DE69212216T2

DE69212216T2 - Festphase-Extraktionsreinigung von DNA

Info

Publication number: DE69212216T2
Application number: DE69212216T
Authority: DE
Inventors: Daniel L Woodard
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1991-05-03
Filing date: 1992-05-01
Publication date: 1997-01-02
Anticipated expiration: 2012-05-02
Also published as: US5405951A; CA2067711C; JPH0751065B2; JPH05268963A; SG49924A1; EP0512767A1; CA2067711A1; EP0512767B1; DE69212216D1

Description

Die Erfindung liegt auf dem Fachgebiet der Molekularbiologie. Insbesondere liegt die Erfindung auf dem Gebiet der Reinigung von Desoxyribonukleinsäure.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die stetigen Fortschritte in Molekularbiologie und verwandten Disziplinen bringen stetigen Bedarf nach Verbesserungen der Ausrüstung, der mit der vollständigen Anerkennung und Weiterentwicklung der fortgeschrittenen Technologie verbunden ist.
Ein breiter Bereich von Technologien bezieht die Verwendung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) in einer Reihe von Formen ein. Zum Beispiel erfordern Fortschritte auf dem Gebiet der Technologie der rekombinanten DNA fortlaufend die Verwendung von DNA in der Form von Sonden, genomischer DNA und Plasmid-DNA.
Die Fortschritte auf dem Gebiet der Diagnostika setzen ebenfalls die Verwendung von DNA auf einer Reihe von Wegen fort. Zum Beispiel werden DNA- Sonden routinemäßig bei dem Nachweis und der Diagnose von menschlichen Pathogenen verwendet. Ähnlich wird DNA bei dem Nachweis von genetischen Störungen verwendet. DNA wird ebenfalls bei dem Nachweis von Nahrungsmittelkontaminanten verwendet. Zudem wird DNA routinemäßig bei der Lokalisierung, Identifizierung und Isolierung von DNA verwendet, die aus einer Vielfalt von Gründen von der Genkartierung bis zur Klonierung und Expression von Rekombinanten von Interesse ist.
In vielen Fällen steht die DNA in extrem kleinen Mengen zur Verfügung und die Verfahren der Isolierung und Reinigung können mühselig und zeitraubend sein. Die oftmals mühseligen und zeitraubenden Verfahren können zu einem Verlust an DNA führen. Bei der Reinigung von DNA aus Testmaterialien, die aus Serum, Urin und Bakterienkulturen erhalten wurden, besteht das zusätzliche Risiko von Kontamination und fälschlich positiven Ergebnissen.
Ein typisches Protokoll zur Isolierung von DNA bringt die differenzierte Auflösung von DNA- und nicht-DNA-Material unter Verwendung von Phenol und Chloroform mit sich. Die Proteine denaturieren und treten in die organische Phase (Phenol) ein oder fallen an der Grenzfläche der organischen und der wäßrigen Phase aus. Die wäßrige Phase enthält die DNA. Mischen dieser wäßrigen Phase mit Alkohol bewirkt Ausfällung der DNA.
Typische Protokolle zur DNA-Reinigung bringen die Verwendung von ätzenden und giftigen Zusammensetzungen mit sich. Das typische Protokoll zur DNA-Reinigung verwendet hohe Konzentrationen an chaotropen Salzen, wie z.B. Natriumiodid und Natriumperchlorat.
Es gibt zahlreiche Protokolle zur Reinigung von DNA. Wie sich durch kürzliche Tätigkeit auf dem Gebiet der DNA-Reinigung zeigte, gibt es dort ein fortgesetztes Streben nach Protokollen zur optimalen DNA-Reinigung. US- P-4923978 offenbart ein Verfahren zur Reinigung von DNA, bei dem eine Lösung von Protein und DNA über einen hydroxylierten Träger geleitet wird und das Protein gebunden wird und die DNA eluiert wird. US-P-4935432 offenbart die Reinigung von DNA durch selektive Bindung der DNA an Anionenaustauscher und nachfolgende Elution. US-P-4946952 offenbart die Isolierung von DNA durch Ausfällung mit wasserlöslichen Ketonen. Ein Verfahren zur DNA-Reinigung, das Chaotrope und dialysierte DNA verwendet, wird in der US-P-4900677 offenbart. PCT WO 89/07603 offenbart ein Verfahren zur Isolierung von Nukleinsäuren aus einer biologischen Probe durch Dissoziierung des in der biologischen Probe vorhandenen Proteins.
Obwohl die vorhandenen Protokolle zur Reinigung von DNA imstande sind, ihr Ziel zu erreichen, ist es wünschenswert. DNA ohne die Verwendung derartiger ätzender und giftiger Verbindungen wie z.B. der am häufigsten verwendeten Chaotrope zu reinigen und außerdem vermehrte Mengen an DNA zu gewinnen.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt in einer Ausführungsform ein Festphasenverfahren zur Reinigung von DNA aus einer Lösung bereit, das die Bindung der DNA an eine hydrophile Oberfläche unter Verwendung eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels. das Waschen der hydrophilen Oberfläche, um das Lösungsmittel, nicht aber die gebundene DNA zu entfernen, das Trocknen der hydrophilen Oberfläche mit der gebundenen DNA und die Eluierung der DNA von der hydrophilen Oberfläche umfaßt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein derartiges Verfahren zur Reinigung von DNA aus einer Lösung bereit, das umfaßt (a) die Zugabe einer hydrophilen Oberfläche zu der Lösung. (b) die Zugabe eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels, (c) die Trennung des Gemisches, das (a) und (b) umfaßt, in eine flüssige und eine nichtflüssige Fraktion. wobei die nichtflüssige Fraktion die an die hydrophile Oberfläche gebundene DNA umfaßt, (d) das Waschen der nichtflüssigen Fraktion von (c). (e) die Abtrennung der flüssigen Fraktion von der nichtflüssigen Fraktion in (d) und (f) das Entfernen der DNA von der hydrophilen Oberfläche der nichtflüssigen Fraktion von (e).
Die Erfindung ist besonders bei der Gewinnung größerer Mengen gereinigter DNA verwendbar. Außerdem kann die DNA durch Bindung an jegliche hydrophile Oberfläche gereinigt werden. Ebenfalls kann die Reinigung bequem bei Raumtemperatur ausgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung kann ausgeführt werden, indem die wasserlöslichen organischen Lösungsmittel für den Bindungspuffer, die in jedem Protokoll zur Reinigung von DNA vorgeschlagen werden, ausgetauscht werden. "Reinigung", wie in diesem Dokument verwendet, bezieht sich auf die Gewinnung von DNA, die im wesentlichen frei von Zelltrümmern und dergleichen ist.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Der Beginn eines jeden Verfahrens zur Reinigung und Isolierung von DNA erfordert die Gewinnung der gewünschten DNA aus ihrem Ausgangsmaterial. Typische Protokolle zur Gewinnung der DNA aus Testmaterialien, wie z.B. Serum, Urin und Bakterienkulturen, sind wohlbekannt und werden routinemäßig ausgeführt. Gleichermaßen ist die Fähigkeit Routine, DNA aus genomischen Bibliotheken und dergleichen zu gewinnen.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Reinigung von DNA gerichtet, die aus einem speziellen Ausgangsmaterial erhalten wurde. Wo die DNA ihren Ursprung hatte, stellt nicht den Schlüssel zur Ausführung der Erfindung dar. Der Schlüssel zu der Erfindung ist die Fähigkeit zur Reinigung von DNA. sobald sie aus ihrem Ausgangsmaterial erhalten worden ist. Typische Verfahren zur Gewinnung von DNA enden mit einer Suspension der DNA in einer Lösung. Die Dokumente schließen diejenigen zur Isolierung der DNA aus biologischen Proben ein, Harding. J.D. . Gebeyehu. G. . Bebee. R. , Simms, D. Ktevan, L. . Nucleic Acids Pesearch, 17 (1989). 6947 und Marko. M.A. Chipperfield. R. and Birnboim H.C., Analytical Biochemistry, 121 (1982), 382. Verfahren zur Isolierung von Plasmid-DNA können bei Lutze, L.H. Winegar. R.A., Nucleic Acids Research 20(1990). 6150. gefunden werden. Die Extraktion von doppelsträngiger DNA aus biologischen Proben kann bei Yamada. 0., Matsumoto. T., Nakashima, M., Hagri, S., Kamahora. T., Ueyama. H., Kishi, Y., Uemura, H., Kurimura, T., Journal of Virological Methods 27 (1990), 203, gefunden werden. Die meisten DNA-Lösungen enthalten die DNA in einem geeigneten Puffer, wie z.B. TE (Tris-EDTA). TEA-Puffer (40 mM Tris-Acetat, 1 mM EDTA) oder ein Lysat.
Sobald die DNA in einer geeigneten Lösung erhalten worden ist, wird typischerweise eine Bindungsmatrix zu der Lösung zugegeben. Allgemein verwendete Bindungsmatrizes sind Siliciumdioxid in der Form von Glas oder Diatomeen.
Nachdem eine Bindungsmatrix zu der Lösung von DNA zugegeben worden ist, wird ein Bindungspuffer zugesetzt. Die vorliegende Erfindung verwendet einen Bindungspuffer, der ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel ist. Der Begriff "wasserlösliches organisches Lösungsmittel" bezieht sich auf ein Lösungsmittel, das organische Eigenschaften hat, was dazu führt, daß die DNA die Lösung verläßt.
Bevorzugte Schritte zur Ausführung der Erfindung mit hydrophilen Oberflächen. wie z.B. von Teilchen oder Kügelchen, umfassen einen Bindungsschritt, einen Waschschritt, einen Trocknungsschritt und einen Eluierungsschritt. Der Bindungsschritt umfaßt im allgemeinen die Zugabe einer hydrophilen Oberfläche zu einer DNA enthaltenden Lösung, die Zugabe einer ein wasserlösliches organisches Lösungsmittel umfassenden Lösung (die Reihenfolge der Zugabe der hydrophilen Oberflächen oder des wasserlöslichen organischen Lösungsmittels ist nicht kritisch). Rühren, Zentrifugieren und Verwerfen der flüssigen Fraktion. Der Bindungsschritt wird gewöhnlich zumindest einmal wiederholt. Der Waschschritt umfaßt im allgemeinen die Zugabe eines Waschpuffers zur Entfernung des Lösungsmittels (zum Beispiel 50% Ethanol und 50% (40 mM Tris, 4 mM EDTA, 0,8 N NaCl, pH 7,4)), Rühren, Zentrifugieren und das Verwerfen der Flüssigkeit. Der Trocknungsschritt umfaßt im allgemeinen das Trocknen für etwa 2 bis 20 Minuten bei etwa 40-70ºC. Der Eluierungsschritt umfaßt im allgemeinen die Zugabe eines Eluierungspuffers (zur Entfernung der DNA von der Oberfläche: zum Beispiel (10 mM Tris. 1 mM EDTA, pH 8.0). Verwirbeln für etwa 30 Sekunden, Erwärmen für etwa 10 Minuten auf etwa 40-70ºC, Zentrifugieren für etwa 2 Minuten und Sammeln der Flüssigkeit. An diesem Punkt enthält die Flüssigkeit die DNA. Der Eluierungsschritt wird gewöhnlich zumindest einmal wiederholt.
Wenn die Erfindung mit hydrophilen Oberflächen wie Filtern ausgeführt wird. schließen bevorzugte Schritte einen Bindungsschritt, einen Waschschritt und einen Eluierungsschritt ein. Der Bindungsschritt umfaßt im allgemeinen die Zugabe eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels zu einer DNA enthaltenden Lösung, Zugabe der entstehenden Lösung durch ein Filter (typischerweise zu einem Vorratsbehälter eines Blotters oder eines anderen Filtrationssystems (z.B. Spritzenfiltration)) und gegebenenfalls Hindurchführen eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels durch das Filter. Das Filter wird nach dem Filtrieren kurz an der Luft getrocknet (etwa eine Minute). Der Waschschritt umfaßt im allgemeinen die Zugabe eines Puffers (zur Entfernung des Lösungsmittels) durch das Filter. Im allgemeinen wird das Filter kurz an der Luft getrocknet (etwa eine Minute). Der Eluierungsschritt umfaßt im allgemeinen die Entfernung der DNA von dem Filter. Die Fläche des Filters, die in Kontakt mit den Lösungen war, wird herausgeschnitten und in ein Zentrifugenglas gegeben. Ein Eluierungspuffer (zur Entfernung der DNA von dem Filter) wird dann zugegeben und nachfolgend etwa 10 Minuten lang auf etwa 40-60ºC erwärmt. Die Flüssigkeit, die jetzt die DNA enthält, wird dann abgenommen.
Zu geeigneten wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln gehören Ethanol, Propanol, Isopropanol und Acetonitril. Bei der Ausführung der Erfindung können ebenfalls verschiedene Konzentrationen von wasserlöslichen organischen Lösungsmitteln verwendet werden. Vorzugsweise ist das Lösungsmittel 100%iges Isopropanol, Ethanol oder Propanol. Am meisten bevorzugt ist das Lösungsmittel Isopropanol. Zu geeigneten Konzentrationen der wasserlöslichen organischen Lösungsmittel gehören 1%ige bis 100%ige Lösungen von Ethanol, Propanol, Isopropanol und Acetonitril. Vorzugsweise betragen die Konzentrationen 20% bis 80%. Am meisten bevorzugt betragen die Konzentrationen 40% bis 60%. Typischerweise wird die veränderliche Konzentration des Lösungsmittels mit Wasser vermindert, jedoch können auch Kombinationen der Lösungsmittel verwendet werden. Zu bevorzugten Kombinationen von Lösungsmitteln gehören Isopropanol und Ethanol, Isopropanol und Propanol sowie Propanol und Ethanol.
Zu Bindungsmatrizes, die zur Verwendung bei der Ausführung der Erfindung geeignet sind, gehört jede hydrophile Oberfläche. Zu Beispielen von hydrophilen Oberflächen, die zur Verwendung bei der Ausführung der Erfindung geeignet sind, gehören Nitrocellulose, Celite-Diatomeen, Siliciumdioxidpolymere, Glasfasern, Magnesiumsilicate. Siliciumstickstoffverbindungen (z.B. SiN&sub4;). Aluminiumsilicate und Siliciumdioxid. Die Vielfalt der Formen, die die hydrophilen Oberflächen annehmen können, sind ebenfalls für die Verwendung in der Erfindung geeignet. Zu geeigneten Formen von hydrophilen Oberflächen gehören Kügelchen. Polymere, Körnchen und Filter (d.h. Membranen).
Man glaubt, daß Bindungspuffer, wie z.B. die wohlbekannten Chaotrope. bewirken, daß DNA in Lösung sich auf Grund der Hydratisierung der Chaotrope an hydrophile Oberflächen anlagert. Man glaubt, daß die Hydratisierung der Chaotrope die Wechselwirkung der Wassermoleküle mit der DNA verringert. Man glaubt, daß die DNA ihrerseits zur Wechselwirkung mit den Wassermolekülen, die die hydrophilen Oberflächen umgeben. gezwungen wird, was zu der Anlagerung der DNA an die hydrophile Oberfläche durch Wasserstoffbrückenbindung führt.
Obwohl nicht beabsichtigt ist, durch Theorie gebunden oder eingeschränkt zu sein. wird angenommen, daß die vorliegende Erfindung den wäßrigen Charakter der DNA-Lösung durch die Verwendung eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels als "Bindungspuffer" vermindert. Es wird angenommen, daß durch die Verminderung des wäßrigen Charakters der DNA-Lösung die DNA gezwungen wird, mit den hydrophilen Oberflächen in Wechselwirkung zu treten, wodurch eine Festphasenextraktion bewirkt wird. Außerdem führt, wie in dem Abschnitt der Beispiele dieses Dokuments gezeigt wird, die Erfindung zur Reinigung auf dem Wege der Bindung an eine hydrophile Oberfläche und nicht auf dem Wege der Ausfällung.
Die Erfindung kann verwendet werden, um DNA aus einer Vielfalt von Ausgangsmaterialien und aus einer Vielfalt von Formen zu reinigen. Zu Ausgangsmaterialien von DNA für eine Reinigung gehören Bakterien, Bakteriophage, Testmaterialien, Pflanzen, Tiere und dergleichen. DNA kann in einer Vielfalt von Formen gefunden werden und schließt einzelsträngige, doppelsträngige. ringförmige und lineare ein. Die Erfindung kann mit DNA aus jeglichem Ausgangsmaterial in jeglicher Form ausgeführt werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die in diesem Dokument beschriebenen speziellen Ausführungsformen der Erfindung. Wie dem Fachmann offensichtlich sein wird, sind verschiedene Veränderungen und Modifizierungen möglich und innerhalb des Rahmens der beschriebenen Erfindung beabsichtigt.

BEISPIEL 1

Dieses Experiment vergleicht die Bindungseigenschaften verschiedener Bindungspuffer mit denen von 6M NaClO&sub4; (Prep-a-gene ). Alle Experimente werden in einer Prep-a-gene-Matrix (Prep-a-gene-Kit, BioRad, Richmond. CA) unter den gleichen Bedingungen, ausgenommen der Austausch der Bindungspuffer, durchgeführt.

VERFAHREN:

Alle 13 Bindungspuffer wurden unter den gleichen Bedingungen verwendet.
Zu jeder der dreizehn Proben wurden 20 µl der Prep-a-gene- Diatomeenlösung, nachfolgend 750 µl Bindungspuffer gegeben, leicht verwirbelt und 5 Minuten bei 45ºC inkubiert. 2 Minuten zentrifugiert. die überstehende Flüssigkeit verworfen und der Bindungsschritt wiederholt. Man wasche mit 500 µl Waschpuffer. zentrifugiere, verwerfe den Puffer und wiederhole. Man gebe 25 µl Eluierungspuffer hinzu, verwirbele, inkubiere 5 Minuten bei 50ºC, zentrifugiere, bewahre die überstehende Flüssigkeit. wiederhole. Man ließ Gel auf jede der dreizehn Proben und den einen Standard laufen.
Die folgenden Puffer sind in der Reihenfolge der Verwendung aufgelistet:
1) Standard-6 M-NaClO&sub4; (Natriumperchlorat) aus dem Prep-a-gene-Kit
2) 10%iges PEG
3) 20%iges PEG
4) 6 M Glycerin
5) 95%iges EtOH
6) 100%iges BuOH
7) 6 M KSCN
8) 6 M Harnstoff
9) 8 M Guanidin HCl
10) 30%iges NH&sub4;OH
11) 10%ige H&sub2;SO&sub4;
12) 100%iges CH&sub3;CN
13) 6 M NaOAc
14) Standard-λ-DNA
Die Ergebnisse der Gelelektrophorese der 13 eluierten DNA-Proben im Vergleich zu der originalen DNA-Probe (λ-DNA) zeigen, daß Ethanol dem 6 M Natriumperchlorat und allen anderen Bindungspuffern, die auf die Rückhaltung der DNA auf der festen Phase (Prep-a-gene-Matrix) getestet wurden, überlegen ist. Acetonitril war ebenfalls gut.

BEISPIEL 2

Dieses Experiment erweitert die in Beispiel 1 erhaltenen Ergebnisse. In jenem Experiment wurde gezeigt, daß ETOH und CH&sub3;CN gute DNA- Bindungspuffer sind. In diesem Experiment soll bestimmt werden, wie niedrig der Prozentsatz an Ethanol, CH&sub3;CN und MeOH in dem Bindungspuffer sein und noch eine gute Abtrennung oder Rückgewinnung der DNA ergeben kann. Alle Experimente werden unter Verwendung der Prep-a-gene-Matrix ausgeführt.

MATERIALIEN:

Prep-a-gene-Kit BioRad
EtOH Fisher
MeOH Fisher
CH&sub3;CN Fisher
1%iges Agarosegel
λ-DNA BRL 56125A, 9 Mol 104, 503 µg in 803 µl

EXPERIMENTELLES

15 Fraktionen/Experimente wurden ausgeführt, die sich nur durch den verwendeten Bindungspuffer unterschieden. Der Waschpuffer. Eluierungspuffer und die feste Phase waren alle aus einem Prep-a-gene-Kit. Das Verfahren wird im wesentlichen übereinstimmend mit der Anleitung zu Beispiel 1 durchgeführt. In jeder Fraktion werden 1,3 µl λ-DNA verwendet. FRAKTIONEN (VERDÜNNT MIT H&sub2;O, SOFERN NICHT 100%ig):
Die aus den 15 getesteten Fraktionen eluierte DNA wurde mittels Gelelektrophorese analysiert und mit einer Standard-DNA-Probe verglichen (1.3 µl λ-DNA in 48 µl TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)). Die Ergebnisse zeigen, daß 100%iges Ethanol der beste Bindungspuffer und 100%iges Acetonitril der zweitbeste ist. Der dem Bindungspuffer verliehene stärker organische Charakter führt zu einer besseren Rückhaltung der DNA.

BEISPIEL 3

Dieses Experiment vergleicht die Bindungsfähigkeit von Propanol (PrOH). Isopropanol (i-PrOH) und Ethanol (EtOH) und deren Verdünnungen ebenso miteinander wie mit NaClO&sub4;. Die Aufgabe besteht darin, den organischen Effekt auf die Bindung der DNA an die Prep-a-gene-Matrix zu optimieren. MATERIALIEN:

VERFAHREN:

Es wurden 13 Fraktionen hergestellt. Bei den 13 Fraktionen wurde jeweils ein Bindungspuffer verwendet, siehe unten. Mit Ausnahme der Bindungspuffer wurde alles mit den Materialien des Prep-a-gene-Kits ausgeführt und das Prep-a-gene-Verfahren wurde im wesentlichen in Übereinstimmung mit den Anleitungen von Beispiel 1 ausgeführt.

VERWENDETE BINDUNGSPUFFER:

1) 100%iges Propanol
2) 80% Propanol, 20% H&sub2;O
3) 100%iges Isopropanol
4) 80% Isopropanol, 20% H&sub2;O
5) 100%iges DMSO
6) 80% DMSO, 20% H&sub2;O
7) 20% Propanol, 80% Ethanol
8) 40% Propanol, 60% Ethanol
9) 60% Propanol, 40% Ethanol
10) 20% Isopropanol, 80% Ethanol
11) 40% Isopropanol, 60% Ethanol
12) 60% Isopropanol, 40% Ethanol
13) Prep-a-gene-Bindungspuffer 6 M NaClO&sub4;
14) Standard-DNA (λ-DNA)
Die eluierten DNA-Proben wurden mittels Gelelektrophorese analysiert und mit der Standard-DNA-Probe verglichen. Die Ergebnisse zeigen, daß 100%iges Isopropanol der beste Bindungspuffer ist. 100%iges Propanol führte ebenfalls zu guter DNA-Rückhaltung. Isopropanol und Propanol können in Wasser auf etwa 80% verdünnt werden und halten noch DNA zurück. Die Tests zeigen, daß die zurückgehaltene Menge an DNA ebenfalls vergrößert wird, wenn der Prozentsatz an Isopropanol oder Propanol in den Ethanolverdünnungen erhöht wird.
Ein Anteil der DNA mit dem höchsten Gewicht (die am nächsten dem Ursprung ist, wo die DNA gestartet ist) wird mit i-PrOH (100%) zurückgehalten, dieser ist höher als mit jedem anderen verwendeten Bindungspuffer. DMSO hat keine DNA zurückgehalten.
Die folgende Zusammenfassung listet die Fähigkeit der Bindungspuffer auf, DNA zurückzuhalten, in der Reihenfolge von dem besten bis zu dem schlechtesten auf der Grundlage der Analyse mittels Gelelektrophorese im Vergleich zu dem Standard:

BEISPIEL 4

Dieses Experiment vergleicht die Fähigkeit der Bindungspuffer 6 M NaClO&sub4; und i-PrOH, DNA an eine Anzahl von Glasfasermembranen anzulagern.

MATERIALIEN:

Filter von Gelman Sciences, Inc. (Gelman Sciences. Ann Arbor. MI) Glasfilter Typ AE (Charge 603 202).
MSI-Glasfaserfilter (Micron Separation. Inc., West Borl, MA) (Charge 19571).
Whatman-GF/B (Whatman Ltd., England, UK) Kontroll-Nr. 7823.
Whatman-GF/D (Kontroll-Nr. 4706).
Whatman-GF/C (Kontroll-Nr. 1505).
λ-DNA (BRL). Charge 9 Mol 1104 (503 µg/803 µl)
Nitrocellulose (Schleicher & Schuell, Keene, NH) 44031621 Prep-a-gene (BioRad), Kontroll-Nr. 4004.
i-PrOH Fisher 744 241

AUSRÜSTUNG:

Blotter (Bio/Dot-Gerät von BioRad)

VERFAHREN:

Sechs (6) Fraktionen wurden hergestellt. die identisch miteinander waren, außer daß die zur Zurückhaltung der DNA verwendete Membran in jedem Falle verschieden war. Etwa 1,3 µg λ-DNA werden in etwa 248 µl TE-Puffer gelöst. Das wird mit etwa 750 µl i-PrOH verdünnt und zu dem Blotter gegeben, indem es durch das Filter gegeben wird. Nachdem die gesamte Flüssigkeit hindurchgelaufen ist, trockne man etwa 1 Minute an der Luft. Man füge etwa 750 µl i-PrOH hinzu und trockne wiederum etwa 1 Minute an der Luft. Nachdem das gesamte i-PrOH hindurchgelaufen ist, gebe man etwa 750 µl des Prep-a-gene-Waschpuffers hinzu. lasse es hindurchlaufen und trockne etwa 1 Minute an der Luft.
Man zerschneide das Filter, wo die Ursprungsmenge hindurchkommt. Man gebe den ausgeschnittenen Teil in ein Zentrifugenglas. Man gebe 50 µl des Prep-a-gene-Eluierungspuffers hinzu. Man erwärme etwa 20 Minuten lang auf etwa 60ºC. Die Ergebnisse der Gelelektrophorese zeigen, daß Isopropanol für Whatman GF/B, Whatman GF/C. MSI-Glas, Gelman AE und Nitrocellulose überlegen ist. Isopropanol und Gelman-AE-Filter hielten etwa 100% der DNA zurück.

BEISPIEL 5

Dieses Experiment bestimmt 1) die Auswirkung des pH auf die DNA- Bindung, 2) die Wirksamkeit von CELITE (Diatomeenerde oder Diatomeen) als Bindungsoberfläche und 3) die Auswirkung. die i-PrOH auf die Anlagerung von DNA an silanisierte (d.h. hydrophobe) Oberflächen hat.

MATERIALIEN:

Silanisierte Oberflächen
Prep-a-gene
i-PrOH
1N NaOH
1N HCl
1%iges Agarosegel in 1 X TE-Puffer
TE-Puffer
Beladungsfarbstoff
λ\-DNA

VERFAHREN:

7 Proben mit 248 µl TE-Puffer und 1.3 µl λ\-DNA werden hergestellt. Zu den Proben 1-3 werden eine von 3 silanisierten Oberflächen (Prep-a-gene- Matrix, Gene-clean-Matrix (Bio 101, La Jolla. CA) und Circle-prep-Matrix (Bio 101)). nachfolgend 750 µl i-PrOH gegeben. Man erwärme 10 Minuten lang auf 60ºC.
Während dieser Zeit gebe man zu drei Proben 20 µl Prep-a-gene-Matrix und zu der vierten gebe man 20 µl einer Lösung von 50% Celite 545 (Fisher) und 50% TE-Puffer. Zu der Celiteprobe und einer von den anderen drei Proben gebe man 750 µl Prep-a-gene-Bindungspuffer, zu einer Probe gebe man 750 µl Prep-a-gene-Bindungspuffer pH 11.0. eingestellt mit 1 N NaOH. Zu einer Probe gebe man 750 µl Prep-a-gene-Bindungspuffer pH 0,1, eingestellt mit 1 N HCl. Man erwärme alle vier Proben 10 Minuten lang auf 60ºC.
Man zentrifugiere die 7 Proben und dekantiere den Bindungspuffer. Man gebe 750 µl des gleichen Bindungspuffers. der beim ersten Mal mit dieser Probe verwendet wurde, zu jeder Probe. Man erwärme 5 Minuten lang auf 60ºC. Man zentrifugiere und dekantiere den Bindungspuffer. Man gebe zu jeder Probe 500 µl Prep-a-gene-Eluierungspuffer, rühre und schüttle 5 Minuten. zentrifugiere, dekantiere, trockne 10 Minuten lang bei 60ºC. Man gebe 25 µl Prep-a-gene-Waschpuffer hinzu, erwärme 10 Minuten lang auf 60ºC. zentrifugiere, sammle den Puffer, wiederhole den Eluierungsschritt.
Die eluierten Fraktionen wurden mittels Gelelektrophorese analysiert und mit Standard-DNA-Proben verglichen. Die Ergebnisse zeigen, daß von den silanisierten Oberflächen keine DNA zurückgewonnen wird, somit in früheren Experimenten die DNA an die Oberflächen gebunden und nicht ausgefällt wurde (ein Niederschlag würde nicht an die Oberflächen gebunden werden und würde in dem Waschschritt weggewaschen werden).

BEISPIEL 6

Dieses Experiment vergleicht die Fähigkeit des Bindungspuffers. DNA an Nitrocellulosemembranen zu binden.

AUSGANGSMATERIALIEN:

Waschpuffer (50% ETOH. 50% (40 mM Tris. 4 mM EDTA, 6 M NaCl . pH 7.4))
Bindungspuffer (50 mM Tris, 1 mM EDTA, 6 M NaClO&sub4;, pH 7,5)
Eluierungspuffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA. pH 8,0)
Nitrocellulose (5,0 µM AE98 System-Nr. 19020. Charge 643 317 S&S)
Nitrocellulose (0,45 µm 8A85. Chargen-Nr. 9039/7 S&S)
1%iges Agarosegel in 1 X TAE (1 X = 89 mM Tris-Borat. 2 mM EDTA. 89 mM Borsäure)
Beladungsfarbstoff
TE-Puffer
i-PrOH
EtOH
KSCN
8M Guanidin HCl
TBS-Puffer
NaClO&sub4;
Prep-a-gene-Kit

VERFAHREN:

7 identische Proben werden hergestellt (248 µl TE-Puffer und 1.3 µl λ-DNA). Die 7 Proben werden mit exakt den gleichen wie in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren, mit der Ausnahme eines jedes Mal verwendeten unterschiedlichen Bindungspuffers. unter Verwendung eines Blotters an Nitrocellulosemembranen gebunden.
Die DNA-Lösung wird zu 750 µl des Bindungspuffers zugegeben, der dann in einen Vorratsbehälter gegeben wird. Man lasse die Flüssigkeit hindurchlaufen und trockne 1 Minute an der Luft. Man gebe 750 µl des entsprechenden Bindungspuffers zu dem Vorratsbehälter, lasse hindurchlaufen und trockne 1 Minute an der Luft. Man wasche mit 750 µl Waschpuffer. Man lasse hindurchlaufen und trockne 1 Minute an der Luft.
Man schneide einen Kreis unter jedem Vorratsbehälter aus und gebe ihn in ein Zentrifugenglas. Man gebe 50 µl Eluierungspuffer hinzu, erwärme 10 Minuten lang auf 60ºC.
Die eluierten DNA-Proben wurden mittels Gelelektrophorese untersucht und mit Standard-DNA-Proben verglichen. Die Ergebnisse zeigen, daß Isopropanol, Propanol und Ethanol DNA zurückhalten, während die Chaotrope signifikant weniger DNA zurückhalten.

BEISPIEL 7

Die Aufgabe dieses Experiments ist es, zu bestimmen, ob λ-DNA, die in ein Chlamydia-Lysat gegeben worden war, an Diatomeen gebunden wird, wenn Isopropanol als der Bindungspuffer verwendet wird.

MATERIALIEN:

Isopropanol (Aldrich. Milwaukee, WI 02610MW)
Prep-a-gene-Kit (BioRad 41640)
λ-DNA (BRL 503 µg/803 µl)
Chlamydia(-)-Lysate:
Chlamydia(-)-Lysate von Wake County Health Dept.
TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8)
TAE-Puffer (1x)
Ethidiumbromid (10 mg/1 ml Stammlösung (Sigma Cat Nr. E-875, Chargen- Nr. 97E-3722)
4% NuSieve-Agarose in 1x TAE-Puffer
φX 174 RF DNA/Hae III (BRL Cat Nr. 5611SA. Chargen-Nr. 940103)
λ-DNA/Hind III (BRL Cat Nr. 56125A. Chargen-Nr. 9M0104) Beladungsfarbstoff Typ II (25% Ficoll, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol)
Elektrophoreseeinheit: BRL Horizon 58 Submarine Unit
Energieeinheit: Pharmacia Typ EPS 500/400
Photoausrüstung: Polaroid -Handkamera Typ 50 Polaroid -Film Typ 57 Fotodyne-UV-Light Box
anderes: silikonisierte sterilisierte Mikrozentrifugengläser Gel-/Beladungs-Pipettenspitzen (Stratagene , LaJolla, CA)

PROBE, HERSTELLUNG UND VERFAHREN:

Es wurden 13 Proben hergestellt, die jeweils ~ 250 µl einer der aufgelisteten menschlichen Chlamydia(-)-Proben enthielten. Zu jeder dieser Proben werden 10 µl einer 1:10-Verdünnung der λ-DNA-Probe gegeben. Eine 14. Probe wird hergestellt, die 250 µl H&sub2;O und 10 µl der 1:10-Verdünnung von λ-DNA enthält, zu der keine menschliche Chlamydia(-)-Probe hinzugegeben wird.
Zu 5 Proben und dem Standard werden 20 µl der Prep-a-gene- Beladungsmatrix gegeben. nachfolgend 750 µl Isopropanol, man schüttele 10 Minuten bei Raumtemperatur. Zu den verbleibenden 8 Proben wird zuerst das Isopropanol gegeben, nachfolgend die Bindungsmatrix und geschüttelt. Der Rest des Experiments wurde für alle 13 Proben und den Standard in exakt der gleichen Weise ausgeführt.
Nach 10 Minuten Schütteln der Proben bei Raumtemperatur zentrifugiere man 1 Minute, dekantiere und verwerfe die überstehende Flüssigkeit. Man wasche mit 750 µl Isopropanol, schüttele 10 Minuten bei Raumtemperatur, zentrifugiere, dekantiere und verwerfe die überstehende Flüssigkeit. Man erwärme 10 Minuten auf 50ºC. um die Bindungsmatrix zu trocknen. Man füge 25 µl Prep-a-gene-Eluierungspuffer hinzu. Man erwärme 10 Minuten auf 50ºC. zentrifugiere 1,5 Minuten. Man sammele die überstehende Flüssigkeit. wiederhole den Eluierungsschritt, wobei sich durch Vereinigung der eluierten Fraktionen jeder der 14 Proben 14 (50 µl) eluierte DNA-Proben ergeben. Diese eluierten Proben werden mittels Gelelektrophorese analysiert, um zu bestimmen, ob irgendwelche DNA eluiert wurde.
Das Experiment zeigt, daß DNA aus einer Probe entfernt werden kann, die Zelltrümmer (d.h. Kohlenhydrate, Proteine, Nukleinsäuren usw.) enthält. Sowohl die Kontroll-λ-DNA als auch menschliche DNA werden aus der Probe entfernt. Das Experiment zeigt auch, daß eine Anzahl von verschiedenen Protokollen mit Isopropanol als Bindungspuffer verwendet werden kann und noch einen großen Prozentsatz an DNA ergibt. der aus einer Probe entfernt wird (z.B. kann bei dem Bindungsschritt Wärme angewendet werden oder nicht, zwei Bindungsschritte können verwendet werden oder einer, ein Waschschritt kann angewendet werden mit 50% Ethanol und 50% pH 8-Puffer einer niedrigen EDTA-Konzentration oder keine Waschung. Die Reihenfolge der Zugabe der Reagentien ist unwichtig, mit anderen Worten können ohne signifikante Veränderungen der DNA-Mengen, die aus der entsprechenden Probe gewonnen werden, Bindungspuffer oder Bindungsmatrix zuerst zugegeben werden).

Claims

1. Festphasenverfahren zur Reinigung von DNA aus einer Lösung, das umfaßt:

Bindung der DNA an eine hydrophile Oberfläche unter Verwendung eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels,

Waschen der hydrophilen Oberfläche, um das Lösungsmittel, nicht aber die gebundene DNA zu entfernen.

Trocknen der hydrophilen Oberfläche mit der gebundenen DNA und Eluierung der DNA von der hydrophilen Oberfläche.

2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem das wasserlösliche organische Lösungsmittel ein Lösungsmittel umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt wird. die aus Isopropanol, Propanol und Ethanol besteht.

3. Verfahren nach Anspruch 1. in dem das wasserlösliche organische Lösungsmittel ein Lösungsmittel umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus 1% bis 100% Ethanol, 1% bis 100% Isopropanol und 1% bis 100% Propanol besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, in dem die hydrophile Oberfläche aus Celite-Diatomeen. Siliciumdioxidpolymeren. Magnesiumsilicat. Siliciumstickstoffverbindungen. Aluminiumsilicaten oder Siliciumdioxid ausgewählt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, in dem die hydrophile Oberfläche Celite- Diatomeen sind.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspruche wobei die hydrophile Oberfläche in Form eines Filters bereitgestellt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, das umfaßt:

(a) Zugabe einer hydrophilen Oberfläche zu der Lösung,

(b) Zugabe eines wasserlöslichen organischen Lösungsmittels,

(c) Trennung des Gemisches, das (a) und (b) umfaßt, in eine flüssige und eine nichtflüssige Fraktion, wobei die nichtflüssige Fraktion die an die hydrophile Oberfläche gebundene DNA umfaßt;

(d) Waschen der nichtflüssigen Fraktion von (c),

(e) Abtrennung der flüssigen Fraktion von der nichtflüssigen Fraktion in (d), und

(f) Entfernen der DNA von der hydrophilen Oberfläche der nichtflüssigen Fraktion von (e).

8. Verfahren nach Anspruch 7, in dem die hydrophile Oberfläche aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Celite-Diatomeen. Siliciumdioxidpolymeren, Magnesiumsilicaten, Siliciumstickstoffverbindungen, Aluminiumsilicaten und Siliciumdioxid besteht.

9. Verfahren nach Anspruch 7, in dem das wasserlösliche organische Lösungsmittel ein Lösungsmittel umfaßt, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Isopropanol, Propanol und Ethanol besteht.

10. Verfahren nach Anspruch 7, in dem das wasserlösliche organische Lösungsmittel ein Lösungsmittel umfaßt. das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus 1% bis 100% Isopropanol, 1% bis 100% Propanol und 1% bis 100% Ethanol besteht.

11. Verfahren nach Anspruch 7, in dem Schritt (g) die Zugabe eines Eluierungspuffers umfaßt.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei die hydrophile Oberfläche in Form eines Filters bereitgestellt wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspruche, wobei der Schritt der Bindung der DNA an die hydrophile Oberfläche wiederholt wird.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Anspruche, wobei der Schritt der Eluierung der DNA von der hydrophilen Oberfläche wiederholt wird.