DE69129112T2

DE69129112T2 - Kryokonservierung von kultivierten epithelgeweben

Info

Publication number: DE69129112T2
Application number: DE69129112T
Authority: DE
Inventors: Richard Odessey; Susan Schaeffer; Alexander Schermer; Ross Tubo
Original assignee: Biosurface Technology Inc
Current assignee: Biosurface Technology Inc
Priority date: 1990-06-04
Filing date: 1991-05-21
Publication date: 1998-07-02
Anticipated expiration: 2011-05-22
Also published as: EP0532670B1; CA2084648C; AU647803B2; AU8060191A; WO1991018505A1; ES2116294T3; JPH05507715A; CA2084648A1; ATE164042T1; US5145770A; DE69129112D1; EP0532670A1; JP2722134B2; DK0532670T3

Description

Grundlagen der Erfindung

Diese Erfindung betrifft die Kryokonservierung und Langzeit-Lagerung kultivierter Epithelgewebeschichten, die als Hautdefektabdeckungen zweckdienlich sind, auf eine Weise, die die Zellebensfähigkeit und Koloniebildungsfähigkeit erhält.
Es ist schon immer in der Medizin ein wichtiges Ziel gewesen, eine Hautdefektabdeckung zu entwickeln, die ein neues Zellwachstum fördert und gleichzeitig einen Flüssigkeitsverlust und eine Infektion als Folge von Hautdefekten bei Verbrennungen, Ulzeration oder chirurgischer Excision verhindert. Da herkömmliche Abdeckungen großflächige Wunden nicht adäquat schützen, sind verschiedene Alternativen entwickelt worden. Diese Alternativen können Spalthaut- und Vollhauttransplantate, Haut von Toten, porcine Haut und humane Allotransplantate und Autotransplantate sein. Die meisten haben sich als unbefriedigend erwiesen, da alle außer Autotransplantate eventuell bei einer nicht erfolgenden immunsuppressiven Therapie vom Körper abgestoßen werden. Außerdem ist die Anwendung herkömmlicher Autotransplantierungsverfahren bei massiven Brandverletzungen, die große Bereiche der Körperoberfläche umfassen, nicht praktikabel.
Green et al. haben ein Verfahren zur Kultivierung von Epithelzellgewebeschichten mit mehreren zelldicken zur Wiederherstellung von Brand-, Geschwür- und anderen Hautwunden entwickelt. In U.S. Patent Nr. 4.016.036 ist das Verfahren zur seriellen Kultivierung von Keratinocyten zur Herstellung stratifizierter Epithelgewebeschichten offengelegt. In U.S. Patent Nr. 4.304.866 ist das Verfahrenzur Herstellung transplantierbarer Zellgewebeschichten mittels Kultivierung von Keratinocyten und Ablösen der Gewebeschicht von seinem Substrat, auf dem sie verankert ist, unter Verwendung eines Enzyms, wie beispielsweise Dispase, offengelegt. In U.S. Patent Nr. 4.456.687 sind zweckdienliche Mittel zur Wachstumsförderung von Epithelzellen offengelegt.
In den von Green et al. entwickelten Kultivierungssystemen teilen sich die Epithelzellen rasch auf der Oberfläche von Gewebekulturschalen oder -kolben und bilden schließlich eine konfluente, leicht stratifizierte Schicht von fest verbundenen Zellen. Diese konfluenten Kulturen können als kohäsive Zellschichten mittels Behandlung, zum Beispiel mit dem Enzym Dispase (siehe US. Patent 4.302.866), freigesetzt werden. Die kultivierten Gewebeschichten können dann an mit Paraffinöl imprägnierter Gaze oder anderen nicht adhärenten Trägern befestigt werden, im Kulturmedium zum Operationssaal transportiert und den Patienten aufgetragen werden.
Großflächige Brandwunden können mit Autotransplantaten, die mit diesen Verfahren präpariert sind, abgedeckt werden, aber die Autotransplantate erfordern eine Kultivierungszeit. Während die Zellen für das Autotransplantat kultiviert werden, besteht die Möglichkeit, die Wunde mit Allotransplantat zu versorgen, das als zeitweilige Wundabdeckung wirksam ist. Ein Allotransplantat- Material fördert ebenfalls die Heilung chronischer Hautgeschwür& und Spalthaut-Entnahmestellen. Kultiviertes Autotransplantat-Material, das mit dem Verfahren von Green et al. präpariert ist, ist jetzt von Biosurface Technology, Inc., Cambridge, Massachusetts, im Handel erhältich. Allotransplantat-Material ist für Versuche und klinische Tests verfügbar.
Eine schwerwiegende, besonders praktische Verwendungseinschränkung von kultivierten Epitheltransplantaten ist ihre inhärente begrenzte Haltbarkeit. Die Lebensfähigkeit und das Koloniebildungsvermögen der Gewebeschichten schwindet rasch nach ihrem Entfernen von dem Substrat, auf dem sie wachsen. Dies begrenzt die Zeit und Distanz, in denen die Gewebeschichten vom Produktionsort zum Operationssaal transport werden können. Die Zellgewebeschichten sind außerordentlich empfindlich. Sie können normalerweise ihre Fähigkeit aufrechterhalten, ständig zu wachsen und Kolonien zu bilden, wenn sie nur etwa sechs bis acht Stunden oder weniger nach einer Freisetzung mit Dispase auf die Hautdefekte aufgetragen werden. Diese zeitlichen Einschränkungen schließen das Führen eines großen Lagerbestands aus. Die Entwicklung eines Kryokonservierungsverfahrens zur Verlängerung der Lagerungsdauer von den kultivierten Gewebeschichten würde das Führen von großen Lagerbeständen für einen weltweiten Versand erlauben.
Auf diesem Fachgebiet sind zahlreiche Beschreibungen verschiedener Gewebekonservierungsverfahren, einschließlich Kryokonservierung, Verwendung spezieller Zellmedien und bestimmter Verpackungstechniken veröffentlicht worden. Eine Kryokonservierung erlaubt eine Langzeit-Lagerung durch Gefrieren des Materials in Gegenwart eines Kryoschutz-Mittels. Dieses Mittel verdrängt das wäßrige Material in den Zellen und um die Zellen und verhindert dadurch eine Eiskristallbildung. In zahlreichen offengelegten Protokollen variiert die Art oder Menge an Kryoschutz-Mittel und/oder die Zeit oder der zeitliche Verlauf oder die Temperatur des Gefrierprozesses bei dem Versuch, die Zellebensfähigkeit nach einem Gefrier/Auftau-Zyklus zu erhalten. Siehe beispielsweise U.S. Patent Nr. 4.559.298, U.S. Patent Nr. 4.688.387.
Eine Lagerung von Gewebe mittels Kryokonservierung ist ein komplizierter und teurer Prozess, der unter Umständen sehr verschiedene Ergebnisse liefern kann. Allerdings hat kein anderes Verfahren gezeigt, daß es die Lagerungszeit von lebensfähigem tierischen Gewebe über eine sehr kurze Dauer hinausgehend, d.h. acht Stunden, verlängert. Siehe zum Beispiel Pittelkow et al., 86 J. Invest. Dermatol. 4: 410-17, 413-14 (1986). Seit Jahren wird gefrorene menschliche Haut von Hautbanken als zeitweilige Allotransplantat-Abdeckung für Brandwunden verwendet. Allerdings ist diese gefrorenen Haut nicht wirklich lebensfähig. Obwohl Haut von Banken metabolisch aktiv ist, ist es ungewiß, ob die Epidermiszellen sich wiedervermehren können. Heimbach, D. et al., "Artificial Dermis for Major Burns: a Multi-Center Randomized Clinical Trial", Ann. Surg. 313-320 (September 1988).
Produktion von kultivierten Epithelautotransplantaten im Großmaßstab, wie von Green et al. beschrieben, ermöglicht eine dauerhafte Abdeckung von großflächigen Wunden mit der eigenen Haut des Patienten. Obwohl große Mengen an kultivierten Epithel für Patienten hergestellt werden können, ist die begrenzte Haltbarkeit des Epithels ein schwerwiegendes Problem. Dies führte dazu, daß Cancadda und Deluca ein Protokoll entwickelt haben, womit konfluente Gewebeschichten von kultivierten Keratinocyten in einem Kulturmedium gefroren werden, das 10% Glycerin enthält (siehe EP 0 296 475). Allerdings zeigten die Erfahrungen mit diesem Verfahren, daß eine Zellwiederfindung unterschiedlich und im allgemeinen sehr gering ist. Zusätzlich macht die begrenzte Inkubationszeit diese Verfahren für eine Produktion im Großmaßstab nicht praktikabel. Außerdem werden Transplantate, die mit einem beliebigen Protokoll gefroren werden und dann nach der Lagerung in Flüssigstickstoff aufgetaut werden, oftmals zerstört. Obwohl eine Hautdefektabdeckung möglich ist, bleibt der tatsächliche Zustand der konfluenten Gewebeschichten auf zellulärer Ebene fraglich.
Frühere Arbeiten mit Kryoschutz-Mitteln mit hohem Molekulargewicht zeigten, daß Polyvinylpyrrolidon (PVP) oder Dextrane (MG 30-100 kD) allein eine Zerstörung von Erythrocyten während der Kryokonservierung verhindern, Pegg, D.E., "Banking of Cells, Tissues and Organs at Low Temperatures", in Current Trends in Cryobiology (A. Smith, ed. 1970). Dextran und Hydroxyethylstärke zusammen mit Glycerin erhalten partiell die Motilität von gefrorenen und aufgetauten Widder-Spermien, Schmehl et al., "the Effects of Nonpenetrating Cryoprotectants Added to Test-Yolk-Glycerol Extender on the Post-Thaw Motility of Ram Spermatocoa" 23 Cryobiol. 6:512-17 (1986).
Unter Verwendung eines Trypanblau Farbstoff- Ausschlusses als ein Maß für die Lebensfähigkeit hat Hydroxyethylstärke (HES) allein gezeigt, daß sie das überleben von kryokonservierten Zellen hämatopoetischen Ursprungs verbessert, aber nur wenn das Kryoschutz-Mittel zugegeben und später in langsamer und zeitaufwendiger Weise entfernt wurde (Conscience und Fischer, "An Improved Preservation Technigue for Cells of Hemapoetic Origin" 22 Cryobiol. 5:495-98 (1985). Dieser Parameter Lebensfähigkeit liefert Informationen nur über eine kurzzeitige Membran-Stabilität und liefert keine Daten über das Proliferationspotential oder Langzeit-Überleben des Gewebes. Diese Autoren schlossen daraus, daß HES keinen Vorteil für eine Kryokonservierung von Zellen epithelialen Ursprungs bietet. In anderen Untersuchungen wurde HES für die Kryokonservierung von Zellen hämatopoetischen Ursprungs erfolgreich eingesetzt, wie mit Zellproliferationstests bestimmt wurde, einem Parameter, der die Langzeit-Lebensfähigkeit besser wiedergibt (Wang, et al., Cryobiol. 24:229-237 (1987).
Untersuchungen mit nicht-penetrierenden (glasbildenden) Mitteln mit hohem Molekulargewicht als Kryoschutz-Mittel konzentrieren sich auf Zellen in Suspension, wie beispielsweise rote Blutkörperchen und Lymphocyten, wie oben beschrieben. Allerdings stellt die erforderliche Notwendigkeit, die Integrität einer kohäsiven Zellschicht während einer Kryokonservierung zu erhalten, schwerwiegende Einschränkungen für die Wiederfindung von lebensfähigen Zellen (d.h. Zellen mit der Fähigkeit zur Gewebe-Regeneration) dar.
Ein Gegenstand dieser Erfindung ist, eine Kryokonservierungsmethodologie bereitzustellen, die in der Lage ist, eine lebende, kultivierte Gewebeschicht aus Epithelzellen zu konservieren, wo das Verfahren die strukturelle Integrität der Gewebeschicht erhält und die Mitosekompetenz der Zellen in der Gewebeschicht konserviert, um eine für eine Wundheilung zweckdienliche Epithelgewebe-Bildung zu erlauben.

Zusammenfassung der Erfindung

Neuartige Verfahren sind nun zur Kryokonservierung von konfluenten Gewebeschichten von lebenden, kultivierten Epithelzellen entdeckt worden, so daß sie ihre Verwendungsfähigkeit als eine Hautdefektabdeckung beibehalten. Diese Methodologie erhält das Koloniebildungsvermögen der Zellen in der Gewebeschicht, d.h. konserviert eine wesentliche Anzahl an lebenden Zellen in der Epithelschicht in einer mitotisch kompetenten Form, so daß eine Regeneration eines gesunden Epithels erfolgt. Diese Verfahren erlauben auch ein Ernten von kultivierten Epithelgewebeschichten, wenn sie reif sind und ein Aufbewahren der Gewebeschichten in einer kryokonservierten Form zur späteren Verwendung.
Die Verfahren beinhalten die folgenden Schritte: 1) Eintauchen der Gewebeschicht in eine Kryoschutz-Lösung, die mindestens ein nicht-zellpenetrierendes, glasbildendes Mittel und vorzugsweise ein zellpenetrierendes, glasbildendes Mittel enthält; 2) Gefrieren des Gewebes mittels Kühlen auf eine Temperatur von oder unter mindestens etwa -65ºC, bevorzugter von oder unter -120ºC (Glasübergangstemperatur von Wasser) und am bevorzugtesten von oder unter -180ºC, insbesondere für längere Lagerungszeiträume. Das bevorzugte Verfahren umfaßt Kühlen in den Bereich von ungefähr -180ºC bis -196ºC, vorzugsweise durch Flüssigstickstoffdampf-Exposition. Das Verfahren umfaßt ferner 3) Lagerung des Gewebes bei einer Temperatur im Bereich von und unter mindestens -65ºC und bis zu ungefähr -180ºC; und 4) Auftauen, um ein intaktes Gewebe zu produzieren, worin die Zellen ein Koloniebildungsvermögen von mindestens 35%, oftmals von 40% und in vielen Fällen von 50% oder mehr besitzen.
Die Kryoschutz-Lösung enthält (auf Gewichtsprozentbasis) etwa 5% bis 20% eines nicht-zellpenetrierenden, glasbildenden Mittels, vorzugsweise etwa 15%, und etwa 10% eines zellpenetrierenden glasbildenden Mittels. Das zellpenetrierende glasbildende Mittel kann Glycerin, Propylenglycol, Ethylenglycol, Dimethylsulfoxid (DMSO) und Mischungen oder Derivate davon sein. Vorzugsweise ist das zellpenetrierende glasbildende Mittel Glycerin. Das nicht-zellpenetrierende glasbildende Mittel kann Dextran, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxyethyl stärke, Chondroitinsulfat, Polyethylenglycol und Mischungen oder Derivate davon sein und ist am bevorzugtesten Dextran oder Hydroxyethylstärke.
In bevorzugten Anwendungen erfordert der Gefrier- Schritt ein langsames Kühlen der Gewebeschicht von mindestens etwa 4ºC auf ungefähr -80ºC, und ein weiteres Kühlen bis zu einer Temperatur im Bereich von ungefähr -180ºC bis zu ungefähr -196ºC, d.h. der Temperatur von Flüssigstickstoffdampf. Das langsame Kühlen wird mit einer Rate von etwa 1ºC/Minute durchgeführt. Zusätzlich erfordert der Auftau-Schritt vorzugsweise eine Erwärmung der Gewebeschicht, z.B. an Luft oder Gas, von der niedrigen Lage rungstemperatur bis zu einem Bereich von -120ºC bis zu etwa -80ºC in einer Zeit zwischen etwa 1 Minute bis 5 Minuten, d.h. mit einer Erwärmungsrate von etwa 20ºC/min bis zu 100ºC/min. Die Gewebeschicht kann dann in einem Wasserbad oder einer anderen Vorrichtung schnell erwärmt werden, um die Temperatur weiter auf etwa 20ºC bis auf etwa 37ºC zu erhöhen.
Vor Verwendung als Hautdefektabdeckung wird die aufgetaute Gewebeschicht vom Kryoschutz-Mittel freigespült unter Verwendung von, zum Beispiel einer isotonischen Puffer-Lösung mit einem physiologischen pH, vorzugsweise Ringers Lactat-Lösung, in der Zellen zeitweilig vor Verwendung aufbewahrt werden können. Die Epithelzellgewebeschichten, die in dem Verfahren verwendet werden, bestehen vorzugsweise aus kultivierten Keratinocyten. Die konfluente Gewebeschicht ist mehrere Zellagen dick und umfaßt differenzierende Schichten.
Weitere Gegenstände und Merkmale der Erfindung sind aus den Zeichnungen, der Beschreibung und nachfolgenden Ansprüchen ersichtlich.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Abbildung 1 ist ein Querschnitt einer stratifizierten kultivierten Keratinocytengewebeschicht nach Freisetzung aus einem Kulturkolben mit Dispase. Die Mikrophotographie stellt eine stratifizierte kultivierte Keratinocytengewebeschicht dar, die im Verfahren dieser Erfindung verwendet wird;
Abbildung 2 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt der Lagerungstemperatur auf die Lebensfähigkeit von kryokonservierten kultivierten Epidermistransplantaten zeigt. Transplantate wurden bei Raumtemperatur 30 Minuten in CPM äquilibriert, das 15% Dextran und 10% Glycerin enthielt, auf -85ºC gefroren und dann bei etwa -180ºC in Flüssigstickstoffdampf, bei -80ºC in einem mechanischen Gefriergerät oder mit festem Kohlendioxid (Trockeneis, Sublimationspunkt -77ºC) bei einer Temperatur von etwa -65ºC aufbewahrt. Nach Auftauen wurden R, CFE und CFC der Transplantate gemessen. Ergebnisse sind in Prozent von nicht-gefrorenen, nicht gelagerten Kontrolltransplantaten angegeben; und
Abbildung 3 ist ein Balkendiagramm, das den Effekt von einer Behandlung nach Auftauen von kryokonservierten kultivierten Epidermistransplantaten zeigt. Transplantate wurden 60 Minuten in Kryoschutz-Medium vor Gefrieren äguilibriert. Nach Gefrieren und ein- bis dreitägiger Lagerung bei -180ºC wurden die Transplantate rasch aufgetaut, nach 0, 30 oder 60 Minuten aus CPM nach Auftauen entnommen und 1 oder 2 Stunden in Ringers Lactat-Lösung gespült. Zellwiederfindung, CFE und CFC der behandelten Transplantate wurden gemessen und in Prozent von nichtgefrorenen, nicht-gelagerten Kontrolltransplantaten angegeben.

Genaue Beschreibung

Kultivierte menschliche Epithelzellgewebeschichten können als dauerhaftes Autotransplantat-Material zur Wiederherstellung von Hautdefekten dienen. Als zeitweiliges Allotransplantatmaterial können die Gewebeschichten ein Heilen von chronischen Hautgeschwüren und Spalthauttransplantat - Entnahmestellen fördern und können auch eine sehr effektive Brandwunden-Abdeckung liefern. Die Gewebeschichten werden unter Verwendung eines von Rheinwald und Green entwickelten Kulturvierungssystems hergestellt, worin seriell kultivierte Epithelzellen sich auf der Oberfläche von Gewebekulturschalen oder -kolben rasch teilen und schließlich eine konfluente, leicht stratifizierte polarisierte Gewebeschicht fest verbundener Zellen bilden. Eine Mikrophotographie eines Querschnitts einer derartigen kultivierten Gewebeschicht ist in Abbildung 1 gezeigt. Stratifizierte Epithelzellkulturen können als kohäsive Zellgewebeschichten durch Behandlung mit einem Enzym, wie beispielsweise Dispase freigesetzt werden, an mit einem nicht-adhärenten Material, z.B. Paraffinöl oder Vaseliner, imprägnierter Gaze angeheftet, in Kulturmedium zum Operationssaal transportiert werden und den Patienten aufgetragen werden.
Eine wesentliche Einschränkung bei der Verwendung kultivierter Epidermistransplantate ist deren extreme Empfindlichkeit und geringe Lagerfähigkeit. Versuche ließen erkennen, daß Zellebensfähigkeit in den Transplantaten wesentlich verringert ist, wenn die Transplantate vor ihrem Kultursubstrat mehr als 8 Stunden getrennt worden waren, wie durch Messung der Fähigkeit von disaggregierten Zellen, das Wachstum fortzusetzen und Kolonien zu bilden, wenn sie unter optimalen Kulturbedingungen wieder ausplattiert waren, festgestellt wurde. Aus diesem Grund ist der Vertrieb von kultivierten Epithel zellgewebeschichten geographisch begrenzt gewesen, d.h. auf Hospitäler, die nahe genug am Herstellungsort lagen, so daß die Transplantate präpariert, transportiert und den Patienten innerhalb von etwa 8 Stunden oder weniger von dem Zeitpunkt an gerechnet, wo zunächst Dispase zu den Kulturen gegeben wurde, um das Ablösen vom Kulturgefäß auszulösen, aufgetragen werden konnten. Die eigentlichen Transitzeiten konnten nur wenige Stunden betragen, da die meiste Zeit zur Präparation der Transplantate benötigt wurde. Operationssaalbelegung und Ankunftszeit der Transplantate waren sorgfältig zu koordinieren. Lagerung der Gewebeschichten für einen beliebigen signifikanten Zeitraum ist nicht möglich gewesen und deshalb konnte ein Lagerbestand eines verwendungsfertigen Produkts nicht geführt werden.
Eine mögliche Erklärung für eine derart kurze Lebensfähigkeits zeitspanne von abgelösten Epithelzellgewebeschichten wurde durch die Beobachtung erhalten, daß Epithelzellen das Potential für weitere Zellteilungen verlieren und die endgültige Differenzierung erfolgt, wenn, als Einzelzellen durch eine Behandlung mit Trypsin oder EDTA aus Kulturen disaggregiert, sie zeitweilig unter Bedingungen gehalten werden, die sie an einem Wiederanhaften an Oberflächen hindern.
Versuche zur Bewertung der Lebensfähigkeit unter acht Stunden ergaben, daß die Temperatur, bei der die Dispase behandelten Transplantate gehalten wurden, extrem wichtig für die Zellebensfähigkeit war, wie durch das Koloniebildungsvermögen (CFE) und die Gesamtzahl an wiedergefundenen koloniebildenden Zellen (CFC oder insgesamt wiedergefundene Zellen x CFE) bestimmt wurde. Ein Halten der kultivierten Epithelgewebeschichten bei oder knapp unter der physiologischen Temperatur läßt das CFE von frischem Gewebe nicht aufrechterhalten. Ähnlicherweise hatte ein Halten bei 4ºC keine offensichtlichen positiven Effekte, trotz sorgfältiger Kontrolle der Mediumbedingungen, pH und CO&sub2;/O&sub2; Gleichgewicht. CFE kann für mehr als etwa 20-30 Stunden aufrechterhalten werden, wenn die kultivierten Gewebeschichten innerhalb eines kritischen Temperaturbereichs von 10ºC bis 25ºC, vorzugsweise 13ºC bis 23ºC, gehalten werden. Allerdings ist heute kein Verfahren zur Lagerung der kultivierten Gewebeschichten für mehr als einen Tag verfügbar, das ihre Verwendungsfähigkeit als eine Hautdefektabdeckung erhält, und ein Erhalt eines Lagerbestands an verwendungsfertigem Produkt zur Verwendung bei einer Wundheilung ist nicht möglich gewesen.
Die Geschichte der Kryokonservierungsmethodologie hat gezeigt, daß die Optimierung eines Kryokonservierungsprotokolls für einen bestimmten Zelltyp nicht notwendigerweise gute Ergebnisse liefert, wenn dieses bei einem anderen Zelltyp angewandt wird oder bei dem gleichen Zelltyp einer anderen Species oder bei anderen Zellen in einem Gewebe angewandt wird. Verfahren zum Gefrieren einer Keratinocyten-Suspension liefern unbefriedigende Ergebnisse, wenn es für intakte Gewebeschichten angewandt wird. Tatsächlich ist ein Gefrieren intakter Gewebe zur Verwendung in Implantaten nach unserem Kenntnissen nicht bei jedem Gewebetyp erfolgreich gewesen (siehe aber Cancedda et al., EP O 296 475).
Die hier offengelegten Verfahren zur Kryokonservierung einer konfluenten Gewebeschicht lebender kultivierter Epithelzellen nach Trennung von ihrem Kultivierungssubstrat erhalten die Mitosekompetenz oder das Koloniebildungsvermögen der Zellen in der Gewebeschicht auf akzeptablen Niveaus und erhalten die Integrität der Gewebeschicht. Zusammengefaßt: das Verfahren umfaßt vier Schritte. Zuerst wird die Gewebeschicht in einer Kryokonservierungslösung eine hinreichende Zeit äquilibriert, um die Kryokonservierungslösung gründlich mit dem Wasser zu mischen und/oder das Wasser innerhalb und zwischen den Zellen zu verdrängen. Zweitens wird die Gewebeschicht vorzugsweise auf ungefähr -180ºC bis -196ºC mit einer Rate, die gering genug ist, eine Eiskristallbildung und spätere Zerstörung der Zellen zu verhindern, gekühlt. Die gefrorenen Gewebeschichten können für lange Zeiträume bei ungefähr -180ºC oder für kürzere Zeitr:ume bei höheren Temperaturen, z.B. etwa -65ºC, gelagert werden. Vor Verwendung werden die Gewebeschichten bei Raumtemperatur an Luft oder Gas für etwa 1-3 Minuten erwärmt und dann vollständig durch schnelles Erwärmen, zum Beispiel in einem Wasserbad, aufgetaut. Viertens wird das Kryoschutz- Mittel von den kultivierten Epithelzellgewebeschichten durch Spülen in einem isotonischen Puffer, wie beispielsweise Ringers Lactat-Lösung entfernt.
Details des Verfahrens sind unten offengelegt.

Prädaration von kultivierten Edithelschichten

Epidermiszellen (Keratinocyten) werden in T150 Kulturkolben (Costar) mit einer Dichte, die eine Konfluenz in 10-12 Tagen erreicht, ausgesäht. Kulturen von gefrorenen Zellsuspensionen von verschiedenen Epidermiszellstämmen können für Allotransplantate; Zellen von Biopsien von Brandverletzten für Autotransplantate verwendet werden. Kulturen werden in gasdichten Kolben bei 37ºC in "FAD" Medium (ein Teil Hams F12, supplementiert mit Adenin, und drei Teilen Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium (DME) plus 10% fötalem Kälberserum (FBS), 0,4 µg/ml Hydrocortison, 1x10&supmin;¹&sup0; M Choleratoxin und 2x10&supmin;&sup9; M Triiodthyronin) gehalten und in Gegenwart von letal bestrahlten 3T3 Fibroblasten wachsen gelassen. Siehe U.S. 4.016.036. Zehn ng/ml Epidermiswachstumf aktor ist aus dem ersten Feeding enthalten.
Die Zellkulturen werden zur Präparation von Transplantaten verwendet, sobald sie eine Konfluenz erreicht haben. Das überstehende Medium wird abgesaugt und 40 ml Dispase II (Boehringer Mannheim) mit einer Endkonzentration von 2,5 mg/ml (ungefähr 1,2 E/ml) wird zu den Kolben gegeben und bei 37ºC inkubiert. Wenn die Ränder der Gewebeschicht sich abgelösen ( 45 min.), wird der obere Teil von jedem Kolben mittels Aufschmelzen mit einem Lötkolben entfernt.
Die Enzym-Lösung wird durch 20 ml DME Medium ersetzt. Die Epithelzellschicht wird dann wiederum mit 20 ml DME gespült. Nach Absaugen von fast 3-4 ml der zweiten Spülung, werden 5x10 cm mit Paraffinöl (Vaseline ) imprägnierte Gazeteile (Cheesebrough Ponds) über jede abgelöste Zellgewebeschicht gelegt, wobei die superfizialen Zellen direkt auf der Gaze anliegen. Die kohäsive Zellschicht wird dann auf die Gazeteile mit 12- 15 Klammern (Ligaclips, Ethicon/J&J) angeheftet. Die Schicht wird bahnenweise geschnitten, zusammengeheftet und die Transplantate werden dann in 100 mm Schalen mit dem Epithel nach oben transferriert. Die Ränder des Transplantats werden auf die Schale mit einem Gummi gedrückt, um ein Aufschwimmen des Transplantats zu verhindern. Zwölf ml DME wird vorsichtig zugegeben und die Platte wird in den Aufbewahrungsbehälter gestellt. (Abbildung 1 zeigt im Querschnitt eine typische kultivierte Gewebeschicht, die gemäß des vorerwähnten Verfahrens präpariert wurde). Zellwiederfindung (R) und ein Test auf Koloniebildungsvermögen (CFE) werden zur Bestimmung der Gesamtzahl an mitotisch kompetenter Zellen (CFC) genutzt. Auf diese Weise können die optimalen Bedingungen zur Konservierung der Lebensfähigkeit während des Kryoschutz-Verfahrens bestimmt werden, z.B. Zusammensetzung des Kryoschutz-Mediums, Äquilibrierungszeit im Kryoschutz-Medium vor Gefrieren und nach Auftauen, Gefriergeschwindigkeit, Lagerungstemperatur, Auftau- Prozess, Spülungen und anschließende Lagerung.
Koloniebildungsvermögen (CFE) -Tests werden mit Transplantaten nach einer Lagerung von 1-3 Tagen nach Gefrieren durchgeführt, wobei die Transplantate präpariert wurden, wie es in den nachfolgenden Beispielen beschrieben ist. Nicht-gefrorene Transplantate werden als Kontrollen getestet. Ligaclips werden mit einer Pinzette entfernt und die freie Zellgewebeschicht wird zu einer Einzelzell-Suspension in einer Mischung aus Trypsin (0,05%) und EDTA (0,01%) in isotonischem Puffer disozuert. Die Enzymwirkung wird durch Zugabe vgn Kälberserum gestoppt und anschließend erfolgen zwei 1:10 Verdünnungsreihen durch Zugabe von 0,5 ml Zellsuspension zu 4,5 ml FAD. Ein Aliguot der ursprünglichen Zellsuspension wird in einem Hämocytometer gezählt. Eine Endkonzentration von 1000-2000 Zellen/ml wird hergestellt und 1 ml Zellsuspension wird in 100 mm Schalen ausplattiert, die letal bestrahlte 3T3 Zellen in 12 ml FAD Medium enthalten.
Nach 10-14 Tagen werden die Kulturen mit 10% Formalin in Phosphat gepufferter Sahne fixiert und mit einer Mischung aus 1% Rhodamin und 1% Nilblau A gefärbt.
Kolonien werden unter einem Präpariermikroskop gezählt und nach Wachsen oder Absterben beurteilt. CFE ist folgendermaßen berechnet:
CFE = Gesamtzahl an Kolonien Anzahl an ausplattierten Zellen
Prozent Wiederfindung und Prozent CFE werden folgendermaßen berrechnet:
RFZ / RFS X 100 = % Wiederfindung; und
CFEFZ / CFEFS X 100 % CFE
wo FZ für gefroren, FE für frisch steht.
Die Gesamtwiederfindung von koloniebildenden Zellen (CFC) wird folgndermaßen berechnet:
CFC = Fraktion von sämtlichen wiedergefundenen Zellen (R) x Fraktion von wiedergefundenem Koloniebildungsvermögen (CFE), demzufolge
Unter Verwendung des Protokolls der Erfindung überschreiten die CFC-Werte typischerweise 35%, normalerweise 40% und sind oftmals größer als oder gleich 50%.

Kryokonservierungsdrotokoll

Eine Entwicklung einer Kryokonservierungsmethodologie erfordert eine Optimierung jeder einzelnen Komponente in dem Verfahren mit Hilfe einer eigenen Untersuchung und anschließendem integrierten Versuch, bei dem die optimalen Komponenten kombiniert sind, um das endgültige Verfahren festzulegen. Optimale Gefrier-, Lagerungs-, Auftau- und Spülverfahren, die mit einem Aufrechterhalten einer maximalen Lebensfähigkeit einhergehen, müssen festgestellt werden. Diese Komponenten werden durch einen Koloniebildungsvermögenstest, wie zuvor beschrieben, festgestellt.
Ein Standard-Kryoschutz-Medium ist aus einer physiologischen isotonischen Salzlösung (z.B. Zellkulturmedium), die mit bovinem Serum und Glycerin, einem zellpenetrierenden glasbildenden Mittel, supplementiert ist, zusammengesetzt. Obwohl es für eine Kryokonservierung von Zellen in Suspensionen erfolgreich verwendet wird, ist seine Fähigkeit zur Konservierung der Lebensfähigkeit von Zellgewebeschichten weniger klar. Die vorteilhaften Wirkungen einer Supplementierung des Standard-Kryoschutz- Mediums mit einer zusätzlichen Komponente, einem nichtzellpenetrierenden glasbildenden Mittel, wie beispielsweise Dextran, kann mit dem folgenden Test gezeigt werden:
Kultivierte Keratinocyten-Gewebeschichten werden in einem Kryoschutz-Medium (CPM), das 10% Glycerin enthält, 6 Minuten (gly c-6) oder 30 Minuten (gly c-30) äquilibriert oder das 10% Glycerin mit 15% Dextran (70 kD) enthält, 30 Minuten äquilibriert, dann auf -180ºC gekühlt und 2-3 Tage bei -180ºC gelagert. Nach Auftauen wird die Lebensfähigkeit durch Bewertung der Gesamtzell-Wiederfindung (R), Koloniebildungsvermögen (CFE) und überleben der koloniebildenden Zellen (CFC) nach Disaggregation der Zellgewebeschicht bestimmt. CFC = wiedergefundene Zellen X CFE der wiedergefundenen Zellen (ausgedrückt in Prozent von nicht-gefrorenen, nicht-gelagerten Kontrollgewebeschichten). Zu beachten ist die erhöhte Zellwiederfindung, und daraus resultierend die erhaltene größere Lebensfähigkeit, wenn das nicht-zellpenetrierende Mittel zusammen mit dem zellpenetrierenden Mittel verwendet wird, im Vergleich zu der Verwendung von ausschließlich dem zellpenetrierenden Mittel.
Das allgemeine Phänomen einer erhöhten Lebensfähigkeit durch die Vewendung von nicht-zellpenetrierenden glasbildenden Mitteln kann durch den folgenden Test veranschaulicht werden:
Der Effekt von Dextran und Hespan (Hydroxyethylstärke) auf die Lebensfähigkeit von kryokonservierten kultivierten Epidermistransplantaten wird mit Transplantaten gezeigt, die in CPM, das entweder 15% Hespan, 15% Dextran (70 kD) oder 15% Dextran (500 kD) zusätzlich zu 10% Glycerin enthielt, 30 Minuten äquilibriert wurden, dann auf -180ºC gekühlt und 2 Tage gelagert wurden. Nach Auftauen wurde die Lebensfähigkeit durch Bewertung von R, CFE und CFC gemessen. Ergebnisse sind in Prozent von nicht-gefrorenen, nicht-gelagerten Kontrolltransplantaten angegeben. Diese Mittel sind hochmolekulargewichtige Formen von komplexen Kohlenhydraten. Das nicht-zellpenetrierende glasbildende Mittel ist vorzugsweise ein hochmolekulargewichtiges Dextran mit ungefähr 50-500 Kilodalton (kD), vorzugsweise 50-70 kD, Chondroitinsulfat, Polyvinylpyrrolidon, Polyethylenglycol oder eine Hetastärke, wie beispielsweise Hydroxyethylstärke. Das zellpenetrierende glasbildende Mittel ist vorzugsweise Glycerin, kann aber auch Propylenglycol, Ethylenglycol, Dimethylsulfoxid und andere penetrierende Glasbildner, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, umfassen.
Der Kryokonservierungsprozess erfordert zuerst ein Eintauchen der Zellgewebeschicht, die gefroren werden soll, in das Kryoschutz-Medium für eine hinreichende Zeit, um ein Äquilibrieren der Zellen mit dem Kryoschutz- Mittel zu erlauben. Der Effekt einer Langzeit-Äquilibrierung von kultivierten Epidermisschichten in einem Kryoschutz-Mittel vor Gefrieren auf die Lebensfähigkeit kann mit dem folgenden Test gezeigt werden:
Transplantate wurden bei Raumtemperatur in 15% Dextran (70 kD) und 10% Glycerin haltigem Kryoschutz- Medium 30, 60 und 120 Minuten äquilibriert. Nach Auftauen wurden Zellen in den Transplantaten auf R, CFE und CFC bewertet. Ergebnisse sind in Prozent von Kontrolltransplantaten angegeben. Die Daten zeigen, daß die Gewebeschicht bis zu zwei Stunden im Kryoschutz-Mittel vor Gefrieren äquilibriert werden kann, ohne daß die Lebensfähigkeit der Zellen in den kryokonservierten Gewebeschichten beeinflusst wird. Diese Äquilibrierung wird typischerweise ungefähr 30-60 Minuten bei etwa 17ºC bis 25ºC, typischerweise bei Raumtemperatur in einer Kryoschutz-Lösung in einer flachen Aufbewahrungsschale durchgeführt.
Im Anschluß an die Äquilibrierung wird die Schale, die die Gewebeschicht und die Kryoschutz-Lösung enthält, gas- und wasserdicht verschlossen. Die Gewebeschicht in dem verschlossenen Behälter wird mindestens auf etwa -65ºC gekühlt (z.B. mit Trockeneis, vorzugsweise unter -120ºC, und um eine länger andauernde Lagerung zu unterstützen auf ungefähr -180ºC bis etwa -196ºC. Die Kühlgeschwindigkeit ist vorzugsweise klein (Z.B. ≤ 1ºC/min) von etwa 0ºC bis mindestens -80ºC. Dies dient der Hemmung der Eiskristallbildung. Vorzugsweise wird das Kühlen gleich von Anfang an in einer geschwindigkeitskontrollierten Kühlvorrichtung, wie beispielsweise einem im Handel erhältlichen programmierbaren Zellgefriergerät (Cryomed, Inc. Nr. 1010/2700) auf eine Temperatur von -40ºC bis -100ºC, vorzugsweise etwa -80ºC bis -85ºC ausgeführt und dann in ein Flüssigstickstoffgefäß überführt und dann in Flüssigstickstoffdampf aufbewahrt, um die Temperatur noch weiter zu verringern.
Mit dem bevorzugten Gefrierprotokoll wird die Gewebeschicht in einem verschlossenen Behälter gekühlt, bis das Gewebe eine Temperatur von ungefähr 4ºC hat. Dann wird die Gewebeschicht mit etwa 1ºC pro Minute abgekühlt. Sobald die Temperatur der Gewebeschicht mindestens -65ºC und vorzugsweise mindestens -85ºC erreicht, wird der Behälter in einer Flüssigstickstoffkühlkammer überführt und bei ungefähr -180ºC (Stickstoffdampf) oder -196ºC (Flüssigstickstoff) gelagert.
Eine Lagerung des Gewebes bei oder unter -180ºC erhält das Koloniebildungsvermögen der Zellen besser als eine Lagerung des Gewebes bei höheren Temperaturen, wie es in Abbildung 2 gezeigt ist. Die Daten lassen eindeutig erkennen, daß eine Lagerung bei -180ºC in Flüssigstickstoffdampf einer Lagerung bei -80ºC in einem mechanischen Gefriergerät oder bei etwa -77ºC in Trockeneis überlegen ist. Da es eine dramatische Verringerung der Lebensfähigkeit während der ersten 2 oder 3 Tage Lagerungszeit bei -80ºC und -77ºC im Gegensatz zur stabilen Lebensfähigkeit bei -180ºC über längere Zeiträume gibt, werden die Transplantate vorzugsweise bei -180ºC transportiert.
Zum Auftauen der Gewebeschicht wird der verschlossene Behälter aus der Flüssigstickstoffkühlkammer entnommen und vorzugsweise etwa 1 Minute bis zu etwa 3 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur an der Luft gehalten. Dadurch stellt sich eine Erwärmungsrate von etwa 20ºC/min bis zu etwa 100ºC/min ein. Das Transplantat kann dann auf Raumtemperatur ohne Rücksicht auf die Erwärmungsrate erwärmt werden. Vorzugsweise wird der letzte Schritt durch Eintauchen des verschlossenen Behälters in ein Wasserbad ausgeführt, bis das Transplantat aufgetaut ist. Dies verhindert, daß die Gewebeschicht zerstört wird. Das Auftauen erfolgt; in etwa 1,25 Minuten in einem 37ºC Wasserbad. Falls das Wasserbad 25ºC hat, dauert ein Auftauen etwa 1,5 Minuten. Alternativ kann auch ohne Wasserbad aufgetaut werden, und die Gewebeschicht taut bei Raumtemperatur auf. Allerdings dauert dies etwa 25 Minuten und führt oft zu einer Reduzierung der Zellebensfähigkeit.
Die aufgetaute Gewebeschicht wird aus dem Kryoschutz-Mittel innerhalb 1 Stunde, vorzugsweise so bald als möglich, entnommen. Sobald das Gewebe aufgetaut ist, kann der Behälter geöffnet und die Kryokonservierungslösung durch eine isotonische Puffer-Lösung mit physiologischem pH (etwa 6,8-7,4), vorzugsweise FAD Medium oder Ringers Lactat-Lösung, ersetzt werden, um das Kryoschutz-Mittel auszudünnen. Tabelle 1A zeigt, daß nicht alle isotonisch gepufferten Lösungen mit physiologischem pH zur Verdünnung des Kryoschutz-Mittels geeignet sind. Phosphat gepufferte Sahne und Standard- Sahne vermindern die Lebensfähigkeit signifikant, wie aus CFE geschlossen wurde. Das aufgetaute Gewebe wird in einem Spül-Puffer vorzugsweise 15 Minuten äquilibriert und kann bis zu 4 Stunden mit einem leichten Rückgang an CFE darin verbleiben (Tabelle 1B). TABELLE 1A Entfernen von Kryoschutz-Medium aus kryokonservierten kultivierten Epidermistransplantaten nach Auftauen. Verwendung von isotonischen Puffern mit pysiologischem pH als Spül-Lösungen.
Transplantate wurden aus dem Kryoschutz-Medium entnommen und in eine Spül-Lösung mit Raumtemperatur 15 Minuten verbracht. Koloniebildungsvermögenstests wurden durchgeführt und die Wiederfindung von CFE (rCFE) wurde in Prozent von nicht-gefrorenen, nicht-gelagerten Kontrolltransplantaten berechnet. FAD, F12/DME Keratinocyten-Wachstumsmedium; PBS, Phosphat gepufferte Saline, Gewöhnliche Sahne, 0,9% Sahne. TABELLE 1B Effekt einer erhöhten Spül-Dauer auf aufgetaute Transplantate
Transplantate wurden aus dem Kryoschutz-Medium entnommen und in FAD Spül-Lösung bei Raumtemperatur für unterschiedliche Zeiten, die oben angegeben sind, verbracht. Koloniebildungsvermögenstests wurden durchgeführt und die Wiederf indung von CFE (rCFE) wurden in Prozent von nicht-gefrorenen, nicht-gelagerten Kontrolltransplantaten berechnet.
Einige Einschränkungen des letzten Verfahrensschritts der Kryokonservierung wurden getestet und sind in Abbildung 3 gezeigt. Die Daten zeigen, daß kultivierte Epithelzellgewebeschichten in einem Kryoschutz-Mittel vor Gefrieren bis zu einer Stunde äquilibriert werden können, gefroren, aufgetaut, bis zu einer Stunde nach Auftauen im Kryoschutz-Mittel bleiben können und zum Schluß bis zu 2 Stunden in Ringers Lactat-Lösung gespült werden können, und eine intakte Zellschicht, die lebensfähig ist und zur Fortsetzung einer normalen physiologischen Funktion fähig ist, produziert wird.
Eine, wie oben offengelegt, präparierte Gewebeschicht kann chirurgisch auf einen sauberen Hautdefekt, wie beispielsweise Brandwunde oder Geschwür, verbracht werden unter Verwendung des Gazeträgers als eine Abdeckung, wobei die teilungsfähige Schicht mit der Wundoberfläche in Kontakt kommt. Allotransplantat-Gewebeschichten lösen sich eventuell ab, aber vor einer Abstoßung liefern sie einen sicheren und wirksamen Wundschutz und fördern oftmals die Wundheilung. Autotransplantat-Gewebeschichten wachsen dauerhaft an und differenzieren und bilden eine intakte normal stratifizierte Haut. Die höheren CFC und CFE Werte, die mit dieser Kryokonservierungsmethodologie erzielt werden, zeigen, daß eine größere Anzahl an einzelnen Zellen in der Gewebeschicht mitotisch kompetent sind, und deshalb eine größere Anzahl an Epithelzell-Kolonien sich an der Wundstelle folglich bilden.
Die Erfindung wird mit Hilfe der folgenden Beispiele, die nicht als Einschränkung zu verstehen sind, näher erläutert.

Beispiel 1

Das geerntete kultivierte Transplantat wird in einer flachen Aufbewahrungsschale in eine Kryoschutz- Lösung, die 15% Dextran (70.000 MG) und 10% Glycerin im Medium umfaßt, verbracht. Der Behälter wird verschlossen, so daß er gas- und wasserdicht ist und genügend Flüssigkeit enthält, so daß wenig oder keine Luft verbleibt, und die Transplantate werden bei Raumtemperatur 30 min äquilibriert.
Die Gewebeschicht wird in dem verschlossenen Behälter gekühlt, bis die Gewebeschicht eine Temperatur von ungefähr 4ºC hat. Die Gewebeschicht wird dann mit 1ºC pro Minute auf ungefähr -85ºC gekühlt. Sobald die Tem peratur die Gewebeschicht -85ºC erreicht, wird der Behälter in eine Flüssigstickstoffkühlkammer überführt und danach in Flüssigstickstoffdampf (etwa -180ºC) aufbewahrt.
Um die Gewebeschicht aufzutauen, wird der Behälter aus der Flüssigstickstoffkühlkammer entnommen und bei Raumtemperatur an Luft etwa 1 Minute gehalten. Dann wird er in ein 37ºC Wasserbad ungefähr 75 sec verbracht, bis die Gewebeschicht aufgetaut ist. Sobald die Gewebeschicht aufgetaut ist, wird der Behälter geöffnet und die Gewebeschicht in Ringers Lactat-Lösung mit einem physiologischen pH 5 min verbracht. Der Puffer wird dann gewechselt, und die Gewebeschicht wird dann in dem Medium wenigstens weitere 10 Minuten äquilibriert.

Beispiel II

Das Transplantat wird in einer flachen Aufbewahrungsschale in eine Kryoschutz-Lösung, die 15% Hydroxyethylstärke (Hespan ) und 10% Glycerin bei Raumtemperatur 15 min. äquilibriert. Im Anschluß an die Äquilibrierung wird der Behälter verschlossen, so daß er gas- und wasserdicht ist.
Die Gewebeschicht in dem verschlossenen Behälter wird gekühlt, bis das Gewebe eine Temperatur von ungefähr 4ºC hat. Im Anschluß an diesen Schritt wird die Gewebeschicht mit 1ºC pro Minute auf ungefähr -85ºC gekühlt. Sobald die Temperatur der Gewebeschicht -85ºC erreicht, wird sie in eine Flüssigstickstoffkühlkammer überführt und in Flüssigstickstoff (ungefähr -196ºC) aufbewahrt.
Um die Gewebeschicht auf zutauen, wird der verschlossene Behälter aus der Flüssigstickstoffkammer entnommen und bei Raumtemperatur an Luft ungefähr 1 Minute gehalten. Sobald die Gewebeschicht aufgetaut ist, wird der Behälter geöffnet und die Gewebeschicht in Ringers Lactat-Lösung oder Serum-freies DME/F12 Keratinocyten-Wachstumsmedium mit einem physiologischen pH 5 min verbracht. Nach 5 min wird der Puffer ausgetauscht und die Gewebeschicht in dem Medium bis zu 4 Stunden äquilibriert.
Die Erfindung kann in anderen spezifischen Formen angewandt werden. Andere Anwendungen liegen im Rahmen der folgenden Ansprüche.

Claims

1. Ein Verfahren zur Herstellung eines kohäsiven Gewebes lebender Epithelzellen, das die Schritte umfaßt:

A. Bereitstellen eines kultivierten, leicht stratifizierten Gewebes von Epithelzellen, das von seiner unterlagernden Schicht getrennt ist;

B. Eintauchen besagten kultivierten Gewebes in eine Kryoschutz-Lösung;

C. Kühlen des Gewebes in der Kryoschutz-Lösung auf eine Temperatur, die im Bereich von und unter -65ºC liegt;

D. Aufbewahren des aus Schritt C resultierenden Gewebes bei einer Temperatur, die im Bereich von und unter -65ºC liegt;

dadurch gekennzeichnet, daß in Schritt B die Zellen in die Kryoschutz-Lösung für eine Zeit eingetaucht werden, die hinreichend ist, um eine Äquilibrierung der Zellen mit der Kryoschutz-Lösung zu erlauben, wobei die Kryoschutz-Lösung ein nicht-zellpenetrierendes glasbildendes Mittel in Kombination mit einem zellpenetrierenden glasbildenden Mittel umfaßt, und sodann

das kryokonservierte Gewebe aufgetaut wird, und das aufgetaute Gewebe ein intaktes, mitotisch kompetentes Gewebe lebensfähiger Zellen ist, die zu einer stratifizierten Differenzierung in der Lage sind, sowie besagtes intaktes Gewebe als eine Hautdefekt-Abdeckung geeignet ist.

2. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Lösung 5% bis 20% von besagtem nicht-zellpenetrierenden glasbildenden Mittel umfaßt.

3. Das Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das nicht-zellpenetrierende glasbildende Mittel aus der Gruppe gewählt ist, die aus Dextran, Polyethylenglycol, Polyvinylpyrrolidon, Hydroxyethylstärke, Chondroitinsulfat und Mischungen und Derivaten davon besteht.

4. Das Verfahren nach Anspruch 3, worin das nichtzellpenetrierende glasbildende Mittel Dextran mit einem Molekulargewicht von 70 Kilodalton bis 500 Kilodalton ist, und worin besagtes Dextran mit dem zellpenetrierenden Mittel Glycerin kombiniert ist.

5. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Kryoschutz- Lösung im wesentlichen 10 Gewichtsprozent eines zellpenetrierenden glasbildenden Mittels umfaßt, das aus der Gruppe gewählt ist, die aus Glycerin, Dimethylsulfoxid und Mischungen und Derivaten davon besteht.

6. Das Verfahren nach einem der vorausgehenden Ansprüche, worin die Zellen in Schritt B für einen Zeitraum zwischen 15 Minuten und 180 Minuten eingetaucht sind.

7. Das Verfahren nach Anspruch 6, worin das Gewebe bis zu und einschließlich 120 Minuten in besagter Kryoschutz- Lösung bei 17ºC bis 30ºC eingetaucht ist und dann auf 4ºC innerhalb von 60 Minuten gekühlt wird.

8. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin

a) der Kühlschritt mit einer Rate von etwa 1ºC pro Minute durchgeführt wird, um das Gewebe von 4ºC auf unter -80ºC zu kühlen; oder

b) das Gewebe langsam auf -80ºC gekühlt und dann auf eine Temperatur gekühlt wird, die im Bereich von und unter 180ºC liegt; oder

c) die Kühl- und Aufbewahrungsschritte auf eine Temperatur von und unter -120ºC ausgeführt werden; oder

d) die Kühl- und Aufbewahrungsschritte auf eine Temperatur von und unter -180ºC ausgeführt werden, wodurch das Aufbewahrungsintervall verlängert werden kan oder

e) das Gewebe auf eine Temperatur unter ca. -180ºC gekühlt wird und das Auftauen des Gewebes bis zu dem Temperaturbereich von -120ºC bis -80ºC durch Inkubieren des Gewebes in einem Gas durchgeführt wird und ein nachfolgendes Auftauen durch Eintauchen in eine Flüssigkeit durchgeführt wird; oder

f) der Auftauschritt ein Erwärmen des Gewebes bis zu einem Bereich von -80ºC in einem Zeitraum zwischen 1 Minute und 5 Minuten und dann auf Raumtemperatur umfaßt.

9. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin die Kühl- und Aufbewahrungsschritte in einem festen, transparenten, sterilen, gasundurchlässigen Behälter durchgeführt werden.

10. Das Verfahren nach Anspruch 1, das die zusätzlichen Schritte umfaßt:

e) Entfernen des Kryoschutz-Mittels von dem aufgetauten Gewebe, um die Lebensfähigkeit von besagtem Gewebe durch Überführen in eine isotonische Salzlösung für einen Zeitraum von bis zu vier Stunden zu erhalten, und gegebenenfalls worin die isotonische Salzlösung ein Kulturmedium, wie beispielsweise DME/F12 oder Ringers Lactat-Lösung, ist.

11. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt B durch Flüssigstickstoffdampf-Exposition des Gewebes durchgeführt wird.

12. Das Verfahren nach Anspruch 1, worin

a) das intakte Gewebe lebensfähiger Zellen durch Beibehalten eines Koloniebildungsvermögens von mindestens 35% gekennzeichnet ist; oder

b) das intakte Gewebe lebensfähiger Zellen durch eine Zellwiederfindung von mindestens 35% gekennzeichnet ist.

13. Das Verfahren nachanspruch 1, das den zusätzlichen Schritt der Fixierung des Gewebes auf einem Träger vor Schritt B umfaßt.

14. Ein Verfahren zur Behandlung eines mit einem Kryoschutz-Mittel imprägnierten Epithelzellgewebes bei einer Temperatur von unter -180ºC, um dieses für ein Auftragen auf einen Patienten als eine Hautdefektabdeckung zu präparieren, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: Erhöhen der Temperatur des Gewebes bis zu einem Bereich von -120ºC bis -80ºC mit einer Rate von 20ºC pro Minute bis 100ºC pro Minute und danach Erhöhen der Temperatur auf etwa 20ºC bis 37ºC.

15. Das Verfahren nach Anspruch 14, worin das Gewebe auf die Temperatur von -80ºC durch Gas-Exposition erwärmt wird und dann auf 20ºC bis 37ºC in einer Flüssigkeit erwärmt wird.

16. Das Verfahren nach Anspruch 14, das den zusätzlichen Schritt des Entfernens des Kryoschutz-Mittels, mit dem besagtes Gewebe imprägniert ist, durch Inkubieren besagten Gewebes in einer isotonischen Salzlösung für einen Zeitraum von bis zu vier Stunden umfaßt.

13. Das Verfahren nach Anspruch 1, das den zusätzlichen Schritt der Fixierung des Gewebes auf einem Träger vor Schritt B umfaßt.

16. Das Verfahren nach Anspruch 14, das den zusätzlichen Schritt des Entfernens des Kryoschutz Mittels, mit dem besagtes Gewebe imprägniert ist, durch Inkubieren besagten Gewebes in einer isotonischen Salzlösung für einen Zeitraum von bis zu vier Stunden umfaßt.