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DE69132564T2 - Verfahren zur identifizierung von verbindungen, die als agonisten oder antagonisten für an der signaltransduktion beteiligte proteine agieren - Google Patents

Verfahren zur identifizierung von verbindungen, die als agonisten oder antagonisten für an der signaltransduktion beteiligte proteine agieren

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DE69132564T2
DE69132564T2 DE69132564T DE69132564T DE69132564T2 DE 69132564 T2 DE69132564 T2 DE 69132564T2 DE 69132564 T DE69132564 T DE 69132564T DE 69132564 T DE69132564 T DE 69132564T DE 69132564 T2 DE69132564 T2 DE 69132564T2
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exogenous
protein
receptor
cells
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Bunsen Rush Laboratories Inc
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Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Chemikalien, die als Agonisten oder Antagonisten für Proteine wirken, die an Signaltransduktionswegen beteiligt sind, welche heterotrimere Guaninnukleotid-Bindungsproteine (G-Proteine) und/ oder zweite Messenger, z. B. zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP), verwenden, und ein Verfahren zur Identifizierung von Nukleinsäureklonen, die für G-Protein kodieren, das an Zelloberflächenrezeptoren (GPC-Rezeptoren) gekoppelt ist, die über Signaltransduktionswege wirken, die G-Proteine und/oder zweite Messenger, z. B. cAMP, verwenden.
    • Hintergrundinformation
  • Es ist allgemein anerkannt, daß viele medizinisch wichtige biologische Prozesse durch Proteine vermittelt werden, die an Signaltransduktionswegen beteiligt sind, die G-Proteine und/oder zweite Messenger, z. B. cAMP, beinhalten (Lefkowitz (1991) Nature, 351: 353-354). Hierein werden diese Proteine als Proteine bezeichnet, die an Wegen mit G-Proteinen oder PPG-Proteinen beteiligt sind. Einige Beispiele für diese Proteine umfassen die GPC-Rezeptoren, wie jene für adrenerge Agenzien und Dopamin (Kobilka, B. K., Dixon, R. A., Frielle, T., et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 46-50; Kobilka, B. K., Matsui, H., Kobilka, T. S., et al. (1987) Science 238 : 650-656; Bunzow, J. R., Van Tol, H. H. M., Grandy, D. K., Albert, P., et al. (1988) Nature 336 : 783-787), G-Proteine selbst, Effektorproteine, z. B. Phospholipase C, Adenylcyclase und Phosphodiesterase, und Actuator-Proteine, z. B. Proteinkinase A und Proteinkinase C (Simon, M. L; Strathmann, M. P.; Gautam, N., (1991) Science 252: 802-8).
  • Biotests auf Chemikalien, die einige wenige GPC-Rezeptoren aktivieren, die in Pigmentzellen endogen sind, sind in Negishi et al. (1988) General and Comparative Endocrinology, 70: 127-132; Messenger und Warner (1977) Br. J. Pharmacology 61: 607-614; Mori und Ler, (1960) Endocrinoloay 67 : 443-450; Moller und Lerner (1966) Acta Endocrinologica, Sl: 149-160; Carter und Shuster (1978) J. Inv. Dermatoloay, 71: 229-232; Lerner et al. (1988) P. N. A. S. USA 85 : 261-264; und C. H. Elwing et al. (1990) Biosensors & Bioelectronics, 5: 449-459, beschrieben.
  • In allen Methoden, die in den oben aufgelisteten Publikationen beschrieben sind, gibt es die folgenden sechs wesentlichen Unterschiede zwischen diesen Methoden und den Methoden der Antragsteller:
  • (1) Die Verfahren der Anmelder beruhen auf Pigmentzellen, die in kontinuierlicher, langfristiger Kultur gezüchtet werden können, während in keinem der Biotests, die in den vorangehenden Publikationen beschrieben sind, Pigmentzellen verwendet werden, die sich in Kultur fortgesetzt teilen. Der Vorteil der Methode der Antragsteller besteht darin, daß sie die direkte Erzeugung einer unbegrenzten Anzahl von Zellen ermöglicht, die für Tests verwendet werden. Ohne diese Möglichkeit sind Durchmusterungen von Drogen in großem Maßstab nicht möglich.
  • (2) Nur die Verfahren der Anmelder bieten eine kontinuierliche Quelle von Pigmentzellen, die aus bestehenden erzeugt werden, ohne frische Zellen von Tieren sammeln zu müssen.
  • (3) Nur bei den Verfahren der Anmelder werden Pigmentzellen verwendet, die in Gewebekulturgefäßen mit hoher Dichte gezüchtet werden können. Dies ist wichtig, um große Anzahlen von Drogen durchmustern zu können, und ist wichtig, um die Möglichkeit zu schaffen, verläßliche Ergebnisse unter Verwendung von Standard-Mikrotiterplattenlesevorrichtungen zu erhalten.
  • (4) Die Verfahren der Anmelder können zur Durchmusterung auf Drogen verwendet werden, die den endogenen Serotonin-Rezeptor auf Pigmentzellen beeinflussen, der eine Pigmentdispersion verursacht. Im Gegensatz dazu wird in den obengenannten Publikationen behauptet, daß Serotonin eine Pigment-Aggregation verursacht, z. B. Messenger und Warner (1977) Br. J. Pharmacoloay 61: 607-614.
  • (5) Bei den Verfahren der Anmelder wird die rekombinante DNA-Technologie angewandt, so daß die Pigmentzellen als Basis für Drogentests auf Rezeptoren und andere Proteine dienen können, die nicht von Natur aus durch Pigmentzellen exprimiert werden. Die in den vorangehenden Publikationen beschriebenen Verfahren sind jedoch auf Rezeptoren beschränkt, die für Pigmentzellen endogen sind.
  • (6) Im Gegensatz zu den zuvor beschriebenen Publikationen können nur die Verfahren der Anmelder zum Klonen von GPC-Rezeptoren verwendet werden, da in den Verfahren der Anmelder kontinuierliche Kulturen von Pigmentzellen und die rekombinante DNA-Technologie verwendet wird.
  • Gegenwärtig gibt es eine wesentliche Einschränkung bei der Auffindung neuer und besserer Drogen für GPC-Rezeptoren, nämlich, es gibt keine anfängliche Durchmusterung für die Testung der Fähigkeiten von Chemikalien, GPC-Rezeptoren zu beeinflussen, die einfach, rasch und allgemein ist. Als Beispiel wären Tests zur Auswertung von GPC-Rezeptoren zu betrachten, die über Gs oder Gi arbeiten, um interzelluläres cAMP zu erhöhen oder zu senken. Ein Radioimmungssay (RIA) für eine cAMP-Ansammlung ist sowohl teuer als auch langsam, und ein einziger Techniker stünde unter Druck, wenn er mehr als 20 Chemikalien an einem einzigen Tag dreifach testen sollte (Steiner et al. (1972) J. Biol. Chem. 247: 1106-1113). Der gegenwärtige Adenylatcyclase-Activierungstest ist währenddessen schneller als der RIA, und eine einzige Person kann bis zu 150 Proben an einem Tag verarbeiten (Salomon et al. (1974) Analytical Biochemistry 58 : 541-548). Der gegenwärtige Adenylatcyclase-Aktivierungstest erfordert jedoch mehrere Stufen und ist daher aufwendig. Ebenso beinhalten beide Verfahren eine beträchtliche Verwendung von radioaktivem Material, zum Beispiel entweder ³²P oder ¹²&sup5;I.
  • Weiteren Stand der Technik in diesem Bereich umfaßt Daniolos et al., Pigment Cell Res. (1990) 3: 38-43; Sharma et al., PNAS (1975) 72(2): 590-594; Julius et al., Science (1988) 241: 558-564; Kobilka et al., J. Biol. Chem (1987) 262(32): 15796-15802; Bouvier et al., Mol. Pharmacol. (1988) 33 : 133-139; Ide, Dev. Biol. (1974) 41: 380-382; Bagnara et al., Bioloaical Molecular Aspects of Pigmentation (1985) 219-227; Lynch et al., J. Biol. Chem. (1986) 261(9): 4212-4216; Rozdzai et al., Cell (1986) 47: 1061-1070; und Schramm et al., Science (1984) 225 : 1350-1356.
    • Definitionen
  • Eine "Chemikalie" umfaßt laut Definition jede Droge, jede Verbindung oder jedes Molekül.
  • Ein "G-Protein gekoppelter Zelloberflächenrezeptor" (GPC-Rezeptor) ist als jedes Zelloberflächentransmembranprotein definiert, das, wenn es durch eine Chemikalie aktiviert wird, seinerseits ein heterotrimeres Guaninnukleotid-Bindungsprotein (G-Protein) aktiviert. Ein "Protein, das an einem Signaltransduktionsweg beteiligt ist, der ein G-Protein und/oder einen zweiten Messenger enthält (PPG-Protein)" ist als jedes Protein definiert, das an dem Weg beteiligt ist, einschließlich GPC-Rezeptoren, G-Proteine, Effektorproteine und Actuator-Proteine.
  • Ein "Effektorprotein" ist als jedes Protein definiert, das durch eine α-Untereinheit eines G-Proteins aktiviert oder inaktiviert wird. Einige Beispiele für Effektorproteine umfassen Adenylcyclase, Phospholipase C und Phospholipase A2. Phosphodiesterase wird auch als Effektorprotein angesehen.
  • Ein "zweiter Messenger" ist als Zwischenverbindung definiert, deren Konzentration, entweder interzellulär oder innerhalb der umgebenden Zellmembran, infolge der Aktivität eines Effektorproteins erhöht oder vermindert ist. Einige Beispiele für zweite Messenger umfassen cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP), Phosphotidylinositole (PI), wie Inositoltriphosphat (IP3), Diacylglycerol (DAG), Kalzium (Ca&spplus;&spplus;) und Arachidonsäurederivate. Ein "Actuator-Protein" ist als ein Protein definiert, dessen Aktivierungszustand infolge der Bindung eines zweiten Messengers modifiziert ist. Einige Beispiele für Effektorproteine umfassen Proteinkinase A und Proteinkinase C.
  • Ein schematisches Beispiel, das eine Zusammenfassung der obengenannten Definitionen anhand eines Weges zeigt, der G-Proteine und den zweiten Messenger cAMP verwendet, ist in Fig. 1 dargestellt.
  • "Pigmentzellen" sind alle pigmenthaltigen Zellen, welche die folgenden Bedingungen erfüllen: (1) Sie sind von einem Tier abgeleitet, dessen Pigmentzellen imstande sind, ihr Pigment infolge eines bestimmten Stimulus zu aggregieren oder zu dispergieren, z. B. durch den Kontakt mit melanozytenstimulierendem Hormon, Melatonin, Licht usw.. (2) Sie können in vitro unendlich vermehrt werden, so daß unbegrenzte Zellmengen erhalten werden können. (3) Pigmentzellen ("Testzellen") zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung enthalten die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele von Chromatophoren: Melanophoren oder Melanozyten, Xanthophoren, Erythrophoren, Leukophoren und Iridophoren. Die Pigmentzellen stammen von Tieren, die auf dem Entwicklungsbaum weiter unten sind als Menschen und Vögel. Nicht einschränkende Beispiele für "niedere Tiere", von welchen Pigmentzellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung entnommen werden können, umfassen die folgenden: Reptilien, z. B. Anolis sp; Amphibien, z. B. Xenovus laevis; Fische, z. B. Zacco temmincki; Crustaciacaeen, z. B. Uca pugilator; Echinodermatocaeen, z. B. Diadema antillarum und Cinidarien, z. B. Nanomsa cara. Besonders bevorzugte Pigmentzellen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind kultivierte Melanophoren von Xenopus laevis (Pigment Cell 1985), Hrg. Bagnara et al., University of Tokyo Press, S. 219-227) und Lerner et al. (1988) P. N. A. S. USA, 85: 261-264.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung rascher und empfindlicher Biotests zur Bewertung neuer Agonisten und Antagonisten für PPG-Proteine, und insbesondere für GPC-Rezeptoren.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung einer Strategie zum Klonen von DNAs, die für GPC-Rezeptoren kodieren.
  • Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von Testsätzen zur Durchführung der Biotestverfahren zur Bewertung neuer Agonisten und Antagonisten für PPG-Proteine, und insbesondere für GPC-Rezeptoren.
  • Diese Aufgaben und andere Aufgaben, Zielsetzungen und Vorteile werden durch die vorliegende Erfindung erfüllt und erreicht.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Identifizierung einer Chemikalie bereitgestellt, die ein Agonist oder Antagonist für ein PPG-Protein ist, wobei das Verfahren umfaßt:
  • (a) das In-Kontakt-Bringen einer Pigmenttestzelle eines niederen Tieres, die zum Exprimieren eines exogenen Gens imstande ist, das für ein PPG-Protein kodiert, mit der Chemikalie, die das PPG-Protein entweder aktiviert oder blockiert, so daß entweder eine Pigmentdispersion oder -aggregation innerhalb der Zelle erhalten wird; und
  • (b) das Bestimmen, ob die Chemikalie ein Agonist oder Antagonist ist, durch jede Veränderung in der Position des Pigments in der Zelle.
  • Verschiedene bevorzugte Merkmale dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 9 beschrieben.
  • Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Klonen eines GPC-Rezeptors bereit, wobei das Verfahren das Einführen, zweckdienlicherweise durch Elektroporation, eines exogenen Nukleinsäureklons, der für den Rezeptor kodiert, wobei der Klon vorzugsweise von einer cDNA Bank erhalten wird, die in einem Plasmidvektor erzeugt wird, in eine Pigmentzelle, die von einem niederen Tier, wie einem Frosch, abgeleitet ist, und die zur kontinuierlichen Proliferation in vitro imstande ist.
  • Die vorliegende Erfindung enthält auch in ihrem Umfang eine Pigmentzelle eines niederen Tieres, die zum Exprimieren eines exogenen Gens imstande ist, das für PPG-Protein kodiert und zum Dispergieren oder Aggregieren des Pigments innerhalb der Zelle bei Bereitstellung eines Stimulus imstande ist. Bevorzugte derartige Zellen sind in den Ansprüchen 12 und 13 beschrieben.
  • Zusätzlich zu Verfahren und Zellen stellt die vorliegende Erfindung einen Testsatz zum Bestimmen, ob eine Chemikalie als Agonist oder Antagonist für ein exogenes PPG-Protein wirkt, bereit, wobei der Testsatz in einem oder mehreren Behältern umfaßt:
  • (a) eine oder mehrere Pigmenttestzellen von einem niederen Tier, die einen exogenen Klon exprimieren, der für das exogene PPG-Protein kodiert;
  • (b) ein (z. B. erstes) Stimulans, das entweder eine Pigmentaggregation durch Aktivierung des exogenen PPG-Proteins herbeiführen kann, wenn seine Aktivierung eine Pigmentdispersion herbeiführt, oder eine Pigmentdispersion durch Aktivierung des exogenen PPG-Proteins herbeiführen kann, wenn seine Aktivierung eine Pigmentaggregation herbeiführt;
  • (c) und für Antagonisten-Testsätze, ein zweites Stimulans, das entweder eine Pigmentdispersion durch Aktivierung des exogenen PPG-Proteins herbeiführen kann, wenn seine Aktivierung eine Pigmentdispersion herbeiführt, oder eine Pigmentaggregation durch Aktivierung des exogenen PPG-Proteins herbeiführen kann, wenn seine Aktivierung eine Pigmentaggregation herbeiführt.
  • Vorzugsweise ist das PPG-Protein, auf das in Verbindung mit den Verfahren, Zellen und dem Testsatz der vorliegenden Erfindung bezug genommen wird, ein GPC-Rezeptor.
  • Ein Verfahren zur Identifizierung einer Chemikalie, z. B. einer Droge, die als Agonist für einen exogenen GPC-Rezeptor oder ein exogenes PPG-Protein wirkt, kann das Einführen eines Stimulus, z. B. einer Chemikalie oder Licht, in Testzellen einer Pigmentzellinie, die zur Dispersion oder Aggregation ihres Pigments als Reaktion auf einen bestimmten Stimulus und zum Exprimieren eines exogenen Klons, der für den GPC-Rezeptor oder PPG-Protein kodiert, imstande sind, umfassen, welcher Stimulus einen anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung herbeiführt, wobei das Pigment innerhalb der Testzellen aggregiert ist, wenn die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins eine Pigmentdispersion herbeiführt, oder das Einführen eines Stimulans, z. B. einer Chemikalie oder Licht, umfassen, welcher einen anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung herbeiführt, wobei das Pigment innerhalb der Testzellen dispergiert ist, wenn die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt; sowie das In-Kontakt-Bringen der Testzellen, die sich in einem anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung befinden, mit der Chemikalie; und das Bestimmen, ob die Pigmentanordnung in den Testzellen, die mit der Chemikalie behandelt sind, sich von dem anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung unterscheidet. Es kann auch eine Kontrolle durchgeführt werden. Bei der Kontrolle wird dieselbe Prozedur wie zuvor beschrieben verwendet, mit der Ausnahme, daß Pigmentzellen verwendet werden, die den exogenen GPC-Rezeptor oder das PPG-Protein nicht exprimieren. Wenn eine Änderung in der Pigmentanordnung in den Testzellen beobachtet wird, die den exogenen GPC-Rezeptor oder das PPG-Protein exprimieren, aber keine Änderung in der Pigmentanordnung in den Kontrollzellen beobachtet wird, die den exogenen GPC-Rezeptor oder das PPG-Protein nicht exprimieren, ist die Chemikalie ein Agonist für den exogenen GPC- Rezeptor oder das PPG-Protein.
  • Ein Verfahren zur Identifizierung einer Chemikalie, die als Antagonist für einen exogenen GPC-Rezeptor oder ein exogenes PPG-Protein wirkt, kann das Einführen eines ersten Stimulans, z. B. einer Chemikalie oder Licht, in Testzellen einer Pigmentzellinie, die zur Dispersion oder Aggregation ihres Pigments als Reaktion auf einen bestimmten Stimulus und zum Exprimieren eines exogenen Klons, der für den GPC-Rezeptor oder PPG-Protein kodiert, imstande sind, umfassen, welches Stimulans einen anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung herbeiführt, wobei das Pigment innerhalb der Testzellen aggregiert ist, wenn die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins eine Pigmentdispersion herbeiführt, oder das Einführen eines ersten Stimulans, z. B. einer Chemikalie oder Licht, umfassen, das einen anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung herbeiführt, wobei das Pigment innerhalb der Testzellen dispergiert ist, wenn die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt; sowie das In-Kontakt- Bringen der Testzellen, die sich in einem anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung befinden, mit der zu identifizierenden Chemikalie; das Beobachten der Zellen zur Bestimmung, daß ihr Zustand der Pigmentanordnung unverändert bleibt; das Hinzufügen eines zweiten Stimulans, das eine Pigmentdispersion durch Aktivieren des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins herbeiführt, zu den Testzellen, die mit der zu identifizierenden Chemikalie in Kontakt gebracht wurden, wenn die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG- Proteins eine Pigmentdispersion herbeiführt, oder das Hinzufügen eines zweiten Stimulans, das eine Pigmentaggregation durch Aktivieren des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins herbeiführt, wenn die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt; und das Bestimmen, ob sich die Pigmentanordnung in den Testzellen, welchen das zweite Stimulans zugefügt wurde, von dem anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung unterscheidet. Es kann auch eine Kontrolle durchgeführt werden. Ein Beispiel einer Kontrolle ist das Einführen in die Testzellen anstelle des zweiten Stimulans, das den exogenen GPC-Rezeptor oder das PPG-Protein aktiviert, eines zweiten Stimulans, das einen endogenen GPC-Rezeptor oder ein endogenes PPG-Protein aktiviert, das dieselbe Wirkung auf die Pigmentanordnung hat, welche die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins hätte. Wenn keine Änderung in der Pigmentanordnung in den Testzellen beobachtet wird, während die Kontrollzellen eine Änderung in der Pigmentanordnung erfahren, ist die zu identifizierende Chemikalie ein Antagonist für den exogenen GPC-Rezeptor oder das exogene PPG-Protein.
  • Ein Verfahren zur Identifizierung einer Chemikalie, die als Agonist für einen endogenen GPC-Rezeptor wirkt, z. B. einer für Serotonin, der für Melanophoren endogen ist, umfaßt das Einführen eines Stimulans, z. B. Melatonin; in Testzellen einer Pigmentzellinie, die zur Dispersion oder Aggregation ihres Pigments als Reaktion auf einen bestimmten Stimulus und zum Exprimieren eines endogenen Serotonin-Rezeptors imstande sind, das In-Kontakt- Bringen der Testzellen, die in einen anfänglichen Zustand der Pigmentaggregation gebracht wurden, mit der Chemikalie; und das Bestimmen, ob das Pigment in den Testzellen, die mit der Chemikalie behandelt sind, dispergiert ist.
  • Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung einer Chemikalie, die als Antagonist für einen endogenen GPC-Rezeptor wirkt, z. B. einer für Serotonin, der für Melanophoren endogen ist, umfaßt das Einführen eines ersten Stimulans, z. B. Melatonin, das einen anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung herbeiführt, in Testzellen einer Pigmentzellinie, die zur Dispersion oder Aggregation ihres Pigments als Reaktion auf einen bestimmten Stimulus und zum Exprimieren eines endogenen Serotonin-Rezeptors, imstande sind, wobei das Pigment innerhalb der Testzellen aggregiert ist; das In-Kontakt-Bringen der Testzellen, die sich in einem anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung befinden, mit der zu identifizierenden Chemikalie; das Beobachten der Zellen zur Bestimmung, daß ihr Zustand der Pigmentanordnung unverändert bleibt; das Hinzufügen zu den Testzellen, die mit der zu identifizierenden Chemikalie in Kontakt gebracht wurden, eines zweiten Stimulans, das eine Pigmentdispersion durch Aktivieren des endogenen Serotonin-Rezeptors herbeiführt; und das Bestimmen, ob das Pigment in den Testzellen, welchen das zweite Stimulans zugefügt wurde, dispergiert ist. Es kann auch eine Kontrolle durchgeführt werden. Ein Beispiel einer Kontrolle ist das Einführen in die Testzellen anstelle des zweiten Stimulans, das den endogenen Serotonin- Rezeptor aktiviert, eines zweiten Stimulans, das einen anderen endogenen GPC-Rezeptor aktiviert, z. B. den MSH-Rezeptor, der wie der Serotonin-Rezeptor eine Pigmentdispersion her- beiführt, wenn er aktiviert ist. Wenn keine Pigmentdispersion in den Testzellen beobachtet wird, während die Kontrollzellen eine Pigmentdispersion erfahren, ist die zu identifizierende Chemikalie wahrscheinlich ein Antagonist für den endogenen Serotonin-Rezeptor.
  • Ein Verfahren zur Identifizierung einer Chemikalie, die als. Agonist für ein PPG-Protein wirkt, das für Melanophoren endogen ist, z. B. endogene Proteinkinase A, Proteinkinase C usw., umfaßt das Einführen eines Stimulans, z. B. einer Chemikalie oder Licht, das einen anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung herbeiführt, in Testzellen einer Pigmentzellinie, die zur Dispersion oder Aggregation ihres Pigments als Reaktion auf einen bestimmten Stimulus und zum Exprimieren eines endogenen PPG-Proteins imstande sind, wobei das Pigment innerhalb der Testzellen aggregiert ist, wenn die Aktivierung des PPG-Proteins eine Pigmentdispersion herbeiführt, oder das Einführen eines Stimulans, z. B. einer Chemikalie oder Licht, umfassen, das einen anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung herbeiführt, wobei das Pigment innerhalb der Testzellen dispergiert ist, wenn die Aktivierung des PPG- Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt; sowie das In-Kontakt-Bringen der Testzellen, die sich in einem anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung befinden, mit der Chemikalie; und das Bestimmen, ob das Pigment in den Testzellen, die mit der Chemikalie behandelt sind, sich von dem anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung unterscheidet.
  • Ein weiteres Verfahren zur Identifizierung einer Chemikalie, die als Antagonist für ein PPG-Protein wirkt, das für Melanophoren endogen ist, z. B. endogene Proteinkinase A, Proteinkinase C, Phosphodiesterase usw., umfaßt das Einführen eines ersten Stimulans, z. B. einer Chemikalie oder Licht, das einen anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung herbeiführt, in Testzellen einer Pigmentzellinie, die zur Dispersion oder Aggregation ihres Pigments als Reaktion auf einen bestimmten Stimulus und zum Exprimieren eines endogenen PPG-Proteins imstande sind, wobei das Pigment innerhalb der Testzellen aggregiert ist, wenn die Aktivierung des PPG-Proteins eine Pigmentdispersion herbeiführt, oder das Einführen eines ersten Stimulans, z. B. einer Chemikalie oder Licht, umfassen, das einen anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung herbeiführt, wobei das Pigment innerhalb der Testzellen dispergiert ist, wenn die Aktivierung des endogenen PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt; sowie das In-Kontakt-Bringen der Testzellen, die sich in einem anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung befinden, mit der zu identifizierenden Chemikalie; das Beobachten der Zellen zur Bestimmung, daß ihr Zustand der Pigmentanordnung unverändert bleibt; das Hinzufügen eines zweiten Stimulans, das eine Pigmentdispersion durch Aktivieren des endogenen PPG-Proteins herbeiführt, zu den Testzellen, die mit der zu identifizierenden Chemikalie in Kontakt gebracht wurden, wenn die Aktivierung des endogenen PPG-Proteins eine Pigmentdispersion herbeiführt, oder das Hinzufügen eines zweiten Stimulans, das eine Pigmentaggregation durch Aktivieren des endogenen PPG-Proteins herbeiführt, wenn die Aktivierung des endogenen PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt; und das Bestimmen, ob sich die Pigmentanordnung in den Testzellen, welchen das zweite Stimulans zugefügt wurde, von dem anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung unterscheidet.
  • Ein Verfahren zum Klonen von GPC-Rezeptoren umfaßt das Einführen exogener Nukleinsäureklone, z. B. einer cDNA-Bank, die in einem Plasmidvektor erzeugt wurde, in Pigmentzellen, die von einem niederen Tier, wie Fröschen, abgeleitet sind und zur kontinuierlichen Proliferation in vitro imstande sind, durch jede annehmbare Prozedur, z. B. Elektroporation. Das Verfahren umfaßt dann das Einführen eines Stimulans, z. B. einer Chemikalie oder Licht in die Zellen, das durch die Aktivierung eines endogenen GPC-Rezeptors einen anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung innerhalb der Zellen herbeiführt; das In- Kontakt-Bringen der Testzellen, die sich in einem anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung befinden, mit einer Chemikalie, die den exogenen Rezeptor aktiviert; und das Identifizieren von Zellen, die mit der Chemikalie behandelt wurden, deren Pigmentanordnung sich von dem anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung geändert hat, wobei eine Änderung in der Pigmentanordnung Zellen anzeigt, die den exogenen Klon exprimieren, der für den Rezeptor kodiert.
  • Ein Testsatz zur Bestimmung, ob eine Chemikalie, z. B. eine Droge, als Agonist für einen exogenen GPC-Rezeptor oder ein exogenes PPG-Protein wirkt, umfaßt in einem oder mehreren Behältern: Pigmenttestzellen von einem niederen Tier, die einen exogenen Klon exprimieren, der für den GPC-Rezeptor oder das PPG-Protein kodiert; und ein Stimulans, z. B. Melatonin, das eine Pigmentaggregation durch Aktivierung eines endogenen Rezeptors herbeiführt, wenn die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins eine Pigmentdispersion herbeiführt, und/oder eines Stimulans, z. B. Licht oder MSH, das eine Pigmentdispersion durch Aktivierung eines endogenen Rezeptors herbeiführt, wenn die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt.
  • Ein Testsatz zum Bestimmen, ob eine Chemikalie als Antagonist für einen exogenen GPC-Rezeptor oder ein exogenes PPG-Protein wirkt, umfaßt in einem oder mehreren Behältern: Pigmenttestzellen von einem niederen Tier, die einen exogenen Klon exprimieren, der für den GPC-Rezeptor oder das PPG-Protein kodiert; ein erstes Stimulans, z. B. Melatonin, das eine Pigmentaggregation durch Aktivierung eines endogenen Rezeptors herbeiführt, wenn die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins eine Pigmentdispersion herbeiführt, und/oder eines ersten Stimulans, z. B. Licht, das eine Pigmentdispersion durch Aktivierung eines endogenen Rezeptors herbeiführt, wenn die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt; und ein zweites Stimulans, das eine Pigmentdispersion durch Aktivierung des exogenen Rezeptors herbeiführt, wenn die Aktivierung des exogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins eine Pigmentdispersion herbeiführt, und/oder ein zweites Stimulans, das eine Pigmentaggregation durch Aktivierung des exogenen Rezeptors herbeiführt, wenn die Aktivierung des exogenen GPC- Rezeptors oder PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt.
  • Ein Testsatz zur Bestimmung, ob eine Chemikalie, z. B. eine Droge, als Agonist für einen endogenen GPC-Rezeptor oder ein PPG-Protein wirkt, umfaßt in einem oder mehreren Behältern: Pigmenttestzellen von einem niederen Tier, die den GPC-Rezeptor oder das PPG- Protein exprimieren; und ein Stimulans, z. B. Melatonin, das eine Pigmentaggregation durch Aktivierung eines endogenen GPC-Rezeptors oder PPG-Proteins herbeiführt, wenn die Aktivierung des endogenen Rezeptors, auf den die Chemikalie gerichtet ist, eine Pigmentdispersion herbeiführt, und/oder ein Stimulans, z. B. Licht, das eine Pigmentdispersion durch Aktivierung eines endogenen Rezeptors herbeiführt, wenn die Aktivierung des endogenen GPC-Rezeptors, auf den die Chemikalie gerichtet ist, oder des PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt.
  • Ein Testsatz zum Bestimmen, ob eine Chemikalie als Antagonist für einen endogenen GPC-Rezeptor oder ein endogenes PPG-Protein wirkt, umfaßt in einem oder mehreren Behältern: Pigmenttestzellen von einem niederen Tier, die den Rezeptor exprimieren; ein erstes Stimulans, z. B. Melatonin, das eine Pigmentaggregation durch Aktivierung eines endogenen Rezeptors herbeiführt, wenn die Aktivierung des endogenen GPC-Rezeptors, auf den die Chemikalie gerichtet ist, oder des endogenen PPG-Proteins eine Pigmentdispersion herbeiführt, und/oder ein erstes Stimulans, z. B. Licht, das eine Pigmentdispersion durch Aktivierung eines endogenen Rezeptors herbeiführt, wenn die Aktivierung des endogenen GPC- Rezeptors, auf den die Chemikalie gerichtet ist, oder des endogenen PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt; und ein zweites Stimulans, das eine Pigmentdispersion durch Aktivierung des endogenen GPC-Rezeptors, auf den die Chemikalie gerichtet ist, oder des endogenen PPG-Proteins herbeiführt, wenn die Aktivierung des endogenen Rezeptors, auf den die Chemikalie gerichtet ist, eine Pigmentdispersion herbeiführt, und/oder ein zweites Stimulans, das eine Pigmentaggregation durch Aktivierung des endogenen GPC-Rezeptors, auf den die Chemikalie gerichtet ist, oder des endogenen PPG-Proteins herbeiführt, wenn die Aktivierung des endogenen GPC-Rezeptors, auf den die Chemikalie gerichtet ist, oder des endogenen PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt.
  • Eine "Chemikalie oder Licht" kann als Stimulans verwendet werden, um den anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung herbeizuführen. Nach der Erfahrung der Erfinder, die mit Melanophoren von Xenopus laevis arbeiteten, ist die einfachste Weise zur Herbeiführung eines anfänglichen Zustandes der Pigmentaggregation die Verwendung von Melatonin, während die einfachste Weise zur Herbeiführung eines anfänglichen Zustandes der Pigmentdispersion die Verwendung von Licht ist. Der Grund für diese Wahl ist, daß in beiden Fällen ihre Wirkungen sofort und leicht durch Stimuli überwunden werden, welche entgegengesetzte Wirkungen auf die Pigmentanordnung haben. Diese Situation trifft nicht bei jeder Art von Chromatophor ein. Zum Beispiel reagieren viele Fisch-Melanophore auf Licht durch Aggregation und nicht durch Dispersion ihres Pigments, während sie auf Melatonin überhaupt nicht reagieren. Wenn solche Melanophoren zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung entwickelt werden, müßten andere anfängliche Stimuli, wie zum Beispiel Licht zur Pigmentaggregation und Epinephrin zur Pigmentdispersion, verwendet werden. Unabhängig von den tatsächlichen Chemikalien oder dem Licht und den Chromatophoren, die in den Tests verwendet werden, sind die Konzepte ähnlich.
    • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Fig. 1 ist eine schematische Zeichnung, die ein Beispiel eines Signaltransduktionsweges unter Verwendung von G-Proteinen und zweiten Messengern, in diesem Fall cAMP, zeigt.
  • Fig. 2a ist eine Photographie, die Zellen zeigt, die mit Melatonin behandelt wurden;
  • Fig. 2b ist eine Photographie, welche dieselben Zellen zeigt, die in Fig. 2a dargestellt sind, die mit MSH behandelt wurden.
  • Fig. 3 ist eine Kurve einer relativen Dispersion in % gegenüber der Wellenlänge einer Lichtstimulierung, welche die spektrale Empfindlichkeit von kultivierten Melanophoren von Xenopus laevis zeigt. Durch Melatonin aggregierte Melanophoren wurden 10 Minuten mit Licht verschiedener Wellenlängen unter Verwendung eines PTI Gittermonochromators stimuliert. Die relativen Empfindlichkeiten von Melanophoren gegenüber verschiedenen Wellenlängen wurden eingestellt, um einen Wert von 100% für 460 nm zu erhalten.
  • Fig. 4a und 4b sind Photographien, die einen Vergleich zwischen der Differenz in der Opazität liefern, die konfluente Zellen aufweisen, deren Pigmentgranula aggregiert oder dispergiert sind.
  • Fig. 5 ist eine Kurve der Veränderung im Extinktionsgrad gegenüber der Zeit einer Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen, die konfluente Melanophoren enthält, die zunächst mit Melatonin in einen Zustand der Pigmentaggregation gebracht und dann mit MSH behandelt wurden.
  • Fig. 6a ist eine photographische Darstellung von Dosis-Wirkungs-Kurven für Melanophoren in einer Platte mit 96 Vertiefungen, wobei jede Vertiefung mit einer anderen Kombination von Melatonin und MSH behandelt wurde; Fig. 6b ist eine graphische Darstellung derselben Information wie in Fig. 6a, umgewandelt von einer Mikrotiterplattenlesevorrichtung.
  • Fig. 7 ist eine Photographie, die zeigt, daß Melanophoren rekombinante DNA exprimieren können, in diesem Fall durch Expression von cDNA, die für Beta-Galactosidase kodiert.
  • Fig. 8A, 8B und 8C sind eine Reihe von Photographien, die zeigen, daß Melanophoren einen exogenen humanen Beta 2-adrenergen Rezeptor exprimieren können und daß, wenn der Rezeptor stimuliert wird, die Pigmentzellen ihr Pigment dispergieren.
  • Fig. 9 ist eine schematische Zeichnung, die verschiedene Untereinheiten von G-Proteinen zeigt, von welchen bekannt ist, daß sie in den Pigmentzellen exprimiert werden.
  • Fig. 10 ist ein schematisches Diagramm eines Beta 2-adrenerger Rezeptor-Agonisttests.
  • Fig. 11 ist ein schematisches Diagramm eines Beta 2-adrenerger Rezeptor-Antagonisttests.
  • Fig. 12 ist schematisches Diagramm eines Alpha 2-adrenerger Rezeptor-Agonisttests.
  • Fig. 13 ist schematisches Diagramm eines Alpha 2-adrenerger Rezeptor-Antagonisttests.
  • Fig. 14a und 14b sind schematische Diagramme. Fig. 14a zeigt einen anfänglichen Zustand der Pigmentanordnung in einem hypothetischen Zellenfeld; Fig. 14b zeigt die Pigmentanordnung in demselben Feld nach der Behandlung mit einer Droge, deren Rezeptor geklont wird.
  • Fig. 15 zeigt eine Graphik der Fraktion von Melanophoren, die auf Bombesin reagieren, nach der Transfektion mit verschiedenen Kombinationen von Plasmiden, die für Bombesin-Rezeptoren kodieren, gegenüber Beta-Galactosidase.
    • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG Überblick
  • Die vorliegende Erfindung nützt die Entwicklung spezieller Pigmentzellinien, die in vitro kontinuierlich vermehrt werden können, und die ihr Aussehen dramatisch ändern können als Reaktion auf die Stimulierung von Proteinen, die an Signaltransduktionswegen beteiligt sind, die G-Proteine und/oder zweite Messenger, z. B. cyclisches Adenosinmonophosphat (cAMP) verwenden.
  • Die Anmelder haben einen genauen und direkten Biotest entworfen, der buchstäblich zur Durchmusterung von tausenden von Chemikalien an einem einzigen Tag verwendet werden kann, um ihre Fähigkeit zu bewerten, GPC-Rezeptoren und andere PPG-Proteine zu aktivieren oder zu blockieren. Beispiele für GPC-Rezeptoren, die untersucht werden können, umfassen Beta 2-adrenerge Rezeptoren, Bombesin-Rezeptoren und Serotonin-Rezeptoren. Beispiele für andere FPG-Proteine, die untersucht werden können, umfassen Adenylcyclase und Proteinkinase C.
  • Das Hauptverdienst der Erfindung ist ihre Fähigkeit, die Rate, mit welcher potentielle Drogen auf ihre Fähigkeit als Agonisten oder Antagonisten für GPC-Rezeptoren bewertet werden können, deutlich gegenüber gegenwärtigen Verfahren zu erhöhen. Im wesentlichen wird ein cDNA-Klon, der für einen GPC-Rezeptor, z. B. einen Beta 2-adrenergen Rezeptor, kodiert, in Pigmentzellen durch eine von mehreren Standardprozeduren, z. B. Elektroporation, eingeführt. Zellen, die entweder vorübergehend oder dauerhaft den Rezeptor exprimieren, bilden die Basis eines Biotests zur Bewertung der Fähigkeit von Chemikalien, entweder Agonisten oder Antagonisten für Beta 2-adrenerge Rezeptoren zu sein, durch Beobachtung, wie die Zugabe von Chemikalien zu den Zellen den Zustand der Pigmentanordnung innerhalb der Zellen verändert. Auf ähnliche Weise können die Zellen auch zur Bewertung von Chemikalien als potentielle Agonisten oder Antagonisten für GPC-Rezeptoren verwendet werden, die bereits auf den Pigmentzellen vorhanden sind. Schließlich können die Zellen auch zur Bewertung von Chemikalien als potentielle Agonisten oder Antagonisten für PPG-Proteine verwendet werden, die bereits auf den Pigmentzellen vorhanden sind.
  • Die Anmelder haben weiters ein Verfahren zum Klonen von cDNAs entwickelt, die für GPC-Rezeptoren kodieren. Zum Beispiel gibt es zwei bekannte Arten von Glucagon- Rezeptoren, von welchen beide GPC-Rezeptoren sind (Wakelam, M. J. O., Murphy, G. J., Hruby, V. J. und Houslay, M. D. (1986) Nature, 323 : 68-71). Einer von ihnen aktiviert einen Signaltransduktionsweg, welcher intrazelluläre Werte von cAMP vermittelt, während der andere IP3-Werte vermittelt. Diese beiden Rezeptoren können durch die neue Methodik geklont werden, da die Stimulierung jedes Weges die Pigmentdispersion herbeiführt. Die vorliegende Erfindung verwendet molekulare biologische Methoden zur Transfektion von pigmenthaltigen Zellen mit einer cDNA-Bank auf Plasmid- oder viraler Basis, die von der mRNA abgeleitet ist, die in einem Gewebe oder einer Zellinie vorhanden ist, die einen Rezeptor von Interesse, in diesem Fall Glucagon, exprimiert. Ein Bilddarstellungssystem, z. B. ein computergesteuertes Videosystem, oder sogar Photographien, kann zur Identifizierung von Pigmentzellen verwendet werden, die ihre Pigmentgranula - Melanosome - als Reaktion auf Glucagon dispergieren. Sobald reaktionsfähige Zellen gefunden sind, können mehrere allgemein bekannte Methoden zum Klonen eines Rezeptors von Interesse verwendet werden.
    • Zellen
  • Es wurden Kulturen von Melanophoren erhalten. Kontinuierliche, langfristige Kulturen von Melanophoren wurden etabliert (Ide (1974), Developmental Biology, 41: 380-384). Kulturen, die von Xenopus laevis abgeleitet wurden, die von den Anmeldern verwendet wurden, wurden etabliert (Daniolos et al. (1990), Pigment Cell Research, 3: 38-43), haben mehr als 100 Zellpopulationsverdopplungen durchlaufen und teilen sich stetig etwa alle 5 Tage weiter. Die Anmelder haben weiters mehrere reine klonale Unterlinien für solche Aspekte, wie ihre Wachstumsraten, den Pigmentationsgrad und die Empfindlichkeit der Pigmentanordnung gegenüber stimulierenden Agenzien, wie Licht und Melatonin, etabliert und charakterisiert.
    • Stimulanzien
  • Agenzien, die GPC-Rezeptoren oder PPG-Proteine beeinflussen, führen dramatische Änderungen in Melanophoren herbei. Basierend auf Experimenten mit intakten Tier-, Haut- und gezüchteten Zellen ist seit vielen Jahren bekannt, daß mehrere Arten von Chromatophoren von verschiedenen Tieren, und insbesondere Melanophoren, auf eine Reihe von Mittel entweder durch Dispergieren oder Aggregieren ihrer Melanosome ansprechen (Lerner und Case (1959) Investigative Dermatolouv, 32: 211-221; Butman et al. (1979) J. Exp. Zool., 208: 17-34; und Hogben und Slome (1931) Proc. Royal Soc. B., 108: 10-53). Ein Beispiel für eine Chemikalie, die eine Pigmentdispersion herbeiführt, umfaßt das melanozytenstimulierende Hormon (MSH). Melatonin bewirkt andererseits eine Pigmentaggregation. Einige Agenzien, wie Norepinephrin, führen eine Pigmentdispersion in Melanophoren von einer Art von Frosch, wie Xenopus laevis, herbei, aber eine Aggregation bei jenen einer anderen Spezies, wie Rana pipiens. Es zeigt sich, daß Melanophoren von Xenopus laevis Betaadrenerge Rezeptoren haben, ihnen aber wesentliche Anzahlen von Alpha-adrenergen Rezeptoren fehlen, während jene von Rana piniens sowohl Beta- als auch Alpha-Rezeptoren haben. Während Melanophoren von einer Quelle, wie unsere, hinsichtlich der exprimierten Rezeptoren konstant bleiben, können interessanterweise stabile genetische Unterschiede selbst innerhalb einer einzigen Spezies vorhanden sein. Zum Beispiel aggregieren die Melanophoren in einigen Rana pipiens ihre Pigmentgranula, wenn sie Acetylcholin ausgesetzt werden, während jene von anderen Rana pipiens auf die Chemikalie nicht ansprechen (Moller und Lemer (1966) Acta Endocrinologica, 51: 149-160). Es ist nicht bekannt, daß ein Mittel, das eine Erhöhung im intrazellulären cAMP verursacht, eine Pigmentdispersion bewirkt (Rozdzail und Haimo (1986) Cell, 47: 1061-1070; Lynch et al. (1986) J. Biol. Chem., 261: 4212-4216). Die Anmelder haben die Fähigkeit von Xenopus laevis Melanophoren, auf mehrere Chemikalien anzusprechen, getestet und Fig. 2 zeigt die Wirkungen von Melatonin und MSH auf vier Zellen. Die Wirkung der Behandlung der Zellen mit 0,1 nM Melatonin über 30 Minuten ist an der linken Seite von Fig. 2 dargestellt, während die rechte Seite dieselben Zellen zeigt, nachdem sie weitere 30 Minuten (bei fortgesetzter Gegenwart des Melatonins) 100 nM MSH ausgesetzt wurden. Zellen, die weder Melatonin noch MSH ausgesetzt wurden, unterscheiden sich in ihrem Maß an Pigmentaggregation und -dispersion (Daten nicht dargestellt).
  • Während bekannt ist, daß MSH, Melatonin und Drogen, die Beta 1-adrenerge Rezeptoren aktivieren, Melanophoren beeinflussen können, haben die Anmelder auch festgestellt, daß Melanophoren von Xenopus laevis ihr Pigment als Reaktion auf Serotonin dispergieren. Diese Erkenntnis ist signifikant, da in der Literatur die entgegengesetzte Wirkung berichtet wird (Messenger und Warner (1977) Br. J. Pharmacology, 61: 607-614). Andererseits haben die Anmelder auch festgestellt, daß ihre Zellen auf viele der Chemikalien, die Rezeptoren der GPC-Klasse beeinflussen, wie Beta 2-adrenerge, Bombesin- oder Substanz-P-Rezeptor selektive Agonisten, nicht mit einer Veränderung in der Pigmentanordnung reagieren. Einige der Ergebnisse der Antragsteller sind in Tabelle 1 zusammengefaßt.
  • Tabelle 1 ist eine Teilliste von Chemikalien und Licht, die eine Pigmentverschiebung in den Melanophoren der Antragsteller herbeiführen.
    • Tabelle 1
  • Eine lichtinduzierte Melanosomdispersion wird durch einen Signaltransduktionsweg auf G-Protein-Basis vermittelt. Im Falle von Melanophoren von Xenopus laevis verwendet der Weg cAMP als zweiten Messenger. Diese Erkenntnis ist von dem Standpunkt aus faszinierend, daß die Phototransduktion in den Melanophoren durch ein anderes zweites Messenger-System vermittelt wird als das auf cGMP basierende, das im visuellen Vertebraten-System verwendet werden (Stryer, L. (1986) Ann. Rev. Neurosci., 9: 87-119). Der wesentliche Punkt ist hier, daß die Lichtempfindlichkeit der Pigmentzellen dazu verwendet werden kann, die Zellen in sehr einfacher Weise in einen Zustand der Pigmentdispersion zu bringen, und in der Durchmusterung auf Chemikalien nützlich ist, die eine Pigmentaggregation verursachen.
  • Fig. 3 zeigt die spektrale Empfindlichkeit gezüchteter Melanophoren von Xenopus laevis. Melanophoren mit aggregiertem Pigment infolge einer Melatonin-Exposition wurden 10 Minuten mit Licht unterschiedlicher Wellenlänge unter Verwendung eines PTI-Gittermonochromators stimuliert. Die relativen Empfindlichkeiten von Melanophoren gegenüber verschiedenen Wellenlängen wurden eingestellt, um einen Wert von 100% bei 460 nm zu erhalten. Wie in Fig. 3 dargestellt, sind die Zellen, wenn die Zellen einem Bereich von Lichtwellenlängen bei konstanten Stärken ausgesetzt werden, gegenüber einem Licht von 460 nm maximal empfindlich, und gegenüber Licht über 550 nm unempfindlich. Da 550 nm innerhalb des sichtbaren Bereichs liegt, ist die Handhabung der Melanophoren ohne Auslösung einer Photoreaktion nicht schwierig.
    • Quantifizierug der Pigmentanordnung
  • Die Fig. 4a und 4b liefern einen Vergleich zwischen dem Unterschied in der Opazität, die konfluente Zellen aufweisen, deren Pigmentgranula aggregiert oder dispergiert sind. Fig. 4a zeigt eine 100 mm Gewebekulturschale mit koniluenten Melanophoren, die 30 Minuten mit 0,1 nM Melatonin behandelt wurden. Fig. 4b zeigt eine weitere Schale, welche dieselbe Anzahl von Melanophoren enthält, die aber 100 nM MSH über 30 Minuten nach der Behandlung mit Melatonin erhielt.
  • Der Melanophorentest gemäß der vorliegenden Erfindung kann mit einer Standardlese-vorrichtung für eine Platte mit 96 Vertiefungen gelesen werden. Obwohl die Fähigkeit einer Chemikalie, eine Pigmentdispersion oder -aggregation innerhalb von Melanophoren herbeizuführen, einfach mit dem Auge erkannt werden kann, ist für eine rasche Drogendurchmusterung eine Quantifizierung des Ausmaßes der Pigmentdispersion nützlich, z. B. mit einer Standardplatte mit 96 Vertiefungen. Fig. 5 zeigt graphisch die Ergebnisse der Pigmentdispersion innerhalb von Melanophoren als Reaktion auf die chemische Stimulierung innerhalb einer Vertiefung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen. Um diese Kurve zu erhalten, wurde die Vertiefung, die eine konfluente Schicht von Melanophoren enthielt, zunächst 1 Stunde mit 10 nM Melatonin behandelt. Die Absorption von Licht bei 620 nM (einer Wellenlänge, die von dem endogenen Photorezeptor der Zelle nicht erfaßt wurde) wurde dann bestimmt. Danach wurde MSH auf 100 nM zugegeben und die Absorption von 620 nM Licht durch die Vertiefung alle S Minuten über eine Stunde gemessen.
  • Der Melanophorentest gemäß der vorliegenden Erfindung kann zur raschen Bestimmung der Dosiswirkungen auf Chemikalien verwendet werden, die mit GPC-Rezeptoren und anderen PPG-Proteinen in Wechselwirkung stehen. Fig. 6 zeigt diesen Punkt mit dem MSH-Rezeptor, der für die Pigmentzellen endogen ist. In Fig. 6a ist eine Mikrotiterplatte dargestellt, in der jede Vertiefung mit einer anderen Kombination von Melatonin und MSH behandelt wurde. Zunächst wurden 8 verschiedene Melatonindosen reihenweise zu Endkonzentrationen zwischen 0,1 und 320 nM zugegeben. Nach 60 Minuten - die Vertiefungen sind dann durch Volumen gegeben - wurden dann eine von 12 verschiedenen MSH-Dosen im Bereich zwischen 0,5 und 1,024 nM zugegeben. Nach 30 Minuten wurde die Platte mit einer Mikroplattenlesevorrichtung ausgelesen und dann fixiert. Die fixierte Platte ist in der Photographie von Fig. 6a dargestellt, während die Dosis-Wirkungs-Kurven, welche die Reihen von oben nach unten zeigen, wie durch die Mikroplattenlesevorrichtung bestimmt, in Fig. 6b dargestellt sind. Die Plattenlesevorrichtung kann zuverlässig zwischen Vertiefungen unterscheiden, die verschiedene Konzentrationen von Chemikalien erhalten.
    • Expression exogener GPC-Rezeptoren in Melanophoren
  • Der erste Schritt in der Entwicklung einer auf Melanophoren basierenden Methodik zur Untersuchung der Wirkungen von Chemikalien auf GPC-Rezeptoren war die Bestimmung, wie Fremd - DNA in den Zellen zu exprimieren ist. Es wurden mehrere Promotoren und Prozeduren zur DNA-Transfektion auf ihre Fähigkeit getestet, von Frosch-Melanophoren zur Expression fremder cDNAs verwendet zu werden. Die getesteten Promotoren umfaßten welche von CMV (Cytomegalovims), RSV (Rous Sarcoma Virus), Frosch-Hitzschock, SV-40 frühe und Frosch-Beta-Actin, während die getesteten Methoden zur Einführung von DNA in die Zellen, die ausgewertet wurden, Kalziumphosphatausfüllung, DEAE- Dextran, Lipofektion und Elektroporation umfaßten (Hall, C. V., Jacob, P. E., Ringold, G. M. und Lee, F. (1983) J. Mol. Appl. Genet., 2: 101-109; Harland, R. und Misher, L. (1988) Development, 102: 837-852; Gorman, C. M., Merlino, G. T., Willingham, M. C., et al. (1982) Proc. Natl. Acad: Sci., 22: 6777-6781; Spaete, R. R. und Mocarski, E. S. (1985) Journal of Virology, 56: 135-143; Sambrook, J., Fritsch, E. F. und Maniatis, T. (1989) Molecular Clonin.g, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. Ausgabe, 1610-1612; McCutchan, Jil. und Pagano, J. S. (1968) J. Natl. Cancer Inst., 41: 351-357; Warden, D. und Thorne, H. V. (1968) J. Gen. Virol. 3: 371-377; Felgner, P. L., Gadek, T. R., Holm, M., et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci., 84: 7413-7317; Boggs, S. S., Gregg, R. G., Borenstein, N. und Smithies, O. (1986), Exp. Hematol., 14: 988-994). Die beste Kombination erscheint die Verwendung eines CMY Promotors, um die Expression einer cDNA von Interesse zu fördern, gemeinsam mit Elektroporation zu sein. Ein Beispiel für die Verwendung der Elektroporation zur Einführung eines Plasmids, das ein LacZ Gen enthält, welches für Beta-Galactosidase kodiert, hinter einem CMV-Promotor in Pigmentzellen ist in Fig. 7 dargestellt. Die Zellen wurden mit Melatonin behandelt, um die Sichtbarkeit von Beta-Galactosidase über einen X-gal Fleck in ihrem Zytoplasma zu unterstützen. Die Wirksamkeit der Transfektion in diesem besonderen Experiment war 63%. In einem durchschnittlichen Experiment beträgt die Wirksamkeit 37%.
  • Der nächste Schritt in der Entwicklung des Pigmentzellen-cDNA-Expressionssystems zur Verwendung in der Durchmusterung von Drogen bestand darin, zu zeigen, daß ein charakterisierter Sieben-Transmembran-Domäne-Rezeptor, der einen Signaltransduktionsxveg auf G-Protein-Basis aktiviert und für gewöhnlich von Menschen exprimiert wird, in Frosch-Melanophoren gut exprimiert werden konnte. Zur Bewertung dieses wesentlichen Punktes wurde der humane Beta 2-adrenerge Rezeptor gewählt, da die Anmelder wußten, daß die Frosch - Pigmentzellen nicht auf die Beta 2-Rezeptor spezifische Droge Metaproterenol ansprechen (siehe Tabelle 1). Zwei Kriterien mußten erfüllt werden. Erstens mußte der Rezeptor von einer signifikanten Anzahl von Zellen exprimiert werden. Zweitens mußte der Rezeptor, der von transfektierten Zellen exprimiert wird; zur Kopplung an endogene Gs imstande sein.
  • Fig. 8 zeigt einen Beweis, daß die obengenannten Kriterien 1 und 2 erfüllt wurden.
  • In der ersten Tafel sind Pigmentzellen dargestellt, die zwei Tage zuvor in einem Elektroporationsexperiment transfektiert worden waren, wobei 40 ug Plasmid verwendet wurden, das für den humanen Beta 2-Rezeptor kodiert, der hinter einem CMV-Promotor angeordnet ist. Hier wurden die Zellen mit 10 nM Melatonin 60 Minuten behandelt, um Pigment zu aggregieren. Die zweite Tafel zeigt das identische Feld von Zellen als Mehrfachexposition, die auf folgende Weise durchgeführt wurde.
  • Erstens wurden die Zellen rotem Licht ausgesetzt, aber der Film in der Kamera wurde nicht vorgeschoben. Zweitens wurden die Zellen 30 Minuten mit 1 um Metaproterenol behandelt. Drittens wurden die Zellen weißem Licht ausgesetzt.
  • Jede Zelle, die ihr Pigment als Reaktion auf Metaproterenol dispergiert, sollte weißes Licht daran hindern, auf den Film zu treffen, obwohl sie bereits rotes Licht hindurchgelassen hat. Das Ergebnis wäre, daß Zellen, die ihre Pigment als Reaktion auf Metaproterenol dispergieren, rot mit schwarzem Mittelpunkt erscheinen.
  • Währenddessen würde jede Zelle, die das Beta 2-Rezeptorplasmid nicht empfangen hat, ihr Pigment als Reaktion auf Metaproterenol nicht dispergieren und somit nur als kleiner dunkler Fleck erscheinen, da jede Filmfläche, die sowohl mit rotem als auch weißem Licht bestrahlt wird, weiß erscheint. Die letzte Tafel zeigt wieder dieselben Zellen, aber als einfache Exposition nach der Behandlung mit Metaproterenol. In diesem Experiment war der Prozentsatz an Zellen, welche die Fähigkeit erlangten, auf Metaproterenol anzusprechen, dieselbe wie die durchschnittliche Transfektionseffizienz der Anmelder. Dies zeigt, daß ein Rezeptor, der ursprünglich von Menschen abgeleitet wurde, imstande ist, funktionell an einen G-Protein vermittelten Signaltransduktionsweg in Frosch-Pigmentzellen zu koppeln.
  • Die Anmelder haben auch gezeigt, daß andere G-Protein vermittelte Signaltransduktionswege eine Pigmentverschiebung innerhalb von Frosch-Melanophoren steuern können, basierend auf mehreren Kriterien. Erstens haben die Zellen zahlreiche verschiedene G-Proteine, wie in Fig. 9 dargestellt ist. Tatsächlich haben die Pigmentzellen mehrfache G-Proteine von jeder Klasse. Zweitens wurden drei andere exogene GPC-Rezeptoren in Frosch- Melanophoren exprimiert (Daten nicht dargestellt). Dazu zählen Rezeptoren für Serotonin, Bombesin und Substanz P. In jedem Fall führte die Zugabe eines geeigneten Agonisten eine Pigmentdispersion herbei. Die Bedeutung dieser Studien ist, daß die Bombesin- und Substanz-P-Rezeptoren, während sie ihre Wirkungen über einen G-Protein vermittelten Signaltransduktionsweg ausüben, andere als jene verwenden, die vom Beta 2-adrenergen Rezeptor benutzt werden. Drittens führt auch das Kalziumionphophor A23187 (Pressman, B. C. (1976) Ann. Rev. Biochem. 45: 501-530) eine Pigmentdispersion herbei (Daten nicht dargestellt). Viertens führt das Agens TPA, von dem bekannt ist, daß es die Proteinkinase C stimuliert, eine Pigmentdispersion herbei (Daten nicht dargestellt).
  • Es sollte für jeden GPC-Rezeptor, der in Pigmentzellen durch Transfektion exprimiert wird, möglich sein, eine Pigmentverschiebung herbeizuführen. Wie zuvor besprochen, haben die Pigmentzellen viele endogene G-Proteine. Während es kaum der Fall ist, daß alle von ihnen GPC-Rezeptoren an den Pigmentverschiebungsmechanismus in den Zellen koppeln, müssen es viele von ihnen tun. Ebenso können zusätzliche durch Expression exogener hinzugefügt werden, abhängig von der Art von rekombinanter DNA-Technologie, die zum Exprimieren von GPC-Rezeptoren in den Melanophoren verwendet werden. Schließlich ist es möglich, chimäre G-Proteine in vitro zu konstmieren und dann in den Melanophoren zu exprimieren, die ermöglichen, daß GPC-Rezeptoren, die für gewöhnlich an einen Weg auf G-Protein-Basis koppeln, der nicht zu einer Pigmentverschiebung führt, an einen zu koppeln, der dies tut. Die Bedeutung dieser Punkte ist, daß jeder GPC-Rezeptor imstande ist, bei Stimulierung eine Pigmentverschiebung herbeizuführen, wenn die Zellen zur Expression eines G-Proteins veranlaßt werden, das sich an ein Signaltransduktionssystem koppeln kann, welches die Pigmentverschiebung reguliert.
    • Biotests zur Bewertung möglicher Agonisten und Antagonisten für exogene GPC-Rezeptoren
  • Der vorbereitende Schritt der Biotestverfahren der vorliegenden Erfindung ist die Expression exogener cDNA in Melanophoren von Xenopus laevis. Der Deutlichkeit wegen wird der humane Beta 2-adrenerge Rezeptor als Beispiel verxvendet. Die Beschreibungen treffen jedoch gleichermaßen auf jeden GPC-Rezeptor zu, dessen kodierende DNA geklont wurde, wie Thyrotropin-, Lutropin-Choriogonadotropin-, Dopamin- und Histamin-Rezeptoren usw.. Sobald Klone für andere GPC-Rezeptoren zur Verfügung stehen, wie jene für Glucagon, sind die Tests ebenfalls in der Folge beschrieben.
    • Bedeutung für das Drogendesign und den Entdeckungsprozeß
  • Technologien für das Auffinden von Chemikalien, die GPC-Rezeptoren und andere PPG-Proteine beeinflussen, und zum Klonen von GPC-Rezeptoren, sind sowohl für die Medizin als auch für die Biologie wichtig. Die Methoden der vorliegenden Erfindung bieten: (1) ein wirksames Verfahren zur raschen und sorgfältigen Durchmusterung auf neue Drogen, welche GPC-Rezeptoren und andere PPG-Proteine beeinflussen, und (2) ein wirksames Verfahren zum Klonen neuer GPC-Rezeptoren und zur Sondierung, wie die Rezeptoren arbeiten. Da zusätzlich GPC-Rezeptorgene charakterisiert werden und ortsgerichtete Mutagenese zu deren Analyse verwendet wird, wird eine ausführliche Kenntnis über die grundlegenden Arbeitsmechanismen in diesen Rezeptoren erhalten. Eine Grundkenntnis der grundlegenden Arbeitsmechanismen in diesen Rezeptoren ist von großem Nutzen für das Verständnis, wie vielversprechende neue Drogen zu entwickeln sind.
  • Die vorliegende Erfindung kann auch zum Testen auf Drogen, z. B. Narkotika, z. B. Kokain, Heroin, Morphin oder Designeropiate in Nahrungsmitteln oder Körperflüssigkeiten, z. B. Blut oder Urin, verwendet werden.
    • Beispiel 1: Erster Biotest
  • Biotest zur Auswertung potentieller Agonisten für den humanen Beta 2-adrenergen Rezeptor oder einen anderen GPC-Rezeptor, dessen Aktivierung zur Pigmentdispersion führt.
  • Zur Durchmusterung auf neue Drogen, welche die in die Zellen β2-adrenergen Rezeptoren stimulieren, werden rekombinante Melanophoren, die den Rezeptor exprimieren, und nicht-rekombinante, die dies nicht tun, in Sätzen von Gewebekulturvertiefungen angesetzt, wie in Fig. 10 dargestellt ist. Alle Vertiefungen werden mit 0,1-1 nM Melatonin behandelt, um eine intrazelluläre Pigmentaggregation herbeizuführen. Diese Konzentration von Melatonin kann einfach mit kleinen Dosen von Chemikalien, wie zum Beispiel Isoproterenol (das die Melanophoren-endogenen Beta 1-adrenergen Rezeptoren stimuliert) oder MSH, überwunden werden.
  • Wie in der ersten Spalte in Fig. 10 erkennbar ist, wird ein selektiver Beta 2-Rezeptor-Agonist, wie Metaproterenol als positive Kontrolle verwendet, wobei eine Vertiefung, die Beta 2-Rezeptor-tragende Zellen enthält, aufgrund der Pigmentdispersion dunkel wird. Zu testende Chemikalien werden gleichzeitig in andere Sätze von Vertiefungen eingebracht, wie in Spalte 2 und 3 von Fig. 10 dargestellt ist, welche Melanophoren, die Beta 2-Rezeptoren exprimieren, beziehungsweise die nicht-rekombinante Mutterzellinie enthalten. Eine möglicherweise interessante Chemikalie wäre jene, die, wie Metaproterenol, eine Pigmentdispersion in den rekombinanten Zellen herbeiführt, aber keine Auswirkung auf die Standardzellen hat.
  • Wenn eine versprechende Chemikalie identifiziert ist, kann sie auf mindestens zwei Arten näher charakterisiert werden. Erstens kann die Geschwindigkeit, mit der verschiedene Konzentrationen eine Pigmentdispersion herbeiführen, mit der Dosiswirkung einer etablierten Droge, wie Metaproterenol, verglichen werden. Und zweitens, wenn Melanophoren, die andere GPC-Rezeptoren exprimieren, verfügbar sind, kann das Ausmaß der Spezifität gegenüber der Kreuzreaktivität mit diesen Rezeptoren ermittelt werden.
    • Beispiel 2: Zweiter Biotest
  • Biotest zur Auswertung potentieller Antaaonisten für den humanen Beta 2-adreneraen Rezeptor oder einen änderen GPC-Rezeptor, dessen Aktivierung zur Pigmentdispersion führt. Zur Durchmusterung auf neue Drogen, welche Beta 2-adrenerge Rezeptoren antagonisieren, werden Melanophoren, die den Rezeptor exprimieren, in parallelen Sätzen von Gewebekulturvertiefungen angesetzt, wie in Fig. 11 dargestellt ist. Wie bei der Strategie zur Identifizierung von Agonisten für Beta 2-adrenerge Rezeptoren, wird 0,1-1 nM Melatonin in alle Vertiefungen gegeben, um eine intrazelluläre Pigmentaggregation herbeizuführen. Ein Beta-adrenerger Rezeptor-Antagonist, wie Propanolol, wird dann als positive Kontrolle aufgebracht (Spalte 1). Der Beta-Rezeptor-Blocker verhindert, daß, die Zellen ihr Pigment nach der Zugabe des für den Beta 2-adrenergen Rezeptor selektiven, stimulierenden Metaproterenols dispergieren. Neue Chemikalien, die zu testen sind, werden anderen Vertiefungssätzen zugegeben.
  • Eine versprechende Chemikalie ist jene, die, wie Propanolol, eine Pigmentdispersion als Reaktion auf Metaproterenol verhindert, die aber nicht die Pigmentverdunklung verhindert, die durch ein Agens, wie MSH, herbeigeführt wird, das einen anderen GPC-Rezeptor an den Zellen stimuliert, wie in Spalte 2 und 3 erkennbar ist. Die negative Kontrolle wird sowohl zur Sicherstellung verwendet, daß die fragliche Chemikalie die Pigmentdispersion nicht einfach durch Beschädigung der Zellen verhindert, wie auch zur Feststellung, daß die Blockade der durch Metaproterenol herbeigeführten Pigmentdispersion nicht auf einer fundamentaleren Ebene in der cAMP-Kaskade, über den Beta 2-adrenergen Rezeptor hinaus, eintritt. Ein Beispiel für den letztgenannten Fall wäre eine Chemikalie, welche die Adenylatcyclase direkt hemmte. Wenn eine interessante Chemikalie gefunden ist, wird sie hinsichtlich der Rezeptorspezifität und der Potenz näher charakterisiert, wie im Falle der Bewertung neuer Agonisten für den Beta 2-adrenergen Rezeptor- beschrieben ist.
    • Beispiel 3: Dritter Biotest Biotest zur Auswertung potentieller Angonisten für den humanen α2-adrenergen Rezeptor oder einen anderen GPC-Rezeptor, dessen Aktivierung zur Pigmentaugreeation führt (Jakobs (1979), Molecular and Cellular Endocrinology 16: 147-156)
  • Zur Durchmusterung auf neue Drogen, die Alpha 2-adrenerge Rezeptoren stimulieren, ist der Assay nahezu identisch mit jenem, der für Agonisten für Beta 2-adrenerge Rezeptoren beschrieben ist, mit der Ausnahme, daß er mit dunklen Vertiefungen und nicht mit hellen beginnt. Rekombinante Melanophoren, die den Rezeptor exprimieren, und nicht-rekombinante, welchen der Rezeptor fehlt, werden in parallelen Sätzen von Gewebekulturvertiefungen angesetzt, wie in Fig. 12 dargestellt ist. Alle Vertiefungen werden Licht ausgesetzt oder erhalten eine kleine Menge einer Chemikalie, wie MSH, zur Herbeiführung einer intrazellulären Pigmentdispersion. Ein für den Alpha 2-adrenergen Rezeptor selektiver Agonist, wie p-Aminoclonidin, dient als positive Kontrolle.
  • Wie die Wirkung von Melatonin, sollte p-Aminoclonidin die rekombinanten Zellen veranlassen, ihre intrazellulären cAMP-Konzentrationen zu senken und ihre Melanosome zu aggregieren. Zu testende Chemikalien werden in andere Vertiefungssätze eingebracht, von welchen einige rekombinante Melanophoren enthalten, und von welchen einige standardmäßige enthalten, wie durch die Spalte 2 und 3 dargestellt ist.
  • Eine interessante Chemikalie wäre jene, die eine Pigmentaggregation in Alpha 2- adrenerger Rezeptor-positiven Zellen herbeiführte, während sie keine Auswirkung auf die Mutterzellen hat. Eine möglicherweise nützliche Chemikalie kann in bezug auf ihre Rezeptorspezifität und Potenz näher charakterisiert werden, wie in dem Abschnitt zur Bewertung von Beta 2-Rezeptoragonisten beschrieben ist.
    • Beispiel 4: Vierter Biotest Biotest zur Auswertung potentieller Antagonisten für den humanen Alpha 2-adrenergen Rezeptor oder einen anderen GPC-Rezeptor, dessen Aktivierung zur Piamentagaregation führt
  • Der Test auf neue Drogen, die Alpha 2-Rezeptoren antagonisieren, beginnt mit rekombinante, Alpha 2-Rezeptoren exprimierende Melanophoren enthaltende Vertiefungen, die durch Licht oder eine Chemikalie, wie MSH, verdunkelt wurden, wie in Fig. 13 dargestellt ist. Ein Alpha 2-Rezeptor-Antagonist, wie Rauwolscin, dient als positive Kontrolle, da er verhindert, daß der Agonist p-Aminoclonidin eine Pigmentdispersion herbeiführt. Neue Substanzen werden in parallele Vertiefungen eingebracht, und eine möglicherweise interessante Chemikalie ist jene, die, wie Rauwolscin, die durch p-Aminoclonidin aber nicht die durch Melatonin herbeigeführte Pigmentaggregation blockiert. Wie zuvor wird die Selektivität und Potenz versprechender Moleküle näher charakterisiert, wie im Falle der Bewertung von Agonisten für Beta 2-adrenerge Rezeptoren beschrieben ist.
    • Beispiel 5: Fünfter Biotest Biotest zur Auswertung potentieller Angonisten für den endogenen Serotonin-Rezeptor
  • Zur Durchmusterung auf neue Drogen, die den endogenen Serotonin-Rezeptor stimulieren, werden Melanophoren auf Sätzen von Gewebekulturvertiefungen angesetzt. Alle Vertiefungen werden mit 0,1-1 nM Melatonin behandelt, um eine intrazelluläre Pigmentaggregation herbeizuführen. Diese Konzentration von Melatonin wird leicht mit geringen Dosen von Chemikalien, wie Isoproterenol (das die Melanophoren-endogenen Beta 1-adrenergen Rezeptoren stimuliert) oder MSH, überwunden. Serotonin wird als positive Kontrolle verwendet, wobei eine Vertiefung infolge der Pigmentdispersion dunkel wird. Zu testende Chemikalien werden gleichzeitig in andere Sätze von Vertiefungen eingebracht. Eine möglicherweise interessante Chemikalie wäre jene, die, wie Serotonin, eine Pigmentdispersion in den Zellen herbeiführte. Wenn eine versprechende Chemikalie identifiziert wird, kann sie durch die Geschwindigkeit, mit welcher verschiedene Konzentrationen eine Pigmentdispersion herbeiführen, im Vergleich zu der Dosiswirkung für eine etablierte Chemikalie, wie Serotonin, näher charakterisiert werden.
  • Als Spezifitätskontrolle für eine versprechende Verbindung, kann ein Serotonin-Rezeptor-Antagonist vor der Zugabe der versprechenden Verbindung zugefügt werden. Wenn eine Pigmentdispersion nach der Zugabe der versprechenden Verbindung nun verhindert ist, ist es wahrscheinlich, daß die neue Verbindung ein spezifischer Agonist für Serotonin-Rezeptoren ist.
  • Bei allen zuvor beschriebenen Tests sollte klar sein, daß Melanophoren, die exogene GPC-Rezeptoren und andere PPG-Proteine, entweder vorübergehend oder dauerhaft exprimieren, verwendet werden können.
    • Beispiel 6: Isolierung von cDNA-Klonen, die für GPC-Rezeptoren kodieren
  • Frosch-Melanophoren können die Basis eines Verfahrens zum Klonen von GPC-Rezeptoren durch rasche Durchmusterung einer cDNA-Bank bilden. Der Schlüssel zum Klonen eines GPC-Rezeptors ist die Fähigkeit zur raschen Durchmusterung willkürlicher cDNA- Klone aus einer Bank, um jenen zu finden, der für den Rezeptor von Interesse kodiert. Hier wird der murine Bombesin-Rezeptor als Beispiel dafür verwendet, wie mindestens 10 000 Klone in einem Experiment durchmustert werden können, und somit, wie ein neuer GPC-Rezeptor unter Verwendung dieses Systems geklont werden kann.
  • In diesem Beispiel werden unter Verwendung des Bombesin-Rezeptors zwei Sätze von Plasmiden eingesetzt. Der erste enthält cDNA, die für den Bombesin-Rezeptor hinter einem CMV-Promotor kodiert, während der zweite cDNA, die für das Markergen Beta-Galactosidase kodiert, anstelle jener für den Bombesin-Rezeptor enthält. Die Plasmide werden bei verschiedenen relativen Konzentrationen vermischt, so daß in jedem Satz insgesamt 40 ug Plasmid erhalten werden, aber mit verschiedenen Mengen jedes einzelnen. In einem Extremfall ist nur Plasmid, das für den Bombesin-Rezeptor kodiert, vorhanden. Die anderen Mischungen enthalten Plasmide für Bombesin gegenüber Beta-Galactosidase mit 1 : 99, 1 : 999 und 1 : 9999.
  • Die verschiedenen Plasmidmischungen werden in getrennte Sätze von Melanophoren elektroporiert; die dann jeweils in eine separate Gewebekulturplatte ausgestrichen werden. Jede Schale wird einzeln mit 10 nM Melatonin behandelt, 30 Minuten inkubiert und dann entweder photographiert oder unter Verwendung eines computergesteuerten Bilddarstellungssystems, wie jenes von Scientific Imaging Systems in Knoxville, Tennessee, automatisch abgetastet.
  • Danach wird Bombesin zugegeben und nach 30 weiteren Minuten wird eine zweite Photographie als Doppelbelichtung über der ersten gemacht oder ein zweites separates Videobild erhalten.
  • Wenn die photographische Vorgangsweise verwendet wird, sind die Ergebnisse ähnlich den in Fig. 8 dargestellten, wobei Zellen, die auf den Testliganden ansprechen, rot erscheinen. Wenn das Videosystem verwendet wird, wird das erste Bild vom zweiten subtrahiert. Ein schematisches Beispiel für diese Methode ist in Fig. 14 dargestellt.
  • Fig. 14a zeigt ein hypothetisches Feld von Zellen, die mit einer Mischung von Plasmiden transfektiert wurden, die fast vollständig jenes für Beta-Galctosidase enthält, und dann einige Tage später mit Melatonin behandelt wurden. Kleine Punkte stellen Melanophoren mit aggregiertem Pigment dar, während größere das Hintergrundrauschen darstellen, das durch Scheinzellen mit dispergierten Melanosomen erzeugt wird, die aus irgendeinem Grund nicht auf Melatonin angesprochen haben.
  • Fig. 14b zeigt dasselbe Feld von Zellen nach der Zugabe von Bombesin. Das Bild ist ein Negativ des Originals. Die schraffierten Kästen in beiden Fig. 14a und 14b dienen als Hilfe zur Ausrichtung der Bilder. Analoge Marker können auf die Oberfläche einer echten Gewebekulturplatte aufgebracht werden, so daß der Computer Felder anpassen kann. Durch die Ausrichtung der beiden Bilder ist es einfach, den einen zusätzlichen großen Punkt in Fig. 14b mit dem Auge oder Computer zu erkennen. Wenn eine auf Bombesin ansprechende Zelle identifiziert wird, kann durch Auswaschen der zugegebenen Chemikalien, Wiederholen der Behandlungen mit Melatonin und Bombesin, und Bestimmen, daß entweder das photographische oder Videoverfahren dieselbe Zelle wieder findet, eine Bestätigung erhalten werden.
  • Daten aus einer realen Versuchsreihe, die wie zuvor aufgebaut war, sind in Fig. 15 dargestellt. Aus der Graphik können drei Punkte festgestellt werden. Erstens, und von größter Bedeutung, ist es möglich, das Plasmid, das für Bombesin-Rezeptoren kodiert, mindestens 10000-fach zu verdünnen, und noch immer Pigmentzelten zu finden, die auf Bombesin ansprechen. In dem besonderen, hierin besprochenen Experiment, betrug die Frequenz der Bombesin-Rezeptorzellen 1 in 500, wenn das den Bombesin-Rezeptor kodierende Plasmid mit 1 in 10 000 vorhanden war. Zweitens ist das Hintergrundrauschen d. h., der Anteil an Zellen, die ihr Pigment während jedes bestimmten 30-minütigen Experiments spontan dispergieren, 1 in 10 000 oder 20mal unter dem echten Signal. Drittens kann der Grund, daß ein Signal von einem 10000-fach verdünnten Plasmid, über einem Hintergrundrauschen von 1 Zelle in 10 000 Zellen, die ihr Pigment in der Zeit, die zur Durchführung eines Experiments notwendig ist, spontan dispergieren, aus der Form der Kurve bei hoher Plasmidverdünnung erkannt werden. Sie zeigt, daß eine Zelle, die Fremd-DNA exprimiert, imstande ist, etwa 100 verschiedene Plasmide und nicht nur 1 zu exprimieren. Dies bedeutet, daß bis zu 10 000 cDNA-Klone in einem Versuchslauf durchrnustert werden können, wenn ein Plasmid, das für einen GPC-Rezeptor kodiert, gesucht wird.
  • Zur Verwendung des Pigmentzellentests zum Klonen von GPC-Rezeptoren sind einige grundlegende Überlegungen relevant. Erstens kann eine cDNA-Bank in fast jedem standardmäßigen eukaryotischen Expressionsplasmid, wie pcDNAl von Invitrogen konstruiert werden. Zweitens kann jedes Gewebes oder jede Zelle zur Bildung der Bank gewählt werden, das/die den GPC-Rezeptor von Interesse exprimiert. Drittens können viel mehr als 10 000 Klone einfach durch Sammeln von Daten von zusätzlichen Zellsätzen durchmustert werden, die mit verschiedenen Sätzen von Klonen von der cDNA-Bank transfektiert wurden. Zur Isolierung eines Klons für einen GPC-Rezeptor können mehrere mögliche Strategien verwendet werden. Ein Beispiel ist ein Fraktionierungsverfahren. Wenn ein positives Signal beobachtet wird, werden die bakteriellen Kolonien, die ursprünglich den Pool von 10 000 Klonen bildeten, in kleinere Pools geteilt, wie in 10 Sätze mit jeweils 1000 Kolonien. Diese werden erweitert, die Plasmide werden isoliert, und jeder Satz wird erneut getestet. Wenn ein Pool ein positives Signal liefert, wird er wieder geteilt, und das Verfahren wird wiederholt, bis ein einziger Klon identifiziert ist. Es ist gut dokumentiert, daß eine Pool- Durchmusterungsstrategie zum Klonen von Rezeptoren verwendet werden kann, die an G- Proteine koppeln (Julius, D., MacDermott, A. B., Axel, R. und Jessell, T. M. (1988); "Molecular Characterizätion of a Funetional cDNA encoding the Serotonin 1c Receptor"; Science 241: 5458-564).

Claims (16)

1. Verfahren zur Identifizierung einer Chemikalie, die ein Agonist oder Antagonist für ein PPG-Protein ist, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Kontaktieren einer Pigmenttestzelle eines niederen Tieres, die zum Exprimieren eines exogenen Gens imstande ist, das für ein PPG-Protein kodiert, mit der Chemikalie, die das PPG-Protein entweder aktiviert oder blockiert, so daß entweder eine Pigmentdispersion oder -aggregation innerhalb der Zelle erhalten wird; und
(b) Bestimmen, ob die Chemikalie ein Agonist oder Antagonist ist, durch jede Veränderung in der Position des Pigments in der Zelle.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein erstes Stimulans vor Schritt (a) aufgebracht wird, um eine Aggregation des Pigments innerhalb der Testzelle zu verursachen, wenn die Aktivierung des exogenen PPG-Proteins zu einer Pigmentdispersion führt, oder eine Dispersion des Pigments innerhalb der Zelle zu verursachen, wenn die Aktivierung des exogenen PPG-Proteins zu einer Pigmentaggregation führt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei in Schritt (b) bestimmt wird, ob eine Chemikalie ein Agonist oder Antagonist ist, indem bestimmt wird, ob sie eine Veränderung der Pigmentdispersion bewirkt, wobei eine Veränderung auf die Gegenwart eines Agonisten hinweist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, welches weiters das Einschließen einer Kontrolle, indem Kontrollzellen verwendet werden, die den exogenen Klon nicht exprimieren, und die imstande sind, ihr Pigment als Reaktion auf einen bestimmten Stimulus, aber nicht das erste Stimulans, zu dispergieren oder zu aggregieren, und wobei keine Änderung in der Pigmentanordnung in den Kontrollzellen bei Kontakt mit dem ersten Stimulans eintritt.
5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei in Schritt (b) bestimmt wird, ob eine Chemikalie ein Antagonist ist oder nicht, indem:
die Zellen nach dem Kontakt mit der Chemikalie beobachtet werden, um festzustellen, daß ihr Zustand der Pigmentanordnung unverändert bleibt, den Testzellen, die mit der Chemikalie in Kontakt gebracht wurden, ein zweites Stimulans hinzugefügt wird, das eine Pigmentdispersion durch Aktivierung des exogenen PPG-Proteins herbeiführen kann, wenn die Aktivierung des exogenen PPG-Proteins eine Pigmentdispersion herbeiführt, oder indem ein zweites Stimulans hinzugefügt wird, das eine Pigmentaggregation durch Aktivierung des exogenen PPG-Proteins herbeiführen kann, wenn die Aktivierung des exogenen PPG-Proteins eine Pigmentaggregation herbeiführt, und bestimmt wird, ob das zweite Stimulans eine Veränderung der Pigmentanordnung bewirkt, wobei eine fehlende Veränderung darauf hinweist, daß die Chemikalie ein Antagonist ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das PPG-Protein ein GPC-Rezeptor ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das PPG-Protein ein Serotonin-Rezeptor ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei das PPG-Protein ein MSH-Rezeptor ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis S. wobei das PPG-Protein Proteinkinase A, Proteinkinase C, Phospholipase C, Phospholipase A2 oder ein G-Protein ist.
10. Verfahren zum Klonen eines GPC-Rezeptors, wobei das Verfahren das Einführen, zweckdienlicherweise durch Elektroporation, eines exogenen Nukleinsäureklons, der für den Rezeptor kodiert, wobei der Klon vorzugsweise von einer cDNA Bank erhalten wird, die in einem Plasmidvektor erzeugt wird, in eine Pigmentzelle, die von einem niederen Tier, wie einem Frosch, abgeleitet ist, und die zur kontinuierlichen Proliferation in vitro imstande ist.
11. Pigmentzelle eines niederen Tieres, die zum Exprimieren eines exogenen Gens imstande ist, das für PPG-Protein kodiert und zum Dispergieren oder Aggregieren des Pigments innerhalb der Zelle bei Bereitstellung eines Stimulus imstande ist.
12. Zelle nach Anspruch 11, die eine Xenopus lczevis Melanophore ist.
13. Zelle nach Anspruch 11 oder 12, wobei das PPG-Protein ein Serotonin- oder MSH-Rezeptor oder Kinase A, Kinase C, Phospholipase C, Phospholipase A2 oder ein G- Protein ist.
14. Testsatz zum Bestimmen, ob eine Chemikalie als Agonist oder Antagonist für ein exogenes PPG-Protein wirkt, wobei der Testsatz in einem oder mehreren Behältern umfaßt:
(a) eine oder mehrere Pigmenttestzellen von einem niederen Tier, die einen exogenen Klon für das exogene PPG-Protein exprimieren;
(b) ein (z. B. erstes) Stimulans, das entweder eine Pigmentaggregation durch Aktivierung des exogenen PPG-Proteins herbeiführen kann, wenn seine Aktivierung eine Pigmentdispersion herbeiführt, oder eine Pigmentdispersion durch Aktivierung des exogenen PPG-Proteins herbeiführen kann, wenn seine Aktivierung eine Pigmentaggregation herbeiführt;
(c) und für Antagonisten-Testsätze, ein zweites Stimulans, das entweder eine Pigmentdispersion durch Aktivierung des exogenen PPG-Proteins herbeiführen kann, wenn seine Aktivierung eine Pigmentdispersion herbeiführt, oder eine Pigmentaggregation durch Aktivierung des exogenen PPG-Proteins herbeiführen kann, wenn seine Aktivierung eine Pigmentaggregation herbeiführt.
15. Testsatz nach Anspruch 14, wobei:
(a) die Pigmenttestzellen Xenopus laevis Melanophoren sind;
(b) das (z. B. erste) Stimulans Melatonin ist, wenn die Aktivierung des exogenen PPG-Proteins zu einer Pigmentdispersion führt, oder melanozytenstimulierendes Hormon oder Isoproterenol ist, wenn die Aktivierung des exogenen PPG-Proteins zu einer Pigmentaggregation führt.
16. Verfahren nach Anspruch 10, Zelle nach einem der Ansprüche 11 bis 13, oder Testsatz nach Anspruch 14 oder Anspruch 15; wobei das PPG-Protein ein GPC-Rezeptor ist.
DE69132564T 1990-07-19 1991-07-17 Verfahren zur identifizierung von verbindungen, die als agonisten oder antagonisten für an der signaltransduktion beteiligte proteine agieren Expired - Lifetime DE69132564T2 (de)

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