DE69131514T2

DE69131514T2 - Herstellung von biologisch aktiven rekombinanten Mitgliedern der NGF/BDNF-Familie neurotroper Proteine

Info

Publication number: DE69131514T2
Application number: DE69131514T
Authority: DE
Inventors: Susan Bektesh; Frank D. Collins; Tadahiko Kohno; Jack Lile; Drzislav Mismer
Original assignee: Amgen Inc
Current assignee: Amgen Inc
Priority date: 1990-04-06
Filing date: 1991-03-18
Publication date: 2000-05-04
Anticipated expiration: 2011-03-19
Also published as: ATE183232T1; FI108146B; NO911303D0; FI911643L; IE910827A1; JPH06319549A; NZ237544A; NO911303L; CA2038669A1; US5235043A; GR3031632T3; AU7413091A; TW206258B; AU651339B2; EP0450386B1; EP0450386A3; JP2521851B2; FI911643A0; CA2038669C; NO308308B1

Description

Bereich der Erfindung

Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung rekombinanter Mitglieder der NGF/BDNF-Familie von menschlichen neurotrophen Proteinen in biologisch aktiver Form.

Hintergrund der Erfindung

Neurotrophe Faktoren sind natürliche Proteine, die im Nervensystem oder in nichtnervösen Geweben, die vom Nervensystem innerviert werden, zu finden sind, und deren Funktion darin besteht, das Überleben von Nerven- und/oder Gliazellen zu fördern und ihre phänotypische Differenzierung zu erhalten (Varon und Bunge, 1978, Ann. Rev. Neuroscience 1, 327; Thoenen und Edgar, 1985, Science 229, 238). Wegen dieser physiologischen Rolle können neurotrophe Faktoren zur Behandlung der Nervenzellendegeneration sowie des Verlusts der Differenzierungsfunktion verwendet werden, die bei einer Vielzahl neurodegenerativer Erkrankungen wie etwa bei der Alzheimer- oder der Parkinson- Krankheit oder nach traumatischen Verletzungen wie Schlaganfall oder physischem Rückenmarktrauma auftreten (Appel, 1981, Ann. Neurology 10, 499).
Damit ein bestimmter neurotropher Faktor bei der Behandlung eines Nervenschadens potentiell verwendbar ist, muß er bei dem beschädigten Nervenzellentyp bzw. den beschädigten Nervenzellentypen eine Reaktion hervorrufen. Typischerweise wirken verschiedene neurotrophe Faktoren auf unterschiedliche Typen von Nervenzellen. Daher ist es ratsam, zur Behandlung von unterschiedlichen Typen von beschädigten Neuronen, die bei unterschiedlichen Erkrankungs- oder Verletzungsformen auftreten, über eine Vielzahl verschiedener neurotrophen Faktoren zu verfügen.
Neben der richtigen neuronalen Spezifität muß ein bestimmter neurotropher Faktor für die Verwendung zur pharmazeutischen Behandlung in hinreichender Menge erhältlich sein. Da neurotrophe Faktoren Proteine sind, wäre es ferner zur Vermeidung einer Immunantwort auf ein fremdes Protein zweckmäßig, menschlichen Patienten nur die menschliche Form des Proteins zu verabreichen.
Da neurotrophe Faktoren typischerweise in verschwindend kleinen Mengen im Gewebe vorhanden sind (z. B. Hofer und Barde, 1988, Nature 331, 261; Lin et al., 1989, Science 246, 1023) und menschliches Gewebe zur Extraktion nicht leicht erhältlich ist, wäre die Gewinnung menschlicher neurotropher Faktoren in für die pharmazeutische Anwendung erforderlichen Mengen direkt aus menschlichem Gewebe schwierig. Als Alternative wäre es zweckmäßig, das menschliche Gen für einen neurotrophen Faktor zu isolieren, und dieses Gen als Grundlage zur Etablierung eines rekombinanten Expressionssystems für die Herstellung potentiell unbegrenzter Mengen des menschlichen Proteins zu benutzen.
Es sind zwei neurotrophe Faktoren beschrieben worden, die hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz eng verwandt sind, aber auf unterschiedliche - obgleich sich teilweise überschneidende- Gruppen reagierender Neuronen wirken (Leibrock et al., 1989, Nature 341, 149). Diese zwei neurotrophen Faktoren sind: (1) der Nervenwachstumsfaktor (nerve growth factor, NGF) und (2) der aus dem Gehirn stammende neurotrophe Faktor (brain-derived neurotrophic factor, BDNF). Sowohl NGF als auch BDNF werden anscheinend als größere Vorläuferform synthetisiert, die dann zur Erzeugung des reifen neurotrophen Faktors durch proteolytische Spaltung prozessiert wird (Edwards et al., 1986, Nature 319, 784; Leibrock et al., 1989, a. a. O.). Die einzigen bisher beschriebenen Gene für Mitglieder der vorgeschlagenen NGF/BDNF. Familie von neurotrophen Proteinen sind das menschliche NGF-Gen sowie verschiedene NGF-Gene in Tieren (Scott et al., 1983, Nature 302, 538; Ullrich et al., 1983, Nature 303, 821; Meier et al., 1986, EMBO J. 5, 1489) und das BDNF-Gen des Schweins (Leibrock et al., 1989, a. a. O.). Die reifen NGFs und der reife BDNF weisen eine signifikante Ähnlichkeit in der Aminosäuresequenz auf, einschließlich der relativen Position aller sechs Cystein-Aminosäurereste, die bei den reifen NGFs und BDNF aller untersuchten Arten identisch ist (Leibrock et al., 1989, a. a. O.). Siehe Fig. 7, in der die menschlichen Formen von NGF und BDNF verglichen und ihre Ähnlichkeiten hervorgehoben werden. Dies legt nahe, daß die dreidimensionale Struktur dieser zwei Proteine, die durch die Lage der Disulfidbindungen bestimmt wird, ähnlich ist. Dazu ist beiden reifen Proteinen ein alkalischer isoelektrischer Punkt (pl) gemeinsam.
NGF wirkt als neurotropher Faktor zumindest für cholinerge Neuronen in dem basalen vorderen Hirnteil (Hefti und Will, 1987, J. Neutral Transm. [Ergänz] (ÖSTERREICH) 24, 309). Man vermutet, daß die in Laufe der Alzheimer-Krankheit eintretende funktionelle Inaktivierung und die Degeneration der auf NGF reagierenden cholinergen Neuronen im basalen vorderen Hirnteil die unmittelbare Ursache für die mit dieser Krankheit verbundenen kognitiven und das Gedächtnis betreffenden Ausfälle ist (Hefti und Will, 1987, a. a. O.). Es wurde gezeigt, daß NGF die Degeneration verhindert und in Tiermodellen für die Alzheimer-Krankheit die Funktion der cholinergen Neuronen des basalen vorderen Hirnteils wiederherstellt; aus diesem Grund wurde NGF zur Verhinderung der Degeneration und zur Wiederherstellung der Funktion dieser Neuronen als Behandlung für die Alzheimer-Krankheit vorgeschlagen (Williams et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 9231; Hefti, 1986, J. Neuroscience 6, 2155; Kromer, 1987, Science 235, 214; Fischer et al., 1987, Nature 329, 65).
BDNF wirkt als neurotropher Faktor für sensorische Neuronen des periphären Neuronensystems (Barde, 1989, Neuron 2, 1525). Aus diesem Grund könnte sich BDNF zur Behandlung des Verlusts an Empfindungsvermögen als brauchbar erweisen, der mit der bei verschiedenen periphären Neuropathien auftretenden Beschädigung der sensorischen Nervenzellen in Verbindung steht (Schaumberg et al., 1983, "Disorders of Peripheral Nerves" F. A. Davis Co., Philadelphia, PA.).
Rekombinante Expressionssysteme, die die für pharmazeutische Entwicklung benötigten großen Mengen des biologisch vollaktiven und strukturell unveränderten reifen NGF produzieren können, werden dringend gebraucht. Siehe die europäische Patentveröffentlichung EP 89113709, dis die rekombinante Expression von NGF in Insektenzellen beschreibt. Biologisch aktiver reifer NGF kann durch Expression von menschlichen oder tierischen NGF-Genen in eukaryontischen Zellexpressionssystemen hergestellt werden (z. B. Edwards et al., 1988, Molec. Cell. Biol. 8, 2456). In derartigen Systemen wird zuerst die vollständige Vorläuferform des NGF synthetisiert und dann zum Erhalt von biologisch aktivem reifem NGF mit der richtigen 3-dimensionalen Faltung proteolytisch prozessiert. Eukaryontische Zellexpressionssysteme produzieren jedoch oft relativ geringe Proteinmengen pro Gramm Zellen und sind für die Verwendung in der Produktion relativ teuer.
Hingegen liefern Expressionssysteme unter Verwendung von prokaryotischen Zellen wie etwa Bakterien relativ große Mengen des exprimierten Proteins pro Gramm Zellen und sind für die Verwendung in der Produktion relativ kostengünstig. Jedoch wurde bisher kein geeignetes bakterielles Expressionssystem beschrieben, das biologisch vollaktiven und strukturell unveränderten reifen NGF herstellen kann. Ein bakterielles Expressionssystem wird in dem kanadischen Patent Nr. 1 220 736 offenbart. Verfahren zur Rückfaltung des exprimierten Proteins werden jedoch nicht vorgeschlagen. Dieser Mangel kann wahrscheinlich auf Probleme zurückgeführt werden, die mit bakteriellen Expressionssystemen in allgemeinen verbunden sind, oder auch mit solchen, die den speziellen Methoden zur Produktion von NGF in Bakterien zugerechnet werden können.
Bakterien sind nicht in der Lage, Vorläuferproteine wie etwa das Vorläuferprotein für NGF durch geeignete proteolytische Spaltungen richtig zu prozessieren, so daß das richtige kleinere reife Protein erhalten wird.
Zur Herstellung von reifem NGF in Bakterien darf daher nur der Abschnitt der DNA-Sequenz für NGF, der das reife Protein kodiert, exprimiert werden, und nicht die längere Vorläuferform. Auf diese Weise wurden in dem Bakterium Escherichia coli relativ große Mengen des reifen menschlichen NGF- Proteins hergestellt (siehe z. B. Iwai et al., 1986, Chem. Pharm. Bull. 34, 4724; Dicou et al., 1989, J. Neurosci. Res. 22, 13, EP-Anmeldung 121 338). Leider wies das in Bakterien exprimierte Protein nur geringe oder gar keine biologische Aktivität auf.
Hu und Neet, 1988, Gene 70, 57 offenbaren die rekombinante Expression des β-Nervenwachstumfaktors der Maus in E. coli. Mittels eines Biotests und eines Enzym-Immuntests wurde bei der rekombinanten Expression eine Ausbeute von 60 ng/l bzw. 10 ng/l der bakteriellen Ausgangskultur ermittelt. Es zeigte sich jedoch, daß die durch Western-Blot ermittelte Proteinausbeute deutlich höher, d. h. etwa 50 ug/l war. Die Autoren nahmen an, daß der Unterschied auf das falsch gefaltete Protein zurückzuführen war, das möglicherweise fehlgepaarte Disulfidbindungen enthielt.
WO87/02985 offenbart ein Verfahren zum Erhalten einer nativen Konformation des Polypeptids Thaumatin, eines Polypeptids mit mehreren Disulfidbrücken. Das Verfahren schließt die Denaturierung des Proteins, die Reduktion und die Bildung eines stabilen Adukts durch Senkung der Konzentration des Reduktionsmittels und gleichzeitige Zugabe von Disulfid-enthaltenden Verbindungen ein. Wurde die Konzentration des Reduktionsmittels nicht gesenkt, so betrug die beobachtete biologische Aktivität nicht mehr als 1%.
Ein Verfahren zur Rückfaltung von in Bakterien exprimiertem NGF, bei dem der in Bakterien hergestellte reife NGF eine gewisse biologische Aktivität wiedererlangt, wird in der europäischen Patentanmeldung 336 324 beschrieben. Dieses Verfahren hat jedoch gravierende Mängel.
Reifer menschlicher NGF war bisher nicht in für die pharmazeutische Anwendung hinreichenden Mengen erhältlich, weil viele eukaryontische Expressionssysteme teuer sind und oft nicht genügende Mengen des reifen NGF produzieren. Die bisher beschriebenen bakteriellen Expressionssysteme produzierten den biologisch aktiven und chemisch unveränderten reifen NGF nicht in Mengen, die für die pharmazeutische Anwendung hinreichend sind. Da der reife menschliche NGF wahrscheinlich zur Be handlung der Alzheimer-Krankheit verwendbar ist, wird die Nichtverfügbarkeit dieses Stoffes in wisschenschaftlichen und klinischen Kreisen sehr bedauert. Eine vom Nationalen Institut für Altersforschung berufene Gruppe führender Wissenschaftler betrachtete die Nichtverfügbarkeit von biologisch aktivem reifem menschlichem NGF als die kritische Barriere für die weitere Entwicklung von NGF als Behandlung für die Alzheimer-Krankheit (Phelps et al., 1989, Science 232, 11).
Man nimmt an, daß ähnliche Schwierigkeiten bei der Herstellung anderer Mitglieder der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen auftreten würden, weil die bisher beschriebenen Mitglieder dieser Familie Cysteinreste an identischen Positionen aufweisen und daher vermutlich ein Muster von intramolekularen Disulfidbindungen bilden, das mit dem von NGF identisch ist (Angeletti et al., 1973, Biochemistry 12, 100).
Angesichts des ersichtlichen Wertes derartiger neurotropher Proteine und der vorstehend angezeigten gegenwärtigen Einschränkungen bei der Produktion großer Mengen der biologisch aktiven Proteine bestünde der Bedarf nach Verfahren zur Rückfaltung von Mitgliedern der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen, die es erlauben, eine spezifische biologische Aktivität zu erhalten.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Mitgliedern der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen.
Ein Verfahren zur Expression von Mitgliedern der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen in einem effizienten bakteriellen Expressionssystem, insbesondere in Escherichia coli wird angegeben. Darüber hinaus wird ein Verfahren beschrieben, mit dem die biologische Aktivität reifer, jedoch biologisch inaktiver menschlicher neurotropher Proteine, die in Bakterien produziert würden, wiederhergestellt werden kann.
Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der reifen, biologisch aktiven Form eines menschlichen neurotrophen Proteins in einem Zellexpressionssystem in einer prokaryotischen Zelle, wobei das neurotrophe Protein aus der NGF/BDNF-Familie der neurotrophen Faktoren ausgewählt wird, umfassend:
(i) Einfügen des für das reife Protein kodierenden Gens in einen Vektor,
(ii) Exprimieren des Gens, wodurch eine biologisch inaktive Form des Proteins gebildet wird; und
(iii) Rückfalten und Renaturieren der biologisch inaktiven Form in einem Reaktionsmedium, dessen Erzeugung folgende Schritte umfaßt:
Spalten sämtlicher intramolekularer und intermolekularer Disulfidbindungen in einer Lösung des neurotrophen Proteins durch Zugabe eines Denaturierungsmittels und eines Reduktionsmittels in die Lösung und Erzeugen freier Thiolreste; Oxidieren der freien Thiolreste mit einer Disulfid-enthaltenden Verbindung, wodurch sich gemischte Disulfidbindungen bilden, wobei das Reduktionsmittel nicht entfernt wird; und Verdünnen der Lösung in Anwesenheit einer Thiol-enthaltenden Verbindung.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die prokaryotische Zelle eine bakterielle Zelle.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die bakterielle Zelle ein E. coli-Stamm von E. coli.
Insbesondere wird ein Verfahren zur Expression von NGF und die wirksame Renaturierung von reifem menschlichem NGF in eine biologisch aktive Form beschrieben. Ein bisher nicht beschriebenes Mitglied der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen, das hier als NGF-3 bezeichnet wird, wurde identifiziert, die Nukleinsäuresequenz des menschlichen, NGF-3 kodierenden Gens wurde identifiziert und die davon abgeleitete Aminosäuresequenz für NGF-3 beschrieben.
Die vorliegende Erfindung schließt ebenfalls die Herstellung gereinigter Formen aller Mitglieder der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen ein, die als pharmazeutische Präparate zur Behandlung der Degeneration von Nervenzellen und des Verlusts der Differenzierungsfunktion, der bei verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten auftritt, wertvoll wären. Diese Anmeldung beschreibt das Gen, das den menschlichen, vom Gehirn stammenden neurotrophen Faktor (BDNF) kodiert und im wesentlichen die in Fig. 1 angegebene Nukleinsäuresequenz umfaßt, sowie diese Sequenz, bei der an Position 196 und/oder an Position 668 A durch G substituiert ist. Beschrieben werden auch der reife, vom Gehirn stammende menschliche neurotrophe Faktor (BDNF), der im wesentlichen die in Fig. 1 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt, sowie diese Sequenz, in der bei Aminosäure 66 Methionin durch Valin und/oder bei Aminosäure 223 Lysin durch Arginin substituiert ist. Der reife menschliche NGF-3, der die in Fig. 7 angegebene Aminosäuresequenz umfaßt, und das Gen, das den reifen menschlichen NGF-3 kodiert und die in Fig. 6 angegebene Nukleinsäuresequenz umfaßt, werden ebenfalls beschrieben.
Ein Verfahren zur Rückfaltung und Renaturierung reifer neurotropher Proteine der NGF/BDNF- Familie, bei dem die Proteine im wesentlichen ihre vollständige biologische Aktivität erlangen, wird ebenfalls offenbart. Dieses Verfahren umfaßt:
Erzeugung eines Reaktionsmediums, die folgende Schritte enthält: Spalten sämtlicher intramolekularer und intermolekularer Disulfidbindungen in einer Lösung des neurotrophen Proteins durch Zugabe eines Denaturierungsmittels und eines Reduktionsmittels in die Lösung und Erzeugen freier Thiolreste; Oxidieren der freien Thiolreste mit einer Disulfid-enthaltenden Verbindung, wodurch sich gemischte Disulfidbindungen bilden, wobei das Reduktionsmittel nicht entfernt wird; und Verdünnen der Lösung in Anwesenheit einer Thiol-enthaltenden Verbindung, wobei das Reaktionsmedium zuläßt, daß das neurotrophe Protein verschiedene 3-dimensionale Konformationen und verschiedene intramolekulare Disulfidbindungsmuster annimmt, und wobei das Protein die energetisch stabilste Konformation annehmen wird; und Isolierung des neurotrophen Proteins aus dem Reaktionsmedium.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Reaktionsmedium unter anaeroben Bedingungen gehalten.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Reaktionsmedium ein Glykol-enthaltendes Reagens, vorzugsweise Polyethylenglykol.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das Denaturierungsmittel Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Disulfid-enthaltende Verbindung oxidiertes Glutathion, Cystin oder Cystamin.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Thiol-enthaltende Verbindung Cystein oder Dithiothreit.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das neurotrophe Protein der menschliche NGF.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das neurotrophe Protein der menschliche BDNF.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das neurotrophe Protein der menschliche NGF-3.
Die Erfindung beschreibt ferner ein bakterielles Zellexpressionssystem zur Herstellung der reifen, biologisch aktiven Form eines menschlichen neurotrophen Proteins, welches das Einfügen des das Protein kodierenden Gens in einen Vektor, das Exprimieren des Gens zum Erhalt einer biologisch inaktiven Form des Proteins, und das Rückfalten und Renaturieren der biologisch inaktiven Form umfaßt.
Es wird hervorgehoben, daß sowohl die vorangehende allgemeine Beschreibung als auch die nachstehende detaillierte Beschreibung lediglich als Beispiel und Erläuterung dienen und die beanspruchte Erfindung nicht einschränken. Die angefügten Zeichnungen, die in die Beschreibung einbezogen und Teil dieser sind, veranschaulichen verschiedene Ausführungsformen der Erfindung und dienen zusammen mit der Beschreibung zur Erläuterung der Grundlagen der Erfindung.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt die Nukleinsäure sowie die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen des menschlichen BDNF dar. Die abgeleitete Aminosäuresequenz der reifen (prozessierten) Form des BDNF ist fett gedruckt.
Fig. 2 stellt die Expression des reifen (prozessierten) menschlichen NGF in E. coli dar, und zwar in dem Vektor pT5T. Einzelheiten werden bei den Ausführungen zu Beispiel 2 angegeben.
Fig. 3 stellt den Verlust und die Wiedererlangung der biologischen Aktivität nach Denaturlerung bzw. Rückfaltung des in eukaryontischen Zeilen hergestellten, reifen menschlichen NGF dar.
Fig. 4 stellt bestimmte Komponenten des bakteriellen Expressionsvektors pT5T dar. Diese Komponenten sind nur symbolisch und nicht maßstabsgetreu gezeichnet. Das NGF-Insert soll für ein beliebiges Mitglied der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen stehen.
Fig. 5 stellt bestimmte Komponenten des bakteriellen Expressionsvektors pT3XI-2 dar. Die Komponenten sind nur symbolisch und nicht maßstabsgetreu gezeichnet. Das NGF-Insert soll für ein beliebiges Mitglied der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen stehen.
Fig. 6 ist ein Vergleich der Nukleinsäuresequenz von NGF-3 mit der Sequenz von NGF bzw. BDNF. Die durch Striche gekennzeichneten Lücken entsprechen der Position von zur Ausrichtung der Aminosequenzen eingesetzten Lücken (siehe Fig. 7). Die durch PCR erhaltene, partielle Nukleinsäuresequenz von NGF-3 ist unterstrichen.
Fig. 7 ist ein Vergleich der Aminosäuresequenz von NGF-3 mit der Sequenz von NGF und BDNF. Die abgeleiteten Sequenzen der reifen Proteine sind fettgedruckt. In der Sequenz von reifem BDNF bzw. NGF unterstrichene Aminosäuren sind mit den entsprechenden Aminosäuren von NGF-3 identisch. In der Sequenz von reifem NGF-3 unterstrichene Aminosäuren sind mit den entsprechenden Aminosäuren sowohl von NGF als auch von BDNF identisch. Zur Optimierung der Ausrichtung wurden in den Sequenzen Lücken eingefügt, die durch Striche gekennzeichnet sind. Die sechs Cysteine von BDNF, NGF und NGF-3 befinden sich bei allen drei Proteinen an den gleichen Positionen und sind in Klammem gesetzt.
Fig. 8 stellt den in E10-Ganglionneuronen aus der dorsalen Rückenmarkswurzel von Hühnern durchgeführten Biotest für Extrakte aus mit dem Plasmid pSG5 transfizierten COS-7-Zellen dar, und zwar mit einem Insert mit menschlichem BDNF und ohne Insert.
Fig. 9 stellt eine Dosis-Wirkungs-Kurve für den in Insektenzellen hergestellten rekombinanten menschlichen NGF bei Anwendung des Biotests in E11-Neuronen aus sympathischen Ganglien von Hühnerembryonen dar.
Fig. 10 stellt die Bioaktivität einer Verdünnungsreihe des fertigen Rückfaltungsgemisches für den in E. coli hergestellten rekombinanten menschlichen NGF bei Anwendung des Biotests in E11-Neuronen aus sympathischen Ganglien von Hühnerembryonen dar.
Fig. 11 stellt die Analyse von (A) 50 ul des in Fig. 10 getesteten fertigen Rückfaltungsgemisches, dem 100 ng des nativen, in Insektenzellen hergestellten NGF zugesetzt wurden, und (B) 50 ul des fertigen Rückfaltungsgemisches, dem nichtnativer, in Insektenzellen hergestellter NGF zugesetzt wurde, mittels Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie dar. Die Position, an der nativer, in Insektenzellen hergestellter NGF bei dieser Säule gewöhnlich auftritt, wurde mit der Beschriftung "NGF", gefolgt von einem Pfeil, gekennzeichnet.
Fig. 12 stellt das Proteinelutionsprofil (Extinktion bei 214 nm) dar, wenn das fertige Rückfaltungsgemisch vor der weiteren Reinigung einer Umkehrphasen-HPLC in einer C4-Säule unterzogen wird. Korrekt rückgefalteter NGF erscheint als der höchste Proteinpeak, der bei einer Acetonitril-Konzentration von etwa 37% eluiert wird.
Fig. 13 stellt das Proteinelutionsprofil (Extinktion bei 214 nm) dar, wenn das fertige Rückfaltungsgemisch nach Dialyse und Konzentrierung, jedoch vor der S-Sepharose einer Umkehrphasen- HPLC in einer C4-Säule unterzogen wird. Korrekt rückgefalteter NGF erscheint als der höchste Proteinpeak, der bei einer Acetonitril-Konzentration von etwa 37% eluiert wird.
Fig. 14 stellt das Proteinelutionsprofil (Extinktion bei 214 nm) dar, wenn das fertige Rückfaltungsgemisch nach Reinigung über S-Sepharose einer Umkehrphasen-HPLC in einer C4-Säule unterzogen wird. Korrekt rückgefalteter NGF erscheint als der höchste Proteinpeak, der bei einer Acetonitril-Konzentration von etwa 37% eluiert wird. Der kleine Proteinpeak, der unmittelbar nach dem Hauptpeak eluiert wird, entspricht der monomeren Form des korrekt rückgefalteten NGF, die bei der Chromatographie in Umkehrphasen-HPLC entsteht.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Im folgenden wird auf die derzeit bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung, die zusammen mit den nachstehenden Beispielen zur Erläuterung der Grundlagen der Erfindung dienen, detailliert Bezug genommen.
Diese Erfindung beschreibt zahlreiche Aspekte der Identifizierung und Herstellung einer "Familie" von neurotrophen Proteinen. NGF und BDNF scheinen eine Familie strukturell verwandter neurotropher Proteine zu definieren, die sich wahrscheinlich in ihrer physiologischen Rolle im Organismus unterscheiden, wobei jedes Mitglied auf eine unterschiedliche Gruppe von reagierenden Neuronen einwirkt.
Zur Behandlung von Menschen empfiehlt sich die Verwendung von menschlichen Proteinen.
Ein wichtiges Hindernis auf diesem Gebiet stellte die Unfähigkeit dar, biologisch aktiven, in Bakterien exprimierten NGF zu erhalten. Der Grund für das Fehlen biologischer Aktivität ist wahrscheinlich, daß das reife NGF-Protein nicht fähig war, von selbst die richtige 3-dimensionale Struktur anzunehmen und die richtigen intramolekularen Disulfidbindungen zu bilden; beides ist für die biologische Aktivität unabdingbar. Daher erscheint es nötig, ein Rückfaltungsprotokoll zu entwickeln, mit dem der in Bakterien hergestellte reife NGF die 3-dimensionale Struktur und das Muster von intramolekularen Disulfidbindungen wieder erlangen kann, die für die volle biologische Aktivität erforderlich sind.
Das in der europäischen Patentanmeldungen Nr. 336 324 beschriebene Protokoll zur Rückfaltung von NGF liefert keine zufriedenstellende Lösung für dieses Problem. Das Protokoll verwendet einen hohen pH-Wert (pH 13 wird empfohlen) - anscheinend zur Auflösung der Disulfidbindungen, die sich in dem in Bakterien hergestellten NGF an falscher Stelle gebildet haben könnten - dann folgt eine Senkung des pH-Wertes - anscheinend um die Bildung der richtigen intramolekularen Disulfidbindungen zu ermöglichen. Es ist bekannt, daß die in diesem Protokoll angewandte Behandlung bei hohem pH eine weitgehende Veränderung der Proteine verursacht, einschließlich der Abspaltung der Amin-Seitenketten von Glutamin und Asparagin (die in dem reifen menschlichen NGF 7 mal vorhanden sind) sowie einer weitgehenden chemischen Modifizierung von nebeneinanderstehenden Paaren Asparagin-Glycin, Asparagin-Serin und Asparagin-Threonin (die in dem reifen menschlichen NGF 2 mal vorhanden sind). Neben diesen chemischen Modifizierungen schien das Rückfaltungsverfahren nur etwa ein Zehntel der biologischen Aktivität von NGF wiederherzustellen. Das in der europäischen Patentanmeldung Nr. 336 324 beschriebene Protokoll erscheint daher für die Herstellung von reifem menschlichem NGF mit voller biologischer Aktivität und ohne chemische Modifizierung unzureichend. Es existieren zwar zahlreiche Protokolle zur Rückfaltung und Renaturierung von Proteinen, die ohne harte Bedingungen auskommen; die Anwendung solcher Verfahren auf NGF ist jedoch bisher ohne Erfolg geblieben. Für eine allgemeine Übersicht über die Rückfaltungsverfahren siehe H. Kohno, Methods Enzymol., Bd. 185, S. -(1990).
Auf der Grundlage dieser Überlegungen wird ein Herstellungssystem, das große Mengen des reifen menschlichen NGF mit voller biologischer Aktivität und ohne chemische Modifizierung in Bakterien produzieren kann, zur Herstellung ähnlich großer Mengen jedes Mitglieds der NGF/BDNF-Familie in einer für die pharmazeutischen Verwendung geeigneten, biologisch aktiven und unveränderten Form verwendbar sein.

1. Isolierung von menschlichem BDNF

Hier werden Verfahren zum Erhalten des menschlichen Gens, das die Vorläufer- und die reife Form von BDNF kodiert, der reifen und der Vorläuferform von menschlichem BDNF sowie der Gene, die diese Proteine kodieren, beschrieben. In der gesamten Anmeldung wird die biologisch aktive Form des Proteins, wie es in der Natur nach proteolytischer Spaltung vorkommt, als die reife Form eines neurotrophen Proteins bezeichnet. Das von dem menschlichen Gen kodierte Protein vor der proteolytischen Spaltung wird als die Vorläuferform eines neurotrophen Proteins bezeichnet. Wie nachstehend im Beispiel 1 beschrieben, wurden die etwa 15-30 Basen langen synthetischen Oligonukleotide BDNF-1, BDNF-2, BDNF-2A, BDNF-2B, BDNF-3, BDNF-4 und BDNF-5 auf der Grundlage verschiedener Regionen Nukleinsäuresequenz, die den BDNF des Schweins kodiert, hergestellt. Diese Oligonukleotide des BDNF des Schweins wurden zusammen mit menschlicher genomischer DNA als Matrize bei der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) als Primer in verschiedenen Kombinationen verwendet, um dazwischenliegende Abschnitte des menschlichen Gens für BDNF zu amplifizieren. Die amplifizierten Fragmente wurden subkloniert und die Subklone wurden auf Subklone durchmustert, die mit einer zusätzlichen Oligonukleotid-Sonde für Sequenzen hybridisieren, die zwischen den Sequenzen der beiden in PCR verwendeten Primer liegen.
Bei dieser Durchmusterung isolierte positive Subklone können sequenziert werden, um so ihre Eigenschaft als Teilabschnitte des BDNF-Gens zu bestätigen. Zum Erhalten des menschlichen Gens für BDNF könnten ein oder mehrere dieser amplifizierten Fragmente zum Durchmustern einer Genbank aus menschlicher genomischer DNA verwendet werden. Subklonierte Restriktionsfragmente menschlicher genomischer Klone können sequenziert werden, um die für die Vorläuferform und die reife Form von menschlichem BDNF kodierende Nukleinsäuresequenz und die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen zu erhalten. Die Nukleinsäuresequenz und die abgeleitete Aminosäuresequenz von menschlichem BDNF, die nach diesen Verfahren erhalten wurden, werden in Fig. 1 angegeben.

2. Identifikation bisher nicht beschriebener Mitglieder der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen

Hier werden Verfahren zum Erhalten der menschlichen Gene beschrieben, die die Vorläufer- und die reife Form von bisher nicht beschriebenen neuen Mitgliedern der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen kodieren. Die gewünschten menschlichen DNA-Sequenzen sind alle bisher nicht beschriebenen Sequenzen, die Proteine kodieren, die zwar mit dem menschlichen NGF bzw. BDNF nicht identisch sind, jedoch hinsichtlich eventueller charakterisierender Eigenschaften der Familie mit NGF oder BDNF eindeutig verwandt sind. Unter solchen Eigenschaften können eine oder mehrere der folgenden Eigenschaften sein: neurotrophe Aktivität in einem geeigneten Biotest, signifikante Homologie in der Aminosäuresequenz unter Berücksichtigung identischer Aminosäuren und konservativer Substitutionen, Erhaltung der Anordnung der Cysteinreste in der Aminosäuresequenz, hydrophobe Signalsequenzen für die Sezernierung des Proteins, Signalsequenzen für die proteolytische Prozessierung zum Erhalten der reifen Form und/oder alkalischer isoelektrischer Punkt des prozessierten Proteins.
A. Auf der Grundlage verschiedener konservierter und variabler Regionen der Nukleinsäuresequenzen, die tierische und menschliche NGFs und BDNFs kodieren, können mehrere synthetische Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 15-40 Basen hergestellt werden. Diese NGF/BDNF-Oligonukleotide können zur Amplifizierung dazwischenliegender Abschnitte der menschlichen Gene für Mitglieder der NGF/BDNF-Familie zusammen mit genomischer menschlicher DNA oder menschlichen cDNA-Genbanken, die aus einer Vielzahl von verschiedenen Regionen des Nervensystems hergestellt wurden, als Matrize bei PCR als Primer in verschiedenen Kombinationen verwendet werden.
Die Verwendung von cDNAs aus verschiedenen Regionen des Nervensystems kann vorteilhaft sein, da (1) Regionen, die keine signifikanten Mengen an NGF und BDNF kodierender Information enthalten, den Hintergrund der durch PCR amplifizierten Fragmente für NGF und BDNF verringern können, und (2) neurotrophe Faktoren, die gewünschte Neuronenpopulationen beeinflussen, sich wahrscheinlich in vorhersagbaren Regionen des Nervensystems befinden.
Die amplifizierten Fragmente können subkloniert und einzelne Subklone zur Sequenzierung ausgewählt werden, und zwar entweder durch (a) positive Hybridisierung mit einem degenerierten Oligonukleotid, das DNA-Sequenzen enthält, die zwischen denen der Oligonukleotid-Primer liegen, oder (b) durch Kartierung mit Restriktionsenzymen zum Nachweis von Subklonen, die ein Insert von etwa der Größe enthalten, die man bei Amplifizierung von NGF oder BDNF erwarten würde.
Durch Sequenzierung solcher ausgewählter Subklone kann bestimmt werden, ob sie Abschnitte der Gene für NGF, BDNF oder neue Mitglieder der NGF/BDNF-Familie sind. Wenn das subklonierte amplifizierte Fragment ein neues Mitglied der NGF/BDNF-Familie zu sein scheint, kann dieses Fragment radioaktiv markiert und zum Durchmustern einer menschlichen genomischen DNA-Genbank verwendet werden, um so das menschliche Gen für das mutmaßliche neue neurotrophe Protein zu erhalten. Das menschliche Gen kann sequenziert werden, wodurch die Nukleinsäuresequenz, die die Vorläufer- und die reife Form des neuen neurotrophen Proteins kodiert, sowie die abgeleitete Aminosäuresequenz bereitgestellt werden.
B. Subklone der wie vorstehend beschrieben durch PCR amplifizierten Fragmente können mit jeweils einem von mehreren nichtdegenerierten DNA-Fragmenten, die für die NGF- oder BDNF-Gene spezifisch sind, durchmustert werden. Zweck dieser Durchmusterung ist es, die Isolierung von Fragmenten zu erleichtern, die von Genen für neue Mitglieder der NGF-BDNF-Familie amplifiziert wurden, indem von den bereits charakterisierten Mitgliedern NGF und BDNF amplifizierte Fragmente ausgeschlossen werden. Amplifizierte Fragmente, die auf diese Weise als von NGF und BDNF verschiedene Fragmente identifiziert wurden, können zwecks Bestätigung sequenziert und, wenn sie für geeignet erachtet werden, zum Erhalt des menschlichen Gens wie vorstehend beschrieben verwendet werden.
C. Zur Lokalisierung von Klonen, die mögliche neue Mitglieder der NGF/BDNF-Familie enthalten, können eine genomische menschliche Genbank und menschliche cDNA-Genbanken, die aus verschiedenen Regionen des Nervensystems hergestellt wurden, durchmustert werden. Solche Genbanken können entweder mit einem Abschnitt der NGF oder BDNF kodierenden menschlichen DNA-Sequenzen oder mit einem von mehreren synthetischen Oligonukleotiden mit einer Länge von etwa 15-40 Basen, die auf der Grundlage von verschiedenen konservierten und variablen Regionen von tierische und menschliche NGFs und BDNFs kodierenden Nukleinsäuresequenzen hergestellt wurden, durchmustert werden. Eine Verringerung der Stringenz der Hybridisierung bei der Durchmusterung dieser Genbanken erlaubt, daß die Sonden nicht nur mit Klonen hybridisieren, die NGF- bzw. BDNF-Sequenzen enthalten, sondern auch mit Klonen, die ähnliche, möglicherweise auch verwandte Sequenzen enthal ten. Um den Hintergrund aus NGF- und BDNF-Klonen zu verringern, kann es zweckmäßig sein, cDNA- Genbanken aus Regionen des Nervensystems zu durchmustern, die keine signifikanten Mengen der NGF bzw. BDNF kodierenden Informationen enthalten. Die bei diesen Durchmusterungen identifizierten Klone können entweder sequenziert werden, um festzustellen, ob sie Gene für neue Mitglieder der NGF/BDNF-Familie darstellen, oder wie im vorstehenden Absatz beschrieben erneut durchmustert werden, um solche Klone auszuschließen, die wahrscheinlich die Gene für die bereits bekannten Mitglieder, NGF und BDNF, darstellen.
Unter Anwendung der vorstehend angegebenen Verfahren wurde ein neues Mitglied der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen identifiziert. Wie nachstehend in Beispiel 4 beschrieben und in Fig. 6 zu sehen ist, wurde die vollständige Nukleinsäuresequenz identifiziert, die das bisher nicht beschriebene Protein NGF-3 kodiert. Von der in Fig. 6 angegebenen Nukleinsäuresequenz wurde die vollständige Aminosäuresequenz für den reifen NGF-3 und seine Vorläuferform abgeleitet. Die von dem sequenzierten NGF-3-Gen abgeleitete Aminosäuresequenz für NGF-3 wird in Fig. 7 angegeben.
Jeder Hinweis auf ein neurotrophes Protein in dieser Patentschrift soll als ein Hinweis auf Proteine ausgelegt werden, die als Mitglieder der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen hier identifiziert und beschrieben werden.

3. Genexpression

Jedes der menschlichen Gene für Mitglieder der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen, einschließlich der menschlichen Gene für NGF, BDNF und NGF-3, kann zur Etablierung eines rekombinanten Expressionssystems für die Herstellung des reifen menschlichen neurotrophen Proteins verwendet werden, das von dem jeweiligen Gen kodiert wird. In einer bevorzugten Version dieser Ausführungsform kann die Expression in Mikroorganismen, insbesondere in Escherichia coli stattfinden.
Die Expression von NGF in E. coli wird nachstehend in Beispiel 2 beschrieben.

A. Allgemeines

Zur Veranlassung der Herstellung solcher neurotrophen Proteine kann eine natürliche oder eine synthetische DNA-Sequenz verwendet werden. In einer Ausführungsform der Erfindung können alternative Formen der neurotrophen Faktoren hergestellt werden, bei denen das aktive Zentrum in einer Weise wirkt, die zu der Wirkungsweise der hier beschriebenen neurotrophen Proteine biologisch äquivalent ist. Das allgemeine Expressionsverfahren umfaßt:
1. Präparation einer DNA-Sequenz, die eine Wirtszelle zur Herstellung eines Proteins mit neurotrophen Aktivitäten oder einer Vorläuferform desselben veranlassen kann;
2. Klonierung der DNA-Sequenz in einen Vektor, der in eine Wirtszelle eingeschleust und dort repliziert werden kann, wobei ein derartiger Vektor die zur Expression der DNA-Sequenz oder eines Vorläufers derselben erforderlichen funktionellen Elemente enthält;
3. Einschleusen des die synthetische DNA-Sequenz und funktionelle Elemente enthaltenden Vektors in eine Wirtszelle, die in der Lage ist, die das neurotrophe Protein oder dessen Vorläuferform kodierende DNA zu exprimieren;
4. Kultivieren der Wirtszellen unter Bedingungen, die die Amplifizierung des Vektors und die Expression des Proteins oder dessen Vorläuferform erlauben;
5. Ernten des Proteins oder dessen Vorläuferform, und
6. Zulassen, daß das Protein eine aktive tertiäre Struktur annimmt, in der das Protein biologische Aktivität besitzt oder zum Erhalt eines Proteins mit biologischer Aktivität prozessiert werden kann.

B. DNA-Sequenzen

DNA-Sequenzen, die zur Verwendung in diesem Verfahren in Betracht kommen, werden zum Teil in den Beispielen 1, 2 und 4 besprochen. Fig. 6 zeigt die vollständigen Nukleinsäuresequenzen, die menschlichen NGF, BDNF bzw. NGF-3 kodieren.
DNA-Sequenzen, die die gewünschten neurotrophen Proteine kodieren, können mit einer Anzahl unterschiedlicher Verfahren erhalten werden. cDNA-Genbanken und genomische Genbanken für menschliche Gene können mit mindestens einer Sonde durchsucht werden, die an das Gen für das neurotrophe Protein oder an dessen Genprodukt binden kann. Nach Identifizierung von das Protein kodierenden Genen anhand ihrer Fähigkeit, an die Sonde zu binden, kann das Gen isoliert und an funktionelle Elemente gekoppelt werden, die zur Erhaltung und Expression des Gens in einer Wirtszelle erforderlich sind.
Ein anderes Verfahren zur Identifizierung und Isolierung von Gensequenzen ist die Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion. Wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde die natürliche DNA-Sequenz, die menschlichen BDNF kodiert, identifiziert und isoliert, indem man mehrere synthetische, unter genauer Betrachtung der Nukleinsäuresequenz für BDNF im Schwein entworfene Oligonukleotide herstellte, die paarweise als Primer bei der Polymerase-Kettenreaktion verwendet wurden, wodurch amplifizierte Fragmente der menschlichen BDNF-Sequenz identifiziert wurden. Die durch PCR erhaltenen amplifizierten Fragmente wurden dann zur Klonierung der vollständigen Nukleinsäuresequenz des menschlichen BDNF verwendet.
Wie in Beispiel 4 beschrieben, wurde die natürliche DNA-Sequenz, die menschlichen NGF-3 kodiert, identifiziert und isoliert, indem man synthetische, unter genauer Betrachtung der Nukleinsäuresequenz der menschlichen und tierischen NGF und BDNF entworfene Oligonukleotide herstellte, die als Primer bei der Polymerase-Kettenreaktion verwendet wurden, wodurch ein amplifiziertes Fragment der bisher nicht beschriebenen menschlichen NGF-3-Sequenz identifiziert wurde. Das durch PCR erhaltene amplifizierte Fragment wurde zur Klonierung der vollständigen Nukleinsäuresequenz für menschlichen NGF-3 verwendet.
Eine DNA-Sequenz, die nach diesen Verfahren aus einer menschlichen genomischen DNA-Genbank isoliert wurde und mindestens einen Teil des hier beschriebenen menschlichen BDNF-Proteins kodiert, wurde nach dem Budapester Vertrag unter der Zugriffsnummer__ bei der American Type Culture Collection, Rockville, M. D. hinterlegt. Diese DNA-Sequenz wird nachstehend im Beispiel 1 genauer beschrieben.
Eine DNA-Sequenz, die nach diesen Verfahren aus einer menschlichen genomischen DNA-Genbank isoliert wurde und mindestens einen Teil des hier beschriebenen menschlichen NGF-3-Proteins kodiert, wurde nach dem Budapester Vertrag unter der Zugriffsnummer__ bei der American Type Culture Collection, Rockville, M. D. hinterlegt. Diese DNA-Sequenz wird nachstehend im Beispiel 4 genauer beschrieben.

C. Vektoren

(i). Mikroorganismen, insbesondere E. coli

Zum Einsatz in der vorliegenden Erfindung kommen alle Vektoren in Betracht, in die eine DNA- Sequenz zusammen mit bevorzugten oder erforderlichen funktionellen Elementen eingefügt werden kann, und die anschließend in eine Wirtszelle eingeschleust und in dieser Zelle repliziert werden können.
Im nachstehenden Beispiel 2 wird die Herstellung zweier Vektoren beschrieben, welche die Nukleinsäuresequenz enthalten, die reifen menschlichen NGF kodiert. Die Vektoren, in welche geeignete Nukleinsäuresequenzen eingefügt wurden, sind die mit PTST und PT3XI-2 bezeichneten Expressionsvektoren für E. coli. Die Einzelheiten des Vektors pT5T : NGF werden in Fig. 4 und die des Vektors pT3XI-2 : NGF in Fig. 5 gezeigt.

(ii) Andere Mikroorganismen

Vektoren, die für den Einsatz in von E. coli verschiedenen Mikroorganismen geeignet sind, kommen für diese Erfindung ebenfalls in Betracht.

(a) Pseudomonas-Vektoren

Für den Einsatz als Klonierungsvehikel in Wirtszellen der Gattung Pseudomonas werden verschiedene Vektor-Plasmide bevorzugt, die sich in einem breiten Spektrum Gram-negativer Bakterien autonom vermehren.
Das Plasmid RSF1010 und dessen Derivate, wie von Bagdasarian, M., Bagdasarian, M. M., Coleman, S., und Timmis, K. N. in Plasmids of Medical. Environmental und Commercial Importance, Hrsg. v. Timmis, K. N. und Fühler, A., Elsevier/North Holland Biomedical Press (1979) beschrieben könnte in einem möglichen Konstrukt eingesetzt werden.

(b) Bacillus-Vektoren

In einem Expressionssystem in Wirtszellen der Gattung Bacillus wird das Plasmid pUB110 als Klonierungsvehikel eingesetzt. Wie bei anderen Wirt-Vektor-Systemen ist es in Bacillus möglich, die neurotrophen Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung entweder als intrazelluläres oder als sezerniertes Protein zu exprimieren.

(c) Clostridium-Vektoren

Bei einem Konstrukt für die Expression in Clostridium wird das von Squires, C. H. et al., in J. Bacteriol. 159, 465-471 (1984) beschriebene Plasmid pJU12 eingesetzt, das mit dem Verfahren von Heefner, D. L. et al., wie in J. Bacteriol 159, 460-464 (1984) beschrieben in C. perfringens durch Transformation eingeschleust wird.

(d) Hefe-Vektoren

Wie von Botstein, D. und Davis, R. W., in The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg. v. Strathern, Jones und Broach, S. 607-636 (1982) beschrieben, kann die Erhaltung in Hefe eingeschleuster, fremder DNA auf verschiedenem Wege erreicht werden.
Wird die letztendliche Expression der rekombinanten neurotrophen Proteine in Hefe in Betracht gezogen, so wird der Klonierungsvektor vorzugsweise zunächst in Escherichia coli eingeschleust; man ließe den Vektor sich dort vermehren und nach Amplifizierung könnte man den Vektor gewinnen und reinigen. Der Vektor würde dann zur letztendlichen Expression des Proteins in die Hefe eingeschleust.

(iii) Säugerzellen

Die cDNA für das neurotrophe Protein dient als Gen für die Expression des Proteins in Säugerzellen.

D. Wirtszellen/Transformation

Der auf diese Weise erhaltene Vektor wird in eine geeignete Wirtszelle eingeschleust. Diese Wirtszellen können Mikroorganismen, Insektenzellen oder Säugerzellen sein. In der bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung sind die verwendeten Wirtszellen Mikroorganismen, insbesondere Zellen von E. coli.

(i) Mikroorganismen

Es wird angenommen, daß jedes Mikroorganismus gewählt werden kann, der die Fähigkeit besitzt, exogene DNA aufzunehmen und ihre Gene und die zugehörigen funktionellen Elemente zu exprimieren. Nachdem ein Wirtsorganismus ausgewählt wurde, wird der Vektor mittels Verfahren in den Wirtsorganismus eingeschleust, die unter durchschnittlichen Fachleuten allgemein bekannt sind.

(ii) Säugerzellen

Zum Einschleusen des Vektors in kultivierte Säugerzellen können verschiedene Methoden angewandt werden, beispielsweise Calciumphosphat-DNA-Copräzipitation, Elektroporation oder Protoplastenverschmelzung. Das bevorzugte Verfahren ist die von Ausubel et al., a. a. O. beschriebene Copräzipitation mit Calciumphosphat.

E. Kultivierung gentechnisch veränderter Zellen

Die Wirtszellen werden unter Bedingungen kultiviert, die für die Expression der neurotrophen Proteine geeignet sind. Diese Bedingungen sind in der Regel spezifisch für die jeweilige Wirtszelle und können ohne weiteres von durchschnittlichen Fachleuten anhand der veröffentlichten Literatur bezüglich der Kultivierungsbedingungen für solche Zellen sowie der darin enthaltenen Lehren ermittelt werden.

4. Renaturierung von exprimierten rekombinanten Proteinen

Die rekombinanten reifen neurotrophen Proteine werden nach dem Ernten, jedoch bevor sie ihre aktive Struktur einnehmen, gereinigt. Diese Ausführungsform wird bevorzugt, da die Erfinder der Meinung sind, daß eine hohe Ausbeute des rückgefalteten Proteins leichter erhalten wird, wenn das Protein zuerst gereinigt wird. In einer bevorzugten alternativen Ausführungsform ist jedoch eine Rückfaltung des neurotrophen Proteins, bei der es seine aktive Struktur einnimmt, vor der Reinigung möglich.
Dem in Mikroorganismen hergestellten Protein kann merkliche biologische Aktivität abgehen; zum Erhalten eines neurotrophen Proteins mit einer von den Mitgliedern der NGF/BDNF-Familie erwarteten spezifischen biologischen Aktivität muß das Protein rückgefaltet und denaturiert werden. Die erwartete spezifische Aktivität entspricht entweder der Aktivität, die bei dem in eukaryontischen Zellen exprimierten Protein beobachtet wird, oder der Aktivität desselben oder eines verwandten Proteins, das aus natürlichen Quellen gewonnen und gereinigt wird (z. B. NGF aus der Maxillardrüse der Maus und BDNF aus dem Hirn des Schweins).
Oft steht der Mangel an biologischer Aktivität bei in Mikroorganismen exprimierten Proteinen mit der Bildung von unrichtigen intramolekularen Disulfidbindungen in Verbindung. In einer bevorzugten Version dieser Ausführungsform kann das in E. coli hergestellte rekombinante neurotrophe Protein rückgefaltet und renaturiert werden, so daß die richtige Konfiguration der intramolekularen Disulfidbindungen und die erwartete spezifische biologische Aktivität erlangt wird.
In einer bevorzugten Version kann das rekombinante Protein durch folgende Schritte rückgefaltet und renaturiert werden:
(1) Zuerst werden alle intramolekularen oder intermolekularen Disulfidbindungen und/oder nichtkovalenten Wechselwirkungen aufgetrennt, an denen das in einem Mikroorganismus hergestellte reife neurotrophe Protein beteiligt ist. Zu diesem Zweck wird das Protein mit einer hinreichenden Menge eines Denaturierungsmittels (beispielsweise Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff) und einer hinreichenden Menge eines Reduktionsmittels (beispielsweise Beta-Mercaptoethanol, Dithiothreit oder Cystein) behandelt, wodurch das Protein denaturiert wird, die nichtkovalenten Wechselwirkungen aufgetrennt werden, und die Anzahl der Disulfidbindungen verringert wird.
(2) Nach Denaturierung und Reduktion des reifen neurotrophen Proteins werden die im reduzierten Protein vorhandenen freien Thiolresten durch Zugabe eines großen Überschusses eines Disulfidenthaltenden Reagens (beispielsweise Glutathion oder Cystin) oxidiert. Diese Reaktion erzeugt gemischte Disulfidbindungen, bei denen jeder Cystein-Rest in dem reifen neurotrophen Protein eine Disulfid-Bindung mit der monomeren Form des oxidierenden Agens bildet. Dieser Schritt trägt dazu bei, während der anschließenden Prozessierung die Bildung von unrichtigen intramolekularen Disulfidbindungen im neurotrophen Protein zu verhindern.
(3) Sodann werden das Denaturierungsmittel und das oxidierende Agens bis zu einer festgelegten Konzentration verdünnt und zur Katalysierung eines Disulfid-Austausches wird ein Thiol-enthaltendes Reagens (beispielsweise Cystein) zugesetzt. Ziel ist es, eine Umgebung zu schaffen, in der die Konzentration des Denaturierungsmittels hinreichend abgesenkt ist, so daß das neurotrophe Protein verschiedene 3-dimensionale Konfigurationen einnehmen kann, und in der das Redoxpotential so eingestellt ist, daß die Bildung und Auflösung von Disulfidbindungen möglich ist. Es wird angenommen, daß die richtige 3-dimensionale Struktur und das Disulfidbindungsmuster des reifen neurotrophen Protein energetisch stabiler ist als andere mögliche Konformationen. Bedingungen, die die Annahme einer Vielzahl von 3-dimensionalen Konformationen und Mustern für intramolekulare Disulfidbindungen durch das neurotrophe Protein zulassen, erlauben daher, daß ein signifikanter Anteil des neurotrophen Proteins das richtige Muster für intramolekulare Disulfidbindungen und die richtige 3-dimensionale Struktur wieder bildet und dadurch biologisch aktiv wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das rekombinante neurotrophe Protein in einer harnstoffhaltigen Pufferlösung bis zu einer Konzentration zwischen 0,1-2 mg/ml gelöst. Nach Bedarf wird der pH-Wert dieser Lösung durch Zugabe einer Pufferlösung mit einem höheren pH-Wert, die ebenfalls Harnstoff enthält, alkalisch gemacht, um den Austausch von Disulfidbindungen zu fördern. Redukti onsmittel wird bis zu einer Endkonzentration von etwa 1-15 mM zugesetzt. Sodann wird oxidierendes Agens bis zu einer Endkonzentration von etwa 15-50 mM zugesetzt. Die das neurotrophe Protein enthaltende Lösung wird etwa 5-20 mal verdünnt und das Thiol-enthaltende Reagens wird zugesetzt, bis man eine Konzentration erreicht, bei der die Lösung etwa 2-3 mal mehr Thiol-enthaltendes Reagens als Disulfid-enthaltendes Reagens enthält.
Bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen für die Rückfaltung rekombinanter neurotropher Proteine wird das fertige Rückfaltungsgemisch entgast und man läßt die Rückfaltung unter anaeroben Bedingungen verlaufen. Zusätzlich wird bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung die NGF-Lösung vor der Rückfaltung von anderen Proteinen im wesentlichen befreit. In diesem Zusammenhang ist unter "im wesentlichen befreit" zu verstehen, daß die Lösung im wesentlichen frei von Proteinen der Wirtszelle ist, die die NGF-Rückfaltungsrate oder -effizienz beeinträchtigen. Schließlich kann das Rückfaltungsgemisch bei den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung auch Glykol-enthaltende Reagenzien enthalten.
Diese Verfahren sind schonend und sollten nicht zu einer chemischen Modifizierung des neurotrophen Proteins führen. Wenn Harnstoff als Denaturierungsmittel im Protokoll verwendet wird, ist es wichtig, eventuell entstehendes Cyanat dadurch zu entfernen, daß man die Harnstofflösung durch eine Anionenaustauschsäule wie z. B. DOWEX 1-X8 (BioRad) schickt. Wird das Cyanat nicht entfernt, so kann es Amin-Reste im Protein modifizieren (Stark, 1967, Methods in Enzymology 11, 125).
Die optimale Konzentration und die Art des Denaturierungsmittels, des oxidierenden Agens, der Thiol-enthaltenden Reagenzien sowie ihre Konzentration in der fertigen Rückfaltungslösung werden empirisch ermittelt, indem der Anteil des richtig rückgefalteten und biologisch aktiven neurotrophen Proteins verfolgt wird. Ziel ist es, in der fertigen Rückfaltungslösung eine kontrollierte Umgebung zu erreichen, in der ein Austausch von Disulfidbindungen sowie Konformationsänderungen im neurotrophen Protein stattfinden können, bis die bevorzugte Konformation sowie das bevorzugte Disulfidbindungsmuster erreicht werden. Es wird erwartet, daß die vorstehend angegebenen bevorzugten Bedingungen für eine optimale Rückfaltung für alle Mitglieder der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen im wesentlichen die gleichen sind, da sie hinsichtlich ihrer Aminosäuresequenz einschließlich der relativen Position aller sechs Cysteinreste im reifen Protein eng verwandt sind, und daher vermutlich das gleiche Disulfidbindungsmuster annehmen.
Die Rückfaltungsausführungsformen gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglichen die Expression von neurotrophen Proteinen mit einem gewünschten Expressionssystem, das nachweislich keine biologisch aktiven neurotrophen Proteine lieferte. Unter Anwendung der Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird das in Bakterien exprimierte rekombinante neurotrophe Protein mindestens zu 10% biologische Aktivität erlangen. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird das neurotrophe Protein mindestens zu 30% biologische Aktivität erlangen. In den am meisten bevorzugten Ausführungsformen wird das Protein zu mindestens 50% biologisch aktiv.
Das nachstehende Beispiel 3 beschreibt einen Versuch, in dem gezeigt wird, daß dieses Rückfaltungsverfahren zur erfolgreichen Rückfaltung von in Bakterien hergestelltem reifem NGF führt:
(1) Korrekt rückgefalteter und biologisch voll aktiver reifer NGF, der entweder in einem eukaryontischen Zellexpressionssystem hergestellt oder aus natürlichen Quellen gereinigt wurde, wird denaturiert und seine Disulfidbindungen werden wie vorstehend beschrieben reduziert, was zum Verlust der biologischen Aktivität führt. Da der NGF vor der Denaturierung und Reduktion biologisch aktiv war, kann anhand des Verlustes der biologischen Aktivität gezeigt werden, daß Denaturierung und Rückfaltung stattgefunden haben. (2) Der denaturierte und reduzierte NGF wird nach dem hier beschriebenen Protokoll renaturiert, woraufhin festgestellt wird, daß die biologische Aktivität wiedergewonnen wurde. Es wird angenommen, daß die Wiedergewinnung der biologischen Aktivität von der richtigen Rückfaltung und Renaturierung des denaturierten und reduzierten Proteins abhängig ist. Es wird behauptet, daß reife NGFs aus den vorstehend angegebenen Quellen, darunter auch aus einem bakteriellen Zellexpressionssystem, nach der Denaturierung und Reduktion in ihrer Struktur nicht unterscheidbar wären. Die gelungene Rückfaltung von reifem NGF aus einem eukaryontischen Zellexpressionssystem oder aus natürlichen Quellen, der denaturiert und reduziert wurde, ist daher ein Hinweis darauf, daß die Rückfaltung von in bakteriellen Zellen hergestelltem reifem NGF gelingen kann (siehe Beispiel 3 und Fig. 3).
Beispiel 3B beschreibt die gelungene Rückfaltung von reifem NGF, der in einem bakteriellen Expressionssystem mit E. coli hergestellt wurde, und zwar unter Anwendung von Verfahren, die den vorstehend beschriebenen ähnlich sind. Der rückgefaltete NGF ist biologisch vollaktiv und wandert bei einer Umkehrphasen-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie zu der Position des nativen, in Insektenzellen hergestellten NGF.

5. Reinigung des rekombinanten neurotrophen Proteins

Das vorstehend beschriebene Protokoll zur Rückfaltung und Renaturierung des reifen neurotrophen Proteins kann bei einem Verfahrensschritt zur Reinigung des rekombinanten Proteins angewandt werden, wo es am günstigsten ist und wo erfahrungsgemäß eine hohe Ausbeute des biologisch aktiven Proteins erzielt wird.

6. Formulierung von pharmazeutischen Produkten

Wie vorstehend erwähnt, erfordert die beschriebene Anwendung der neurotrophen Proteine als therapeutische Mittel eine Formulierung mit pharmazeutisch verträglichen Trägem.
Unabhängig von der Verabreichungsform wird die spezifische Dosis nach dem grobgeschätzten Körpergewicht des Patienten berechnet. Eine feinere Berechnung zur Ermittlung der geeigneten Dosierung für Behandlungen mit jeder der vorstehend genannten Formulierungen wird von durchschnittlichen Fachleuten routinemäßig durchgeführt und gehört zum Bereich der Aufgaben, die von ihnen routinemäßig und ohne unzumutbares Experimentieren durchgeführt werden. Bei Verwendung der neurotrophen Proteine werden im Biotest keine toxischen Wirkungen beobachtet.

BEISPIEL 1: ISOLIERUNG SEQUENZIERUNG UND EXPRESSION DES MENSCHLICHEN GENS FÜR BDNF

A. Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifizierung von Teilabschnitten des menschlichen BDNF-Gens

Auf der Grundlage der beschriebenen Nukleinsäuresequenz für BDNF des Schweins (Leibrock et al., 1989, a. a. O.) wurden folgende Oligonukleotide synthetisiert:
BDNF-1 [nicht-degeneriertes Oligonukleotid aus dem kodierenden Strang, das unmittelbar stromaufwärts von der fünften kodierenden Base des BDNF des Schweins liegt und auch am 5'-Ende eine BamHI-Schnittstelle enthält]
5' GAA TCC GGT GAG AAG AGT GAT GAC 3'
BDNF-2 [teilweise degeneriertes guessmer Oligonukleotid aus dem kodierenden Strang, das sich stromabwärts von dem Startcodon des BDNF des Schweins erstreckt; zur Verringerung der Degeneration wurde dieses Oligonukleotid in zwei verschiedenen Ansätzen synthetisiert; ein guessmer ist ein Oligonukleotid, dessen Degeneration durch Verwendung von bei Säugern bevorzugten Codons reduziert wurde]
BDNF-2A
5' ATG ACN ATC/A/T CTG TTT/C CTG ACN ATG 3'
BDNF-2B
5' ATG ACN ATC/A/T CTG TTT/C CTC ACN ATG 3'
BDNF-3 [nicht-degeneriertes Oligonukleotid aus dem nichtkodierenden Strang, das unmittelbar stromabwärts von dem Terminationscodon vom BDNF des Schweins liegt und auch am 5'-Ende eine Spel-Schnittstelle enthält]
5' ACT AGT TAA TCT ATA CAA CAT AAA GCC 3'
BDNF-4 [teilweise degeneriertes guessmer, Oligonukleotid aus dem nichtkodierenden Strang, das sich stromaufwärts von dem Terminationscodon vom BDNF des Schweins erstreckt]
5' ATN GTG/C AGN GTA/G CAN ACA/G CA 3'
BDNF-5 [degeneriertes Oligonukleotid aus dem kodierenden Strang, das in der kodierenden Region des reifen (prozessierten) BDNF-Proteins liegt]
5' GAT/C AAA/G AAA/G ACN GCN GTN GAT/C ATG 3'
PCR-Reaktionen wurden unter Verwendung genomischer menschlicher DNA als Matrize und mit folgenden Kombinationen von synthetischen Oligonukleotiden als Primer durchgeführt: BDNF-1 und BDNF-3, BDNF-2A und BDNF-3, BDNF-2B und BDNF-3, BDNF-2A und BDNF-4, BDNF-28 und BDNF-4 und BDNF-1 und BDNF-4. Die Reaktionsprodukte wurden einer Elektrophorese unterzogen und zur Identifizierung amplifizierter Fragmente, die mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit dem menschlichen BDNF entsprechen, wurden DNA(Southern)-Blots mit radioaktiv markiertem BDNF-5 als Sonde untersucht. Hinsichtlich der Details siehe die Anlage zur Versuchsdurchführung in diesem Beispiel.
Banden mit der in etwa erwarteten Größe, die mit BDNF-5 hybridisierten, traten bei den Reaktionen unter Verwendung von BDNF-1/BDNF-3, BDNF-2A/BDNF-3 und BDNF-2B/BDNF-3 als Primer auf. Die DNA in dem Bereich der hybridisierenden Southern-Bande in dem der Elektrophorese unterzogenen BDNF-1/BDNF-3-Reaktionsgemisch wurde aus dem Gel herausgeschnitten und ein Teil davon wurde unter Verwendung von BDNF-1 und BDNF-3 als Sequenzierungsprimer direkt sequenziert, wodurch eine Teilsequenz des menschlichen Gens in der BDNF kodierenden Region erhalten wurde (Fig. 1). Die übriggebliebene amplifizierte DNA wurde in mit Smal verdauten M13mp 10-Phagen subkioniert und positive Subklone, die mit radioaktiv markiertem BDNF-5 hybridisierten, wurden ausgewählt. Zwei unabhängige Subklone in entgegensetzten Orientierungen, BDNF-PCR1 und 2, wurden sequenziert, wodurch die Sequenz des menschlichen Gens in der BDNF kodierenden Region erhalten wurde (Fig. 1).

B. Verwendung von durch PCR amplifizierter DNA zur Klonierung des menschlichen Gens für BDNF

DNA aus dem Bereich der amplifizierten, hybridisierenden Southern-Bande wurde radioaktiv markiert und zum Durchmustern einer Genbank aus genomischer menschlicher DNA in dem Lambda- Phagen EMBL3 eingesetzt; 6 positive Klone wurden als Plaque gereinigt. Die DNA des Klones #3 wurde in getrennten Ansätzen mit folgenden Restriktionsenzymen verdaut: HinfI, AluI, RsaI und NcoI/Sau3AI. Diese Enzyme wurden deshalb gewählt, weil sie die BDNF kodierende Sequenz in mehrere Fragmente spalten, die der Größe nach für die Klonierung in M13 geeignet sind. Restriktionsfragmente, die die für BDNF kodierende Sequenz enthielten, wurden in den M13mp 10-Phagen subkloniert und zur Bestätigung der Sequenz des menschlichen Gens in der BDNF kodierenden Region sequenziert (Fig. 1). Fig. 1 zeigt ebenfalls die abgeleitete Aminosäuresequenz der Vorläuferform und des reifen (prozessierten) menschlichen BDNF-Proteins. Die in Fig. 1 vorgeschlagene Spaltstelle beruht auf der Ähnlichkeit zwischen den Spaltsteilen in den bekannten Sequenzen für NGF und für BDNF des Schweins sowie zwischen den bekannten Aminosäuresequenzen von NGF und BDNF des Schweins.
Die BDNF-Sequenzen, die aus durch PCR amplifizierten Fragmenten (Fig. 1) und aus zwei Klonen mit genomischer menschlicher DNA erhalten wurden, unterschieden sich in der Position 196 der Nukleinsäure. Der genomische menschliche Klon hatte an Position 196 ein A anstelle eines G, wodurch bei Aminosäure 66 Valin durch Methionin ersetzt wird. Dieser Unterschied tritt bei der Vorläuferform, jedoch nicht bei der reifen biologisch aktiven Form des BDNF auf. Diese Änderung eines einzelnen Basenpaares und einer einzelnen Aminosäure kann einen allelischen Unterschied in der BDNF-Sequenz des menschlichen Genoms darstellen.
Die Sequenzierung eines weiteren Klons ergab eine Sequenz, die mit der in Fig. 1 gezeigten Sequenz identisch war, mit der Ausnahme, daß die Aminosäure an Position 223 Lysin (K) anstelle von Arginin (R) und daß das Codon AAA anstelle von AGA ist. Dieser Unterschied tritt in der reifen biologisch aktiven Form des menschlichen BDNF auf. Dieses könnte ein alternatives menschliches Allel an dieser Position darstellen.

C. Expression von biologisch aktivem BDNF in COS-7-Zellen

Zur Bestätigung, daß das von uns erhaltene menschliche BDNF-Gen tatsächlich biologisch aktiven BDNF kodiert, wurde das Gen in COS-7-Zellen transient exprimiert und das exprimierte Material wurde auf die Fähigkeit, das Überleben von kultivierten Ganglionneuronen aus der dorsalen Rückenmarkswurzel von 10 Tage alten Hühnerembryonen zu fördern, getestet; dies ist eine bekannte Eigenschaft des aus Schweinegehirnen gereinigten BDNF (Barde et al., 1982, The EMBO Journal 1, 549).

1. Herstellung eines DNA-Konstruktes für die Expression von menschlichem BDNF

Die aus einem Gel gereinigte DNA mit der wie vorstehend in Teil B erhaltenen kodierenden Sequenz für menschlichen BDNF, die durch PCR mit den Oligonukleotiden BDNF-1 und BDNF-3 aus menschlicher genomischer DNA amplifiziert worden war, wurde mit dem Expressionsvektor pSG5 für COS-Zellen durch Ligation verknüpft (Green et al., 1988 Nuc. Acids Res. 16, 369). Das pSG5-Plasmid wurde mit den Restriktionsendonukleasen EcoRI und BamHI verdaut und die kohäsiven Enden wurden durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I in Anwesenheit aller vier Desoryribonukleotide geglättet. Die aus einem Gel gereinigte DNA mit der vollständigen BDNF kodierenden Sequenz wurde dann mit pSG5 mit geglätteten Enden durch Ligation verknüpft. Die Orientierung der eingefügten DNA, aus der nach Transfektion von COS-Zellen das BDNF-Vorläuferprotein mit dem sehr frühen SV40-Promoter (SV40 immediate early promoter) exprimiert werden kann, wurde durch Restriktionskartierung ermittelt. fn der gewünschten Orientierung kann das BDNF-Insert nach Verdauung mit BamHI und BgIII von dem Vektor getrennt werden.

2. Transfektion von COS-Zellen

DNA aus pSG5 mit dem BDNF kodierenden Insert bzw. ohne Insert wurde durch alkalische Lyse und anschließende Dichtegradientenzentrifugation in CsCl präpariert (Maniatis et al., a. a. O.). Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Lipofektin gemäß Protokoll C der Herstelleranweisungen (BRL) in COS-7-Zellen durch Transfektion eingeschleust. COS-Zellkulturen, in die Plasmid-DNA ohne BDNF-kodierendes Insert durch Transfektion übertragen wurde, dienten als negative Kontrolle.

3. Biotest für exprimierte Materialien

Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen von der Platte abgeschabt und die erhaltenen Zellen durch kurze Zentrifugation geerntet. Die Zellpellets wurden in 20 mM Natriumphosphat-Puffer bei pH 6,7 mit 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF und 0,1 uM Pepstatin auf Eis durch kurze Beschallung extrahiert. Eine Verdünnungsreihe des Zellextraktes jeder Kultur wurde unter Verwendung von Ganglionneuronen aus der dorsalen Rückenmarkswurzel von 10 Tage alten Hühnerembryonen auf Bioaktivität getestet (siehe Anlage zur Versuchsdurchführung für Beispiel 3). Bei dem Extrakt aus Zellen, die mit das BDNF-Insert enthaltendem pSG5 transfiziert waren, wurde, anders als bei dem Extrakt aus Zellen, die mit pSG5 ohne Insert transfiziert worden waren, eine signifikante biologische Aktivität nachgewiesen (Fig. 8). Diese Ergebnisse weisen darauf hin, daß das von uns klonierte Gen einen biologisch aktiven BDNF exprimieren kann.

D. Expression von reifem menschlichem BDNF in E coli

Das reife menschliche BDNF-Gen, wie in Fig. 1 beschrieben, wird in Expressionsvektoren für E. coli eingefügt; solche Vektoren werden in E. coli-Wirtszellen eingeschleust und die Expression des Gens zur Erzeugung von reifem menschlichem BDNF wird gemäß den nachstehend in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durch Austausch des BDNF-Gens durch das NGF-Gen erzielt.

ANLAGE ZUR VERSUCHSDURCHFÜHRUNG FÜR BEISPIEL 1

1. Molekularbiologische Methoden

Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde im wesentlichen wie von Saiki et al. 1988, Science 239, 487 beschrieben durchgeführt. Die PCR-Reaktionsprodukte wurden einer Elektrophorese in 2%igen Agarosegelen unterzogen und zwecks DNA(Southern)-Blotting auf Zeta-Bind-Membranen (BioRad) transferiert. Die geeigneten amplifizierten Banden wurden aus den Originalgelen herausgeschnitten und als Vorbereitung für die Subklonierung wurden die Enden mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase (New England Biolabs) aufgefüllt; sodann wurden die Fragmente entweder mit glatten Enden kloniert oder, wenn bei den Primern Restriktionsschnittstellen vorhanden waren, nach Verdauung mit den geeigneten Enzymen kloniert. Solche Fragmente wurden in einen M13mp 10-Vektor (Amersham) subkloniert, der in geeigneter Weise gespalten und mit Phosphatase behandelt worden war. Die Oligonuklotide wurden durch eine Kinase-Reaktion radioaktiv markiert (T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1982)). Die Bedingungen für die Oligonukleotid-Hybridisierung waren 6 · SSCP, 2 · Denhardt-Lösung, 2 mM EDTA, 0,05% Natriumpyrophosphat, 0,1% SDS, 100 mcg/ml Hefe-tRNA als nicht-spezifischer Kompetitor, pH 8,0. Die Hybridisierungstemperatur und die Stringenz- Bedingungen für die Waschung hybridisierter Blots und Filter wurden für jede Oligonukleotid-Sonde auf der Grundlage ihres relativen GC-Gehalts einzeln eingestellt. Lange, radioaktiv markierte DNA-Sonden wurden durch "random priming" hergestellt [A. P. Feinberg und B. Vogelstein, Anal. Biochem. 132,6 (1983)]. Die Hybridisierungsbedingungen bei Verwendung solcher Sonden waren: 5 · SSCP, 2 · Denhardt-Lösung, 2 mM EDTA, 0,05% Natriumpyrophosphat, 0,1% SDS, 250 ug/ml DNA aus Heringsspermien, pH 8,0 bei 65ºC, Waschung bei 65ºC mit 0,1 · SSCP und 0,1% SDS. Die Sequenzierung wurde nach dem Dideoxy-Kettenabruchsverfahren [F. Sanger, S. Nicklen, A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463 (1977)] unter Verwendung von einzelsträngiger DNA, die aus Subklonen in M13-Vektoren in beiden Orientierungen präpariert wurde, als Matrize durchgeführt.

BEISPIEL 2: HERSTELLUNG VON REKOMBINANTEM NGF IN E. COLI

Ein synthetisches Gen, das die reife (prozessierte) Form des menschlichen NGF kodiert, wurde von British Biotech bezogen. Dieses Gen ist mit der für NGF beschriebenen menschlichen Nukleinsäuresequenz (Ullrich et al. 1983, a. a. O.) identisch, mit Ausnahme der zur Insertion einer Vielzahl an Restriktionsschnittstellen durchgeführten Änderungen in der menschlichen Nukleinsäuresequenz, und wird in dem BBG26-Plasmid geliefert.
Zur Erzeugung einer für die nachfolgenden Arbeitsschritte hinreichenden Plasmidmenge wurde der DH5alpha-Stamm von E. coli mit dem Plasmid transformiert. Zur Modifizierung des synthetischen Gens für seine Insertion in einen geeigneten Expressionsvektor wurden folgende zwei Oligonukleotide synthetisiert:

NGF-A

Translationeller Koppler BamHI

5'-GATC CGATCTTGGAGGATGATTAA ATG TCC TCC TCC CAC CCG ATC TTT CAC CGC GGC G-3º

NGF-B

EcoRI

5'-AAT TC GCC GCG GTG AAA GAT CGG GTG GGA GGA GGA CAT TTAATCA TCCTCCAAGATCG-3'
Diese Oligonukleotide enthalten eine BamHI-Schnittstelle am 5'-Ende und eine EcoRI-Schnittstelle am 3'-Ende. In der Nähe des 5'-Endes des synthetischen NGF-Gens befindet sich eine nur einmal vorkommende EcoRI-Schnittstelle. Nach Behandlung von BBG26 mit dem Restriktionsenzym EcoRI können die synthetischen Oligonukleotide neben der EcoRI-Schnittstelle in 5' mit dem geschnittenen Plasmid durch Ligation verbunden werden; dadurch wird der 5'-Abschnitt der NGF kodierenden Sequenz ersetzt. Das Ersetzen des 5'-Endes der kodierenden Sequenz ermöglicht die Insertion eines stromaufwärts gelegenen translationellen Kupplers (siehe die oben angegebenen Oligonukleotidsequenzen) und den Ersatz durch in E. coli bevorzugte Codons (nach deBoer und Kastelein in From Gene to Protein: Steps Dictating the Maximal Level of Gene Expression (1986) Hrsg. v. Davis und Reznikoff, S. 225-283, Butterworths, NY). Solche Änderungen sind dazu bestimmt, eine effiziente Expression der NGF-Sequenzen zu fördern.
Die mit Kinase behandelten und miteinander assoziierten (annealed) Oligonukleotide NGF-A und NGF-8 wurden dann mit dem BBG26-Plasmid, das zuvor mit EcoRI geschnitten und anschließend mit Phosphatase behandelt wurde, durch Ligation verknüpft und das Gemisch wurde mit Phosphatase behandelt. Das Gemisch wurde mit dem Restriktionsenzym BamHI behandelt und das etwa 390bp lange BamHI-Fragment, welches modifizierte kodierende Sequenzen für NGF enthält, wurde aus einem Gel gereinigt. Dieses Fragment wurde mit jeweils einem von zwei verschiedenen Expressionsvektoren für E. coli, die aus einem Gel gereinigt, mit BamHI geschnitten und mit Phosphatase behandelt worden waren, durch Ligation verknüpft; diese Vektoren waren (1) ein als PT5T bezeichneter Vektor auf der Grundlage des T7-Phagen-Promotersystems, und (2) ein als pT3XI-2 bezeichneter Vektor, der auf einem hybriden "Tac"-Promoter beruht, der sowohl von Tryptophan als auch von Lactose abgeleitet ist (zu den Einzelheiten siehe die Anlage zur Versuchsdurchführung für dieses Beispiel und die Fig. 4 und 5). Als Ergebnis erhielt man pT5T : NGF bzw. pT3XI-2 : NGF.
pT5T : NGF wurde zur Transformation des BL21(DE3)-Stamms von E. coli verwendet. Dieser (in Studier und Moffat, J. Mol. Biol. (1986) 189,113-130 beschriebene) Stamm enthält das Gen für die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des durch IPTG induzierbaren lac-Promoters in einem nichtexzidierbaren lysogenen lambda-Bakteriophagen. Da sich das Insert in dem pT5T-Vektor unter der Kontrolle des T7-Phagen-Promoters befindet, bringt dies letztendlich die Expression der eingefügten Sequenzen unter die Kontrolle des lac-Promoters; die Expression ist daher durch Isopropylβ-D-thiogalactopyranosid (IPTG) induzierbar. Um herauszufinden, welche Transformanten das NGF- Insert enthielten, wurden diese Transformanten gepickt, kultiviert und mit dem ³²P-markierten, 390 bp langen BamHI-Fragment hybridisiert. Acht positive Transformanten wurden ausgewählt und kultiviert, aus denen Vektor-DNA isoliert und sequenziert wurde. Alle acht enthielten das richtige Insert in der richtigen Orientierung in dem Vektor. Zwei davon wurden jede für sich bis zu einer optischen Dichte (O. D.) von etwa 0,6 in Luria-Nährmedium mit 15 mcg/ml Tetracyclin kultiviert; sodann wurden die Kulturen durch Zugabe von IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM induziert. Zwischen 2 und 21 Std. nach der Induktion wurden in Zeitabständen Proben der einzelnen Kulturen genommen und in Probenpuffer für SDS-PAGE (0,025% Bromphenofblau, 10% Glycerin, 1% β-Mercaptoethanol, 2% SDS, 0,0625 M Tris/HCl-Puffer, pH 6,8) lysiert. Jede Probe wurde einer SDS-PAGE-Elektrophorese unter reduzierenden Bedingungen unterzogen und die Erzeugung von NGF wurde sowohl anhand des Auftretens einer mit Coomassie-Brilliantblau gefärbten Bande mit dem richtigen Molekulargewicht als auch anhand der Western-Blot-Analyse unter Verwendung von Antikörpern gegen NGF aus der Maxillardrüse der Maus (Sigma) überprüft. Als negative Kontrollen dienten Proben aus nicht induzierten identischen Kulturen sowie aus Kulturen von Bakterien, die mit dem pT5T-Vektor ohne NGF-Insert transformiert worden waren. Die in Fig. 2 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Transformante pT5T : NGF-18 eine Proteinbande mit dem für prozessierten NGF zu erwartenden Molekulargewicht erzeugt, die auch vom Anti-NGF-Antiserum erkannt wird (Spuren beschriftet als pT5T : NGF-18 2, 4, 6, 8, 10 und 21 Std. nach Induktion mit IPTG). Wie erwartet kann diese Bande in mit pT5T ohne NGF-Insert transformierten Bakterien (Spuren beschriftet als pT5T u (nicht induziert) und i (induziert) und in der pT5T : NGF-18-Transformante, die nicht durch IPTG induziert wurde (Spur beschriftet als pT5T : NGF-18 0 Stunden nach Induktion mit IPTG) nicht nachgewiesen werden.
pT3XI-2 : NGF wurde in JM107, einen phagenresistenten K-Stamm von E. coli, durch Transformation eingeschleust. Dreizehn Transformanten wurden wie bei den pT5T : NGF-Transformanten kultiviert; von diesen dreizehn Transformanten exprimierten drei das reife menschliche NGF-Protein, was wie vorstehend für pT5T : NGF-Transformanten durch SDS-PAGE von Zellextrakten nach Coomassie-Brilliantblau-Färbung und Immunfärbung mit Antiserum gegen NGF der Maus ermittelt wurde.
Die Amino-terminaie Aminosäuresequenz des von pT3XI-2 : NGF in E. coli JM107 erzeugten rekombinanten NGF ließ erkennen, daß das Amino-terminale Methionin während der Expression bei mindestens 85% des erzeugten NGF entfernt wurde. Dies legt nahe, daß der erzeugte NGF den für den prozessierten reifen menschlichen NGF richtigen Amino-Terminus aufweist.
Wie durch die nachstehend in Beispiel 3 angegebenen Verfahren ermittelt, weist der wie hier beschrieben erzeugte NGF keine nachweisbare biologische Aktivität auf.
Das aus den pT5T : NGF- und pT3XI-2 : NGF-Vektoren hergestellte Protein wurde auf seine Aktivität bei der Stimulierung von Nervenwachstum getestet, wobei rekombinanter hβNGF, der unter Verwendung eines Baculovirus-Vektors in Insektenzellen hergestellt wurde, als Kontrolle eingesetzt wurde. Die positive Kontrolle ergab bei einer Konzentration von 1,1 mg/ml eine Neuronenüberlebensrate, die der Hälfte des maximalen Wertes entsprach. Dagegen zeigten die aus den zwei Vektoren in E. coli hergestellten Polypeptide selbst bei einer Konzentration von etwa 3600 mg/ml keine signifikante biologische Aktivität.

ANLAGE ZUR VERSUCHSDURCHFÜHRUNG FÜR BEISPIEL 2

1. Beschreibung von pT5T, einem auf dem "T7-Promoter"-System beruhenden Expressionsvektor (bezüglich der Merkmale des Vektors siehe bitte Fig. 4)

Der auf dem T7-Promoter beruhende Expressionsvektor pT5T ist im wesentlichen identisch mit pJU1003 [Squires et al. J. Biol. Chem. (1988) 263,16297-16302], mit Ausnahme eines kurzen DNA- Stücks zwischen der 5' von dem T7-Promoter gelegenen, einmal vorkommenden BglII-Schnittstelle und der ClaI-Schnittstelle in dem Tetracyclinresistenzgen. Diese DNA weist folgende Sequenz auf:

2. Beschreibung von pT3XI-2: eine Modifikation des pKK223-3 unter Verwendun4 des hybriden Tac'-Promotersystems (bezüglich der Merkmaie des Vektors siehe bitte Fig. 5)

Das Ausgangsplasmid für diese Konstruktion war das von Pharmacia bezogene pKK223-3- Plasmid. Das pKK223-3-Plasmid enthält einen Teil des Tetracyclinresistenz-Gens. Dieses nicht funktionelle Gen wurde durch ein vollständiges, im pBR322-Plasmid enthaltenes Tetracyclinresistenz-Gen ersetzt. Das pKK223-3-Plasmid wurde mit SphI vollständig und mit BamHI teilweise verdaut. Ein 4,4 Kilobasenpaare langes Fragment wurde aus einem Gel gereinigt und mit einem synthetischen Adaptor, der die Sequenz:
5, GATCTAGAATTGTCATGTTTGACAGCTTATCAT 3'
3' ATCTTAACAGTACAAACTGTCGAATAGTAGC 5'
aufwies, und einem 539 Basenpaare langen DNA-Fragment aus der Verdauung des Tetracyclinresistenz-Gens von pBR322 (PL Biochemicals, Katalog-Nummer 27-4891-01) mit Cla I und Sph I kombiniert. Das resultierende Plasmid wurde pCJ1 genannt.
Anschließend wurde ein von New England Biolabs bezogener XhoI-Linker in die Pvull-Schnittstelle des pCJ1-Plasmids eingefügt, wodurch das pCJX-1-Plasmid erhalten wurde. Diese Insertion zerstört das rop-Gen, das die Anzahl der Plasmidkopien steuert. Aus dem pMC9-Plasmid [Calos et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1983), 80, 3015-3019] wurde ein EcoRI-Fragment mit dem lac1-Gen gereinigt, und sodann mit Hilfe von XhoI-EcoRI-Adaptoren mit der Sequenz:
5' TCGAGTCTAGA 3'
3' CAGATCTTTAA 5'
in die XhoI-Schnittsteile eingefügt.
Die Polylinker-Sequenz zwischen den EcoRI- und PstI-Schnittstellen im pCJX-1-Plasmid wurde dann durch die nachstehend gezeigte Polylinker-Sequenz ersetzt:
5'AATTCCCGGG TACCAGATCT GAGCTCACTA GTCTGCA 3'
3' GGGCCC ATGGTCTAGA CTCGAGTGAT CAG 5'
Das auf diese Weise erhaltene Plasmidvektor wird pCJXI-1 genannt.
Zuletzt wurde das Tetracyclinresistenz-Gen durch ein ähnliches Gen ersetzt, bei dem die Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme Hind III, Bam HI und Sal I durch Mutagenese mit Bisulfit zerstört worden waren. Zur Mutagenisierung des Tetracyclinresistenz-Gens von pBR322 wurde folgendes Verfahren angewandt. Das pBR322-Plasmid wurde mit Hind III gespalten und dann mit Natriumbisulfit mutagenisiert [Shortle und Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) 5, 2170-2174]. Die mutagenisierte DNA wurde zum Erhalt von zirkulärer DNA durch Ligation verknüpft, anschließend wurde sie mit Hind III geschnitten, wodurch Plasmide, die der Mutagenisierung entkommen waren, linearisiert wurden. Der JM109-Stamm von E. coli [Yanisch-Perron et al. Gene (1985) 33,103-119] wurde mit dem Plasmid transformiert und dann auf Selektivmedium ausplattiert. Die Plasmide wurden aus Tetracyclinresistenten Kolonien isoliert und auf den Verlust der Hind III-Schnittstelle in dem Tetracyclinresistenz- Gen untersucht. Das erfolgreich mutagenisierte Plasmid wurde ph genannt. Ein ähnliches Verfahren wurde zur Mutagenisierung der Bam HI-Schnittstelle in pT1 angewandt, wodurch das pT2-Plasmid erhalten wurde. Das pT2-Plasmid wurde seinerseits zum Entfernen der Sal I-Schnittstelle mutagenisiert, wodurch das pT3-Plasmid erhalten wurde. Ein ClaI/BsmI-Fragment von pT3, das das mutagenisierte Tetracyclinresistenz-Gen enthält, wurde isoliert und zum Ersetzen des homologen Fragments von pCJXI-1 verwendet, wodurch pT3XI-2 erhalten wurde. Das mutierte Tetracyclinresistenz-Gen kodiert noch ein funktionelles Protein.

3. Bildung von pT3XI-2-φ10TC3FGFsyn (Vorbereitung des tac-Promoter-Vektors für NGF)

Zuerst wurde ein "Gen" für den basischen Fibroblasten-Wachstumsfaktor (basic Fibroblast Growth Factor, bFGF) synthetisiert. Dieses "Gen" kodiert eine Sequenz, die mit der von Sommer et a. (1987, Biochem. Biophys. Res. Commun. 141, 67) für bFGF beschriebene Sequenz identisch ist, jedoch die Codons nutzt, die bevorzugt bei E. coli in stark exprimierten Genen zu finden sind. In seiner Struktur weist dieses Gen einen kodierenden Abschnitt auf, vor dem eine translationelle Koppler sequenz (siehe Squires et al. 1988, a. a. O.) liegt, wodurch eine effiziente Translationsinitiation gewährleistet wird.
Das synthetische bFGF-Gen wurde zuerst zwischen die EcoRI- und Hind III-Schnittstellen des M13mp18-Vektors eingefügt und sequenziert. Die Struktur dieses Gens ist:
Bestimmte Merkmale des Gens sind hervorgehoben.
Es wurde dann durch Verdauung mit Bam HI und Hind III isoliert und in das mit BamHI und HindIII geschnittene pJU1003-Plasmid (Squires et al. 1988, a. a. O.) eingefügt, wodurch pJU1003- synFGF erhalten wurde. Dieses Plasmid wurde mit Xba I und Hind III geschnitten und das Xba I/Hind III-Fragment mit dem bFGF-Gen wurde isoliert. Dieses Fragment wurde mit Hilfe eines EcoRI-XbaI-Linkers:
5' AAT TCC ACA ACG GTT TCC CT 3'
3' GG TGT TGC CAA AGG GAG ATC 5'
in das mit EcoRI und Hind III geschnittene pT3XI-2-Plasmid durch Ligation eingebaut. Das neue Plasmid wurde pT3XI-2-φ10TC3FGFsyn genannt.

4. Einfügen des NGF-Expressionskonstrukts in den Tac-Promoter-Vektor

pT3XI-2-φ10TC3FGFsyn wurde mit BamHI geschnitten, was zur Linearisierung des 7,4 kb-Paare langen Expressionsvektors und zur Freisetzung des etwa 0,5 kb-Paare langen bFGF-DNA-Fragments führte. Das 390 bp BamHI-Fragment, das die modifizierten NGF kodierenden Sequenzen enthielt, wurde in das aus einem Gel gereinigte, mit BamHI geschnittene Vektor-DNA-Fragment durch Ligation eingebaut, wodurch das Plasmid kpT3XI-2 : NGF erhalten wurde.

BEISPIEL 3: RÜCKFALTUNG UND RENATURIERUNG VON MITGLIEDERN DER NGF/BDNF- FAMILIE VON NEUROTROPHEN PROTEINEN

A. Die Rückfaltung von in eukaryontischen Zellen erzeugtem oder aus natürlichen Quellen gereinigtem reifem NGF

Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Fähigkeit, die inaktive reife Form des in Bakterien hergestellten rekombinanten NGF rückzufalten und ihre biologische Aktivität wiederherzustellen. Zum Nachweis der Durchführbarkeit wurde zunächst festgestellt, daß biologisch vollaktiver reifer NGF, der in einem eukaryontischen Zellexpressionssystem hergestellt oder aus natürlichen Quellen gereinigt wurde, erfolgreich rückgefaltet werden kann, nachdem seine biologische Aktivität durch Denaturierung und Reduktion der Disulfidbindungen zerstört worden ist. Dieser Nachweis ist aus zweierlei Gründen erheblich:
(1) Es ist plausibel anzunehmen, daß reifer NGF, der in Bakterien hergestellt (ursprünglich inaktiv) oder aus natürlichen Quellen gereinigt (ursprünglich aktiv) wurde, nach vollständiger Denaturierung und Reduktion inaktiv sein und keine erkennbare Strukturunterschiede aufweisen wird. Da sie keine erkennbaren Strukturunterschiede aufweisen, ist die gelungene Rückfaltung von denaturierten und reduzierten reifen NGFs aus eukaryontischen Zellen oder natürlichen Quellen ein Hinweis dafür, daß auch in Bakterien exprimierter reifer NGF nach seiner Denaturierung und Reduktion erfolgreich rückgefaltet werden kann.
(2) Anders als in einem eukaryontischen Zellexpressionssystem kann die vollständige NGF-Vorläuferform zur Erzeugung des richtigen reifen NGF in Bakterien nicht proteolytisch prozessiert werden. Daher ist es bei Bakterien erforderlich, anstatt der vollständigen Vorläuferform die kodierende Sequenz für reifen NGF direkt zu exprimieren. Es ist theoretisch möglich, daß die richtige Faltung und Erlangung der biologischen Aktivität des reifen NGF nur eintritt, wenn dieser wie bei eukaryontischen Zellen und natürlichen Quellen zuerst als vollständige Vorläuferform synthetisiert wird. Dies würde die Wahrscheinlichkeit einer erfolgreichen Rückfaltung des in Bakterien hergestellten reifen Proteins auf Null reduzieren. Jedoch beweist die hier gezeigte, gelungene Rückfaltung von denaturiertem und reduziertem reifem NGF, daß eine richtige Rückfaltung nicht von der vollständigen Vorläuferform abhängt.
Zwei Formen des ursprünglich biologisch aktiven reifen NGF werden nach ihrer Denaturierung und Reduktion erfolgreich rückgefaltet: (1) reifer (Beta)-NGF, der aus der Maxillardrüse von männlichen Mäusen gereinigt wurde (SIGMA) und (2) rekombinanter reifer menschlicher NGF, der gemäß den in der europäischen Patentveröffentlichung EP 89113709 beschriebenen Verfahren in eukaryontischen Zellen hergestellt wurde. Fig. 3 zeigt, daß der wie vorstehend erzeugte rekombinante reife menschliche NGF bei den für NGF zu erwartenden Konzentrationen (Greene, 1977, Develop. Biol. 58, 96-113) das Überleben von sympathischen Ganglionneuronen aus Hühnerembryonen fördert. Fig. 3 zeigt ebenfalls, daß diese biologische Aktivität nach Denaturierung und Reduktion der Disulfidbindungen verlorengeht. Ferner zeigt Fig. 3, daß das denaturierte und reduzierte Protein nach der Rückfaltung gemäß den hier beschriebenen Verfahren seine vollständige biologische Aktivität wiedererlangt. Im wesentlichen ähnliche Ergebnisse wurden bei Verwendung von reifem, aus der Maxillardrüse von Maus gereinigtem Beta-NGF erhalten. Diese erfolgreichen Rückfaltungen stellen einen starken Hinweis auf die Durchführbarkeit einer Rückfaltung von in Bakterien erzeugtem reifem NGF dar.

1. Protokoll zur Rückfaltung von NGF

NGF wurde in einer Konzentration von 0,5 mg/ml in PBS (0,15 M NaCl, 0,04 M K&sub2;HPO&sub4;, 0,02 M K&sub2;HPO&sub4;, pH 7,2) gelöst und durch Zugabe von Guanidinhydrochlorid bis zu einer Endkonzentration von 3 M denaturiert. Nach 30 Minuten bei 25ºC wurde der Lösung Dithiotreit (DTT) bis zu einer Endkonzentration von 5,6 mM zugesetzt und die Inkubation bei 25ºC wurde 2 Stunden fortgesetzt (auch 50 mM DTT ist mit etwa dem gleichen Erfolg verwendet worden). Sodann wurde oxidiertes Glutathion bis zu einer Endkonzentration von 50 mM zugesetzt und das Gemisch wurde 10 Minuten lang bei 25ºC inkubiert. Diese Lösung wurde mit einer 0,6%igen Tris-Lösung (Boehringer/Mannheim 604-205), die 0,2% menschliches Serumalbumin enthielt und deren pH nicht eingestellt war, 7fach verdünnt. Die gleiche Wirkung erzielte man durch Zugabe von L-Cystein bis zu einer Endkonzentration von 20 oder 30 mM. Dieses Rückfaltungsgemisch wurde 16-20 Stunden lang bei 25ºC inkubiert und das Material wurde dann mit einem Centricon-10-Konzentrator (Amicon) konzentriert und der Puffer durch PBS ausgetauscht.

2. Testen der biologischen Aktivität von NGF nach Rückfaltung

Wie in der Anlage zur Versuchsdurchführung für dieses Beispiel beschrieben, wurde die Fähigkeit von unbehandeltem Ausgangs-NGF, von NGF im 3 M Guanidin und 5,6 mM DTT enthaltenden Denaturierungspuffer sowie von denaturiertem und anschließend rückgefaltetem NGF getestet, das Überleben von Neuronen aus dissoziierten lumbalen sympathischen Kettenganglien aus E11-Hühnerembryonen zu fördern. Fig. 3 zeigt die Ergebnisse dieses Biotests. Der denaturierte und reduzierte NGF zeigte die Hälfte der maximalen biologischen Aktivität bei 450 ng/ml, während der Ausgangs-NGF und der rückgefaltete NGF die Hälfte der maximalen biologischen Aktivität bei 0,5 bzw. 1,0 ng/ml zeigten. Diese Ergebnisse sind ein Hinweis darauf, daß Denaturierung und chemische Reduktion die biologische Aktivität von rekombinantem reifem menschlichem NGF ungefähr um Faktor 1000 reduzierten, und daß dieses Material durch das Rückfaltungsverfahren im Rahmen des etwa 200% betragenden Meßfehlers des Biotests die biologische Aktivität des Ausgangs-NGF wiedererlangte.

B. Die Rückfaltung von in E. coli-Zellen erzeugtem reifem menschlichem NGF

Reifer NGF, der wie in Beispiel 2 beschrieben in E. coli-Zellen exprimiert wurde, ist biologisch inaktiv. Dieser NGF wird zum Erhalt von biologisch aktivem NGF gemäß den nachstehend beschriebenen Verfahren rückgefaltet.

1. Gewinnung des Ausgangsmaterials für die Rückfaltung

10 Gramm E. coli-Zellpaste von pT3X1-2 : NGF in JM107 - wie in Beispiel 2 beschrieben - wurden in 50 ml 10 mM EDTA, pH 7,0 resuspendiert und zweimal durch eine French-Presse mit 16.000 psi geschickt. Der Zellextrakt wurde 20 Minuten lang bei 16.000 g zentrifugiert und der Überstand wurde verworfen. Das Pellet wurde in 100 ml 10 mM EDTA, pH 7,0 homogenisiert. Das resuspendierte Pellet wurde wie vorstehend beschrieben zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde nochmals in 100 ml 10 mM EDTA, pH 7,0 homogenisiert. Das resuspendierte Pellet wurde wie vorstehend beschrieben zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mit 30 ml einer 4 M Harnstoff- Lösung in 50 mM Tris, pH 8,0 mit 0,2% β-Mercaptoethanol homogenisiert. Das resuspendierte Pellet wurde zentrifugiert und der Überstand wie vorstehend verworfen. Das Pellet wurde mit 30 ml 20 mM Natriumcitrat, pH 3,0 mit 8 M Harnstoff homogenisiert. Das resuspendierte Pellet wurde wie vorstehend beschrieben zentrifugiert und der Überstand auf Eis stehengelassen. Das Pellet wurde in 30 ml 20 mM Natriumcitrat, pH 3,0 mit 8 M Harnstoff homogenisiert und wie oben zentrifugiert und der Überstand wurde auf Eis stehengelassen. Die Überstände können bei -80ºC gelagert werden.

2. Rückfaltung des E. coli-Extraktes

Dem vorstehend beschriebenen Extrakt des letzten Überstandes wird ein Viertel Volumen einer 1 Molaren Tris-Lösung mit einem pH-Wert von 8,5, die 8 M Harnstoff enthält, zugesetzt. Dithiothreit wird bis zu einer Endkonzentration von 5-15 mM zugesetzt und die Lösung wird 1 Stunde lang bei 25ºC stehengelassen. Sodann wird Cystin (oder oxidiertes Gluthation) bis zu einer Endkonzentration von 15-50 mM zugesetzt und die Lösung 10-15 Minuten lang bei 25ºC stehengelassen. Neun Volumina 100 mM Na&sub2;HPO&sub4;, pH 8,3 mit 3,2-4,2 M Harnstoff werden zugesetzt, gefolgt von Cystein bis zu einer Endkonzentration, die der 2-3fachen Endkonzentration von Cystin (oder Glutathion) entspricht. Diese Lösung wird über Nacht bei 4ºC gehalten. Unter diesen Bedingungen wird der aktive NGF weder reduziert noch denaturiert.
Die vorstehenden Bedingungen liefern Konzentrationsbereiche und alternative Reagenzien, die wir brauchbar gefunden haben. Im folgenden wird ein Beispiel für ein repräsentatives Rückfaltungsexperiment angegeben:
Vierzig ml des vorstehend beschriebenen E. coli-Extraktes (mit etwa 650 ug NGF/ml, wie durch Laser-Densitometrie von mit Coomassie-Brilliantblau gefärbten SDS-Polyacrylamidgelen abgeschätzt wurde) wurden 10 ml einer 1 M Tris-Lösung, pH 8,5 mit 8 M Harnstoff zugesetzt. Zwei ml einer 400 mM Dithiothreit-Lösung wurden zugesetzt und die Lösung wurde 1 Stunde lang bei 25ºC stehengelassen. Vier ml 600 mM oxidiertes Glutathion wurden zugesetzt und die Lösung 15 Minuten lang bei 25ºC stehengelassen; sodann wurden 450 ml 100 mM Na&sub2;HPO&sub4;, pH 8,3 mit 3,2 M Harnstoff zugesetzt, gefolgt von 6 ml einer 1 Molaren Cystein-Lösung. Diese Lösung wurde 16 Stunden lang bei 4ºC stehengelassen. Nachstehend wird diese Lösung als das fertige Rückfaltungsgemisch bezeichnet.

2a. Alternative Verfahren zur Extraktion und Rückfaltung von in E. coli erzeugtem, reifem menschlichem NGF

Die nachstehenden Verfahren werden gegenüber den bereits vorgestellten bevorzugt, da sie zu einer erheblich größeren Rückfaltungseffizienz und -rate führen und eine höhere Ausbeute des richtig rückgefalteten und biologisch aktiven reifen menschlichen NGF ergeben.

Extraktion von NGF

Die (in Beispiel 2 beschriebenen) NGF-produzierenden E. coli-Zellen wurden mit Hilfe einer French-Presse oder einer Gaulin-Mühle bei einem Verhältnis 10 Volumina pro Gewichtseinheit (z. B. 1 Liter/100 g Zellpaste) in 10 mM EDTA, pH 7,0 aufgeschlossen. Zur Trennung des Überstandes vom Pellet wurde das Lysat 20 Minuten lang bei 16.000 g zentrifugiert. Das Pellet wurde wie vorstehend beschrieben zweifach durch Homogenisierung in 10 Volumina einer 10 mM EDTA-Losung, pH 7,0 extrahiert und zentrifugiert. Das Pellet wurde nochmals wie vorstehend beschrieben extrahiert. Das gewaschene Pellet wurde mit 5 Volumina pro Gewichtseinheit von einer 20 mM Tris-Lösung, pH 8,0 mit 2 M Harnstoff extrahiert und wie vorstehend beschrieben zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen.
NGF wurde mit 10 Volumina pro Gewichtseinheit einer 20 mM Citrat-Lösung, pH 3,0 mit 8 M Harnstoff extrahiert und wie oben zentrifugiert. Der Überstand wurde auf Eis gehalten, während das Pellet zum letzten Mal mit 4 Volumina pro Gewichtseinheit einer 20 mMolaren Citrat-Lösung, pH 3,0 mit 8 M Harnstoff wie vorstehend beschrieben extrahiert wurde. NGF stellte etwa 50% des Gesamtproteins in dem CH(Citrat-Harnstoff)-Extrakt dar.
Typischerweise wurde die Rückfaltung wie folgt durchgeführt: 20 ml einer 1 M Tris-Lösung, pH 8,5 mit 8 M Harnstoff wurden zu 80 ml des CH-Extraktes, der etwa 2 mg/ml NGF enthielt, gegeben. Dithiothreit oder 2 β-Mercaptoethanol wurden bis zu einer Endkonzentration von 5 mM zugesetzt und das Gemisch wurde 30-60 Minuten fang bei 25ºC gehalten. Sodann wurde oxidiertes Glutathion oder Cystin bis zu einer Endkonzentration von 20 mM zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde 10-15 Minuten lang bei 25ºC gehalten. Anschließend wurden 19 Volumina des Verdünnungspuffers (100 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 10 mM Ethanolamin, pH 8,3, 4,6 M Harnstoff und 15,8% Polyethylenglykol-300) zugesetzt. Cystein oder 2-Mercaptoethylamin wurden bis zu einer Endkonzentration von 3 mM zugesetzt. Das fertige Rückfaltungsgemisch wurde unter Vakuum entgast und mit gereinigtem Argon durchströmt, und zwar über 3-5 Zyklen aus Entgasen und Abführen des Argons. Das Gemisch wurde gegen Gaseintritt abgedichtet und 1-7 Tage lang bei 9ºC unter Argon gehalten.
Es ist zweckmäßig, das Verhältnis von Cystein (oder 2-Mercaptoethylamin) zu oxidiertem Glutathion (oder Cystamin) in dem fertigen Rückfaltungsgemisch zu optimieren. Das optimale Verhältnis (typischerweise zwischen 2 und 10) kann abhängig von verschiedenen Faktoren variieren, darunter von der Temperatur, bei der das Endreaktionsgemisch gehalten wird. Man erhält rückgefalteten NGF bei Temperaturen von 0-25ºC, die bevorzugte Temperatur liegt jedoch zwischen 4 und 9ºC. Der Verdünnungsschritt liefert rückgefalteten NGF in einer 3 bis 80fachen Endverdünnung, jedoch liefern 20fache Verdünnungen oder höher den größten Prozentanteil an rückgefaltetem NGF im gesamten NGF. Rückgefalteter NGF wird mit einer Endkonzentration von bis zu 25% von Polyethylenglykol-200, -300 und -1000 erhalten, jedoch liefern Polyethylenglykol-200 oder -300 in einer Endkonzentration von 15% die höchste Ausbeute. Anstelle von Polyethylenglykol können Ethylenglykol, Glycerin oder Propylenglykol verwendet werden; die Rückfaltungseffizienz wird im Vergleich zu Polyethylenglykol-300 um etwa zwei Drittel reduziert. Dis Harnstoffkonzentration in dem fertigen Rückfaltungsgemisch kann zwischen 4 und 6 M liegen, eine Konzentration von 4,5-6,0 M liefert jedoch die höchsten Ausbeuten von rückgefaltetem NGF. Die Rückfaltung findet bei einem pH-Wert im fertigen Rückfaltungsgemisch in dem Bereich zwischen 8 und 10 statt, die schnellste Rückfaltungsrate erhielt man jedoch bei pH 10. Die Konzentration des Phosphatpuffers in dem fertigen Rückfaltungsgemisch wird am besten zwischen 100 und 300 mM gehalten, Wahrend das Verhältnis von Phosphatpuffer zu Ethanolamin bei 10 : 1 gehalten wird.
Durch die wie vorstehend beschrieben durchgeführte Rückfaltung wird mehr als etwa 30% der anfänglichen NGF-Menge die richtig rückgefaltete, biologisch aktive Form einnehmen. Wenn der aus E. coli extrahierte NGF wie vorstehend beschrieben mit Harnstoff und Mercaptoethanofdenaturiert und reduziert und dann über RP-HPLC gereinigt wird (er erscheint als ein einzelner Peak bei einer Acetonitril-Konzentration von etwa 43%), erhöht sich die Rückfaltungseffizienz auf mehr als 60% des Ausgangs-NGF. Dies ist ein Hinweis dafür, daß Kontaminanten in dem E. coli-Extrakt die Rückfaltungseffizienz teilweise beeinträchtigen. Die Reinigung des NGF vor der Rückfaltung durch andere Verfahren als RP-HPLC, wie etwa durch Ionenaustauschchromatographie, kann ebenfalls die Rückfaltungseffizienz erhöhen.

3. Ermittlung der Rückfaltungseffizienz

Die Gesamtmenge an NGF im fertigen Rückfaltungsgemisch wurde wie folgt ermittelt: SDS- Polyacrylamidgele, bei denen einige Spuren unterschiedliche Konzentrationen eines NGF-Kalibrierungsstandards (das in Beispiel 3 beschriebene, mit einem Baculovirus in Insektenzellen erzeugte Material) und andere Spuren aliquote Teile des fertigen Rückfaltungsgemisches enthielten, wurden unter reduzierenden Bedingungen gefahren, mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt und anschließend mit Laser densitometrisch eingescannt. Die Menge an NGF in einer unbekannten Probe kann durch quantitative Korrelation zwischen den durch Laser-Densitometrie erhaltenen Werten für optische Dichte und der Menge des NGF-Standardproteins ermittelt werden.
Die Menge an richtig rückgefaltetem NGF in einem fertigen Rückfaltungsgemisch wurde wie folgt ermittelt: In dem in der Anlage zur Versuchsdurchführung für Beispiel 3 beschriebenen Test wurden Verdünnungsreihen des fertigen Rückfaltungsgemisches auf ihre Fähigkeit getestet, das Überleben von sympathischen Kettenneuronen aus Hühnerembryonen in vitro zu fördern. In dem gleichen Test wurden eine Reihe verschiedener Konzentrationen des als Standard eingesetzten, in Insektenzellen erzeugten NGF auf ihre Fähigkeit getestet, das Überleben von Neuronen zu fördern. Es wurde angenommen, daß die Verdünnung des fertigen Rückfaltungsgemisches, die bei dem Biotest eine halbmaximale Überlebensrate ergab, die gleiche Konzentration des richtig rückgefalteten NGF enthielt, wie der zum Erhalt einer halbmaximalen Überlebensrate benötigte NGF-Standard.
Durch diese Verfahren wurde die Menge des im oben beschriebenen Rückfaltungsexperiment erhaltenen, richtig rückgefalteten NGF ermittelt. In dem Biotest wurden zum Erhalt einer halbmaximalen Überlebensrate 3,7 ng/ml des in Insektenzellen erzeugten NGF benötigt. Da eine Verdünnung des fertigen Rückfaltungsgemisches von 1 : 1500 zu einer halbmaximalen Überlebensrate führte, konnte man daraus schließen, daß das fertige Rückfaltungsgemisch (1500 · 3,7 = ) 5550 ng/ml aktiven NGF enthielt. Mittels Laserdensitometrie wurde eine Gesamtmenge an NGF im fertigen Rückfaltungsgemisch von 52.000 ng/ml ermittelt, was auf eine Rückfaltungseffizienz von etwa 11% hinweist.
Fig. 9 veranschaulicht die Ergebnisse des Biotests für den in Insektenzellen erzeugten NGF- Standard, der die halbmaximale Überlebensrate bei einer Konzentration von 3,7 ng/ml erzielte. Fig. 10 veranschaulicht die Ergebnisse des Biotests für das fertige Rückfaltungsgemisch, das die halbmaximale Überlebensrate bei einer Verdünnung von 1 : 1500 lieferte.

4. Reinigung und Charakterisierung von rückgefaltetem, in E. coli erzeugtem NGF

Die Reinigung und Charakterisierung des biologisch aktiven, rückgefalteten NGF in dem fertigen Rückfaltungsgemisch erfolgte durch Umkehrphasen-Hochieistungs-FlüSSigkeitschromatographie (RP-HPLC). Die RP-HPLC wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Lösungsmittel A = 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, Lösungsmittel B = 0,1% TFA in Acetonitril (sämtliche Reagenzien waren HPLC-rein), Säule = VyDec C4 #214TP54, Flußrate = 1 ml pro Minute. Die Probe wurde zum Zeitpunkt 0 eingespritzt und der Gradient nach folgendem Programm aufgebaut:

Zeit % B

0 5%
5-10 5-20%
10-40 20-50
40-50 50-80%
Zur Kalibrierung der Säule für die nachfolgende Analyse der rückgefalteten Proben wurden die Positionen ermittelt, an denen nativer NGF und reduzierter NGF eluiert werden. % B steht für die Menge an Lösungsmittel B in dem Eluent aus der Säule. Eine Probe des in Insektenzellen erzeugten nativen NGF wurde bei etwa 34% B eluiert. Eine Probe des denaturierten und reduzierten, in Insektenzellen erzeugten NGF wurde bei etwa 43% B eluiert. Der NGF wurde durch Behandlung mit 6 M Guanidinhydrochlorid und 50 mM Dithiothreit in 200 mM Tris, pH 8,5 denaturiert und reduziert. Zur Ermittlung des genauen % B, bei dem diese zwei Proben eluiert werden, mußte jede einzelne RP-HPLC- Säule mit diesen Standards kalibriert werden.
50 ul fertiges Rückfaltungsgemisch aus dem vorstehend beschriebenen Rückfaltungsexperiment ergaben einen Proteinpeak an der Position des nativen NGF (Fig. 11B). An dieser Stelle lief vor der Rückfaltung kein Protein. Wenn einer zweiten 50 ul-Probe 100 ng von nativem, in Insektenzellen erzeugten NGF zugesetzt wurde, war der Peak an der Position von NGF etwa doppelt so groß (Fig. 11A). Dies ist die Bestätigung dafür, daß das nach Rückfaltung auftretende Protein an derselben Position wie nativer NGF läuft, und ebenfalls ein Hinweis dafür, daß in 50 ul des fertigen Rückfaltungsgemisches etwa 100 ng dieses Materials vorhanden sind. Wenn Fraktionen, die entlang des RP-HPLC- Gradienten gesammelt wurden, auf Bioaktivität in dem Überlebenstest mit sympathischen Neuronen getestet wurden, zeigte einzig dieser Peak eine nachweisbare Bioaktivität. Dies ist eine weitere Bestätigung dafür, daß es sich bei dem Protein im fertigen Rückfaltungsgemisch um NGF handelt. Die spezifische Aktivität dieses Peaks befand sich in dem Bereich, der für nativen, in Insektenzellen erzeugten NGF (halbmaximale Überlebensrate bei 0,5-5 ng/ml bei getrennten Tests an verschiedenen Tagen) beobachtet wurde. Folglich läuft der rückgefaltete NGF aus E. coli an der Position des nativen, in Insektenzellen erzeugten NGF und ist biologisch vollaktiv.
Wenn die Rückfaltung wie in dem vorstehenden Beispiel 3.B.2a. durchgeführt wird, kann der rückgefaltete NGF wie folgt gereinigt werden. Das fertige Rückfaltungsgemisch wird mit einer Konzen trierungsvorrichtung wie etwa einem Hohlfaserfilterkonzentrator etwa 20fach konzentriert. Das Konzentrat wird dann gegen 10-20 Volumina Harnstoff enthaltenden Puffer dialysiert. Als Puffer wird 50 mM Natriumacetat, pH 5,0 verwendet, weil der rückgefaltete NGF in diesem Puffer löslich und stabil ist, und weil sein pH-Wert für die anschließende Kationenaustauschchromatographie geeignet ist. Der Dialysepuffer enthält eine ausreichende Menge an Harnstoff, um nach der Dialyse eine Harnstoff-Endkonzentration von 1,5-2 M zu erreichen. Der Umkehrphasen-HPLC nach zu urteilen erlaubt dies die Fällung von E. coli-Proteinen und nicht richtig rückgefaltetem NGF.
Zum Pelletieren des Präzipitats wird die dialysierte Probe zentrifugiert und dann auf eine S-Sepharose-Säule in 50 mM Natriumacetat-Puffer, pH 5,0 appliziert. Die Säule wird gewaschen und mit einem linearen Kochsalz-Gradienten zwischen 0,05 und 1,5 M NaCl eluiert. Der NGF wird durch Umkehrphasen-HPLC bis zur Homogenität gereinigt.
Fig. 12 veranschaulicht das durch Umkehrphasen-HPLC (RP-HPLC) erhaltene Proteinprofil des fertigen Rückfaltungsgemisches. Der richtig rückgefaltete NGF erscheint als der größte Proteinpeak, der bei einer Acetonitril-Konzentration von etwa 37% eluiert wird. Fig. 13 veranschaulicht das RP-HPLC-Proteinprofrl des fertigen Rückfaltungsgemisches nach Konzentrierung und Dialyse, aber vor der Chromatographie in S-Sepharose. Die in Fig. 12 sichtbare Kontaminierung mit anderen Proteinen einschließlich nichtrückgefalteten NGF, der bei einer Acetonitril-Konzentration von etwa 47% eluiert wird (Fig. 12), wurde erheblich reduziert und der richtig rückgefaltefe NGF ist im wesentlichen rein. Fig. 14 veranschaulicht das RP-HPLC-Proteinprofil des Materials nach Chromatographie über S-Sepharose. Nahezu alle kontaminierenden Proteine wurden entfernt. Der kleine Peak, der unmittelbar nach dem Hauptpeak mit rückgefaltetem NGF eluiert wird, ist die monomere Form des rückgefalteten NGF. Der bei einer Acetonitril-Konzentration von etwa 37% eluierte Hauptpeak ist die dimere Form des rückgefalteten NGF:
In dem Biotest auf das Überleben von sympathischen Nervenzellen aus Hühnerembryonen zeigte der durch Umkehrphasen-HPLC gereinigte NGF eine spezifische Aktivität von E. D.&sub5;&sub0; = 0,17 ± 0,01 ng/ml. Im Vergleich zeigte der (wie in Beispiel 3 beschrieben) in Insektenzellen erzeugte, rekombinante menschliche NGF eine spezifische Aktivität von E. D.&sub5;&sub0; = 0,25 ± 0,02 ng/ml. Dies zeigt, daß der rückgefaltete NGF, der in E. coli erzeugt und durch die soeben beschriebenen Verfahren rückgefaltet und gereinigt wurde, biologisch vollaktiv ist.

C. Die Rückfaltung von reifem menschlichem BDNF

Reifer menschlicher BDNF, der wie vorstehend in Beispiel 1D beschrieben mit rekombinanten Methoden in E. coli erzeugt wurde, wird durch Rückfaltung gemäß den vorstehend in Beispiel 3B. beschriebenen Verfahren biologisch aktiv gemacht.

D. Die Rückfaltung von reifem NGF-3

Wie nachstehend in Beispiel 4 beschrieben, wird reifer menschlicher NGF-3 durch Rückfaltung gemäß den vorstehend in Beispiel 3B beschriebenen Verfahren biologisch aktiv gemacht.

ANLAGE ZUR VERSUCHSDURCHFÜHRUNG FÜR BEISPIEL 3

1. Biotest für NGF und BDNF

Die Kulturen aus Sympathischen Kettenganglien und dorsalen Wurzelganglien aus Hühnerembryonen wurden wie bereits beschrieben (Collings und Lile, 1989, Brain Research 502, 99) angelegt. In Kürze: Befruchtungsfähigen, pathogenfreien Hühnereiern, die 8-11 Tage lang bei 38ºC bei feuchter Atmosphäre inkubiert worden waren, wurden die sympathischen Ganglien oder die dorsalen Wurzelganglien entnommen. Die Ganglien wurden chemisch dissoziiert, indem sie zunächst 10 Minuten lang bei 37ºC mit Hank'scher ausgewogener (balanced) Kochsalziösung, die frei von divalenten Kationen war und 10 mM HEPES-Puffer, pH 7,2 enthielt, und dann 12 Minuten lang bei 37ºC mit einer Lösung aus 0,125% Bactotrypsin 1 : 250 (Difco, Detroit, Michigan) in Hank'scher balancierter Kochsalzlösung, die wie vorstehend modifiziert wurde, behandelt wurden. Die Behandlung mit Trypsin wurde durch Zugabe von fetalem Kalbserum bis zu einer Endkonzentration von 10% gestoppt. Nach dieser Behandlung wurden die Ganglien in eine Lösung überführt, die aus Bicarbonat-freiem, Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glucosegehalt, 10% fötalem Kalbserum und 10 mM HEPES, pH 7,2 bestand, und mechanisch dissoziiert, indem sie etwa zehnmal durch eine Pasteur-Glaspipette passiert wurden, deren Öffnung an einer Flamme poliert und so verengt worden war, daß das Füllen der Pipette 2 Sekunden in Anspruch nahm. Die dissoziierten Ganglien wurden dann drei Stunden lang in Kulturmedium (Dulbecco-modifiziertes Eagle-Medium, das mit 10% fötalem Kalbserum, 4 mM Glutamin, 60 mg/l Penicillin-G, 25 mM HEPES, pH 7,2 ergänzt wurde) auf Gewebekulturplatten mit einem Durchmesser von 100 mm ausplattiert (40 dissoziierte Ganglien pro Platte). Durch diese Vorplattierung wurden die an der Platte haftenden, nichtneuronalen Zellen von den nichthaftenden Nervenzellen getrennt. Nach drei Stunden wurden die nichthaftenden Nervenzellen durch Zentrifugation geerntet, in Kulturmedium resuspendiert und in halbflächige Mikrotiter-Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen bei einem Volumen 50 ul pro Vertiefung und einer Dichte von 1500 Nervenzellen pro Vertiefung ausplattiert. Vorher wurden die Microtiter-Vertiefungen über Nacht bei 4ºC mit einer Lösung von Poly-L-ornithin in 10 mM Natriumborat, pH 8,4 in einer Konzentration von 1 mg/ml behandelt, mit destilliertem Wasser gewaschen und luftgetrocknet.
10 ul einer Verdünnungsreihe der auf neurotrophe Aktivität zu testenden Probe wurden in jede Vertiefung gegeben und die Platten wurden 20 Stunden lang bei 37ºC in einer feuchten Atmosphäre inkubiert, die 7,5% CO&sub2; enthielt. Nach 18 Stunden wurden in jede Vertiefung 15 ul einer Lösung des Tetrazolium-Farbstoffes MTT in Bicarbonat-freiem, Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium mit hohem Glucosegehalt, das 10 mM HEPES, pH 7,2 enthielt, in einer Konzentration von 1,5 mg/ml gegeben und die Kulturen wurden für weitere vier Stunden in dem Inkubator bei 37ºC stehengelassen. Sodann wurden 75 ul einer Lösung von 6,7 ml 12 M HCl pro Liter Isopropanol zugesetzt und der Inhalt jeder Vertiefung wurde 30 mal zerrieben, wodurch die Zellen aufgeschlossen wurden und der Farbstoff in Suspension gebracht wurde. Für jede Vertiefung wurde mit einem automatischen Mikrotiterplattenleser (Tynatech, Chantilly, Virginia) die Extinktion bei 570 nm relativ zu einer Referenz bei 690 nm ermittelt. Die Extinktion der Vertiefungen, denen kein neurotrophes Agens zugesetzt worden war (negative Kon trollen), wurde von der Extinktion der probenenthaltenden Vertiefungen abgezogen. Die erhaltene Extinktion ist proportional zu der Anzahl lebender Zellen in jeder Vertiefung, definiert als diejenigen Nervenzellen, die den Farbstoff reduzieren können. Die Konzentration der trophischen Aktivität in trophischen Einheiten (TU) pro ml wurde als die Verdünnung definiert, die 50% der maximalen Überlebensrate von Nervenzellen lieferte. Wenn, beispielsweise, eine Probe in einer Verdünnung von 1 : 100.000 eine 50%ige maximale Überlebensrate lieferte, wurde der Titer als 100.000 TU/ml definiert. Zur Berechnung der spezifischen Aktivität wurde die Anzahl der trophischen Einheiten pro ml durch die Konzentration des Proteins pro ml in der unverdünnten Probe geteilt.

BEISPIEL 4: KLONIERUNG VON NGF-3, EINEM NEUEN MITGLIED DER NGF/BDNF-FAMILIE VON NEUROTROPHEN PROTEINEN

A. Anwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zur Amplifizierung eines DNA-Fragmentes von NGF-3

Auf der Grundlage von stark konservierten Regionen in den Nukleinsäuresequenzen, die die reifen (prozessierten) NGF verschiedener Spezies und den BDNF des Schweins und des Menschen kodieren, wurden zwei teilweise degenerierte Oligonukleotide, NNF-1 und NNF-3, synthetisiert. Die Sequenzen dieser Oligonukleotide und die Restriktionsschnittstellen am 5'-Ende, die zur Erleichterung der Subklonierung amplifizierter Fragmente eingebaut wurden, werden nachstehend dargestellt. (I = Inosin)

NNF-1 (SINN-STRANG)

HindIII

5'-GGAAGCTT GTG TG(C/T) GAC AG(C/T) (A/G)T(C/T) AG(C/T) (A/G) (A/T)G TGG GT -3'

NNF-3 (ANTISINN-STRANG)

BamHI

5'-CCGGATCC TTC CA(A/G) TG(C/T) (C/T)TI (A/G) (A/C) (A/G) TCI AT(G/C) CC(C/T) C(G/T)G CA-3'
NNF-1 und NNF-3 wurden als Primer für PCR (siehe Anlage zur Versuchsdurchführung für Beispiel 1) mit menschlicher genomischer DNA als Matrize verwendet. Die PCR-Produkte wurden einer Elektrophorese in einem 3%igen Agarosegel unterzogen und eine fluoreszierende DNA-Bande, die die in etwa zu erwartende Länge von 150-200 bp aufwies, wurde aus dem Gel herausgeschnitten und durch Ligation der glatten Enden in den mit Smal-geschnittenen M13mp 10-Phagen kloniert. Die erhaltene Ligations-Reaktion wurde auf den E. coli-Stamm TG1 ausplattiert und es wurden Doppel-Abdrücke abgenommen. Der erste Abdruck wurde mit der durch PCR erhaltenen, zufallsmarkierten kodierenden Sequenz für den menschlichen BDNF (siehe Beispiel 1) bei hoher Stringenz hybridisiert. Der zweite Abdruck wurde mit der von British Biotech erhaltenen, zufallsmarkierten kodierenden Sequenz für das reife Protein des menschlichen NGF (siehe Beispiel 1) bei hoher Stringenz hybridisierten. Plaques, die mit einer der Sonden hybridisierten, wurden nicht weiter untersucht. Alle übrigen Plaques, die - wie die Unfähigkeit, Beta-Galactosidase herzustellen, zeigt - ein Insert enthielten, wurden sequenziert. Der Phage in einer solchen Plaque, NNF-18, enthielt zwischen den Oligonukleotiden NNF-1 und NNF-3 ein 136 bp langes amplifiziertes DNA-Fragment, das ein Proteinfragment mit einer 53%igen Identität mit menschlichem NGF und einer 44%igen Identität mit dem menschlichen BDNF aufwies (Fig. 7). Einige Aminosäuren waren sowohl zu NGF als auch zu BDNF homolog und andere nur zu NGF oder zu BDNF (Fig. 7). Der Grad der Homologie des NGF-3-Fragments zu NGF bzw. BDNF ist in etwa gleich mit dem Homologiegrad der beiden letzteren Proteine zueinander (Fig. 7). In Fig. 6, in der die DNA-Sequenz dieses Fragments mit NGF und BDNF verglichen wird, ist diese Sequenz unterstrichen. Auf der Grundlage dieser Homologien ist man zu dem Schluß gekommen, daß dieses Fragment aus einem Gen für ein neues Mitglied der NGF/BDNF-Familie von neurotrophen Proteinen amplifiziert wurde. Das neue Gen bzw. Protein wurde NGF-3 genannt.

B. Verwendung der durch PCR amplifizierten DNA zur Klonierung des menschlichen Gens für NGF-3

Das DNA-Fragment für NGF-3, das wie vorstehend beschrieben durch PCR amplifiziert worden war, wurde durch PCR-Amplifizierung in Anwesenheit von ³²P-dCTP radioaktiv markiert und zum Durchmustern einer genomischen menschlichen Genbank in lambda-FIX II (Stratagene Cat. Nr. 946203) eingesetzt. Durch wiederholte Klonierung wurden aus 1,2 · 10&sup6; Plaques sechs positive gereinigt. DNA aus einem positiven Klon wurde mit dem Restriktionsenzym HinCII teilweise verdaut und in den Vektor M 13 subkloniert. Verschiedene M13-Subklone, die mit dem radioaktiv markierten PCR- Fragment hybridisierten, wurden gemäß den vorstehend in Beispiel 1B. beschriebenen Verfähren in beiden Orientierungen sequenziert, um die vollständige Nukleinsäuresequenz (Fig. 6) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (Fig. 7) des menschlichen NGF-3 zu erhalten.

C. Expression von reifem menschlichem NGF-3 in E. coli

Das reife menschliche NGF-3-Gen, das wie vorstehend in Beispiel 4B. beschrieben erhalten wurde, wird in Expressionsvektoren für E. coli eingebaut; derartige Vektoren werden in E. coli-Wirtszellen eingeschleust und die Expression des Gens zum Erhalt von reifem BDNF wird gemäß den vorstehend in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren durch Austausch des NGF-Gens gegen das NGF-3-Gen erreicht. Das exprimierte rekombinante Protein wird dann durch Rückfaltung gemäß dem vorstehend in Beispiel 3B beschriebenen Verfahren biologisch aktiv gemacht.
Die vorstehende Beschreibung und die Beispiele geben eine Beschreibung der Erfindung und die bevorzugten Ausführungsformen derselben an. Zahlreiche Modifizierungen der hier beschriebenen Verfahren sind für Durchschnittsfachleute selbstverständlich und fallen unter den Schutzbereich der nachstehend angegebenen Ansprüche.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen der reifen, biologisch aktiven Form eines menschlichen neurotrophen Proteins in einem prokaryotischen Expressionssytem, wobei das neurotrophe Protein aus der NGF/BDNF-Familie der neutrotrophen Faktoren ausgewählt wird, umfassend:

(i) Einfügen des für das reife Protein kodierenden Gens in einen Vektor;

(ii) Expremieren des Gens, wodurch eine biologisch inaktive Form des Proteins gebildet wird; und

(iii) Rückfalten und Renaturieren der biologisch inaktiven Form in einem Reaktionsmedium, dessen Erzeugung folgende Schritte umfaßt:

Spalten sämtliche intramolekularer und intermolekularer Disulfidbindungen in einer Lösung des neurotrophen Proteins durch Zugabe eines Denaturierungsmittels und eines Reduktionsmittels zur Lösung und Bilden freier Thiolreste;

Oxidieren der freien Thiolreste mit einer Disulfid-enthaltenden Verbindung, wodurch sich gemischte Disulfidbindungen bilden, wobei das Reduktionsmittel nicht entfernt wird; und

Verdünnen der Lösung in Anwesenheit einer Thiol-enthaltenden Verbindung:

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die prokaryotische Zelle eine bakterielle Zelle ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die bakterielle Zelle ein Stamm von E. coli ist.

4. Verfahren zum Rückfaltenund Renaturieren von reifen neurotrophen Proteinen der NGF/BDNF- Familie, bei dem die Proteine ihre biologische Aktivität erlangen, umfassend:

Erzeugen eines Reaktionsmediums, wobei folgende Schritte umfaßt sind:

Oxidieren der freien Thiolreste mit einer Disulfid-enthaltenden Verbindung, wodurch sich gemischte Disulfidbindungen bilden, wobei das Reduktionsmittel nicht entfernt wird; und Verdünnen der Lösung in Anwesenheit einer Thiol-enthaltenden Verbindung,

wobei das Reaktionsmedium zuläßt, daß das neurotrophe Protein verschiedene 3-dimensionale Konformationen und verschiedene Muster bezüglich der intramolekularen Disulfidbindungen annimmt, wobei das Protein die energetisch stabilste Konformation annehmen wird, und Isolieren des neurotrophen Proteins aus dem Reaktionsmedium.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Reaktionsmedium unter anaeroben Bedingungen gehalten wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem Reaktionsmedium ein Glycol-enthaltendes Reagenz enthält.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Glycol-enthaltende Reagenz Polyethylenglycol ist.

8, Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Denaturierungsmittel Guanidinhydrochlorid oder Harnstoff ist.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, bei dem die Disulfid-enthaltende Verbindung oxidiertes Glutathion, Cystin oder Cystamin ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, bei dem die Thiol-enthaltende Verbindung Cystein oder Dithiothreit ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem das neurotrophe Protein der menschliche NGF ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem das neurotrophe Protein der menschliche BDNF ist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem das neurotrophe Protein der menschliche NGF-3 ist.