3

Restriktionsfragmentanalyse

Genomische DNA von RAW 264.7-Zellen wurde, wie von DiLella et al. ("Guide to Molecular Cloning Techniques" (1987), S. 199, Berger et al., Hrsg., Academic Press, Orlando) beschrieben, isoliert. Menschliche genomische DNA und Maus-C3H/HeN genomische DNA wurden von Clontech (Palo Alto, Ka) bezogen.
Die genomische DNA wurde gemäß den Herstellerangaben mit Restriktionsenzymen gespalten. Die gespaltene DNA wurde auf 1 % Agarosegelen getrennt und anschließend auf HyBond- Nylonmembranen (Amersham, Arlington Heights, IL) transferiert. Die Filter wurden vorhybridisiert und in 50 mM Natriumphosphat, pH 6,5, 5 x SSC, 1 mM Natriumpyrophosphat, 40 % Formamid, 10 % Dextransulfat, 5 x Denhardtslösung, 0,1 % SDS und 100 mg/ml mit Ultraschall behandelter Lachssperma- DNA hybridisiert. Für eine Southern-Analyse verwendete DNAs waren die 1,1 kb-mMIP-2-cDNA (Clon mMIP-2-20a), die 0,98 kb- hu-MIP-2β-cDNA (Clon hu-MIP-2-4a) und eine 1,05 kb-hu-MIP- 2α-cDNA (Clon hu-MIP-2-5a). Alle cDNAs wurden durch "Zufalls-Priming" mit ³²P-CTP unter Verwendung eines Multiprimer-DNA-Markierungssystems (Amersham, Arlington Heights, IL) markiert. Nach der Vorhybridisierung wurde 2 bis 4 Stunden bei 37ºC markierte cDNA zu 1 x 10&sup6; Cpm pro ml zugesetzt. Es wurde 16 bis 18 Std. bei 37ºC hybridisiert. Die Filter wurden 10 min. bei Raumtemperatur in 2 x SSC und 0,1 % SDS gespült, anschließend 3 Mal 45 min. bei 65ºC in 0,1 x SSC und 0,1 % SDS gewaschen. Gelegentlich wurde zur erneuten Hybridisierung die hybridisierende Sonde durch 45- minütige Behandlung bei 65ºC in 0,5 x SSC, 0,1 % SDS und 50 % Formamid vom Blot entfernt.

Southern-Analyse

RAW 264.7-DNA wurde mit jedem der drei Restriktionsenzyme BamHI, EcoRI und EcoRV gespalten, durch Agarose-Gelelektrophorese getrennt und mit einer ³²P-markierten mMIP-2- cDNA-Sonde hybridisiert. Die in Figur 6A dargestellten Ergebnisse weisen darauf hin, daß mMIP-2-cDNA ein einzelnes Gen definiert. Die gleichen Ergebnisse wurden bei einer entsprechenden Analyse (Daten nicht dargestellt) von Maus- C3N/HeJ-DNA erhalten.
Eine Southern-Analyse von menschlicher genomischer DNA wurde mit hu-MIP-2α- und hu-MIP-2β-cDNA-Sonden durchgeführt. Hybridisierungs- und Waschbedingungen, bei denen zwischen hu-MIP-2α und hu-MIP-2β unterschieden werden kann, wenn sie mit ihren jeweiligen cDNAs als Sonden abgesucht werden, wurden ermittelt. Die verwendeten Bedingungen unterscheiden jedoch nicht zwischen hu-MIP-2α- und hu- gro/MGSA-spezifischen Sequenzen. Die Ergebnisse der Southern-Analyse von menschlicher genomischer DNA, die mit BamHI, EcoRI oder EcoRV gespalten und mit hu-MIP-2α- oder hu-MIP-2β-cDNA als Sonden hybridisiert wurden, sind in den Figuren 6B bzw. C dargestellt. Die für jede cDNA erhaltenen Hybridisierungsmuster unterscheiden sich deutlich. MIP-2α- cDNA hybridisierte stark an EcoRV-Fragmente von etwa 23 und 1,1 kb, während MIP-2β-cDNA an ein 7,0 kb-EcoRV-Fragment hybridisierte. Entsprechend hybridisierte hu-MIP-2β-cDNA an 1,8 kb- und 3,3 kb (schwach)-EcoRI-Fragmente, während hu- MIP-2α stark an 3,3 und etwa 1,1 kb-EcoRI-DNA-Fragmente und schwach an 4,6 und 3,8 kb-EcoRI-Fragmente hybridisierte. Schließlich hybridisierte MIP-2β-cDNA stark an ein 2,4 kb- BamHI-Fragment und sehr schwach an ein 4,3 kb-BamHI-Fragment, während menschliche MIP-2α-cDNA stark an 20, 2,0 und 1,1 kb-BamHI-Fragmente und weniger stark an ein 4,3 kb- BamHI-Fragment hybridisierte. Die größere Komplexität der mit der hu-MIP-2α-cDNA-Sonde erhaltenen Hybridisierungsmuster, besonders bei mit BamHI gespaltener DNA, im Vergleich zu dem mit der hu-MIP-2β-cDNA-Sonde erhaltenen Hybridisierungsmuster, läßt den Schluß zu, daß die hu-MIP-2α- Sonde mehr als ein Gen nachweist, vermutlich hu-gro sowie hu-MIP-2a. Die hier dargestellten Ergebnissen lassen den Schluß zu, daß hu-MIP-2β und hu-MIP-2α zwei unterschiedliche Gene sind.

Beispiel 4

Clonierung und Expression in Prokaryoten

Plasmid ARV-2-p25-gag (am 27. August 1985 unter der Hinterlegungsnr. 53246 bei der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, hinterlegt) ist ein pBR322- Derivat, wobei die ursprünglichen pBR322-Sequenzen, die zwischen den EcoRI- und PvuII-Restriktionsstellen liegen, durch den tac-Promotor, Shine Dalgarno-Sequenzen und einen Polylinker substituiert sind. Vgl. außerdem EP 0 181 150.
Der Clon hu-MIP-2-4a (Beispiel 3) wird mit PvuII und Bali gespalten und mit einem Linker, der die Sequenz
aufweist, ligiert. Das Plasmid ARV-2-p25-gag wird anschließend mit EcoRI und PvuII gespalten und die ligierte hu-MIP- 2-4a inseriert. Das erhaltene Konstrukt wird anschließend gemäß dem Protokoll von Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 62 (1972), 2110) in kompetente E. coli D1210-Zellen transformiert. Die Zellen werden mit 25 bis 50 ng des Konstrukts transformiert und das Transformationsgemisch wird auf Agarplatten, die 100 ug/ml Ampicillin enthaltende L- Brühe aufweisen, plattiert. Die Platten werden 12 Stunden bei 37ºC inkubiert und Ampicillin-resistente Kolonien in 1 ml L-Brühe, die 100 ug/ml Ampicillin enthält, transferiert. Die Zellen werden bei 37ºC gezüchtet und die Expression induziert, indem 10 ul von 100 mM IPTG zu einer Endkonzentration von 1 mM zugesetzt werden, wonach zwei Stunden bei 37ºC inkubiert wird. Die Zellen werden anschließend lysiert und das Produkt gereinigt.

Beispiel 5

Expression in Hefe

Das Plasmid pGAI1 enthält DNA, die den Hefe-α- Faktorleader, ein Gen für menschliches Proinsulin und einen α-Faktorterminator unter der transkriptionellen Kontrolle des Hefe-Glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase (GAPDH)- Promotors codiert. Der Vektor ist in EP 0 324 274 vollständig beschrieben.
Die codierende Sequenz für hu-MIP-2β wurde durch Amplifikation durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) eines von einem λgt10-Clon (λgt10-hu-MIP-2-4a) stammenden Fragments erhalten, wobei die nachstehenden Primer verwendet wurden: Primer Stop
Nach 30 Zyklen der PCR-Amplifikation wurde die DNA mit KpnI und SalI gespalten und das 244 bp-Fragment, das die 4 Carboxy-terminalen Aminosäuren des α-Faktorleaders, die dibasische Prozessierungsstelle und das vollständige, aus 73 Aminosäuren bestehende, reife hu-MIP-2β codierte, wurde durch Acrylamid-Gelelektrophorese isoliert. Dieses Fragment wurde anschließend in pGAI1, das mit KpnI und SalI gespalten und auf einem Agarosegel gereinigt worden war, ligiert. Nach der bakteriellen Transformation und dem Screening wurde das Plasmid pMIP540 erhalten, das durch DNA-Sequenzierung nachweisbar die abgeleitete Nucleotidsequenz aufwies. Dieses Plasmid wurde mit BamHI gespalten und das erhaltene 1163 bp- Fragment, das die GAPDH-Promotorsequenz, das α-Faktorleader/hu-MIP-2β-Fusionsprotein und den α-Faktortranskriptionsterminator enthielt, in die BamHI-Stelle des Expressionsvektors pAB24 cloniert, wobei das Expressionsplasmid pYMIP540 erhalten wurde.
Der Stamm Saccharomyces cerevisiae MB2-1 (leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, ura3Δ, CAN und Cirº) wurde durch Standardverfahren mit dem Plasmid pYMIP540 transformiert und ura-prototrophe Transformanten selektiert. Die Expression wurde durch Inokulation von einzelnen Kolonien von bestimmten Transformanten in ein Leucin-Selektionsmedium und eine etwa 48-stündige Züchtung analysiert. Die Kulturen wurden anschließend zentrifugiert, die Zellen in einem Medium, dem Uracil fehlte, resuspendiert und in einem ura-Selektionsmedium 20fach verdünnt. Die Kulturen wurden anschließend etwa 72 Stunden gezüchtet, anschließend geerntet und zellfreie Überstände hergestellt. Das konditionierte Medium wurde durch SDS-PAGE auf die Gegenwart von hu-MIP-2β analysiert, wonach eine Färbung mit Coomassie erfolgte. Eine Bande wurde in der SDS-PAGE beobachtet, die ähnlich wanderte, wie ein nativer mMIP-2-Standard (von B. Sherry, Rockefeller University, zur Verfügung gestellt).

Beispiel 6

Expression in Säugerzellen

(A) Expression in COS-7-Zellen

Das Plasmid pSV7tPA2I (ATCC-Hinterlegungsnr. 40163, am 14. Februar 1985 hinterlegt) ist ein Säugerexpressionsvektor, der DNA enthält, die das vollständige menschliche tPA in einer Polylinkersequenz, die vom SV40-Replikationsursprung, frühen Promotor und von einer Polyadenylierungsstelle flankiert wird, codiert. Dieses Plasmid wird auch in der PCT-Anmeldung WO 86/05514 beschrieben.
Die hu-MIP-2β codierende Sequenz wird durch PCR mit dem Plasmid pYMIP540 amplifiziert und zur Herstellung des Plasmids pSV-MIP-2β in eine Stelle des Expressionsvektors pSV7tPA2I, der einen SV40-Replikationsursprung und einen frühen Promotor 5'-seitig und eine Polyadenylierungsstelle 3'-seitig zur Insertionsstelle aufweist, inseriert. COS-7- Zellen werden unter Verwendung einer Modifikation des von Graham und van der Eb., Virol. 52 (1973), 456-67, beschriebenen Verfahrens transfiziert. In doppelter Ausfertigung werden die Proben den Schalen zugesetzt und 6 Stunden bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator auf den Zellen absitzen gelassen. Nach der Züchtung werden die Zellen vorsichtig mit Calcium- und Magnesium-freiem PBS gespült. Die Schalen werden anschließend 3 bis 4 Minuten mit dem Adjuvans Glycerin in Kontakt gebracht, gespült, und anschließend wird ihnen DMEM-Medium zugesetzt, dem 4,5 mg/ml Glucose, 3,7 mg/ml Natriumbicarbonat, 292 ug/ml Glutamin, 110 ug/ml Natriumpyruvat, 100 E/ml Penicillin, 100 E/ml Streptomycin und 10 % fötales Kälberserum (FCS) zugesetzt worden sind. Nachdem sich die Kultur vom Glycerin-Schock erholt hat, wird das Medium durch serumfreies Medium ausgetauscht. Zwölf Stunden nach der Entfernung des Serums wird das konditionierte Medium auf hu-MIP-2β getestet.

(B) Expression in CHO-Zellen

CHO-dhfr&supmin;-Zellen werden am Tag vor der Transfektion mit einer Dichte von 5 x 10&sup5; bis 10&sup6; Zellen/Schale (10 cm) in F12-Medium, dem 1,18 mg/ml NaHCO&sub3;, 292 ug/ml Glutamin, 110 ug/ml Natriumpyruvat, 100 E/ml Penicillin, 100 E/ml Streptomycin, 150 mg/ml Prolin und 10 % FCS zugesetzt worden sind, plattiert. Die Zellen werden anschließend, wie vorstehend in Abschnitt (A) beschrieben, zusammen mit einem Marker-enthaltenden Plasmid, das ein an den späten Adenovirus-Hauptpromotor gebundenes dhfr-Gen trägt, transfiziert (Copräzipitation in Calciumphosphat). Nach einer Züchtung für 48 Stunden werden die Zellen 1:20 geteilt, in einem Selektionsmedium (DMEM, 150 ug/ml Prolin und 10 % FCS) gezüchtet und 1 bis 2 Wochen kultiviert.

Beispiel 7

A. Herstellung eines einen selektierbaren Marker codierenden Plasmids

Das Plasmid pAd-DHFR, das die Maus-DHFR-cDNA enthält, wurde durch Fusion des späten Adenovirus-2 (Ad-MLP, Karteneinheiten 16 bis 27.3)-Hauptpromotors an die nichttranslatierten 5'-Sequenzen der Maus-DHFR-cDNA konstruiert (J. H. Nunberg et al., Cell 19 (1980), 355-64). SV40-DNA, die einen Teil der frühen Transkriptionseinheit codiert, einschließlich des Introns des kleinen t-Antigen-Gens, und den Transkriptionsterminationsbereich des frühen SV40-Bereichs aufweist, wurde von pSV-2-neo (Southern und Berg, J. Mol. Appl. Gen. 1 (1982), 327-41) erhalten und an das nichttranslatierte 3'-Ende der DHFR-cDNA fusioniert. Diese drei Segmente wurden in pBR322 subcloniert, wobei das Plasmid pAD-DHFR erhalten wurde.

B. Herstellung eines Säuger-Expressionsvektors

1. pSV7d:

Die Expressionskassetten wurden unter Verwendung des Säugerzellen-Expressionsvektors pSV7d (2423 bp) hergestellt.
Das Plasmid pSV7d (vgl. Truett et al., DNA 4 (1985), 333) wurde, wie nachstehend beschrieben, konstruiert: Das 400 bp-BamHI/HindIII-Fragment, das den SV90-Replikationsursprung und frühen Promotor enthielt, wurde aus pSVgtI (von Paul Berg, Stanford University, Kalifornien) ausgeschnitten und gereinigt. Das 240 bp-SV40-BclI/BamHI-Fragment, das die SV40-Poly-A-Verknüpfungsstelle enthielt, wurde aus pSV2/DHFR (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1 (1981), 854-864) ausgeschnitten und gereinigt. Die Fragmente wurden mit den nachstehend beschriebenen Linkern fusioniert: Stopcodons BclI-überstehendes Ende
Diese Linker enthalten fünf Restriktionsstellen sowie Stopcodons in allen drei Leserahmen. Das erhaltene 670 bp- Fragment, das den SV40-Replikationsursprung, den frühen SV40-Promotor, den Polylinker mit Stopcodons und die SV40- Polyadenylierungsstelle enthielt, wurde in die BamHI-Stelle von pML, einem pBR322-Derivat, aus dem 1,5 kb entfernt wurden (Lusky und Botchan, Cell 36 (1984), 391), cloniert, um pSV6 zu erhalten. Die EcoRI- und EcoRV-Stellen in den pML- Sequenzen von pSV6 wurden durch Spaltung mit EcoRI und EcoRV entfernt, mit Bal31-Nuclease zur Entfernung von etwa 200 bp an jedem Ende behandelt und schließlich erneut ligiert, wobei pSV7a erhalten wurde. Durch Verkürzen mit Bal31 wurde auch eine BamHI-Restriktionsstelle entfernt, die den SV40- Bereich in einer Entfernung von etwa 200 bp von der EcoRV- Stelle flankierte. Zur Entfernung der den SV40-Bereich flankierenden zweiten BamHI-Stelle wurde pSV7a mit NruI gespalten, die die pML-Sequenz stromaufwärts vom Replikationsursprung spaltet. Das Produkt wurde durch Ligierung von glatten Enden rezirkularisiert, wobei pSV7b erhalten wurde.
pSV7c und pSV7d repräsentieren nacheinander erfolgende Polylinkersubstitutionen. Zunächst wurde pSV7b mit StuI und XbaI gespalten. Anschließend wurde der nachstehend beschriebene Linker in den Vektor ligiert, wobei pSV7c erhalten wurde:
Danach wurde pSV7c mit BglII und XbaI gespalten und anschließend mit dem nachstehend beschriebenen Linker ligiert, wobei pSV7d erhalten wurde:

2. pCMV6a

Zur Erhöhung des Transkriptionsniveaus und der Stabilität der Messenger-RNA von heterologen Proteinen wurde der frühe SV40-Transkriptionsinitiationsbereich durch Sequenzen des "immediate early" Bereichs des menschlichen Cytomegalovirus (Boshart et al., Cell 4 (1985), 521-530) ersetzt. Ferner wurden nichttranslatierte 5'-Sequenzen, die vom frühen SV40-Bereich der Messenger-RNA stammten, durch nichttranslatierte 5'-Sequenzen des HCMV-1E1-Gens zusammen mit seinem ersten Intron ersetzt. Dieses Intron wurde mit eingefügt, da es vermutlich ein schnelleres Prozessieren der gespleißten Transkripte und eine stabilere mRNA bewirkt. Der Expressionsvektor weist außerdem einen SV40-Replikationsursprung auf, damit er vorübergehend in COS7-Zellen exprimiert werden kann, und ein bakterielles β-Lactamasegen, damit die DNA durch Selektion auf eine Ampicillinresistenz cloniert werden kann.
Das Plasmid wurde aus einem 700 bp-SalI-PvuI-Fragment von pSV7d (in Beispiel 7, Abschnitt B, 1, beschrieben) konstruiert, das den SV40-Polyadenylierungsbereich enthielt, ein 1400 bp-PvuI-EcoRI (mit Klenow-Polymerase aufgefülltes)- Fragment von pSVT2 (Myers et al., Cell 25 (1981), 373-84, und Rio et al., Cell 32 (1983), 1227-40), das den SV40-Replikationsursprung und den Rest des β-Lactamasegens liefert, ein 1700 bp-SspI-SalI-Fragment, das von einem Plasmidsubclon des menschlichen Cytomegalovirus (Towne-Stamm) stammt, in den die SalI-Stelle durch in vitro-Mutagenese in der Nähe der Translationsstartstelle des 1E1-Proteins eingeführt worden war, und das 4300 bp-SalI-SalI-Fragment von pSVF8- 92C, das die cDNA, die das Glycoprotein Faktor VIII:C 92K Mr codiert, enthielt.
Das Plasmid pCMV6a120-SF2 gleicht dem vorstehend beschriebenen pCMV6a, ausgenommen, daß das SalI-SalI-Fragment, das den Proteinfaktor VIII:C 92K Mr codiert, durch eine Expressionskassette, die die nichttranslatierte 5'-Sequenz und die Signalsequenz von an ein heterologes Gen fusionierter menschlicher tPA enthielt, ersetzt wurde. Dieser Vektor wurde in E. coli-Zellen, die bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer 68249 hinterlegt sind, transformiert. Durch eine Spaltung von pCMV6a120-SF2 mit NheI und SalI wird das heterologe Gen entfernt. Jedes hu-MIP-2β-Polypeptidgen kann zur Insertion in den Säuger-Expressionsvektor pCMV6a120-SF2 an Linker ligiert werden. Das hu-MIP-2β-Gen wird beispielsweise durch eine Amplifikation mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) aus dem Hefeplasmid erhalten. Primer zur Steuerung der PCR-Reaktion können ausgehend von der in Figur 3 dargestellten Nucleinsäuresequenz von hu-MIP-2β leicht konstruiert werden, und die Primer können so konstruiert werden, daß sie geeignete Restriktionsstellen, beispielsweise NheI und SalI, zur Insertion des amplifizierten Gens in den Vektor enthalten. Das DHFR-Gen kann in diese neue hu- MIP-2β-Expressionskassette inseriert werden. Dieser neue Vektor erhielt die Bezeichnung pCMV-MIP-2β.

C. Herstellung einer MIP-2β-Säuger-Expressionszellinie

Dieses Beispiel beschreibt die Herstellung einer stabilen CHO-Zellinie, die das native hu-MIP-2β produziert.
Die DHFR&supmin;-CHO-Zellinie DG44 (G. Urlaub et al., Som. Cell. Mol. Genet. 12 (1986), 555-66) wird zunächst mit dem Plasmid pCMV-MIP-2β transfiziert. In diesem Plasmid reguliert der CMV-Promotor (im Beispiel 7B-2 beschrieben) das MIP-2β-Gen, das von pYMIP550 (in Beispiel 5 beschrieben) stammt, und der tPA-Leader (in Beispiel 7B-2 beschrieben) steuert die Sekretion des codierten hu-MIP-2β und enthält stromabwärts die Ad-MLP/dhfr-Kassette, die von pAd-DHFR (in Beispiel 7A beschrieben) stammt. Die Zellen werden unter Verwendung des "Polybrene"-Verfahrens, das von W. Chaney et al., Som. Cell. Mol. Genet. 12 (1986), 237-44, beschrieben wird, transfiziert. Durch Selektion auf DHFR&spplus;-Zellen (in DMEM + 10 % DFSC) werden mehrere hu-MIP-2β-Produzenten isoliert.

Information zu den Hinterlegungen

Die nachstehend beschriebenen Materialien wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, hinterlegt: Name Hinterlegungsdatum Hinterlegungsnr. Ovarialzellen des chinesischen Hamsters E. coli S. cerevisiae
Diese Materialien wurden nach den Bestimmungen des Budapester Vertrages über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck eines Patentverfahrens hinterlegt. Diese Hinterlegungen werden zur Verwendung durch den Fachmann bereitgestellt und stellen kein Eingeständnis dar, daß eine Hinterlegung nach 35 U.S.C., Abschnitt 112, erforderlich ist. Die Sequenz der Polynucleotide, die in den hinterlegten Materialien enthalten sind, sowie die Aminosäuresequenz der von ihnen codierten Polypeptide sind hier durch Bezugnahme eingeschlossen und geben bei Ungereimtheiten mit der schriftlichen Beschreibung der hier beschriebenen Sequenzen den Ausschlag. Eine Lizenz ist erforderlich, um die hinterlegten Materialien herzustellen, zu verwenden oder zu verkaufen, eine derartige Lizenz wird allerdings hiermit nicht gewährt.

Claims

1. Mittel, das menschliches MIP-2β-Polypeptid enthält und im wesentlichen frei von menschlichem Gewebe ist, wobei das Polypeptid aus menschlichem MIP-2β, menschlichen MIP-2β-Muteinen, verkürzten menschlichen MIP-2β-Peptiden und menschlichen MIP-2β-Fusionsproteinen ausgewählt ist und eine Aminosäuresequenz, die in Figur 3 dargestellt ist, enthält, die aber nicht in menschlichem MGSA, menschlichem MIP-2a, Maus-MIP-2 oder Maus-KC vorkommt.

2. Mittel nach Anspruch 1, das im wesentlichen frei von anderen menschlichen Proteinen ist.

3. Mittel nach Anspruch 1, das im wesentlichen frei von anderen Proteinen ist.

4. Mittel nach Anspruch 1, wobei das hu-MIP-2β-Polypeptid hu-MIP-2β ist.

5. Mittel, enthaltend DNA-Moleküle, die einen heterologen Bereich umfassen, der hu-MIP-2β-Polypeptid codiert, wobei das Polypeptid aus menschlichem MIP-2β, menschlichen MIP-2β-Muteinen, verkürzten menschlichen MIP-2β-Peptiden und menschlichen MIP-2β-Fusionsproteinen ausgewählt ist und eine Aminosäuresequenz, die in Figur 3 dargestellt ist, enthält, die aber nicht in menschlichem MGSA, menschlichem MIP-2α, Maus-MIP-2 oder Maus-KC vorkommt, wobei das Mittel im wesentlichen frei von anderen DNA- Molekülen ist.

6. Mittel nach Anspruch 5, wobei der das hu-MIP-2β-Polypeptid codierende Bereich eine intronfreie DNA-Sequenz ist.

7. DNA-Molekül, das eine intronfreie DNA-Sequenz enthält, die eine Aminosäuresequenz des hu-MIP-2β-Polypeptids codiert, wobei das Polypeptid aus menschlichem MIP-2β, menschlichen MIP-2β-Muteinen, verkürzten menschlichen MIP-2β-Peptiden und menschlichen MIP-2β-Fusionsproteinen ausgewählt ist und eine Aminosäuresequenz, die in Figur 3 dargestellt ist, enthält, die aber nicht in menschlichem MGSA, menschlichem MIP-2α, Maus-MIP-2 oder Maus-KC vorkommt.

8. DNA-Molekül nach Anspruch 7, wobei das hu-MIP-2β-Polypeptid hu-MIP-2β ist.

9. Zellpopulation, die mit dem DNA-Molekül nach Anspruch 5 transformiert ist, wobei die Population im wesentlichen frei von Zellen ist, die nicht mit dem DNA-Molekül transformiert wurden.

10. Verfahren zur Herstellung eines hu-MIP-2β-Polypeptids, wobei das Polypeptid aus menschlichem MIP-2β, menschlichen MIP-2β-Muteinen, verkürzten menschlichen MIP-2β- Peptiden und menschlichen MIP-2β-Fusionsproteinen ausgewählt ist und eine Aminosäuresequenz, die in Figur 3 dargestellt ist, enthält, die aber nicht in menschlichem MGSA, menschlichem MIP-2α, Maus-MIP-2 oder Maus-KC vorkommt, umfassend:

Bereitstellung einer Population von transformierten Zellen nach Anspruch 9,

Züchtung der Population unter Bedingungen, unter denen das Polypeptid exprimiert wird, und

Gewinnung des Polypeptids.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Polypeptid von der Zelle sezerniert wird.

12. Einzelstrang-DNA-Molekül, umfassend mindestens 20 aufeinanderfolgende Nucleotide, wobei die aufeinanderfolgenden Nucleotide eine Untersequenz umfassen, die einzigartig ist für die Sequenz von hu-MIP-2β, wie sie in Figur 3 gezeigt ist, oder eine dazu komplementäre DNA- Sequenz.

13. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart eines Polynucleotids, das im wesentlichen homolog zur Codierungssequenz für menschliches MIP-2β ist, umfassend:

Bereitstellung einer Probe, von der man annimmt, daß sie das Polynucleotid enthält,

Inkubation der Probe mit einer Nucleotidsonde, die eine Sequenz aufweist, die komplementär zur Einzelstrang-DNA nach Anspruch 12 ist, unter Bedingungen, bei denen die Sonde Hybride mit Nucleinsäure aus der Probe bildet, und Nachweis der Nucleinsäurehybride.

14. Antikörper, der mit einem Epitop auf einem hu-MIP-2β-Polypeptid reagiert, wobei das Polypeptid aus menschlichem MIP-2β, menschlichen MIP-2β-Muteinen, verkürzten menschlichen MIP-2β-Peptiden und menschlichen MIP-2β-Fusionsproteinen ausgewählt ist und eine in Figur 3 dargestellte Aminosäuresequenz enthält, die aber nicht in menschlichem MGSA, menschlichem MIP-2α, Maus-MIP-2 oder Maus-KC vorkommt, aber nicht mit Maus-MIP-2, menschlichem gro-Protein oder dem durch das Maus-KC-Gen codierten Protein reagiert.

15. Antikörper nach Anspruch 14, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.

16. Mittel, das den Antikörper nach Anspruch 14 enthält, wobei das Mittel im wesentlichen frei von anderen Immunglobulinmolekülen ist.

17. Hybridomzellinie, die den monoclonalen Antikörper nach Anspruch 15 produziert.

18. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von menschlichem MIP-2β in einer Probe, umfassend:

Inkubation der Probe mit einem Antikörper, der mit hu- MIP-2β-Polypeptid reagiert, wobei das Polypeptid aus menschlichem MIP-2β, menschlichen MIP-2β-Muteinen, verkürzten menschlichen MIP-2β-Peptiden und menschlichen MIP-2β-Fusionsproteinen ausgewählt ist und eine Aminosäuresequenz, die in Figur 3 dargestellt ist, enthält, die aber nicht in menschlichein MCSA, menschlichem MIP- 2α, Maus-MIP-2 oder Maus-KC vorkommt, und

Nachweis des Immunkomplexes.

19. Verfahren zum Nachweis der Gegenwart von anti-hu-MIP-2β- Antikörpern in einer Probe, umfassend:

Inkubation der Probe mit dem Mittel nach Anspruch 2 und Nachweis des Immunkomplexes.

20. Arzneimittel, das die Knochenmarkbildung in myelopoetischen Zellen stimuliert, umfassend eine wirksame Menge des hu-MIP-2β-Polypeptids, wobei das Polypeptid aus menschlichem MIP-2β, menschlichen MIP-2β-Muteinen, verkürzten menschlichen MIP-2β-Peptiden und menschlichen MIP-2β-Fusionsproteinen ausgewählt ist und eine Aminosäuresequenz, die in Figur 3 dargestellt ist, enthält, die aber nicht in menschlichem MGSA, menschlichem MIP- 2α, Maus-MIP-2 oder Maus-KC vorkommt.