GEBIET DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung beschäftigt sich mit der Hemmung von Gefäßverengung an einer
intravaskulären Stelle, die mit Angioplastie, Endarteriektomie oder Atherektomie behandelt wurde,
in natürlichen und synthetischen Gefäßtransplantaten, in arteriovenösen Fisteln, an intravaskulären
Stellen nach dem Einsetzen von Gefäß-Stents oder kardiovaskulären Vorrichtungen oder an einer
intravaskulären Stelle mit Thrombozytenablagerung. Insbesondere betrifft diese Erfindung die
Verwendung von Antikörpern, die das Platelet Activation Dependent Granule-External Membrane
Protein ("PADGEM") erkennen, sowie von Antikörper-Homologen hievon zur Hemmung dieser,
Gefäßverengungen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Einem betreuenden Arzt stehen mehrere therapeutische Eingriffsverfahren zur Verfügung, die
bei der Behandlung okklusiver Arterienerkrankungen eingesetzt werden können. Diese Verfahren
inkludieren Ballon-Angioplastie, Endarteriektomie, Atherektomie, Bypass-Chirurgie, das Einsetzen
von Gefäß-Stents oder von kardiovaskulären Vorrichtungen.
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Die Verfahren der Angioplastie bedienen sich im allgemeinen einer Erweiterung eines
Blutgefäßes mit Hilfe eines Ballon-Katheters, der durch das Lumen des betroffenen Gefäßes an der
Stelle der Gefäßverengung eingesetzt wird. Wenn der Ballon-Katheter den verengten Abschnitt des
Gefäßes erreicht, wird der Ballon aufgeblasen, um das okkludierende Material flach gegen die
Gefäßwand zu drücken. Das Ziel der Angioplastie ist die Erweiterung des Lumens des betroffenen
Gefäßes, um den Blutstrom zu verstärken. Die perkutane transluminale Koronar-Angioplastie
("PTCA") ist eine Art von Angioplastie-Verfahren, die normalerweise zur Behandlung okkludierter
Koronararterien verwendet wird. Die Angioplastie wird auch zur Steigerung des Blutstroms in
ockludierten peripheren Blutgefäßen verwendet.
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Wie die Angioplastie werden auch Endarteriektomie- und Atherektomie-Verfahren zur
Behandlung okklusiver Arterienerkrankungen verwendet. Die Endarteriektomie ist ein chirurgisches
Verfahren, bei welchem die verdickten atheromatösen Tunica-Intima einer Arterie entnommen
werden. Die Endarteriektomie der Carotis ist ein Beispiel dieses Verfahrens, in welchem okklusives
Material aus der Carotis-Arterie entnommen wird, um den Blutstrom zum Gehirn zu verstärken.
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Bei der Atherektomie wird eine Schneidvorrichtung, die an einem Katheter befestigt ist, an
einer Stelle atherosklerotischer Plaque-Ablagerung angeordnet. Wenn die Vorrichtung in Position
ist, wird das Schneidgerärt aktiviert, um die Plaque aufzureißen und einzusammeln. Dieses
Verfah
ren kann zur Behandlung von Okklusionen in peripheren sowie koronaren Gefäßen verwendet
werden.
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Bei der Bypass-Chirurgie erfolgt das Einsetzen einer Gefäßtransplantationsprothese, um die
okkludierten, verengten oder verletzten Abschnitte von Arterien oder Gefäßen zu umgehen. Die
Transplantation kann unter Verwendung natürlichen Gefäßgewebes oder synthetischer Materialien,
wie etwa Polytetrafluorethylen ("PTFE") erreicht werden. Die erfolgreiche Transplantation stellt
den Blutstrom zu den unterversorgten Geweben wieder her. Die
Koronararterien-Bypass-Transplantationschirurgie ("CABG") wird zur Wiederherstellung des Blutstroms zu unterversorgten
Koronargeweben verwendet. Die Bypass-Transplantationschirurgie kann auch dazu verwendet
werden, die Blutversorgung von peripheren Geweben wiederherzustellen.
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Ballon-Angioplastie, Endarteriektomie, Atherektomie und Bypass-Chirurgie sind
kostenintensive und invasive Verfahren, die für den Patienten deutliche Risken darstellen. Komplikationen, die
mit diesen Verfahren verbunden sind, sind gut dokumentiert und bewirken oft eine Verengung des
behandelten Gefäßes.
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Eine Gefäßverengung post Angioplastie, post Endarteriektomie und post Atherektomie kann
kurz nach dem Verfahren aus der akuten Wiederverschließung des Gefäßes oder aus schrittweise
stärker werdender Restenose des Gefäßes resultieren. Eine deutliche Restenose tritt zum Beispiel
bei einem Drittel aller Patienten auf, an denen eine Koronar-Angioplastie bzw. eine
Carotis-Endarteriektomie vorgenommen wurde. Es sind häufig wiederholte Eingriffe oder eine wiederholte
Bypass-Chirurgie erforderlich, um diese Gefäßverengungen zu behandeln.
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Es ist auch bekannt, daß ein Gesamtverschluß bzw. eine progressive Stenose der
Gefäßtransplantationsprothese im Anschluß an eine Bypass-Chirurgie auftreten kann. Diese Komplikationen
können ebenfalls eine zusätzliche Behandlung durch Angioplastie oder eine wiederholte Bypass-
Chirurgie erfordern.
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Andere therapeutische Eingriffsverfahren für symptomatische okklusive
Arterienerkrankungen, wie etwa das Einsetzen von Gefäß-Stents oder kardiovaskulären Vorrichtungen, tragen auch
das Risiko der Komplikation durch Gefäßverengung in sich. Gefäß-Stents sind Vorrichtungen, die
dazu verwendet werden, Blutgefäße durch physikalische Mittel offen zu halten. Stents können in
peripheren und koronaren Arterien eingesetzt werden, wobei speziell gestaltete flexible
Zulieferkatheter verwendet werden. Die Einsetzung eines Stents wird oft während eines
Angioplastie-Verfahrens durchgeführt. Eine schwere kardiovaskuläre Erkrankung kann die Behandlung mit
kardiovaskulären Vorrichtungen erfordern, inklusive prosthetischer Herzklappen und künstlicher Herzen.
Ein thrombotischer Verschluß und eine Stenose von Blutgefäßen wurden im Anschluß an das
Einsetzen von Gefäß-Stents und kardiovaskulärer Vorrichtungen beobachtet, wodurch oft ein
neuerlicher chirurgischer Eingriff und ein Ersatz der Vorrichtung notwendig wurden.
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Temporäre oder permanente arteriovenöse Fisteln, die Implantationsstellen darstellen, die zur
Errichtung eines Gefäßzugangs für die Hemodialyse verwendet werden, sind auch oft durch die
Komplikation einer Implantat-Verengung bedroht. Diese Verengung kann aus einem frühen
thrombotischen Verschluß oder aus progressiver Stenose resultieren.
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Die Ablagerung von Thrombozyten an der Stelle der Gefäßverengung in den Fällen von
neuerlichem Verschluß und Restenose von Blutgefäßen und Transplantaten im Anschluß an
therapeutische Eingriffsverfahren wurde beobachtet. Es ist nicht eindeutig, welche Wirkung die
Thrombozytenablagerung auf den neuerlichen Verschluß und die Restenose haben. Die Ablagerung von
Thrombozyten kann mit der Bildung von Thromben einhergehen und kann eine physiologische
Reaktion auf die Verletzung von Gefäßgewebe darstellen. Die mögliche Aktivierung der abgelagerten
Thrombozyten und ihre Produktion von PADGEM können auch die Rekrutierung von Leukozyten
beeinflussen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die vorliegende Erfindung sieht vor: die Verwendung eines anti-PADGEM-Antikörpers,
eines rekombinanten Antikörpers, eines chimärischen Antikörpers oder eines humanisierten
Antikörpers oder eines Fab-Fragments, Fab'Fragments, F(ab')&sub2;-Fragments, F(v)-Fragments, eines
Schwerketten-Monomers, Schwerketten-Dimers, Schwerketten-Trimers, Leichtketten-Monomers,
Leichtketten-Dimers, Leichtketten-Trimers oder eines Dimers zwischen einer leichten Kette und einer
schweren Kette hievon, das sich an PADGEM bindet, oder eines Peptids, welches die, Aktivität von
anti-PADGEM-Antikörpern nachahmt, zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von
Gefäßverengung an intravaskulären Stellen, die durch Angioplastie, Endarteriektomie oder
Atherektomie behandelt wurden, in natürlichen und synthetischen Gefäßtransplantaten, an
intravaskulären Stellen nach dem Einsetzen von Gefäß-Stents oder kardiovaskulären Vorrichtungen, in
arteriovenösen Fisteln oder an einer intravaskulären Stelle mit Thrombozytenablagerung.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
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Fig. 1A und 1B zeigen serienmäßige Vorderansichten von externen Shunts, die in zwei
Pavian-Patienten (Paviane A und B) implantiert wurden. Die Bilder wurden unter Verwendung einer
Gamma-Kamera Ohio Nuclear Series 100 gemacht. Diese Bilder zeigen, daß im Anschluß an die
Infusion von monoklonalem Antikörper GA6 oder GA6 F(ab')&sub2; Fragmenten die Anreicherung von
Neutrophilen und Monozyten in dem Shunt unterdrückt wurde. stellt die Leukozytenablagerung
dar, wenn kein Antikörper infundiert wird; stellt die Leukozytenablagerung anschließend an die
Infusion von GA6 Antikörper dar; und stellt die Leukozytenablagerung im Anschluß an die
Infusion von GA6 F(ab')&sub2; Fragment dar.
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Fig. 2 zeigt serienmäßige Vorderansichten des Shunts und demonstriert, daß Geschwindigkeit
und Menge der Thrombozytenablagerung im wesentlichen identisch waren in Anwesenheit und
Abwesenheit von infundiertem GA6 Antikörper oder GA6 Antikörper-Fragmenten. stellt die
Thrombozytenablagerung dar, wenn kein Antikörper infundiert wurde; stellt die
Thrombozytenablagerung im Anschluß an die Infusion von GA6 Antikörper dar; und stellt die
Thrombozytenablagerung im Anschluß an die Infusion von GA6 F(ab')&sub2; Fragment dar.
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Fig. 3 zeigt repräsentative elektronenmikroskopische Aufnahmen der Oberfläche des Lumens
des Dacron-Transplantats, das aus dem arteriovenösen Shunt entnommen wurde. Shunts, die aus
einem Pavian erhalten wurden, dem keine anti-PADGEM-Antikörper oder Antikörper-Fragmente
infundiert worden waren, zeigten beträchtliche Mengen von Fibrinausfällung, Thrombozyten und
Leukozyten. Shunts, die aus einem Pavian erhalten wurden, welchem anti-PADGEM-Antikörper
oder Antikörper-Fragmente infundiert worden waren, hatten Thrombozyten, jedoch waren das
Ausmaß der Fibrinausfällung und die Leukozyten sehr deutlich herabgesetzt. Fig. 3A zeigt die
Oberfläche des Lumens, wenn keine anti-PADGEM GA6 Antikörper infundiert wurden. Der Pfeil
deutet auf einen gebundenen Leukozyt. Fig. 3B zeigt die Oberfläche des Lumens, wenn
GA6-Antikörper infundiert wurden. Der Pfeil deutet auf einen gebundenen Thrombozyt. Fig. 3C zeigt die
Oberfläche des Lumens, wenn F(ab')&sub2; Fragmente von GA6 infundiert wurden. Der Pfeil deutet auf
einen gebundenen Erythrozyt. Die Mikroaufnahmen stammen von Dacron-Transplantaten, die aus
dem Pavian B nach Beendigung jedes Versuchs entnommen worden waren.
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Fig. 4A und 4B. Fibrinablagerung auf dem Dacron-Transplantat und deren Inhibierung durch
den Anti-P-Selectin GA6 Antikörper. Das Fab'Fragment von T2G1s (einem Fibrin-spezifischen
Antikörper), der mit Technetium-99m markiert worden war, wurde durch die Venenverbindung des
Shunts knapp vor Beginn der Strömung an der angegebenen Stelle injiziert, und GA6 Fab'&sub2; wurde
gleichzeitig durch die arterielle Verbindung injiziert. 4A: Pavian A mit (o) oder ohne ( ) GA6
Fab'&sub2; Antikörper (2 mg/kg). B: Pavian B mit (o) oder ohne ( ) GA6 Fab'&sub2; Antikörper (5 mg/kg).
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
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PADGEM, ein Glycoprotein mit 140.000 Dalton, ist ein Bestandteil der Membran von alpha-
Körnern und Weibel-Palade-Körpern von Thrombozyten und endothelialen Zellen (Berman et al.
1986 [1], Stenberg et al. 1985 [2], Bonfanti et al. 1989 [3]). PADGEM wird an der
Plasmamembran von aktivierten Thrombozyten exprimiert (Larsen et al. 1989 [4], Hamburger und McEver
1990 [5]). Es wird angenommen, daß es die zelluläre Haftung von aktivierteil Thrombozyten an
Neutrophilen und Monozyten mediiert [5]. WO 91/01380, WO 91/06632 und "Current Studies in
Hematology and Blood Transfusion, Nr. 58 (17. Juni 1991), S. 32-36" ofenbaren eine Hemmung
der Wechselwirkung zwischen Leukozyten und aktivierten Thrombozyten durch die Verwendung
von anti-PADGEM-Antikörpern.
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Die vorliegende Erfindung ist auf die Verwendung eines anti-PADGEM-Antikörpers, eines
rekombinanten Antikörpers, chimärischen Antikörpers oder humanisierten Antikörpers oder eines
Fab-Fragments, Fab'Fragments, F(ab')&sub2;-Fragments, F(v)-Fragments, eines
Schwerketten-Monomers, Schwerketten-Dimers, Schwerketten-Trimers, Leichtketten-Monomers, Leichtketten-Dimers,
Leichtketten-Trimers oder eines Dimers zwischen einer leichten Kette und einer schweren Kette
hievon, das sich an PADGEM bindet, oder eines Peptids, welches die Aktivität von anti-PADGEM-
Antikörpern nachahmt, zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung von Gefäßverengung an
intravaskulären Stellen, die durch Angioplastie, Endarteriektomie oder Atherektomie behandelt
wurden, in natürlichen und synthetischen Gefäßtransplantaten, an intravaskulären Stellen nach dem
Einsetzen von Gefäß-Stents oder kardiovaskulären Vorrichtungen, in arteriovenösen Fisteln oder an
einer intravaskulären Stelle mit Throbozytenablagerung gerichtet.
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Wie der Ausdruck hierin verwendet wird, ist ein "Antikörper-Homolog", welches an
PADGEM bindet, ein Protein oder ein Polypeptid, welches ein oder mehrere Polypeptide umfaßt,
die aus Immunglobulin-Leichtketten, Immunglobulin-Schwerketten und Antigen-bindenden
Fragmenten hievon, die zur Bindung an PADGEM befähigt sind, ausgewählt sind. Die
Polypeptid-Bestandteile eines Antikörper-Homologs, welches aus mehr als einem Polypeptid aufgebaut ist,
können gegebenenfalls durch Disulfid-Bindung oder eine andere kovalente Vernetzung verbunden sein.
Dementsprechend inkludieren Antikörper-Homologe, die an PADGEM binden, intakte
Immunglobuline der Typen IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (ebenso wie Unterarten hievon), in welchen die leichten
Ketten des Immunglobulins vom Typ kappa oder lambda sein können. Diese Antikörper-Homologe
enthalten auch Abschnitte von intakten Immunglobulinen, die die Spezifität der PADGEM-Bindung
beibehalten, zum Beispiel Fab-Fragmente, Fab'Fragmente, F(ab')&sub2;-Fragmente, F(v)-Fragmente,
Schwerketten-Monomere, -Dimere oder -Trimere, Leichtketten-Monomere, -Dimere oder
-Trimere, Dimere, die aus einer schweren und einer leichten Kette bestehen, und dergleichen.
Solche Antikörper-Fragmente können zum Beispiel durch chemische Methoden hergestellt werden,
z. B. durch Spaltung eines intakten Antikörpers mit einer Protease, wie etwa Pepsin oder Papain,
und gegebenenfalls durch Behandlung des gespaltenen Produkts mit einem Reduktionsmittel.
Andererseits können brauchbare Fragmente dadurch hergestellt werden, daß Wirtszellen verwendet
werden, die mit Genen für verkürzte schwere und/oder leichte Ketten transformiert wurden.
Schwerketten- und Leichtketten-Monomere können dadurch hergestellt werden, daß ein intakter
Antikörper mit einem Reduktionsmittel, wie etwa Dithiothreitol, behandelt wird, worauf eine
Reinigung zur Trennung der Ketten erfolgt. Schwerketten- und Leichtketten-Monomere können auch
von Wirtszellen produziert werden, die mit einer DNA transformiert wurden, die entweder für die
gewünschte schwere Kette oder leichte Kette, jedoch nicht für beide, codiert (vgl. z. B. Ward et al.;
1989 [6]; L. Sastry et al., 1989 [7]).
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Antikörper-Homologe, die für die vorliegende Erfindung verwendbar sind, umfassen auch
Peptide, die die Wirkung von anti-PADGEM-Antikörpern in der Bindung an PADGEM
nachahmen. Solche nachahmende Peptide können dadurch hergestellt werden, daß eine Vielzahl von
Peptiden, semi-peptidischen Verbindungen oder nicht-peptidischen Verbindungen synthetisiert wird,
worauf diese Verbindungen auf ihre Fähigkeit zur Bindung an PADGEM und zur Inhibierung der
Leukozytenbindung an PADGEM untersucht werden. (Vgl. z. B. Scott und Smith, 1990 [8]; Devlin
et al., 1990 [9]).
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Die für die vorliegende Erfindung verwendbaren Antikörper-Homologen werden auch
humanisierte, chimärische und rekombinante Antikörper umfassen, die an PADGEM binden. (Vgl. z. B.
Boss, US-Patent 4,816.397 [10]). Zum Beispiel können rekombinante Antikörper dadurch
hergestellt werden, daß cDNA oder genomische DNA, die für die Immunglobulin-Leichtkette und
-Schwerkette des gewünschten Antikörpers codieren, von einer Hybridomzelle, die einen
gewünschten Antikörper produziert, geklont werden. Die cDNA oder genomische DNA, die für
solche Polypeptide codiert, wird dann in Expressionsvektoren eingesetzt, sodaß beide Gene operativ
zu transkriptionellen und translationellen Expressionssteuerungssequenzen verbunden werden. Der
Expressionsvektor und die Expressionssteuerungssequenzen werden so ausgewählt, daß sie mit der
verwendeten Expressionswirtszelle kompatibel sind. In der Regel werden beide Gene in denselben
Expressionsvektor eingesetzt.
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Es können prokaryotische und eukaryotische Wirtszellen verwendet werden. Die Expression
in eukaryotischen Wirtszellen ist bevorzugt, weil solche Zellen, eher als prokaryotische Zellen,
einen richtig gefalteten und immunologisch aktiven Antikörper aufbauen und ausscheiden. Es kann
jedoch jeder produzierte Antikörper, der durch ungeeignete Faltung inaktiv ist, nach allgemein
bekannten Methoden renaturierbar gemacht werden (vgl. Kim und Baldwin, 1982 [11]). Es ist
möglich, die Wirtszellen zu verwenden, um nur Abschnitte von intakten Antikörpern zu
produzieren, wie etwa Leichtketten-Dimere oder Schwerketten-Dimere, die auch Antikörper-Homologe sein
können, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind.
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Es versteht sich, daß auch Veränderungen in den obigen Vorgangsweisen für die vorliegende
Erfindung in Betracht gezogen werden. Zum Beispiel kann es wünschenswert sein, eine Wirtszelle
mit einer DNA, die entweder für die leichte Kette oder für die schwere Kette (aber nicht für beide)
eines Antikörper-Homologs codiert, zu transformieren. Die rekombinante DNA-Technologie kann
auch dazu verwendet werden, einen Teil der oder die gesamte DNA, die sowohl für nur eine oder
auch für die beiden leichten und schweren Ketten codiert und die für die PADGEM-Bindung nicht
notwendig sind, zu entfernen. Die von solchen verkürzten DNA-Molekülen exprimierten Moleküle
sind Antikörper-Homologe gemäß dieser Erfindung. Zusätzlich dazu können bifunktionelle
Antikörper produziert werden, in welchen nur eine schwere und eine leichte Kette
Antikörper-Homologe gemäß dieser Erfindung sind und die andere schwere bzw. leichte Kette für ein sich von
PADGEM unterscheidendes Antigen oder für ein anderes Epitop von PADGEM spezifisch ist.
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Chimärische rekombinante Antikörper-Homologe, die an PADGEM binden, können ebenfalls
in dieser Erfindung verwendet werden. Wie der Ausdruck hierin verwendet wird, ist ein
"chimärisches rekombinantes Antikörper" -Homolog ein Antikörper-Homolog, welches
ursprünglich von einem nicht-humanen Säugetier-Antikörper stammt, wobei rekombinante
DNA-Technologie dazu verwendet wurde, alle oder einen Teil der Gelenks- und konstanten Regionen der leichten
Kette, der schweren Kette oder beider durch entsprechende Regionen aus einer humanen
Immunglobulin-Leichtkette oder -Schwerkette zu ersetzen.
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Chimärische rekombinante Antikörper werden dadurch hergestellt, daß eine Wirtszelle mit
einem geeigneten Expressionsvektor transformiert wird, welcher eine DNA umfaßt, die für die
gewünschten Immunglobulin-Leichtketten und -Schwerketten codiert, worin die gesamte oder ein Teil
der DNA, die (der) für die Gelenks- und konstanten Regionen der schweren Kette und/oder der
leichten Kette codiert, durch eine DNA aus der entsprechenden Region einer Immunglobulin-
Leichtkette oder -Schwerkette einer unterschiedlichen Spezies ersetzt wurde. Wenn der
ursprüngliche rekombinante Antikörper nicht-human ist, wird eine Substitution entsprechender humaner
Sequenzen bevorzugt. Ein beispielhafter chimärischer rekombinanter Antikörper hat variable
Regionen der Maus und Gelenks- und konstante Regionen des Menschen. (Vgl. allgemein Boss et al.,
US-Patent 4,816.397 [10]; Cabilly et al., US-Patent 4,816.567 [12]; und Morrison et al., 1984
[13]).
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Anti-PADGEM-Antikörper, die in dieser Erfindung verwendbar sind, sind vorzugsweise
monoklonale Antikörper. Sie können unter Verwendung üblicher Materialien und Methoden
hergestellt werden. Monoklonale anti-PADGEM-Antikörper wurden bereits früher beschrieben (z. B.
Larsen et al., 1989 [4]; Furie, US-Patent 4,783.330 [14]). Die in dem US-Patent 4,783.330
beschriebenen anti-PADGEM-Antikörper wurden unter der ATCC Eingangs- -Nr. HB 8670
hinterlegt. Für die in dem folgenden Beispiel beschriebenen Darlegungen wurde ein monoklonaler anti-
PADGEM-Antikörper mit der Bezeichnung GA6 verwendet. Andere anti-PADGEM-Antikörper
werden in der vorliegenden Erfindung auch verwendbar sein. Diese inkludieren die monoklonalen
Antikörper GE12 und AC11, welche, wie GA6, mit PADGEM binden und die Leukozytenbindung
an PADGEM inhibieren. Zell-Linien, die diese Antikörper produzieren, wurden bei der American
Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, hinterlegt. Die ATCC-Eingangsgungsnummern
für die Zell-Linien, die jeweils die Antikörper GA6, GE12 und AC11 produzieren, sind HB10943,
HB10942 und HB 10941. Die monoklonalen Antikörper GA6, GE12 und AC11 können in der
weiter unten beschriebenen Weise hergestellt werden.
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Die Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper ist weitgehend bekannt (vgl.
allgemein Lerner, 1981 [15]; Gefter et al., 1977 [16]). Kurz gesagt, wird eine unsterbliche Zell-Linie
(in der Regel Myelomzellen) an Lymphozyten (in der Regel Splenozyten) aus einem Säugetier,
welches mit einer Zubereitung aus PADGEM immunisiert wurde, fusioniert. Die Kulturüberstände
der entstehenden Hybridomzellen werden auf jene Antikörper untersucht, die die geeigneten
Eigenschaften aufweisen, z. B. an PADGEM binden.
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Es sind alle die vielen gut bekannten zur Fusionierung von Lymphozyten und unsterblichen
Zell-Linien verwendbaren Arbeitsvorschriften für die Herstellung solcher monoklonaler Antikörper
brauchbar (vgl. z. B. Galfre et al. (1977) [17]; Gefter et al., 1977 [16]). Viele Variationen solcher
Verfahren sind den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und werden auch verwendbar sein.
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In der Regel (und vorzugsweise) stammt die unsterbliche Zell-Line (z. B. eine Myelom-Zell-
Linie) von derselben Säugetier-Spezies wie die Lymphozyten. Verwendbare Säugetierte inkludieren
Mäuse und Ratten. Insbesondere stammen sowohl die unsterbliche Zell-Linie als auch die
Lymphozyten von einer Inzuchtmaus des Stammes BALB/c (Jackson Labs, Bar Harbour, ME). Bevorzugte
unsterbliche Zell-Linien sind Maus-Myelom-Zell-Linien, die auf ein Kulturmedium, welches
Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin ("HAT Medium") enthält, empfindlich sind. Die bevorzugteste
Maus-Myelom-Zell-Linie ist P3X63-AG8.653 (ATCC, Rockville, MD, Katalog Nr. CRL 1580).
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Bei dieser bevorzugten Ausführungsform werden HAT-empfindliche Maus-Myelom-Zellen an
Maus-Splenozyten unter Verwendung von Polyethylenglykol ("PEG"), vorzugsweise PEG-3350,
fusioniert. Die Immunisierung des Säugetiers bei der Herstellung dieser monoklonalen Antikörper
kann unter Einsatz von Standardverfahren erreicht werden. PADGEM-Fragmente, intakte
PADGEM-Moleküle und ganze aktivierte Thrombozyten können für die Immunisierung verwendet
werden. Die Einheitsdosis und die Immunisierungsvorschrift hängen von der Spezies des
immuni
sierten Tieres, seinem Immunstatus, dem Körpergewicht des Säugetiers und der
PADGEM-Konzentration in dem verabreichten PADGEM-Präparat ab. Wir bevorzugen zum Beispiel die
Immunisierung von Balb/c Mäusen monatlich während drei Monaten mit 12 ug PADGEM. Für die
anfängliche Immunisierung wird PADGEM in der Regel in komplettem Freunds Adjuvans emulgiert und
für die anschließenden Immunisierungen wird unvollständiges Freunds Adjuvans verwendet. Vor
der Fusion werden die Mäuse mit PADGEM (z. B. 12 ug) in unvollständigem Freunds Adjuvans
aufgefrischt.
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Den immunisierten Säugetieren kann zwischen den Auffrischungen Blut abgenommen werden
und das Serum jeder Blutprobe wird auf die gewünschten monoklonalen Antikörper unter
Verwendung eines beliebigen der weiter unten beschriebenen Sichtungsassays untersucht. Die zur
Herstellung von Hybridomzellen verwendeten Lymphozyten werden in der Regel aus immunisierten
Säugetieren isoliert, deren Seren bereits positive Testergebnisse hinsichtlich der Anwesenheit von
monoklonalen Antikörpern, die an PADGEM binden, ergeben haben.
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Hybridomzellen, die aus der Fusion der immortalisierten Mauszellen resultieren, werden dann
unter Verwendung von HAT-Medium ausgewählt, welches nicht fusionierte und unproduktiv
fusionierte Myelomzellen tötet (unfusionierte Splenozyten sterben nach einigen Tagen, da sie nicht
transformiert werden).
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Hybridomzellen, die monoklonale anti-PADGEM-Antikörper produzieren, können durch
Screenen der Hybridom-Kulturüberstände unter Verwendung üblicher Screenungsassays festgestellt
werden. Assays zur Feststellung, ob ein spezieller Antikörper an PADGEM bindet und ob ein
spezieller Antikörper die PADGEM-Bindung an Leukozyten, z. B. HL60 Zellen inhibiert, werden
bevorzugt. Geeignete Assays inkludieren solche, die auf der Antikörperbindung an PADGEM auf
Platten unter Verwendung eines ELISA basieren, sowie solche, die auf der Antikörperbindung an
aktivierte Thrombozyten unter Verwendung von FACS basieren; Adhäsionsassays für die
Antikörper-Inhibierung der Leukozyten- (z. B. HL60) Zellbindung an PADGEM; und Adhäsionsassays für
die Antikörper-Inhibierung der Leukozyten-Zellbindung an aktivierte Thrombozyten.
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Hybridome, die positive Testergebnisse für die gewünschte Antikörper-Aktivität ergeben,
können durch begrenzende Verdünnung geklont und in einem Nährmedium unter Bedingungen und
während einer ausreichenden Zeit, um den Hybridomzellen die Ausscheidung der monoklonalen
Antikörper in das Kulturmedium zu gestatten, gezüchtet werden. Gewebskulturverfahren und
Kulturmedien, die für Hybridomzellen geeignet sind, sind allgemein bekannt (vgl. z. B. Lerner [15]).
Schließlich wird der konditionierte Überstand der Hybridomkultur, der die Antikörper-Homologen
enthält, gesammelt.
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Andererseits kann der gewünschte monoklonale Antikörper durch Injizieren der
Hybridomzellen in den Peritonealraum einer nicht-immunisierten Maus produziert werden. Die
Hybridomzellen vermehren sich in dem Peritonealraum und scheiden den monoklonalen Antikörper aus, welcher
sich als Ascites-Flüssigkeit anreichert (vgl. Lerner [15]). Der Antikörper wird dann durch Abziehen
der Ascites-Flüssigkeit aus dem Peritonealraum mit einer Injektionsspritze geerntet.
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Die monoklonalen Antikörper können leicht aus den konditionierten Medien oder aus dem
Ascites gereinigt werden, wobei Verfahren verwendet werden, die in der Fachwelt allgemein
bekannt sind.
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Die vorliegende Erfindung verwendet anti-PADGEM-Antikörper und deren
Antikörper-Homologe zur Herstellung eines Medikaments, welches dazu verwendet werden kann, eine
Gefäßverengung an einer intravaskulären Stelle, die durch Angioplastie, Endarteriektomie oder
Atherektomie behandelt wurde, in einem natürlichen oder synthetischen Gefäßtransplantat, in
arteriovenösen Fisteln, an einer intravaskulären Stelle nach dem Einsetzen von Gefäß-Stents oder
kardiovaskulären Vorrichtungen oder an einer intravaskulären Stelle mit Thromozytenablagerung zu
hemmen. Die anti-PADGEM-Antikörper und die Antikörper-Homologe, die in dieser Erfindung
verwendbar sind, werden in Form einer pharmazeutischen Zusammensetzung verabreicht, welche
eine therapeutisch wirksame Menge des Antikörpers und vorzugsweise einen pharmazeutisch
verwendbaren Träger, wie etwa physiologische Salzlösung, enthält.
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Eine geeignete therapeutische Dosierung für einen anti-PADGEM-Antikörper oder ein
Antikörper-Homolog gemäß dieser Erfindung hängt von Faktoren ab, wie etwa der Halbwertszeit des
speziellen Antikörpers oder Antikörper-Homologs, dem Isotop des Antikörpers oder Antikörper-
Homologs, dem zu behandelnden Zustand, dem Alter, der Empfindlichkeit und Toleranz des
Patienten und anderen solchen Faktoren, die routinemäßig von einem behandelnden Arzt in Betracht
gezogen werden. Geeignete Dosierungen können im Bereich von etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht
des Patienten bis etwa 5 mg/kg liegen und die Dosierung kann in einem Bereich von einmal pro Tag
in einer einzigen Verabreichung bis zu einer konstanten Infusion über mehrere Tage hinweg, in
Abhängigkeit von Faktoren, wie den oben genannten, verabreicht werden. Eine Dosierung von
1 mg/kg für eine einzige Verabreichung war zum Beispiel für das Pavian-Modell des arteriovenösen
Shunts, das in dem weiter unten beschriebenen Beispiel angegeben ist, geeignet.
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Die anti-PADGEM-Antikörper und Antikörper-Homologe, die in dieser Erfindung
verwendbar sind, können dem Patienten auf jede beliebige Weise verabreicht werden, wie etwa intravenös,
intramuskulär, subkutan oder intra-arteriell. Die intravenöse Verabreichung wird bevorzugt.
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Ein Kardiologe kann mit Vorteil das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellte
Medikament verwenden, zum Beispiel unter Gegebenheiten, wo ein Patient unter dem Risiko einer
Gefäßverengung im Anschluß an einen therapeutischen Engriff steht. Monoklonale anti-PADGEM-
Antikörper oder Antikörper-Homologe hievon können vor, während und anschließend an ein
Angioplastie-, Endarteriektomie- oder Atherektomie-Verfahren, an das Einsetzen eines natürlichen
oder synthetischen Gefäßtransplantats, das Setzen von arteriovenösen Fisteln, das Einsetzen eines
Gefäß-Stents oder einer kardiovaskulären Vorrichtung oder einer intravaskulären
Thrombozytenablagerung therapeutisch verabreicht werden. Die Verabreichung der monoklonalen anti-
PADGEM-Antikörper wird die Gefäßverengung im Zusammenhang mit einer Restenose,
Reokklusion und einem Transplantatverschluß in wirksamer Weise inhibieren.
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Zum besseren Verständnis dieser Erfindung ist das folgende Beispiel angegeben. Dieses
Beispiel dient nur Zwecken der Erläuterung und ist nicht zur Einschränkung des Rahmens der
Erfindung in irgendeiner Weise aufgestellt.
BEISPIEL
Inhibierung der Gefäßverengung
bei einem arteriovenösen Shunt-Modell
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Bei der Verwendung eines arteriovenösen Shunt-Modells bei Pavianen haben wir gezeigt, daß
die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge von monoklonalen
anti-PADGEM-Antikörpern oder von Antikörper-Fragmenten überraschend wirksam bei der Hemmung von
Gefäßverengung an einer intravaskulären Stelle in einem Gefäßtransplantat ist.
A. Der Monoklonale Antikörper
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Der monoklonale anti-PADGEM-Antikörper GA6 wurde unter Verwendung von Balb/cJ
Mäusen hergestellt. Die Mäuse wurden monatlich 3 Monate lang mit 12 ug PADGEM immunisiert.
Das PADGEM stammte aus gepoolten humanen Thrombozyten unter Verwendung einer
Affinitätsreinigung. Für die anfängliche Immunisierung wurde PADGEM in komplettem Freunds
Adjuvans emulgiert und für die anschließenden Immunisierungen wurde PADGEM in unvollständigem
Freunds Adjuvans emulgiert. Vier Tage vor der Fusion wurden die Mäuse mit 12 um PADGEM in
Freunds unvollständigem Adjuvans aufgefrischt. Die Hybridome wurden nach Standardmethoden
unter Verwendung von P3X63-Ag8.653 Myelomzellen als Fusionspartner hergestellt (Lerner, 1981
[15]): Die Überstände der Hybridomkultur wurden auf die Bindung von PADGEM-beschichteten
Platten unter Verwendung eines ELISA gescreent und wurden auf die Inhibierung der Haftung von
HL60 Zellen, die sich an PADGEM-beschichtete Platten binden, untersucht. Die mutmaßlich
positiven Zellen in diesen Assays wurden durch begrenzende Verdünnung geklont. Die Antikörper
wurden aus der Ascites-Flüssigkeit unter Einsatz von Protein A Affinitäts-Chromatografie isoliert.
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Der Antikörper GA6 und Fragmente hievon binden an Pavian-Thrombozyten mit hoher
Affinität und inhibieren die Bindung von HL60 Zellen an PADGEM in vitro.
B. Das Transplantat
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Ein ex vivo Dacron-Transplantat wurde an den Innenwänden eines arteriovenösen Shunts
befestigt. Ein solches Transplantat ist thrombogen und ist imstande, Thrombozyten und Fibrin
innerhalb seines Lumens anzureichern. Vor der chirurgischen Einführung des arteriovenösen Shunts
in die Paviane wurde das Dacron-Transplantat in Pavian-Ganzblut nach dem Verfahren von
Sauvage vorgeronnen (Sauvage, 1976 [18]). Eine Nuclear-Bildaufzeichnung mit ¹²³I-markierten
polyklonalen anti-PADGEM-Antikörpern zeigte, daß PADGEM von den innerhalb des
thrombogenen Dacron-Transplantats angereicherten Thrombozyten exprimiert wurde (Palabrica et al., 1989
[19]).
C. Demonstration der In Vivo Antikörper Aktivität
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Wir analysierten die Wechselwirkung zwischen dem auf den Zellmembranen der gebundenen
Thrombozyten exprimierten PADGEM und den anti-PADGEM-Antikörpern unter Verwendung
von radio-markierten Neutrophilen und Monozyten aus dem Wirtspavian.
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Leukozyten vom Pavian-Gesamtblut wurden durch Dichtegradient-Zentrifugierung
hergestellt. Neutrophile und mononukleare Zellen wurden durch Inkubation mit ¹¹¹Indiumoxin (424
uCi) markiert. Die markierten Zellen wurden mit Plasma gewaschen und anschließend neuerlich in
Plasma suspendiert. Die ¹¹¹In-markierten Leukozyten wurden in anästhetisierte Paviane infundiert.
Eine Stunde später wurde der vorgeronnene Shunt in die Paviane eingeführt. Serienmäßige
Vorderansichten des externen Shunts, die unter Verwendung einer Gamma-Kamera Ohio Nuclear
Series 100 erhalten wurden, zeigten, daß sich in Abwesenheit von anti-PADGEM-Antikörpern
Neutrophile und Monozyten in dem Shunt anreicherten. Wenn GA6 Antikörper oder Fragmente
hievon in den Pavian mit einer Dosierung von 1 mg/kg eine Stunde nach der Infusion der
¹¹¹Inmarkierten Leukozyten und einer Minute nach Einsetzen des Dacron-Shunts infundiert wurden,
zeigten die Serienbilder, daß die Anreicherung von Neutrophilen und Monozyten innerhalb des
Shunts unterdrückt wurde (vgl. Fig. 1A und 1B).
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Als ein Vergleichsversuch wurde AC1.2, ein nicht-inhibierender monoklonaler anti-
PADGEM-Antikörper mit GA6 in seiner Wirkung auf die Leukozyten-Anreicherung auf dem
Transplantat verglichen. Die Infusion der AC1.2 Fab'&sub2;-Fragmente (1 mg/kg) in den Pavian hatte
insofern keine Wirkung auf die Leukozyten-Anreicherung in dem Dacron-Transplantat, als 90 und
120 Minuten im Anschluß an die Antikörper-Infusion die Anzahl der gebundenen markierten
Leukozyten innerhalb des experimentiellen Fehlers in Anwesenheit oder Abwesenheit von AC1.2 die
gleiche war. Im Gegensatz zu GA6 inhibierten die AC 1.2 Fab'&sub2;-Fragmente die
Leukozyten-Anreicherung in dem Dacron-Transplantat nicht, wodurch demonstriert wurde, daß nur Antikörper, die
die in vitro Wechselwirkung von Leukozyt/Thrombozyt inhibieren, die Leukozyten-Anreicherung in
vivo inhibieren.
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Die Verwendung von radiomarkierten Thrombozyten zeigte, daß anti-PADGEM-Antikörper
die Anreicherung der Thrombozyten in dem Dacron-Shunt nicht beeinflußten.
Pavian-Thrombozyten wurden mit ¹¹¹In markiert und anschließend in einen Pavian infundiert. Serienmäßige
Vorderansichten des Shunts zeigten, daß die Geschwindigkeit und Menge der Thrombozytenablagerung
im wesentlichen identisch in Anwesenheit und Abwesenheit von infundiertem GA6 Antikörper oder
infundierten Antikörper-Fragmenten war (vgl. Fig. 2).
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Es wurden zusätzliche in vivo Experimente wie oben vorgenommen, mit der Ausnahme, daß
ein radiomarkierter anti-Fibrin-Antikörper auf seine Bindung an das Transplantat überwacht wurde.
Das Fab'Fragment von T2G1s (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Thomas Shabile,
Centocor) wurde mit Technetium-99 m (spezifische Radioaktivität 23mCi/mg) markiert. Der
Antikörper (2mCi) wurde durch die venöse Verbindung des Shunts knapp vor Beginn der
Strömung an der angegebenen Stelle injiziert. GA6 Fab'&sub2; wurde gleichzeitig durch die arterielle
Verbindung während der ersten Minute der Strömung injiziert. Serienmäßige Vorderansichten in
jeweils 2 Minuten wurden von dem Shunt während der Dauer von 90 Minuten unter Verwendung
einer Gamma-Kamera Ohio Nuclear Series 100 gemacht. Es wurde ein Parallel-Loch-Collimator
mit einer mittleren Energie, hoher Auflösung und einem Fenster von 20% verwendet. Die Kinetik
der Aufnahme des Tc-99 m T2G1s Antikörpers durch das Transplantat und den Blut-Pool stammte
aus den Radionuclid-Bildern. Die Aktivität wurde als Zählungen pro Minute ausgedrückt, auf die
injizierte Dosis normalisiert und hinsichtlich der Hintergrundaktivität korrigiert.
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Die Ergebnisse sind in Fig. 4 gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen eine deutliche Abnahme der
Fibrinablagerung, die aus der Behandlung mit dem GA6 Fab'&sub2;-Fragment resultiert.
D. Bewertung des Shunts
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Nach Einführen des Shunts in die Paviane wurde der Blutstrom durch den Shunt mit 100 ml
pro Minute während des Verlaufs des Experiments aufrechterhalten. Im Anschluß an den Zeitraum
des Blutstroms wurden die Shunts histopathologisch bewertet, um die Shunts von Tieren, die mit
Antikörper GA6 oder GA Antikörper-Fragmenten behandelt worden waren, mit den Shunts von
Tieren, die keine Antikörper GA6 oder Antikörper-Fragmente erhalten hatten, zu vergleichen. Der
Shunt wurde entnommen, gewaschen und nach einer Fixierung in 2% Glutaraldehyd wurde der
Shunt in Längsrichtung aufgeschnitten und mit dem Elektronenmikroskop geprüft. Shunts, die aus
Tieren erhalten wurden, die keine Infunsion mit anti-PADGEM-Antikörper oder
Antikörper-Fragmenten erhalten hatten, enthielten beträchtliche Mengen von Fibrin-Gerinnung, Thrombozyten und
Leukozyten. Im Gegensatz dazu enthielten die Shunts, die aus Tieren, die mit
anti-PADGEM-Antikörper oder Antikörper-Fragmenten infundiert worden waren, Thrombozyten, jedoch war die
Menge an Fibrin-Gerinnung und Leukozyten, die mit dem Shunt assoziiert waren, sehr deutlich
herabgesetzt (vgl. Fig. 3).
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Das Shunt-Modell in den Pavianen demonstrierte, daß anti-PADGEM-Antikörper keine
Wirkung auf die Anreicherung der Thrombozyten innerhalb des Shunts ausüben. Jedoch zeigt die
mikroskopische Bewertung des Shunts in überraschender Weise, daß die anti-PADGEM-Antikörper
oder die Fragmente hievon die Entzündungs- und thrombotische Reaktion innerhalb eines
Blutgefäßes im Anschluß an die Ablagerung der Thrombozyten deutlich reduzieren können.
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Das vorhergehende Beispiel demonstriert daher in unerwarteter Weise, daß anti-PADGEM-
Antikörper oder Antikörper-Fragmente dazu verwendet werden können, die Gefäßverengung an
einer intravaskulären Stelle, die durch Angioplastie, Endarteriektomie oder Atherektomie behandelt
worden war, in natürlichen und synthetischen Gefäßtransplantaten, in arteriovenösen Fisteln, an
intravaskulären Stellen im Anschluß an den Einsatz von Gefäß-Stents oder kardiovaskulären
Vorrichtungen und an intravaskulären Stellen mit Thrombozytenablagerung hemmen können.
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Es ist eine große Vielzahl von anti-PADGEM-Antikörpern und Antikörper-Homologen
hievon, die an PADGEM binden, zusätzlich zu den speziell in dem vorhergehenden Beispiel genannten
Antikörper für das erfindungsgemäße Verfahren auch verwendbar. Im Hinblick auf die Lehren
hierin sind alle solche Ausführungsformen speziell in Betracht gezogen und im Rahmen der
Erfindung, wie er durch die anschließenden Ansprüche definiert ist, eingeschlossen.
ZITIERTE VERÖFFENTLICHUNGEN
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