DE69122712T2

DE69122712T2 - Verfahren zur nukleinsäure hybridisierung und amplifizierung

Info

Publication number: DE69122712T2
Application number: DE69122712T
Authority: DE
Inventors: Christopher J. Novato Ca 94945 Green; Elissa P. Palo Alto Ca 94301 Sena; David A. Atherton Ca 94025 Zarling
Original assignee: Daikin Industries Ltd
Current assignee: Daikin Industries Ltd
Priority date: 1990-05-07
Filing date: 1991-04-17
Publication date: 1997-02-20
Anticipated expiration: 2011-04-18
Also published as: JP3010738B2; EP0481065B1; EP0481065A1; WO1991017267A1; DE69122712D1; US5223414A; CA2056983A1; JPH04507198A; CA2056983C

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren für die Verwendung von RecA-Protein(en) zum Katalysieren von DNA-Synthese-, -Reparatur- und -Amplifizierungsreaktionen.

Literatur

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Hintergrund der Erfindung

Die EP-A-0229701 offenbart ein Amplifizierungsverfahren, das auf die Anwendung von Hitze zum Denaturieren einer doppelsträngigen Nukleotidsequenz angewiesen ist.
RecA+-Protein (Wildtyp) ist ein Protein mit 38.000 Dalton, das in dem Bakterium Escherichia coli, gefunden wurde und für homologe DNA-Rekombination wichtig ist. Die meisten Informationen über seine Biochemie und Enzymologie stammen aus Untersuchungen an gereinigtem RecA+-Protein. Zahlreiche in vitro-Untersuchungen haben gezeigt, daß RecA+- Protein eng an der Paarbildungsreaktion zwischen homologen DNA-Sequenzen beteiligt ist, was letztendlich zu homologen Rekombinationsereignissen führt (siehe Cox et al., neuer Übersichtsartikel über Eigenschaften von RecA+-Protein). Es ist diese Paarbildungsreaktion, die RecA+-Protein sehr geeignet für DNA-Diagnose- und -therapieanwendungen macht.
In Gegenwart von ATP katalysiert RecA+-Protein einen Strangaustausch zwischen einer Vielzahl von Substraten, wobei für DNA-Sondenanwendungen einzel- und doppelsträngige DNA am wichtigsten sind. Einzelsträngige DNA (Sonde) interagiert mit dem homologen Bereich der doppelsträngigen ("nativen") Zielsequenzen zuerst durch Bildung eines Rekombinationszwischenproduktes, welches hybridisierte, teilweise verbundene Moleküle enthält. Dem folgt Verzweigungswanderung und Bildung von vollständigen Hybridmolekülen zwischen den ursprünglichen einzel- und doppelsträngigen DNAs, abhängig von dem Ausmaß ihrer Homologie. Diese Reaktion ergibt ein Produkt, welches ein Hybrid zwischen Sonde und Ziel ist. Derartige Hybride können leicht unter Verwendung von z. B. radioaktiv markierten, enzymmarkierten, chemolumineszenzmarkierten, phosphoreszenzmarkierten oder fluoreszenzmarkierten Sonden nachgewiesen werden.
RecA+-Protein wurde in einer Vielzahl von Anmeldungen verwendet. Z. B. lehrt die JP-A-63109800 ein DNA-Sequenzierungsverfahren unter Verwendung eines Primers, einer doppelsträngigen Ziel-DNA und eines RecA-Proteins in Gegenwart von ATP, dNTPs, ein oder vier ddNTPs und einer DNA-Synthetase (z. B. Klenow-Fragment). RecA katalysiert die Hybridisierung des Primers an das Ziel durch Bildung einer D-Schleifenstruktur. Der hybridisierte Primer wird von der DNA-Synthetase verlängert und die synthetisierte DNA in einem Gel aufgetrennt und sichtbar gemacht.
Eine mutante Form des Proteins ist in Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 85, S. 6592- 6596, 9/88 (M.V.V.S. Madiraju, et al.) beschrieben. Dieses Protein (RecA-803) führt unter suboptimalen Bedingungen sowohl zu einer höheren Bildungsrate als auch einer höheren Ausbeute an verbundenen Molekülen als Wildtyp RecA.
Die vorliegende Anmeldung zeigt die Möglichkeit der Verwendung von RecA+-Protein zur Erleichterung und Verbesserung der Effizienz von Hybridisierungsreaktionen, an denen einzelsträngige Primer und komplementäre, native doppelsträngige Zielsequenzen beteiligt sind. Insbesondere ist RecA+-Protein für viele DNA-Sondenanwendungen besonders gut geeignet, da die doppelsträngige Ziel-DNA vor der Hybridisierung nicht denaturiert werden muß (z. B. durch Erhitzen). Die EP-A-0322311 schlägt z. B. vor, RecA zu verwenden, um die Wiedererkennung eines doppelsträngigen DNA-Zielmoleküls durch eine Sonde zu erleichtern, ohne das Zielmolekül ausdrücklich denaturieren zu müssen. Das Protein wurde in einem Verfahren zum Nachweis von Viren durch PCR-Amplifizierung und -Hybridisierung eingesetzt. Weiterhin ist RecA+-Protein geeignet zur Erleichterung der Initiation und Vollendung von DNA-Kettenverlängerung bei DNA-Sequenzen, die entweder beschädigt oder schwer zu denaturalisieren sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren für durch RecA-Protein erleichterte Amplifizierung einer doppelsträngigen DNA-Zielsequenz mit ersten oder zweiten komplementären, zirkulären oder linearen Strängen zu liefern, wobei jeder lineare Strang 5mi - und 3'-Enden besitzt. Das Verfahren umfastt die Komplexbildung eines Primers, der komplementär zu einem 5'-Endabschnitt des ersten Strangs ist, und eines Primers, der komplementär zu einem 5'-Endabschnitt des zweiten Strangs ist, mit RecA-Protein in Gegenwart von ATP-γ-S. Die komplexierten Primer werden dann in einem Gemisch zur Reaktion gebracht, das u. a. die Zielsequenz, alle vier dNTPs, RecA-Protein und DNA-Polymerase enthält. Die Reaktion wird unterhalb der Temperatur, die für thermische Dissoziation der zwei Zielstränge erforderlich ist, durchgeführt und fortgesetzt, bis ein erwünschter Amplifizierungsgrad der Zielsequenz erreicht ist.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist besonders geeignet, wenn die Ziel-DNA eine hemmende Sekundärstruktur oder anderweitig amplifizierungshemmende Bereiche aufweist.
Während der Durchführung der DNA-Synthesereaktion können weitere Zugaben von DNA-Polymerase, RecA-Protein und/oder ATP-γ-S vorgenommen werden.
Eine Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens umfaßt, daß die beiden Primer zu derselben DNA-Sequenz komplementär sind. Eine weitere Ausführungsform umfaßt die Verwendung von Primern, die endständige 5'-Sequenzen enthalten, die zu der DNA-Zielsequenz nicht komplementär sind. Diese nicht komplementären Sequenzen können Sequenzen umfassen, die für Erkennungsstellen von Restriktionsendonukleasen, Einfangsequenzen, Reportersequenzen, RecA-Proteinladesequenzen, Z-DNA-Sequenzen oder doppelsträngige Schwänze kodieren.
Ein entscheidender Vorteil der Erfindung ist die Verwendung des Verfahrens zur Synthese/Amplifizierung physikalisch oder chemisch beschädigter DNA-Substrate.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfaßt, daß das RecA-Protein das Proteinprodukt des recA-803-Gens ist.
Die RecA-tragenden Primer der vorliegenden Erfindung dienen aufgrund ihrer erhöhten Fähigkeit komplementäre Sequenzen und Sequenzen in Bereichen mit normalerweise hemmender Sekundärstruktur aufzufinden und sich damit zu paaren auch als geeignete Sonden in auf Hybridisierung basierenden diagnostischen Systemen.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 zeigt die Ergebnisse der elektrophoretischen Auftrennung von DNA-Bindungsreaktionen, wobei die Aktivitäten von RecA+- und recA-803-Proteinen verglichen werden.
Figur 2A zeigt die Ergebnisse von ATP-Hydrolysereaktionen, wobei die ATPase- Aktivitäten von RecA+- und recA-803-Proteinen verglichen werden. Figur 2B zeigt die Ergebnisse von Strangtransferreaktionen, wobei die Aktivitäten von RecA+- und recA-803- Proteinen verglichen werden.
Figuren 3, 4A und 4B zeigen die Ergebnisse von Bindungstests von RecA+-Protein mit doppelsträngiger DNA.
Figur 5 zeigt die Auswirkungen von RecA+-Protein und Einzelstrangbindeprotein auf die Synthese großer DNA von einzelsträngigen DNA-Matrizen.
Figur 6 zeigt die Auswirkung von recA-803-Protein auf die Synthese großer DNA von doppelsträngigen, linearen Matrizen.
Figur 7 zeigt die Ergebnisse, die die Verbesserung der DNA-Synthese von nativen Lambda-DNA-Matrizen durch RecA+-Protein demonstrieren.
Figur 8 zeigt die Ergebnisse, die beweisen, daß die Verbesserung der DNA-Synthese durch RecA+-Protein nicht vom Vorhandensein von Einzelstrangbindeprotein abhängig ist.
Figur 9 zeigt die Ergebnisse, die die Abhängigkeit der durch RecA+-Protein katalysierten DNA-Synthese von dem Vorhandensein spezifischer Primer beweist.
Figuren 10 und 11 zeigen Ergebnisse, die die durch RecA+-Protein katalysierten, bei einer einzelnen Temperatur durchgeführten DNA-Amplifizierungsreaktionen demonstrieren.
Figur 12 zeigt Ergebnisse, die beweisen, daß RecA+ bei Amplifizierungsreaktionen bei einer einzigen Temperatur, die Produktspezifität erhöht.
Figur 13 zeigt die Teilsequenz des RecA-Gens von Aquaspirillum magnetotacticum.

Genaue Beschreibung der Erfindung

I. Vergleich der DNA-Bindungs- und DNA-Strangtransferaktivitäten von RecA+- und recA-803-Protein

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ausgezeichnete RecA+-Proteinkatalysatoren zu liefern, um DNA-Hybridisierungs- und DNA-Synthesereaktionen zu erleichtern. Experimente, die zur Unterstützung der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, ließen vermuten, daß recA-803-Protein ein nützlicher Kandidat für solch einen Katalysator sei. Das mutante recA-803- Gen wurde kloniert und sequenziert und das Proteinprodukt überexprimiert und gereinigt (Madiraju et al.). Dieses neue mutante RecA-Protein bildet effizienter stabilere Rekombinationszwischenprodukte zwischen Ziel- und Sonden-DNAs als Wildtyp RecA+-Protein, was durch Nitrozellulosefilterbindungstests bewiesen wurde (Madiraju et al.). Diese Beobachtung legt nahe, daß die DNA-Paarbildungseffizienz des recA-803-Proteins, wie sie durch einen Nitrozellulosefilterbindungstest gemessen wurde, signifikant größer ist als diejenige des Wildtyp RecA+-Proteins. Unter verschiedenen Bedingungen katalysiert das mutante RecA- Protein die Paarbildungsreaktion mit schnellerer Kinetik und mit einer höheren Endausbeute als dies normalerweise durch das Wildtyp RecA+-Enzym erreicht wird.
Große Mengen mutanten recA-803-Proteins wurden aus E. coli, welche ein Plasmid (Dr. A. John Clark, Dept. Mol. Biology, UC Berkeley) enthielten, das das Gen überexprimiert, isoliert, wobei etwa 40 % des Gesamtproteins in der Bakterienzelle mutantes recA-803- Protein ist.
Beispiel 1 (Figur 1) präsentiert Daten aus einem Gelretardationstest zur Untersuchung der relativen DNA-Bindungseffizienz von RecA+- und recA-803-Protein. RecA+- oder recA- 803-Protein wird mit der doppelsträngigen, linearisierten DNA von phiX-174 unter Bedingungen, die die Bildung von Protein-DNA-Komplexen erlauben, zur Reaktion gebracht. Die Reaktionen wurden in zwei Proben aufgeteilt, wobei die Hälfte jeder Probe mit einem Detergens, wie SDS, behandelt wurde, um die Protein-DNA-Komplexe zu zerstören. Die behandelten und unbehandelten Proben wurden nebeneinander auf 0,7 %-igen Agarosegelen aufgetrennt (siehe Material und Methoden). Eine Grundlage des Gelretardationstests ist, daß DNA- Protein-Komplexe viel langsamer durch die Gelmatrix wandern. Spuren 7 und 8 in Figur 1 zeigen unbehandelte bzw. behandelte Proben. Ein Vergleich der Spuren 3 (RecA+-Protein) und 7 (recA-803-Protein) zeigt deutlich, daß recA-803-Protein, im Vergleich mit RecA+- Protein, wesentlich effizienter an doppelsträngige, lineare phiX-174-DNA bindet; ähnliche Experimente mit doppelsträngigen Plasmid- oder viralen DNAs führten zu identischen Ergebnissen.
Beispiel 2 präsentiert Daten, die zeigen, daß recA-803-Protein im Vergleich mit RecA+-Protein auch ein überlegener Katalysator bei der Hydrolyse von ATP und bei der Erzeugung signifikant größerer Mengen an DNA-Strangtransferprodukten ist. Aus dem in Beispiel 2A beschriebenen Experiment wird deutlich, daß das recA-803-Protein signifikant mehr DNA-abhängige ATPase-Aktivität als das RecA+-Protein aufweist (Figur 2A). In Beispiel 2B wurde einzelsträngige, zirkuläre Virionen-DNA von phiX-174 mit recA-803- oder RecA+- Protein für 10 Minuten bei 37 ºC vorinkubiert, um ein Radding-artiges Filament (Radding) zu bilden. Das doppelsträngige Ziel wurde anschließend zugegeben, und die Stränge wurden mit ATP-γ-S als Kofaktor überführt. Die Ergebnisse zeigen, daß recA-803 im Vergleich zu RecA+- Protein eine signifikant größere Menge an Strangtransferprodukt katalysiert. Die Strangtransferprodukte erscheinen als eine diskrete Bande, angezeigt durch die Pfeile in Figur 2B. Vergleich von Spuren 3 und 6 (RecA+-Protein) mit Spur 8 (recA-803-Protein) zeigt die erhöhte Effizienz des recA-803-Proteins bei der Erzeugung von DNA-Strangtransferprodukten. Aufgrund dieses und ähnlicher Experimente scheint das recA-803-Protein etwa 5 bis 7 mal mehr Strangtransferprodukte der Form II zu erzeugen als RecA+-Protein.
Die Eigenschaften der erhöhten Fähigkeit, DNA zu binden, und der gesteigerten Effizienz bei der Katalyse der Strangtransferreaktion machen das recA-803-Protein zu einem überlegenen Katalysator bei DNA-Synthese-, -Hybridisierungs-, -Diagnose- und -Therapieanwendungen. Diese erwünschten Eigenschaften machen das recA-803-Protein zu einem idealen Katalysator, um schnelle und effiziente Tests zur Hybridisierung von DNA-Sondensequenzen mit nativen, doppelsträngigen DNA-Zielen in Lösung zu liefern. In derartigen Tests kann jedes Trennungssystem (Collins et al., Rigas et al., Leahy et al.) eingesetzt werden, das zwischen nicht hybridisierter Sonde (die einzelsträngig verbleibt) und hybridisiertem Sonde- Ziel-Komplex (der teilweise doppel- oder mehrsträngig ist, d. h., daß er doppelsträngige Bereiche mit Abschnitten einzelsträngiger, gebundener Sonde enthält) unterscheidet.
Die Verwendung von RecA-Protein katalysiert verstärkte Hybridisierung mit homologen Sequenzen bei DNA-Diagnostika, eliminiert alle erforderlichen, arbeitsaufwendigen Schritte bei der gebräuchlichen Denaturierung der Ziel-DNA und überwindet die erheblichen Beschränkungen, die durch Rückfaltung und andere repetitive Sequenzen, die für Denaturierung und daher für den Nachweis unzugänglich scheinen, gesetzt werden. In der Natur umfassen die Funktionen des RecA+-Proteins höchstwahrscheinlich die Erleichterung der DNA-Polymerisation oder -Rekombination in (i) Bereichen komplexer oder ungewöhnlicher Sekundärstruktur oder (ii) chemisch oder physikalisch beschädigter DNA-Sequenzen.

II. Verstärkte Bindung des RecA-Proteins an beschädigte DNA oder DNA mit Z-Konformation

RecA+-Protein aus E. coli ist ein Hauptbeteiligter bei der Erkennung und anschließenden Reparatur von beschädigten DNA-Doppelhelizes. Verschiedene physikalische und chemische Agenzien, wie UV-Licht (Lu et al.) und Psoralen (Shi et al.), die Pyrimidinbasen an doppelsträngige DNA-Konformation anlagern und/oder darin verdrehen können, sind dafür bekannt, daß sie die Bindung von RecA+-Protein verstärken. Die Erkennung von doppelhelikaler DNA durch RecA+-Protein, in die Purin eingefügt worden ist, wurde zuvor nicht untersucht. N-Acetoxy-N-2-Acetylaminofluoren (N-AcO-AAF) ist ein starkes Mutagen und chemisches Modellkarzinogen, welches kovalent Desoxyguaninreste bindet, was zu Addukten, vorzugsweise an der C-8-Position, führt (Kriek). Diese Modifikation verursacht weitreichende topologische Veränderungen und Entwindung der DNA-Helix dadurch, daß die Rotation der Desoxyguaninbase von der Anti- in die Synkonformation induziert wird (Fuchs et al., 1976). Energieminimierungsstudien legen nahe, daß diese Rotation mit einer Einfügung des heterozyklischen Adduktes in das Helixinnere einhergeht, was eine Biegung in der helikalen Achse bewirkt (Hingerty et al.). Weiterhin induziert eine kovalente Modifikation mit N-AcO-AAF einen B T Z-Übergang verschiedener abwechselnder Purin-Pyrimidin- oder anderer Sequenzen in doppelsträngiger DNA (Sage et al., 1980, 1981; Santella et al., 1981a, 1981b; und Wells et al.).
Beispiel 3 beschreibt die Ergebnisse von Bindungstests von RecA+-Protein und doppelsträngiger DNA. Blaho et al. haben zuvor gezeigt, daß RecA+-Protein bevorzugt an bromierte oder methylierte, lineare synthetische Z-DNA bindet, verglichen mit den B-DNA- Polymeren. Die in Figur 3 vorgestellten Ergebnisse von Beispiel 3 zeigen in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Blaho et al. eine bevorzugte Bindung an das bromierte Substrat. Weiterhin zeigen die Ergebnisse in Figur 3, daß die Bindung von RecA+ an die doppelsträngige, synthetische DNA bei neutralem pH mit ATP-γ-S als Kofaktor durch Purinanlagerung mit N-AcO-AAF verstärkt wird. Bei diesem und anderen ähnlichen Experimenten wurde durch vermehrte N-ACO-AAF-Anlagerungen in der doppelsträngigen DNA die Bindung von RecA+- Protein an den DNA-Doppelstrang erhöht. Die Bindung war proportional zu dem Grad der N- AcO-AAF-Anlagerung in dem Bereich von 5 - 20 % N-AcO-AAF-Anlagerung.
Die Ergebnisse in Beispiel 4 (Figuren 4A und 4B) zeigen deutlich eine offensichtliche Sequenzspezifität von RecA+-Protein mit bevorzugten Bindungsaffinitäten zu doppelsträngigem Oligo-[d(C-A)d(G-T)] im Verhältnis zu den Doppelsträngen, die von Oligo-[d(Br&sup5;C-G)] oder Oligo-[d(C-G)] gebildet werden. RecA+-Protein zeigt sequenzspezifische (Figuren 4A und 4B) und konformationsspezifische (Figur 3) Präferenzen der Bindung für diese DNA-Doppelstränge.
RecA-Protein hat dementsprechend wertvolle diagnostische und therapeutische Anwendungen. Wenn die Ziel-DNA beschädigt wurde oder ungewöhnliche Sekundärstruktur besitzt, können herkömmliche Verfahren zur DNA-Hybridisierung und/oder -Synthese unwirksam sein. Die Ergebnisse der in den Beispielen 3 und 4 vorgestellten Experimente zeigen den Wert, die Fähigkeit von RecA-Protein zu nutzen, eine Bindung an komplexe DNA und komplementäre Basenpaarungen zu fördern.

III. Verstärkung der in vitro-DNA-Synthese durch RecA+ und recA-803

DNA-Amplifizierungsverfahren nach dem Stand der Technik basieren alle auf einem dreistufigen Prozeß, der Denaturierung der DNA-Matrize, Primerhybridisierung und Primerverlängerung durch DNA-Polymerase umfaßt (Mullis und Mullis et al.). Die vorliegende Erfindung liefert einzigartige und wertvolle Alternativen unter Nutzung der Katalyse durch RecA-Protein.
Ein neues Verfahren von durch RecA-Protein katalysierter DNA-Amplifizierung beinhaltet die Inkubation von DNA-Zielsequenzen und DNA-Primern, die zu der Zielsequenz komplementär sind, mit RecA+-Protein oder recA-803-Protein in Gegenwart von ATP oder ATP-γ- S bei 37 ºC. Diese Bedingungen lassen durch RecA-Protein katalysierte D-Schleifen vom Radding-Typ oder Verbindungsmoleküle zwischen den Primern und der Ziel-DNA zu. Diese stabilen, durch RecA katalysierten Verbindungsmoleküle werden mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I verlängert.
Beispiel 5 beschreibt die verstärkende Wirkung von RecA+-Protein auf die DNA- Synthese, ausgehend von einer einzelsträngigen Matrize. Die in Figur 5 vorgestellten Daten zeigen die Erhöhung der Synthese einzelsträngiger DNA durch RecA+- und Einzelstrangbindeproteine (SSB) aus E. coli. Die zwei Proteine scheinen eine synergistische Wirkung zu haben. Die Synthese auf einzelsträngigen, zirkulären DNA-Matrizen von phiX-174 wurde durch Überziehen der Primer mit RecA+ verstärkt, wodurch ein Filament vom Radding-Typ erzeugt wurde. Die Einbeziehung von SSB-Protein aus E. coli in die Reaktion verstärkte ebenfalls auf einzelsträngige DNA gerichtete DNA-Synthese, was durch Einbau von [³H]dGTP in DNA mit hohem Molekulargewicht (unlöslich in kalter TCA) gemessen wurde.
Die Wirkung von RecA-Protein auf die DNA-Synthese, ausgehend von einer doppelsträngigen DNA-Matrize (dsDNA), wurde ebenfalls untersucht (Beispiel 6). Die in Figur 6 vorgestellten Daten zeigen durch recA-803-Protein verstärkte DNA-Synthese, ausgehend von einer doppelsträngigen Matrize unter Verwendung von 18-meren Primern. Die Primer wurden für 5 Minuten bei 37 ºC mit recA-803-Protein (3 µM) zur Reaktion gebracht, damit vor der Zugabe der dsDNA Filamente gebildet wurden. Nach einer darauf folgenden, zusätzlichen Inkubation für 5 Minuten wurde großes Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aus E. coli zugegeben. RecA-803-Protein verstärkte signifikant die DNA-Synthese, was durch erhöhten Einbau von [α-³&sup5;S]dATP in DNA mit hohem Molekulargewicht bewiesen wurde.
Beispiele 5 und 6 zeigen, daß die Raten und das Ausmaß der DNA-Synthese durch Primer, die mit RecA+ oder recA-803 überzogen worden waren, signifikant verstärkt wurden.
Beispiel 7 zeigt, daß RecA-Protein die DNA-Synthese von nativen, viralen Lambda- DNA-Matrizen verstärken kann. In Beispiel 7 wurden die Reaktionen bei Raumtemperatur ohne die Primer zusammengefügt. RecA+-Protein wurde mit den zwei 25-meren, einzelsträngigen Primern (PCR01 und PCR02, Tabelle 1) inkubiert. Anschließend wurden ATP-γ-S und SSB- Protein der Reaktion zugegeben, gefolgt von der nativen λ-DNA-Matrize. Die Reaktionen wurden in einem 37 ºC warmen Heizblock inkubiert und vor der Zugabe von Klenow-DNA- Polymerase für 3 Minuten bei 37 ºC äquilibriert. Nach der Initiation der Reaktion durch die erste Zugabe von Klenow wurden anschließend über den Zeitraum von 80 Minuten in zehnminütigen Intervallen 10 zusätzliche Einheiten frischer Klenow-Polymerase hinzugefügt. Von den Reaktionen wurden Proben genommen und die Menge an neusynthetisierter DNA gemessen. Die in Figur 7 vorgestellten Daten zeigen, daß die Synthese von nativer λ-DNA bei Einbeziehung von RecA+-Protein und ATP-γ-S in Langzeitreaktionen (72 Stunden), katalysiert durch Klenow-DNA-Polymerase bei einer einzigen Temperatur von 37 ºC, verstärkt wird. Die Verstärkung der DNA-Synthese wurde durch erhöhte Ethidiumbromidbindung und Färbung von DNA-Produkten, die durch Elektrophorese in 0,7 %igen Agarosegelen aufgetrennt wurden, nachgewiesen.
Beispiel 7 legt Daten vor, die zeigen, daß die Fähigkeit von RecA-Protein, die DNA- Synthese an dsDNA-Matrizen zu verstärken, nicht von der Gegenwart von SSB-Protein abhängt. Die in Figur 8 vorgestellten Daten zeigen DNA-Synthese bei Abwesenheit von SSB- Protein (Spur 1) und demonstrieren weiter die Fähigkeit des RecA+-Proteins, DNA-Synthese in Kurzzeitreaktionen zu verstärken (8 aufeinanderfolgende Zugaben von Polymerase, alle 10 Minuten für 80 Minuten).
Die Primer-abhängige Natur der durch das RecA-Protein katalysierten DNA-Synthese ist in Beispiel 8 beschrieben. Die in Figur 9 vorgestellten Daten zeigen verstärkte native DNA- Synthese in Polymerasereaktionen mit exonukleasefreien (US Biochemicals) Doppelmutanten des großen Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I aus E. coli nur in Gegenwart von RecA+-Protein und Primern.
Eine 500 bp lange DNA-Matrize wurde unter Verwendung von PCR01- und PCR02- Primerpaaren enzymatisch synthetisiert (Amplitaq -Kit, Perkin-Elmer-Cetus) (Tabelle 1). Dieses doppelsträngige Produkt wurde als eine einfache, 500 bp lange Matrize zusammen mit den 40-meren Primern PCR01 und PCR02 (Tabelle 1) für DNA-Synthesereaktionen verwendet. Die Reaktionen wurden für 17,5 Stunden bei 37 ºC unter Verwendung exonukleasefreier Doppelmutanten des großen Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I aus E. coli inkubiert. Die in Figur 10 vorgestellten Daten (Beispiel 9) (Spur 4) zeigen eine Bande neu synthetisierter DNA- Produkte mit einer elektrophoretischen Beweglichkeit und einem Molekulargewicht, die der 500 bp langen, nativen λ-DNA-Matrize entspricht. Die Synthese dieser DNA-Produkte war unbedingt von der Zugabe von RecA+-Protein zu der Reaktion abhängig. Unter den gleichen Bedingungen wurden bei Reaktionen, die sowohl mit RecA+-Protein als auch SSB-Proteinen versetzt wurden, andere Produkte mit niedrigeren Mulekulargewichten (Spur 5) erzeugt. Dieses Ergebnis ließ vermuten, daß das DNA-Syntheseprodukt heterogener ist, wenn SSB- Protein vorliegt, was bedeutet, daß das Protein eine negative Auswirkung in Bezug auf die Spezifität besitzt, obwohl die Synthese großer DNA in Gegenwart von SSB-Protein verbessert werden kann.
In einem anderen Experiment wurden 500 bp lange DNA-Produkte von 500 bp langen λ-DNA-Matrizen mit den 25meren Primerpaaren synthetisiert (Beispiel 9). Tabelle 2, dargestellt in Beispiel 9, faßt eine Anzahl von Reaktionsbedingungen zusammen, unter denen die Fähigkeit des RecA+-Proteins getestet wurde, DNA-Synthese zu katalysieren. Die Ergebnisse der Reaktionen sind in Figur 11 dargestellt. Im allgemeinen hängen die verstärkenden Effekte des RecA-Proteins von der Konzentration des RecA-Proteins, dem Protein-DNA-Verhältnis, der Inkubationszeit und dem Vorliegen der spezifischen Primerpaare in geeigneten Konzentrationen ab (Spur 7).
Hybridisierung einer radioaktiv markierten Sonde, die spezifisch für die 500 bp lange λ-Matrize ist, mit bei einer einzigen Temperatur durch RecA+ katalysierten Klenow-DNA- Amplifizierungsreaktion zeigt, daß RecA+ tatsächlich die Produktsynthese verstärkt (Beispiel 9C). Die in Figur 12 gezeigten Daten belegen, daß eine signifikante Amplifizierung der 500 bp langen Matrize nur in der Reaktion stattfand, die RecA+ und ATP-γ-S enthielt und bei der SSB-Protein fehlte (Spur 3).
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Synthese und Amplifizierung nativer, doppelsträngiger, d. h. nicht denaturierter Ziel-DNA-Sequenzen in Lösung unter Einsatz durch RecA katalysierter Zielhybridisierung mit homologen Oligonukleotidprimersequenzen. Diese Hybridisierungsreaktion positioniert die Primer für die anschließende Verlängerung durch DNA-Polymerasen. Die Reaktion ist ein zweistufiger Prozeß und erfordert eine Optimierung beider Reaktionsstufen: (i) die Primerhybridisierung und (ii) die Primerverlängerung.
Ziel-DNA-Sequenzen können durch eine Vielzahl von Verfahren und von vielen Quellen erhalten werden, z. B.: (i) die ursprüngliche Ziel-DNA-Sequenz kann aus einer einzelsträngigen Nukleinsäurematrize, wie einzelsträngiger DNA oder einem RNA-Molekül, durch Standardverfahren synthetisiert werden (Maniatis et al.) und (ii) die ursprüngliche Zielsequenz kann aus einer Zell- oder Gewebequelle extrahiert werden. Die Ziel-DNA-Sequenz kann auch in einer homogenen Mischung vorliegen, d.h., daß diese hauptsächlich aus Zielsequenzen zusammengesetzt ist, oder in einer heterogenen Mischung, d. h., daß andere Sequenzen vorliegen.
Zuerst wird ein zu der Zielsequenz komplementärer Primer mit der Ziel-DNA-Sequenz unter Bedingungen zur Reaktion gebracht, die dem RecA-Protein ermöglichen, die Bildung von miteinander verbundenen Molekülen aus dem Primer und der Ziel-DNA zu katalysieren. Diese Reaktion wird mit nativen DNA-Substraten durchgeführt, d. h., daß die DNA-Stränge nicht hitzedenaturiert sind. Die mehrsträngigen Strukturen, deren Bildung durch RecA-Protein katalysiert wird, werden unter Verwendung des Klenow-Fragmentes von DNA-Polymerase I in Gegenwart von Nukleotidtriphosphaten verlängert. RecA-Protein bereitet die Hybrid-DNA für die Verlängerung durch DNA-Polymerase topologisch vor.
In anschließenden Amplifizierungskreisläufen können freie Primer, die zu den vorliegenden Ziel-DNA-Strängen komplementär sind, entweder an einen ursprünglichen Strang oder an den neuen Strang binden. Einmal hybridisiert, werden diese Komplexe anschließend durch DNA-Polymerase, wie oben beschrieben, verlängert. Der Prozeß wird wiederholt und die Zielsequenz synthetisiert und daher vielfach amplifiziert. Nach wenigen Amplifizierungskreisläufen kann die native Zielsequenz mit einer markierten einzelsträngigen DNA-Sonde durch Massenwirkungshybridisierung und/oder durch RecA-Protein-Sonden-Komplexe in Hybridisierungsreaktionen, die von dem RecA-Protein katalysiert werden, nachgewiesen werden. Alternativ kann man die Reaktion viele Kreisläufe durchlaufen lassen, wodurch man ein amplifiziertes Produkt erhält, welches z. B. durch elektrophoretische Auflösung der getrennten Reaktionsbestandteile in einem Agarosegel, gefolgt von Färbung der aufgetrennten DNA in dem Gel mit Ethidiumbromid, sichtbar gemacht werden kann.
Der Vorteil, RecA+- und recA-803-Proteine in DNA-Amplifizierungs- und DNA-Synthesereaktionen zu verwenden, ist, daß diese Proteine eine effiziente Hybridisierung des einzelsträngigen DNA-Primers an Ziel-DNA-Sequenzen erheblich erleichtern. Weiterhin bereiten diese Proteine den Komplex aus DNA-Primer und nativem Ziel topologisch für die Verlängerung vor. Aufgrund dieser topologischen Wirkung von RecA-Protein können zelluläre DNA- Polymerasen, wie Klenow-Fragment von DNA-Polymerase I aus E. coli, den Primer verlängern, wenn der Matrizenstrang entwunden ist. Diese Reaktion ist einfacher als Amplifizierungsreaktionen, die ein Erhitzen erfordern, um Einzelstrangmatrizen zu liefern, und ein Abkühlen, um Hybridisierung der Primer zu ermöglichen.
Dementsprechend ist eine Hauptanwendung dieser durch RecA verstärkten DNA- Synthesen, normale, durch Licht beschädigte oder chemisch beschädigte DNA-Sequenzen zu amplifizieren, wobei die RecA-Katalyse verwendet wird, um Primer an deren homologen Zielen für die nachfolgende Verlängerung durch DNA-Polymerasen richtig zu positionieren. Ein weiterer Vorteil der Verwendung der durch RecA-Protein katalysierten DNA-Synthese ist, daß nicht viele Kreisläufe mit thermischer Denaturierung und Renaturierung bei hoher Temperatur erforderlich sind (Saiki et al.).
Eine zweite wichtige Anwendung ist, wie oben beschrieben, die Fähigkeit von RecA- Protein, DNA topologisch für die DNA-Synthese vorzubereiten, insbesondere DNA mit Konformationen oder Sekundärstrukturen, die durch herkömmliche Verfahren, wie Hitzedenaturierung, schwer zu synthetisieren oder amplifizieren sind.
Eine dritte Anwendung dieser durch RecA-Protein katalysierten Reaktionen nutzt die Fähigkeit der RecA-Protein-DNA-Primer-Komplexe aus, effizient komplementäre Sequenzen aufzufinden. Die Protein-Primer-Komplexe können z. B. als Sonden in diagnostischen Tests verwendet werden, die auf der Identifizierung von Sequenzen in einer Probe, basierend auf deren Komplementarität zu dem Primer, beruhen. Der gebundene Komplex kann anschließend durch eine Vielzahl von Verfahren, wie durch Antikörper, die gegen das recA-803-Protein gerichtet sind, stabilisiert und identifiziert werden.

IV. Andere geeignete Proteine mit den Aktivitäten des RecA-Proteins

In der vorliegenden Erfindung gehört das RecA-Protein zu einer Familie von RecA ähnlichen Proteinen, die alle im wesentlichen die gleichen Funktionen aufweisen, insbesondere: (i) die Fähigkeit des Proteins, Primer an deren homologen Zielen für nachfolgende Verlängerung durch DNA-Plymerasen richtig zu positionieren; (ii) die Fähigkeit von RecA-Protein, DNA topologisch für die DNA-Synthese vorzubereiten und (iii) die Fähigkeit von RecA-Protein-DNA- Primer-Komplexen, komplementäre Sequenzen effizient aufzufinden und zu binden. Das am besten charakterisierte RecA-Protein stammt aus E. coli. Zusätzlich zu dem Wildtyp-Protein wurde eine Reihe mutanter RecA-Proteine identifiziert (z. B. recA-803). Weiterhin besitzen viele Organismen derartige RecA ähnliche Proteine (siehe unten).
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, sollen diese aber in keiner Weise darauf beschränken.

Material und Methoden

DNAs und Enzyme

Synthetische Polymere, die Poly-[d(C-G)] und Poly-[d(Br&sup5;C-G)] umfassen, wurden enzymatisch mit DNA-Polymerase von Poly-[d(I-C)]-Matrizen (Pharmacia) synthetisiert und, wie zuvor beschrieben, charakterisiert (Zarling et al., 1984a, 1984b; Zarling et al. 1990). Poly-[d(C-A)d(G-T)] wurde von Pharmacia-P.L. erhalten. Polynukeotide wurden bis zu einer Durchschnittsgröße von 550 Basenpaare (bp) sonifiziert, um Oligonukleotide zu erzeugen, was durch Agarosegelelektrophorese bestimmt wurde. Endmarkierung von Polynukeotiden wurde, wie von Silberklang et al. beschrieben, durchgeführt. Restriktionsendonukleasen wurden von einer Vielzahl handelsüblicher Quellen erhalten (z. B. New England Biolabs und Boehringer Mannheim).
Gereinigtes Wildtyp-RecA+-Protein und Restriktionsendonukleasen wurden von Pharmacia gekauft. RecA+-Protein wurde bei -70 ºC in 20 mM Tris-HCl (pH = 7,5), 0,1 mM EDTA, 0,1 mM Dithiothreitol (DTT) in einer Endkonzentration von 50 % (v/v) Glycerin gelagert. M13mp18-DNA und ATP-γ-S wurden von Boehringer Mannheim erhalten.

Agarosegelelektrophorese von Protein-DNA-Komplexen

Reaktionen wurden durch Zugabe von TBE-Puffer (90 mM Tris-HCl, 90 mM Borsäure, 2,8 mM EDTA, pH = 8), der 0,25 % Bromphenolblau und 0,25 % Xylencyanol enthielt, alles in 50 % Glycerin (v/v), beendet.
Sämtliche Proben wurden in 0,7 %-igen Agarosegelen, die wie üblich in einfach konzentriertem Tris-Borat-EDTA-Puffer gefahren wurden, analysiert (Maniatis et al.). Wenn die Proben Protein-DNA-Komplexe waren, wurden die Gele bei 4 ºC für etwa 2 bis 3 Stunden bei 90 Volt der Elektrophorese unterzogen. DNA-Banden wurden sichtbar gemacht, indem das Gel in 4 µg/ml Ethidiumbromid gefärbt, in destilliertem Wasser entfärbt und anschließend unter Verwendung einer ultravioletten Lichtquelle fotografiert wurde.

Quelle der DNA-Primer

Primer wurden entweder gekauft (z. B. wurden die Primer in Tabelle 1 von Cetus Perkin-Elmer erhalten) oder unter Einsatz handelsüblich erhältlicher, automatisierter Oligonukleotidsynthetisierer hergestellt. Alternativ können maßgestaltete synthetische Primer gekauft werden, z. B. von Synthetic Genetics (San Diego, CA).

Beispiel 1

Vergleich der Bindung von recA-803- und RecA+-Wildtyp-Proteinen Wirksamkeiten gegenüber DNA-Substraten

Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse von DNA-Bindungsreaktionen, wobei die Aktivitäten von RecA+- und recA-803-Proteinen verglichen werden.
Die Reaktionen wurden in einem Volumen von 0,01 ml zusammengegeben mit: 10 mM Tris-Acetatpuffer (pH = 7,5 bei 37 ºC), 2 mM Magnesiumacetat, 1 mM Dithiothreitol, 50 mM Natriumacetat, 5 % Glycerin (zugegeben als 10-fach konzentrierter Puffer), 1,6 mM ATP- γ-S, 0,05 µg phiX-174 als zirkuläre Virionen-DNA und entweder 34,3 µM (Figur 1, Spuren 2, 5 und 6) oder 17,1 µM (Figur 1, Spuren 3, 4, 7 und 8) RecA+- oder recA-803-Protein. Die Reaktionsgemische wurden für 10 Minuten bei 37 ºC äquilibriert. Die Konzentration von Magnesium wurde anschließend durch Zugabe von 0,2 M Magnesiumacetat auf eine Endkonzentration von 12 mM erhöht. 0,4 µg mit XhoI verdaute, lineare, doppelsträngige DNA (Form II-DNA) von phiX-174 und ein geeignetes Volumen 10-fach Puffer wurden anschließend dem Gemisch zugesetzt, was zu einem Endreaktionsvolumen von 20 µl führte. Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 ºC wurden alle Reaktionen in zwei gleiche Aliquots aufgeteilt, von denen eines mit Proteinase K (10 µg/ml) für 15 Minuten bei 37 ºC behandelt wurde (Spuren 2, 4, 6 und 8). Die unbehandelten Proben, entsprechend der Spuren 1 und 2 aus Figur 1, sind nicht gezeigt.
Ein Vergleich der Spuren 3 und 7 (Figur 1) zeigt klar, daß bei gleichen Proteinkonzentrationen RecA+-Protein weniger doppelsträngige Ziel-DNA bindet al.s recA-803-Protein.

Beispiel 2

Vergleich der ATPase-Aktivitäten von RecA+ und recA-803 und deren Fähigkeit Strangtransferreaktionen zu katalysieren

Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse von ATPase- und Strangtransferreaktionen, wobei die Aktivitäten von RecA+- und recA-803-Protein verglichen werden.

A. ATPase-Aktivitätsreaktionen

Es wurden die ATPase-Aktivitäten gleicher Konzentrationen von RecA+ und recA-803 verglichen. Die Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 18 µl-Puffer mit 35 mM Tris- HCl (pH = 7,5), 6,7 mM MgCl&sub2;, 2 mM Dithiothreitol, 100 µg/ml Rinderserumalbumin (BSA), 1,4 mM ATP, 0,002 µM [γ-³²P]-ATP durchgeführt. Zu diesen Reaktionsgemischen wurde RecA- oder recA-803-Protein in Gegenwart von oder ohne 50 µM einzelsträngiger phiX-174- Phagen-DNA zugegeben.
Die Reaktionen wurden bei 37 ºC für 30 Minuten in 0,6 ml Mikrozentrifugenröhrchen inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Abkühlen auf 0 ºC beendet, gefolgt von der Zugabe von 12 µl 25 mM EDTA, welches 3 mM unmarkiertes ATP, ADP bzw. AMP als Träger enthielt. Ein Aliquot von 10 µl jeder Reaktion wurde anschließend auf kunststoffbeschichtete TLC-Bögen aus PEI-Zellulose F (Pharmacia) getropft und die TLC-Bögen in einer Lösung mit 0,5 M LiCl und 0,25 M Ameisensäure entwickelt. Radioaktive Produkte wurden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Bereiche, die dem freigesetzten anorganischen Phosphat entsprachen, wurden von den TLC-Bögen abgeschabt und in einem Szintillationszähler gemessen. Der Prozentwert der Hydrolyse wurde berechnet, indem der cpm-Wert des Produkts durch den gesamten cpm-Wert der 10 µl-Probe geteilt wurde.
Figur 2A zeigt die Ergebnisse der obigen Reaktionen. Weder recA-803 (offene Rauten) noch RecA+ (ausgefüllte Quadrate) besitzen bei Abwesenheit von DNA signifikante ATPase Aktivitäten. Jedoch besitzt recA-803 (ausgefüllte Rauten) in Gegenwart von DNA höhere ATPase-Aktivität, wenn man es mit RecA+-Protein (offene Quadrate) vergleicht.

B. Strangtransferreaktionen

Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 1 in einem Volumen von 0,01 ml zusammengegeben mit den folgenden Ausnahmen: anstelle von 0,05 µg wurden 0,3 µg einzelsträngige, zirkuläre Virionen-DNA von phiX-174 verwendet, und in sämtlichen Reaktionen wurden 34,3 µM RecA+- oder recA-803-Protein verwendet.
Nach 30 Minuten Inkubation bei 37 ºC wurden die Reaktionen in Hälften unterteilt, und zu einer Hälfte von jeder Probe wurde SDS in einer Endkonzentration von 0,5 % zugegeben. Zu allen Proben wurde Gelladefarbstoff (50 % Glycerin, 50 % TEB, 0,25 % Bromphenolblau, 0,25 % Xylencyanol, Maniatis et al.) zugegeben. Die Proben wurden für 3 Stunden bei 7,6 V/cm in einem 0,7%-igen Standardagarosegel, hergestellt wie oben beschrieben, der Elektrophorese unterzogen. DNA-Banden wurden durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht.
Die Reaktionen in den Spuren 3, 4, 5 und 6 (Figur 2B) enthielten RecA+-Protein, wogegen Spuren 7 und 8 (Figur 2B) recA-803-Protein enthielten. Spuren 1 und 2 enthielten kein RecA+-Protein. Spuren 3, 6 und 8 waren Proben, die mit SDS behandelt worden waren. Die beiden hellen Banden in Spur 1 entsprechen den Substraten der Reaktion. Vollständiger Strangtransfer führt zu der Bildung von doppelsträngiger, eingeschnittener, zirkulärer DNA (Form II). Strangtransferprodukte sind in Figur 2B durch den Pfeil angezeigt.

Beispiel 3

Verstärkte Bindung von RecA+-Protein an Oligo-[d(Br&sup5;C-G)] und an mit N-Acetoxy-N- 2-acetylaminofluoren modifizierte DNA

Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse von Bindungstests mit RecA+-Protein und doppelsträngiger DNA, die die erhöhte Fähigkeit des RecA+-Proteins zeigen, an durch Licht beschädigte DNA, chemisch beschädigte DNA oder DNA in der Z-Konformation zu binden.

A. Herstellung von DNA-Addukt

N-Acetoxy-N-2-acetylaminofluoren (erhalten von Dr. Frederick Beland, National Center for Toxicological Research, Jefferson, Arizona) wurde bei -20 ºC gelagert. Anlagerungsreaktionen wurden in einem Gesamtreaktionsvolumen von 50 µl durchgeführt und enthielten die folgenden Reagenzien: 2,5 µg DNA (entweder Oligo-[d(Br&sup5;C-G)] oder Oligo-[d(C-G)], 0 bis 200 mM N-Acetoxy-N-2-acetylaminofluoren (N-AcO-AAF), 50 mM NaCl und 5 mM Tris-HCl, pH = 7,5. Die Reaktionen wurden für 10 Minuten bei 25 ºC in der Dunkelheit durchgeführt. Ungebundenes N-AcO-AAF wurde durch Extraktion mit 20 Volumen eiskaltem, wasserfreiem Diethylether entfernt. Das DNA-Addukt wurde anschließend mit Ethanol präzipitiert und ausgiebig gegen 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH = 7,5 dialysiert. Das Ausmaß der Modifikation jeder Reaktion wurde aus dem Verhältnis von A&sub3;&sub0;&sub5;/A&sub2;&sub6;&sub0; bestimmt, wie es von Fuchs et al. (1972) beschrieben wurde, wobei ein Extinktionskoeffizient von &epsi; = 18.000 für N-AcO- AAF verwendet wurde. In den folgenden Reaktionen wurde DNA mit 5 - 20 % Anlagerung von N-AcO-AAF verwendet.

B. RecA+-Proteinbindungstests

Die in den Bindungstests verwendeten DNA-Substrate wurden unter Verwendung von Adenosin-[γ-P³²]-triphosphat (New England Nuclear) nach dem Verfahren von Silberklang et al. endmarkiert. Die Bindungsreaktionen hatten ein Gesamtvolumen von 50 µl und enthielten folgendes: 0,57 µM Oligo-[d(Br&sup5;C-G)] oder Oligo-[d(C-G)], 0,33 µM RecA+-Protein, TEA- Puffer (25 mM Triethanolamin, pH = 7,5, 1,0 mM Dithiothreitol und 5,0 mM MgCl&sub2;) und 20 µM ATP-γ-S. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe des RecA+-Proteins bei 37 ºC gestartet und für den in Figur 3 spezifizierten Zeitraum inkubiert.
Sämtliche Reaktionen wurden durch Filtration durch Nitrozellulosemembranfilter (Millipore, Millititer -STHA09610), die mit zweifach destilliertem Wasser vorbefeuchtet und vor der Probenfiltration mit TEA-Puffer vorbehandelt worden waren, beendet. Die Filter wurden sechs mal mit TEA-Puffer gewaschen, unter einer Wärmelampe getrocknet und in Aquasol-2 (Dupont, New England Nuclear) eingetaucht. Die auf jedem Filter zurückgehaltene Radioaktivität wurde unter Verwendung eines Flüssigkeitsszintillationszählers (Hewlett Packard Modell 2000CA) gemessen. Unter diesen Bedingungen war die Effizienz für die Zurückhaltung von an Protein gebundener DNA durch die Nitrozellulose etwa 50 %.
Figur 3 zeigt die Ergebnisse der DNA-Bindungstests. Die Symbole in Figur 3 stehen für die folgenden DNA-Substrate: offene Quadrate, Oligo-[d(Br&sup5;C-G)]; ausgefüllte Quadrate, Oligo- [d(Br&sup5;C-G)]-N-AcO-AAF-Addukte; offene Dreiecke, Oligo-[d(C-G)]; ausgefüllte Dreiecke, Oligo- [d(C-G)]-N-AcO-AAF-Addukte.
Figur 3 zeigt die erhöhte Bindung von RecA+-Protein an chemisch modifizierter DNA (N-AcO-AAF-Addukte) im Verhältnis zu unmodifizierter DNA. Weiter stellt die Figur die verstärkte Bindung von RecA+-Protein an Oligo-[d(Br&sup5;C-G)] mit einer Z-DNA-Konformation im Verhältnis zu Oligo-[d(C-G)] mit einer B-DNA-Konformation dar.

Beispiel 4

Bevorzugte Bindung von RecA+-Protein an doppelsträngiges Oligo-[d(C-A)d(G-T)] im Verhältnis zu entweder Oligo-(d(C-G)] oder Oligo-[d(Br&sup5;C-G)]

Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse von DNA-Bindungstests, die die bevorzugte Bindung von RecA+-Protein an verschiedene doppelsträngige DNAs mit wechselnden Sequenzen von Purinen und Pyrimidinen [z. B. (PuPyPuPyPuPyPuPy)n] zeigen.

A. Konstante RecA+-Protein/DNA-Konzentration (Figur 4A)

Die DNA-Bindungsreaktionen hatten ein Gesamtvolumen von 50 µl und enthielten die folgenden Bestandteile: 0,35 µM RecA+-Protein, 0,7 µM DNA-Substrat (-Moleküle), TEA- Puffer (siehe oben) und 20 µM ATP-γ-S. Die Reaktionen wurden bei 20 ºC durchgeführt und durch Filtration des Protein-DNA-Komplexes durch Nitrozellulosefilter (beschrieben in Beispiel 3) zu den in Figur 4A dargestellten Zeitpunkten beendet.

B. Konstante DNA-Konzentration mit ansteigender RecA+-Protein-Konzentration

Die DNA-Bindungsreaktionen hatten ein Gesamtvolumen von 50 µl und enthielten die folgenden Bestandteile: 0 bis 5,0 µM RecA+-Protein, 1,0 µM DNA-Substrat (-Moleküle), TEA- Puffer (siehe oben) und 20 µM ATP-γ-S. Die Reaktionen wurden bei 20 ºC für 20 Minuten durchgeführt und durch Filtration des Protein-DNA-Komplexes durch Nitrozellulosefilter (beschrieben in Beispiel 3) beendet.
Die in den obigen Reaktionen verwendeten DNA-Substrate waren in den Figuren 4A und 4B folgende: offene Quadrate, Oligo-[d(C-G)]; ausgefüllte Quadrate, Oligo-(d(Br&sup5;C-G)] und offene Dreiecke, Oligo-[d(C-A)d(G-T)].
Figuren 4A und 4B zeigen deutlich die bevorzugte Bindung von RecA+-Protein an die folgenden Sequenzen abwechselnder Purine und Pyrimidine in absteigender Reihenfolge der Präferenz: doppelsträngiges Oligo-[d(C-A)d(G-T)] mit der rechtsgängigen B-Konformation, Oligo-(d(Br&sup5;C-G)] mit der linksgängigen Z-Konformation und Oligo-(d(C-G)] mit der rechtsgängigen B-Konformation.

Beispiel 5

Verstärkung der DNA-Synthese durch RecA+-Protein an einzelsträngigen, zirkulären DNA-Matrizen

Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse, die einen verstärkenden Effekt des RecA+- Proteins bei der Synthese großer DNA von einer einzelsträngigen Matrize zeigen.
Der 24-mere Primer [d(AGCGGATAACAATTTCACACAGGA)] wurde unter Verwendung von ATP-γ-S mit RecA+-Protein beschichtet. Der beschichtete Primer wurde zu einzelsträngiger M13mp18-DNA in einem Reaktionsgemisch mit rATP, dem rATP regenerierenden System PEP/PK (Boehringer Mannheim), dNTPs und [³H]dGTP (New England Nuclear), Einzelstrangbindeprotein (SSB) aus E. coli (U.S. Biochemical Corporation) zugegeben. Das gesamte Reaktionsvolumen betrug 26,25 µl. Diese Bedingungen wurden durch die Gegenwart oder das Fehlen von RecA+-Protein und SSB-Protein variiert (siehe Figur 5). Nach 4 Minuten bei 37 ºC wurden 0,5 Einheiten des großen Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I (New England Biolabs) zugegeben.
Die Reaktionen wurden bei 37 ºC inkubiert, und für 15 Minuten wurden in 5minütigen Intervallen Proben genommen. Die Reaktionsproben wurden durch Präzipitation der ³H- markierten DNA mit kalter, 5 %iger Trichloressigsäure und Filtration durch Glasfilter (Schleicher und Schuell, Inc.) gesammelt. Die Menge des Einbaus an [³H]dGTP, die in neusynthetisierte, hochmolekulare DNA eingebaut worden war, wurde unter Verwendung eines Packard P2000-Flüssigkeitsszintillationszählers durch Messen der Glasfilter in einer Szintillationsmischung auf Toluolbasis bestimmt.
Die Ergebnisse der Reaktionen sind in Figur 5 dargestellt. Die Reaktionsbestandteile waren folgende: offene Kreise, DNA-Polymerase I; ausgefüllte Kreise, DNA-Polymerase I und SSB-Protein; offene Quadrate, DNA-Polymerase I und RecA+-Protein; und ausgefüllte Quadrate, DNA-Polymerase I, RecA+-Protein und SSB-Protein.
Die in Figur 5 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Zugabe von RecA+-Protein bei Abwesenheit von SSB-Protein die Synthese großer DNA verbessert. Weiterhin scheint es einen synergistischen Effekt von SSB-Protein und RecA+-Protein auf die DNA-Synthese von einer einzelsträngigen, zirkulären Matrix zu geben.

Beispiel 6

Durch recA-803-Protein verstärkte DNA-Synthese von linearen, doppelsträngigen Matrizen

Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse, die die Verstärkung der Synthese großer DNA durch recA-803-Protein zeigen.
Die doppelsträngige, lineare Matrize für diese Reaktionen war das Plasmid pJC801- 886, welches die kodierenden Sequenzen für das RecA-Gen aus E. coli enthält, geschnitten mit der Endonuklease Sal I, was ein 8 Kilobasen langes (kb), lineares Fragment liefert.
Es wurden die folgenden, für das RecA-Gen spezifischen Primer verwendet: Primer A [d(ATGCGACCCTTGTGTATC)] und Primer B [d(GTGGTGGGTAGCAAACC)]. Die Primer wurden mit RecA+-Protein (3,0 µM) in 30 mM Tris-Acetat, 60 mM Natriumacetat, 10 mM Mg-Acetat, wobei weiter das PEP/PK (Boehringer Mannheim) rATP-regenerierende System enthalten war, für 5 Minuten bei 37 ºC beschichtet.
Die DNA-Synthesereaktionen wurden in einem Gesamtreaktionsvolumen von 32 µl durchgeführt. Die Reaktionen enthielten 0,5 µg pJC801-886, 0,6 µM jedes der Primer A und B, 30 mM Tris-Acetat, pH = 8,3, 60 mM Na-Acetat, 10 mM Mg-Acetat, das in Beispiel 5 beschriebene ATP-regenerierende System, dNTPs und [α-³&sup5;S]dATP. Es wurden fünf Einheiten Klenow-DNA-Polymerase I zugegeben. Die Reaktionen wurden bei 37 ºC für 30 Minuten inkubiert und zu den in Figur 6 gezeigten Zeitpunkten Proben genommen. Die Reaktionsproben wurden durch Präzipitation der ³&sup5;S-markierten DNA mit kalter, 5 %iger Trichloressigsäure und Filtration durch Glasfilter (Schleicher und Schuell, Inc.) gesammelt. Die Menge an [³&sup5;S]dATP, die in die neusynthetisierte, hochmolekulare DNA eingebaut worden war, wurde unter Verwendung eines Packard P2000-Flüssigszintillationszählers durch Messen der Glasfilter in einem Szintillationsgemisch auf Toluolbasis bestimmt.
Die in Figur 6 dargestellten Ergebnisse (offene Quadrate, bei Fehlen von recA-803- Protein und ausgefüllte Quadrate, in Gegenwart von recA-803-Protein) zeigen deutlich die Verstärkung der Synthese großer DNA von einer linearen, doppelsträngigen Matrize in Gegenwart von recA-803-Protein.

Beispiel 7

Durch RecA+-Protein verstärkte DNA-Synthese von nativen, linearen Lambda-DNA- Matrizen

Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse, die die Verstärkung der DNA-Synthese von nativen Lambda-DNA-Matrizen unter Verwendung von 25-meren Primern durch RecA+- Protein zeigen.

A. Herstellung von RecA+-Protein-Primer-Komplexen

Für die DNA-Synthesereaktionen wurden die folgenden Primer verwendet: Tabelle 1
Die Primersequenzen (Cetus-Perkin Eimer, Norwalk, CT) wurden aus der viralen Lambda-DNA-Sequenz erhalten. Das virale Lambda-Genom ist etwa 48,5 kb lang. Der von den Primern angestrebte DNA-Abschnitt ist 500 Basenpaare (bp) lang und umfaßt die Primersequenzen, was etwa 1 % des gesamten Lambda-Genoms ausmacht.
RecA-Protein wurde unter den folgenden Bedingungen an die einzelsträngigen DNA- Primer gebunden: 0,66 µM RecA+-Protein wurde mit einer Endkonzentration von 1 µM jedes Primers (insgesamt 2 µM) inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde für 10 Minuten bei 22 ºC inkubiert. RecA+-Protein wurde unter diesen Bedingungen wirksam an die einzelsträngigen Primer gebunden, was durch Gelretardation der Primer-RecA+-Proteinkomplexe nachgewiesen wurde.
Nach der 10 minütigen Inkubation wurde das RecA-Primer-Gemisch zu der Reaktionsmischung (10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl&sub2;, einer Endkonzentration von 750 µM dNTPs und einer Endkonzentration von 10 % DMSO) hinzugegeben. Anschließend wurde der Reaktion ATP-γ-S in einer Endkonzentration von 1 µM und SSB-Protein in einer Endkonzentration von 0,094 mM zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 0,5 µg viraler, genomischer Lambda-DNA (New England Biolabs).

B. DNA-Synthese wird durch die Gegenwart von RecA+-Protein verstärkt.

Das obige Reaktionsgemisch wurde bei 37 ºC für 3 Minuten äquilibriert. Die DNA- Synthesereaktionen wurden durch Zugabe von einer Einheit Klenow-DNA-Polymerase I (Klenow) gestartet. Die Reaktionen wurden bei 37 ºC gehalten. Nach der initiierenden Zugabe von Klenow wurden die Reaktionen in 10 minütigen Intervallen über den 80 minütigen Reaktionszeitraum sieben mal mit einer Einheit Klenow versetzt.
Es wurden die folgenden, spezifischen Reaktionsbedingungen angewandt, um die Wirkung der Zugabe des RecA+-Proteins auf die DNA-Synthesereaktionen zu untersuchen (Figur 7): (a) Spur 1, acht aufeinanderfolgende Zugaben von 0,66 µM RecA+-Protein und 0,094 mM SSB-Protein in 10 minütigen Intervallen; (b) Spur 2, acht aufeinanderfolgende Zugaben von 0,66 µM RecA+-Protein, 0,094 mM SSB-Protein und 1 mM ATP-γ-S in 10 minütigen Intervallen; (c) Spur 3, nur die anfängliche Zugabe des mit den Primern komplexierten RecA+-Proteins, gefolgt von acht aufeinanderfolgenden Zugaben von ATP-γ-S und SSB- Protein und (d) Spur 4, eine Kontrollreaktion, bei der RecA+-Protein, SSB-Protein und ATP-γ-S weggelassen wurden. Spuren 5 und 6 enthalten Lambda-DNA (0,5 µg) bzw. einen Satz von 1 kb-DNA-Molekulargewichtsmarkern (BRL).
Die Reaktionsprodukte wurden durch Elektrophorese in einem 0,7 %igen Agarosegel aufgetrennt und die DNA-Banden durch Färbung mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht. Die Ergebnisse sind in Figur 7 dargestellt.
Figur 7 zeigt, daß die Synthese von Lambda-DNA durch Hinzunahme von RecA+- Protein verstärkt wurde. Die Verstärkung zeigt sich durch eine erhöhte Konzentration an DNA- Produkten in den Spuren, die RecA+-Protein enthalten, was durch verstärkte Ethidiumbromidfärbung belegt wird.

C. Die Verstärkung der DNA-Synthese durch RecA+-Protein ist unabhängig vom Einzelstrangbindeprotein.

Die Reaktionsbedingungen waren die gleichen, wie oben in Abschnitt A beschrieben. Die Reaktionsgemische wurden bei 37 ºC für 3 Minuten äquilibriert DNA-Synthesereaktionen wurden durch Zugabe von 1 Einheit Klenow-DNA-Polymerase I (Klenow) gestartet. Die Reaktionen wurden bei 37 ºC gehalten. Nach der anfänglichen Zugabe von Klenow wurden die Reaktionen über den Reaktionszeitraum von 80 Minuten in 10 minütigen Intervallen mit einer Einheit Klenow versetzt. Jede Reaktion erhielt 8 Einheiten Klenow, wobei die anfängliche Zugabe einer Einheit inbegriffen war.
Die folgenden, spezifischen Reaktionsbedingungen wurden verwendet, um die Wirkung von Einzelstrangbindeprotein (SSB) aus E. coli auf die DNA-Synthese in Gegenwart von RecA+-Protein zu untersuchen. Die erste Reaktion (Spur 1, Figur 8) enthielt kein SSB-Protein. Die zweite Reaktion (Spur 2, Figur 8) enthielt 0,094 µM SSB-Protein, welches der Reaktion nach der Zugabe des RecA+-Protein-Primers zugegeben wurde. Die dritte Reaktion war eine Kontrollreaktion, die weder RecA+-Protein noch SSB-Protein enthielt (Spur 3, Figur 8). Sämtliche Reaktionen enthielten 1 mM ATP-γ-S und wurden bei 37 ºC für 80 Minuten inkubiert.
Am Ende der 80 Minuten wurden 2,5 µl Proteinase K (50 µg/µl) zu den Reaktionen gegeben und das Gemisch für 15 Minuten bei 37 ºC gehalten. Die DNA-Moleküle wurden anschließend durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt.
Die Ergebnisse der obigen Reaktionen sind in Figur 8 gezeigt. Die in jeder Spur aufgetragenen Proben sind oben beschrieben. Spur 4 enthielt eine Standard-1 kb-Molekulargewichtsleiter (BRL). Das Auftauchen von Produkten mit hohem Molekulargewicht in Spuren 1 und 2 zeigt deutlich, daß die DNA-Synthesereaktion nicht von dem Vorhandensein von SSB- Protein abhängt. Spur 3 zeigt jedoch die Abhängigkeit der Reaktion vom Vorhandensein von RecA+-Protein.

Beispiel 8

RecA+-Protein verstärkt die Primer-abhängige DNA-Synthese bei 37 ºC

Dieses Beispiel beschreibt die Ergebnisse, die die Abhängigkeit der DNA-Synthesereaktion von dem Vorhandensein von sowohl RecA+-Protein als auch den Lambda-spezifischen Primern zeigen.
Die Reaktionsbedingungen waren im wesentlichen wie in Beispiel 7A beschrieben mit den folgenden Ausnahmen. Die erste Reaktion enthielt RecA+-Protein, jedoch wurden die Primer weggelassen (Spur 1, Figur 9). Die zweite Reaktion enthielt Primer, aber kein RecA+- Protein (Spur 2, Figur 9). Die dritte Reaktion enthielt sowohl RecA+-Protein als auch die Primer (Spur 3, Figur 9).
Die Reaktionsgemische wurden für 3 Minuten bei 37 ºC äquilibriert. Die DNA-Synthesereaktionen wurden durch Zugabe von 1 Einheit exonukleasefreier DNA-Polymerase I (eine Doppelmutante des großen Klenow-Fragments, das Enzym ist erhältlich bei U.S. Biochemicals) aus E. coli gestartet. Die Reaktionen wurden bei 37 ºC gehalten. Nach der anfänglichen Zugabe von Polymerase wurden die Reaktionen in 10 minütigen Intervallen jeweils mit zusätzlichen Einheiten von Klenow versetzt. Die Reaktionen wurden für insgesamt 72 Stunden bei 37 ºC inkubiert. Die 28 µl-Proben wurden wie oben mit Proteinase K behandelt, bevor sie zur elektrophoretischen Auftrennung aufgetragen wurden.
Wie man in Spur 3, Figur 9, sehen kann, findet DNA-Synthese nur in Gegenwart von RecA+-Protein und den Lambda-spezifischen Primern statt.

Beispiel 9

RecA+ erleichtert die DNA-Amplifizierung bei 37 ºC

Die Ergebnisse in diesem Beispiel zeigen die Verstärkung der DNA-Synthese einer 500 bp langen Lambda-Zielsequenz durch RecA+-Protein.

A. Die Wirkung von SSB-Protein

Die Reaktionsbedingungen waren mit den folgenden Ausnahmen im wesentlichen wie in Beispiel 7A beschrieben. Sämtliche Reaktionen enthielten 0,5 µg einer 500 bp langen Matrize, die den Nukeotiden 7131-7630 des Lambda-Genoms entsprachen, welches aus dem Produkt einer durch DNA-Polymerase I von T. aquaticus katalysierten, thermischen Amplifizierung unter Verwendung einer Lambda-DNA-Matrize (Mullis), welche die native, genomische Lambda-DNA ersetzte, aufgereinigt worden war. Die ersten beiden Reaktionen enthielten kein RecA+-Protein (Spuren 2 und 3, Figur 10). Die dritte Reaktion enthielt eine Endkonzentration an RecA+-Protein von 0,66 µM und kein SSB-Protein (Spur 4, Figur 10). Die vierte Reaktion enthielt eine Endkonzentration an RecA+-Protein von 0,66 µM und eine Endkonzentration an SSB-Protein von 0,094 µM (Spur 5, Figur 10).
Die Reaktionsgemische wurden für 3 Minuten bei 37 ºC äquilibriert. DNA-Synthesereaktionen wurden durch Zugabe von 1 Einheit exonukleasefreier DNA-Polymerase I (U. S. Biochemicals) aus E. coli gestartet. Die Reaktionen wurden bei 37 ºC gehalten. Nach der anfänglichen Zugabe von Polymerase wurden die Reaktionen für weitere 70 Minuten alle 10 Minuten mit einer Einheit Klenow versetzt. Der Zeitraum der Reaktion betrug 17,5 Stunden. Die Proben wurden wie oben mit Proteinase K behandelt, bevor sie zur elektrophoretischen Auftrennung aufgetragen wurden.
Wie man in Figur 10 sehen kann, erfolgt bei Abwesenheit von RecA+-Protein keine DNA-Synthese (Spuren 2 und 3). Die 500 bp lange Matrize wurde als Standard in Spur 1 aufgetragen. Die in Gegenwart von RecA+-Protein (Spur 4) durchgeführte Synthese weist eine Produktbande von vergleichbarer Größe wie die 500 bp lange Matrize auf. Jedoch scheint die in Gegenwart von RecA+-Protein und SSB-Protein durchgeführte Synthese, neusynthetisierte Produkte zu erzeugen, die kleiner als die 500 bp lange Matrize sind (Spur 5).

B. Die Wirkung jedes der Bestandteile des Reaktionsgemisches auf die DNA-Synthese

Die Reaktionsbedingungen waren wie oben in diesem Beispiel beschrieben. Die folgende Tabelle faßt die eingesetzten Reaktionsbedingungen zusammen. Tabelle2
Die Konzentrationen dieser Bestandteile in dem Reaktionsgemisch waren folgende: 0,66 µM RecA+-Protein, 0,094 µM SSB-Protein, 1 µM ATP-γ-S, 2 µM 40-mere Primer, 2 µM 25-mere Primer, 0,5 µg 500 bp lange Matrize, 1 Einheit/Zugabe von insgesamt 8 Einheiten exonukleasefreier DNA-Polymerase I. Die Reaktionsnummern entsprechen den Spurnummern, die in Figur 11 dargestellt sind.
Wie man aus den in Figur 11 wiedergegebenen Ergebnissen sehen kann, wird die DNA- Synthese unter den Reaktionsbedingungen am wirkungsvollsten verstärkt, die oben für Reaktion 7 angegeben sind, nämlich in Gegenwart von RecA+-Protein und ATP-γ-S. Reaktion 8 enthielt die gleichen Bestandteile wie Reaktion 7 mit der Ausnahme, daß auch SSB-Protein enthalten war. Ein Vergleich der Spuren 8 und 7 zeigt, daß die Gegenwart von SSB-Protein die Wirkung von RecA+-Protein und ATP-γ-S auf die DNA-Synthese von einer doppelsträngigen Matrize nicht verstärkt.

C. RecA+ verstärkt die spezifische Amplifizierung in Reaktionen bei einer einzigen Temperatur.

Sämtliche Reaktionen enthielten 0,5 µg einer 500 bp langen Matrize, die den Nukleotiden 7131-7630 des Lambda-Genoms entsprach, welches aus dem Produkt einer durch DNA- Polymerase I aus T. aquaticus katalysierten, thermischen Amplifizierung unter Verwendung einer Lambda-DNA-Matrize (Mullis), welche die native, genomische Lambda-DNA ersetzte, aufgereinigt worden war. Die Reaktionsbedingungen waren im wesentlichen wie in Beispiel 7A beschrieben mit den folgenden Ausnahmen: Reaktion 1 enthielt ATP-γ-S, und es fehlten RecA+- und SSB-Protein (Spur 1, Figur 12); Reaktion 2 enthielt ATP-γ-S und SSB-Protein, und es fehlte RecA+-Protein (Spur 2, Figur 12); Reaktion 3 enthielt ATP-γ-S und RecA +- jedoch kein SSB-Protein (Spur 3, Figur 12); und Reaktion 4 enthielt sämtliche der Reaktionsbestandteile (Spur 4, Figur 12).
DNA-Synthesereaktionen bei einer einzigen Temperatur wurden im wesentlichen, wie oben in Beispiel 7A beschrieben, durchgeführt. Nach 72 Stunden Inkubation bei 37 ºC wurden 16 µl große Anteile von jeder Reaktion mit Proteinase K (100 µg pro Anteil) für 15 Minuten bei 37 ºC behandelt und anschließend auf ein 0,7 %iges Agarosegel aufgetragen. Nach elektrophoretischer Auftrennung wurden die DNA-Fragmente nach Standardprotokollen (Maniatis et al.) auf Hybridisierungstransfermembranen (Hybond-N , Amersham) überführt. Die DNA wurde durch UV-Strahlung mit der Membran verknüpft (Stratalinker , Stratagene). Die mit UV-Strahlung behandelte Transfermembran wurde mit ³²P-endmarkierter Sonde PCR03A hybridisiert. PCR03A (Nukeotide 7351 bis 7390 des nativen Lambda-Genoms) ist ein 40-mer, das einer internen DNA-Sequenz der 500 bp langen Lambda-Matrize, welche in der obigen Amplifizierungsreaktion verwendet wurde, entspricht. Die Membran wurde anschließend autoradiographiert.
Die Hybridisierung von spezifischer, radioaktiv markierter Sonde mit Produkten einer bei einer einzigen Temperatur durchgeführten, durch Klenow und RecA+ katalysierten Amplifizierungsreaktoin zeigt, daß RecA+ die tatsächliche Produktsynthese verstärkte. Das Autoradiogramm (Figur 12) zeigt deutlich, daß eine signifikante Amplifizierung des 500 bp langen Produktes nur bei der Reaktion stattgefunden hat, die RecA+ und ATP-γ-S enthielt und bei der SSB-Protein fehlte (Spur 3).

Claims

1. Verfahren zum Erzielen einer Amplifizierung einer doppelsträngigen DNA-Zielsequenz mit ersten und zweiten komplementären Strängen, jeder Strang mit 5'- und 3'-Enden, durch:

a) Komplexierung eines Primers, der zu einem Bereich am 5'-Ende des ersten Strangs komplementär ist, und eines Primers, der zu einem Bereich am 5'-Ende des zweiten Strangs komplementär ist, mit RecA-Protein in Gegenwart von ATP-γ-S;

b) Reaktion der komplexierten Primer in einem Reaktionsgemisch, das auch die Zielsequenz, alle vier dNTPs, RecA-Protein und DNA-Polymerase enthält, wobei die Reaktion unterhalb der Temperatur durchgeführt wird, die zur thermischen Dissoziation der zwei Zielstränge erforderlich ist, und fortgeführt wird, bis ein gewünschter Amplifizierungsgrad der Zielsequenz erreicht ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die doppelsträngige Ziel-DNA Bereiche mit inhibierender Sekundärstruktur hat.

3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die doppelsträngige Ziel-DNA hergestellt wird, indem man ein einzelsträngiges DNA-Molekül nimmt und es in ein doppelsträngiges DNA-Molekül durch:

a) Komplexierung eines Primers, der zu einem Bereich am 5'-Ende des Einzelstrangs komplementär ist, mit RecA-Protein in Gegenwart von ATP-γ-S;

b) Reaktion der komplexierten Primer in einem Reaktionsgemisch, das auch die einzelsträngige Zielsequenz, alle vier dNTPs und Polymerase enthält, wobei ein komplementärer Strang zu der einzelsträngigen Zielsequenz erzeugt wird, überführt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die einzelsträngige DNA Bereiche mit inhibitorischer Sekundärstruktur aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem das einzelsträngige DNA-Molekül ein cDNA- Molekül ist.

6. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Reaktion weitere Zugabe von Polymerase umfaßt.

7. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Reaktion weitere Zugabe von RecA-Protein umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die Reaktion weitere Zugabe von ATP-γ-S oder einer Mischung von dATP und ATP-γ-S umfaßt.

9. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die beiden Primer zu der gleichen DNA-Sequenz komplementär sind.

10. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Primer endständige 5'-Sequenzen umfassen, die zu der DNA-Zielsequenz nicht komplementär sind.

11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem die nicht-komplementären Sequenzen Sequenzen umfassen, die Erkennungsstellen für Restriktionsendonukleasen codieren.

12. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die doppelsträngige Ziel-DNA physikalisch oder chemisch beschädigt wurde.

13. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem das RecA-Protein das Proteinprodukt des recA- 803-Gens ist.

14. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Polymerase das große Klenow-Fragment von E. coli DNA-Polymerase I ist und die Reaktion bei 37 ºC durchgeführt wird.