DE69128628T2 - Oligo(alpha-arabinofuranosyl nukleotide) und entsprechende alpha-arabinofuranosyl vorläufer - Google Patents

Description

Gebiet der Erfindung
• Die Erfindung betrifft Oligonudeotide, die a-D-Arabinofuranosylnucleoside umfassen, und die Verwendung dieser neuen Zusammensetzungen für diagnostische und chemotherapeutische Zwecke.
Stand der Technik
• Oligonucleotide eignen sich als diagnostische Sonden zum Nachweis von "Zielt"-DNA- oder -RNA-Sequenzen. Eine Sonde enthält im allgemeinen eine Sequenz einer Ribo- oder. Desoxyribonucleinsäure, die zur Zielsequenz komplementär ist&sub1; und eine Nachweiseinrichtung. Eine Sonde, in der die Nucleotide der Sequenz anstelle von Ribose natürliche ß-Arabinose enthalten, wird zusammen mit einem Verfahren, die sich eines anti-Arabinose-Antikörpers als Nachweiseinrichtung bedient, von R. M. Mccormick im US-Patent 4 760 017 (Anmeldetag 23.12.1985, Ausgabetag 26.07.1988) vorgeschlagen.
• Oligonudeotide können auch als chemotherapeutische Mittel zur Bekämpfung der Expression von Gensequenzen, die für einen eindringenden Organismus, wie ein Virus, einen Pilz oder ein Bakterium, charakteristisch sind, verwendet werden. In der Natur wird ein Teil der RNA-Expression durch Bakterien-"antisense"-PNA gesteuert, die ihre Wirkung durch Bildung von PNA:RNA-Hybriden mit komplementären Ziel-RNAS und durch Modulation oder Inaktivierung von deren biologischer Aktivität ausübt. Verschiedene neuere untersuchungen unter Verwendung von Plasmidvektoren zur Einführung von antisense-RNAs in eukaryontische Zellen haben gezeigt, daß sie in wirksamer Weise die Expression von MRNA-Zielen in vivo hemmen; vgl. P. J. Green et al., Ann. Rev. Biochem., Bd. 55 (1986), 5. 569-597. Ferner kann eine spezifische mRNA unter einer großen Anzahl von MRNAS selektiv für die Proteinsynthese inaktiviert werden, indern man eine Hybridisierung mit einem komplementären DNA-Restriktionsfragment durchführt, das an die mRNA bindet und deren Transiation zu Protein an den Ribosomen verhindert; vgl. B. M. Paterson et al., Proc. Natl.. Acad. Sci., Bd. 74 (1977), S. 4370-4374; und N. D. Hastie et al., Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 75 (1978), S. 1217-1221.
• Es wurde gezeigt, daß eine geeignete kleine antisense-Oligonucleotid-Sonde die Replikation von Rous-Sarcoma-Virus (RSV) in Zellkultur hemmen kann; vgl. P. C. Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75 (1978), S. 280. Ferner wurde gezeigt, daß die virale RSV-RNA-Translation unter diesen Bedingungen gehemmt wird; vgl. Stephenson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75 (1978), S. 285-288. Außerdem wurde gezeigt, daß Oligonudeotide, die komplementär zu einer MRNA-Spleiß-Akzeptorstelle im HIV-Virusgenom (Verursacher von AIDS) komplementär sind, zur Hemmung der Expression und Replikation in Zellkultur befähigt sind; vgl. P. C. Zamecnik et al.&sub1; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 83 (1986), S. 4143; Goodchild et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 85 (1988), S. 5507- 5511.
• Ungeladene Methylphosphonat-oligodesoxynucleotide mit einer Sequenz, die komplementär zu den Initiationscodonregionen von Kaninchen-Globin-m-RNA ist, hemmte die Translation der mRNA sowohl in zellfreien Systemen als auch in Kaninchen-Reticulozyten; vgl. K. R. Blake et al., Biochemistry, Bd. 24 (1985), S. 6139-6145. Ein weiteres ungeladenes Methylphosphonat-oligonucleotid-Analoges, eine 8-Nucleotidsequenz, die zur Akzeptor-Spleißverknüpfung einer mRNA von Herpes simplex-Virus, Typ I, komplementär ist, kann die Virusreplikation in intakten Vero-Zellen hemmen. Jedoch waren recht hohe Konzentrationen (> 25 uM) dieser nicht-ionogenen Sonde für diese Hemmung erforderlich.
• Bei Untersuchungen der Eigenschaften von Oligomeren, die aus den α- Desoxyanomeren der natürlichen β-Desoxynucleoside zusammengesetzt sind, wurde gezeigt, daß Oligo-(α-thymidylat) an Polyadenylat viel stärker als das natürliche β-Oligomere bindet; vgl. N. T. Thuong et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 84 (1987), S. 5129-5133. Dieses α-Desoxyoligomere ist auch stark Nuclease-beständig; vgl. C. Cazenave et al., Nucleic Acids Res., Bd. 15 (1987), S. 10507-10521. Von einem weiteren α-Oligomeren, α- Desoxy-(G&sub2;T&sub1;&sub2;G&sub2;) wurde gezeigt; daß es an (dA)12 mit einem Tm-Wert von 53º bindet, während das entsprechende Oligo-(β-anomere) mit einem Tm-Wert von 27º bindet;- vgl. C. Gagnor et al., Nucleic Acids Res., Bd. 15 (1987), S. 10419-10436. Ferner bindet das antisense-α-Oligodesoxynucleotid parallel zum sense-Strang; vgl. J. Sun et al., Nucleic Acids Res., Bd. 15 (1987), S. 6149-6158; und F. Morvan et al., Nucleic Acids Res., Bd. 15 (1987), S. 7027-7044. Während jedoch α-Desoxyribofuranoside eine Nuclease-Resistenz bewirken und eine größere Hybridstabilität besitzen als die entsprechenden β-Oligomeren, sind sie sehr schwierig zu synthetisieren, da die α-Anomeren der Desoxynudeoside aus natürlichen Quellen nicht isoliert werden können und ihre synthetische Herstellung schwierig und teuer ist.
• Daher blieb die Schwierigkeit bestehen, leicht synthetisierbare Ohgonudeotide aufzufinden, die Nudease-beständig sind, eine Hybridstabilität besitzen und einen verbesserten Hybridisierungswirkungsgrad aufweisen.
Zusammenfassende Darstellung der Erfindung
• Die Erfindung betrifft funktionalisierte α-D-Arabinofuranosylnucleoside und -nucleotide, aus α-D-Arabinofuranosylnucleosid-Monomereinheiten gebildete Oligonucleotide und aus α-D-Arabinofuranosylnucleosid-Monomereinheiten gebildete Oligonucleotide, bei denen eine oder mehrere der Einheiten funktionalisiert sind, sowie die Verwendung dieser neuen Zusammensetzungen für diagnostische und chemotherapeutische Zwecke.
• Die α-D-Arabinofuranosylnucleoside und -nudeotide der Erfindung werden durch die Formel Ia wiedergegeben:
• Die erfindungsgemäßen Oligomeren werden durch die folgende Formel Ib wiedergegeben:
• Die Symbole in diesen Formeln haben die nachstehend angegebenen Bedeutungen:
• B bedeutet eine Nucleotidbase, wobei es sich im Fall der Oligomeren der Formel Ib sich entweder in sämtlichen Einheiten des Oligomeren um die gleiche Base handelt oder diese Base von einer Einheit zur nächsten variiert.
• R¹ bedeutet entweder Wasserstoff oder eine reaktive Gruppe, die eine Internucleotidbindung bilden kann.
• R² bedeutet entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe.
• R³ bedeutet entweder Wasserstoff oder eine Schutzgruppe.
• R bedeutet Phosphat, Thiophosphat, Phosphoramidat oder Alkanphosphonat und ist entweder in allen Nudeotideinheiten gleich oder variiert von einer Einheit zur nächsten, wobei es sich vorzugsweise um Monophosphat handelt.
• t hat den Wert 0 oder 1 und ist entweder in allen Nudeotideinheiten gleich oder variiert von einer Einheit zur nächsten, mit der Maßgabe, daß t bei mindestens einer der Nudeotideinheiten 1 ist, einschließlich Oligonucleotide, bei denen t an mindestens einer der Einheiten den Wert hat, sowie Oligonudeotide, bei denen t an sämtlichen Einheiten den Wert 1 hat.
• W bedeutet eine chemische Verknüpfungsgruppe.
• A bedeutet einen Interkalator, ein Vernetzungsmittel, eine Gruppe, die doppelsträngige DNA binden kann, eine Reportergruppe oder eine Gruppe, die eine oder mehrere Reportergruppen binden kann.
• n ist eine ganze Zahl mit einem Wert von mehr als 1, die die Anzahl der Einheiten des Oligomeren wiedergibt, und hat vorzugsweise einen Wert von 5 bis 2000 und insbesondere von 10 bis 100.
• Bevorzugte Beispiele für reaktive Gruppen, die sich für die Bildung der Internucleotidbindung eignen, sind phosphorhaltige Gruppen, wie Phosphat, Diphosphat, Triphosphat, Thiophosphat, Alkylphosphochloridite, Alkylphosphoramidite, Alkanphosphonate und aktivierte Phosphatdiester. Beispiele für Schutzgruppen sind Trityl, Methoxytrityl, Dimethoxytrityl, 9- Phenylxanthen-9-yl, Benzoyl, Isobutyryl und Acetyl. Beispiele für weitere Gruppen innerhalb dieser Definitionen sind nachstehend aufgeführt.
• Zu der Erfindung gehört der Befund, daß die Monomereinheiten eine stark selektive Verkappungsreaktion in der 2'-Stellung des α-D-Arabinofuranosylrings ausüben, wenn sowohl die 2'-Stellung als auch die 3'-Stellung freiliegen, was die entsprechende Derivatbildung der Einheiten zur Verwendung bei der Oligonucleotidsynthese erleichtert.
• Die Oligonudeotide eignen sich zur Identifizierung, Isolierung, Lokalisierung und/oder zum Nachweis von in Frage stehenden komplementären Nucleinsäuresequenzen in zellfreien Systemen oder in Zeilsystemen. Daher stellt die Erfindung ferner ein Verfahren zur Identifizierung von Zielnucleinsäuresequenzen bereit, wobei das Verfahren die Verwendung einer Oligonucleotidsonde, die mindestens einen markierten α-Arabinofuranosylnucleotidrest enthält, umfaßt.
• Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide eignen sich auch als chemotherapeutische Mittel zur Bekämpfung der Expression von Gensequenzen oder zur Hemmung der mRNA-Translation.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
• Die erfindungsgemäßen Monomereinheiten und Oligomeren enthalten α-D- Arabinofuranosylstrukturen anstelle der in RNA und DNA natürlich vorkommenden β-D-Ribo- oder 2'-Desoxy-β-D-ribonucleoside. Sie enthalten ferner die α-Verknüpfung zwischen dem Zucker und der heterocyclischen Base des Nucleosids, was den Oligonudeotiden eine Nuclease-Resistenz und eine feste komplementäre Strangbindung verleiht.
• Geeignete Nucleotidbasen im Rahmen von B in den Formeln Ia und Ib sind solche, die einer Hybridisierung zugänglich sind. Bei diesen Nucleotidbasen kann es sich somit um Purine, Pyrimidine und Analoge von Purinen und Pyrimidinen handeln, wie 3- und 7-Desazapurine und Pyrazolo{3,4-d}pyrimidine. Es können jedoch auch andere Nucleotidbasen verwendet werden. Insbesondere können beliebige Basen, die einer Hybridisierung mit DNA oder RNA zugänglich sind, verwendet werden. Beispiele für Nucleotidbasen, die dieser Beschreibung entsprechen, sind Adenin-9-yl, Guanin-9-yl, 7- subst.-7-Desazaadenin-9-yl, 7-subst.-7-Desazaguanin-9-yl, 8-subst.- Adenin-9-yl, 8-subst.-Guanin-9-yl, Thymin-1-yl, Uracil-1-yl, Gytosin-1- yl, 5-subst.-Uracil-1-yl, 5-subst.-Gytosin-1-yl, 3-.subst.-4-Aminopyrazolo{3,4-d}pyrimidin-1-yl und 3-subst.-6-Amino-4-oxopyrazolo{3,4-d}pyrimidin-1-yl. Bevorzugte Basen sind Adenin, Guanin, Thymin, Gytosin und Uracil.
• Wie vorstehend angegeben, umfaßt die Definition von R¹ in der Formel Ia reaktive Gruppen, die zur Bildung von Internucleotidbindungen geeignet sind. Bei diesen reaktiven Gruppen handelt es sich um Gruppen, deren Einsatz während der Kettenerweiterung bei der Synthese eines Oligonucleotids möglich ist. Reaktive Gruppen, die sich diesbezüglich besonders gut eignen, sind phosphorhaltige Gruppen. Beispiele hierfür sind Alkylphosphorchloridite, Alkylphosphoramidite und aktivierte Phosphatdiester.
• Die Definitionen von R² und R³ umfassen Schutzgruppen, bei denen es sich um Gruppen handelt, die den Sauerstoff, an den sie gebunden sind, vor anderen Reaktionen als zur Entfernung dieser Gruppen schützen. Beispiele hierfür sind nachstehend aufgeführt.
• Die funktionelle Gruppe A in den Formeln Ia und Ib ist so definiert, daß sie Interkalatoren, Vernetzungsmittel, Reportergruppen, Gruppen die eine oder mehrere Reportergruppen binden können und Gruppen, die doppelsträngige DNA binden können, umfaßt.
• Bei Interkalatoren handelt es sich um planare, aromatische, bi-, tri- oder polycyclische Moleküle, deren Abmessungen grob den Abmessungen eines Purin-Pyrimidin-Paars entsprechen und die sich in einer doppelsträngigen Nucleinsäure-Helix zwischen zwei benachbarte Basenpaare einordnen können. Interkalatoren werden zur Herbeiführung von Leserastermutationen ("frameshift") in DNA und RNA verwendet. Es wurde auch gezeigt, daß dann, wenn ein Interkalator kovalent über einen Linkerarm an das Ende eines Desoxyoligonucleotids gebunden ist, der Interkalator die Bindungsaffinität des Oligonucleotids für seine Zielsequenz erhöht, was zu einer stark erhöhten Stabilität des komplementären Sequenzkomplexes führt. Einige gebundene Interkalatoren schützen auch das Oligonucleotid gegen Exonucleasen, wenngleich nicht gegen Endonudeasen; vgl. J.-S. Sun et al., Nucleic Acids Res., Bd. 15, S. 6149-6158; und T. L. Doan et al., Nucleic Acids Res., Bd. 15, S. 7749-7760. Beispiele für interkalierende Mittel, die angebunden werden können, sind Oxazolopyridocarbazol, Acridinorange, Proflavin, Acriflavin und Derivate von Proflavin und Acridin, wie 3-Azido-6-(3-brompropylamino)-acridin, 3-Amino-6-(3-brompentylamino)- acridin und 3-Methoxy-6-chlor-9-(5-hydroxypentylamino)-acridin.
• Funktionelle Gruppen, die Vernetzungsmittel darstellen, erfüllen in den erfindungsqemäßen Spezies verschiedene Funktionen. Bei chemotherapeutischen Anwendungen können die erfindungsgemäßen Oligonucleotide beispielsweise zur Erhöhung des Wirkungsgrads der mRNA-Translationshemmung oder der Genexpressionskontrolle verwendet werden. Die Oligonucleotide bewirken dies, indem sie eine irreversibleschädigung in einer komplementären Zielsequenz herbeiführen. Dies wird durch kovalente Verknüpfung von Vernetzungsmitteln mit dem Oligonucleotid erreicht, wobei die Vernetzungsmittel zur Herbeiführung von Kettenbrüchen in der komplementären Sequenz befähigt sind. Brüche in der Sequenzkette können auch durch andere funktionelle Gruppen hervorgerufen werden, insbesondere durch Reste, die zur Bildung von Komplexen von Metallen, die Hydroxylreste erzeugen, befähigt sind.
• Es können verschiedene Vernetzungsmittel verwendet werden. Ein Beispiel für einen Typ von Vernetzungsmitteln, die Kettenbrüche hervorrufen, sind Mittel, die dies bewirken, wenn sie alkalischen Bedingungen ausgesetzt werden, beispielsweise durch Behandlung mit Piperidin. Zu Beispielen hierfür gehören α-Halogencarbonylverbindungen, 2-Chlorethylamine und Epoxide. Diese und weitere Beispiele für Vernetzungsmittel, die eine ähnliche Funktion ausüben, werden beschrieben von: D. G. Knorre et al., Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, Bd. 32 (1985), S. 291-320; und C. Hélène et al., Molecular Mechanisms of Carcinogenic and Antitumor Activity, Hrsg. Chagas and Pullman, Adenine Press, S. 205-222.
• Die Verwendung von Reportergruppen oder Gruppen, die zur Bindung an eine oder mehrere Reportergruppen befähigt sind, als funktionelle Gruppe A erfolgt, wenn die erfindungsgemäßen α-Arabinofuranosyloligonucleotide als Sonden in Nucleinsäuretests dienen. Diese Gruppen erweisen sich als wirksam beim Nachweis des Vorhandenseins von hybridisierbaren Polynucleotiden.
• Bei Reportergruppen handelt es sich um Gruppen, die eine physikalische oder chemische Eigenschaft besitzen, die gemessen oder nachgewiesen werden kann. Die Nachweisbarkeit kann durch eine Eigenschaft, wie Farbveränderung, Lumineszenz, Fluoreszenz oder Radioaktivität, erreicht werden, oder sie kann durch die Fähigkeit der Reportergruppe, als Ligandenerkennungsstelle zu dienen, erzielt werden.
• Beispiele für Reportergruppen die die Radioaktivität ausnutzen, sind Gruppen mit ³H-, ¹²&sup5;I-, ³&sup4;S-, ¹&sup4;C- oder ³²P-Atomen. Weitere Beispiele für Reportergruppen sind Fluorophore, chemilurnineszierende Mittel, Enzyme oder Enzymsubstrate. Weitere Typen von Reportergruppen sind solche, die Liganden umfassen, die an Antiliganden binden, wie Antikörper oder andere Spezies, die zur Bildung eines Ligand-Antiligand-Komplexes befähigt sind, wobei der Antiligand entweder von Natur aus nachweisbar ist oder kovalent an eine Markierung gebunden ist, die zur Emission eines nachweisbaren Signals befähigt ist, wie ein Fluorophor, ein chemilumineszierendes Mittel, ein Enzym oder dergl. Liganden und Antiliganden können stark variieren. Sofern ein Ligand einen natürlichen "Antiliganden" besitzt, nämlich Liganden, wie Biotin, Thyroxin und Cortisol, kann er in Verbindung mit seinem markierten, natürlich vorkommenden Antiliganden verwendet werden. Alternativ können beliebige haptenische oder antigene Verbindungen in Kombination mit einem in geeigneter Weise markierten Antikörper verwendet werden. Ein bevorzugtes Markierungsverfahren bedient sich Biotin-markierter Analoger von Oligonudeotiden; vgl. P. Langer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 78 (1981), S. 6633-6637.
• Die optimale Wahl einer Reportergruppe für eine spezielle Anwendung und das Verfahren zum direkten oder indirekten Anbringen dieser Gruppe hängt von verschiedenen Erwägungen ab, wozu die erforderliche Empfindlichkeit, die einfache Konjugation mit der Sonde, Stabilitätsanforderungen und die verfügbaren Gerätschaften gehören.
• Hauptsächliche Beispiele für Enzym-Reportergruppen sind Hydrolasen, insbesondere Phosphatasen, Esterasen, Ureasen und Glycosidasen, oder Oxidoreduktasen, insbesondere Peroxidasen. Beispiele für fluoreszierende Verbindungen sind Fluorescein und dessen Derivate, Rhodamin und dessen Derivate, Dansyl und Umbelliferon. Beispiele für chemilumineszierende Verbindungen sind Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazindione, wie Luminol.
• Bekannte Beispiele für Gruppen, die zur Bindung an eine oder mehrere Reportergruppen befähigt sind, sind Gruppen mit nudeophilen Eigenschaften. Beispiele für derartige Gruppen sind solche mit aliphatischen oder aromatischen Amingruppen, Carboxylgruppen, Hydroxylgruppen und dergl.
• Beispiele für Gruppen, die zur Bindung an doppelsträngige DNA befähigt sind, sind Antikörper mit Antikörperbindungsstellen, die für doppelsträngige DNA spezifisch sind. Derartige Gruppen sind aus dem Stand der Technik ebenfalls bekannt und erfüllen verschiedene Aufgaben.
• Die Menge der in der Hybridisierungslösung vorhandenen markierten Sonde kann stark variieren, und zwar je nach der Art der Markierung, der Menge der markierten Sonde, die vernünftigerweise an eine zelluläre Zielnucleinsäure binden kann, und der genauen Stringenz des Hybridisierungsmediums und/oder des Waschmediums. Im allgemeinen wird die Sonde im erheblichen Überschuß im Vergleich zur stöchiometrischen Menge des Ziels eingesetzt, um die Bindungsrate der Sonde an die Zielnudeinsäuren zu erhöhen.
• Der in den Formeln Ia und Ib durch W wiedergegebene chemische Verknüpfungsarm verstärkt die Fähigkeit der funktionellen Gruppe A zur Wechselwirkung mit beliebigen der verschiedenen Spezies, mit denen er zur Ausübung seiner Funktion in Wechselwirkung treten muß. Zu diesen Spezies gehören, wie vorstehend angegeben, Antikörper, Detektorproteine oder chemische Reagenzien. Der Verknüpfungsarm hält die funktionelle Gruppe in einem geeigneten Abstand von der Base, wenn die Base mit einer anderen Base in der doppelsträngigen Formation gepaart ist. Zu Linkerarmen können folgende Gruppen gehören: Alkylengruppen mit 1 bis 12 Kohlenstoffatomen, Alkenylengruppen mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 olefinischen Bindungen, Alkinylengruppen mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen und 1 oder 2 acetylenischen Bindungen oder derartige Gruppen, die an einem terminalen Ende mit einer nucleophilen Gruppe, z. B. einer Oxy-, Thio-, Amino-, Carbonyl-, Amido- oder Epoxygruppe, substituiert sind. Derartige funktionelle Gruppen, zu denen aliphatische oder aromatische Amine gehören, weisen nudeophile Eigenschaften auf und können als Verknüpfungspunkt für die funktionelle Gruppe A dienen. Gruppen, wie die Malonamidogruppe kommen ebenfalls erfindungsgemäß als Verknüpfungsarm in Frage.
• Bevorzugte Verknüpfungsarme enthalten Kohlenstoffketten mit einer Länge von mindestens drei Kohlenstoffatomen. Bei der terminalen nucleophilen Gruppe handelt es sich vorzugsweise um eine Amino- oder Amidogruppe.
• Der Verknüpfungsarm ist vorzugsweise an die Nucleotidbase in der 8- Stellung, wenn B ein Purin ist; in der 5-Stellung, wenn B ein Pyrimidin ist; in der 3-Stellung, wenn B ein 3-Desazapurin ist; in der 7-Stellung, wenn B ein 7-Desazapurin ist; oder in der 3-Stellung, wenn B ein Pyrazolo{3,4-d}pyrimidin ist, gebunden. Somit ist bei Strukturen unter Verwendung der fünf üblichen Basen für Nudeotide, bei denen B Adenin oder Guanin bedeutet und t den Wert 1 hat, W in der 8-Stellung von B gebunden; für Nudeotide, bei denen B Cytosin oder Uracil bedeutet und t denn Wert 1 hat, W in der 8-Stellung von B gebunden. Nudeotide, bei denen B Thymin bedeutet, enthalten im allgemeinen keinen Verknüpfungsarm und in entsprechender Weise keine funktionelle Gruppe A.
• Bei bevorzugten erfindungsgemäßen Oligonucleotiden gemäß der Formel Ib handelt es sich um solche, bei denen t in mindestens einer monomeren Nucleotideinheit den Wert 1 hat und das Oligomere ferner Monomereinheiten enthält, in denen t den Wert 0 hat. Bei bevorzugten Oligonudeotiden handelt es sich um solche mit 1 bis 20 Einheiten, bei denen t den Wert 1 hat, wobei zusätzliche Einheiten, in denen t den Wert 0 hat, den Rest bilden.
• Das Produkt der Formel Ia kann nach bekannten Verfahren aus bekannten Ausgangsmaterialien hergestellt werden. Ferner können die Ausgangsmaterialien selbst nach in der Literatur beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise läßt sich 9-(α-D-Arabinofuranosyl)-adenin nachdem Verfahren von Bristow und Lythgoe, J. Chem. Soc., (1949), S. 2306-2309 herstellen. Die Herstellung von 9-(α-D-Arabinofuranosyl)-guanin und -isoguanin wird von W. W. Lee et al., J. Med. Chem., Bd. 14 (1971), S. 819-823 beschrieben. Die Herstellung von 1-(α-D-Arabinofuranosyl)-uracil und -thymin wird von Nishimura und Shimizu, Chem. Pharm. Bull., Bd. 13 (1965), S. 803-810 beschrieben. Die Herstellung von 1-(α-D-Arabinofuranosyl)-cytosin wird von Montgomery und Thomas, J. Heterocyclic Chem., Bd. 16 (1979), S. 353-357 beschrieben.
• Schutzgruppen werden in diese Ausgangsmaterialien nach herkömmlichen Verfahren eingeführt. Die gebildeten Zwischenprodukte werden zur Verwendung bei der Synthese von Oligonudeotiden aktiviert. Die Umwandlung der Zwischenprodukte in geschützte, aktivierte Formen wird nach Verfahren erreicht; die analog zu Verfahren verlaufen, die ausführlich für 2'-Desoxynucleoside in verschiedenen Übersichtsartikeln beschrieben sind; vgl. beispielsweise Sonveaux, Bioorganic Chemistry, Bd. 14 (1986), S. 274-325; R. A. Jones, Oligonudeotide Synthesis, A Practical Approach, Hrsg. M. J. Gait, IRL Press, (1984), S. 23-34.
• Ein Reaktionsschema, bei dem Thymin die Base B bedeutet, ist nachstehend als Schema 1 wiedergegeben. Es ist darauf hinzuweisen, daß es sich beim Ausgangsnucleosid II zur bequemeren Darstellung der reaktiven Teile des Moleküls um eine umgedrehte Ansicht der Formel Ia handelt. Schema 1
• Wie vorstehend in Schema 1 dargestellt, wird das Nucleosid (II) mit 1,3-Dichlor-1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (TIPSYL Cl) behandelt, wodurch man das 3',5'-cyclische Disiloxan (III) erhält, das sodann mit Benzoylchlorid (BzCl) unter Bildung des 2'-O-Benzoats (IV) behandelt wird. Die Behandlung mit Fluoridionen ergibt die desylilierte Verbindung (V). Durch Tritylierung der 5'-OH-Gruppe erhält man das 2',5'-geschützte Nucleosid (VI). Wenn B Adenin oder Cytosin bedeutet, müssen die Nucleoside auch am Amin der Base geschützt werden. Daher werden derartige Nucleoside benzoyliert. Guanin erfordert eine Isobutyryl-Schutzgruppe, so daß, wenn B Guanin bedeutet, das Benzoylderivat mit Isobutyrylchlorid umgesetzt wird. In der letzten Stufe im Schema 1 ergibt die Phosphitylierung der 3'-OH-Gruppe das Reagenz (VII), das für die direkte Verwendung in einem automatisierten DNA-Synthesegerät fertiggestellt ist.
• Die neuartige Umsetzung, die einen Aspekt der vorliegenden Erfindung bildet, ermöglicht es, das gleiche Produkt durch ein alternatives Reaktionsschema zu erhalten, bei dem nicht die Herstellung eines 3',5'-cyclischen Disiloxan-Zwischenprodukts beteiligt ist, so daß zwei Stufen entfallen. Bei dieser neuartigen Umsetzung handelt es sich um eine Verkappungsreaktion eines α-D-Arabinofuranosylnucleotids mit freiliegenden Hydroxylgruppen in den 2'- und 3'-Stellungen. Es wurde festgestellt, daß die Umsetzung selektiv an der 2'-Stellung erfolgt.-Ein Nucleotid der Formel
• in der
• B eine Nucleotidbase bedeutet;
• W eine Verknüpfungsgruppe bedeutet;
• A einen Bestandteil aus der aus Interkalatoren, Vernetzungsmitteln, Gruppen, die doppelsträngige DNA binden können, Reportergruppen und Gruppen, die eine oder mehrere Reportergruppen binden können, bestehenden Gruppe bedeutet;
• t 0 oder 1 ist; und
• Pr¹ eine Schutzgruppe bedeutet; wird mit einem Verkappungsmittel umgesetzt, bei dem es sich um eine Pr²-haltige Verbindung handelt, die zur Bindung der Pr²-Gruppe, die ebenfalls eine Schutzgruppe darstellt, an ein Hydroxyl-Sauerstoffatom befähigt ist, mit dem Ergebnis, daß selektiv das folgende Produkt gebildet wird:
• Die Ausdrücke "verkappen" und "schützen" werden in der vorliegenden Beschreibung in austauschbarer Weise verwendet und sollen eine dauerhafte Bindung einer Spezies sowie die Bindung einer Spezies, die leicht durch eine anschließende Behandlung entfernt werden kann, gemäß dem Fachmann bekannten Verfahren umfassen. Bei den Verkappungs- oder Schutzgruppen handelt es sich um beliebige Atome oder Gruppen, die zu einer Blockierung des Hydroxyl-Sauerstoffatoms dienen und diese somit vor anderen Reaktionen schützen. Somit dient beispielsweise eine Verkappung in der 2'-Stellung zur Einschränkung von Reaktionen, wie einer Phosphitylierung und Kettenerweiterung bei der Bildung von Oligonudeotiden mit der ungeschützten Hydroxylgruppe in der 3'-Stellung.
• Verschiedene Schutzgruppen und reaktive Mittel, die diese in einer zur Verknüpfung mit einem Hydroxyl-Sauerstoffatom geeigneten Form enthalten, sind bekannt. Beispiele, die erfindungsgemäß für die vorstehende Formel und die Formel Ia (in der die Schutzgruppen unter die Definition von R² und R³ fallen) von besonderem Interesse sind, sind Trityl, Methoxytrityl, Dimethoxytrityl, 9-Phenylxanthen-9-yl, Benzoyl, Isobutyryl und Acetyl. Bevorzugte Schutzgruppen im Rahmen von Pr¹ sind Trityl, Methoxytrityl (insbesondere 4-Methoxytrityl), Dimethoxytrityl (insbesondere 4,4'-Dimethoxytrityl), 9-Phenylxanthen-9-yl, Benzoyl und Isobutyryl. Bevorzugte Gruppen im Rahmen von Pr² sind Benzoyl und Isobutyryl. Insbesondere bevorzugt für Pr¹ sind 4,4'-Dimethoxytrityl und 9-Phenylxanthen-9- yl. Im Rahmen von Pr² werden Benzoyl und Isobutyryl besonders bevorzugt.
• Die zweckmäßigsten und am weitesten verbreiteten reaktiven Vorläufer für diese Gruppen sind Säurehalogenide, vorzugsweise Chloride, für sämtliche von Acetyl abweichende Gruppen und Essigsäureanhydrid für die Acetylgruppe. Die Umsetzungen können gemäß Bedingungen und Verfahrensweisen, die dem Fachmann für Verkappungsreaktionen bekannt sind, ablaufen. Annähernd äquimolare Mengen des Nucleosids und des Verkappungsmittels werden unter reaktiven Bedingungen, im allgemeinen in einer flüssigen Lösung, miteinander in Kontakt gebracht. Verschiedene inerte organische Lösungsmittel können verwendet werden, wobei ein bevorzugtes Beispiel hierfür trockenes Pyridin ist. Für die Acetyl-Schutzgruppe wird die Umsetzung im allgemeinen in Gegenwart von 4-Dimethylaminopyridin, das als Katalysator dient, unter Verwendung von Tetrahydrofuran als Lösungsmittel durchgeführt. Der Druck und die Temperatur sind für diese Reaktionen nicht kritisch und können variiert werden. Im allgemeinen reichen atmosphärische Temperatur- und Druckbedingungen jedoch aus. Das Stoppen der Reaktionen, das Entfernen der Lösungsmittel und die Reinigung der Produkte erfolgen nach herkömmlichen Verfahren.
• Eine Darstellung für ein Reaktionsschema, das diese Umsetzung umfaßt, ist im nachstehenden Schema 2 gezeigt. Auch hier handelt es sich zu Er läuterungszwecken bei der Base um Thymin. Dabei ist erneut das Ausgangsnucleotid II in einer im Vergleich zur Formel Ia umgekehrten Darstellung gezeigt. Schema 2 Pyridin
• Im Schema 2 wird das Nucleosid (II) direkt trityliert, wobei diese Reaktion erwartungsgemäß selektiv in der 5'-Stellung erfolgt. Dies führt zu einem Zwischenprodukt mit zwei OH-Gruppen, eine in der 2'-Stellung und die andere in der 3'-Stellung (VIII). Bei der anschließenden Benzoylierung verläuft die Umsetzung in unerwarteter Weise selektiv in der 2'- Stellung anstelle der Bildung eines Gemisches der 2'- und 3'-benzoylierten Form, wodurch man das 2',5'-geschützte Nucleosid (VI) erhält. Diese Verbindung läßt sich leicht durch die gleiche Umsetzung wie sie in Schema 1 herangezogen wird, in das 3'-phosphitylierte Reagenz (VII) umwandeln.
• Erfindungsgemäße Verbindungen, bei denen R¹ oder R² ein Mono-, Dioder Triphosphat darstellen, lassen sich nach bekannten Verfahren herstellen.
• Aktivierte Nucleotide VII, die nach Schema 1 oder Schema 2 oder nach einem beliebigen anderen Reaktionsschema hergestellt worden sind, werden zur Synthese von Arabinooligonucleotiden auf analoge Weise, wie sie für DNA- und RNA-Nucleotide angewandt wird, eingesetzt. Nucleotide werden in der vorher gewählten Sequenz unter Bildung einer Nucleotidkette verknüpft, die komplementär zu einer Sequenz von Nudeotiden in einer Ziel- DNA oder -RNA ist. In einer bevorzugten Ausführungsform können die aktivierten Nucleotide VII direkt in einem automatisierten DNA-Synthesegerät gemäß den Verfahrensweisen und Bedienungsanleitungen des verwendeten speziellen Synthesegeräts eingesetzt werden. Die Oligonucleotide lassen sich einem Synthesegerät unter Anwendung des standardmäßigen handelsüblichen Phosphoramidit-Verfahrens (beschrieben von M. J. Gait, Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, a.a.O.) oder des H-Phosphonat-Verfahrens herstellen. Bei einem derartigen Herstellungsverfahren wird das zu verwendende Nucleosid am 3'-Ende der gewünschten Sequenz mit Bernsteinsäureanhydrid behandelt und mit einem standardmäßigen, handelsüblichen CPG-Kügelchen nach dem Verfahren von T. Atkinson et al., Oligonucleotide Synthesis, A Practical Approach, a.a.O., gekuppelt.
• Die Oligonudeotide können zweckmäßigerweise durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt werden.
• Die erfindungsgemäßen Oligonucleotide binden in paralleler Orientierung an komplementäre Stränge. Wenn Sequenzen in antisense-Orientierung zu Ziel-mRNA oder -DNA zu bilden sind, beispielsweise für chemotherapeutische Zwecke, werden sie mit dem 3'-Ende des gewünschten Oligonucleotids entsprechend dem 3'-Ende der Zielsequenz kodiert.
• Ziel-Nucleinsäuresequenzen können erfindungsgemäß unter Verwendung einer Oligonucleotidsonde identifiziert werden, die mindestens einen markierten α-Arabinofuranosylnucleotidrest gemäß der vorstehenden Beschreibung enthält. Eine typische Vorgehensweise läuft folgendermaßen ab:
• (a) Nucleinsäuren in der zu testenden Probe werden zunächst denaturiert.
• (b) Sodann wird eine markierte α-Arabinofuranosyloligonucleotid- Sonde mit den Zielnudeinsäuren hybridisiert, wobei die Sonde eine Sequenz einschließt, die komplementär zur Sequenz der Ziel-Nucleinsäuren ist.
• (c) Sodann wird die Probe zur Entfernung von ungebundener Sonde gewaschen.
• (d) Anschließend wird die Probe mit Nachweismitteln inkubiert.
• (e) Schließlich wird die Probe auf das Vorhandensein von Signalen, die eine Hybridisierung mit der Sonde anzeigen, untersucht.
• Jede dieser Stufen kann nach aus dem Stand der Technik bekannten Verfahrensweisen durchgeführt werden. Zu Hybridisierungstechniken gehören beispielsweise homogene Hybridisierungen, bei denen beide komplementären Nudeinsäuren frei in Lösung vorliegen, und heterogene Hybridisierungen, bei denen eine Nudeinsäure an einen festen Träger gebunden ist, beispielsweise an einen Slot-Blot oder einen Träger, wie beim Southern- Transfertest. Beispiele für Hybridisierungsmethoden, die herangezogen werden können, sind in Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, Hrsg. B. D. Hames und S. J. Higgins, IRL Press (1985) beschrieben.
• Kits zur Durchführung von derartigen Tests enthalten typischerweise die folgenden Bestandteile:
• ein Sondenreagenz, das ein markiertes α-Arabinofuranosyloligonucleotid mit einer zur Sequenz zur Ziel-Nucleinsäure komplementären Sequenz umfaßt;
• ein Denaturierungsrnittel zur Umwandlung von doppelsträngiger Nucleinsäure in einzelsträngige Nucleinsäure; und
• ein Hybridisierungsreaktionsgemisch.
• Gegebenenfalls enthalten derartige Kits ein Signalerzeugungssystem, beispielsweise ein Enzym und ein Enzymsubstrat.
• Die folgenden Beispiele dienen iur Erläuterung der Erfindung und sollen die Erfindung in keiner Weise beschränken oder eingrenzen.
• Die Beispiele 1 bis 3 erläutern das Schema 1 bis zur Verbindung VI, wobei gemäß der Darstellung in den Gleichungen Thymin als Base dient.
Beispiel 1 1(3',5'-O-Tetraisopropyldisiloxan-1",3"-yl-α-D-arabinofuranosyl)- thymin (Verbindung III)
• Eine Lösung von 1-α-D-Arabinofuranosylthymin (Verbindung II) (300 mg, 0,85 inmol) in trockenem Pyridin (15 ml) wurde mit 1,3-Dichlor- 1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxan (0,38 ml, 0,85 mMol) versetzt. Die erhaltene Lösung wurde 18 Stunden gerührt. Sodann wurde das Pyridin aus der Lösung abgedampft. Der Rückstand wurde mit Essigsäureethylester und Wasser ausgeschüttelt. Die organische Phase wurde mit kaltem 1N HCl, H&sub2;O, gesättigtem wäßrigem NaHCO&sub3; und wäßrigem NaCl gewaschen und sodann über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Durch Flash-Chrornatographie unter Verwendung von 5% Aceton/Methylenchlorid erhielt man 230 mg (54%) Produkt vom F. 80-96ºC, das aufgrund folgender Daten als Verbindung III identifiziert wurde:
• H-NMR (CDCl&sub3;) : 9,1 (1H, br s, NH) , 7,35 (1H, s, H-6) , 5,55 (1H, d, H-1', J = 4,8), 4,5 - 3,8 (6H, m, weitere Zuckerprotonen), 1,95 (3H, s, CH&sub3;) , 1,2 - 0,9 (26H, rn, i-Pr).
• Elementaranalyse:
• ber. für C&sub2;&sub2;H&sub3;&sub9;N&sub2;O&sub7;Si&sub2;: C 52,88; H 7,87; N 5,61;
• gef. : C 52,50; H 7,93; N 5,37
Beispiel 2 1-(2'-O-Benzoyl-α-D-arabinofuranosyl)-thymin (Verbindung V)
• Eine kalte Lösung von 1-{3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxan-1",3"- diyl)-α-D-arabinofuranosyl}-thymin (Verbindung III) (0,9 g, 1,8 mMol) in trockenem Pyridin (10 ml) wurde mit Benzoylchlorid (0,2 ml, 1,8 mMol) versetzt. Nach 4-stündigem Rühren bei Umgebungstemperatur wurde das Gemisch in Eis/Wasser gegossen und sodann mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wurde getrocknet und eingedampft. Der Rückstand (Verbindung (IV) wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Dieses Produkt (Verbindung IV) (600 mg, 1,2 mMol) wurde mit 10 ml 1N Tetra-n- butylammoniumfluorid in Tetrahydrofuran versetzt. Der Rührvorgang wurde 2 Stunden fortgesetzt. Sodann wurde das Lösungsmittel abgedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung von 10% Aceton/Hexanen gereinigt. Die das Produkt enthaltenden Fraktionen wurden gewonnen und eingedampft. Man erhielt 100 mg (12%) Produkt, das aufgrund folgender Daten als Verbindung V identifiziert wurde:
• H-NMR (d&sub6;-DMSO) : 11,34 (1H, s, NH) , 8,1 - 7,5 (5H, m, ArH) , 7,73 (1H, s, H-6) , 5,97 (1H, d, H-1', J = 4,80), 5,89 (1H, d, 3'-OH, J = 4,80), 5,51 (1H, t, H-2', J = 4,95), 4,99 (1H, t, 5'-OH, J = 5,70), 4,45 - 4,25 (2H, m&sub1; H-3' und H-4'), 3,7 - 3,5 (2H, m, H-5'), 1,82 (3H, s, CH&sub3;).
Beispiel 3 1-{2'-O-Benzoyl-5'-(dimethoxytrityl)-α-D-arabinofuranosyl}-thymin (Verbindung VI)
• 1-(2'-O-Benzoyl-α-D-arabinofuranosyl)-thymin (Verbindung V) (60 mg, 0,13 mMol) in Pyridin (10 ml) wurde mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (80 mg, 0,23 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 18 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Lösungsmittel wurden unter vermindertem Druck entfernt. Das Produkt wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie unter Verwendung von 30% Aceton/Hexanen als Laufmittel isoliert. Man erhielt 30 mg (Ausbeute 28%) Produkt, das aufgrund folgender Daten als Verbindung VI identifiziert wurde:
• H-NMR: 8,1 - 6,7 (19H, m, ArH), 6,02 (1H, d, H-1', J = 4,5 Hz), 5,39 (1H, m, H-2¹), 4,55 (2H, m, H-3' und H-4'), 3,78 (6H, s, OCH&sub3;), 3,67 (2H, m, H-5'), 2,00 (3H, s, CH&sub3;).
• Elementaranalyse
• ber. für C&sub3;&sub8;H&sub3;&sub8;N&sub2;O&sub9;: C 68,46; H 5,74; N 4,20;
• gef. : C 68,25; H 5,52; N 4,01
• Die Beispiele 4 bis 8 erläutern das Schema 2, wobei auch hier Thymin als Base verwendet wird. Dazu gehören die Herstellung des Nucleosid-Ausgangsmaterials und die Verarbeitung zur Verbindung VII.
Beispiel 4 1-(2',3',5'-Tri-O-benzoyl-α-D-arabinofuranosyl)-thymin
• Ein Gemisch aus trockenem Thymin (0,5 g, 3,96 mmol), Hexamethyldisilazan (30 ml), Ammoniumsulfat (50 mg) und trockenem Pyridin (1,0 ml) wurde 2 Stunden unter Rückfluß erwärmt. Sodann wurden die Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der erhaltene Rückstand wurde zu einer Lösung von 1-O-Acetyl-2',3',5'-tri-O-benzoyl-α-D-arabinofuranose (2,0 g, 3,96 mMol) in trockenem Acetonitril (50 ml) gegeben. Sodann wurde Trimethylsilyl trifluormethansulfonat (0,765 ml, 3,96 mmol) zugegeben, und das Gemisch wurde 18 Stunden gerührt. Die Lösungsmittel wurden abgedampft, und der Rückstand wurde in Essigsäureethylester gelöst. Diese Lösung wurde mit einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung und sodann mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Flash-Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Stufengradienten von 10% Aceton/Hexan bis 50% Aceton/Hexane erhielt man nach Trocknung 1,0 g (Ausbeute 44,3%) Produkt vom F. 90ºC. Die Identität des Produkts wurde aufgrund folgender Daten bestätigt.
• H-NMR (CDCl&sub3;) : 8,83 (1H, s, NH) , 8,2 - 7,4 (15H, m, ArH) , 7,30 (1H, s, H-6), 6,29 (1H, d, H-1', J 44 3,29 Hz), 5,95 (1H, t, J = 2,85), 5,77 (1H, t, J = 3,0), 4,98 (1H, m, H-4'), 4,73 (2H, m, H-5') 1,95 (3H, s, CH&sub3;).
• Elementaranalyse
• ber. für C&sub3;&sub1;H&sub2;&sub6;N&sub2;O&sub9;: C 65,26; H 4,59; N 4,91;
• gef. : C 64,87; H 4,75; N 4,51
Beispiel 5 1-α-D-Arabinofuranosylthymin (Verbindung II)
• 1-(2',3',5'-Tri-O-benzoyl-α-D-arabinofuranosyl)-thymin (18,6 g, 32,6 mMol) wurde in trockenem Methanol gelöst und mit frisch hergestelltem Natriummethoxid auf den pH-Wert 11 (Anzeige durch feuchtes pH-Indikatorpapier) eingestellt. Nach Rühren über Nacht wurde die Lösung mit Dowex-50R H&spplus;-Harz behandelt, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde mit Essigsäureethylester gewaschen und getrocknet. Man erhielt 8,0 g (69%) rohes Produkt. Dieses Produkt wurde ohne weitere Reinigung eingesetzt. Aufgrund folgender Daten wurde das Produkt als Verbindung (II) identifiziert:
• UV: λmax (pH-Wert 7), 267 nm
• H-NMR: 11,27 (1H, s, NH), 7,60 (1H, s, H-6), 5,72 (1H, d, H-1', J = 4,80), 5,64, 5,44, 4,89 (3H, br s, 2',3',5'-OH), 1,90 (3H, s, CH&sub3;) und weitere Zuckerprotonen.
Beispiel 6 1-(5'-O-Dimethoxytrityl-α-D-arabinofuranosyl)-thymin (Verbindung VIII)
• 1-α-D-Arabinofuranosylthymin (Verbindung II) (0,5 g, 1,4 mMol) in Lösung in trockenem Pyridin (20 ml) wurde mit 4,4'-Dimethoxytritylchlorid (0,656 g, 1,9 mMol) versetzt. Das Gemisch wurde 20 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt und sodann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in Essigsäureethylester (100 ml) gelöst und sodann in eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung gegossen. Die organische Phase wurde mit H&sub2;O gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und sodann zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Stufengradienten von Ethylacetat/Hexanen (1/1 bis 2/1) gereinigt. Das Hauptprodukt wurde gewonnen und getrocknet. Man erhielt 0,4 g (Ausbeute 49%) Produkt vom F. 80ºC. Die Identität des Produkts als Verbindung VIII wurde durch folgende Daten bestätigt:
• Elementaranalyse
• ber. für C&sub3;&sub1;H&sub3;&sub2;N&sub2;O&sub8; 0,75 H&sub2;O: C 64,8; H 5,88; N 4,88;
• gef.: C 65,23; H 6,04; N 4,45
Beispiel 7 1-(2'-O-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-α-D-arabinofuranosyl)-thymin (Verbindung VI)
• Eine kalte Lösung von 1-(5'-O-Dimethoxytrityl-α-D-arabinofuranosyl)- thymin (Verbindung VIII) (330 mg, 0,57 mMol) in trockenem Pyridin (15 ml) wurde mit Benzoylchlorid (0,068 ml, 0,58 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde 4 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt, sodann in eine gesättigte Natriumbicarbonatlösung gegossen und mit Essigsäureethylester extrahiert. Die organische Phase wurde mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wurde eingedampft. Der Rückstand wurde durch Flash-Chromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Stufengradienten von 20% Essigsäureethylester/Hexanen bis 60% Essigsäureethylester/Hexane gereinigt. Das Produkt wurde sodann durch präparative HPLC unter Verwendung einer C&sub1;&sub8;- Säule (80% CH&sub3;CN/H&sub2;O) rechromatographiert. Man erhielt 185 mg (Ausbeute 51%) Produkt. Die Identität des Produkts wurde durch die gleichen Analysen, wie sie für die in Beispiel 3 gebildete Verbindung durchgeführt wurden, bestätigt, wobei man identische Ergebnisse erhielt. Dies bestätigt die ungewöhnlich hohe Selektivität der Reaktion in der 2'-Stellung, obwohl die Hydroxylgruppe in der 3'-Stellung verfügbar ist.
Beispiel 8 1-{2'-O-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-α-D-arabinofuranosyl}-thymin- 3'-O-(2"-cyanoethoxy-N,N-diisopropyl)-phosphoramidit (Verbindung VII)
• Eine Lösung von 1(2'-O-Benzoyl-5'-O-dimethoxytrityl-α-D-arabinofuranosyl)-thymin (Verbindung VI) (460 mg, 0,72 rnmol), Dusopropylethylamin (0,5 ml) und Dichlormethan (40 ml) wurde mit 2-Cyanoethyl-N,N-diisopropylchlorphosphoramidit (0,448 ml, 1,8 mmol) in zwei Portionen versetzt. Die Lösung wurde 2 Stunden gerührt. Sodann wurde Methanol (0,1 ml) zugegeben. Die erhaltene Lösung wurde in eine Lösung von Essigsäureethylester (100 ml) und Triethylamin (10 ml) gegossen. Diese Lösung wurde mit wäßriger 10%iger Natriumcarbonatlösung und sodann mit gesättigter wäßriger Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet, abfiltriert und eingedarnpft. Der Rückstand wurde zusammen mit Acetonitril eingedampft, in Xylolen (10 ml) gelöst und in Hexane (300 ml) gegossen. Der ausgefallene Feststoff wurde abfiltriert und getrocknet. Man erhielt 260 mg (Ausbeute 43%) Produkt, das ohne weitere Reinigung für die Oligonucleotidsynthese verwendet wurde.
Beispiel 9 Pentadeca-{1-α-D-arabinofuranosyl)-thymin-3'-phosphat}
• Dieses Beispiel erläutert die Herstellung eines Oligomeren aus dem Nucleotid von Beispiel VII.
• Die Herstellung des Oligomeren wurde mit dem automatischen DNA-Synthesegerät Milligen 7500 (Milligen/Biosearch, Abteilung der Millipore Corporation, Burlington, Massachusetts, USA) durchgeführt. Für sämtliche Reagenzien und Waschvorgänge wurden normale Zykluszeiten angewandt, mit Ausnahme des Phosphoramidit-Reagenzzyklus, der auf 5 Minuten eingestellt wurde. Die Synthese wurde in einem 1 Mikromol-Maßstab durchgeführt, wobei man mit einer "3'-Amino-Schwanz"-Säule der Fa. Glen Research Corporation, Herndon, Virginia, USA, begann. Die Schutzgruppenentfernung und Reinigung des Oligomeren wurde nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt; vgl. Oligonudeotide Synthesis, A Practical Approach, Hrsg. M. J. Gait, a.a.O. Das Oligomere wies aufgrund der festen Trägersäule in der 3'-Stellung eine HO(CH&sub2;CH(NH&sub2;)CH&sub2;OPO&sub3;(H)-Gruppe auf. Diese Gruppe störte die Hybridisierung nicht.

Claims (10)

1. Oligonucleotid, welches eine Kette von Nucleotideinheiten umfaßt, wobei jede dieser Nudeotideinheiten die Formel

aufweist, worin

R ein Rest ist, der aus der aus Phosphat, Thiophosphat, Phosphoramidat und Alkanphosphonat bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und entweder in allen Nudeotideinheiten gleich ist oder in den Nudeotideinheiten verschieden ist,

B eine Nucleotidbase ist,

W eine Verknüpfungsgruppe ist,

A aus der aus Interkalatoren, Vernetzungsmitteln, Gruppen, die doppeisträngige DNA binden können, Reportergruppen und Gruppen, die eine oder mehrere Reportergruppen binden können, bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und, wenn t 1 ist, in allen Nudeotideinheiten gleich ist oder in den Nucleotideinheiten Verschieden ist und

t 0 oder 1 ist und entweder in allen Nucleotideinheiten gleich ist oder in den Nucleotideinheiten verschieden ist, unter der Maßgabe, daß t bei mindestens einer der Nucleotideinheiten 1 ist.

2. Oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei B aus der aus Purinen, Pyrimidinen, 3-Deazapurinen, 7-Deazapurinen und Pyrazolo{3,4-d}pyrimidinen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

3. oligonucleotid gemäß Anspruch 1, wobei A aus der aus Interkalatoren, Signal-erzeugenden Reportergruppen und Liganden, die an Signal-erzeugende Antiliganden binden können, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

4. Verbindung der Formel

worin

R¹ ein aus der aus Wasserstoff und reaktiven Gruppen, die eine Internucleotidbindung bilden könnnen, bestehenden Gruppe ausgewählter Rest ist,

R² ein aus der aus Wasserstoff und Schutzgruppen bestehenden Gruppe ausgewählter Rest ist,

R³ ein aus der aus Wasserstoff und Schutzgruppen ausgewählter Rest ist,

B eine Nucleotidbase ist,

W eine Verknüpfungsgruppe ist und

A aus der aus Interkalatoren, Vernetzungsmitteln, Gruppen, die doppelsträngige DNA binden können, Reportergruppen und Gruppen, die eine oder mehrere Reportergruppen binden können, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

5. Verbindung gemäß Anspruch 4, wobei B aus der aus Purinen, Pyrimidinen, 3-Deazapurinen, 7-Deazapurinen und Pyrazolo{3, 4-d}pyrimidinen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

6. Verbindung gemäß Anspruch 4, wobei A aus der aus Interkalatoren, Signal-erzeugenden Reportergruppen und Liganden, die an Signal-erzeugenden Antiliganden binden können, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

7. Verfahren zum Umsetzen eines α-D-Arabinofuranosylderivats der Formel

worin

B eine Nucleotidbase ist,

W eine Verknüpfungsgruppe ist,

A aus der aus Interkalatoren, Vernetzungsmitteln, Gruppen, die doppelsträngige DNA binden können, Reportergruppen und Gruppen, die an eine oder mehrere Reportergruppen binden können, bestehenden Gruppe ausgewählt ist,

t 0 oder 1 ist und

Pr¹ eine Schutzgruppe ist,

mit einem Capping-Reagens, das die Gruppe Pr² enthält, wobei die Gruppe Pr² selektiv in die 2-Stellung des a-D-Arabinofuranoserestes unter Bildung eines α-D-Arabinofuranosylderivats eingeführt wird, welches die Formel

hat, worin B, A, W, t, Pr¹ und Pr² wie vorstehend definiert sind.

8. Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins einer Zielnucleinsäuresequenz in einem Probengemisch, welches umfaßt:

(a) Kontaktieren der Probe mit einer Sonde, die ein α-D- Arabinofuranosyloligonucleotid gemäß Anspruch 1 mit einer der Zielnucleinsäuresequenz komplementären Basensequenz umfaßt, wobei t bei mindestens einer der Nudeotideinheiten davon 1 ist,

(b) Entfernen der nicht-hybridisierten Sonde aus dem Probengemisch und

(c) Nachweisen des Vorhandenseins von A in dem Probengemisch als Anzeige für die Zielsequenz.

9. Untersuchungs-Kit zum Nachweisen des Vorhandenseins einer Zielnucleinsäuresequenz in einem Probengemisch, wobei das Kit eine markierte α-D-Arabinofuranosyloligonucleotid- Sonde gemäß Anspruch 1 mit einer der Zielnucleinsäuresequenz komplementären Basensequenz, ein Denaturierungsmittel zum Umwandeln der doppelsträngigen Nucleinsäure in einzelsträngige Nucleinsäure und ein Hybridisierungs-Reaktionsgemisch umfaßt.

10. Untersuchungs-Kit zum Nachweisen des Vorhandenseins einer Zielnucleinsäuresequenz in einem Probengemisch, wobei das Kit eine markierte α-D-Arabinofuranosyloligonucleotid- Sonde gemäß Anspruch 1 mit einer der Zielnucleinsäuresequenz komplementären Basensequenz und einen Behälter umfaßt.