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DE69229174T2 - Verwendung von haloalkylderivaten von reportermolekülen zur analyse der metabolischen aktivität in zellen - Google Patents

Verwendung von haloalkylderivaten von reportermolekülen zur analyse der metabolischen aktivität in zellen

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Claims (21)

1. Verfahren für die Retention eines durch die Aktivität eines intrazellularen Enzym gebildeten nachweisbaren Fluoreszenzreaktionsprodukts in einer Zelle, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
a) Kontaktieren der Zelle mit einer biologisch verträglichen Lösung, die ein Substrat der Form
XR-REPORTER-BLOCK
enthält, in der -BLOCK eine Gruppe darstellt, die so gewählt wird, daß sie durch die Einwirkung des Enzyms entfernt werden kann, wodurch man REPORTER erhält, dessen spektrale Eigenschaften sich von denjenigen des Substrats unterscheiden;
-REPORTER- ein Molekül darstellt, das, wenn es nicht mehr durch eine BLOCK-REPORTER-Bindung an BLOCK gebunden ist, über Spektraleigenschaften verfügt, die sich von denjenigen des Substrats unterscheiden; und
XR- einen Halogenalkylrest darstellt, in dem X Cl, I oder Br darstellt und R 1-4 Kohlenstoffatome enthält, der zu einer kovalenten Reaktion mit einem intrazellularen Thiol (Z-S-K) unter Bildung eines Thioetherkonjugats (Z-S-R-) fähig ist, wobei die Zelle mit der biologisch verträglichen Lösung unter Bedingungen kontaktiert wird, unter denen das Substrat in intrazellulare Räume der Zelle, die möglicherweise das Enzym enthält, eintreten kann; und
b) Vorsehen eines genügend langen Zeitraums, damit man durch Einwirkung des Enzyms BLOCK entfernt, wodurch man REPORTER mit unterschiedlichen Spektraleigenschaften erhält, und damit XR mit dem intrazellularen Thiol unter Bildung des Thioetherkonjugats innerhalb der Zelle reagieren kann;
wobei das Verfahren gegebenenfalls folgende weitere Schritte umfaßt:
c) Vorbereiten der Zelle für den Nachweis bzw. die Messung der Fluoreszenz von REPORTER; und gegebenenfalls
d) Durchführen dieses Nachweises bzw. dieser Messung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, in dem
a) BLOCK einen einwertigen Rest darstellt, der durch Entfernung einer Hydroxygruppe von einem Phosphat oder von einem Sulfat erhalten wird, oder ein biologisch verträgliches Salz solch eines Rests darstellt; oder einen einwertigen Rest, der durch Entfernung einer Hydroxygruppe von einer Carboxygruppe einer aliphatischen Säure, aromatischen Säure, einer Aminosäure oder eines Peptids erhalten wird, darstellt; oder einen einwertigen Rest, der durch Entfernung einer Hydroxygruppe von einem Alkohol oder von einem Mono- oder Polysaccharid erhalten wird, darstellt, oder
b) -REPORTER- ein Molekül darstellt, das an BLOCK durch eine BLOCK-REPORTER-Bindung gebunden ist, bei der es sich entweder
i) um eine Amidbindung, die durch Entfernung einer Hydroxygruppe von einer Carbonsäure einer Aminosäure oder eines Peptids und einem Wasserstoffatom von einem Aminorest an REPORTER entsteht, handelt; oder
ii) um eine Ether- oder Thioetherbindung, die durch Entfernung einer Hydroxygruppe von einem Niederalkohol mit 6 oder weniger Kohlenstoffatomen oder einer Hydroxygruppe von einem Mono- oder Polysaccharid und einem Wasserstoffatom von einem Phenol- oder Thiophenolrest an REPORTER entsteht, handelt; oder
iii) um eine Esterbindung, wobei der Ester ein Ester einer aliphatischen oder aromatischen Carbonsäure oder von Phosphorsäure oder Schwefelsäure ist, oder eines biologisch verträglichen Salzes davon ist, handelt;
so daß, wenn REPORTER nicht mehr über eine BLOCK- REPORTER-Bindung an BLOCK gebunden ist, REPORTER über Spektraleigenschaften verfügt, die sich von denjenigen des Substrats unterscheiden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem es sich bei REPORTER um ein Anthracen, Benzphenalenon, Cumarin, Fluorescein, Naphthalen, Phenalenon, Pyren, Resorufin oder Rhodamin handelt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem -REPORTER-, wenn an BLOCK gebunden, im wesentlichen nicht fluoresziert und bei dem bei Entfernung von BLOCK REPORTER fluoresziert.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das Substrat ein Amid eines 7-Aminocumarins und einer Aminosäure oder eines Peptid bedeutet und XR XCH&sub2; bedeutet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem die BLOCK-REPORTER-Bindung eine Esterbindung darstellt, in der der Ester ein Ester einer Guanidinbenzoesäure, Phosphorsäure oder Schwefelsäure oder ein biologisch verträgliches Salz davon ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die Zelle für den Nachweis oder die Messung der Fluoreszenz von REPORTER vorbereitet wird, wobei die Vorbereitung das Fixieren der Zelle mit einem aldehydhaltigen Fixiermittel umfaßt, so daß REPORTER innerhalb der fixierten Zelle zurückgehalten wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, bei dem das Thioetherkonjugat innerhalb der Zelle für die Dauer von mindestens einer Zellteilung zurückgehalten wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das weiterhin die Sortierung der Zelle aufgrund der Fluoreszenz von REPORTER innerhalb der Zelle umfaßt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Enzym um
i) β-Galactosidase, β-Glucosidase oder β-Glucuronidase; oder
ii) eine alkalische Phosphatase, saure Phosphatase, Arylsulfatase oder Guanidinbenzoatase, oder
iii) eine Peptidase handelt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, bei dem
i) das Enzym in der Zelle aufgrund der Expression einer transfizierten Nukleinsäuresequenz vorliegt, oder
ii) das Enzym die Expression eines Markergens anzeigt.
12. Substrat der Formel
XR-REPORTER-BLOCK
in der BLOCK einen einwertigen Rest darstellt, der durch Entfernung einer Hydroxygruppe von Phosphat oder von Sulfat erhalten wird, oder ein biologisch verträgliches Salz solch eines Rests darstellt;
oder einen einwertigen Rest, der durch Entfernung einer Hydroxygruppe von einer Carboxygruppe einer aromatischen Carbonsäure oder einer Aminosäure oder eines Peptids erhalten wird, darstellt; oder
einen einwertigen Rest, der durch Entfernung einer Hydroxygruppe von einem Alkohol oder von einem Mono- oder Polysaccharid erhalten wird, darstellt, wobei BLOCK so gewählt wird, daß es von -REPORTER- durch Einwirkung eines Enzyms entfernt werden kann, wodurch man -REPORTER- erhält, dessen spektrale Eigenschaften sich von denjenigen des Substrats unterscheiden;
-REPORTER- ein Molekül darstellt, das, wenn es nicht mehr durch eine BLOCK-REPORTER-Bindung an BLOCK gebunden ist, über Spektraleigenschaften verfügt, die sich von denjenigen des Substrats unterscheiden; und
XR- einen Halogenalkylrest darstellt, in dem X ein einzelnes Cl, I oder Br darstellt und R 1-4 Kohlenstoffatome enthält;
unter der Voraussetzung, daß das Substrat nicht die Formel
aufweist, in der A einen Halogenalkylrest darstellt;
und unter der weiteren Voraussetzung, daß das Substrat nicht die Formel
aufweist, in der X ein Halogen darstellt,
R&sub1; -H oder -CH&sub3; darstellt,
R&sub4; -H oder -CH&sub3; darstellt,
mindestens einer der Reste R² oder R³ -OCH&sub3; darstellt, während der andere -H, eine Alkylgrupppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, -OH, -OCH&sub3; oder ein Halogenatom darstellt.
13. Substrat nach Anspruch 12, bei dem
i) REPORTER ein Anthracen, Benzphenalenon, Cumarin, Fluorescein, Naphthalin, Phenalenon, Pyren, Resorufin oder Rhodamin darstellt; oder
ii) REPORTER ein Fluorescein, Rhodamin, Resorufin, Phenalenon oder Benzphenalenon darstellt und XR XCH&sub2; darstellt.
14. Substrat nach Anspruch 13, bei dem XR ClCH&sub2; darstellt.
15. Substrat nach einem der Ansprüche 12 bis 14, bei dem es sich bei der BLOCK-REPORTER-Bindung
i) um eine Amidbindung, die durch Entfernung einer Hydroxygruppe von einer Carbonsäure einer Aminosäure oder eines Peptids und einem Wasserstoffatom von einem Aminorest an REPORTER entsteht, handelt; oder
ii) um eine Etherbindung, die durch Entfernung einer Hydroxygruppe von einem Niederalkohol mit 6 oder weniger Kohlenstoffatomen oder einer Hydroxygruppe von einem Mono- oder Polysaccharid und einem Wasserstoffatom von einem Phenolrest an REPORTER entsteht, handelt; was Amidbindungen und Etherbindungen umfaßt; oder
iii) um eine Esterbindung, wobei der Ester ein Ester einer aromatischen Carbonsäure oder von Phosphorsäure oder Schwefelsäure ist, oder eines biologisch verträglichen Salzes davon ist, handelt.
16. Substrat nach einem der Ansprüche 12 bis 15, bei dem
i) das Monosaccharid β-D-Galactose, β-D-Glucose oder β-D-Glucuronsäure und XR ClCH&sub2; darstellt; oder
ii) das Monosaccharid β-D-Galactose, β-D-Glucose oder β-D-Glucuronsäure XR ClCH&sub2; und REPORTER ein Fluorescein darstellt.
17. Substrat nach Anspruch 12, bei dem es sich um ein Amid eines 7-Aminocumarins und einer Aminosäure oder eines Peptids oder eines biologisch verträglichen Salzes einer Aminosäure oder eines Peptids handelt und XR XCH&sub2; darstellt.
18. Substrat nach Anspruch 12, bei dem es sich um ein Amid eines Rhodamins handelt und XR XCH&sub2; darstellt.
19. Verwendung zur Bildung eines Reaktionsprodukts einer Enzymaktivität, das in einer Zelle durch Bindung mit einer Thiolgruppe einer Verbindung der folgenden Formel zurückgehalten werden kann:
XR-REPORTER-BLOCK
in der -BLOCK eine Gruppe darstellt, die so gewählt wird, daß sie durch die Einwirkung des Enzyms entfernt werden kann, wodurch man REPORTER erhält, dessen spektrale Eigenschaften sich von denjenigen des Substrats unterscheiden;
-REPORTER- ein Molekül darstellt, das, wenn es nicht mehr durch eine BLOCK-REPORTER-Bindung an BLOCK gebunden ist, über Spektraleigenschaften verfügt, die sich von denjenigen des Substrats unterscheiden; und
XR- einen Halogenalkylrest darstellt, in dem X Cl, I oder Br darstellt und R 1-4 Kohlenstoffatome enthält, der zu einer kovalenten Reaktion mit einem intrazellularen Thiol (Z-S-H) unter Bildung eines Thioetherkonjugats (Z-S-R-) fähig ist.
20. Verwendung nach Anspruch 19, wobei (i) das Reaktionsprodukt fluoresziert, (ii) die Verbindung wie weiter in einem der Ansprüche 2 bis 6 oder 12 bis 18 definiert ist und/oder (iii) -BLOCK durch ein wie in Anspruch 10(i), 10(ii) oder 10(iii) definiertes Enzym entfernt werden kann.
21. Verwendung eines wie in einem der Ansprüche 12 bis 18 definierten Substrats als Substrat zur Bildung eines intrazellular zurückhaltbarer. Fluoreszenzfarbstoffs aufgrund von intrazellularer Enzymeinwirkung.
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