DE69125161T2

DE69125161T2 - Synthetische peptide und mischungen davon zum nachweis der gegen hiv-gerichteten antikörper

Info

Publication number: DE69125161T2
Application number: DE69125161T
Authority: DE
Inventors: Martial Brossard J4X 2R9 Pq Lacroix
Original assignee: Adaltis Inc; Biochem Immunosystems US Inc
Current assignee: Adaltis Inc
Priority date: 1990-07-09
Filing date: 1991-07-08
Publication date: 1997-06-19
Anticipated expiration: 2011-07-09
Also published as: AU8189591A; WO1992000997A1; DE69125161T3; ZA915286B; MX9100115A; CA2086922A1; NZ238856A; JPH05508837A; DE69125161D1; EP0538283A1; ES2098359T3; PT98249B; CA2086922C; IE912377A1; AU664828B2; JP3533214B2; CS209691A3; IL98769A0; US5241047A; ES2098359T5

Description

Bei dieser Anmeldung handelt es sich um eine Teilfortführung der US-Anmeldungen 07/148,821 (eingereicht am 27. Januar 1988), 07/185,518 (eingereicht am 22. April 1988) und 07/281,205 (eingereicht am 8. Dezember 1988).

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft neuartige cyclische Peptide und Kombinationen davon sowohl allein als auch mit linearen und cyclischen Peptiden zum Nachweis von HIV-Antikörpern.

Hintergrund der Erfindung

Man nimmt an, daß das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS), der AIDS verwandte Komplex (ARC) und Vorstufen von AIDS durch ein Retrovirus, und zwar HIV (Human Immunodeficiency Virus) verursacht werden. Das erste mit AIDS im Zusammenhang stehende Virus, HIV-1 (auch als HTLV-III, LAV-1 und ARV bekannt) ist bereits umfassend charakterisiert worden. Ein weiteres pathogenes menschliches Retrovirus namens HIV-2 (früher LAV-2) ist jetzt bei westafrikanischen AIDS-Patienten isoliert worden (siehe z.B. WO 87/04459). In jüngerer Zeit wurde nachgewiesen (Guyader et al., Nature 326, 662-669, 1987), daß HIV-2 verschiedene konservierte Sequenzen mit HIV-1 und den Immunschwächeviren von Affen (SIV) gemeinsam hat.
Obwohl in der Technik auch andere Zähisysteme verwendet werden, haben wir uns wegen der besseren Verständlichkeit und eines erleichterten Vergleichs für das Aminosäurezählsystem von Ratner et al., Nature 313, 277 - 284, 1985, für die HIV-1-Proteine und das von Guyader et al., Nature 326, 662 - 669, 1987, für die HIV-2-Proteine entschieden. Die Aminosäuren in den erfindungsgemäßen Peptiden werden durch den Einbuchstabencode wie folgt bezeichnet: ala = A, arg = R, asn = N, asp = D, cys = C, gln = Q, glu = E, gly = G, his = H, ile = I, leu = L, lys = K, met = M, phe = F, pro = P, ser = 5, thr = T, trp = W, tyr = Y und val = V.
Bei den ersten immundiagnostischen Tests zum Nachweis von Antikörpern im Serum von mit HIV-1 infizierten Patienten verwendete man das ganze Virus als Antigen. Bei den Tests der zweiten Generation bediente man sich der durch die rekombinante DNA-Methodik erhaltenen Polypeptidsequenzen. Cabradilla et al., Bio/Technology 4 128 - 133 (1985) und Chang et al., Bio/Technology 3, 905 - 909 (1985) beschreiben bakteriell synthetisierte virale Proteinfragmente von Bausteinen der 82- bzw. 102-Aminosäure. EPA 0 202 314 und 0 114 243 betreffen die Regionen gp41 und gp120 überspannende rekombinante Polypeptide, die allein oder in Mischung immunreaktiv sind. Shoeman et al., Anal. Biochem. 161, 370 - 379 (1987) beschreiben verschiedene Polypeptide von gp41, die mit Antikörpern reaktiv sind, welche sich im Serum von mit HIV-1 infizierten Patienten befinden. Jedoch ist keines der vorstehenden Testverfahren ganz zufriedenstellend. Ihre fehlende Sensibilität ist ein besonders kritischer Nachteil. Möglicherweise kann das Virus enthaltendes Blut unentdeckt bleiben und dadurch die Infektion von Empfängern von Blutprodukten verursachen. Außerdem bleiben AIDS-Träger, deren Infektion nicht diagnostiziert wurde, weiterhin infektiös. Auch der Mangel an Spezifität (falsch positive Ergebnisse) ist ein Problem - Gesunden wird mitgeteilt, sie hätten möglicherweise AIDS. Solche falsch positiven Ergebnisse können durch Verunreinigungen verursacht sein. Eine weitere Ursache können gemeinsame Epitope mit in diesen Antigenzubereitungen vorhandenen Viren sein, die nicht mit AIDS in Zusammenhang stehen. In diesem Punkt hat Gallaher, Cell 50 327 - 328, 1987, berichtet, daß ein gp41-Bereich von HIV-1 eine Sequenz von fünf aneinanderangrenzenden Aminosäurebausteinen mit dem das Synzithium betreffenden respiratorischen Virus und von fünf gleichmäßig verteilten Aminosäuren des F1-Glykoproteins des Masernvirus gemeinsam hat. Somit könnten selbst in hohem Maße gereinigte rekombinante Polypeptide, die diese Region oder irgendwelche anderen noch nicht entdeckten gemeinsamen Bereiche enthalten, für falsch positive Ergebnisse und die damit einhergehende inakzeptable Spezifität verantwortlich sein. Schließlich ist es mit diesen Tests nach dem Stand der Technik nicht möglich, einen sehr geringen Gehalt an HIV-Antikörpern nachzuweisen. Dies ist ein Nachteil der Tests in bezug auf ihre Fähigkeit, AIDS-Infektionen in einem sehr frühen Stadiun nachzuweisen. Dadurch wird nicht nur der Beginn einer Behandlung verzögert, sondern die Infektion kann sich auch durch Proben von Blut oder anderen Körperflüssigkeiten ausbreiten, ehe eine AIDS-Infektion wirksam nachgewiesen wird.
In einem Versuch, diese Probleme zu lösen, werden jetzt diagnostische Mittel und Verfahren entwickelt, bei denen man sich kürzerer HIV-Antigene bedient. Empirische Verfahren zur Identifizierung von Peptidsequenzen, die einzigartigen und hoch konservierten Epitopen der HIV-Viren entsprechen, stehen jetzt ebenfalls zur Verfügung. Diese Verfahren könne beispielsweise bei der Auswahl kurzer Aminosäuresequenzen hilfreich sein, die mit größerer Wahrscheinlichkeit auf der Oberfläche des nativen Proteins freiliegen und deshalb nützliche Testinstrumente sind (siehe Hopp und Woods, J. Immunol. Met. 88, 1 - 18, 1986, für einen Überblick). Obwohl diese Verfahren durchaus nützlich sind, sind sie nicht mehr als indikativ. Trotzdem wurden sie dazu verwendet, auf der Oberfläche der für AIDS verantwortlichen Viren vorhandene Epitope zu identifizieren. Beispielsweise betreffen US-A-4,629,783, die PTC Anmeldung US86/00831 und EPA 0 303 224 verschiedene synthetische Peptide aus den Proteinen p18, p25, gp41 und gp120. Diese Peptide haben den Vorteil, daß sie sich relativ einfach und preiswert herstellen lassen. Wichtiger jedoch ist, daß das Risiko, aufgrund von Verunreinigungen oder der Anwesenheit gemeinsamer Epitope mit den nicht mit AIDS im Zusammenhang stehenden viralen Proteinen falsch positive Ergebnisse zu erhalten, geringer ist.
Diese kleineren Peptide haben zwar in bezug auf Spezifität im Vergleich mit früheren rekombinanten Polypeptiden oder Ansätzen unter Einsatz ganzer Viren für die Diagnose von AIDS-Infektionen Vorteile, sind jedoch in bezug auf die Gesamtsensibilität nicht ganz zufriedenstellend, vielleicht weil das synthetisierte Epitop keine Konformation annehmen und aufrechterhalten kann, die von den AIDS-Antikörpern erkannt wird. Obwohl die Anzahl von in jedem dieser Fälle getesteten Serumproben sehr gering ist, erwies sich die Spezifität (kaum oder gar keine falsch positiven Ergebnisse) bei den kleinen synthetischen Peptiden als sehr hoch (95 bis 100 %) aber die Sensibilität insgesamt schwankte zwischen 80 und 100 %. Tatsächlich wurden im einzigen Beispiel, bei dem man eine Sensibilität von 100 % erreichte, nur zehn Proben getestet. Beispielsweise beschreiben Smith et al., J. Clin. Microbiol. 25 1498 - 1504, 1987, zwei überlappende Peptide, E32 und E34, die hoch immunreaktiv sind. Unter 240 seronegativen Proben erhielt man keine falsch positiven Ergebnisse, aber drei seropositive Proben von insgesamt 322 wurden von den Peptiden nicht identifiziert (Sensibilität von 99,1 %). Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 83, 6159 - 6163, 1986) beschreibt eine Reihe überlappender Peptide (einschließlich Aminosäurebausteine von Smiths E32 -und E34-Peptiden). Von diesen zeigte ein 21-mer-Peptid 100 % Spezifität und 98 % Sensibilität (von 228 seropositiven AIDS-Patienten entnommenen Proben waren 224 mit diesem Peptid positiv). Die am 13. November 1987 eingereichte US-Anmeldung 120,027 betrifft ein kurzes synthetisches Peptid, das die Bausteine 606 bis 620 (SGKLICTTAVPWNAS) von gp41 (HIV-1) überspannt. Von diesem Peptid wird berichtet, daß es mit Antikörpern von Patienten, die mit den AIDS-Viren infiziert sind, immunreaktiv ist. Auch die Spezifität war ausgezeichnet (63/63), aber von 57 bestätigt positiven Proben wurden 6 seropositive Proben nicht nachgewiesen (Sensibilität von 89 %).
Gnann et al. (J. Virol 61, 2639 - 2641, 1987, und J. Infec. Dis. 156, 261 - 267, 1987) betreffen ebenfalls eine Serie überlappender Peptide von einer vermutlich immundominanten Region von gp41 (HIV-1). Gnann et al. schlossen daraus, daß cys-605 wesentlich für die Immunreaktivität dieses Segments des gp41-(HIV-1)-Proteins war. Sie berichteten, daß ein Peptid mit der Sequenz SGKLIC (606-611) nicht mit irgendeinem der 22 getesteten HIV-1 positiven Seren immunreaktiv war, während der Zusatz des Cysteinbausteins zum N-Terminus die Immunreaktivität teilweise wiederherstellte. 21 von 44 Seren reagierten mit dem 7-mer-Peptid (48 % Sensibilität).
Gnann et al. (J. Virol.) vertraten auch die These, daß die Cysteinbausteine an den Positionen 605 und 611 von gp41 (HIV-1) eine Rolle in der Antigenkonformation dieses Bereichs spielen könnten, vielleicht durch die Bildung einer cyclischen Struktur über Disulfidbindungen. Jedoch haben Gnann et al. nie nachgewiesen, daß sie über ein synthetisches Peptid verfügen, in dem die beiden Cysteingruppen durch Disulfidbindungen verbunden sind.
Obwohl Gnann et al. Peptide beschreiben, die sich für die Identifizierung von HIV-1-Antikörpern eignen, haben selbst diese Peptide keine Sensibilität von 100 %. Beispielsweise berichten Gnann et al., (J. Virol. 61, 2639 - 2641 (1987)), daß ihre 600-611-Aminosäuresequenzen zwar 22 von 22 positiven Seren nachwies, daß bei ähnlichen Tests, die im "Center for Disease Control" in Atlanta, Georgia, mit der gleichen 12-Aminosäuresequenz (600 - 611) durchgeführt wurden, eines von 79 positiven Seren nicht entdeckt wurde. Auch berichteten Gnann et al. in J. Infect. Dis. 156, 261 - 267, 1987, daß die gleiche 12-Aminosäuresequenz bei 131 von 132 mit HIV-1 infizierten Patienten aus den Vereinigten Staaten reaktiv war.
Gnann et al., Science 237, 1346 - 1349, 1987, berichten über ein kurzes lineares synthetisches Peptid, das die Bausteine 592 bis 603 von gp42 (HIV-2) überspannt. Dieses weist zwei Cysteine in einer Region auf, die homolog zu der Region 605 - 611 von gp41 (HIV-1) ist. Dieses Peptid reagierte mit 5 von 5 Seren, die mit HIV- 2 infizierten Patienten entnommen worden waren.
Auch über andere Peptide, die die Aminosäuren 605 - 611 von gp41 (HIV-1) enthalten, wird in der Technik berichtet. WO 86/06414 betrifft das Peptid X(39), das durch die Region von etwa bp 7516 bis bp 7593 codiert ist, und das Peptid XIII(79), das durch die Region von etwa bp 7543 bis einschließlich bp 7593 codiert ist, wobei beide die 7-Aminosäuresequenz 605 - 611 aufweisen. Wie es heißt, sind diese Peptide linear; ein Hinweis auf die Bildung cyclischer Strukturen liegt nicht vor. In WO 87/06005 wird berichtet, daß eine Serie von syntheti schen Peptiden, die die Cys(605) - Cys(611)-Bausteine des Glykoproteins (gp41) der HIV-1-Hülle beinhalten, bei der Solubilisierung in einem neutralen oder basischen wäßrigen Puffer eine Reihe spontaner oxydativer Verwandlungen durchlaufen. Es wird darüber spekuliert, daß die Peptide bei Verwendung in ELISAs im Ergebnis eine Mischung aus linearen Monomeren, cyclischen Monomeren, linearen oder cyclischen Dimeren und linearen Polymeren verschiedener Länge sind. Die Anmeldung wies die Gegenwart cyclischer Komponenten im Grunde nicht nach und charakterisierte die möglicherweise vorhandenen anderen Dimere und Polymere nicht. Darüber hinaus wird darüber spekuliert, daß die Polymerformen die wichtigsten Komponenten für die ELISA-Reaktivität sind.
Abgesehen davon&sub1; daß die Peptide des Standes der Technik eventuell komplexe Mischungen verschiedener oxydativer Formen des Peptids sind, ist es mit ihnen nicht möglich, die AIDS-Infektion so früh wie wünschenswert nachzuweisen. Beispielsweise berichten Gnann et al. (J. Virol.), daß in Fällen, wo die HIV-1 positiven Seren mit einem Faktor von mehr als 500 verdünnt werden, einige dieser verdünnten Seren negativ testen. Das heißt, das Peptid verfügt nur über geringe Sensibilität für einen frühen HIV-Nachweis.
Diese Probleme versuchte man durch Verwendung von Peptiden zu lösen, die chemisch cyclisiert wurden&sub1; um eine Disulfidbrücke zwischen den relevanten Cysteinen zu bilden. Beispiele dafür sind der von M. Lacroix et al. durchgeführte Vergleichstest von cyclischen und linearen Peptiden in einem ELISA für HIV-1- und HIV-2-spezifische Antikörper, Nr. 3147, Juni 1989, AIDS Konferenz, Montreal, Kanada, EP 0 326 490 und WO 89/03844. Diese Erfindung betrifft Verbesserungen solcher cyclischer Peptide.

Zusammenfassung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird eine neuartige Serie von Peptiden zur verfügung gestellt, die besonders dafür adaptiert sind, daß sie 100 % von HIV-1- und HIV-2-Antikörpern nachweisen, und zwar auch dann, wenn solche Antikörper nur in sehr geringen Mengen im Serum vorhanden sind.
Genauer werden die neuartigen erfindungsgemäßen Peptide aus im wesentlichen reinen Peptiden der Formeln 1 oder II ausgewählt:
Darin ist x unabhängig aus einem der folgenden Aminosäuresequenzanalogen der Aminosäuresequenz von gp41- HIV-1
KILAVERYLKDQQLLGIWG- (586-604)
KKILAVERYLKDQQLLGIWG- (585-604),
diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-1-Isolate abgeleitet sind, sowie unter infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen ausgewählt, wobei solche Aminosäuresequenzen durch mindestens ein Lysin in Position 586 oder ein Lysin sowohl in der Position 585 als auch 586 gekennzeichnet sind;
y, falls vorhanden, ist unabhängig aus
diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-1-Isolate abgeleitet sind, sowie infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen ausgewählt;
e und f, falls vorhanden, sind unabhängig aus der aus einer Aminosäuresequenz eines beliebigen Epitops des Bereichs, der sich über die Aminosäuren 586 bis 629 des gp41 von HIV-1 erstreckt, oder des Bereichs, der sich über die Aminosäuren 578 bis 613 des gp36 von HIV-2 erstreckt, diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-1- oder HIV-2-Isolate abgeleitet sind, infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen und jeglichen Kombinationen dieser Epitope ausgewählt;
a ist ein Aminoterminus oder ein Substituent, der als Kupplungsmittel wirkt und/oder der das Peptid als Immundiagnostikum besser geeignet macht, ohne dessen antigene Eigenschaften zu verändern, und
b ist ein Carboxyterminus oder ein Substituent, der als Kupplungsmittel wirkt und/oder der das Peptid als Immundiagnostikum besser geeignet macht, ohne dessen antigene Eigenschaften zu verändern; sowie
Darin ist x' unabhängig aus einem der folgenden Aminosäuresequenzanalogen der Aminosäuresequenz von gp36- HIV-2
KVTAIEKYLQDQARLNSWG (575-596)
KKVTAIEKYLQDQARLNSWG (577-596),
diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-2-Isolate abgeleitet sind, sowie unter infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen ausgewählt, wobei solche Aminosäuresequenzen durch mindestens ein Lysin in Position 578 oder ein Lysin sowohl in der Position 577 und 578 gekennzeichnet sind;
y', falls vorhanden ist unabhängig aus
diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-2-Isolate abgeleitet sind, sowie infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenenden Aminosäuresequenzen ausgewählt, und
e, f, a und b haben die gleiche Definition wie vorstehend.
In einer anderen Ausführungsform werden die erfindungsgemäßen neuartigen Peptide aus im wesentlichen reinen Peptiden der Formeln III und IV ausgewählt:
Darin ist x², falls vorhanden&sub1; unabhängig aus folgender Gruppe ausgewählt:
diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-1-Isolate abgeleitet sind, sowie unter infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen;
y, e, f, a und b haben die gleiche Definition wie vorstehend und entweder e oder f ist vorhanden; sowie
Darin ist x³, falls vorhanden, unabhängig aus folgender Gruppe ausgewählt:
diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-2-Isolate abgeleitet sind, sowie unter infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen;
y', e, f, a und b haben die gleiche Definition wie vorstehend und entweder e oder f ist vorhanden.
Ein besonders bevorzugtes Peptid der Formel I ist BCH-408 mit folgender Sequenz:
Dieses Peptid inkorporiert an der f-Position 619 die Aminosäuresequenz des Epitops, das sich an der Position 606-610 (SGKLI) von gp41 von HIV-1 befindet, und an der Position 586 ein Lysin.
Ein besonders bevorzugtes Peptid der Formel II ist BCH- 417, das die folgende Sequenz aufweist:
Dieses Peptid inkorporiert an der f-Position 613 die Aminosäuresequenz des Epitops, das sich an der Position 598-602 (AFRQV) von gp36 von HIV-2 befindet, und an der Position 578 ein Lysin.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung Auswahl der Peptide für die Synthese

Die erfindungsgemäßen Peptide wurden auf der Grundlage veröffentlichter Aminosäuresequenzen von HIV-1 und HIV- 2 synthetisiert. Jedoch können selbstverständlich auch die von den homologen Regionen anderer HIV-1 oder HIV- 2-Isolate abgeleiteten Sequenzen verwendet werden, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen.
In den erfindungsgemäßen Peptiden wurden Epitope in diesen nativen Sequenzen zur Verwendung als e und f ausgewählt. Dazu bediente man sich verschiedener physikalisch-chemischer Prinzipien, die die Voraussage erleichtern, welche Anteile eines Polypeptids am wahrscheinlichsten oberflächenorientiert und dadurch immunogen sind. Dazu gehören die Hydrophilieaufzeichnungen von Hopp und Woods (Proc. Natl. Acad. Sci. 78, 3824 - 3828, 1981) und ein ähnlicher Ansatz von Kyte und Doolittle (J. Mol. Biol. 157, 105 - 132, 1982). Auch die empirische Voraussage der Proteinkonformation (Chou und Fasman, Ann. Rev. Biochem. 47, 251 - 276, 1978) sind ein nützlicher Leitfaden für die Voraussage, welche Teile des Polypeptids wahrscheinlich immunogen sind.
Die e- und f-Epitope der erfindungsgemäßen Peptide umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf WGCAF (identifiziert von Norrby et al., AIDS Research & Human Retroviruses, Band 5, Nr. 5, 1989); KD, SGKL und LEDQ (identifiziert von Norrby et al., AIDS, Band 3, Nr. 1, 1989); LKDQ, CSGKLI und IWG (identifiziert von Mathiesen et al., Immunology, 67, 1 - 7, 1989); und ARILAVERYLKD sowie SGKLICTTAVPWNAS (identifiziert von Dopel et al., Jol. of Vir. Meth., 25, 167 - 178, 1989).
Es liegt auch im Rahmen der Erfindung, die erfindungsgemäßen Peptide zu modifizieren, um ihren Nutzen als immundiagnostische Reagenzien zu erhöhen, ohne ihre antigenen Eigenschaften zu verändern. Solche Veränderungen sind unter anderem:
- Zusatz eines Cysteinbausteins am Amino- oder Carboxyterminus, um die Kupplung des Peptids an ein Trägerprotein mit heterobifunktionellen vernetzend wirkenden Reagenzien wie Sulfosuccinimidyl-4(p- maleinimidphenyl)butyrat, einem bevorzugten Reagenz für die Durchführung solcher Vernetzungen, zu erleichtem;
- Zusatz bestimmter Aminosäuren am Amino- oder Carboxyterminus, um die Vernetzung der Peptide untereinander zu erleichtern, um das Peptid mit einem Träger oder einem größeren Peptid zu koppeln oder die physikalischen oder chemischen Eigenschafgen des Peptids zu modifizieren. Solche Veränderungen erfolgen beispielsweise durch Zugabe von Tyrosin, Glutaminsäure oder Asparaginsäure, die über eine Veresterungsreaktion als Zwischenglieder verwendet werden können, oder Lysin, das durch eine Schiff'sche Base oder Amidbildung verbunden werden kann, sowie
- Derivatisierung durch Acylierung der endständigen Aminogruppen, Thioglykolsäureamidierung und Amidierung der endständigen Carboxygruppen z.B. unter Verwendung von Ammoniak oder Methylamin. Diese Modifizierungen führen zu Veränderungen in der Nettoladung auf dem Peptid und können auch die kovalente Verkettung des Peptids mit einer festen Unterlage, einem Träger oder einem anderen Peptid erleichtern. Es steht nicht zu erwarten, daß diese Modifizierungen zu einer Veränderung der Immunreaktivität des Peptids führen.
Die erfindungsgemäßen Peptide können auch durch verschiedene Veränderungen wie Insertionen, Deletionen und Substitutionen konservativer oder nicht konservativer Art modifziert werden, wenn solche Veränderungen Vorteile bei ihrer Verwendung bieten. Dazu gehören vorzugsweise folgende konservative Veränderungen: gly, ala; val, ile, leu; asp, glu; asn, gin; ser, thr; lys, arg; phe, tyr; ala, ser; ala, thr; ala, val; ala, pro; ala, glu; leu, gln; gly, phe; ile, ser; und ile, met. Methionin, eine Aminosäure, die zu spontaner Oxidation neigt, kann normalerweise durch Norleucin ersetzt werden, ohne die Antigenität zu veränden.
Es kann auch von Vorteil sein, einen "Schwanz" aus einer kleinen Anzahl (1 bis 10) hydrophober Aminosäuren an die erfindungsgemäßen Peptide anzuhängen. Solche "Schwänze" können die passive Adsorption eines Peptids an eine feste Unterlage erleichtern. Diese Modifizierung kann entweder an den endständigen COOH- oder NH&sub2;- Gruppen erfolgen. Der bevorzugte Zusatz besteht aus phe-ala-phe-ala-phe.
Erfindungsgemäß sind die bevorzugten cyclischen Peptide der Formel 1 solche, in denen x, y, e und f folgende Definition haben:
x: KILAVERYLKDQQLLGIWG, y: TTAVPWNAS,
e und f nicht vorhanden (BCH-87ck);
x: KKILAVERYLKDQQLLGIWG, y: TTAVPWNAS,
e und f nicht vorhanden (BCH-266) und
x: KILAVERYLKDQQLLGIWG, y: TTAVPWNA,
f: SGKLI und e nicht vorhanden (BCH-408), wobei BCH-408 am meisten bevorzugt wird.
Die bevorzugten cyclischen Peptide der Formel II sind solche, in denen x', y', e und f die folgende Definition haben:
x': KVTAIEKYLQDQARLNSWG, y': HTTVPWNDS
e und f nicht vorhanden (BCH-202ck);
x': KKVTAIEKYLQDQARLNSWG y': HTTVPWNDS
e und f nicht vorhanden (BCH-265) und
x': KVTAIEKYLQDQARLNSWG, y': HTTVPWNDS
f: AFRQV und e nicht vorhanden (BCH-417), wobei BCH-417 am meisten bevorzugt wird.
Tabelle 1 zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen dieser bevorzugten Peptide (ohne Einbeziehung möglicher Komponenten a und b): Tabelle 1 - Peptidsequenzen

Herstellung linearer und cyclischer Peptide

Die erfindungsgemäßen Peptide werden bevorzugt unter Einsatz einer herkömmlichen Synthese in der festen Phase hergestellt.
Man kann jedoch auch andere allgemein bekannte Verfahren zur Peptidsynthese verwenden. Der Harzträger ist jedes geeignete, herkömmlich in der Technik für die Festphasenherstellung von Polypeptiden verwendete Harz, vorzugsweise p-Benzyloxyalkoholpolystyrol und p-Methylbenzydrylaminharz. Nach der Verbindung der ersten geschützten Aminosäure mit dem Harzträger wird die Aminoschutzgruppe durch in der Technik herkömmlich verwendete Standardverfahren bei der Festphasenpeptidsynthese entfernt. Nach der Entfernung der Aminoschutzgruppe werden die verbleibenden durch α-Amino geschützten und, falls erforderlich, durch Seitenketten geschützten Aminosäuren nacheinander miteinander verbunden, um das Produkt zu erhalten. Alternativ können mehrere Aminosäuregruppen vor der Verbindung mit der auf Harz geträgerten Aminosäuresequenz durch das Lösungsverfahren miteinander verbunden werden.
Bei der Wahl des geeigneten Kupplungsreagenz hält man sich an die etablierte Technik. Beispielsweise sind geeignete Kupplungsreagenzien N,N'-Diisopropylcarbodiimid oder N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) entweder allein oder vorzugsweise in Gegenwart von 1-Hydroxybenzotriazuol. Bei einem anderen geeigneten Kopplungsverfahren bedient man sich vorgeformter symmetrischer Anhydride geschützter Aminosäuren.
Die für jede an die wachsende Polypeptidkette angefügte Aminosäure notwendige α-Aminoschutzgruppe ist vorzugsweise 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc), obwohl auch jede andere geeignete Schutzgruppe verwendet werden kann, solange sie sich unter den Kopplungsbedingungen nicht zersetzt und sich in Gegenwart etwaiger anderer im wachsenden Molekül bereits vorhandener Schutzgruppen ohne weiteres selektiv entfernen läßt.
Die Kriterien für die Wahl der Schutzgruppen für die Seitenkettenaminosäuren sind folgende:
(a) Stabilität der Schutzgruppe gegenüber den verschiedenen Reagenzien unter Reaktionsbedingungen, die für die Entfernung der α-Aminoschutzgruppe bei jedem Schritt der Synthese selektiv sind;
(b) Erhaltung der strategischen Eigenschaften der Schutzgruppe (d.h. keine Abspaltung unter Kopplungsbedingungen) und
(c) Entfernbarkeit der Schutzgruppe bei Abschluß der Polypeptidsynthese, und zwar unter Bedingungen, die die Polypeptidstruktur ansonsten nicht beeinträchtigen.
Die vollständig geschützten, auf Harz geträgerten Peptide werden mit einer 50 bis 60%igen Lösung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid über 1 bis 6 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart geeigneter Fänger wie Anisol, Thioanisol, Ethylmethylsulfid, 1,2-Ethandithiol und verwandten Reagenzien vom p-Benzyloxyalkoholharz abgespalten. Gleichzeitig können auch die am wenigsten säurebeständigen Seitenkettenschutzgruppen entfernt werden. Säurebeständigere Schutzgrupen werden durch eine HF-Behandlung entfernt.
Erfindungsgemäße cyclische Peptide werden durch direkte oxydative Umwandlung von geschützten oder ungeschützten SH-Gruppen zu einer Disulfidbindung hergestellt. Dies geschicht durch folgende, in der Technik der Peptidsynthese allgemein bekannte Techniken. Bei dem am meisten bevorzugten Verfahren werden die freien SH-Gruppen mit Kaliumferricyanid direkt oxidiert. Man nimmt an, daß solche cyclischen Peptide eine starrere Konformation annehmen, die das Binden an HIV-Antikörper fördern kann.

Peptidmischungen und Polymere

Im Rahmen der Erfindung liegen auch größere Peptide, die durch die kovalente Verbindung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen Peptiden hergestellt werden. Polymere (sowohl Homo- als auch Copolymere) dieser Peptide werden ebenfalls in Betracht gezogen.
Ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegen andere cyclische erfindungsgemäße Peptide, deren Mischungen sowie andere cyclische und lineare, von HIV abgeleitete Peptide. Es hat sich überraschend gezeigt, daß diese Mischungen HIV-1 und HIV-2-Antikörper in seriell verdünnten Serumproben und in Serumumwandlungspanels (HIV-1) mit hoher Sensibilität nachweisen können. Außerdem hat sich erwiesen, daß diese Mischungen ein hohes Maß von Spezifität zur Verfügung stellen, so daß nur eine minimale Anzahl falsch positiver Ergebnisse auftritt.
Solche Mischungen enthalten mindestens ein cyclisches Peptid der allgemeinen Formel I oder III (vorzugsweise BCH-87ck, BCH-266 oder BCH-408 und am meisten bevorzugt BCH-408) in Kombination mit mindestens einem cyclischen Peptid der allgemeinen Formel II oder IV (vorzugsweise BCH-202ck, BCH-265 oder BCH-417 und am meisten bevorzugt BCH-417).

HIV-Antikörpernachweis

Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidmischungen eignen sich als diagnostische Reagenzien für den Nachweis AIDS-assoziierter Antikörper nach in der Technik allgemein bekannten Verfahren. Dazu gehören ELISA, Hämagglutination, Single-Dot- und Multi-Dot- Verfahren (Einpunkt- und Mehrpunktverfahren) und Tests. Der wichtigste Vorteil dieser Peptide beim Nachweis von Antikörpern gegen AIDS liegt in ihrer Spezifität und der hohen Sensibilität, vor allem jedoch in ihrer Fähigkeit, im Vergleich zu bekannten, bisher verwandten Antigenen auch die Gegenwart sehr geringer Mengen der AIDS-Viren zu entdecken.
Nach einem Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1 oder HIV-2 verwendet man die sogenannte "Western Blotting"-Analyse (Towbin, H., Staehelin, T. und Gordon J., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 76, 4350 - 43541 1979). Bei dieser Technik werden ein oder mehrere erfindungsgemäße Peptide auf Nitrocellulosepapier aufgebracht. Das Nitrocellulosepapier wird gesättigt und dann mit dem zu testenden Serum behandelt. Nach dem Waschen wird das Nitrocellulosepapier mit einem mit einem Enzym markierten anti-Human-IGG behandelt. Anschließend wird die enzymatische Aktivität durch ein geeignetes Substrat bestimmt. Natürlich können auch andere Marker wie z.B. radioaktive oder fluoreszierende Marker verwendet werden.
Eine bevorzugte praktische und klassische Technik zur Bestimung von Antikörpern gegen HIV-1 oder HIV-2 unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptids oder einer Peptidmischung ist ELISA. Bei diesem Test wird beispielweise ein erfindungsgemäßes Peptid, eine Peptidmischung oder eine Kombination in die Vertiefungen einer Mikrotiterpiatte adsorbiert oder kovalent damit verbunden. Die Vertiefungen werden dann mit den zu testenden Seren oder Analyten behandelt. Nach dem Waschen wird den Vertiefungen mit Peroxidase markiertes Antihuman-IGG oder Antihuman-IGM zugesetzt. Die Bestimmung der Peroxidase erfolgt mit einem entsprechenden Substrat, z.B. mit o-Phenylendiamin. Ohne daß der Nutzen dieses beispielhaften Tests beeinträchtigt wird, kann die Peroxidase auch durch einen anderen Marker ersetzt werden, z.B. einen radioaktiven Marker oder einen, der Fluoreszenz, Chemilumineszenz oder Infrarot ausstrahlt.
Beim ELISA-Test können einzelne Peptide oder Peptidkombinationen verwendet werden. Letztere werden bevorzugt, da man damit die für den Nachweis am wirksamsten Peptide miteinander kombinieren, gleichzeitig jedoch jene ausschließen kann, die zu falschen Ergebnissen beitragen. Im Laufe dieser Studien entdeckten wir, daß einige Serumproben bei Peptidmischungen korrekt positive Ergebnisse lieferten, bei einzelnen Peptiden als Antigen jedoch zweideutig reagierten. Deshalb wird erfindungsgemäß der am meisten bevorzugte Test auf HIV-1- und HIV-2-Antikörper unter Verwendung einer Kombination von Peptidantigenen durchgeführt.
Ein weiteres Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1 oder HIV-2 mit den erfindungsgemäßen Peptiden oder Peptidmischungen ist ein immunologischer Enzymtest nach dem sogenannten "Double-Antigen-Sandwich"-Verfahren. Dieses Verfahren basiert auf den Arbeiten von Maiolini, die in "Immunological Methods" 20, 25 - 34, 1978, beschrieben sind. Gemäß diesem Verfahren wird das Serum oder ein anderer zu testender Analyt mit einer festen Phase in Kontakt gebracht, die mit einem erfindungsgemäßen Peptid bzw. einer Peptidmischung (Fängerschicht) sowie mit einem mit Peroxidase markierten erfindungsgemäßen Peptid bzw. einer Peptidschicht (Testschicht) beschichtet wurde. Die immunologische Reaktion kann in einem oder zwei Schritten erfolgen. Wenn die immunologische Reaktion in zwei Schritten durchgeführt wird, dann erfolgt zwischen den beiden Inkubierungen vorzugsweise ein Waschschritt. Auch nach der bzw. den immunologischen Reaktionen kann ein Waschschritt durchgeführt werden. Anschließend wird die Peroxidase mit einem Substrat bestimmt, z.B. mit o-Phenylendiamin. Andere Enzyme und Chromogene einschließlich der bereits beschriebenen können in diesem Test verwendet werden.
Geeignete Festphasen sind organische und anorganische Polymere wie Amylasen, Dextrans, natürliche oder modifizierte Cellulosen, Polyethylene, Polystyrole, Polyacrylamide, Agarosen, Magnetide, poröse Glaspulver, Polyvinyldienfluorid (Kynar) und Latex, die Innenwand von Testgefäßen wie z.B. Teströhrchen, Titerplatten oder Küvetten aus Glas und Kunststoff sowie die Oberfläche fester Körper, z.B. Stäbe aus Glas und Kunststoff, Stäbe mit verdickten Enden und Stäbe mit Lappen oder Lamellen an den Enden. Kugeln aus Glas und Kunststoffen sind besonders gut geeignete Festphasenträger.
Die erfindungsgemäßen Peptide und Peptidmischungen sind nicht nur nützlich zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1 oder HIV-2, sondern indirekt auch zum Nachweis von HIV-1 oder HIV-2 selbst, da diese Peptide, die entweder frei, polymerisiert oder mit einem geeigneten Träger konjugiert sind, nützlich zur Erzeugung von Antikörpern, vor allem monoklonalen Antikörpern gegen HIV-1 oder HIV-2 sind. Solche Antikörper können dadurch hergestellt werden, daß man einem Säugetier oder einem Vogel eine ausreichende Menge eines erfindungsgemäßen Peptids oder einer Peptidmischung einspritzt und die Antikörper aus dem Serum dieser Tiere gewinnt. Geeignete Wirte zur Erzeugung von Antikörpern sind Säugetiere wie Kaninchen, Pferde, Ziegen, Meerschweinchen, Ratten, Mäuse, Kühe, Schafe usw.
Verschiedene, allgemein bekannte Verfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidmischungen können zur quantitativen Bestimmung von HIV-1 oder HIV-2-Infektionen verwendet werden. Bei einem solchen Verfahren werden bekannte Mengen einer zu untersuchenden Serumprobe, ein erfindungsgemäßes radiomarkiertes cyclisches Peptid oder eine Peptidmischung sowie unmarkiertes erfindungsgemäßes Peptid bzw. eine Peptidmischung vermischt und stehengelassen. Der Antikörper/Antigenkomplex wird durch in der Technik bekannte Verfahren von den ungebundenen Reagenzien getrennt, z.B. durch Behandlung mit Ammoniumsulfat, Polyethylenglykol, einem zweiten Antikörper, der entweder im Überschuß vorliegt oder an einen unlöslichen Träger gebunden ist, mit Dextran beschichtete künstliche Kohle u.a. Die Konzentration des erfindungsgemäßen markierten Peptids oder der Peptidmischung wird entweder in der gebundenen oder ungebundenen Phase bestimmt. Dann kann der HIV-1- oder HIV-2-Gehalt der Probe dadurch bestimmt werden, daß man die Menge der beobachteten markierten Komponenten auf bekannte Weise mit einer Standardkurve vergleicht.
Ein weiteres geeignetes quantitatives Verfahren ist der "Double-Antibody-Sandwich-Test". Bei diesem Test wird die zu testende Probe mit zwei verschiedenen Antikörpern behandelt, die unter Einsatz verschiedener Tiere, z.B. Schafe oder Kaninchen, gegen ein erfindungsgemäßes Peptid bzw. eine Peptidmischung gezogen wurden. Alternativ können mit der bekannten Koehler-Milstein-Technik zur Herstellung monoklonaler Antikörper monoklonale Antikörper hergestellt werden. Um gegen das gleiche Antigen, aber verschiedene Epitope gerichtete monoklonale Antikörper zu unterscheiden, kann man sich des Verfahrens von Stähli et al. (J. of Immunological Methods, 32, 297 - 304, 1980) bedienen. Es ist auch möglich, ein polyklonales Antiserum und einen monoklonalen Antikörper zu verwenden.
Einer dieser Antikörper ist markiert und der andere auf eine feste Phase geschichtet. Die dafür geeigneten festen Phasen sind die gleichen wie vorstehend beschrieben. Geeignete Marker sind Enzyme, z.B. Peroxidase, radioaktive Marker oder fluoreszierende Marker. Die bevorzugte Festphase ist eine Kunststoffperle und der bevorzugte Marker Meerrettichperoxidase.
Dann wird die Serumprobe mit dem Festphasenantikörper und dem markierten Antikörper inkubiert. Es ist möglich, die Probe zuerst mit dem Festphasenantikörper zu behandeln, dann zu waschen, und anschließend mit dem markierten Antikörper zu behandeln. Es ist jedoch auch möglich, die Probe zuerst mit dem Festphasenantikörper und nach einer bestimmten Zeit mit dem markierten Antikörper zu behandeln. Vorzugsweise wird die Probe mit dem Festphasen- und dem markierten Antikörper zusammen behandelt.
Nach der oder den immunologischen Reaktionen kann ein Waschschritt erfolgen. Nach dem Waschen wird der Marker mit in der Technik bekannten Verfahren bestimmt. In dem Fall, wo Peroxidase als Marker verwendet wird, erfolgt die Bestimmung mit dem Substrat, z.B. o-Phenylendiamin oder Tetramethylbenzidin. Die Menge der markierten Komponente ist proportional zur Menge des oder der in der Probe vorhandenen Antigene.
Die Verfahren und Tests zur Bestimmung und Quantifizierung von HIV-1, HIV-2 oder Antikörpern gegen HIV-1 oder HIV-2 wie vorstehend beschrieben, können mit geeigneten Testausrüstungen durchgeführt werden. Diese enthalten in einem Behälter ein erfindungsgemäßes cyclisches Peptid, Peptidmischungen oder Kombinationen davon, oder Antikörper gegen HIV-1 oder HIV-2, die durch ein erfindungsgemäßes cyclisches Peptid oder eine Mischung aus cyclischen und linearen Peptiden erzeugt wurden.
Die erfindungsgemäßen Peptide oder Peptidmischungen bzw. -kombinationen sind auch geeignet als Wirkstoff in Impfstoffen, die eine Schutzimmunität gegen HIV-1 und HIV-2 in Wirten hervorrufen können, die für die Infektion mit diesem Virus anfällig sind. Die Art der Verabreichung, die Antigendosen sowie Anzahl und Häufigkeit der Injektionen schwanken von Person zu Person und können sich an der Vorgehensweise orientieren, mit denen man derzeit Immunität gegen andere Virusinfektionen erreicht. Beispielsweise sind die Impfstoffe pharmazeutisch verträgliche Zusammensetzungen, die mindestens ein erfindungsgemäßes Peptid, seine Analoge, Mischungen oder Kombinationen daraus enthalten, und zwar in einer Menge, die in einem damit behandelten Menschen oder Säugetier ausreichend Antikörper erzeugt, um für einen bestimmten Zeitraum Schutz gegen HIV-1- oder HIV-2-Infektionen zu bieten.
Die Impfstoffe werden nach bekannten Verfahren hergestellt. Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen werden aus praktischen Gründen herkömmlich mit physiologisch verträglichen Trägersubstanzen kombiniert, z.B. Salziösungen von pharmazeutischer Qualität, Tetanustoxoid und Napfschneckenhämocyanin (KLH). Die erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzungen können auch Hilfsmittel oder andere Mittel zur Verbesserung der Immunantwort enthalten, z.B. Alaunzubereitungen, Liposomen oder Immunmodulatoren. Darüber hinaus können diese Impfstoffzubereitungen auch noch andere Antigene enthalten, die gegen andere Viren (z.B. HTLV-I, HTLV- II, oder den Zytomegalovirus) oder andere pathogene Substanzen außer HIV-1 und HIV-2 immun machen. Auch die Menge dieser anderen Antigene hängt von dem zu behandelnden Menschen oder Säugetier und dem Verlauf der Krankheit ab. Jedoch sollte das Antigen in ausreichender Menge vorhanden sein, um genügend Antikörper für einen Schutz des behandelten Menschen gegen diese pathogene Substanz oder dieses Virus für eine bestimmte Zeit zu erzeugen.

Auswahl der getesteten Seren

Um die überraschende Sensibilität und Spezifität der erfindungsgemäßen Peptide zu zeigen, wurde eine Auswahl von Seren mit beispielhaften Peptiden getestet.
Die O.D.-Werte erhielt man bei 450 nm. Die mit dem Verdünnungspuffer der Probe gemessenen Leerwerte wurden nicht abgezogen.
Die Proben NEIA-2*2, BBI-1-162 bis 168, 878140, 87L139, 87V103 sind alle negativ in bezug auf HIV-Antikörper. Die Probe LSPQ-S9-1 ist im frühen Stadium serokonvertiert (HIV-1). Die CAP-113 bis CAP-120 markierte Serie entspricht einem Pool von sieben HIV-1-positiven Plasmaproben, die seriell mit einem HIV-negativen Plasma verdünnt wurden. CAP-113 ist der 50-fach mit HIV-negativem Plasma verdünnte Pool; CAP-114 ist 100-fach verdünnt, CAP-115 ist 200-fach verdünnt usw. Auf ähnliche Weise entspricht die CAP-222 bis CAP-230 markierte Serie einem Pool von sieben HIV-2-bestätigten seropositiven Plasmaproben. CAP-222 ist 50-fach mit einem HIV-negativen Plasma verdünnt, CAP-223 100-fach usw. Ehe der Test durchgeführt wird, wird jede Probe einschließlich der CAP-Serie mit dem Verdünnungspuffer der Probe noch einmal um das 50-fache verdünnt. In diesen Tests wird die Grenze für Seropositivität als die Summe des O.D- Wertes für die Probe NEIA-2*2 plus 0,100 definiert.

Ergebnisse

Die erfindungsgemäßen cyclischen Peptide wurden beschichtet und gemäß dem vorstehend beschriebenen ELISA- Test getestet. Tabelle 2 vergleicht die Sensibilität des Peptids BCH-87c (586(Arginin)) mit der von Peptid BCH-87ck (586(Lysin)) und von Peptid BCH-265 (586- Lysin)-585(Lysin)) bei progressiver Verdünnung des Antikörpers in den Serumproben. Es stellte sich heraus, daß die Substitution eines Lysins für das Arginin an der Aminosäureposition 586 die Sensibilität für den Nachweis von HIV-1-Antikörpern steigerte. Eine weitere Steigerung der Sensibilität wurde durch ein zusätzliches Lysin an Position 585 erreicht. Tabelle 3 vergleicht die Wirksamkeit von BCH-87c, BCH-87ck, BCH-266 und BCH-408 bei progressiv höheren Verdünnungen. Aus Tabelle 3 geht hervor, daß das Peptid BCH-408, bei dem ein wichtiges an der Position 606-610 (SGKLI) befindliches Epitop sich an seinem c-Terminus wiederholt, im Vergleich zu anderen Peptiden über eine überlegene Sensibilität verfügt.
Es stellte sich auch bei den HIV-2-Peptiden heraus, daß die Substitution eines Lysins für ein Arginin an der Aminosäureposition 578 die Sensibilität zum Nachweis von HIV-2-Antikörpern verbesserte. Eine weitere Steigerung der Sensibilität erreicht man durch ein zusätzliches Lysin an der Position 577. Tabelle 4 vergleicht die Sensibilität des Peptids BCH-202c (578(Arginin)) mit der von Peptid BCH-202ck (578(Lysin)) und von Peptid BCH-266 (598-Lysin)-577(Lysin)) bei progressiver Verdünnung des Antikörpers in den Serumproben.
Es wurden auch Peptidcocktails hergestellt, um eine Mischung aus HIV-1 und HIV-2-Antikörpern nachzuweisen. Tabelle 5 zeigt die Sensibilität der Peptidcocktailmischungen BCH-87c und BCH-202c (Arginin) im Vergleich mit BCH-87ck und BCH-202ck (Lysin). Der Peptidcocktail mit den Peptiden, in denen Arginin durch Lysin ersetzt war, hatte eine höhere Sensibilität zum Nachweis von HIV-Antikörpern. Tabelle 2 - HIV-1 Tabelle 3 - HIV-1 Tabelle 4 - HIV-2 Tabelle 5 - HIV-1 Vergleich des Verhaltens von zwei Peptidcocktails
Im folgenden werden die allgemeinen Verfahren für die Synthese und Anwendung der erfindungsgemäßen Peptide veranschaulicht.

Verfahren 1:

Herstellung von Harzen, auf denen sich durch Nα-FMOC geschützte Aminosäurebausteine befinden

Der erwünschte durch Nα-FMOC geschützte Aminosäurebaustein in einer Mischung aus Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) und Dimethylformamid (DMF) (4 : 1) wurde bei 0ºC zu einer Suspension von p-Benzyloxyalkoholharz in CH&sub2;Cl&sub2; DMF (4 : 1). gegeben. Die Mischung wurde von Hand einige Sekunden gerührt und erst mit N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) und dann mit einer katalytischen Menge von 4-(Dimethylamino)pyridin behandelt. Man rührte die Mischung weitere 30 Minuten bei 0ºC und dann über Nacht bei Raumtemperatur. Das filtrierte Harz wurde nacheinander mit CH&sub2;Cl&sub2;, DMF und Isopropanol (je dreimal) und schließlich mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Das Harz wurde in CH&sub2;Cl&sub2; suspendiert, in einem Eisbad gekühlt und erneut destilliert. Dann gab man der gerührten Suspension erst Pyridin und dann Benzoylchlorid zu. Man rührte bei 0ºC noch 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur 60 Minuten. Nach dem Filtrieren wurde das Harz nacheinander mit CH&sub2;Cl&sub2;, DMF und Isopropanol (je dreimal) und schließlich mit Erdölether (zweimal) gewaschen, ehe man es unter hohem Vakuum zu einem konstanten Gewicht trocknete.
Die spektrophotometrische Bestimmung der Substitution nach Meienhofer et al. (Int. J. Peptide Protein Res. 13, 35, 1979) gibt den Substitutionsgrad auf dem Harz an.

Verfahren 2:

Verbindung folgender Aminosäuren

Das Harz mit dem durch Nα-FMOC geschützten ersten Aminosäurebaustein wurde in ein Reaktionsgefäß eines Biosearch 9600 Peptidsynthesisers gelegt und wie folgt behandelt:
1) mit DMF (4 mal je 20 Sekunden) gewaschen;
2) mit einer 30%igen Lösung von Piperidin in DMF (3 Minuten) vorgewaschen;
3) die Schutzgruppen mit einer 30%igen Piperidinlösung in DMF entfernt (7 Minuten);
4) mit DMF (8 mal je 20 Sekunden) gewaschen;
5) auf freie Aminogruppen untersucht - Kaiser Test (muß positiv sein);
6) Das Peptidharz wurde 1 bis 2 Stunden mit 8 Äquivalenten der erwünschten mit FMCO geschützten Aminosäure und 1-Hydroxybenzotriazol und Benzotriazol-1- yl-oxy-tris (dimethylamino) phosphonhexafluorphosphat, die jeweils in trockenem redestillierten DMF mit 16 Äquivalenten 4-Methylmorpholin, aufgelöst waren, vorsichtig geschüttelt;
7) mit DMF (6 mal je 20 Sekunden) gewaschen.
Nach Schritt 7 wurde ein Aliquot für einen Ninhydrintest entnommen. Wenn der Test negativ war, kehrte man zu Schritt 1 zum Ankoppeln der nächsten Aminosäure zurück. War der Test positiv oder leicht positiv, wiederholte man die Schritte 6 und 7.
Das vorstehende Schema kann dazu verwendet werden, sämtliche Aminsosäuren der in dieser Erfindung beschriebenen Peptide miteinander zu verbinden. Nα-Schutz mit FMOC kann während der ganzen Synthese auch den übrigen Aminosäuren gewährt werden.
Radiomarkierte Peptide können nach dem vorstehenden Verbindungsprotokoll durch Inkorporieren einer mit Tritium markierten Aminosäure hergestellt werden.
Nach Zugabe der letzten Aminosäure wird die Nα-FMOC- Schutzgruppe des endständigen N-Bausteins dadurch entfernt, daß man zu den Schritten 1 bis 7 des vorstehenden Schemas zurückkehrt Das Peptidharz wird mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen und im Vakuum getrocknet, um das rohe geschützte Peptid zu ergeben.

Verfahren 3:

Entfernung der Schutzgruppe und Abspalten der Peptide vom Harz

Das geschützte Peptidharz wurde in einer 55%igen Lösung von Trifluoressigsäure (TFA) in CH&sub2;Cl&sub2;, die 2,5 % Ethandithiol und 2,5 % Anisol enthielt, suspendiert. Die Mischung wurde mit N&sub2; gespült und bei Raumtemperatur 1,5 Stunden gerührt. Dann wurde die Mischung filtriert und das Harz mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Das Harz wurde erneut 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 20%iger TFA in CH&sub2;Cl&sub2; behandelt. Die Mischung wurde filtriert und das Harz erst mit 20 % TFA in CH&sub2;Cl&sub2; und dann mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden im Vakuum unter 35ºC verdampft und der Rückstand mehrere Male mit trockenem Dimethylether zerrieben. Der Feststoff wurde in 10 % wäßriger Essigsäure aufgelöst und lyophilisiert, um das rohe Produkt zu ergeben.
Die weitere Entfernung der Schutzgruppen der arg- und cys-Bausteine enthaltenden Peptide erfolgte durch einstündige Behandlung mit HF bei 0ºC in Gegenwart von Anisol und Dimethylsulfid. Die Peptide wurden mit 10%iger wäßriger Essigsäure extrahiert, mit Dimethylether gewaschen und lyophilisiert, um die rohen Peptide zu ergeben.

Verfahren 4:

Reinigung der Peptide

Die rohen Peptide wurden durch präparative HPLC auf einer Vydac-Kolonne (2,5 x 25 mm) aus C&sub1;&sub8; oder C&sub4; reverser Phase mit einem Gradienten der mobilen Phase gereinigt. Der abfließende Strom wurde bei 220 nm und dann durch analytische HPLC überwacht. Die relevanten Fraktionen wurden zusammengefaßt, verdampft und lyophilisiert. Die Identität der synthetischen Peptide wurde durch analytische Chromatographie der reversen Phase und durch Aminosäureanalyse verifiziert.

Verfahren 5:

Cyclisierung von Peptiden

Eine Lösung aus Kaliumferricyanid (0,01M, pH 7,0) wurde langsam zu einer verdünnten wäßrigen Lösung (0,5 mM) des linearen Peptids mit einem pH von 7,0 gegeben. Nach 24 Stunden bei Raumtemperatur wurde der pH auf 5,0 verringert und die Lösung 30 Minuten mit einem lonenaustauschharz (Bio-Rad Ag-3X4a, Cl-Form) behandelt. Die Suspension wurde filtriert und das Filtrat lyophilisiert, um das rohe cyclische Peptid zu ergeben. Das Peptid wurde durch präparative HPLC der reversen Phase gereinigt und durch Aminosäureanalyse charakterisiert. Den Beweis, daß das Peptid tatsächlich cyclisch war, erhielt man dadurch, daß man die HPLC-Mobilität des cyclischen Peptids mit dem linearen Ausgangspeptid verglich. Dabei reduzierte man einen aliquoten Teil des cyclischen Peptids wieder zum linearen Peptid und beobachtete außerdem das Verschwinden freier Sulfhydryl- Gruppen nach der cyclisierung (Ellman-Test)

Verfahren 6

Konjugieren von Peptiden an Rinderserumalbumin (BSA) oder Schlüsselloch-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH)

Peptide wurden an BSA oder KLH konjugiert, die zuvor entweder mit Sulfosuccinimidyl-4-(p-maleinimidphenyl)butyrat (Sulfo-SMPB) oder Sulfosuccinimdyl-4-(N-maleinimidmethyl)cyclohexan-1-carboxylat (Sulfo-SMCC) derivatisiert worden waren.
Eine wäßrige Lösung von Sulfo-SMPB oder Sulfo-SMCC (Pierce Chemicals) wurde einer Lösung von BSA oder KLH in 0,02 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) zugesetzt. Die Mischung wurde 45 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt und der aktivierte Träger sofort auf eine mit 0,1M Natriumphosphatpuffer (pH 6,0) bei 4ºC ins Gleichgewicht gebrachte Sephadex-Kolonne aufgebracht.
Die Fraktionen der ersten Peakabsorption (280 nm), die dem aktivierten Träger entsprachen, wurden in einem Rundbodenkolben kombiniert. Dazu gab man eine Lösung aus Peptid in 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 6,2). Die Mischung wurde gründlich mit N&sub2; gespült und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Verbindungseffizienz wurde mit einen ³H-markierten Peptid und durch Aminosäureanalyse des Konjugats überwacht.

Verfahren 7:

Nachweis von HIV-Antikörpern durch ELISA

Jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte wird mit 100 µl einer Lösung gesättigt, die ein Peptid oder eine Peptidmischung (5 µg/ml) enthält, und über Nacht stehen gelassen. Die Vertiefungen werden entleert und zweimal mit einem Waschpuffer (Tris 0,043M, NaCl 0,5M, Thimerosal 0,01 %, Tween 20 0,05 %, pH 7,4) gewaschen. Dann werden die Vertiefungen 1 Stunde bei 37ºC mit 0,35 ml Waschpuffer gesättigt und einmal mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die zu analysierenden Serumproben werden mit Probepuffer (Waschpuffer plus Kasein, 0,05 %) verdünnt. Die Proben werden vor der Zugabe der verdünnten Serumprobe (0,1 ml) mit Waschpuffer gespült. Dann läßt man diese 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubieren. Anschließend werden die Vertiefungen entleert, mit Waschpuffer zweimal schnell und dann einmal zwei Minuten lang gewaschen. Die Konjugatlösung (affinitätsgereinigte Ziegenantikörper an mit Peroxidase markiertem Human-IgG, 0,5 mg in 5 ml 50%igem Glycerol), die mit 1 % Rinderserumalbumin in Waschpuffer verdünnt ist, wird in jede Vertiefung gegeben (0,1 ml) und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend werden die Vertiefungen entleert und mit Waschlösung zweimal rasch und dann fünfmal gewaschen, während der Puffer pro Wäsche 2 Minuten mit der Vertiefung in Kontakt ist. Die Substratlösung (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, 8 mg pro ml DMSO) wird mit 100 Volumen 0,1M Citrat-Acetat- Puffer, pH 5,6, der 0,1 % 30%iges H&sub2;O&sub2; enthält, verdünnt und in jede Vertiefung gegeben (0,1 ml pro Vertiefung). Nach 10 Minuten wird der Inhalt jeder Vertiefung mit 0,1 ml 2N H&sub2;SO&sub4; behandelt und die optische Dichte bei 450 nm abgelesen. Sämtliche Bestimmungen werden doppelt ausgeführt.

Verfahren 8:

Herstellung von Peptidcocktails

Peptidcocktails werden durch Vermischen gleicher Volumen von zwei Peptidlösungen von je 10 µg/ml hergestellt. In einem Cocktail verwendet man die Peptide BCH-87c und BCH-202c; der andere ist eine Mischung aus BCH-87ck und BCH-202ck. Jeder Cocktail wird dazu verwendet, wie vorstehend beschrieben zwei Serien von Platten zu beschichten.

Claims

1. Im wesentlichen reines Peptid der Formel

in der

x unabhängig aus der aus

KILAVERYLKDQQLLGIWG (586-604)

KKILAVERYLKDQQLLGIWG (585-604),

diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-1-Isolate abgeleitet sind, sowie unter infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei solche Peptide durch mindestens ein Lysin in Position 586 oder Lysine in den Positionen 585 und 586 gekennzeichnet sind,

y, falls vorhanden, unabhängig aus der Gruppe gewählt ist, die aus

diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-1-Isolate abgeleitet sind, sowie infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen besteht,

e und f, falls vorhanden, unabhängig aus der aus einer Aminosäuresequenz eines beliebigen Epitops des Bereiches, der sich über die Aminosäuren 586 bis 629 des gp41 von HIV-1 erstreckt, oder des Bereiches, der sich über die Aminosäuren 578 bis 613 des gp36 des HIV-2 erstreckt, diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-1- oder HIV-2- Isolate abgeleitet sind, infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen und jeglichen Kombinationen dieser Epitope bestehenden Gruppe ausgewählt sind,

a ein Aminoterminus oder ein Substituent ist, der als Kupplungsmittel wirkt und/oder der das Peptid als Immundiagnostikum besser geeignet macht, ohne dessen antigene Eigenschaften zu verändern, und

b ein Carboxyterminus oder ein Substituent ist, der als Kupplungsmittel wirkt und/oder der das Peptid als Immundiagnostikum besser geeignet macht, ohne dessen antigene Eigenschaften zu verändern.

2. Im wesentlichen reines Peptid der Formel

in der

x' unabhängig aus der aus

KVTAIEKYLQDQARLNSWG (578-596)

KKVTAIEKYLQDQARLNSWG (577-596),

diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-2-Isolate abgeleitet sind, sowie unter infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei solche Peptide durch mindestens ein Lysin in Position 577 oder Lysine in den Positionen 577 und 578 gekennzeichnet sind,

y', falls vorh en, unabhängig aus der Gruppe gewählt ist, die aus

diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-2-Isolate abgeleitet sind, sowie infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzenzen besteht,

3. Peptid gemäß Anspruch 1, bei dem x für KILAVERYLKDQQLLGIWG und y für TTAVPWNAS steht und e und f fehlen.

4. Peptid gemäß Anspruch 1, bei dem x für KKILAVERYLKDQQLLGIWG und y für TTAVPWNAS steht und e und f fehlen.

5. Peptid gemäß Anspruch 1, bei dem x für KILAVERYLKDQQLLGIWG, y für TTAVPWNAS und f für SGKLI steht und e fehlt.

6. Peptid gemäß Anspruch 2, bei dem x' für KVTAIEKYLQDQARLNSWG und y' für HTTVPWVNDS steht und e und f fehlen.

7. Peptid gemäß Anspruch 2, bei dem x' für KKVTAIEKYLQDQARLNSWG und y' für HTTVPWVNDS steht und e und f fehlen.

8. Peptid gemäß Anspruch 2, bei dem x' für KVTAIEKYLQDQARLNSWG, y' für HTTVPWVNDS und f für AFRQV steht und e fehlt.

9. Im wesentlichen reines Peptid der Formel

in der

x² unabhängig aus der aus

diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-1-Isolate abgeleitet sind, sowie unter infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist,

y, falls vorhanden, unabhängig aus der Gruppe gewählt ist, die aus

e und f unabhängig unter WGCAF, KD, SGKL, LEQD, LKDQ, CSGKLI, SGKLI und AFRQV ausgewählt sind, und mindestens eines von e und/oder f im Peptid vorhanden ist,

10. Im wesentlichen reines Peptid der Formel

in der

x³ unabhängig aus der aus

diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenze n, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-2-Isolate abgeleitet sind, sowie unter infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist,

y', falls vorhanden, unabhängig aus der Gruppe gewählt ist, die aus

diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-2-Isolate abgeleitet sind, sowie infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen besteht,

11. Gemisch, enthaltend zwei oder mehr aus der aus Peptiden eines der Ansprüche 1, 2, 9 und 10 bestehenden Gruppe ausgewählte Peptide.

12. Gemisch nach Anspruch 11, welches mindestens das folgende Peptid enthält:

sowie diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-1-Isolate abgeleitet sind, sowie unter infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei solche Aminosäuresequenzen durch mindestens ein Lysin in Position 586 gekennzeichnet sind.

13. Gemisch nach Anspruch 11, welches mindestens das folgende Peptid enthält:

sowie diesen Sequenzen entsprechenden Aminosäuresequenzen, wobei die Aminosäuresequenzen von homologen Regionen anderer HIV-2-Isolate abgeleitet sind, sowie unter infolge konservativer Substitutionen von diesen Sequenzen abweichenden Aminosäuresequenzen bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei solche Aminosäuresequenzen durch mindestens ein Lysin in Position 578 gekennzeichnet sind.

14. Gemisch nach Anspruch 11, welches mindestens das folgende Peptid enthält:

15. Gemisch nach Anspruch 11, welches mindestens das folgende Peptid enthält:

16. Vorrichtung zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern, die aus der aus HIV-1- Antikörpern, HIV-2-Antikörpern und deren Mischungen bestehenden Gruppe gewählt sind, in einem Analyten, wobei die Vorrichtung durch ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder ein Gemisch gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15 gekennzeichnet ist.

17. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern, die aus der aus HIV-1- Antikörpern, HIV-2-Antikörpern und deren Mischungen bestehenden Gruppe gewählt sind, in einem Analyten, welches den Schritt des In-Kontakt-bringens eines Aliquots des Analyten mit einem Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder mit einem Gemisch gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15 umfaßt.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, ausfgewählt aus der aus ELISA, Hämagglutination, dem Single-dot- oder dem Multi-dot-strip-Testverfahren (Einpunkt- oder Mehrpuhkt-Streifen- Verfahren) bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

19. Antikörper, der gegen ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 - 10 oder eine Mischung derselben gerichtet ist.

20. Antikörper gemäß Anspruch 19, wobei es sich um einen monoklonalen Antikörper oder eine Mischung monoklonaler Antikörper handelt.

21. Vorrichtung zum Nachweis der Anwesenheit von Antigenen, die aus der aus HIV-1-Antigenen, HIV-2-Antigenen und deren Mischungen bestehenden Gruppe ausgewählt sind, in einem Analyten, wobei die Vorrichtung durch einen Antik:rper gemäß einem der Ansprüche 19 oder 20 gekennzeichnet ist.

22. Verfahren zum Nachweis der Anwesenheit von Antigenen, die aus der aus HIV-1-Antigenen, HIV-2-Antigenen und deren Mischungen bestehenden Gruppe gewählt sind, in einem Analyten, welches den Schritt des In-Kontakt-bringens eines Aliquots des Analyten mit einem Antikörper gemäß Anspruch 19 oder 20 umfaßt.

23. Pharmazeutisch geeignete Zubereitung, welche ein Peptid gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10 oder ein Gemisch gemäß einem der Ansprüche 11 bis 15 enthält, wobei das Peptid oder die Mischung in der Zubereitung in einer Menge enthalten ist, die in einem mit der Zubereitung behandelten Säuger, einschließlich des Menschen eine ausreichende Bildung von Antikörpern bewirkt, um den behandelten Säuger eine Zeit lang vor HIV-1- oder HIV-2-Virusinfektionen zu schützen.

24. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 23, welche einen physiologisch annehmbaren Träger enthält.

25. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 23, welche ein Adjuvans oder einen Verstärker der Immunantwort enthält.

26. Pharmazeutische Zubereitung gemäß Anspruch 23, welche ein zweites Antigen gegen ein anderes Pathogen als den HIV-1- oder HIV-2-Virus enthält, wobei das zweite Antigen in der Zubereitung in einer Menge enthalten ist, die eine ausreichende Bildung von Antikörpern bewirkt, um den behandelten Säuger eine Zeit lang vor Infektionen durch dieses Pathogen zu schützen.

27. Verfahren zum Schützen eines Säugers, einschließlich des Menschen, vor Infektionen mit HIV-1 oder HIV-2 oder Coinfektionen mit HIV-1 oder HIV-2 und einem anderen Pathogen, umfassend die Behandlung des Säugers mit einer pharmazeutischen Zubereitung gemäß einem der Ansprüche 23 bis 26.