DE69230785T2

DE69230785T2 - Änderung von Fettsäuren durch eine Desaturase in transgenischem Pflanzengewebe

Info

Publication number: DE69230785T2
Application number: DE69230785T
Authority: DE
Inventors: W. Scott Grayburn; David F. Hildebrand
Original assignee: University of Kentucky Research Foundation
Current assignee: University of Kentucky Research Foundation
Priority date: 1991-12-31
Filing date: 1992-12-07
Publication date: 2000-08-10
Anticipated expiration: 2012-12-08
Also published as: EP0550162A1; JPH0698777A; HUT63653A; MX9207053A; KR930013121A; CA2084348A1; EP0550162B1; AU3018792A; NZ245367A; AU6069396A; AU671962B2; PL171514B1; ATE190661T1; HU9204175D0; DE69230785D1; PL297262A1; US5866789A

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft die Veränderung der Synthese von Fettsäuren und der entsprechenden Zusammensetzungen von Triacylglyceriden in Pflanzen durch Einsatz eines Fettsäure-Coenzym A- oder Δ9-Desaturase-Gens.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Pflanzen produzieren natürlicherweise ein Spektrum von Fettsäuren und synthetisieren ein noch breiteres Spektrum von Lipiden, einschließlich Mono-, Di- und Triacylglyceriden, Phospholipiden, Glycolipiden und anderen, aus den Fettsäuren, die sie herstellen. Das spezifische Spektrum von Lipiden, das von jeder bestimmten Pflanze hergestellt wird, wird sowohl durch den Genotyp der Pflanze als auch durch die Reaktion der Pflanze auf Umweltfaktoren wie Wärme, Kälte, Trockenheit etc. bestimmt. Unabhängig von den Umweltbedingungen kann jedoch eine Pflanze niemals eine Fettsäure oder Lipidzusammensetzung produzieren, für welche sie nicht die notwendige biochemische Maschinerie besitzt, und solche biochemischen Stoffwechselwege werden letztlich durch den Genotyp bestimmt. Traditionelle Verfahren der genetischen Modifikation beinhalten Verfahren genetischer Rekombination, die vom Pflanzenzüchter auf der Ebene der ganzen Pflanze gesteuert werden. Diese Verfahren, obwohl gut charakterisiert und einfach durchzuführen, ergeben typischerweise inkrementale Verbesserungen des Ölgehalts und der Zusammensetzung durch Optimierung der natürlichen Biochemie, anstatt neue biochemische Stoffwechselwege zur Verfügung zu stellen.
Gleichzeitig besteht aufgrund ihres Einflusses auf die Nahrungsmittelqualität und ihrer Bedeutung bei biologischen Prozessen ein andauerndes Interesse an der Veränderung von Feusäure-Desaturierungsmechanismen in Pflanzen. Die Eigenschaften von Fetten und Ölen werden durch ihre Fettsäurezusammensetzung bestimmt, welche wiederum die Nahrungsqualität und oxidative Stabilität beeinflußt. Gleichermaßen hängen die speziellen Strukturen und Zusammensetzungen anderer Pflanzenlipide, welche die Pflanze aus Fettsäuren synthetisiert, von der Zusammensetzung des Fettsäure-Pools ab, welcher als Vorläufer für die Biosynthese dieser Lipide zur Verfügung steht.
In jüngster Zeit bestand Interesse an der Verringerung des Gehalts an gesättigten Fettsäuren in Nahrungsmitteln. Medizinische Forschung und Ernährungsforschung veranlaßten viele Produzenten von Nahrungsmitteln und Nahrungsmittelkomponenten, bestimmte Zusammensetzungen in ihren Nahrungsmitteln und Nahrungsmittelkomponenten auf Fett- und Ölbasis zu wünschen. Diese erwünschten Zusammensetzungen besitzen häufig einen hohen Gehalt an einfach und mehrfach ungesättigten Fettsäuren und entsprechenden Triacylglyceridspeichern oder einen geringen Gehalt an gesättigten Fettsäuren und auf gesättigten Fettsäuren basierenden Triacylglyceriden. Industrielle Verbraucher von Fetten und Ölen pflanzlichen Ursprungs haben auch Präferenzen hinsichtlich der Anforderungen an Ausgangsmaterialien, die in ihren industriellen Verfahren eingesetzt werden, und solche Anforderungen verlangen oft große Prozentsätze einer einzigen Fettsäuregruppe. Oft ist die bevorzugte Fettsäuregruppe eine ungesättigte Fettsäuregruppe, wie z. B. Palmitoleat, Oleat, Linoleat oder Linolenat. Unglücklicherweise kooperiert die Natur nicht durch die Bereitstellung von Ölsaat-Pflanzen, welche die bevorzugten Zusammensetzungen produzieren. Es wurden deshalb Anstrengungen unternommen, um Ölsaat-Varietäten und -Hybride zu entwickeln, welche pflanzliche Öle mit einem höheren Gehalt an einfach ungesättigten Fettsäuren ergeben. Angesichts der inkrementalen Natur der genetischen Verfahren mit ganzen Pflanzen besteht jedoch weiterhin der Bedarf und der Wunsch nach Zusammensetzungen und Verfahren, welche biochemische Stoffwechselwege auf der Einzelgen-Ebene mittels Gentechnik beeinflussen und zur Verfügung stellen können.
Auch wenn traditionelle Pflanzenzüchtungsverfahren bei der Veränderung der Fettsäurezusammensetzung in den Lipiden einer Pflanzenvarietät erfolgreich sind, weisen die nativen biochemischen Stoffwechselwege der Pflanze weiterhin alle ihre der Fachwelt bekannten charakteristischen Eigenschaften und Begrenzungen auf. So zeigen beispielsweise Ölsaat-Erntepflanzen, welche durch Pflanzenzüchtung verbessert wurden, die üblichen Reaktionen auf Umweltveränderungen. Diese Reaktionen umfassen eine Tendenz zur Produktion höherer Prozentsätze an gesättigten Fetten unter wärmeren Wachstumsbedingungen und höherer Prozentsätze an ungesättigten Fetten unter kühleren Wachstumsbedingungen, was die verläßliche Produktion von Ölsaaten mit einer speziellen Fettsäurezusammensetzung so schwierig wie die Voraussage des Wetters macht. Somit wäre es auch sehr wünschenswert, über Mittel zur Kompensierung dieser Umwelteinflüsse zu verfügen. Bisher wurden wenig Anstrengungen hinsichtlich dieses Ziels unternommen.
Schließlich besteht ein andauernder Wunsch nach Verbesserung und Erweiterung des Umweltbereiches von Erntepflanzen. Einige Ölsaat-Spezies, die aus gemäßigten, subtropischen und tropischen Regionen stammen, sind schlecht an kühlere Produktionsgebiete angepaßt. Selbst Ölsaaten, die sich für kältere Klimate eignen, können von einer weiteren Adaption profitieren, nachdem die Vorverlegung der Pflanzzeit im Frühling und die Verlängerung der Wachstumssaison im Sommer und Herbst manchmal für höhere Ernteerträge genutzt werden kann. Pflanzenzüchter richteten sehr viel Aufmerksamkeit auf einen Aspekt der notwendigen klimatischen Adaption, die Reifungsgeschwindigkeit, jedoch ist ein weiterer wichtiger Aspekt der klimatischen Adaption die Kältetoleranz (im Unterschied zu Frosttoleranz).

KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 ist eine Plasmidkarte des Plasmids, welches bei der in den Beispielen 1-5 beschriebenen Transformationsarbeit eingesetzt wurde.
Fig. 2 ist ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse der Experimente der Beispiele 1--4 darstellt und Unterschiede in den 16 : 1/16 : 0- und 18 : 1/18 : 0-Verhältnissen bei Kontrollgewebe und transformiertem Callusgewebe zeigt.
Fig. 3 ist ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse der Experimente der Beispiele 1-4 darstellt und ein computererzeugtes Bild von Gelen zeigt, welche die Anwesenheit des Gens dieser Erfindung, wie durch PCR amplifiziert, zeigen.
Fig. 4 ist ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse der Experimente der Beispiele 14 darstellt und Unterschiede in den 16 : 1/16 : 0- und 18 : 1/18 : 0-Verhältnissen bei Kontrollgewebe und transformiertem Pflanzengewebe zeigt.
Fig. 5 ist ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse der Beispiele 1-4 darstellt und Unterschiede in den 16 : 0-, 18 : 2- und 18 : 3-Fettsäure-Prozentsätzen bei Kontrollpflanzen und transformierten Pflanzen zeigt.
Fig. 6 ist ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse der Experimente der Beispiele 1-4 darstellt und Unterschiede in den prozentualen 16 : 1-, 16 : 3-, 18 : 0- und 18 : 1-Niveaus zwischen Kontrollgewebe und transformiertem Pflanzengewebe zeigt.
Fig. 7 ist ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse der Experimente der Beispiele 1-4 darstellt und Unterschiede in den 16 : 1116 : 0- und 18 : 1/18 : 0-Verhältnissen bei Kontrollgewebe und transformiertem Pflanzengewebe zeigt.
Fig. 8 ist ein Balkendiagramm, welches die Ergebnisse der Experimente der Beispiele 1-5 darstellt und Veränderungen der Verhältnisse von gesättigten zu ungesättigten Fettsäuren in reifer Saat der erfindungsgemäß transformierten Pflanzen zeigt.

OFFENBARUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt eine chimäre Expressionskassette bereit, umfassend einen cDNA-Klon, welcher für eine Säuger-Fettsäure-Coenzym A-Desaturase kodiert, in funktionsfähiger Verknüpfung mit regulatorischen Sequenzen, welche die Expression des cDNA-Klons in Pflanzenzellen veranlassen.
Vorzugsweise ist das Fettsäure-Coenzym A-Desaturase-Gen ein Stearyl-Coenzym A- Desaturase-Gen. Das Stearyl-Coenzym A-Desaturase-Gen stammt vorzugsweise aus der Ratte. Die Expressionskassette ist gegebenenfalls imstande, in einer Bakterienzelle repliziert zu werden.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Bakterienzellen bereit, welche mindestens eine Kopie einer Expressionskassette wie oben beschrieben als fremdes Plasmid enthalten.
Durch die vorliegende Erfindung werden auch transformierte Pflanzenzellen bereitgestellt, welche mindestens eine Kopie der oben beschriebenen Expressionskassette enthalten. Solche transformierten Pflanzenzellen können von einer einkeimblättrigen Spezies sein, vorzugsweise Zellen von Mais, Sorghum, Weizen, Palme oder Reis. Alternativ können die transformierten Pflanzenzellen von einer zweikeimblättrigen Spezies stammen, vorzugsweise Zellen von Sojabohne, Rapssamen, Jojoba, Chinesischem Lichtnußbaum, Tabak, Saflor, Erdnuß oder Sonnenblume.
Die vorliegende Erfindung stellt auch eine Zellkultur oder Gewebekultur, umfassend Zellen wie oben beschrieben, bereit.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Erhöhung der prozentualen Zusammensetzungsanteile ungesättigter Fettsäuregruppen und entsprechender Fettsäure-abgeleiteter Lipide in Pflanzenzellen und ganzen Pflanzen bereitgestellt, umfassend den Schritt der Einführung einer chimären Expressionskassette wie oben beschrieben in solche Pflanzenzellen oder in die Zellen solcher ganzen Pflanzen. Das Verfahren kann auch den weiteren Schritt der sexuellen oder klonalen Reproduktion der ganzen Pflanzen auf solche Weise umfassen, daß mindestens eine Kopie der von der Expressionskassette bereitgestellten Sequenz in den Zellen der Nachkommenschaft der Reproduktion vorhanden ist.
Vorzugsweise wird die Expressionskassette in die Zellen durch Elektroporation, Mikroteilchenbeschuß oder Mikroinjektion eingeführt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird auch ein Verfahren zur Erhöhung der prozentualen Zusammensetzungsanteile ungesättigter Fettsäuregruppierungen und entsprechender Fettsäureabgeleiteter Lipide in für ein Agrobacterium empfänglichen zweikeimblättrigen Pflanzen bereitgestellt, wobei die Expressionskassette in die Zellen durch Infektion der Zellen mit Agrobakterien eingeführt wird, in denen ein Plasmid modifiziert wurde, um die Expressionskassette wie oben beschrieben zu enthalten.
Ungesättigte Fettsäuren werden durch verschiedene Enzyme in Pflanzen und Tierzellen produziert und es besteht wenig strukturelle Homologie oder Sequenzhomologie zwischen den in Tierzellen und Hefezellen gefundenen Desaturasen und den entsprechenden Enzymen in Pflanzen. Es wurde jedoch nun festgestellt, daß, wenn ein Konstrukt gemäß dieser Erfindung, enthaltend ein Gen für eine Coenzym A-abhängige Desaturase, durch ein übliches Transformationsverfahren, wie z. B. Mikroteilchenbeschuß, Agrobacterium-Infektion oder Mikroinjektion, in Pflanzenzellen eingeführt wird, das Gen in den Zellen unter der Kontrolle der benachbarten regulatorischen Pflanzensequenzen exprimiert wird und erfolgreich mit der biosynthetischen Maschinerie wechselwirkt, welche natürlicherweise in den Pflanzenzellen vorliegt, um die Desaturierung der natürlicherweise hergestellten Palmitat- und Stearatgruppierungen unter Bildung von Palmitoleat und Oleat zu katalysieren. Durch Veranlassung der Bildung größerer Mengen dieser einfach ungesättigten Verbindungen begünstigt diese Erfindung auch die Produktion anderer Fettsäuregruppen mit höheren Graden an Ungesättigtheit, für welche die einfach ungesättigten Verbindungen als Vorläufer dienen. Diese ungesättigten Gruppen sind identisch mit natürlich vorkommenden ungesättigten Fettsäuregruppen und können dann in Triacylglycerid-Speicherlipide in den Pflanzengeweben mittels existierender biochemischer Stoffwechselwege inkorporiert werden. Auf diese Weise wird der prozentuale Zusammensetzungsanteil der ungesättigten Fettsäuregruppen und der entsprechenden Triacylglyceride (ebenso wie der Mono- und Diacylglyceride, Phospholipide und anderer Fettsäure-abgeleiteter Lipide) erhöht. Somit stellt diese Erfindung auch Pflanzenzellen und ganze Pflanzen mit erhöhten prozentualen Zusammensetzungsanteilen ungesättigter Fettsäuregruppen und entsprechender Fettsäure-abgeleiteter Lipide bereit, wobei die Pflanzenzellen ein chimäres Genkonstrukt gemäß dieser Erfindung enthalten. Ebenfalls bereitgestellt werden Verfahren zur Erhöhung der prozentualen Zusammensetzungsanteile ungesättigter Fettsäuregruppen und entsprechender Fettsäure-abgeleiteter Lipide in Pflanzenzellen und ganzen Pflanzen, umfassend den Schritt der Einführung eines chimären Genkonstrukts gemäß dieser Erfindung in solche Pflanzenzellen oder die Zellen solcher ganzen Pflanzen.
Bei Betrachtung der Tabakpflanze als Modellsystem werden hauptsächlich zwei gesättigte Fettsäuren in Tabakblättern gefunden, Palmitin (16 : 0)- und Stearin (18 : 0)-Säure. Bei Verwendung dieser Moleküle als Substrate werden Doppelbindungen, jeweils zu einem Zeitpunkt eine, durch aufeinanderfolgende Desaturierungsreaktionen eingeführt. An diesen Reaktionen sind Desaturasen, welche Wasserstoffentfernung katalysieren, und Elektronentransport- Komponenten beteiligt. Bei Pflanzen wird der erste Desaturierungsschritt durch ein lösliches Enzym katalysiert, das in Chloroplasten lokalisiert ist. Bei höheren Pflanzen werden 16 : 1 und 18 : 1 aus Palmitin- und Stearinsäuren gebildet, die mit einem Acyl-Trägerprotein (ACP) oder bestimmten Glycerin-Lipiden verestert sind. Anschließende Desaturierungsreaktionen können sowohl in Plastiden als auch im endoplasmatischen Retikulum stattfinden, wobei anscheinend unterschiedliche Gene für die Enzyme kodieren, welche an den verschiedenen subzellulären Orten gefunden werden. Es wurde geschätzt, daß es mindestens acht Gene gibt, welche die Aktivität spezieller Desaturasen im Pflanzensystem kontrollieren.
In vitro-Studien von Saflor-Desaturase zeigen ein Erfordernis für E. coli-Extrakten zugesetztes Ferridoxin. Ähnliche Ergebnisse wurden für Avocado-Desaturase gefunden.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Erfindung wird die Stearyl-Coenzym A- Desaturase aus der Ratte eingesetzt. Diese ist eine Δ9-Desaturase, welche in der normalen Ratte Elektronen von reduziertem Cytochrom b&sub5; im Cytoplasma benötigt. Bei der normalen Pflanze finden diese Reaktionen jedoch gewöhnlich über eine Δ9-Desaturase im Chloroplasten statt. Intermembran-Formen von Fettsäuren im Cytoplasma können als CoA-Derivate existieren. Es wurde nun festgestellt, daß eine Desaturase von einem Organismus in einem anderen Reich trotz des großen Unterschieds zwischen den Gen- und Proteinsequenzen und Strukturen in den beiden Reichen effektiv mit essentiellen Biostoffwechselweg-Komponenten, die von einer Pflanze bereitgestellt werden, funktionieren kann. Somit beinhaltet diese Erfindung die Schaffung eines biochemischen Stoffwechselwegs in der Pflanze, welcher normalerweise von den CoA-Formen von Fettsäuren Gebrauch macht und eher im Cytoplasma als in den Chloroplasten funktioniert. Die mit dieser Erfindung erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin, daß Cytochrom b&sub5; und Cytochrom b&sub5;-Reduktase, die in Pflanzen vorhanden sind, die entsprechenden Komponenten ersetzen können, welche normalerweise in dem funktionellen Ratten-Desaturase-Komplex gefunden werden.
Es wurde auch festgestellt, daß die Synthese von ungesättigten Fettsäuren und der davon abgeleiteten Lipide eine allgemeine Pflanzenreaktion auf kalte Umweltbedingungen ist. Es wurde gezeigt, daß Bakterien mit veränderten Membran-Fettsäurezusammensetzungen bei niedrigeren Temperaturen überleben als Wildtyp-Stämme. Ohne sich auf eine Theorie festlegen zu wollen, wird angenommen, daß die Synthese dieser Fettsäuren und Lipide, welche bei niedrigeren Temperaturen flüssig bleiben als deren gesättigte Gegenstücke und deshalb zur Aufrechterhaltung der Membran-Fluidität bei niedrigen Temperaturen beitragen, der Pflanze helfen, diese niedrigeren Temperaturen zu tolerieren. Somit bietet die vorliegende Erfindung auch die Gelegenheit, die Kältetoleranz von Pflanzen durch Unterstützung ihrer natürlichen Fähigkeit zur Synthese ungesättigter Fettsäuren und davon abgeleiteter Lipide zu erhöhen.
Umgekehrt versteht es sich, daß Pflanzen auch dazu neigen, unter wärmeren Umweltbedingungen vollständig gesättigte Fettsäuren und davon abgeleitete Lipide zu synthetisieren. Andererseits stammen die in dieser Erfindung eingesetzten Desaturase-Gene typischerweise von Tieren oder Hefen und funktionieren deshalb recht effektiv bei den wärmeren Temperaturen, welche normalerweise von diesen natürlichen Wirtsorganismen bereitgestellt werden. So bietet die vorliegende Erfindung auch die Möglichkeit, die Wirkungen wärmerer Wachstumstemperaturen auf die Lipidzusammensetzung in Ölsaat-Pflanzen zu eliminieren oder zu kompensieren, indem ein Desaturase-Gen bereitgestellt wird, welches bei höheren Temperaturen aktiver ist und somit mit zunehmender Temperatur größere Mengen an Fettsäure- Desaturierungsprodukten produziert.

GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT

Obwohl jede beliebige Pflanzenspezies unter Verwendung der Expressionskassette und Verfahren dieser Erfindung modifiziert werden kann, einschließlich, ohne Beschränkung, Spezies aus den Gattungen Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manicot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Hemerocallis, Nemesia, Pelargonium, Panicum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browallia, Glycine, Lolium, Triticum und Datura, steht zu erwarten, daß die durch diese Erfindung bereitgestellten Fettsäuremodifikationen am vorteilhaftesten in ölproduzierenden Erntepflanzen, wie z. B. Sojabohne, Sonnenblume, Rapssamen, Saflor, Erdnuß, Mais, Flachs, Chinesischer Lichtnußbaum, Jojoba und Palme, genutzt werden.
Das Fettsäure-Coenzym A-Desaturase-Gen kann aus jedem geeigneten tierischen oder Hefe- Wirt kloniert werden, da festgestellt wurde, daß die Sequenz dieses Gens bei Säuger-Spezies hoch konserviert ist und es sogar Bereiche von Homologie zwischen Säuger- und Hefe-Genen gibt. Gene, welche für die Desaturase kodieren, die den 18 : 0-zu-18 : 1-Schritt katalysiert, wurden aus der Ratte, Maus und Hefe kloniert. Das Human-Genom-Projekt wird schließlich die kodierende Sequenz für die Human-Fettsäure-CoA-Desaturase ergeben, welche erwünschtenfalls eingesetzt werden kann. Andererseits wurde keine nachweisbare Identität zwischen der Aminosäuresequenz der Ratten-Stearyl-CoA-Desaturase (in der hier beschriebenen Transformationsarbeit verwendet) und Rizinus (Ricinus communis)-Stearyl-ACP-Desaturase festgestellt, so daß das erforderliche Coenzym A-abhängige Gen nicht von Pflanzen erhalten werden kann.
"Fettsäure-abgeleitete Lipide" bedeutet hier jedes natürlich vorkommende Pflanzenlipid, welches als Vorläufer eine gesättigte oder ungesättigte C&sub1;&sub2;-Säure oder höhere Fettsäure, die in der Pflanze synthetisiert wird, aufweist. Diese schließen, ohne Beschränkung, Mono-, Di- und Triacylglyceride, Phospholipide, wie z. B. Phosphatidylcholin und Phosphatidyl-ethanolamiw Glycolipide und andere Lipide von Blattgeweben und andere ein. Durch Überführung der natürlich vorkommenden Fettsäure-"Ausgangsmaterialien" für die Synthese dieser Verbindungen von gesättigt zu ungesättigt, veranlaßt diese Erfindung die in der Pflanze existierenden natürlichen biochemischen Stoffwechselwege, die Produktion der entsprechenden, von ungesättigten Fettsäuren abgeleiteten Lipide zu bevorzugen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Praxis der vorliegenden Erfindung, ohne diese darauf beschränken zu wollen.

BEISPIEL 1

Konstruktion des Pflanzenexpressionsplasmids

Die cDNA für Stearyl-CoA-Desaturase aus der Ratte besteht aus einer kodierenden 1,1-kb- Sequenz, gefolgt von einer untranslatierten 3,5-kb-Sequenz. Das in den hier vorliegenden Beispielen eingesetzte Gen kodiert für die Aminosäuren 3 bis 356. Das Plasmid pDs3-358, konstruiert wie beschrieben in J. Biol. Chem., 263 : 232-2536, wurde von P. Strittmatter zur Verfügung gestellt. Dieses wurde mit BamHI und SstI verdaut, um ein 1,2-kb-Fragment freizusetzen, welches das Ratten-Desaturase-Gen enthielt. Dieses wurde mit Bluescript SK-+ (Stratagene), verdaut mit BamHI und SstI, ligiert. Dieses Plasmid wurde dann mit Hindill und SstI verdaut, um ein 1,2-kb-Fragment freizusetzen. Der Pflanzenexpressions-vektor pKYLX71 : 355 ist ein Derivat von pKYLX71, worin der CaMV 355-Promotor durch einen 355-Promotor ersetzt wurde, welcher eine Verdoppelung der Basen -416 bis -90, bezogen auf die Transkriptions-Initiationsstelle, enthält. Dieses Plasmid wurde mit Hindill und SstI verdaut, mit alkalischer Kalbsdarmphosphatase behandelt und mit dem oben beschriebenen 1,2-kb- Fragment ligiert, um p71 2RDS zu erzeugen. Neben dem Strukturgen für Ratten-Desaturase enthält dieses Plasmid das Neomycinphosphotransferase-Gen (welches Kanamycinresistenz verleiht), einen RK2-Replikationsursprung für ein breites Wirtsspektrum, T-DNA-Ränder und ein Polyadenylierungssignal. Eine Karte dieses Plasmids ist in Fig. 1 dargestellt. Dem Kontrollplasmid fehlte das Ratten-Desaturase-Strukturgen, es war jedoch ansonsten identisch. Kompetente E. coli TB 1 wurden mit den Plasmiden transformiert. Einzelkolonien wurden von LB-Platten gewonnen, die 50 mg/l Kanamycin und 12,5 mg/l Tetracyclin enthielten. Kolonien wurden in Flüssigkulturen überführt und DNA durch alkalische Lyse präpariert. Plasmide mit der erwarteten Größe wurden für weitere Experimente eingesetzt.

BEISPIEL 2

Pflanzentransformation

Pflanzen von Nicotiana tabacum cv. "Xanthi" wurden mittels Cokultivierung mit A2robacterium tumefaciens gemäß allgemeiner Praxis (siehe beispielsweise den Artikel von Horsch et al., Science, 227 : 1229-12231 von 1985) transformiert, mit Ausnahme dessen, daß Blattstreifen anstelle von Scheiben eingesetzt wurden. Die Selektion auf Kanamycinresistenz erfolgte bei einer Konzentration von 100 mg/l. Callusinduktion, Triebbildung und Wurzelbildung geschahen alle in Gegenwart von Kanamycin. Mefoxin war in den Medien in 300 mg/l enthalten, um die Teilung von A arobacterium tumefaciens zu verhindern.
Die Plasmide pKYLX71 : 355 und p71²RDS wurden aus E. coli in den A. tumefaciens-Stamm LBA4404 mittels triparentaler Paarungen unter Verwendung von pRK2013 als Helferplasmid mobilisiert.

BEISPIEL 3

Pflanzen-DNA-Isolierung und Sequenzamplifizierung

Gesamt-Pflanzen-DNA wurde unter Anwendung einer Extraktion mit abgesäuertem Guanidiniumthiocyanat aus grünen Blättern isoliert. Nachdem die Gesamt-Pflanzen- Nukleinsäuren in 4 M LiCl gemischt und zentrifugiert worden waren, wurde der Überstand (welcher die DNA enthielt) in ein neues Röhrchen überführt und mit zwei Volumina Ethanol gefällt. Die DNA wurde dann zentrifugiert, mit 70%igem Ethanol gewaschen, unter Vakuum getrocknet und in 1 mM Tris, 0,1 mM EDTA. pH 7,5, resuspendiert.
PCR-Reaktionen wurden in einem Gesamtvolumen von 20 ul durchgeführt und enthielten 200 ng Gesamt-Blatt-DNA, 11 ng Primer (5' ACGTGGATCCACCATGCCGGCCCACAT-GCTC 3') und (5' GCTACTCTTGTGGCTCCC 3'), 1 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 50 mM KCl, 10 mM Tris, pH 8,3, 1,5 mM MgCh, 0,01% Gelatine und 1 Einheit Taq-DNA- Polymerase (AmpliTaqTNI DNA-Polymerase, Perkin-Elmer Cetus). Eine negative Kontrolle bestand aus all den gleichen Komponenten mit Ausnahme der Pflanzen-DNA. Eine weitere negative Kontrolle umfaßte DNA aus kanamycinresistenten Pflanzen, die mit dem zur Pflanzentransformation eingesetzten Vektor (pKYLX71 : 355), jedoch ohne die Desaturase- Sequenz, transformiert worden waren. Reaktionsmischungen wurden mit Mineralöl bedeckt und in einen Thermocycler (Lab-Line) eingebracht. Die Temperatur wurde zyklisch auf 95ºC für 2 Sekunden (Denaturierung), dann auf 64ºC und 59ºC für jeweils 2 Sekunden (Annealing) und dann auf 72ºC für 180 Sekunden (Verlängerung) für insgesamt 30 Zyklen gebracht. Die PCR- Produkte wurden auf einem 0,8%igen Agarosegel in TAE-Laufpuffer getrennt. Größenmarker waren 1-kb-DNA-Leitern (BRL).

BEISPIEL 4

Lipid-Fraktionierung und Fettsäure-Analyse

Blattgewebe (etwa 0,5 g) wurde in 3 ml Chloroform : Methanol (2 : 1) eingebracht und in einem Tissumizer (Tekmar) zerkleinert. Lösungsmittel wurden dann in einer Speedvac konzentriert und auf einer Silicagel-60-Platte zur PC-Isolierung fraktioniert. Flecken wurden abgeschabt und Methylester in Schwefelsäure/Methanol wie im folgenden beschrieben hergestellt. Die für Trockengewichtsberechnungen eingesetzten Blattproben wurden lyophilisiert.
Methylester von den Gesamt-Fettsäuren wurden in Glasröhrchen aus 100-200 mg Callusgewebe hergestellt, welches in 2 ml 1%iger Schwefelsäure in Methanol mit einem Tissumizer wie oben beschrieben oder mit Glasstäbchen zerkleinert worden war. Blätter, welche für eine Gesamtfettsäure-Analyse präpariert wurden, wurden nicht zerkleinert. Die Umesterung lief bei 80ºC ab, bis etwa 0,2 ml des Methanols verblieben. Heptadecansäure (17 : 0; 1 mg/ml in Hexan) wurde als interner Standard direkt Pflanzengewebe mit 0,1 mg pro g Gewebefrischgeu-icht zugegeben. Hexan wurde etwa 10 Minuten lang vor der Gewebeextraktion verdampfen gelassen. Die quantitative Bestimmung der Gesamt-Pflanzenfettsäuren erfolgte durch einen Vergleich von Peakflächen auf Chromatogrammen mit Heptadecansäure-Flächen. Für die quantitative Bestimmung von Fettsäuren aus Lipiden, die auf DC-Platten fraktioniert worden waren, wurden 25 mg Nonadecansäure (19 : 0) jedem Fleck vor dem Abschaben zugegeben. Fettsäuremethylester wurden durch Gaschromatographie analysiert wie von Dahmer et al., J. Amer. Oil Chem. Soc. 66 : 543-548 (1989), beschrieben, mit Ausnahme dessen, daß eine Hewlett Packard FFAP-Säule eingesetzt wurde.
Standards für PC, FFA, TG, 16 : 0, etc. stammten von Sigma. Blätter der FadC-Mutante von Arabidopsis thaliana können 16 : 1 anhäufen [Science 252 : 80-87 (1991)]. Blätter der FadD- Mutante können 16 : 2 anhäufen, unter entsprechender Verringerung von 16 : 3. Extrakte aus diesen Blättern und Wildtyp-Blättern wurden zur Bestimmung der Retentionszeiten für 16 : 1, 16 : 2 und 16 : 3 eingesetzt.

ERGEBNISSE

Nach der Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformation wurden kanamycinresistente Tabak-Calli hinsichtlich veränderter Fettsäurezusammensetzung gescreent. Mehrere Calli besaßen höhere Verhältnisse von 16 : 1/16 : 0 und/oder 18 : 1/18 : 0 als die Kontrollen (Fig. 2). Das Verhältnis von 18 : 1/18 : 0 konnte nicht aus dem 16 : 1/16 : 0-Verhältnis vorausgesagt werden. Bei 9 der 10 untersuchten Desaturase-Transformanten war das 18 : 1/18 : 0-Verhältnis höher als das 16 : 1/16 : 0-Verhältnis, wie auch bei Kontroll-Calli zu sehen. Diese Daten legten nahe, daß regenerierte Pflanzen ebenfalls erhöhte Fettsäureniveaus aufweisen könnten.
Daten, welche die Anwesenheit des eingeführten Desaturase-Gens anzeigen, werden in Fig. 3 gezeigt. Die PCR-Amplifizierung der Gesamt-Pflanzen-DNA bestätigte, daß das erwartete 1,1kb-Produkt nicht in zwei Kontrollpflanzen zu sehen ist, welche mit einem Plasmid transformiert wurden, dem das Ratten-Desaturase-Gen fehlt. Fig. 4 bis 7 stellen Daten, welche aus der Analyse von Blättern von diesen selben Pflanzen erhalten wurden, graphisch dar.
Wie bei Calli, wurde erhofft, daß Blätter, die das Ratten-Desaturase-Gen beherbergen, eine Erhöhung der 16 : 1/16 : 0- und/oder der 18 : 1/18 : 0-Verhältnisse im Vergleich zu Kontrollen aufwiesen. Fig. 4 zeigt eine klare Erhöhung des 16 : 1/16 : 0-Verhältnisses für zwei Pflanzen (RT und RU), die mit dem Ratten-Desaturase-Gen transformiert wurden. Die Pflanze RT weist ein höheres 18 : 1/18 : 0-Verhältnis als Kontrollen auf, während dies bei RU nicht der Fall ist. Dies steht im Gegensatz zu Daten von Calli (Fig. 2), wo die 18 : 1/18 : 0-Verhältnisse bei Calli, die das Ratten-Desaturase-Gen trugen, einheitlich höher waren als bei Kontrollen. Jedoch arbeitet der CaMV 35S-Promotor in einigen differenzierten Geweben nicht so gut wie in undifferenzierten Calluszellen und dies könnte den Unterschied erklären.
Nachdem nicht bekannt war, welche Auswirkung eine eingeführte Desaturase auf die Fettsäurezusammensetzung und -niveaus haben könnte, wurden auch die Mengen an 16 : 0, 16 : 1, 16 : 2, 16 : 3, 18 : 0, 18 : 1, 18 : 2 und 18 : 3 bestimmt. Um sichtbar zu machen, wie sich diese Gruppierungen veränderten, wurden die Mengen an 16 : 0, 16 : 1, 16 : 2, 16 : 3, 18 : 0, 18 : 1, 18 : 2 und 18 : 3 in Tabakblättern kombiniert und die Menge jeder Fettsäure als Prozentsatz dieser Gesamtmenge ausgedrückt (Fig. 5). Eine große Erhöhung an 16:I sowie eine Verringerung an 16 : 0 und 18 : 0 ist bei den Pflanzen RT und RU ersichtlich. Die Niveaus an 18 : 2 nahmen im Verhältnis zu Kontrollen ebenfalls zu. Die Desaturase-Transformanten RT und RU wiesen auch einen verringerten Prozentsatz an 18 : 3 im Vergleich zu Kontrollen auf.
Um einen Gesamtüberblick der Lipidanhäufung zu gewinnen, wurden 16- und 18-Kohlenstoff- Fettsäuren (16 : 0, 16 : 1, 16 : 2, 16 : 3, 18 : 0, 18 : 1, 18 : 2 und 18 : 3) kombiniert und als mg FS pro Gramm Frischgewicht oder Trockengewicht ausgedrückt (Daten nicht gezeigt). Die Ähnlichkeit zwischen den 16- und 18-Kohlenstoff-Fettsäure-Gesamtniveaus in Kontrollpflanzen und Desaturase-transformierten Pflanzen legt einen Ausgleich zwischen den an dem Blattlipid- Metabolismus beteiligten Stoffwechselwegen nahe. Ein solcher Ausgleich wurde bei verschiedenen Desaturase-Mutanten von Arabidopsis [Science 252 : 80-87 (1991)] angenommen.
Als weiterer Hinweis darauf, daß erhöhte Niveaus von 16 : 1, die in Desaturase-transformiertem Tabak gefunden wurden, von dem Produkt des eingeführten Gens herrührten, wurden Blattlipide in Klassen fraktioniert. Nachdem 16 : 1 normalerweise nicht in Pflanzen-Phosphatidylcholin (PC) erscheint, untersuchten wir diese Fraktion genauer, wobei die Ergebnisse in Fig. 6 illlustriert sind. Es ist ersichtlich, daß 16 : 1 nur in PC aus Pflanzen nachgewiesen wurde, die mit dem Ratten-Desaturase-Gen transformiert worden waren. Dieser qualitative Unterschied zwischen Kontrollen und Desaturase-Transformanten ergibt einen klaren Hinweis darauf, daß die eingeführte Desaturase in Blattgewebe funktioniert. Die Anwesenheit von 16 : 1 in Phosphatidylcholin aus Blättern, die mit dem Ratten-Desaturase-Gen transformiert wurden, (Fig. 6) ist eine notwendige Voraussetzung, um die Saatlipid-Zusammensetzung, welche hauptsächlich Triglycerid ist, zu verändern. Phosphatidylcholin ist der unmittelbare Vorläufer von Triglycerid in sich entwickelnden Samen.
Die Möglichkeit, die Fettsäurezusammensetzung in Pflanzen mit einer Desaturase aus der Ratte zu manipulieren, zeigt, daß eine andere Vorgehensweise als Mutantenselektion zur Veränderung von Pflanzenlipid-Niveaus eingesetzt werden kann.

BEISPIEL 5

Samen aus transgenen Pflanzen wurde ebenfalls überprüft und die dramatische Erhöhung der 16 : 1-Fettsäuregruppierungen in den Gesamt-Blattlipiden wird im Saatlipid widergespiegelt, wenn auch auf einem niedrigeren Niveau, wie in Fig. 7 ersichtlich. Das ungesättigte/gesättigte Fettsäure-Verhältnis war auch in repräsentativen Desaturase-Transformanten im Vergleich zu transgenem Kontrollpflanzen-Blattgewebe und -Samengewebe erhöht worden (Fig. 7). Dies wird durch Beobachtung des gesättigt/ungesättigt-Verhältnisses von 16-Kohlenstoff- Fettsäuregruppen weiter illustriert. Wie in Fig. 8 zu sehen, wiesen die ausgewählten transgenen Pflanzen G, M, U, T, J und W große Abnahmen von 16 : 01(16 : 1 + 16 : 2 + 16 : 3) im Vergleich zu der Kontrollpflanze E auf.

BEISPIEL 6

Das Plasmid pDs3-358, konstruiert wie in J. Biol. Chem., 263 : 2532-236, beschrieben, wurde von P. Strittmatter zur Verfügung gestellt. Dieses wurde mit Baml-II und SstI verdaut, um ein 1,2-kb-Fragment freizusetzen, welches das Ratten-Desaturase-Gen enthielt. Dieses wurde mit einem vorher hergestellten ACT-Vektor, pALLNAPGI, ligiert, um pALLNAPSCD zu erzeugen; dieses Verfahren positionierte den für Stearyl-CoA-Desaturase kodierenden Teil direkt hinter den samenspezifischen Promotor Napin in einem binären Vektor, bereit für die Pflanzentransformation.
Eine Promotor-Gen-Kassette, enthaltend den Napin-Promotor und das Stearyl-CoA-Desaturase-Gen, wurde als HindIII-SstI-Fragment ausgeschnitten und eingesetzt, um das HindIll- SstI-Fragment eines binären Vektors, pALLTKrep zu ersetzen, um pALLTKNAPSCD zu erzeugen, welcher strukturell und funktionell äquivalent zu pALLNAPSCD war, mit Ausnahme dessen, daß er eine klarere Selektion hinsichtlich transgener Pflanzen auf dem Antibiotikum Kanamycin ermöglichte. Die Überführung der DNA in Agrobacterium erfolgte mittels Transformation direkt in den Organismus, im Gegensatz zu der triparentalen Paarung wie oben beschrieben. Das Gen wurde in Canola-Zellen mittels Zellverwundung und Cokultivierung eingeführt, und ganze Canola-Transformanten wurden aus den transformierten Calluskulturen regeneriert. Samen wurden aus den resultierenden regenerierten transformierten Pflanzen erhalten.

SEQUENZPROTOKOLL

INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 1:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 31 Basen
(B) TYP: Nukleotid
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Nein
(x) PUBLIKATIONSINFORMATION:
(A) AUTOREN: Stritmatter et al.
(C) JOURNAL: J. Biol. Chem.
(D) BAND: 263
(F) SEITEN: 2532-2536
(G) DATUM: 1988
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 1:
ACGTGGATCC ACCATGCCGG CCCACATGCT C 31

INFORMATION FÜR SEQ-ID-NR. 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 18 Basen
(B) TYP: Nukleotid
(C) STRÄNGIGKEIT: einzelsträngig
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: synthetische DNA
(iii) HYPOTHETISCH: Nein
(iv) ANTISENSE: Ja
(x) PUBLIKATIONSINFORMATION:
(A) AUTOREN: Stritmatter et al.
(C) JOURNAL: J. Biol. Chem.
(D) BAND: 263
(F) SEITEN: 2532-2536
(G) DATUM: 1988
(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ-ID-NR. 2:
GCTACTCTTG TGGCTCCC 18

Claims

1. Chimäre Expressionskassette, umfassend einen cDNA-Klon, welcher für eine Säuger-Fettsäure-Coenzym A-Desaturase kodiert, in funktionsfähiger Verknüpfung mit regulatorischen Sequenzen, welche die Expression des cDNA-Klons in Pflanzenzellen veranlassen.

2. Expressionskassette nach Anspruch 1, worin das Fettsäure-Coenzym A- Desaturase-Gen ein Stearyl-Coenzym A-Desaturase-Gen ist.

3. Expressionskassette nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Fettsäure- Coenzym A-Desaturase-Gen ein Stearyl-Coenzym A-Desaturase-Gen aus der Ratte ist.

4. Expressionskassette nach irgendeinem der vorherigen Ansprüche, welche imstande ist, in einer Bakterienzelle repliziert zu werden.

5. Bakterienzellen, welche mindestens eine Kopie einer Expressionskassette nach Anspruch 4 als fremdes Plasmid enthalten.

6. Transformierte Pflanzenzellen, welche mindestens eine Kopie der Expressionskassette nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 enthalten.

7. Transformierte Zellen nach Anspruch 6, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Zellen einer einkeimblättrigen Spezies handelt.

8. Transformierte Zellen nach Anspruch 7, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Zellen von Mais, Sorghum, Weizen, Palme oder Reis handelt.

9. Transformierte Zellen nach Anspruch 6, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Zellen einer zweikeimblättrigen Spezies handelt.

10. Transformierte Zellen nach Anspruch 9, ferner dadurch gekennzeichnet, daß es sich um Zellen von Sojabohne, Rapssamen, Jojoba, Chinesischem Lichtnußbaum, Tabak, Saflor, Erdnuß oder Sonnenblume handelt.

11. Zellkultur oder Gewebekultur, umfassend Zellen nach irgendeinem der Ansprüche 5 bis 10.

12. Verfahren zur Erhöhung der prozentualen Zusammensetzungsanteile ungesättigter Fettsäuregruppierungen und entsprechender Fettsäure-abgeleiteter Lipide in Pflanzenzellen und ganzen Pflanzen, umfassend den Schritt der Einführung einer chimären Expressionskassette nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 in solche Pflanzenzellen oder in die Zellen solcher ganzen Pflanzen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, umfassend den weiteren Schritt der sexuellen oder klonalen Reproduktion der ganzen Pflanzen auf solche Weise, daß mindestens eine Kopie der von der Expressionskassette bereitgestellten Sequenz in den Zellen der Nachkommenschaft der Reproduktion vorhanden ist.

14. Verfahren nach Anspruch 12, worin die Expressionskassette durch Elektroporation, Mikroteilchenbeschuß oder Mikroinjektion in die Zellen eingeführt wird.

15. Verfahren zur Erhöhung der prozentualen Zusammensetzungsanteile ungesättigter Fettsäuregruppierungen und entsprechender Fettsäure-abgeleiteter Lipide in für ein Agrobakterium anfälligen zweikeimblättrigen Pflanzen, worin die Expressionskassette in die Zellen eingeführt wird durch Infektion der Zellen mit Agrobakterien, in denen ein Plasmid modifiziert wurde, um die Expressionskassette nach irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 einzuschließen.