DE69231952T2

DE69231952T2 - Komplexbildnermittel und zielimmunoreagenzien

Info

Publication number: DE69231952T2
Application number: DE69231952T
Authority: DE
Inventors: A. Hilborn; Z. Houssain; J. Murray; Richard Philion; K. Saha; Chandra Shah; W. Shearman; A. Snow; L. Toner
Original assignee: Nycomed Imaging AS
Current assignee: GE Healthcare AS
Priority date: 1992-05-07
Filing date: 1992-05-07
Publication date: 2002-04-04
Anticipated expiration: 2012-05-08
Also published as: FI945194A0; AU672951B2; NO944182D0; JP3358141B2; RU94046010A; EP0639083B1; RU2122431C1; BR9207126A; WO1993021957A1; EP0639083A1; AU2316192A; DE69231952D1; ATE203168T1; KR950701229A; JPH07506667A; FI945194A7; NO944182L; CA2135059A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Immunreagenzien und im besonderen radioaktive Ziel-Immunreagenzien, welche einen besonderen Nutzen in therapeutischen und diagnostischen bilderzeugenden Zusammensetzungen und Verfahren haben. Die vorliegende Erfindung betrifft des weiteren neue Komplexierungsmittel.

Hintergrund der Erfindung

Vor 1980 wurde das Abzielen bzw. Targeting auf Tumor tragende Stellen durch Radioimmunglobulin von einer Anzahl von Laboratorien in unterschiedlichen Institutionen gezeigt (S. E. Order et al., "Use of Isotopic Immunoglobulin in Therapy." Cancer Research 40, 3001-7 (August 1980)). 1980 war gezeigt worden, daß Tumore radioaktiv markierte Antikörper gegen mit Tumoren assoziierte Antigene konzentrierten und daß die verwendeten radioaktiv markierten Reagenzien sowohl ein diagnostisches bilderzeugendes Verfahren der Tumore, z. B. durch ein bilderzeugendes Verfahren mit einer Gamma-Kamera (Radioimmunoscintigraphie) und Positronentomographie erlaubten, als auch eine therapeutische Behandlung, d. h. die Verminderung der Tumorgröße durch das Abzielen des radioaktiven Immunreagenzes.
In früherer Zeit wurde das Abzielen mit radioaktiv markierten Immunreagenzien mit radioaktivem Iod ausgeführt. Iodisotope werfen jedoch, wie von Scheinberg et al., "Tumor Imaging with Radioactive Metal Chelates Conjugated to Monoclonal Antibodies", Science, 215, Nr. 19, 1511-13 (März 1982) bemerkt wurde, verschiedene Probleme auf, insbesondere in bezug auf das Scannen von Tumorbildern. Von den drei gewöhnlich verfügbaren Isotopenformen hat nur ¹²³I die geeigneten Emissionseigenschaften für das bilderzeugende Verfahren und eine Halbwertszeit, welche kurz genug ist, um auf eine sichere Weise diagnostisch verwendet zu werden. Die Gamma-Strahlung von ¹²&sup5;I ist zu schwach für ein bilderzeugendes Verfahren. ¹³¹I wurde oft verwendet, aber ist wegen seiner langen Halbwertszeit und der hochenergetischen Gamma- und cytotoxischen Beta-Strahlungen nicht wünschenswert. ¹³¹I ist ebenfalls therapeutisch für große Tumore verwendet worden, scheint jedoch bei der Behandlung kleiner Tumore unwirksam zu sein. Darüber hinaus erlaubt ein schneller Metabolismus radioaktiv iodierter Antikörper eine Inkorporierung des Iods in die Schilddrüse und eine aktive Ausscheidung des Iods über den Magen-Darm- und den Urogenitaltrakt. Diese Verteilung des radioaktiven Iods behindert ein bilderzeugendes Verfahren spezifischer Tumore, da die Tumore durch die Hintergrundstrahlung verdeckt werden.
Zusätzlich zum Abzielen auf Tumore mit radioaktiven Antikörpern für ein diagnostisches bilderzeugendes Verfahren und zur therapeutischen Behandlung, wurde ein ähnliches Abzielen für die diagnostischen bilderzeugenden Verfähren bei Infarkten durchgeführt, insbesondere bei Herzinfarkten, unter Verwendung von Antikörpern gegen Myosin des Hundeherzens (Khaw et al., "Myocardial Infarct Imaging of Antibodies to Canine Cardiac Myosin Indium-111-Diethylenetriamine Pentaacetic Acid", Science 209, 295-7 (Juli 1980)], und bei bilderzeugenden Verfahren für Arthereosclerose durch das Abzielen auf arthereosclerotische Plaques. Es gibt dieselben Nachteile bei der Verwendung von radioaktivem Iod bei den diagnostischen bilderzeugenden Verfahren für Infarkt wie bei dem bilderzeugenden Verfahren und bei therapeutischen Verfahren beim Tumor.
Es ist bekannt, daß ¹¹¹In mit Polyaminocarbonsäuren wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) komplexiert werden können. Die kovalente Bindung von Proteinen (Antikörpern) an diese Komplexierungsmittel, welche durch eine Acylierung mit aktivierten Carbonylen, aromatische Diazonium-Kopplung oder Bromacetylierung durchgeführt wird, ist jedoch ineffizient, obwohl die von Brechbial et al., ["Synthesis of 1-(p-Isothiocyanatobenzyl) Derivatives of DTPA and EDTA. Antibody Labeling and Tumor Imaging Studies", Inorg. Chem. 25, 2772-81 (1986)] beschriebenen Isocyanatobenzylderivate geschaffen wurden, um eine kovaente Anheftung von Proteinen an die Komplexierungsmittel zu erleichtern.
Vor kurzem wurden Anstrengungen in der Forschung auf verbesserte Antikörper gerichtet (Aks), z. B. monoklonale, spezifische Antikörper für ein spezifisches Abzielen, Antikörper, welche Radionuclide komplexieren oder direkt an sie binden, bevorzugte Radionuclide und Kombinationen davon mit Antikörpern und Komplexierungsmitteln. Einige Versuche wurden in Richtung einer Verbesserung von Komplexierungsmitteln gemacht.
Nichtsdestotrotz sind EDTA und insbesondere DTPA und Derivate davon die vorherrschenden Komplexierungsmittel geblieben, um Antikörper kovalent zu binden und metallische Radionuclide in einer koordinierten Weise zu komplexieren. Die Unzulänglichkeiten von DTPA wurden jedoch festgestellt, z. B. von Parker et al., "Implementation of Macrocycle Conjugated Antibodies for Tumor Targeting", Pure and Appl. Chem. 61, Nr. 9, 1637-41 (1989); " Herkömmlicherweise wurde das Metall-Radionuclid durch ein azyklisches Chelat (z. B. EDTA oder DTPA) komplexiert, welches kovalent an den Antikörper gebunden ist. Keines der Chelate ist angemessen, da das Metall dazu tendiert in vivo zu dissoziieren, ...." und von Cox et al., "Synthesis of a Kinetically Stable Yttrium-90 Labelled Macrocycle -Antibody Conjugate", J. Chem. Soc., Chem. Commun. 797-8 (1989); " Yttrium-90 ist ein attraktives Isotop für die Therapie... aber seine klinische Verwendung wird wegen seiner Toxizität für das Knochenmark sehr beschränkt sein, welche aus der durch Säure vorangetriebenen Freisetzung von &sup9;&sup0;Y aus einem mit einem Chelat wie Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) verknüpften Antikörper resultiert."
Frühere Versuche, um verbesserte Komplexieningsmittel zu entwickeln, haben Materialien bereitgestellt, welche ihre eigenen Unzulänglichkeiten aufweisen. Zum Beispiel beschreiben Craig et al., "Towards Tumor Imaging with Indium-111 labelled Macrocycle Antibody Conjugates", J. Chem. Soc. Chem. Commun., 794-6 (1989) makrozyklische hexakoordinierende Liganden, stellen aber fest, daß "die limitierende Eigenschaft dieser Vorgehensweise darin besteht, daß ein Markieren des Makrozyklus mit ¹¹¹In vor der Konjugierung des Antikörpers erforderlich ist. Eine Bindunt von Indium durch (4) bei 37ºC ist nicht hinreichend schnell für eine effektive radioaktive Markierung... Andere dreibasige Triazamacrozyklische Liganden wurden daher auf ihre Fähigkeit gescreent, Indium auf eine schnelle Weise unter milden Bedingungen (20ºC, pH 5, < 1h) zu binden, und dennoch einen kinetisch stabilen Komplex in vivo zu bilden....Nur (6) erwies sich jedoch als wirksam, wenn die Konzentration des Liganden 10 uM war und unter diesen Bedingungen wurde ein Ertrag von 96% radioaktiver Markierung bestimmt (30 min. pH 5, 20ºC).
Nichtsdestoweniger sind dreißig Minuten immer noch unbefriedigend. Es wäre in hohem Maße wünschenswert, Komplexierungsmittel zu haben, die EDTA und DTPA überlegen sind, welche in einer koordinierten Weise bevorzugte Radionuclide wie In, Y, Sc, Ga, Ge, etc. innerhalb von einigen Minuten binden würden, d. h. in weniger als etwa 5 min., direkt vor einer Verabreichung des Mittels an den Patienten, insbesondere, wenn kurzlebige Radionuclide notwendigerweise aus einem längerlebigen Radionuclid zum Zeitpunkt der Behandlung des Patienten erzeugt werden müssen.
Man muß bemerken, daß Komplexe von Yttrium, einem bevorzugten Radionuclid für die Therapie, dazu tendieren, weniger stabil als diejenigen von Indium zu sein [(Mather et al., "Labelling Monoclonal Antibodies with Yttrium 90", Eur. J. Nucl. Med 15, 307-312 (1989)], bezogen auf herkömmliche Komplexe. Mather et al., beschreiben, daß Bioverteilungsstudien an Krebspatienten unter Verwendung von radioaktiv markierten Antikörpern nahelegten, daß die Stabilität von Yttrium-markierten Antikörpern in vivo nicht so groß ist, wie diejenige ihrer ¹¹¹In-markierte Gegenstücke, und daß diese Befunde durch andere, neue Publikationen auf dem Gebiet unterstützt werden.
Wenn chelatbildende Mittel kovalent an Proteine (wie Aks) gebunden werden, sind die Proteine gewöhnlicherweise in der Lage, weit mehr als ein Molekül des chelatbildenden Mittels anzunehmen, da sie ein Wirtsmaterial von Amin- und Sulfhydrylgruppen enthalten, durch welche die chelatbildenden Mittel gebunden werden. Es ist oft sehr wichtig, zu bestimmen, wie viele chelatbildende Stellen an jedes Proteinmolekül gebunden werden. Der bequemste Weg, dies zu bewerkstelligen, ist durch spektrophotometrische Mittel. Chelatbildende Mittel nach dem Stand der Technik und Chelate davon haben jedoch Absorptionsspektren, welche mit denjenigen von nützlichen Proteinen überlappen, und eine analytische Bestimmung der Anzahl von chelatbildenden Stellen oder Stellen mit Chelat pro Molekül des Proteins können nicht auf eine eindeutige Weise durch Spektrophotometrie gemacht werden, da die überlappenden Absorptionsspektren einander maskieren. Es wäre daher in hohem Maße wünschenswert, chelatbildende Mittel zur Konjugation an Proteine zu erhalten, deren spektrophotometrische Absorptionen und deren spektrophotometrische Absorptionen des Metallchelats nicht mit denjenigen der Proteine, an welche die chelatbildenden Mittel chemisch gebunden sind, überlappen.
Ein anderes Problem von einigen Zusammensetzungen nach dem Stand der Technik besteht darin, daß das chelatbildende Mittel durch ein Reduktionsmittel aktiviert werden muß, bevor es das Radionuclidchelat bildet. Falls die Proteinkonjugate vor der Formulierung des Radionuclidchelats gebildet werden sollen, dann kann das Reduktionsmittel, das für die Aktivierung des Komplexierungsmittel verwendet wird, das Protein abbauen. Zum Beispiel komplexieren, die chelatbildenden Mittel, welche augenblicklich für eine Komplexierung von Technetium (Tc) und Rhenium (Re) verwendet werden, die Metalle über schwefelhaltige Gruppen, welche mit einem Reduktionsmittel (Dithiothreitol) reduziert werden müssen, um das chelatbildende Mittel vor der Bildung des Radionuclidchelates zu aktivieren. Falls das Disulfidbindungen enthaltende Proteinkonjugat vor der Reduktion gebildet wird, dann kann das Reduktionsmittel das Protein abbauen. Es wäre in hohem Maße wünschenswert, chelatbildende Mittel zu haben, welche in der Lage sind, Konjugate mit Proteinen zu bilden, bevor sie mit Radionucliden komplexieren.
Zusammengefaßt leiden die verschiedenartigen, augenblicklich verfügbaren radioaktiv markierten Antikörper und chelatbildenden Mittel, welche zur Herstellung immunreaktiver Konjugate durch das kovalente Binden eines chelatbildenden Mitteis an das immunreaktive Protein verwendet werden, und Radionuclidkomplexe davon zur Verwendung in diagnostischen bilderzeugenden Verfahren und zielgerichteten Therapeutika an einem oder mehreren der folgenden Nachteile: 1) Toxizität; 2) Verteilung bzw. Zerlegung eines Reagenzes aufgrund eines schnellen Metabolismus; 3) unangemessene Emissionseigenschaften; 4) ineffizientes kovalentes Binden an das Protein zur Herstellung eines Konjugates; 5) langsame Komplexierung mit Metallen; 6) instabile Metallkomplexierung, z. B. bezogen auf die Temperatur, die Zeit oder den pH; 7) die Unfähigkeit, Konjugate zu bilden und während der Lagerung stabil zu bleiben, bis eine Metallkomplexierung gewünscht wird; 8) die Unmöglichkeit, das Radionuclidkomplexreagenz spektrophotometrisch zu analysieren; und 9) die Unfähigkeit ohne Aktivierungsschritte, welche das Protein abbauen, zu komplexieren.
In der WO92/08494 wird ein Abzielen radioaktiver Immunreagenzien beschrieben, welche entworfen sind, um sich gegen eine Anzahl der vorausstehend beschriebenen Probleme zu richten. Die Immunreagenzien basieren auf Spezies von Pyridin oder Phenanthrolin.

Zusammenfassung der Erfindung

Wir haben Komplexe entdeckt, welche die vorausstehend diskutierten Probleme nach dem Stand der Technik lösen. Die Komplexe dieser Erfindung umfassen ein Metallradionuklidion, ein Komplexierungsmittel, welches ein Derivat eines Terpyridins ist, und wahlweise eine immunreaktive Gruppe, welche kovalent an das Komplexierungsmittel durch eine Proteinreaktive Gruppe gebunden ist. Im besondereren wird in Übereinstimmung mit der Erfindung bereitgestellt:
Ein Komplex eines Komplexierungsmittels der Formel
(worin jedes R² eine Gruppe CH&sub2;N(CH&sub2;COOH)&sub2; oder eine Carboxyalkylthioalkylgruppe bedeutet oder zusammen beide R²-Gruppen eine Gruppe der Formel
bedeuten und R eine Protein-reaktive Gruppe bedeutet, welche wahlweise kovalent an eine immunreaktive organische Verbindung gebunden ist; mit der Maßgabe daß, wenn jedes R² eine Gruppe CH&sub2;N(CH&sub2;COOH)&sub2; bedeutet, dann R verschieden ist von einer p- Methoxyphenylgruppe, substituiert in der 3-Position durch eine Amino-, Isothiocyanato- oder Dimethylaminothiocarbonylaminogruppe), und wenn beide R²-Gruppen eine Gruppe von Formeln
bedeuten, dann R die Bedeutung 3-Amino-4-methoxyphenyl hat, oder einem Salz hiervon, bedeutet, mit einem Metallradionuclid.
Diese Erfindung stellt ebenfalls therapeutische und diagnostische Zusammensetungen, welche die vorausstehend beschriebenen Komplexe umfassen, bereit.
Diese Erfindung stellt des weiteren die Verwendung des eine immunreaktive Gruppe enthaltenden Komplexes, wie hierin vorausstehend beschrieben, bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung in einem diagnostischen bilderzeugenden Verfahren bereit.
Es ist ein vorteilhaftes Merkmal dieser Erfindung, daß die beschriebenen Yttrium enthaltenden Komplexe eine niedrigere Strahlungstoxizität aufweisen, wenn sie mit radioaktiven Immunreagenzien verglichen werden, die mit anderen mit Yttrium celatbildenden Mitteln hergestellt worden sind.
Es ist ebenfalls ein vorteilhaftes Merkmal, daß die Komplexe dieser Erfindung nicht schnell metabolisiert werden und sich nicht nachteilig verteilen.
Es ist ein anderesvorteilhaftes Merkmal, daß die beschriebenen Komplexe in einer effizienten Weise kovalente Bindungen mit Proteinen und anderen biologischen Molekülen bilden.
Noch ein weiteres vorteilhaftes Merkmal dieser Erfindung besteht darin, daß die beschriebenen Komplexe gute Emissionseigenschaften aufweisen und leicht einer spektrophotometrischen Analyse unterzogen werden.
Zusätzlich können Proteinkonjugate der Komplexierungsmittel gebildet und gelagert werden, bis eine Metallkomplexierung gewünscht wird, und die Komplexierung kann ohne Aktivierungsschritte, welche Protein abbauen, fertiggestellt werden.
Darüber hinaus komplexieren die Komplexierungsmittel schnell mit Metallen und die resultierenden Chelate weisen eine ausgezeichnete Stabilität in Bezug auf Zeit, Temperatur und pH auf.
Andere vorteilhafte Merkmale dieser Erfindung werden leicht mit Bezug auf die nachfolgende Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen ersichtlich.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Die Beschreibung, welche folgt, betrifft in erster Linie die Verwendung der Komplexe in therapeutischen und diagnostischen bilderzeugenden Zusammensetzungen und Verfahren. Außerdem sind die Komplexe nützlich als diagnostische Mittel, zum Beispiel als Radioimmunelektrophoresemittel.
Die Komplexe dieser Erfindung umfassen ein Metallradionuclidion, ein Komplexierungsmittel und wahlweise eine immunreaktive Gruppe, welche kovalent an das Komplexierungsmittel über eine Protein-reaktive Gruppe, wie vorausstehend beschrieben, gebunden ist.
Mit "Protein-reaktive Gruppe" ist jedwede Gruppe gemeint, welche mit einer beliebigen funktionellen Gruppe, die typischerweise auf Proteinen gefunden oder in diese eingeführt wird, reagieren kann. Es wird jedoch in spezifischer Weise betrachtet, daß die Protein-reaktive Gruppe mit Biomolekülen konjugiert sein kann, die kein Protein sind. Auf diese Weise schließen die Protein-reaktiven Gruppen, welche in der Praxis dieser Erfindung nützlich sind, diejenigen Gruppen ein, welche mit jedwedem biologischen Molekül reagieren können (einschließlich von Kohlenhydraten, Nukleinsäuren und Lipiden), welche eine reaktive Gruppe enthalten oder eine spezifische Rezeptor-Liganden-interaktive Gruppe, um eine verknüpfende Gruppe zwischen dem Komplexierungsmittel und der immunreaktiven Gruppe zu bilden.
Bevorzugte Protein-reaktive Gruppen können ausgewählt werden aus, sind aber nicht beschränkt auf (1) Eine Gruppe, welche direkt mit den Anin- oder Sulfhydrylgruppen auf dem Protein oder dem biologischen Molekül, welches die immunreaktive Gruppe enthält, reagieren wird, zum Beispiel aktives Halogen enthaltende Gruppen, einschließlich von zum Beispiel Chlormethylphenylgruppen und Chloracetyl [Cl-CH&sub2;CO]-Gruppen, aktivierte durch 2-Abgangsgruppen substituierte Ethylsulfonyl- und Ethylcarbonylgruppen wie 2-Chlorethylsulfonyl und 2-Chlorethylcarbonyl; Vinylsulfonyl; Vinylcarbonyl; Epoxy; Isocyanato; Isothiocyanato; Aldehyd; Aziriden; Succinimidoxycarbonyl; aktivierte Acylgruppen, wie Carbonsäurehalogenide; gemischte Anhydride und dergleichen; und andere Gruppen, von welchen bekannt ist, daß sie nützlich in herkömmlichen fotografische Gelatine härtenden Mitteln sind; (2) Eine Gruppe, welche leicht mit modifizierten Proteinen oder biologischen Molekülen, welche die immunreaktive Gruppe enthalten, reagieren kann, d. h. Proteine oder biologische Moleküle, welche die immunreaktive Gruppe modifiziert enthalten, um reaktive Gruppen, wie die in (1) vorausstehend beschriebenen zu enthalten, zum Beispiel durch eine teilweise Oxidation des Proteins, um ein Aldehyd oder eine Carbonsäure einzuführen, wobei in diesem Fall die "Protein-reaktive Gruppe" ausgewählt sein kann aus Amino, Alkylamino, Arylamino, Hydrazino, Alkylhydrazino, Arylhydrazino, Carbazido, Semicarbazido, Thiocarbazido, Thiosemicarbazido, Sulfhydryl, Sulfhydrylakyl, Sulfhydrylaryl, Hydroxy, Carboxy, Carboxyalkyl und Carboxyaryl. Die Altylanteile der Protein-reaktiven Gruppe können von 1 bis etwa 20 Kohlenstoffatome enthalten, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, s-Butyl, t-Butyl, 2-Ethylhexyl, Decyl, Hexadecyl, Octadecyl etc.. Die Arylanteile der Protein-reaktiven Gruppe können von etwa 6 bis etwa 20 Kohlenstoffe enthalten, wie Phenyl, Naphtyl, Phenanthryl, Nitrophenyl, Hydroxyphenyl, Aminophenyl, Hexadecylaminophenyl, Octadecylaminophenyl, Tolyl, Xylyl, Methoxyphenyl, 3-Amino-4-methoxyphenyl, 4- Methoxy-3-(N-methylhydrazinothioformamido)phenyl, 3-Isocyanato-4-methoxyphenyl, 3- Isothiocyanato-4-methoxyphenyl, Methylthiophenyl, Carboxyphenyl.
(3) Eine Gruppe, welche mit dem Protein oder dem biologischen Molekül, welches die immunreaktive Gruppe enthält, verknüpft werden kann oder mit dem modifizierten Protein wie in (1) und (2) vorausstehend vermerkt durch die Verwendung eines kreuzvernetzenden Mittels. Bestimmte nützliche kreuzvernetzende Mittel wie zum Beispiel difunktionale gelatinehärtende Mittel, Bisepoxide und Bisisocyanate werden ein Teil von, d. h. eine verknüpfende Gruppe, in dem Konjugat von Protein und komplexbildendem Mittel während der kreuzvernetzenden Reaktion. Andere nützliche kreuzvernetzende Mittel jedoch erleichtern die Kreuzvernetzung zum Beispiel als verbrauchbare Katalysatoren und sind nicht in dem Endkonjugat vorhanden. Beispiele für solche kreuzvernetzende Mittel sind die kreuzvernetzenden Mittel Carbodiimid und Carbamoyionium wie in dem US-Patent 4 421 847 offenbart, wobei die Beschreibung davon hierin in ihrer Gesamtheit durch den Bezug darauf mit eingeschlossen ist, und die Dikationenether des US-Patents 4 877 724, dessen Beschreibung hierin durch den Bezug darauf in seiner Gesamtheit mit eingeschlossen ist. Bei diesen kreuzvernetzenden Mitteln muß einer der Reaktanden eine Carboxylgruppe haben, und der andere eine Amin- oder Sulfhydrylgruppe. Das kreuzvernetzende Mittel reagiert zuerst in einer selektiven Weise mit der Carboxylgruppe, dann wird es während der Reaktion der "aktivierten" Carboxylgruppe mit einem Amin abgespalten, um eine Amidverknüpfung zwischen dem Protein und dem metallkomplexierenden Mittel zu bilden, wodurch auf diese Weise die zwei Einheiten kovalent gebunden werden. Ein Vorteil dieser Vorgehensweise besteht darin, daß das Kreuzvernetzen von gleichartigen Molekülen, z. B. Komplexierungsmittel mit Komplexierungsmitteln, verhindert wird, wohingegen die Reaktion von difunktionellen kreuzvernetzenden Mitteln nicht selektiv ist, so daß unerwünschte kreuzvernetzte Moleküle erhalten werden. Insbesondere bevorzugte Protein-reaktive Gruppen schließen Amino und Isothiocyanato ein.
Die Polypyridin-Komplexierungsmittel mit metallkomplexierenden Stellen z. B. Heteroatomen und Iminodiacetatgruppen können durch Verfahren, welche im Fachbereich bekannt sind, hergestellt werden. Geeignete Reaktionsschemata werden in dem US-Patent 4 837 169 und dem US-Patent 4 859 777 erläutert, deren Beschreibungen hierdurch hierin durch den Bezug darauf eingeschlossen sind.
Für eine volle Beschreibung, wie die Komplexe der Erfindung herzustellen sind, wird die Aufmerksamkeit auf WO 92/08494 und WO93/21957 gelenkt.
Die Komplexe dieser Erfindung schließen ein Radionuclidion ein. Das Radionuclidion kann ausgewählt werden aus zum Beispiel den Ionen von Sc, Fe, Pb, Ga, Y, Bi, Mn, Cu, Cr, Zn, Ge, Mo, Tc, Ru, In, Sn, Sm, Sb, W, Re, Po, Ta und Ti. Bevorzugte Radionuclide schließen die Ionen &sup4;&sup4;SC&spplus;&spplus;&spplus;, 64,67Cu&spplus;&spplus;, ¹¹¹In&spplus;&spplus;&spplus;, ²¹²Pb&spplus;&spplus;, &sup6;&sup9;Ga&spplus;&spplus;, &sup9;&sup0;Y&spplus;&spplus;&spplus;, und ²¹²Bi&spplus;&spplus;&spplus; ein. Die am meisten bevorzugten von diesen sind &sup9;&sup0;Y&spplus;&spplus;&spplus;-Ionen.
Das Metallradionuclidion und das Komplexierungsmittel werden einfach komplexiert durch das bloße Mischen einer wäßrigen Lösung des Komplexierungsmittels mit einem Metallradionuclidsalz in einer wäßrigen Lösung, bevorzugtermaßen mit einem pH von 4 bis 11. Das Salz kann jedwedes wasserlösliche Salz des Metalls, wie Halogensalze sein. Das Chelat wird im allgemeinen in einer wäßrigen Lösung, bei einem pH, der zwischen 5 und 9 liegt, und bevorzugtermaßen von 6 bis 8, hergestellt. Der Komplex wird wahlweise mit Puffern gemischt, wie Acetat, Phosphat und Borat, um den optimalen pH herzustellen.
Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "Immunreaktive Gruppe", daß jedwede organische Verbindung eingeschlossen ist, welche in der Lage ist, kovalent an das Komplexierungsmittel zu binden, und welche in einem lebenden Organismus gefunden wird oder nützlich in der Diagnostik, der Behandlung oder der Genmanipulation von zellulärem Material oder lebenden Organismen ist, und welche die Fähigkeit für die Wechselwirkung mit einer anderen Komponente hat, welche in biologischen Flüssigkeiten gefunden werden kann oder welche mit Zellen, die behandelt werden sollen, wie Tumorzellen, assoziiert sein kann.
In Abhängigkeit von der beabsichtigten Verwendung, kann die immunreaktive Gruppe ausgewählt werden aus einer breiten Vielzahl von natürlich auftretenden oder synthetisch hergestellten Materialien, einschließlich von aber nicht beschränkt auf Enzyme, Aminosäuren, Peptide, Polypeptide, Proteine, Lipoproteine, Glycoproteine, Hormone, Arzneimittel (zum Beispiel Digoxin, Phenytoin, Phenobarbitol, Thyrozin, Triiodothyronin, Gentamicin, Carbamazepin und Theophyllin) Steroide, Vitamine, Polysaccaride, Viren, Protozoen, Pilze, Parasiten, Rickettsien, Schimmelpilze und Bestandteile davon, Blutbestandteile, Gewebe und Organbestandteile, Pharmazeutika, Haptene, Lektine, Toxine, Nukleinsäuren (einschließlich von Oligonukleotiden), Antikörper (einschließlich von genmanipulierten Antikörpern und Fragmenten davon), Antikörperfragente, antigene Materialien (einschließlich von Proteinen und Kohlenhydraten), Avidin und Derivate davon, Biotin und Derivate davon und andere, die dem Fachmann bekannt sind.
Bevorzugte immunreaktive Gruppen zur Verwendung in der Praxis dieser Erfindung sind diejenigen, welche ein Rezeptormolekül, das spezifisch für einen Liganden von Interesse ist, haben. Daher kann eine spezifische Bindungsreaktion, welche das Mittel einschließt, für das erwartete Abzielen verwendet werden. Beispiele für solche Ligand-Rezeptor-Komplexe schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Antikörper-Antigen, Avidin-Biotin, Repressor (Induktor) -Promotor von Operons und Zucker-Lektin-Komplexe. Zusätzlich werden komplementäre Nukleinsäuren, d. h. ein hybridisiertes Produkt komplementärer Stränge ebenfalls als spezifische Bindungsmaterialien, wie der Begriff hierin verwendet wird, betrachtet.
Besonders bevorzugte immunreaktive Gruppen schließen (1) jedwede Substanz, welche, wenn sie einem immunkompetenten Wirt präsentiert wird, zu der Bildung eines spezifischen Antikörpers führen wird, welcher in der Lage ist, an diese Substanz zu binden oder (2) den so hergestellten Antikörper, welcher an einer Antigen-Antikörper-Reaktion teilnimmt, ein. Daher kann die immunreaktive Gruppe ein antigenes Material, ein Antikörper oder ein Anti-Antikörper sein. Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper sind nützlich. Die Antikörper können ganze Moleküle oder verschiedenartige Fragmente davon sein, solange sie wenigstens eine reaktive Stelle für die Reaktion mit den reaktiven Gruppen auf dem Komplexierungsmittel oder mit den verknüpfenden Gruppen, wie hierin beschrieben, enthalten. In spezifischer Weise als hierin mit diesen bevorzugten immunreaktiven Gruppen eingeschlossen betrachtet werden Antikörper und Proteine, welche durch die Verfahren der Molekularbiologie hergestellt worden sind. Solche Verfahren sind in dem Fachbereich wohlbekannt und werden zum Beispiel in den US-Patenten 4 816 397 und 4 816 567 beschrieben.
In bestimmten Ausführungsformen kann die immunreaktive Gruppe ein Enzym sein, welches eine reaktive Gruppe für die Anheftung an das Komplexierungsmittel hat. Repräsentative Enzyme schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Aspartataminotransaminase, Alaninaminotransaminase, Laktatdehydrogenase, Creatinphosphokinase, Dihydrofolatreduktase, Gammaglutamyltransferase, alkalische saure Phosphatase, Säurephosphatase der Prostata (Prostatic Acid Phosphatase), Meerrettichperoxidase und verschiedene Esterasen.
Falls gewünscht, kann die immunreaktive Gruppe modifiziert oder in chemischer Weise verändert werden, um reaktive Gruppen für das Anheften des Komplexierungsmittels bereitzustellen, durch dem Fachmann bekannte Verfahren. Solche Verfahren schließen die Verwendung von verknüpfenden Einheiten und die chemische Modifikation wie in WO-A- 89/02931 und WO-A-89/02932, welche sich auf die Modifikation von Oligonukleotiden richten, und in dem US-Patent 4 719 182 beschrieben, ein, wobei alle Beschreibungen von diesen hierin durch den Bezug darauf in ihrer Gesamtheit mit eingeschlossen sind.
Zwei in hohem Maß bevorzugte Verwendungen der Komplexe dieser Erfindung bestehen in einem diagnostischen bilderzeugenden Verfahren für Tumore und die radiologische Behandlung von Tumoren. Bevorzugte immunologische Gruppen schließen daher Antikörper gegen mit Tumoren assoziierte Antigene ein. Spezifische Beispiele schließen B72.3 Antikörper (beschrieben in den US-Patenten Nr. 4 522 918 und 4 612 282) ein, welche colorektale Tumore erkennen, 9.2.27 Anti-Melanom-Antikörper, D612 Antikörper, welche colorektale Tumore erkennen, UJ13A Antikörper, welche kleinzellige Lungenkarzinome erkennen, NRLU-10 (Tfs- 2) Antikörper, welche kleinzellige Lungenkarzinome und kolorektale Tumore erkennen, 7E11C5-Antikörper, welche Prostatatumore erkennen, CC49 Antikörper, welche kolorektale Tumore erkennen, TNT-Antikörper, welche nekrotisches Gewebe erkennen, PR1A3-Antikörpa, welche Kolonkarzinome erkennen [Richman, P. I. and Bodmer, W. F. (1987), Int. J. Cancer. Bnd. 39, S. 317-328] ING-1 und andere gentechnisch hergestellte Antikörper, welche in der internationalen Patentveröffentlichung WO-A-90/02569 beschrieben werden, B 174- Antikörper (entwickelt bei Biomira Inc. in Edmonton, Canada), welche Plattenepithelkarzinome erkennen, B43-Antikörper, welche mit bestimmten Lymphomen und Leukämien reagieren und andere, welche von besonderem Interesse sein können.
Solche Antikörper und andere nützliche immunologische Gruppen, die vorausstehend beschrieben wurden, sind große komplexe Moleküle mit vielfachen Stellen für ein Anhängen des Komp lexierungsmittels. Folglich kann die immunreaktive Gruppe zusätzliche Komplexierungsmittel an sich über eine der Protein-reaktiven Gruppen angehängt haben. Daher ist der Begriff immunreaktive Gruppe so gedacht, daß er immunologische Gruppen mit Komplexierungsmittelmolekülen, welche daran über eine oder mehrere Protein-reaktive Gruppen gebunden sind, einschließen soll.
Zusätzlich kann ein Antikörper oder ein Fragment davon, welcher eine Kohlenhydratregion enthält, an das Komplexierungsmittel über die Kohlenhydratregion des Antikörpers angeheftet sein, wie in dem US-Patent 4 937 183 beschrieben, wobei die Beschreibung davon hierin durch den Bezug darauf in ihrer Gesamtheit mit eingeschlossen ist. Nützliche Verfahren zur Anheftung eines Antikörpers sind ebenfalls in den US-Patenten 4 671 958, 4 699 784, 4 741 900 und 4 867 973 beschrieben. Der Begriff "Protein-reaktive Gruppe", wie hierin definiert, ist so gedacht, daß er solche Verknüpfungen mit einschließen soll.
Andere Verfahren zur Durchführung der kovalenten Bindung der immunreaktiven Gruppe an die radioaktiven Metallkomplexierungsmittel sind im Fachbereich bekannt und schließen das einfache Vermischen der Materialien mit einander ein.
Die Komplexe dieser Erfindung können jedwedes Verhältnis des Metallradionuclidions zu dem Komplexierungsmittel enthalten. In bevorzugten Ausführungsformen ist das Molverhältnis von dem Metallion zu dem Komplexierungsmittel von etwa 1 : 100 bis zu etwa 1 : 1.
Das Verhältnis des Komplexierungsmittels zu der immunreaktiven Gruppe kann in weitem Maß variieren, von etwa 0,5 : 1 bis zu 10 : 1 oder mehr, in einigen Ausführungsformen ist das Molverhältnis des Komplexierungsmittels zu den immunreaktiven Gruppen von etwa 1:1 bis zu etwa 6 : 1.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter:

Präparation 1: Makrozyklisches chelatbildendes Mittel: Dinatrium-1,7-dicarboxymethyl-[4'-(3-amino-4-methoxyphenyl)-2,2' : 6'2"-terpyridinol-1,4,7,10,13,16-hexaaza- 18-Krone-6

Teil A - 6,6"-Dicyano-4'-(4-methoxyphenyl)-2,2' : 6',2"-terpyridin

Eine Mischung von 6,6"-Dibrom-4'-(4-methoxyphenyl)-2,2' : 6',2"-terpyridin (0,0745 Mol), Kupfer(I)-cyanid (0,296 Mol), Natriumcyanid (0,297 Mol) und 300 ml Dimethylformamid läßt man bei 160ºC 6 h reagieren. Nach dem Abkühlen wurde die Reaktionsmischung in 1500 ml Wasser überführt und die resultierende Mischung wird 2 Stunden lang gerührt und filtriert. Der feste Filterkuchen wird in einer Lösung von Natriumcyanid (200 g in 400 ml Wasser) gelöst und die resultierende Lösung wird über Nacht gerührt. Das gewünschte feste Produkt wird filtriert, mit Wasser pulverisiert (6 · 600 ml) und getrocknet, um ein weißes Pulver zu erhalten.

Teil B - 6,6"-Bis(aminomethyl)-4'-(4-methoxyphenyl)-2,2' : 6'2"-terpyridin

Eine Mischung von 6,6"-Dicyano-4'-(4-methoxyphenyl)-2,2' : 6',2" terpyridin (4 mMol) und 480 mg 10%-igem Pd/C in 130 ml Essigsäure wird bei 45ºC 22 Stunden lang hydriert (H&sub2; 50 psi). Die Reaktionsmischung wird filtriert und das Lösemittel wird ausgetrieben, um das gewünschte Diamin als das Acetatsalz zu erhalten, welches mit Methanol pulverisiert wird, gefolgt von der Entfernung des Lösemittels und der Trocknung, um das gewünschte Diaminacetat zu erhalten. Teil C - zyklisches 6,6"-Bis(aminomethyl)-4'-(4-methoxyphenyl)-2,2' : 6'2"-terpyridinpyridin-2,6-dicarbonsäuredilactam
Eine Lösung von 6,6"-Bis(aminomethyl)-4'-(4-methoxyphenyl)-2,2' : 6'2"-terpyridin (2 mMol) in Tetrahydrofuran (41 ml) und eine Lösung von Diisopropylamin (4 mMol) in Dimethylformamid (9 ml) werden unter Rühren in 350 ml THF gegeben. Zu der vorausstehenden Lösung wird tropfenweise eine Lösung von 2,6-Pyridin-dicarbonylchlorid in THF (50 ml) gegeben und die Reaktionsmischung wird über Nacht gerührt. Die Lösemittel werden unter vermindertem Druck destilliert und der Filterkuchen wird in 250 ml CH&sub2;Cl&sub2; gelöst. Die organische Schicht wird sukzessive mit Wasser (2 · 30 ml), 0,01 N HCl-Lösung (2 · 25 ml), Wasser (1 · 20 ml), 5%-iger NaHCO&sub3;-Lösung (2 · 25 ml) und Wasser (2 · 20 ml) gewaschen.
Nach dem Trocknen (Na&sub2;SO&sub4;), wird das Lösemittel destilliert, um das gewünschte Dilactam, welches dann über Silicagelchromatographie gereinigt wird, zu erhalten. Teil D. Dinatrium-1,7-dicaboxymethyl-[4'-3-amino-4-methoxyphenyl)-2,2' : 6'2"-terpyridino]- 1,4,7,10,13,16-hexaaza-18-Krone-6
Das zyklische Dilactam (a) von dem vorausstehenden Teil C wird mit Diboran reduziert, um das Diamin bereitzustellen, welches man mit Ethylbromacetat zur Reaktion bringt, um das Bis(ethylacetat) bereitzustellen. Dieses wird daraufhin mit Salpetersäure und Schwefelsäure nitriert, um das 4'(4-Methoxy-3-nitrophenyl)-2,2' : 6'2"-teipyridinyl-Derivat bereitzustellen. Die Nitrogruppe wird dann mit Ammoniumformiat in Gegenwart von Palladium auf Kohlenstoff reduziert, und die Estergruppen werden mit Natriumhydroxid verseift, um das gewünschte makrozyklische chelatbildende Mittel bereitzustellen (b).

Claims

1. Komplex aus einem Komplexierungsmittel der Formel

(worin jedes R² eine Gruppe CH&sub2;N(CH&sub2;COOH)&sub2; oder eine Carboxyalkylthioalkylgruppe bedeutet oder zusammen beide R²-Gruppen eine Gruppe der Formel

bedeuten und R eine Protein-reaktive Gruppe bedeutet, welche wahlweise kovalent an eine immonureaktive organische Verbindung gebunden ist; mit den Maßgaben, dass, wenn jedes R² eine Gruppe CH&sub2;N(CH&sub2;COOH)&sub2; bedeutet, dann R verschieden ist von einer p-Methoxyphenylgruppe, substituiert in der 3-Position durch eine Amino-, Isothiocyanato- oder Dimethylaminothiocarbonylaminogruppe), und wenn beide R²-Gruppen eine Gruppe der Formel

bedeuten, dann R die Bedeutung 3-Amino-4-methoxyphenyl hat, oder ein Salz hiervon, mit einem Metallradionuclidion.

2. Komplex nach Anspruch 1, wobei die Gruppe R eine reaktive Gruppe umfaßt, gewählt aus Amino, Alkylamino, Arylamino, Hydrazino, Alkylhydrazino, Arylhydrazino, Carbazido, Semicarbazido, Thiocarbazido, Thiosemicarbazido, Sulfhydryl, Sulfhydrylalkyl. Sulfhydrylaryl, Hydroxy, Carboxy, Carboxyalkyl, Carboxyaryl, aktives Halogen enthaltenden Gruppen, 2-Abspaltguppen-substituiertes Ethylcarbonyl, Vinylsulfonyl, Vinylcarbonyl, Epoxy. Isocyanato, Isothiocyanato, Aldehyd, Aziridin, Succinimidoxycarbonyl-aktivierte Acylgruppen und gemischte Anhydride, wahlweise kovalent gebunden an ein immunoreaktives organisches Material.

3. Komplex nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die Gruppe R eine immunoreaktive Gruppe umfaßt, gewählt aus Enzymen, Aminosäuren, Polypeptiden, Proteinen, Lipoproteinen, Glycoproteinen, Hormonen, Drogen, Steroiden, Vitaminen, Polysacchariden, Pharmazeutika, Haptenen, Lectinen, Toxinen, Nucleinsäuren, Antikörpern, antigenen Materialien. Avidin und Biotin.

4. Komplex nach Anspruch 3, wobei die Gruppe R einen Antikörper umfaßt.

5. Komplex nach Anspruch 4, wobei die Gruppe R einen Antikörper umfaßt, gewählt aus B72.3, 9.2.27, D612, UJ13A, NRLU-10, 7E11C5, CC49, TNT, PRIA3, ING-1, B174 und B43.

6. Komplex nach Anspruch 5, wobei die Gruppe R den Antikörper ING-1 umfaßt.

7. Komplex nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Metallradionuclidion &sup9;&sup0;Y³&spplus; ist.

8. Diagnostische oder therapeutische Zusammensetzung, umfassend einen eine immunoreaktive Gruppe enthaltenden Komplex nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.

9. Verwendung eines eine immunoreaktive Gruppe enthaltenden Komplexes nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei diagnostischen Bilderzeugungen.