DE69227589T2

DE69227589T2 - Ecdysteroid-abhängige gen regulierung in säugetier-zellen

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Publication number: DE69227589T2
Application number: DE69227589T
Authority: DE
Inventors: Paul J. Burlingame California 94010 Godowski
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1991-08-08
Filing date: 1992-08-03
Publication date: 1999-04-08
Anticipated expiration: 2012-08-04
Also published as: DE69227589D1; JPH07501928A; WO1993003162A1; EP0598011A1; EP0598011B1; ES2123569T3; ATE173295T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von spezifischen Ecdysteroiden in Säugerzellen, um die Genexpression heterologer Gene unter der Kontrolle bindender Ecdysteroid-Rezeptorproteine zu induzieren.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Steroidhormon-Rezeptor-Superfamilie repräsentiert eine evolutionär konservierte Gruppe von Proteinen, welche Entwicklungsprozesse und metabolische Prozesse in erster Linie durch ihre Funktion als Liganden-abhängige Transkriptionsfaktoren beeinflussen (hinsichtlich eines Überblicks siehe K. R. Yamamoto, Annu. Rev. Genet, 19, 209 [1985]; M. Beato, Cell 56, 335 [1989]; R. M. Evans, Science 240, 889 [1988]). Eine Strukturanalyse von Rezeptorproteinen hat Domänen dieser Proteine identifiziert, deren Funktion die Bindung von DNA oder Ligand und die Erhöhung der Transkription ist (S. Rusconi und K. R. Yamamoto, EM80 J. 6, 1309 [1987]; P. J. Godowski, D. Picard und K. R. Yamamoto, Science 241, 812 [1988]; S. M. Hollenberg und R. M. Evans, Cell 55, 899 [1988]); N. J. G. Webster, S. Green, J. R. Jin und P. Chambon, Cell 54, 199 [1988]; Ligandenbindung ist für die Wechselwirkung einiger Rezeptoren mit ihren zugehörigen Antwortselementen erforderlich (P. B. Becker et al., Nature 324, 686 [1988]) und könnte auch das Vermögen zur Dimerisierung und zur transkriptionalen Aktivierung kontrollieren (S. Y. Tsai et al., Cell 55, 361 [1988]); V. Kumar und P. Chambon, Cell 55, 145 [1988]).
Die Fähigkeit von Transkriptionsfaktoren zur Funktion in heterologen Spezies hat ein System zur Verfügung gestellt, um die funktionellen Domänen dieses Faktors zu analysieren, und einen neuen Mechanismus, um die Expression heterologer Gene zu steuern (A. J. Courey und R. Tjian, Cell 55, 887 [1988); A. J. Courey, D. A. Holtzman, S. P. Jackson und R. Tjian, Cell 59, 827 [1989]). Es ist gezeigt worden, daß Säuger-Steroidhormon-Rezeptoren bei Expression in Hefe (D. Metzger, J. H. White und P. Chambon, Nature 334, 31 [1988]); D. Picard, M. Schena und K. R. Yamamoto, Gene 86, 257; M. Schena und K. R. Yamamoto, Science 241, 965 [1988]) und Drosophila-Zellen funktionieren.
Die Ecdysteroide sind Steroide, deren Wirkung durch einen intrazellulären Rezeptor vermittelt wird, und schließen die Häutungshormone von Insekten ein. Das Ecdysteroid-Hormon 20-OH-Ecdyson, auch als β-Ecdyson bekannt, steuert die zeitliche Koordination der Entwicklung bei vielen Insekten. Siehe allgemein Koolman (Hrsg.), Ecdysone: From Chemistry to Mode of Action, Thieme Medical Pub., N. Y. (1989). Der generische Begriff "Ecdyson" wird häufig als Abkürzung für 20-OH-Ecdyson verwendet. Pulse oder Zunahmen und Abnahmen der Ecdyson- Konzentration im Verlauf eines kurzen Zeitraums bei der Insektenentwicklung werden in verschiedenen Stadien der Drosophila-Entwicklung beobachtet.
Diese Stadien schließen die Embryogenese, drei Larvenstadien und zwei Puppenstadien ein. Das letzte Puppenstadium endet mit der Bildung der reifen Fliege. Eine untersuchte Wirkung von Ecdyson auf die Entwicklung ist diejenige, welche aus einem Puls am Ende des dritten oder letzten Larvenstadiums resultiert. Dieser Puls induziert den Beginn der Metamorphose der Larve zur reifen Fliege. Bestimmte Gewebe, Imago-Gewebe genannt, werden induziert, damit sie mit ihrer Bildung reifer Strukturen wie Augen, Flügel und Beine zu beginnen.
Während der Lanrenstadien der Entwicklung entwickeln sich Polyten- Riesenchromosomen in den Nicht-Imago-Larvengeweben. Diese kabelähnlichen Chromosomen bestehen aus Aggregaten, die bis zu etwa 2000 Chromosomenkopien umfassen. Diese chromosomalen Aggregate sind äußerst nützlich, da sie das Mittel bieten, wodurch die Position eines gegebenen Gens innerhalb eines Chromosoms mit einem sehr hohen Auflösungsgrad bestimmt werden kann, um mehrere Größenordnungen höher als typischerweise für normale Chromosomen möglich.
Ein "Puff" in den Polyten-Chromosomen ist eine lokalisierte Expansion oder Schwellung dieser kabelähnlichen Polyten-Chromosom-Aggregate, welche mit der Transkription eines Gens am Ort des Puffs assoziiert ist. Ein Puff ist deshalb ein Indikator der Transkription eines Gens, das an einer bestimmten Position im Chromosom lokalisiert ist.
Es wurde ein genregulatorisches Modell vorgeschlagen, um den zeitlichen Ablauf der Polyten-Puffs zu erklären, die durch den Ecdyson-Puls induziert werden, welcher die Metamorphose von der Larve zum reifen Exemplar veranlaßt. Siehe Ashburner et al., "On the Temporal Control of Puffing Activity in Polytene Chromosomes", Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 38 : 655-662 (1974). Dieses Modell vertrat die These, daß Ecdyson · reversibel mit einem Rezeptorprotein, dem Ecdyson-Rezeptor, wechselwirkt, um einen Ecdyson-Rezeptor-Komplex zu bilden. Dieser Komplex würde direkt die Transkription eines kleinen Satzes von "frühen" Genen induzieren, welche für ein halbes Dutzend sofort induzierter "früher" Puffs verantwortlich sind. Es wird postuliert, daß diese frühen Gene für regulatorische Proteine kodieren, welche die Transkription eines zweiten Satzes von "späten" Genen induzieren, welche für die Bildung der "späten" Puffs verantwortlich sind, die nach den frühen Puffs auftreten. Das Modell definiert so eine genregulatorische Hierarchie von drei Stufen, wobei sich das Ecdyson-Rezeptor-Gen in der ersten Stufe befindet, die frühen Gene in der zweiten Stufe und die späten Gene in der dritten. Obwohl dieses Modell von dem Puff-Muster abgeleitet wurde, das in einem Nicht-Imago-Gewebe beobachtet wurde, könnten ähnliche genregulatorische Hierarchien auch die metamorphischen Veränderungen bei der Entwicklung der Imago-Gewebe bestimmen, welche ebenfalls Ziele von Ecdyson sind, sowie die Veränderungen in der Gewebeentwicklung, welche durch die Ecdyson-Pulse induziert werden, die in anderen Entwicklungsstufen auftreten.
Es wurden verschiedene Strukturdaten von Steroid- und anderen lipophilen Rezeptorproteinen von Wirbeltieren erhalten. Eine "Superfamilie" solcher Rezeptoren wurde auf der Basis ihrer strukturellen Ähnlichkeiten definiert. Siehe Evans "The Steroid and Thyroid Hormone Receptor Superfamily", Science 240 : 889-895 (1988); Green und Chambon, "Nuclear Receptors Enhance Our Understanding of Transcription Regulation", Trends in Genetics 4 : 309-314 (1988). Soweit deren Funktionen bestimmt wurden, regulieren diese Rezeptoren, komplexiert mit ihren jeweiligen Hormonen, die Transkription ihrer primären Zielgene, wie für den Ecdyson-Rezeptor im obigen Modell vorgeschlagen.
Ecdysteroid-Rezeptoren von reifen Weibchen von Drosophila melanogaster wurden von Handier et al. Mol. Cell Endo 63 : 103-9, 1989, beschrieben. Ecdysteroid- Rezeptoren für die Schmeißfliege Calliphora vicina wurden von Lehmann et al., Eur. J. Biochem. 181 : 577-82, 1989, charakterisiert. Die Isolierung von 20- Hydroxyecdyson aus Vitex stricken (ein ostafrikanisches Kraut) wird in JP 1135794 beschrieben. Der Ecdysteron-Gehalt des Kulturmediums von Drosophila- Speicheldrüsen wurde in SU 1130605 mitgeteilt. Muristeron, extrahiert aus den Samen von Faladana-Pflanzen und als biologisches Insektizid eingesetzt, wird im US-Patent 3,828,082 beschrieben. Die Synthese von Ecdyson wird im US-Patent 3,354,154 beschrieben.
Ecdysteroid-Analoga können von Pflanzen produziert werden, um die Entwicklung von Insekten zu stören. Ein von Pflanzen produziertes Ecdysteroid- Analogon ist Meriston A. Muristeron oder Muristeron A (Fig. 7, Verbindung IV) besitzt ein Molekulargewicht von 496640 Dalton, eine Formel C&sub2;&sub7;H&sub4;&sub4;O&sub8; und den CHCD-Namen 2, 3, 5, 11, 14, 20, 22-Heptahydroxy-7-cholesten-6-on (Cononica, L., et al., Phytochemistry 14: 525, 1975). Es ist ein Bestandteil der Pflanze Ipomoea calonyction und zeigt eine hohe Insektenhäutungsaktivität. Es wird angenommen, daß es die Pflanze durch Störung der Insektenentwicklung im Larvenstadium schützt (Trematerra et al., Bollettino Zool. Agr. Bachic 18: 87-93, [1986]). Es wurde gezeigt, daß Muristeron A Ecdysteroidaktivität in Insekten besitzt, beispielsweise, um die Degeneration der Speicheldrüse der Zecke zu veranlassen (Lindsay et al., J. Insect. Physiol. 34: 351-360, [1988]). Muristeron A-Rezeptor-Komplexe sind für eine Dissoziation in Hochsalzpuffern nicht so anfällig wie andere Ecdysteroid-Rezeptor- Komplexe und diese Affinität ermöglichte die Verwendung von radioaktiv markiertem Muristeron A, um den Ecdysteroid-Rezeptor während der Chromatographie zu verfolgen (Landon et al., J. Biol. Chem. 263: 4693-4697, [1988]).
Viele medizinisch und kommerziell bedeutende Proteine können in verwendbarer Form durch gentechnisch manipulierte Bakterien erzeugt werden. Es werden jedoch viele exprimierte Proteine in Bakterien inkorrekt prozessiert und werden vorzugsweise von gentechnisch manipulierten eukaryotischen Zellen erzeugt. Typischerweise werden Hefezellen oder Gewebekulturzellen von Säugern eingesetzt. Da beobachtet wurde, daß die Proteinprozessierung fremder Proteine in Hefezellen ebenfalls häufig ungenügend ist, konzentrierte sich die Hauptaufmerksamkeit auf kultivierte Säugerzellen zur Proteinproduktion. Es ist Allgemeingut, daß die Produktion großer Mengen fremder Proteine die Gesundheit dieser Zellen beeinträchtigt, was die Ausbeute des gewünschten Proteins nachteilig beeinflussen kann. Dieses Problem kann teilweise umgangen werden, indem ein induzierbares Expressionssystem eingesetzt wird. In einem solchen System werden die Zellen so manipuliert, daß sie das fremde Protein nicht exprimieren, und somit ihre Gesundheit nicht beeinträchtigt ist, bis ein Induktionsmittel dem Wachstumsmedium zugegeben wird. Auf diese Weise können große Mengen gesunder Zellen erzeugt und dann induziert werden, um große Mengen des fremden Proteins zu erzeugen. Unglücklicherweise beeinträchtigen in den gegenwärtig verfügbaren Systemen diese Induktionsmittel selbst, z. B. Metallionen oder hohe Temperatur, die Zellen und verringern so wiederum die Ausbeute des gewünschten fremden Proteins, das die Zellen produzieren. Es besteht deshalb ein Bedarf für die Entwicklung unschädlicher induzierender Faktoren zur effizienten Produktion rekombinanter Proteine. Solche unschädlichen Faktoren könnten sich auch als unschätzbar für eine Humantherapie erweisen, wenn das Individuum unter mangelnder Fähigkeit zur Produktion bestimmter Proteine leidet. Durch Verwendung von Methoden, die denjenigen zur Produktion von Proteinen in kultivierten Zellen ähnlich sind, könnten solche unschädlichen Faktoren zur Induktion der Synthese des benötigten Proteins eingesetzt werden, um sowohl das Timing als auch die Menge des in dem betroffenen Individuum produzierten Proteins zu steuern. Deshalb besteht Bedarf für ein induzierbares Expressionssystem sowohl in Säugerzellkultur als auch in Säugern an sich.
Die Hormone, welche mit Mitgliedern der Steroid-Rezeptor-Superfamilie aus Säugern oder anderen Wirbeltieren Komplexe bilden, sind unwahrscheinliche Kandidaten für solche unschädlichen Faktoren, und es wurde auch nicht festgestellt, daß sie die Anforderungen an die Eigenschaften solcher Faktoren erfüllen, da Säugerzellen diese Rezeptoren oder hochhomologe Proteine enthalten, welche die Expression vieler Zielgene in Anwesenheit des jeweiligen Hormons ändern würden und dadurch die Wirtszellen beeinträchtigen. Aus diesen und anderen Gründen war die Entwicklung eines alternativen Steroid-Rezeptor-Systems ein Ziel von Forschern. Unglücklicherweise waren die Anstrengungen trotz beträchtlichen Einsatzes von Resourcen nicht erfolgreich. Die Abwesenheit von Informationen über die Struktur, Funktion und Molekularbiologie von Nicht-Säuger-Steroidrezeptoren hat das Vermögen zur Produktion solcher Produkte signifikant behindert. Seit kurzem erlaubt die Isolierung und Charakterisierung von Drosophila DHR23α-DNA, welche eine Partialsequenz des DHR23α-Polypeptids enthielt, ein Mitglied der Steroidhormon- Rezeptor-Superfamilie, das vorher im Labor von Dr. David Hogness (W. Seegraves, Doktorarbeit, Stanford University [1988]) identifiziert wurde, die Isolierung der DNA- Sequenz, die für das DHR23α kodiert. Diese isolierte DNA-Sequenz erlaubt die Konstruktion von Expressionssystemen, welche die für den DHR23α-Ecdysteroid- Rezeptor kodierende DNA inkorporiert haben.
Zusammengefaßt, die Insekten-Steroidhormone und deren Rezeptoren, z. B. die Ecdysteroide, sind eine potentielle Quelle von Material zur Entwicklung unschädlicher Steroid-Rezeptor-Systeme zur Verwendung in Säugerzellkulturen und in Säugern selbst. Es ist jedoch von keinem Ecdysteroid eine Funktion zur Induktion der Aktivität eines Ecdysteroid-Rezeptors in einer Säugerzelle gezeigt worden. Zur Entwicklung eines Systems, das auf einem Insektenhormon-Rezeptor-System basiert, besteht daher Bedarf für ein Ecdysteroid-Hormon oder Hormon-Analogon, welches den Ecdysteroid-Rezeptor in Säugerzellen induziert, um diejenigen Gene, die unter die Kontrolle des Ecdysteroid-Rezeptors gestellt sind, zu exprimieren.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wird von mir gezeigt, daß DHR23α, ein Drosophila-Steroid-Rezeptor- Homolog, in kultivierten Säugerzellen als Ecdysteroid-abhängiger Transkriptionsfaktor dienen kann, wenn es durch eine spezifische Gruppe von Ecdysteroiden, welche Muristeron A einschließt, induziert wird. Muristeron A und verwandte Ecdysteroide, denen eine 25-Hydroxylgruppe fehlt, werden in Säugerzellen die Expression von DNA-Sequenzen unter der transkriptionalen Kontrolle von DHR23α induzieren. Die induzierbare DHR23α-Aktivität wurde durch keines der getesteten Säuger-Steroidhormone induziert. Die DNA-Bindungs- und Transaktivierungsaktivitäten von viralen, Säuger- oder bakteriellen Proteinen wurden bei Fusion mit der Liganden-bindenden DHR23α-Domäne Ecdysteroid-abhängig gemacht. Dieses System ist nützlich zur selektiven Regulation der Expression endogener oder heterologer Gene in Säugerzellen.

BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Fig. 1. (A) Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des DHR23αcDNA-Klons (Seq.-ID.-Nr. 1). Die Zahlen auf der linken und rechten Seite zeigen Nukleotid- bzw. Aminosäurereste an. Die konservierten Aminosäuren, die der mutmaßlichen DNA-bindenden Domäne entsprechen, sind unterstrichen. (B) Schematischer Vergleich des Drosophila-DHR23α-Proteins mit dem Human- Schilddrüsenhormon-Rezeptor (hTRβ), dem Human-Vitamin D3-Rezeptor (hVDR) und dem Human-Retinsäure-Rezeptor (hRARα). Die Aminosäurereste werden durch Zahlen oberhalb der Boxen angezeigt. Der Bereich von DHR23α, der als "DNA" gekennzeichnet ist, wird mit den DNA-bindenden Domänen der anderen Rezeptoren verglichen. Der als "Ligand" gekennzeichnete Bereich von DHR23α enthält den Bereich der höchsten Homologie zu den Liganden-bindenden Domänen der anderen Rezeptoren. Der Prozentsatz der Identität in diesen Bereichen wird durch die Zahlen innerhalb der Boxen angezeigt. Der als "QLQP" gekennzeichnete Bereich ist reich an den Aminosäuren (Q), Leucin (L) und Prolin (P).
Fig. 2. Spezifische Ecdysteroide sind Agonisten für den DHR23α-Rezeptor in Säugerzellen. Human-293-Zellen wurden mit 2,5 ug des Expressionsplasmids pRSV. DHR23α oder des Stamm-Expressionsplasmids pRSV (Kontrolle) und 0,5 ug des Reporterplasmids pEc4M "CO (EcRE) oder pG4M "GO (GRE) kotransfiziert. Als Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden 0,5 ug des Kontrollplasmids pRSV.hGH in die Transfektionsmischung eingeschlossen. Nach der Transfektion wurden die Zellen ohne (-) oder mit α-Ecdyson (alpha), 20-OH-Ecdyson (20-OH), Polypodin B (ppB), Ponasteron A (ponA) oder Muristeron A (murA) behandelt. CAT-Extrakte wurden 48 Stunden nach der Transfektion gewonnen und einem Assay unterworfen. Die Werte wurden auf die Expression von hGH normalisiert und die Durchschnittswerte von drei unabhängigen Experimenten sind gezeigt. Der " Induktionsfaktor" repräsentiert das Expressionsniveau des Reportergens in Zellen, die mit Hormon inkubiert wurden, geteilt durch die Expression dieses Reportergens in Extrakten aus Zellen, die ohne hinzugefügten Liganden inkubiert wurden.
Fig. 3. Wirkung von Säugerhormonen auf die Aktivität von DHR23α. Zellen wurden mit dem DHR23α-Expressionsvektor und dem Ec&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO-Reportergen transfiziert und ohne die (-) oder mit den folgenden Hormone(n) (1 uM) behandelt:
Muristeron A (mur A), Dexamethason (Dex), 17β-Estradiol (E2), Aldosteron (Aldo), Corticosteron (Cort), Hydroxycorticosteron (OH-Cort), Schilddrüsenhormon (T3), Promegeston (Promeg) oder 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 (VD3). Die Reportergen- Aktivität wurde bestimmt wie in Fig. 2 beschrieben.
Fig. 4. Schematische Darstellung und Expression von Rezeptorproteinen. (A) Die Rezeptorkonstrukte sind entsprechend einer dreiteiligen Nomenklatur bezeichnet, welche den Ursprung ihrer N-terminalen Transaktivierungs-, DNA- bindenden und Liganden-bindenden Domänen angibt. "G" und "Ec" beziehen sich auf den Glucocorticoid-Rezeptor bzw. DHR23α. "E" bezieht sich auf ein Derivat der DNA-bindenden Domäne des Ratten-Glucocorticoid-Rezeptors mit zwei Aminosäuresubstitutionen (G458E, S459 G), welche die DNA-Bindungsspezifität in diejenige des Estrogen-Rezeptors überführen. "X" (ausgefülltes Kästchen) zeigt die DNA-bindende Domäne (Aminosäuren 1-87) des Escherichia coli-LexA-Proteins an. "V" (schattiertes Kästchen) bezeichnet ein Derivat der N-terminalen GR-Domäne, worin die Aminosäuren 153-406 durch die transkriptionale Aktivierungsdomäne des HSV-VP16-Proteins (Aminosäuren 411-490) ersetzt sind. GGEc wurde konstruiert durch Ersatz der Liganden-bindenden Domäne von GGG (Aminosäuren 528-795) durch die Liganden-bindende Domäne von DHR23α (Aminosäuren 329-878). Auf ähnliche Weise wurde zur Konstruktion von GXEc die Liganden-bindende Domäne von GXG durch die Liganden-bindende DHR23α-Domäne ersetzt. (B) Akkumulierung von Rezeptorproteinen in transfizierten Zellen. Gesamtzellextrakte wurden 48 Stunden nach der Transfektion mit Rezeptor-Expressionsplasmiden hergestellt, welche für die folgenden Fusionsproteine kodieren. Spur 1, EcEcEc; Spur 2, GGG; Spur 3, GGEc; Spur 4, VGEc; Spur 5, G"E"G; Spur 6, G"E"Ec; Spur 7, GXG; Spur 8, GXEc; Spur 9, VXEc. Die Blots wurden mit dem monoklonalen Antikörper BugR2 umgesetzt, weicher ein Epitop in der N-terminalen Domäne des Ratten-Glucocorticoid-Rezeptors erkennt, und dann mit einem Schaf-Antiserum gegen Maus-Antikörper, das mit Meerrettich-Peroxidase gekoppelt war. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker sind angezeigt.
Fig. 5. RNase-Schutz-Analyse von Transkripten, die durch Rezeptorproteine induziert wurden. Gesamt-RNA wurde aus Zellen 48 Stunden nach der Transfektion mit Expressionsplasmiden, die entweder für DHR23α (EcEcEc), GGG oder GGEc und für das Reportergen G&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO kodieren, hergestellt. Die Position der geschützten Bande von 377 Basen für G&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO und der geschützten Bande des internen Kontrollgens (exprimiert von einem CMV-Enhancer/Promotor- Konstrukt) von 294 Basen wird durch den ausgefüllten bzw. offenen Pfeil angezeigt.
Fig. 6. Induktion von Estrogen-Rezeptoren (EREn) durch chimäre Rezeptoren. Die Zellen wurden mit Expressionsplasmiden transfiziert, die entweder für DHR23α (EcEcEc), G"E"G oder G"E"Ec und für E&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO, enthaltend 4 EREn fusioniert mit dem MTV-Promotor, kodieren. Die Zellen wurden 48 Stunden lang ohne (-) oder mit Muristeron A (M) oder Dexamethason (D) inkubiert.
Fig. 7. Die chemische Struktur der Ecdysteroide: (I) Ecdysteroid- Benennungssystem, R&sub1; und R&sub2; sind Stellen einer Substitution durch eine elektronegative Gruppe; (II) Ecdyson; (III) 20-OH-Ecdyson (β-Ecdyson); (IV) Ponasteron A; (V) Muristeron A; (VI) 5-Dehydroxymuristeron A; (VII) und 11- Dehydroxymuristeron A.

BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN

Steroid-Rezeptoren sind Mitglieder einer großen Familie von Transkriptionsfaktoren, deren Aktivität durch die Bindung ihres zugehörigen Steroid-Liganden streng reguliert wird. Diese Liganden-abhängigen Transkriptionsfaktoren können genutzt werden, um die regulierte Expression von heterologen Genen in Säugerzellen zu erreichen. Jedoch ist die Brauchbarkeit dieser Systeme bei transgenen Tieren durch den Hintergrund endogener Steroide und deren Rezeptoren limitiert. Die vorliegende Erfindung demonstriert, daß ein Analogon der Insekten-Ecdysteroide, Muristeron A, die Genexpression in Säugerzellen unter Verwendung des Insekten-Steroid- Rezeptors DHR23α und seiner DNA-bindenden DNA induzieren wird.
In der vorliegenden Erfindung beabsichtigte ich ein System zur spezifischen Regulation heterologer Gene in Säugerzellen in Gewebekultur und in transgenen Tieren zu entwickeln. Ein solches System bietet eine wirksame Methode zur Regulation der Synthese der Produkte von heterologen Genen. Systeme, welche das Vermögen von Säuger-Steroidhormon-Rezeptoren zur Funktion als Liganden- abhängige Transkriptionsfaktoren ausnützen, haben sich zur Regulation der Expression von heterologen Genen in Säugerzellen als geeignet erwiesen (D. I. Israel und R. J. Kaufman, Nuc. Acids Res. 17, 4589 [1989]). Die Anwendungsmöglichkeiten dieser Systeme in kultivierten Zellen oder transgenen Tieren sind jedoch durch den Hintergrund endogener Steroid-Rezeptoren und deren Liganden beschränkt. In der vorliegenden Erfindung zeige ich, daß das Drosophila DHR23α-Protein, ein Mitglied der Steroidhormon-Rezeptor-Superfamilie, das zuvor 1988 von W. Seegraves an der Stanford Universität (W. Seegraves, Doktorarbeit, Stanford University [1988]) identifiziert wurde, als Liganden-abhängiger Transkriptionsfaktor in Säugerzellen funktionieren kann, wenn er durch spezifische Ecdysteroide wie DHR23α induziert wird. Die Aktivität von DHR23α wird nach der Verabreichung bestimmter Ecdysteroide induziert, aber von keinem der getesteten Säugerhormone. Eine neue Zielgenspezifität wurde erzielt durch Verwendung chimärer Rezeptoren, welche die Liganden-bindenden DHR23α-Domänen fusioniert an heterologe DNA-bindende Domänen enthalten. Schließlich konnte die Aktivität dieser chimären Proteine durch Einschluß einer potenten viralen Transaktivierungsdomäne erhöht werden.
Oligonukleotid-Sonden, basierend auf der partiellen DHR23-Sequenz (W. Seegraves, Doktorarbeit, Stanford University [1988]) wurden verwendet, um eine cDNA-Bank, hergestellt von Drosophila-Larven im frühen Puppenstadium, zu screenen. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des DHR23α-Klons ist in Fig. 1A dargestellt. Der Bereich höchster Homologie zwischen DHR23α und anderen Mitgliedern der Steroid-Rezeptor-Superfamilie ist in einem Cystein-reichen Bereich (Reste 264-329) zu finden, welcher der DNA-bindenden Domäne entspricht (Fig. 1 B). Die mutmaßliche Liganden-bindende Domäne hat eine begrenzte Homologie mit Mitgliedern der Retinsäure- und Schilddrüsenhormon-Rezeptoren und dem Vitamin D-Rezeptor gemeinsam. Die N-terminale Domäne (Reste 1-263) hat keine signifikante Homologie mit irgendeinem Mitglied der Steroid-Rezeptor-Superfamilie gemeinsam. Ich identifizierte auch eine zweite Form des Proteins, DHR23β, welche durch unterschiedliches Splicing zu entstehen scheint. DHR23β ist mit DHR23α in den DNA- und Liganden-bindenden Domänen identisch, enthält jedoch eine nicht verwandte N-terminale Domäne von 234 Aminosäuren.
Es ist berichtet worden, daß DHR23α die Transkription von Genen, die Ecdyson-Antwortelemente (EcRE) enthalten, in Drosophila-Gewebekulturzellen reguliert, die mit 20-OH-Ecdyson behandelt wurden (M. Koelle, Script, das bei einem Seminar am 2. Oktober 1989 bei Genentech, Inc., So. San Francisco, CA, präsentiert wurde). Ich stellte fest, ob DHR23α in mit Ecdysteroiden behandelten Säugerzellen funktionieren könnte, um die Transkription eines Reportergens zu erhöhen, das EcRE verknüpft mit dem Maus-Brusttumorvirus (MTV)-Promotor und dem Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gen enthält. Human-293-Zellen wurden mit einem Expressionsvektor auf RSV-Basis kotransfiziert, der für DHR23α und das Reportergen Ec&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO kodiert, welches 4 Kopien eines Ecdyson- Antwortelements (EcRE) von dem Drosophila HSP27-Promotor (G. Riddihough und H. R. B. Pelham, EMBO J. 6, 3729 (1987)) verknüpft mit einem MTV-Promotor-CAT- Konstrukt enthält. Die CAT-Aktivität wurde bestimmt in Extrakten von Zellen, die mit den oder ohne die Ecdysteroide(n) α- oder 20-OH-Ecdyson, Polypodin B, Ponasteron A oder Muristeron A inkubiert worden waren. Weder α-Ecdyson, 20-OH- Ecdyson noch Polypodin B wirkten als Agonisten für DHR23α in Säugerzellen. Im Gegensatz dazu wurde die Expression des Reportergens in Zellen, die mit Muristeron A behandelt worden waren, deutlich erhöht und in geringerem Maße bei Ponasteron A (Fig. 2). Diese Induktion war abhängig von der Anwesenheit eines EcRE im Reportergen, da DHR23α die Expression von Reportergenen, die Bindungsstellen für entweder den Glucocorticoid-Rezeptor (GRE, Fig. 2) oder für den Estrogen-Rezeptor (ERE, Fig. 6) enthielten, nicht regulierte. So wirkt in Säugerzellen DHR23α in Ecdysteroid-abhängiger Weise, um selektiv die Expression eines EcRE-enthaltenden Reportergens zu stimulieren.
Es ist unklar, warum 20-OH-Ecdyson und Polypodin B, welche in Drosophila- Zellinien Agonisten darstellen, nicht in der Lage sind, DHR23α in Säugerzellen zu aktivieren. Transportverlust, Inaktivierung oder nicht-spezifische Bindung könnten für die fehlende Aktivität in Säugerzellen verantwortlich sein. Es wurde jedoch gezeigt, daß die spezifischen Aktivitäten und relativen Wirksamkeiten von Liganden für ihre Rezeptoren sich manchmal unterscheiden, wenn dieser Rezeptor in einem heterologen System exprimiert wird. Beispielsweise ist bekannt, daß die Aktivitäten von Glucocorticoid-Liganden für ihren Rezeptor in Hefe und in Säugerzellen signifikant differieren. Überraschenderweise wirken nur spezifische Derivate von Ecdyson als Agonisten und diese haben das verwandte Merkmal der fehlenden 25- Hydroxylgruppe gemeinsam. Die einzige Strukturdifferenz zwischen dem schwachen Agonisten Ponasteron A und 20-OH-Ecdyson, welches inaktiv ist, besteht darin, daß dem ersteren eine Hydroxylgruppe an Position 25 fehlt. Noch überraschender und unerwarteter ist, daß sich der starke Agonist Muristeron von Ponasteron A nur durch die Addition von Hydroxylgruppen an den Positionen 5 und 11 unterscheidet. Deshalb fehlt überraschenderweise den Ecdysteroid-lnduktoren von DHR23αregulierter Expression in Säugerzellen eine Hydroxylgruppe an Position 25. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Ecdysteroid eine Hydroxylgruppe an den Positionen 5 oder 11 enthalten. Alternativ steht zu erwarten, daß jede elektronegative Gruppe, die an den Positionen 5 und/oder 11 von Muristeron substituiert ist, zu einer Aktivierung von Ecdysteroid-Rezeptoren führen würde. Unter den elektronegativen Gruppen, welche an den Positionen 5 und 11 von Muristeron substituiert sein können, sind Hydroxyl, Keton, Sulfhydryl, Nitrat, Nitrit und Halogene, insbesondere Fluor, Brom und Chlor. Der aktivste Induktor von DHR23α-regulierter Expression ist Muristeron A, welches sowohl an der 5- als auch an der 11-Position Hydroxylgruppen enthält. Der CHCD-Name von Muristeron A ist 2, 3, 5, 11, 14, 20, 22- Heptahydroxy-7-cholesten-6-on; für 5-Dehydroxymuristeron A ist er 2, 3, 11, 14, 20, 22- Sepfahydroxy-7-cholesten-6-on; und für 11-Dehydroxymuristeron A 2, 3, 5, 14, 20, 22- Septahydroxy-7-cholesten-6-on.
In der vorliegenden Erfindung ist der Ecdysteroid-Rezeptor definiert als jeder Insekten-Steroid-Rezeptor, der eine physiologisch signifikante Bindungsaffinität für Muristeron A aufweist oder für ein Derivat von Muristeron A, welches eine elektronegative Substitution an den Positionen 5 oder 11 enthält. Unter solchen physiologisch signifikanten Rezeptoren sind der Ecdyson-Rezeptor und DHR23X. Eine physiologisch signifikante Bindungsaffinität ist eine effektive Bindung bei einer Konzentration von 10&supmin;&sup6; M oder weniger. In der vorliegenden Erfindung ist Ecdysteroid definiert als jedes Steroid mit fehlendem 25-OH, das eine physiologisch effektive Affinität für einen Ecdysteroid-Rezeptor aufweist.
Zur Feststellung, ob Säuger-Steroidhormone als Agonisten für DHR23α wirken könnten, untersuchte ich repräsentative Mitglieder von Hormonen, die bekanntermaßen Säuger-Steroid-Rezeptoren aktivieren. Keines dieser Hormone konnte als Agonist für DHR23α wirken (Fig. 3). Diese Ergebnisse legen nahe, daß die DHR23-Aktivität in Säugerzellen selektiv durch Ecdysteroide reguliert wird. Deshalb werden Säugerzellen, welche Gene unter der Kontrolle von DHR23α enthalten, durch Muristeron A und nicht durch die getesteten Säuger- Steroidhormone induziert werden.

Ecdysteroid-Regulierung von Säuger-, viralen und bakteriellen DNA-bindenden oder Transaktivierungs-Domänen

Ein interessantes Merkmal von Steroid-Hormon-Rezeptoren ist das Ausmaß, in dem individuelle Domänen in Kombination mit Domänen heterologer Proteine funktionieren können. Die DNA-Bindungsspezifität eines Rezeptors kann geändert werden, indem dessen DNA-bindende Domäne durch diejenige von anderen Steroid- Rezeptoren (S. Green und P. Chambon, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 325, 75 [1987]) oder von DNA-bindenden Proteinen von Bakterien (P. J. Godowski, D. Picard und K. R. Yamamoto, Science 241, 812 [1988]) oder Hefe (N. J. G. Green, S. Green, J. R. Kin und P. Chambon, Cell 54, 199 [1988]) ersetzt wird. In einigen Fällen werden die Aktivitäten heterologer Proteine hormonreguliert, wenn dieses Protein mit einer Liganden-bindenden Steroid-Rezeptor-Domäne fusioniert wird. Beispielsweise können die Transaktivierungs- oder Transformationsaktivitäten von E1A, c-myc oder c-fos durch Fusion einer Liganden-bindenden Steroid-Rezeptor-Domäne unter hormonelle Kontrolle gebracht werden (M. Eilers, D. Picard, K. R. Yamamoto und J. M. Bishop, Nature 340, 66 [1989]; D. Picard, S. J. Salser und K. R. Yamamoto, Cell 54, 1073 [1988]; G. Superti-Furga, G. Bergers, D. Picard und M. Busslinger, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 5114 [1991]).
Ich entschloß mich aus folgenden Gründen festzustellen, ab die Ligandenbindende Domäne von DHR23α zur Regulation der DNA-bindenden und Transaktivierungs-Domänen des Säuger-Glucocorticoid-Rezeptors eingesetzt werden konnte. Erstens sind im Gegensatz zu DHR23α hochaffine DNA- Bindungsstellen für den GR identifiziert worden (M. Beato, Cell 56, 335 [1989]) und Reportergene, welche diese Stellen enthalten, sind sehr stark reguliert. Somit konnte die Empfindlichkeit unserer Assays erhöht werden. Zweitens konnten diese chimären Rezeptoren eingesetzt werden, um endogene Gene in Säugerzellen als Antwort auf Ecdysteroide selektiv zu regulieren. Ich konstruierte ein chimäres Gen, GGEc, worin die Sequenzen, welche für die Liganden-bindende Domäne des GR kodieren, durch diejenigen von DHR23α ersetzt wurden (Fig. 4A). Eine Western-Biot-Analyse zeigte an, daß GGEc in transfizierten Zellen exprimiert wurde, jedoch auf beträchtlich geringeren Niveaus als der intakte GR (Fig. 4B). Wie erwartet, war DHR23α nicht in der Lage, die Expression von G4M&submin;&sub7;&sub7;CO zu induzieren, ein Reportergen, das vier Kopien eines hochaffinen GRE enthält (Tabelle 1). Die Expression des GRE- enthaltenden Reportergens wurde jedoch mehr als 700fach durch GGEc in Muristeron-behandelten Zellen induziert. Die relativen Wirksamkeiten von Ecdysteroiden als Agonisten für den chimären Rezeptor sind identisch mit denjenigen für DHR23α; weder α-Ecdyson, 20-OH-Ecdyson noch Polypodin B wirkten als Agonisten, wohingegen Ponasteron A und Muristeron A als schwache bzw. starke Agonisten wirkten.
Die Ergebnisse der CAT-Assays wurden bestätigt und erweitert durch direkte Analyse von Transkripten, die am regulierten Promotor initiiert wurden. RNA, isoliert aus transfizierten Zellen, wurde durch RNAse-Kartierungsexperimenfe nachgewiesen unter Verwendung von Sonden, welche komplementär zu dem GRE- enthaltenden Reporterplasmid waren und einem kotransfizierten Kontrollgen, das von dem CMV-Enhancer und Promotor exprimiert wurde. Fig. 5 zeigt, daß GGEc in hormonabhängiger Weise agiert, um die Expression von einem GRE-MTV-Promotor- Konstrukt zu stimulieren.
Ich stellte dann fest, ob ein DHR23-Fusionsprotein Gene regulieren könnte, die normalerweise auf Estrogene ansprechen. Ich konstruierte ein Derivat von GGEc, welches einen Austausch von zwei Aminosäuren im ersten Finger des Ratten-Glucocorticoid-Rezeptors (G458E, S459 G) inkorporiert hat, von dem gezeigt worden ist, daß er die DNA-Bindungsspezifität des GR in die von ER überführt (K. Umesono und R. Evans, Cell 57, 1139 [1989]; M. Danielsen, L. Hinck, G. Ringold, Cell 57, 1139 [1989]) (Fig. 4A). Dieses Fusionsprotein, G"E"Ec, reguliert nun das ERE enthaltende Reportergen E4M-77C0 in Muristeron-abhängiger Weise (Fig. 6). Wie erwartet, war G"E"Ec nicht in der Lage, die Expression von Reportergenen ohne ERE zu induzieren.
Es steht zu erwarten, daß chimäre Proteine, welche die Liganden-bindende DHR23α-Domäne fusioniert mit DNA-bindenden Domänen von Säugerproteinen enthalten, sich als geeignet zur Regulation der Expression von nativen oder transgenen endogenen Genen in transgenen Tieren erweisen. Es steht zu erwarten, daß solche Fusionskonstrukte geeignet sind zur Regulation der Expression von exogenen Genen, die in transgene Tiere oder Säugerzellen eingeführt wurden. Ich stellte als nächstes fest, ob die Liganden-bindende DHR23α-Domäne zur Regulation der Aktivität einer DNA-bindenden Domäne, die normalerweise nicht in Säugerzellen exprimiert wird, eingesetzt werden könnte. Ich konstruierte das chimäre Gen GLxEc durch Ersatz der Sequenzen, die für die DNA-bindende GR-Domäne in der GGEc- Fusion kodieren, durch diejenigen, welche für die DNA-bindende Domäne des Escherichia coli-LexA-Repressors kodieren (J. W. Little und S. A. Hill, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 2301 [1985]) (Fig. 4). Ein Reportergen X&sub4;C&submin;&sub3;&sub3;CO wurde konstruiert, welches vier Kopien eines 26-bp-lex-Qperators (R. Brent und M. Ptashne, Nature 312, 612 (1984]) an Position -33 des CMV-Promotors enthält. GLxEc besaß keine Auswirkung auf die Expression eines OC&submin;&sub3;&sub3;CO, eines Reportergens, dem der lex-Operator fehlt (Fig. 6B). Die Transkription von X&sub4;C&submin;&sub3;&sub3;CO wurde jedoch stark durch GLxEc induziert und diese Induktion war vollständig hormonabhängig (Fig. 6A). Als Kontrollen wies ich nach, daß X&sub4;C&submin;&sub3;&sub3;CO nicht in Zellen induziert wurde, die mit Muristeron behandelt wurden und entweder mit DHR23α, dem die DNA-bindende IexA-Domäne fehlt, oder durch GLxG (P. J. Godowski, D. Picard und K. R. Yamamoto, Science 241, 812 [1988]), das die Liganden-bindende Glucocorticoid-Rezeptor-Domäne enthält, kotransfiziert worden waren.
Schließlich stellte ich fest, ob die Aktivität von DHR23α-Fusionsproteinen durch Einschluß einer potenten viralen Transaktivierungsdomäne weiter erhöht werden konnte. Ich konstruierte VGEc- und VLxEc-Fusionsgene durch Ersatz eines Teils der N-terminalen GR-Aktivierungsdomäne in GGEc bzw. GLxEc durch die saure Aktivierungsdomäne von Herpesvirus VP16 (I. Sadowski et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 335, 563 [1988]; D. J. Cousens, R. Greaves, C. R. Coding und P. O'Hare, EMBO J. 8, 2337 [1989]) (Fig. 4A). In transfizierten Zellen akkumulierten diese Proteine auf ähnlichen Niveaus wie Derivate, denen die VP16-Aktivierungsdomäne fehlte (Fig. 4B). Sowohl VGEc als auch GLxEc wirkten in Ecdysteroid-abhängiger Weise, um die Aktivität des entsprechenden Reportergens zu induzieren (Tabellen 1 und 2). Die Aktivität von VGEc und GLxEc war jedoch 5- bzw. 10fach größer als die von GGEc und GLxEc (M. A. Labow, S. B. Baim, T. Shenk und A. J. Levine, Mol. and Cell. Biol. 10, 3343 [1990]). Somit kann die Liganden-bindende DHR23α-Domäne zur Regulation der Aktivitäten von viralen, Säuger- und bakteriellen DNA-bindenden oder Transaktivierungs-Domänen eingesetzt werden.
Die Entwicklung eines Systems zur regulierten Expression von endogenen und exogenen Genen in eukaryotischen Zellen stellt ein wichtiges Verfahren bereit, um die Funktion dieser Genprodukte zu studieren und um Tiermodelle für eine Krankheit zu entwickeln. Unsere Resultate demonstrieren die Möglichkeit, Nicht- Säuger-Steroidhormon-Rezeptoren zur Regulation von Genen in Säugerzellen einzusetzen. Es gibt mehrere wichtige Merkmale dieses Systems. DHR23α wirkt als potenter und selektiver Regulator der Transkription von Genen, die EcRE enthalten, und die Aktivität von DHR23α kann weiter modifiziert werden durch Ersatz seiner DNA-bindenden oder Transaktivierungs-Domänen durch diejenigen aus heterologen Proteinen. Es ist wichtig, daß die DHR23α-Aktivität durch Ecdysteroide reguliert wird, die normalerweise nicht in Säugerzellen exprimiert werden. Obwohl ich nicht alle Säuger-Steroide untersuchte, wirkte keines der am häufigsten vorkommenden natürlichen Maus-Steroide als Agonisten für DHR23α. So ist es vorstellbar, daß die transkriptionalen regulatorischen Aktivitäten von DHR23α oder DHR23α- Fusionsproteinen vollständig von der Verabreichung von exogenem Liganden abhängen werden.
Mehrere Berichte haben die Möglichkeit der Verwendung des E. coli-lac- Repressors zur Regulation von Genexpression in Säugerzellen demonstriert. Sowohl der lac-Repressor als auch die Systeme auf Basis von Steroid-Rezeptoren können die Transkription induzieren oder reprimieren (D. M. Ornitz, R. W. Moreadith und Leder P., PNAS 88, 698 [1991]). Ein attraktives Merkmal eines regulatorischen Systems auf Steroid-Rezeptor-Basis ist die bemerkenswerte Flexibilität hinsichtlich der Aktivitätstypen, welche von der Liganden-bindenden Domäne kontrolliert werden können. Die Aktivitäten von strukturell verschiedenen DNA-bindenden Proteinen wie IexA, c-fos, GAL4 und c-myc werden bei Fusion mit einer Liganden-bindenden Steroid-Rezeptor-Domäne hormonabhängig gemacht (P. J. Godowski, D. Picard und K. R. Yamamoto, Science 241, 812 [1988]; N. J. G. Green, S. Green, J. R. Kin und P. Chambon, Cell 54, 199 [1988]; M. Eilers, D. Picard, K. R. Yamamoto und J. M. Bishop, Nature 340, 66 [1989]; D. Picard, S. J. Salser und K. R. Yamamoto, Cell 54, 1073 [1988]; G. Superti-Furga, G. Bergers, D. Picard und M. Busslinger, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 88, 5114 [1991]). Chimäre Proteine können weiter durch Hinzufügung oder Entfernung von Transaktivierungs-Domänen modifiziert werden. Somit steht zu erwarten, daß DHR23α-Fusionsgene konstruiert werden können, um die Expression praktisch jeden beliebigen Gens zu regulieren, für das eine cisagierende regulatorische Sequenz und deren zugehörige DNA-bindende Domäne identifiziert wurden.
Unter den Genen, von denen angenommen wird, daß sie zur Verwendung im Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind diejenigen, die für Zytokine, Hormone, Strukturproteine, Enzyme und Nukleinsäuren kodieren, welche in weniger als therapeutisch erforderlichen Konzentrationen in Säugern vorhanden sind. Unter den Zytokinen und Hormonen sind Polypeptide, wie z. B.: Wachstumshormon, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren, Interleukine, Humanwachstumshormon, N-Methionyl-Humanwachstumshormon, Rinderwachstumshormon, Parathormon, Thyroxin, Insulin, Proinsulin, Relaxin, Prorelaxin, Glycoprotein-Hormone wie Follikel-stimulierendes Hormon (FSH), Thyrotropin (TSH), Parathormon und luteinisierendes Hormon (LH), hämopoetischer Wachstumsfaktor, Leber-Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Prolactin, Plazenta-Lactogen, Tumornekrosefaktor-Alpha und -Beta, Anti-Müller- Hormon, Mausgonadotropin-assoziiertes Peptid, Glucagon, Inhibin, Activin, Gefäßendothel-Wachstumsfaktor, Integrin, Thrombopoetin, Erythropoetin, Nervenwachstumsfaktoren wie NGF-β, Thrombozytenwachstumsfaktor, hämopoetischer Wachstumsfaktor, Gewebefaktorprotein, Anti-Müller-Hormon, Mausgonadotropin-assoziiertes Peptid, transformierende Wachstumsfaktoren (TGF) wie TGF- Alpha und TGF-Beta, Insulin-ähnliche Wachstumsfaktoren I und II, Latenzassoziiertes Peptid, Erythropoetin, osfeoinduktive Faktoren, Interferone wie Interferon-Alpha, -Beta und -Gamma, Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF) wie M- CSF, GM-CSF und G-CSF, Interleukine (IL) wie IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 und andere Polypeptid-Faktoren.
Unter den Enzymen sind Gewebe-Plasminogenaktivase (TPA), Urokinase, Elastase, Adenosindeaminase, Bombesin, Faktor IX, Faktor VIII, Thrombin, Enkephalinase, β-Lactamase, Superoxiddismutase, reverse Transkriptase, RNase, DNase, Enzyme, die an der Glycolyse, dem Krebs-Zyklus, der Gluconeogenese, dem Harnstoffzyklus, der oxidativen Phosphorylierung, der Synthese oder dem Abbau von Purinen, Pyrimidinen, Nukleinsäurepolymeren, Cholesterin, Protein, Glycogen, Fettsäuren, Kohlenhydrat, Phospholipiden, Glycoproteinen oder Lipiden beteiligt sind.
Unter den Strukturproteinen sind Lungenoberflächen-aktives Mittel, Albumin, Antikörper, Trägerproteine, Glycoprotein-Hormon-Rezeptoren, CD-4, Insulinähnlichen Wachstumsfaktor bindende Proteine, Calcitonin, Faktor VIII, ein Antikörper, Protein A oder D, Rheumafaktoren, virale Antigene, HIV-Hüllproteine GP120 und GP140, Immunglobuline, Serumproteine und jedes Protein, das in einer suboptimalen Menge vorhanden ist.
Unter den Nukleinsäuren sind DNA und RNA, sowohl "Sense"- als auch "Antisense"-Stränge. Die RNA kann von jeder Art sein, einschließlich ribosomaler RNA, Messenger-RNA, Transfer-RNA, kleiner Kern-RNA und RNA, die eine enzymatische Funktion besitzt oder an einer enzymatischen Funktion beteiligt ist. Die Verfahren der vorliegenden Erfindung sind anwendbar auf die Produktion von Nukleinsäuren, welche als "Antisense"- oder "Suppressor"-Nukleinsäuren wirken und die Aktivität einer natürlich vorkommenden Säuger-Nukleinsäure inhibieren. Solche Nukleinsäuren haben insbesondere therapeutische Wirksamkeit bei der Behandlung von viralen Erkrankungen, Krebsarten und übermäßiger Produktion eines Proteins oder eines anderen Stoffwechselprodukts.
Ornitz et al. (D. M. Ornitz, R. W. Moreadith und Leder P., PNAS 88, 698 ([1991]) beschrieben ein binäres System zur Regulation der Expression von heterologen Genen in transgenen Mäusen. In diesem System wird ein "Transaktivator"-Stamm, welcher das Hefe-GAL4-Protein exprimiert, mit "Target"- Stämmen gekreuzt, die ein transkriptional schweigendes Transgen, gesteuert von UAS-Sequenzen, enthalten. Die bigenen Nachkömmlinge dieser Kreuzung exprimieren beide Transgene im selben Gewebe. Bigene Systeme, welche DHR23α oder DHR23α-Genfusionen inkorporiert haben, werden ein allgemeines Verfahren zur Steuerung der Häufigkeit, des Zeitverlaufs und/oder der Gewebespezifität der Expression von endogenen oder exogenen Genen bieten. Beispielsweise steht zu erwarten, daß eine gewebespezifisch und entwicklungsmäßig regulierte Expression von Transgenen, die von EcRE kontrolliert werden, durch "Targeting" des Expressions-DHR23α mit geeigneten gewebespezifischen Enhancern erzielt wird. Die Expression des EcRE-enthaltenden "Target"-Gens wird erwartungsgemäß zu geeigneten Zeiten induziert durch "Anschalten" seines Aktivators mit Ecdysteroiden. Diese Entwicklung eines Systems, welches die Gewebe- und Entwicklungssteuerung von Genen in transgenen Tieren erlaubt, bietet einen wichtigen Ansatz, welcher Strategien, die auf "Gene-knockout"-Technologie basieren, ergänzt.
Säugerzellen, die für das vorliegende Verfahren geeignet sind, umfassen diejenigen, die in einem intakten Säuger enthalten sind. Sie schließen sowohl differenzierte als auch undifferenzierte Zellen ein. Ebenfalls vom Begriff Säugerzellen umfaßt sind etablierte Zellinien und primäre Zellkulturen, die von Säugergewebe stammen. Unter den bevorzugten Säuger-Zellinien sind die 293- Zellinie und CHO-Zellinie.

Therapeutische Zusammensetzungen und Verabreichung von Ecdysteroid

Ecdysteroide können transgenen Säugern oder Säugerzellen verabreicht werden, welche ein Gen unter der transkriptionalen Kontrolle eines Ecdysteroids enthalten. Ein Beispiel ist Gentherapie, um einem Säuger die Expression eines Polypeptids zu ermöglichen, das vorher in ungenügenden Mengen produziert wurde. Beispiele solcher Polypeptide sind oben genannt.
Therapeutische Formulierungen von Ecdysteroiden werden zur Lagerung vorereitet durch Mischen einer Ecdysteroid-Untereinheit, die den gewünschten Reinheitsgrad aufweist, mit fakultativen physiologisch annehmbaren Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren (Remington's Pharmaceutical Sciences, supra) in Form eines lyophilisierten Kuchens oder wäßriger Lösungen. Annehmbare Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für die Empfänger bei den eingesetzten Dosierungen und Konzentrationen nicht toxisch und umfassen Puffer wie Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidantien, einschließlich Ascorbinsäure, Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste); Proteine wie Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; hydrophile Polymere wie Polyvinylpyrrolidon; Aminosäuren wie Glycin, Glutamin, Asparagin, Arginin oder Lysin; Monosaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, einschließlich Glucose, Mannose oder Dextrine; Chelatbildner wie EDTA; Zuckeralkohole wie Mannit oder Sorbit; Salz-bildende Gegenionen wie Natrium; und/oder nicht-ionische Tenside wie Tween, Pluronics oder Polyethylenglycol (PEG).
Das zur in vivo-Verabreichung eingesetzte Ecdysteroid muß steril sein. Dies wird ohne weiteres erreicht mittels Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder nach der Lyophilisierung und Rekonstitution. Das Ecdysteroid wird normalerweise in lyophilisierter Form oder in Lösung gelagert werden.
Therapeutische Ecdysteroid-Zusammensetzungen werden im allgemeinen in einem Behälter untergebracht, der eine sterile Zugangsöffnung enthält, z. B. ein Beutel für eine intravenöse Lösung oder ein Gefäß mit einem Stopfen, der von einer Nadel zur subkutanen Injektion durchstochen werden kann.
Die Route des Ecdysteroid-Verabreichung entspricht bekannten Verfahren, z. B. Injektion oder Infusion auf intravenösen, intraperitonealen, intrazerebralen, intramuskulären, intraokularen, intraarteriellen oder intraläsionalen Routen, oder durch Systeme zur verzögerten Freisetzung wie im folgenden angegeben. Das Ecdysteroid wird kontinuierlich durch Infusion oder durch Bolus-Injektion verabreicht.
Geeignete Beispiele von Präparaten zur verzögerten Freisetzung umfassen semipermeable Matrices von festen hydrophoben Polymeren, die das Ecdysteroid enthalten, welche Matrices in Form von Formkörpern vorliegen, z. B. Filme oder Mikrokapseln. Beispiele von Matrices zur verzögerten Freisetzung umfassen Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2-hydroxyethylmethacrylat) wie beschrieben von Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15 : 167-277 (1981) und Langer, Chem. Tech. 12 : 98-105 (1982) oder Poly(vinylalkohol), Polylactide (US 3,773,919, EP 58481), Copolymere von L-Glutaminsäure und Gammaethyl-L-glutamat (Sidman et al., Biopolymers 22 : 547-556 [1983]), nicht-abbaubares Ethylenvinylacetat (Langer et al., supra), abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie das Lupron DepotTM (injizierbare Mikrosphären, aufgebaut aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure (EP 133988).
Ecdysteroid-Zusammensetzungen zur verzögerten Freisetzung umfassen auch in Liposomen eingeschlossenes Ecdysteroid. Liposomen, die Ecdysteroid enthalten, werden nach an sich bekannten Verfahren hergestellt: DE 32 18 121;
Epstein ef al., Proc. Natl. Acad. Sci. 82 : 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 77 : 4030-4034 (1980); EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; EP 142641; japanische Patentveröffentlichung 83-118008; US-4,485,045 und 4,544,545; und EP 102324. Normalerweise sind die Liposomen vom kleinen (etwa 200 bis 800 Angström) unilamellaren Typ, worin der Lipidgehalt größer als etwa 30 Mol-% Cholesterin ist, wobei der gewählte Anteil für die optimale Ecdysteroid- Therapie eingestellt wird.
Eine effektive Menge des therapeutisch einzusetzenden Ecdysteroids wird beispielsweise von den therapeutischen Zielen abhängen, dem Verabreichungsweg, der Aktivität des Polypeptids, welches durch das Ecdysteroid induziert wird, und dem Zustand des Patienten. Dementsprechend wird es für den Therapeuten erforderlich sein, die Dosierung so einzustellen und den Verabreichungsweg so zu modifizieren, wie es erforderlich ist, um eine optimale therapeutische Wirkung zu erzielen. Eine typische Tagesdosierung könnte im Bereich von etwa 1 ug/kg bis zu 100 mg/kg oder mehr liegen, je nach den oben genannten Faktoren. Typischerweise wird der Arzt das Ecdysteroid verabreichen, bis eine Dosierung erreicht ist, welche die gewünschte Wirkung erzielt. Der Fortschritt dieser Therapie wird unschwer mittels üblicher Assays auf die Anwesenheit oder Aktivität des induzierten Polypeptids überwacht.
Ecdysteroid-Zusammensetzungen werden transgenen Säugern oder einer transgenen Säugerzellkultur verabreicht, wenn sich dort innerhalb der Ziel- Zellpopulation ein verfügbarer Ecdysteroid-Rezeptor befindet und eine DNA- bindende Ecdysteroid-Domäne positioniert ist, um die Expression einer DNA- Sequenz zu fördern, welche für ein gewünschtes Polypeptid oder eine Nukleinsäure kodiert. Der Ecdysteroid-Rezeptor, z. B. DHR23α, wirkt als potenter und selektiver Regulator der Transkription von Genen, welche Ecdysteroid-Rezeptor-bindende DNA-Stellen enthalten. Die Aktivität von Ecdysteroiden, wie DHR23α, kann weiter modifiziert werden, indem deren DNA-bindende oder Transaktivierungs-Domänen durch diejenigen aus anderen natürlich vorkommenden Genen ersetzt werden, wodurch die Ecdysteroid-Kontrolle über die anderen natürlich vorkommenden Gene und die Produkte, welche diese produzieren, erleichtert wird. Die chimären Ecdysteroid-Rezeptoren binden immer noch an denselben Liganden, jedoch induzieren sie die Expression des Gens, welches durch die heterologe DNA- bindende Domäne, spezifiziert durch die fusionierte Transaktivierungs-Domäne, spezifiziert wird. Die Transformation von Säugerzellen wird nach Standardverfahren erreicht. Geeignete Vektoren zur Transformation von Säugerzellen umfassen virale und Säuger-DNA, die zur Expression in Säugerzellen imstande ist.
Die folgenden Beispiele sollen zur Erläuterung dienen und keine Beschränkung darstellen.

BEISPIEL 1

Klonierung von DNA, die für DHR23α kodiert

Oligonukleotid-Sonden, basierend auf der partiellen DHR23-Sequenz (W. Seegraves, Doktorarbeit, Stanford University [1988]), wurden eingesetzt, um eine cDNA-Bank zu screenen, die von Drosophila-Larven im frühen Puppenstadium hergestellt wurde. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des DHR23α-Klons ist in Fig. 1A gezeigt. Der Bereich der höchsten Homologie zwischen DHR23α und anderen Mitgliedern der Steroid-Rezeptor-Superfamilie wird in einem cysteinreichen Bereich (Reste 264-329) gefunden, welcher der DNA-bindenden Domäne entspricht (Fig. 1B). Die mutmaßliche Liganden-bindende Domäne hat eine begrenzte Homologie mit Mitgliedern der Retinsäure- und Schilddrüsenhormon-Rezeptoren und dem Vitamin D-Rezeptor gemeinsam. Die N-terminale Domäne (Reste 1-263) hat keine signifikante Homologie mit irgendeinem Mitglied der Steroid-Rezeptor-Superfamilie gemeinsam. Ich identifizierte auch eine zweite Form dieses Proteins, DHR23β, welche durch unterschiedliches Splicing zu entstehen scheint. DHR23β ist mit DHR23α in den DNA- und Liganden-bindenden Domänen identisch, enthält jedoch eine nicht verwandte N-terminale Domäne von 234 Aminosäuren.
Fig. 1A illustriert die Nukleotidsequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz des DHR23α-cDNA-Klons. Die Zahlen auf der linken und rechten Seite zeigen die Nukleotid- bzw. Aminosäurereste an. Das erste ATG nach einem stromaufwärts gelegenen, im Leserahmen befindlichen Stopcodon ist unterstrichen und wurde als Initiationscodon gewählt. Das Initiator-Methionin stimmt mit der Drosophila- Konsensussequenz für die Translationsinitiation überein. Die konservierten Aminosäuren, die der mutmaßlichen DNA-bindenden Domäne entsprechen, sind unterstrichen. Zur Isolierung der DHR23α-Klone vollständiger Länge wurden ~600.000 Phagen von einer Bank von Drosophila-Larven in der dritten Erscheinungsform mit zwei 50-mer-Oligonukleotid-Sonden gescreent, die den Nukleotiden 109-158 und 1820-1869 der partiellen DHR23α-Sequenz in Seegraves, Stanford University, Doktorarbeit 1988, entsprachen. Es wurden acht positive Klone isoliert, durch PCR-Analyse weiter charakterisiert und die Nukleotidsequenz der beiden größten Inserts bestimmt. Die Ergebnisse der Sequenzierung sind in Fig. 1A dargestellt.

BEISPIEL 2

Expression und Aktivität des DHR23α-Polyoehtids in Säugerzellen

Ich stellte fest, ob DHR23α in mit Ecdysteroiden behandelten Säugerzellen funktionieren könnte, um die Transkription eines Reportergens zu erhöhen, welches EcRE in Verknüpfung mit dem Maus-Brusttumorvirus (MTV)-Promotor und Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-Gen enthält. Human-293-Zellen wurden kotransfiziert mit einem Expressionsvektor auf RSV-Basis, der für DHR23α und das Reportergen Ec&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO, welches 4 Kopien eines Ecdyson-Antwortelements (EcRE) von dem Drosophila-HSP27-Promotor (G. Riddihough und H. R. B. Pelham, EMBO J. 6, 3729 [1987]) verknüpft mit einem MTV-Promotor-CAT-Konstrukt enthält, kodiert. Die CAT-Aktivität wurde in Extrakten von Zellen bestimmt, die mit den oder ohne die Ecdysteroide(n) α- oder 20-OH-Ecdyson, Polypodin B, Ponästeron A oder Muristeron A inkubiert worden waren. Weder α-Ecdyson, 20-OH-Ecdyson noch Polypodin B wirkten als Agonisten für DHR23α in Säugerzellen. Im Gegensatz dazu war die Expression des Reportergens deutlich erhöht in Zellen, die mit Muristeron A behandelt worden waren, und in einem geringeren Ausmaß bei Ponasteron A (Fig. 2). Diese Induktion war abhängig von der Anwesenheit eines EcRE im Reportergen, da DHR23α die Expression von Reportergenen, die Bindungsstellen für entweder den Glucocorticoid-Rezeptor (GRE, Fig. 2) oder für den Estrogen-Rezeptor (ERE, Fig. 6) enthielten, nicht regulierte. So wirkt in Säugerzellen DHR23α in Ecdysteroidabhängiger Weise, um selektiv die Expression eines EcRE-enthaltenden Reportergens zu stimulieren.
Spezifische Ecdysteroide sind Agonisten für den DHR23α-Rezeptor in Säugerzellen. Human-293-Zellen wurden kotransfiziert mit 2,5 ug des Expressions plasmids pRSV. DHR23α oder des Stamm-Expressionsplasmids pRSV (Kontrolle) und 0,5 ug des Reporterplasmids pEc&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO (EcRE) oder pG4M77CO (GRE). Als Kontrolle der Transfektionseffizienz wurden 0,5 ug des Kontrollplasmids pRSV.hGH in die Transfektionsmischung eingeschlossen. Nach der Transfektion wurden die Zellen ohne (-) oder mit α-Ecdyson (alpha), 20-OH-Ecdyson (20-OH), Polypodin B (ppB), Ponasteron A (ponA) oder Muristeron (murA) behandelt. Alle Kandidaten- Liganden wurden in einer Konzentration von 1 uM zugegeben. CAT-Extrakte wurden 48 h nach der Transfektion gewonnen und die Assays wie beschrieben durchgeführt (D. R. Cavener, Nucl. Acids Res. 15, 1353-1361 [1987]). Die Werte wurden auf die Expression von hGH normalisiert und die Durchschnittswerte von drei unabhängigen Experimenten sind in Fig. 2 dargestellt. Der "Induktionsfaktor" repräsentiert das Expressionsniveau des Reportergens in Zellen, die mit Hormon inkubiert wurden, geteilt durch die Expression des Reportergens in Extrakten von Zellen, die ohne zugegebenen Liganden inkubiert worden waren.
Die Wirkung von Säugerhormonen auf die Aktivität von DHR23α ist in Fig. 3 gezeigt. Die Zellen wurden mit dem DHR23α-Expressionsvektor und dem Ec&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO-Reportergen transfiziert und ohne (-) oder mit den folgenden Hormonen (1 uM) behandelt: Muristeron A (mur A), Dexamethason (Dex), 17β-Estradiol (E2), Aldosteron (Aldo), Corticosteron (Cort), Hydroxycorticosteron (OH-Cort), Schilddrüsenhormon (T3), Promegeston (Promeg) und 1,25-Dihydroxy-Vitamin D3 (VD3). Die Reportergen-Aktivität wurde bestimmt wie oben für Fig. 2 beschrieben. Retinsäure wirkte ebenfalls nicht als Agonist für DHR23α.
Eine schematische Darstellung chimärer Genkonstrukte und ein Western-Blot der resultierenden exprimierten Rezeptorproteine sind in den Fig. 4A und 1B illustriert. In Fig. 4A sind die Rezeptorkonstrukte entsprechend einer 3-teiligen Nomenklatur bezeichnet, die den Ursprung ihrer N-terminalen Transaktivierungs-, DNA-bindenden und Liganden-bindenden Domänen angibt. "G" und "Ec" beziehen sich auf den Glucocorticoid-Rezeptor bzw. DHR23α. "E" bezieht sich auf ein Derivat der DNA-bindenden Domäne des Ratten-Glucocorticoid-Rezeptors mit zwei Aminosäuresubstitutionen (G458E, S459 G), welche die DNA-Bindungsspezifität in diejenige des Estrogen-Rezeptors überführen (K. Umesono und R. Evans, Cell 57, 1139 [1989]; M. Danielsen, L. Hinck, G. Ringold, Cell 57, 1131 [1989]). "X" (ausge fülltes Kästchen) zeigt die DNA-bindende Domäne (Aminosäuren 1-87) des Escherichia coli-LexA-Proteins an. Das "V" (schattiertes Kästchen) bezeichnet ein Derivat der N-terminalen GR-Domäne, worin die Aminosäuren 153-406 durch die transkriptionale Aktivierungsdomäne des HSV VP16-Proteins (Aminosäuren 411- 490) ersetzt sind. Das Konstrukt GGEc wurde konstruiert durch Ersatz der Ligandenbindenden Domäne von GGG (Aminosäuren 528-795) durch die Liganden-bindende Domäne von DHR23α (Aminosäuren 329-878). Gleichermaßen wurde zur Konstruktion von GXEc die Liganden-bindende Domäne von GXG (bezeichnet als NLxC in P. J. Godowski, D. Picard und K. R. Yamamoto, Science 241, 812 [1988]) durch die Liganden-bindende DHR23α-Domäne ersetzt.
In Fig. 4B ist die Akkumulierung von Rezeptorproteinen in transfizierten Zellen in einem Western-Blot gezeigt, nachgewiesen mit Enzym-verknüpften Antikörpern. Gesamtzell-Extrakte werden 48 h nach der Transfektion mit Rezeptor- Expressionsplasmiden, welche für die folgenden Fusionsproteine kodieren, hergestellt. Spur 1, EcEcEc; Spur 2, GGG; Spur 3, GGEc; Spur 4, VGEc; Spur 5, G"E"G; Spur 6, G"E"Ec; Spur 7, GXG; Spur 8, GXEc; Spur 9, VXEc. Die Blots wurden mit dem monoklonalen Antikörper BuGR2 umgesetzt, welcher ein Epitop in der N-terminalen Domäne des Ratten-Glucocorticoid-Rezeptors (30) erkennt, und dann mit einem Schaf-Antiserum gegen Maus-Antikörper, gekoppelt mit Meerrettich- Peroxidase. Die Positionen der Molekulargewichtsmarker sind angezeigt.
Eine RNase-Schutz-Analyse von Transkripten, welche durch Rezeptorproteine induziert wurden, ist in Fig. 5 dargestellt. Gesamt-RNA wurde aus Zellen 48 Stunden nach der Transfektion mit Expressionsplasmiden, die entweder für DHR23α (EcEcEc), GGG oder GGEc und für das Reportergen G&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO kodieren, hergestellt. Dieses Reportergen enthält 4 GRE, fusioniert an Position -77 eines MTV- Promotor-Humanwachstumshormon-Genkonstrukts. Bei den Assays wurden 50 ug Gesamt-RNA eingesetzt. Die Position der geschützten Bande von 377 Basen für G&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO und der geschützten Bande von 294 Basen des internen Kontrollgens (exprimiert von einem CMV-Enhancer/Promotor-Konstrukt) wird durch den ausgefüllten bzw. offenen Pfeil angezeigt.
Die Induktion von ERE durch chimäre Rezeptoren ist in Fig. 6 dargestellt. Zellen wurden mit Expressionsplasmiden transfiziert, die entweder für DHR23α (EcEcEc), G"E"G oder G"E"Ec und für E&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO, das 4 ERE mit dem MTV-Promotor fusioniert enthält, kodieren. Die Zellen wurden 48 Stunden lang ohne (-) oder mit Muristeron A (M) oder Dexamethason (D) inkubiert. Die Reportergen-Aktivität wurde bestimmt wie oben für Fig. 2 beschrieben.
In Tabelle 1 unten illustriert ist die Induktion eines auf einen Glucocorticoid- Rezeptor (GRE) ansprechenden Gens durch chimäre Rezeptoren. 293-Zellen wurden mit Effektor-Plasmiden transfiziert, welche für die angegebenen Rezeptorproteine und das Reportergen G&sub4;M&submin;&sub7;&sub7;CO kodieren. Diese transfizierten Zellen wurden entweder ohne zugegebenes Hormon (-), mit Muristeron A (M) oder mit dex (D) inkubiert. Die Reportergen-Aktivität wurde bestimmt wie oben für Fig. 2 beschrieben. Der "Induktionsfaktor" repräsentiert das Expressionsniveau des Reportergens in Zellen, die mit Hormon inkubiert wurden, geteilt durch die Expression des Reportergens in Extrakten von Zellen, die ohne zugegebenen Liganden inkubiert worden waren. TABELLE 1 Induktion eines Glucocorticoid-Rezeptors durch chimäre Rezeptoren
In Tabelle 2 ist die transkriptionale Aktivierung durch Rezeptor-LexA- Fusionsproteine illustriert. Effektor-Plasmide, kodierend für die angegebenen Rezeptorproteine, wurden mit einem Reportergen transfiziert, das entweder lex- Operatoren enthält (X&sub4;C&submin;&sub3;&sub3;CO) oder nicht (OC&submin;&sub3;&sub3;CO). "Kontrolle" zeigt an, daß die Zellen mit einem "Effektor"-Plasmid transfiziert wurden, welche keine Rezeptor-cDNA enthält. Die Zellen wurden entweder mit (+) oder ohne (-) Muristeron A inkubiert. Der Induktionsfaktor wurde bestimmt wie zuvor beschrieben; die Standardabweichungen sind in Klammern angegeben. TABELLE 2 Transkriptionale Aktivierung durch chimäre Rezeptoren
Obwohl die Erfindung notwendigerweise in Verbindung mit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben wurde, wird ein Durchschnittsfachmann nach Lektüre der vorangehenden Beschreibung imstande sein, verschiedene Änderungen, Substitutionen von Äquivalenten und Modifikationen des hier dargelegten Gegenstands vorzunehmen, ohne über dessen Konzeption und Umfang hinauszugehen. Somit kann die Erfindung auf anderen Wegen als den hier speziell beschriebenen ausgeführt werden. Der durch das Patent verliehene Schutz soll deshalb nur durch die beigefügten Ansprüche und deren Äquivalente beschränkt sein.

SEQUENZVERZEICHNIS

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: Genentech, Inc.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Ecdysteroid-abhängige Regulation von Genen in Säugerzellen
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 1
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Genentech, Inc.
(B) STRASSE: 460 Point San Bruno Blvd.
(C) STADT: South San Franciso
(D) STAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) PLZ: 94080
(v) COMPUTER-LESBARE FORM:
(A) MEDIUMTYP: 5,25 Inch, 360 Kb-Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOSIMS-DOS
(D) Software: patin (Genentech)
(vii) GEGENWÄRTIGE ANMELDUNGSDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) ANMELDUNGSDATUM: 3. August 1992
(C) KLASSIFZIERUNG:
(viii) ANWALTNERTRETER-INFORMATION:
(A) NAME: Fitts, Renée A.
(B) ZULASSUNGSNUMMER: 35136
(C) REFERENZ/AKTENZEICHEN: 607
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEFON: 415/225-1489
(B) TELEFAX: 415/952-9881
(C) TELEX: 910/371-7168
(2) INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR.1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 2970 Basen
(B) TYP: Nukleinsäure
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR.1:

Claims

1. Verfahren zur Induktion von Genexpression in einer Säugerzelle, welches umfaßt das Kontaktieren eines Ecdysteroids mit einem Ecdysteroid-Rezeptor- Polypeptid, umfassend eine DHR23α-Ecdysteroid-bindende Domäne, in einer Säugerzelle, wobei die Säugerzelle weiter enthält eine bindende DNA- Sequenz für den DHR23α-Ecdysteroid-Rezeptor, wenn dieser in Kombination mit seinem Liganden-Ecdysteroid vorliegt, worin die Bildung eines Rezeptor- Ligand-bindende-DNA-Sequenz-Komplexes die Genexpression induziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das Ecdysteroid keine Hydroxylgruppe an Position 25 enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Ecdysteroid eine elektronenziehende Gruppe an den Positionen 5 und/oder 11 enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die elektronenziehende Gruppe aus den folgenden ausgewählt ist: Hydroxyl, Keton, Sulfhydryl, Nitrat, Nitrit, Fluor, Brom, Iod und Chlor.

5. Verfahren nach Anspruch 2, worin das Ecdysteroid ausgewählt ist aus den folgenden: Muristeron A, 5-Dehydroxymuristeron A, 11-Dehydroxymuristeron A und Ponasteron.

6. Verfahren nach Anspruch 1, worin die bindende DNA-Sequenz weiter eine DNA-Sequenz enthält, die für ein eukaryotisches Gen kodiert.

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das heterologe eukaryotische Gen kodiert für ein Polypeptid oder eine Nukleinsäure, ausgewählt aus den folgenden: Cytokin, Enzym, Struktur-Polypeptid, DNA und RNA.

8. Verfahren zur Produktion eines gewünschten Proteins, umfassend:

a) Kontaktieren eines Ecdysteroids mit einem Ecdysteroid-Rezeptor- Polypeptid, umfassend eine DHR23α-Ecdysteroid-bindende Domäne, in einer Säugerzelle, wobei die Säugerzelle weiter enthält eine chimäre DNA- Sequenz, umfassend 1) eine erste bindende DNA-Sequenz mit Bindungsspezifität für den DHR23α-Ecdysteroid-Rezeptor, wenn dieser in Kombination mit seinem Liganden-Ecdysteroid vorliegt, und 2) eine zweite DNA-Sequenz, kodierend für ein gewünschtes Protein, das heterolog zu der bindenden DNA-Sequenz ist und sich unter der transkriptionalen Kontrolle des Ecdysteroid-Rezeptor-Ligand-Komplexes befindet; und

b) Inkubation der Zelle und Produktion des gewünschten Proteins.

9. Verfahren nach Anspruch 8, worin das gewünschte Protein ausgewählt ist aus den folgenden: Cytokinen, Enzymen und Struktur-Polypeptiden.

10. Verfahren nach Anspruch 8, worin das Ecdysteroid ausgewählt ist aus den folgenden: Muristeron A, 5-Dehydroxymuristeron A, 11-Dehydroxymuristeron A und Ponasteron.

11. Verfahren zur Regulation der Genexpression in einer Säuger-Zellinie oder -Zellkultur, wobei die Säugerzelle eine DNA-Sequenz enthält, die für ein Polypeptid kodiert, das heterolog zu der Säugerzelle ist und sich unter der transkriptionalen Kontrolle eines DHR23α-Ecdysteroid-Rezeptors befindet, umfassend:

a) Transformation der Säugerzelle, um ein Ecdysteroid-Rezeptor- Fusionspolypeptid, welches eine DHR23α-Ecdysteroid-bindende Domäne und eine heterologe Transaktivierungsdomäne umfaßt, zu exprimieren; und

b) Kontaktieren der transformierten Säugerzelle mit einem Ecdysteroid, welches den DHR23α-Ecdysteroid-Rezeptor aktiviert.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Transaktivierungsdomäne ausgewählt ist aus den folgenden: saure Aktivierungsdomäne des Herpesvirus VP16, lexA, c-fos, GAL4 und c-myc.

13. Verfahren nach Anspruch 11, worin das Ecdysteroid ausgewählt ist aus den folgenden: Muristeron A, 5-Dehydroxymuristeron A, 11-Dehydroxymuristeron A und Ponasteron.