DE69227984T2

DE69227984T2 - Impfstoff, der eine Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors von Neisseria meningitidis enthält

Info

Publication number: DE69227984T2
Application number: DE69227984T
Authority: DE
Inventors: Ling F-69280 Marcy-L'etoile Lissolo; Marie-Jose F-69100 Villeurbanne Quentin-Millet
Original assignee: Pasteur Merieux Serum et Vaccines SA
Current assignee: Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1991-10-03
Filing date: 1992-09-29
Publication date: 1999-05-12
Anticipated expiration: 2012-09-30
Also published as: HU219762B; DE69227984D1; NO309865B1; NO932009L; JPH06503364A; DK0560969T3; EP0560969B1; FI932490A0; CA2096411A1; GR3029580T3; HU9301631D0; AU2764092A; ATE174930T1; HUT69929A; ES2128358T3; AU668522B2; US5618540A; EP0560969A1; FR2682114A1; FI932490L

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine pharmazeutische Impfzusammensetzung, die zur Vorbeugung von durch Neisseria meningitidis verursachten Hirnhautentzündungen bestimmt ist.
Hirnhautentzündungen haben im allgemeinen entweder einen viralen oder einen bakteriellen Ursprung. Die hauptsächlich verantwortlichen Bakterien sind: N. meningitidis und Haemophilus influenzae, die jeweils an etwa 40 bzw. 50% der Fälle von bakterieller Meningitis beteiligt sind.
In Frankreich werden jährlich etwa 600 bis 800 Fälle von N. meningitidis-Hirnhautentzündung gezählt. In den Vereinigten Staaten beläuft sich die Zahl der Fälle auf etwa 2500 bis 3000 pro Jahr.
Die Spezies N. meningitidis wird nach der Art der Kapselpolysaccharide in Serogruppen unterteilt. Es gibt zwar ein Dutzend Serogruppen, aber die Meningitisfälle sind zu 90% drei Serogruppen zuzuschreiben: A, B und C.
Es gibt wirksame Impfstoffe auf der Basis der Kapselpolysaccharide, mit denen man Hirnhautentzündungen aufgrund der N. meningitidis-Serogruppen A und C vorbeugen kann. Diese Polysaccharide sind bei Kindern unter 2 Jahren nur wenig oder gar nicht immunogen und erzeugen kein immunologisches Gedächtnis. Diese Nachteile lassen sich aber überwinden, indem man diese Polysaccharide mit einem Trägerprotein konjugiert.
Im Gegensatz dazu ist das Polysaccharid der N. meningitidis-Gruppe B bei Menschen in konjugierter oder unkonjugierter Form nicht oder geringfügig immunogen. So scheint es stark wünschenswert, nach einem Impfstoff zu suchen, mit dem die von N. meningitidis, insbesondere der Serogruppe B, induzierten Hirnhautentzündungen bekämpft werden können und der kein Impfstoff auf Polysaccharidbasis ist.
Zu diesem Zweck sind bereits verschiedene Außenmembranproteine von N. meningitidis vorgeschlagen worden. Es handelt sich insbesondere um den Membranrezeptor für menschliches Transferrin.
Der Großteil der Bakterien benötigt im allgemeinen Eisen für das Wachstum und hat daher spezielle Aufnahmesysteme für dieses Metall entwickelt. N. meningitidis, das ein strenges Menschenpathogen ist, kann Eisen nur durch menschliche Eisentransportproteine, wie Transferrin und Lactoferrin, aufnehmen, da die Menge an Eisen in freier Form beim Menschen (in der Größenordnung von: 10&supmin;¹&sup8; M) vernachlässigbar und in jedem Fall unzureichend für das Bakterienwachstum ist.
So besitzt N. meningitidis einen Rezeptor für menschliches Transferrin und einen Rezeptor für menschliches Lactoferrin. Dadurch kann es diese Eisen-chelatisierenden Proteine binden und daraufhin das für sein Wachstum nötige Eisen einfangen.
Der Transferrinrezeptor des Stammes N. meningitidis B16B6 ist von Schryvers et al. (WO 90/12591) aus einem Membranextrakt gereinigt worden. Dieses gereinigte Protein besteht anscheinend im wesentlichen aus zwei Typen von Polypeptiden: einem Polypeptid mit einem höheren apparenten Molekulargewicht von 100 kD und einem Polypeptid mit einem niedrigeren apparenten Molekulargewicht von etwa 70 kD, wie nach Elektrophorese auf einem Polyacrylamidgel in Gegenwart von SDS festgestellt wurde.
Nachdem die Arbeiten von Schryvers et al. die genaue Zusammensetzung des Transferrinrezeptors bei N. meningitidis nachwiesen, glaubten verschiedene Autoren, einschließlich Schryvers selbst, lange, daß die Funktion des Transferrinrezeptors mit dem hauptsächlichen Außenmembranprotein assoziiert ist, dessen Molekulargewicht tatsächlich sehr ähnlich dem der Unterheit mit dem niedrigeren Molekulargewicht des Transferrinrezeptors ist: 70-71 kD. Siehe beispielsweise Schryvers & Morris, Mol. Microbiol. (1988) 2 (2): 281, und Banerjee-Bhatnagar et al., Infect. Immun. (1990) 58 (9): 2875. Mit der SDS-PAGE-Gelelektrophoresetechnik zeigte jedes dieser Dokumente die zahlreichen, in einem N. meningitidis-Außenmembranextrakt enthaltenen Proteine, unter denen sich das Hauptprotein mit 70-71 kD sowie die Untereinheiten des Transferrinrezeptors (ohne benannt zu werden) befinden. Durch Elektroblot zeigten die Autoren, daß die Ligandenaktivität für Transferrin mit der bei 70-71 kD laufenden Bande einhergeht, von der man jetzt weiß, daß sie das Hauptprotein mit 70-71 kD und Tbp2 gemeinsam enthält. Bei den in Schryvers &. Morris bzw. Banerjee-Bhatnagar et al. beschriebenen Experimenten wird kein Außenmembranprotein gereinigt.
Das Produkt der insbesondere von Schryvers durchgeführten Reinigung wird gemäß willkürlicher Definition und für die Zwecke der vorliegenden Patentanmeldung als Transferrinrezeptor und die Polypeptide, aus denen es besteht, werden als Untereinheiten bezeichnet. Im nachstehenden Text werden die Untereinheiten mit höherem Molekulargewicht und mit niedrigerem Molekulargewicht als Tbp1 bzw. Tbp2 bezeichnet.
Überraschenderweise hat man jetzt gefunden, daß die hochmolekulargewichtige Untereinheit die Produktion neutrali sierender Antikörper nicht induzieren kann. Nur die kleinere der 2 Untereinheiten des Rezeptors ist zu dieser Funktion in der Lage.
Folglich stellt die Erfindung bereit:
(i) Die Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht des Rezeptors für menschliches Transferrin aus einem N. meningitidis-Stamm, ein Fragment oder ein Analogon dieser Untereinheit, in gereinigter Form; d. h. dissoziiert und isoliert von der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des Rezeptors; und
(ii) eine pharmazeutische Impfstoffzusammensetzung, die als therapeutisches Mittel die Untereinheit mit dem niedrigeren Molekulargewicht des Rezeptors für menschliches Transferrin aus mindestens einem N. meningitidis-Stamm, ein Fragment oder ein Analogon der Untereinheit in Abwesenheit der Unterheit mit hohem Molekulargewicht des Rezeptors umfaßt;
und die die therapeutische Verwendung der Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht des Rezeptors für menschliches Transferrin aus mindestens einem N. meningitidis-Stamm, eines Fragmentes oder Analogons der Untereinheit in Abwesenheit der Unterheit mit hohem Molekulargewicht des Rezeptors ermöglicht.
Gewöhnlich läßt sich die Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht in gereinigter Form (d. h. dissoziiert und isoliert von der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht) insbesondere ausgehend von einem Transferrinrezeptor erhalten. Letzterer kann aus einem N. meningitidis-Stamm isoliert werden, der zuvor in einem Medium gezüchtet wird, das an Eisen in freier Form verarmt ist, insbesondere gemäß dem Verfahren von Schryvers et al., WO 90/12591, ähnlich beschrieben in Schryvers et al., Infect. Immun. (1988) 56(5): 1144. Anschließend wird der gereinigte Rezeptor der Einwirkung eines starken Denaturierungsmittels, wie 8 M Harnstoff oder 6 M Guanidinium-HCl unterworfen. Die dissoziierten Untereinheiten werden schließlich durch herkömmliche Chromatographieverfahren, wie Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie oder Gelfiltration, getrennt.
Alternativ kann die Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht mittels genetischer Techniken hergestellt werden. Das für diese Untereinheit codierende DNA-Fragment kann in einem heterologen Expressionssystem (z. B. Bakterien, Hefe, Säugerzellen) exprimiert werden. In diesem Fall wird die Untereinheit aus einer Kultur gewonnen und gereinigt. Diese Verfahren sind außerdem natürlich zur Herstellung von Fragmenten oder Analoga der Untereinheiten geeignet.
Mit "Fragment der Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht" wird ein Peptid bezeichnet, dessen Aminosäuresequenz in der Sequenz der Untereinheit enthalten ist. Mit "Analogon der Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht" ist ein Protein gemeint, dessen Aminosäuresequenz einen Homologiegrad von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, ganz besonders bevorzugt mindestens 95% mit der Sequenz der Untereinheit aufweist. Für erfindungsgemäße Zwecke ist es selbstverständlich, daß ein solches Fragment oder Analogon die immunogenen Eigenschaften der Untereinheit beibehalten muß.
Bezüglich der Tbp2-Untereinheit lassen sich die N. meningitidis-Stämme in 2 große Gruppen einteilen:
- diejenigen, bei denen die Tbp2-Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 65 bis 74 kD hat (als Typ 2394 bezeichnete Stämme); und
- diejenigen, bei denen die Tbp2-Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 75 bis 90 kD hat (als Typ 2169 bezeichnete Stämme).
Gewöhnlich ist nicht entscheidend, welche Serogruppe der N. meningitidis-Stamm hat, aus dem die erfindungsgemäß verwendbare Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht stammt. Vorteilhafterweise stammt sie aus einem N. meningitidis-Stamm der Serogruppe B. Unter einem besonders bevorzugten Aspekt der Erfindung stammt sie aus dem N. meningitidis-Stamm B16B6, der auch als 2394 (B : 2a : P1.2 : L2.3) bezeichnet wird, oder aus M982, der auch als 2169 (B : 9 : P1.9 : L3.7) bezeichnet wird, die bei der Sammlung des Institut Pasteur, 25 rue du Dr. Roux, 75015 Paris, unter den entsprechenden Registrierungsnummern CIP 7908 bzw. CIP 7917 öffentlich zugänglich sind.
Als Beispiel ist die Tbp2-Untereinheit der Stämme 2394 und 2169 anhand ihrer Aminosäuresequenz beschrieben, wie sie in den Sequenzbezeichnungen Nr. 1 und 2 (SEQ ID Nr. 1 und 2) gezeigt ist. Die apparenten Molekulargewichte dieser Untereinheiten sind etwa 68-70 bzw. 87 kD, wie nach Elektrophorese auf Polyacrylamidgelen in Gegenwart von SDS gezeigt wurde.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung ist insbesondere geeignet zur Vorbeugung oder Milderung der Wirkungen einer N. meningitidis-Infektion.
Eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung kann auf herkömmliche Weise hergestellt werden. Insbesondere wird ein erfindungsgemäßes therapeutisches Mittel mit einem pharmazeutisch verträglichen Verdünnungsmittel oder Träger vereinigt. Eine erfindungsgemäße Zusammensetzung kann auf einem herkömmlichen, im Impfstoff-Fachgebiet verwendeten Weg, insbesondere auf subkutanem Weg, intramuskulärem Weg oder intravenösem Weg, beispielsweise in Form einer injizierbaren Suspension verabreicht werden. Die Verabreichung kann durch eine Einzeldosis oder eine ein- oder mehrmals nach einem bestimmten Zeitintervall wiederholte Dosis erfolgen. Die geeignete Dosierung variiert in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern, z. B. vom behandelten Individuum oder vom Verabreichungsweg.
Schließlich kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung eine oder mehrere Untereinheiten mit niedrigerem Molekulargewicht enthalten, wie sie von unterschiedlichen N. meningitidis-Stämmen herrühren. So umfaßt unter einem besonderen Aspekt der Erfindung eine vorteilhafte pharmazeutische Zusammensetzung die Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht des Rezeptors für menschliches Transferrin aus einem Stamm vom Typ 2394 (Molekulargewicht von 65 bis 74 kD) und die Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht des Rezeptors für menschliches Transferrin aus einem Stamm vom Typ 2169 (Molekulargewicht von 75 bis 90 kD).
Vorzugsweise umfaßt die erfindungsgemäße Zusammensetzung die Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht des Rezeptors für menschliches Transferrin aus dem Stamm 2394 (Molekulargewicht: 68-70 kD) und die Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht des Rezeptors für menschliches Transferrin aus dem Stamm 2169 (Molekulargewicht: 87 kD).
Die Fig. 1 zeigt die SEQ ID NR: 1 bezüglich der Aminosäuresequenz der Tbp2-Untereinheit von N. meningitidis 2394.
Die Fig. 2 zeigt die SEQ ID NR: 2 bezüglich der Aminosäuresequenz der Tbp2-Untereinheit von N. meningitidis 2169.
Die Erfindung wird eingehend durch die nachstehenden Beispiele beschrieben.

BEISPIEL 1: Reinigung der Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht des Transferrinrezeptors aus dem Stamm 2394 durch Ionenaustauschchromatographie.

1A - Kultur

Ein Lyophilisat des N. meningitidis-Stammes 2394 wird in etwa 1 ml Mueller-Hinton-Brühe (BMH, Difco) aufgenommen. Die Bakteriensuspension wird dann auf festem Mueller-Hinton-Medium, das gekochtes Blut (5%) enthält, ausplattiert.
Nach 24stündiger Inkubation bei 37ºC in einer Atmosphäre mit 10% CO&sub2; wird der Bakterienrasen gesammelt, um 150 ml BMH, pH-Wert 7,2, aufgeteilt auf 3 250-ml-Erlenmeyerkolben, anzuimpfen. Die Inkubation wird 3 Std. bei 37ºC unter Schütteln fortgesetzt. Mit jeder der 3 so durchgeführten Kulturen können 400 ml BMH, pH-Wert 7,2, angeimpft werden, die mit 30 uM Ethylendiamindi-(o-hydroxyphenylessigsäure) (EDDA, Sigma) supplementiert sind, einem Chelator für Eisen in freier Form.
Nach 16stündiger Kultur bei 37ºC unter Schütteln werden die Kulturen durch Betrachten im Mikroskop nach Gram-Färbung auf ihre Reinheit untersucht. Die Suspension wird zentrifu giert und das die Bakterien enthaltende Sediment wird gewogen und bei -20ºC aufbewahrt.

1B - Reinigung

Das Reinigungsverfahren ist im wesentlichen cias von Schryvers et al. (s. o.) beschriebene.
Das in 1A erhaltene Bakteriensediment wird aufgetaut und dann in 200 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, (Puffer A) resuspendiert. Die Suspension wird 20 min bei 15000 · g bei 4ºC zentrifugiert. Das Sediment wird gewonnen und in einer Endkonzentration von 150 g/l in Puffer A resuspendiert. 150- ml-Fraktionen werden während 8 min bei 800 bar in einem Hochdruck-Zell-Lysegerät (Rannie, Modell 8.30H) behandelt. Das so erhaltene Zell-Lysat wird 15 min bei 4ºC und 15000 · g zentrifugiert. Der überstand wird gewonnen und 75 min bei 4ºC und 200000 · g zentifugiert.
Nach Entfernen des Überstandes wird das Sediment in Puffer A aufgenommen. Nach einer Proteinbestimmung nach Lowry wird die Konzentration der Suspension auf 5 mg/ml eingestellt.
Auf 1,4 ml der Membransuspension werden 1,75 mg biotinyliertes menschliches Transferrin gemäß dem von Schryvers beschriebenen Verfahren zugegeben. Die Endkonzentration der Membranfraktion beträgt 4 mg/ml. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 37ºC inkubiert und dann 75 min bei 4ºC und 100000 · g zentrifugiert. Das Membransediment wird in Puffer A aufgenommen, der 0,1 M NaCl enthält, und 60 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Nach dem Solubilisieren wird zu dieser Suspension ein solches Volumen an 30% (Gew./Vol.) Sarkosyl (N-Lauroylsarko sin, Sigma) und 500 mM EDTA gegeben, daß die Endkonzentrationen von Sarkosyl und EDTA 0,5% bzw. 5 mM betragen. Nach einer Inkubation von 15 min bei 37ºC unter Schütteln wird 1 ml Streptavidin-Agarose-Harz (Pierce), das zuvor in Puffer A gewaschen wurde, zugegeben. Die Suspension wird 15 min bei Raumtemperatur inkubiert und dann 10 min bei 1000 · g zentrifugiert. Das Harz wird dann in eine Säule gepackt, und das direkte Eluat wird verworfen.
Das Harz wird mit 3 Säulenvolumina 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, der 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl enthält, (Puffer B) und dann mit einem Säulenvolumen Puffer B gewaschen, der 750 mM Guanidinium-HCl enthält. Der Transferrinrezeptor wird dann mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, der 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,05% Sarkosyl und 2 M Guanidinium-HCl enthält, eluiert. Das Eluat wird in Fraktionen mit einem Volumen von 1 Vol. in Röhrchen gesammelt, die 1 Vol. 50 mM Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 1 M NaCl enthalten. Die optische Dichte des Eluates wird bei 280 nm am Ausgang der Säule mit einem UV-Detektor gemessen.
Die dem Elutionsmaximum entsprechenden Fraktionen werden gesammelt, gegen 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 8,0, der 0,5 M Harnstoff enthält, dialysiert und dann in einer Konzentrationszelle vom Typ Amicon, die mit einer Membran mit der Trenngrenze von 10000 Dalton ausgestattet ist, auf eine Endkonzentration von etwa 3 mg Protein/ml eingeengt.
Eine bestimmte Menge Harnstoff wird zu der eingeengten Lösung zugegeben, so daß die Harnstoff-Endkonzentration 8 M beträgt. Die Endkonzentration der Proteinlösung ist weiterhin zwischen 2 und 3 mg/ml. Die Lösung wird 6 Tage bei 4ºC inkubiert.
Das Gemisch wird anschließend auf einem Anionenaustauschharz (Q-Sepharose, Pharmacia) chromatographisch aufgetrennt, das zuvor mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, der 5 M Harnstoff enthält, äquilibriert wurde.
Unter diesen Bedingungen wird die hochmolekulargewichtige Untereinheit (Tbp1) unmittelbar im direkten Eluat gewonnen, während die Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht (Tbp2) durch einen linearen Gradienten von 0-1 M NaCl in Puffer A eluiert wird, der 0,5% Sarkosyl und 5 M Harnstoff enthält. Die optische Dichte wird bei 280 nm am Ausgang der Säule mit einem UV-Detektor gemessen.
Die dem Elutionsmaximum entsprechenden Fraktionen werden gesammelt, gegen 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 8,0, der 0,05% Sarkosyl enthält, dialysiert und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in einer 10fach höheren Konzentration in Wasser aufgenommen. Die Lösung wird ein zweites Mal gegen 50 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 8,0, dialysiert, der 0,05% Sarkosyl enthält, (Puffer C), und die Lösung wird dann über eine Membran mit 0,22 um-Poren filtriert.
Der Proteingehalt wird bestimmt und durch Zugabe von Puffer C unter sterilen Bedingungen auf 1 mg/ml eingestellt. Diese Präparation wird bei -70ºC aufbewahrt.

Beispiel 2: Reinigung der Untereinheit mit dem niedrigeren Molekulargewicht des Transferrinrezeptors aus dem Stamm 2169

Die Kultur des Stammes 2169 und die Reinigung der Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht des Transferrinrezeptors erfolgen unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Beispiel 3: Reinigung der Untereinheit mit dem niedrigeren Molekulargewicht des Transferrinrezeptors aus dem N. meningitidis Stamm 2394 durch hydrophobe Chromatographie

Die Kultur des N. meningitidis-Stammes 2394 und die Reinigungsschritte bis zur Herstellung der Membransuspension erfolgen unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Ein Volumen der Membransuspension wird mit dem gleichen Volumen 50 mM Tris, pH-Wert 8,0, der 2 M NaCl, 20 mM EDTA, 1% (Gew./Vol.) Sarkosyl enthält, versetzt. Das Gemisch wird 15 min bei 37ºC unter leichtem Schütteln inkubiert. Dann wird ein Volumen dieser Suspension mit einem identischen Volumen Sepharose 4B-Harz zusammengebracht, das mit menschlichem Transferrin gekuppelt ist. Dieses Affinitätsharz wird gekuppelt, indem menschliches Transferrin (Sigma, St. Louis, USA) an Sepharose 4B-CNBr (Pharmacia) nach den Angaben des Herstellers gepfropft wird. Die Ligandendichte beträgt 5 mg Transferrin/ml Harz. Der Kontakt erfolgt in einem Bad während 1 Std. bei Umgebungstemperatur unter leichtem Rotationsschütteln. Das Harz wird dann in eine Säule gepackt, und das direkte Eluat wird verworfen.
Das Harz wird mit 3 Säulenvolumen 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, der 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,5% Sarkosyl enthält, (Puffer B) und dann mit einem Säulenvolumen Puffer B gewaschen, der 750 mM Guanidinium-HCl enthält. Der Transferrinrezeptor wird dann mit 50 mM Tris-HCl-Puffer, pH-Wert 8,0, der 1 M NaCl, 10 mM EDTA, 0,05% Sarkosyl und 2 M Guanidinium- HCl enthält, eluiert. Die optische Dichte des Eluates wird bei 280 nm am Ausgang der Säule mit einem UV-Detektor gemes sen. Die dem Elutionsmaximum entsprechenden Fraktionen werden vereinigt, und das Protein wird durch Zugabe von drei Volumen eiskaltem Ethanol gefällt.
Nach einer Inkubation über Nacht bei +4ºC wird das Protein durch Zentrifugation für eine Stunde bei 10000 · g gesammelt. Das Präzipitat wird in einem solchen Volumen 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, der 0,5 M NaCl, 5 M Guanidinium- HCl enthält, (Puffer D) aufgenommen, daß die Proteinendkonzentration etwa 1 mg/ml beträgt. Die Lösung wird mit Phenyl- Sepharose-Harz (Pharmacia) zusammengebracht, das zuvor im gleichen Puffer äquilibriert wurde. Die Inkubation erfolgt in einem Bad unter Rotationsschütteln während 2 Stunden bei Umgebungstemperatur. Das Gel wird dann in eine Säule gepackt.
Unter diesen Bedingungen wird die hochmolekulargewichtige Untereinheit (Tbp1) im direkten Eluat gesammelt, während die Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht (Tbp2) an das Harz gebunden ist. Die Säule wird mit drei Volumen Puffer D, dann mit 5 Volumen 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, gewaschen. Tbp2 wird mit 10 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,0, der 0,5% Sarkosyl enthält, eluiert. Der im Elutionspuffer für Tbp2 enthaltene Überschuß an Sarkosyl wird durch Ethanolfällung entfernt, das Protein wird anschließend in 50 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 8,0, der 0,05% Sarkosyl enthält, (Puffer C) aufgenommen.
Die Lösung wird dann über eine Membran mit 0,22 um-Poren filtriert. Der Proteingehalt wird bestimmt und durch Zugabe von Puffer C unter sterilen Bedingungen auf 1 mg/ml eingestellt. Diese Präparation wird bei -70ºC aufbewahrt.

BEISPIEL 4: Reinigung der Untereinheit mit dem niedrigeren Molekulargewicht aus dem N. meningitidis Stamm 2169 durch hydrophobe Chromatographie

Die Kultur des N. meningitidis Stammes 2169 und die Reinigung der Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht des Transferrinrezeptors (Tbp2) erfolgen unter den gleichen Bedingungen, wie in Beispiel 3 beschrieben.

BEISPIEL 5: Demonstration der Bedeutung der Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht als Impfstoff.

Die bakterizide Aktivität von Seren wird bestimmt, die spezifisch gegen die Untereinheit mit niedrigerem Molekulargewicht (Tbp2) des Transferrinrezeptors der N. meningitidis- Stämme 2394 und 2169 gerichtet sind.
Dazu werden die Tbp2-Untereinheiten durch hydrophobe Chromatographie präpariert, wie in den Beispielen 3 und 4 beschrieben.
Neuseeland-Albinokaninchen erhalten subkutan und intramuskulär 50 ug des aus dem Stamm 2394 oder 2169 isolierten Tbp2 in Gegenwart von komplettem Freund'schen Adjuvans (Difco). 21 und 42 Stunden nach der ersten Injektion erhalten die Kaninchen erneut 50 ug der gereinigten Tbp2-Untereinheit in Gegenwart von inkomplettem Freund'schen Adjuvans. 15 Tage nach der nächsten Injektion wird das Serum der Tiere entnommen, das Komplement zerstört und das Serum durch eine Membran mit 0,45 um-Poren filtriert.
Eine Verdünnungsreihe wird von jedem der Anti-Tbp2-2394- und Anti-Tbp2-2169-Antiseren in M199-Medium (Gibco) hergestellt. 200 ul jeder Verdünnung werden in die Löcher einer Makrotiterplatte (8 · 12 Inch) überführt. Als Bezugsprobe dienen 200 ul M199-Medium. In jedes Loch werden gegeben: (i) 100 ul einer Kultur eines N. meningitidis-Stammes in der exponentiellen Wachstumsphase in Mueller-Hinton-Medium mit 30 uM EDDA und (ii) 100 ul Komplement (verdünntes Serum eines Jungkaninchens).
Nach 30minütiger Inkubation bei 37ºC unter leichtem Schütteln wird in jedes Loch 1 ml Mueller-Hinton-Medium gegeben, das 1 ml geschmolzenen Topagar enthält. Nach dem Festwerden des Mediums wird die Inkubation 18-24 Stunden bei 37ºC fortgesetzt; dann wird die Anzahl der koloniebildenden Einheiten in jedem Loch bestimmt. Der Kehrwert der letzten Verdünnung des Antiserums, in deren Gegenwart 50% Lyse, verglichen mit der Bezugsprobe, beobachtet wird, entspricht dem Bakterizidtiter.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt: Bakterizidaktivität der Anti-Tbp2-2394- und Anti-Tbp2-2169-Antiseren
Das Antiserum wirkt bakterizid gegenüber dem Stamm, aus dem das Tbp2 isoliert wurde. Das zeigt, daß die induzierten Anti-Tbp2-Antikörper funktionell sind und das Bakterium in Gegenwart von Komplement lysieren können.

BEISPIEL 6: Pharmazeutische Impfzusammensetzung zur Vorbeugung von N. meningitidis-Infektionen

Die im Beispiel 3 oder 4 erhaltene sterile Lösung wird aufgetaut. Zur Herstellung vvn einem Liter Impfstoff, der 200 ug/ml Wirkstoff enthält, werden die nachstehenden Lösungen steril gemischt:
- Lösung mit 1 mg/ml der Tbp2-Untereinheit des 2394- (oder 2169-) Rezeptors in Puffer C 200 ml
- Gepufferte Salzlösung (PBS), pH-Wert 6,0 300 ml
- Aluminiumhydroxid mit 10 mg Al&spplus;&spplus;&spplus;/ml 50 ml
- 1% (Gew./Vol.) Merthiolat in PBS 10 ml
- PBS, Q. s. ad 1000 ml

BEISPIEL 7: Pharmazeutische Impfzusammensetzung zur Vorbeugung von N. meningitidis-Infektionen

Die in den Beispielen 3 und 4 erhaltenen sterilen Lösungen werden aufgetaut. Zur Herstellung von einem Liter Impfstoff, der 100 ug/ml von jedem der Wirkstoffe enthält, werden die nachstehenden Lösungen steril gemischt:
- Lösung mit 1 mg/ml der Tbp2-Untereinheit des 2394-Rezeptors in Puffer C 100 ml
- Lösung mit 1 mg/ml der Tbp2-Untereinheit des 2169-Rezeptors in Puffer C 100 ml
- Gepufferte Salzlösung (PBS), pH-Wert 6,0 300 ml
- Aluminiumhydroxid mit 10 mg Al&spplus;&spplus;&spplus;/ml 50 ml
- 1% (Gew./Vol.) Merthiolat in PBS 10 ml
- PBS, Q. s. ad 1000 ml Fig. 1 Fig. 1 (Fortsetzg.) Fig. 2 Fig. 2 (Fortsetzg.) Fig. 2 (Fortsetzg.)

Claims

1. Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus einem N. meningitidis-Stamm in gereinigter Form; Peptid, dessen Aminosäuresequenz von einem Fragment der Sequenz der Untereinheit stammt; oder ein Analogon der Untereinheit, dessen Aminosäuresequenz mindestens 80% Homologie mit der Sequenz der Untereinheit aufweist, wobei die immunogenen Eigenschaften der Untereinheit bei dem Peptid oder Analogon konserviert sind.

2. Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus einem N. meningitidis-Stamm der Serogruppe B in gereinigter Form.

3. Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus einem N. meningitidis-Stamm in gereinigter Form, wobei die Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 65 bis 74; kD hat.

4. Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus dem N. meningitidis- Stamm 2394, deren Aminosäuresequenz die in der SEQ ID NR: 1 gezeigte ist, in gereinigter Form.

5. Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus dem N. meningitidis-Stamm in gereinigter Form, wobei die Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 75 bis 90 kD hat.

6. Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus dem N. meningitidis- Stamm 2169, deren Aminosäuresequenz die in der SEQ ID NR: 2 gezeigte ist, in gereinigter Form.

7. Pharmazeutische Impfstoffzusammensetzung, umfassend als therapeutisches Mittel die Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus mindestens einem N. meninpitidis-Stamm; ein Peptid, dessen Aminosäuresequenz von einem Fragment der Sequenz der Untereinheit stammt; oder ein Analogon der Untereinheit, dessen Aminosäuresequenz mindestens 80% Homologie mit derjenigen der Untereinheit aufweist, in Abwesenheit der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des Rezeptors.

8. Pharmazeutische Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 7, umfassend als therapeutisches Mittel die Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus mindestens einem N. meningitidis-Stamm.

9. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, umfassend die Untereinheit des menschlichen Transferrin-Re zeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus mindestens einem N. meningitidis-Stamm der Serogruppe B.

10. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, umfassend als therapeutisches Mittel die Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus einem N. meningitidis-Stamm, wobei die Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 65 bis 74 kD hat.

11. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 10, umfassend als therapeutisches Mittel die Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus N. meningitidis 2394, deren Aminosäuresequenz die in der SEQ ID NR: 1 gezeigte ist.

12. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 8, umfassend als therapeutisches Mittel die Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus einem N. meningitidis-Stamm, wobei die Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 75 bis 90 kD hat.

13. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 12, umfassend als therapeutisches Mittel die Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus N. meningitidis 2169, deren Aminosäuresequenz die in der SEQ ID NR: 2 gezeigte ist.

14. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend als therapeutisches Mittel:

i) eine erste Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus einem ersten N. meningitidis-Stamm, wobei diese erste Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 65 bis 74 kD hat; und

ii) eine zweite Untereinheit des menschlichen Transferrin- Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus einem zweiten N. meningitidis-Stamm, wobei diese zweite Untereinheit ein Molekulargewicht von etwa 75 bis 90 kD hat; in Abwesenheit der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des Rezeptors des ersten und des zweiten N. meningitidis-Stammes.

15. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 14, umfassend als therapeutisches Mittel:

i) die Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus N. meningitidis 2394, deren Aminosäuresequenz die in der SEQ ID NR: 1 gezeigte ist; und

ii) die Untereinheit des menschlichen Transferrin-Rezeptors mit dem geringeren Molekulargewicht aus N. meningitidis 2169, deren Aminosäuresequenz die in der SEQ ID NR: 2 gezeigte ist;

in Abwesenheit der Untereinheit mit hohem Molekulargewicht des Rezeptors der Stämme N. meningitidis 2394 und 2169.