DE69311764T2

DE69311764T2 - Peptide, die Antikörper induzieren, die genetisch divergierende HIV-1 Isolationen neutralisieren

Info

Publication number: DE69311764T2
Application number: DE69311764T
Authority: DE
Inventors: Gottfried Himmler; Hermann Katinger; Georg Maiwald; Thomas Muster; Martin Purtscher; Florian Rueker; Franz Steindl; Alexandra Trkola
Original assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Current assignee: Polymun Scientific Immunbiologische Forschung GmbH
Priority date: 1992-05-14
Filing date: 1993-05-13
Publication date: 1998-02-05
Anticipated expiration: 2013-05-14
Also published as: EP0570357A2; ES2053413T3; EP0570357A3; US5756674A; DE570357T1; JPH06293797A; ES2053413T1; CA2096159C; CA2096159A1; JP3369246B2; US5866694A; EP0570357B1; US5693752A; DE69311764D1

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Peptide die Antikörper induzieren, welche genetisch verschiedene HIV-1-Isolate neutralisieren. Diese Peptide werden zusammen mit einem Adjuvans, als rekombinante Fusionsproteine, chemisch an Trägermoleküle gebunden, als rekombinante schimärische Viren oder als rekombinante Antikörper eingesetzt. Zusätzlich kann mit diesen Peptiden das Stadium der Infektion bestimmt und das Fortschreiten der Infektion vorausgesagt werden.

EINLEITUNG

Das erworbene Immunschwächesyndrom (AIDS) ist die klinische Manifestation des Spätstadiums einer lang andauernden Infektion mit menschlichem Immunschwächevirus Typ 1 (HIV-1). Immunantworten die gegen das Virus und gegen virusinfizierte Zellen während der andauernden Infektion gerichtet sind, sind üblicherweise nicht in der Lage, eine Auflösung der Infektion zu vermitteln. Eine Möglichkeit, eine Immunantwort auszulösen, welche die Festsetzung einer beständigen Infektion verhindern kann oder welche das Voranschreiten zu AIDS verhindern kann sind Vakzinen. Die meisten Vakzinstrategien gegen HIV-1 sind gegen das Oberflächenglykoprotein gpl 60 gerichtet, welches aus gp120 und gp41 aufgebaut ist und welches für das Binden des Virus an den Zellrezeptor CD4 und für die Fusionsaktivität verantwortlich ist.
Im Zusammenhang mit gp160 wurden jedoch mehrere Phänomene beobachtet, welche gegen die Verwendung des ganzen gp160 oder gp120 als Immunogen sprechen. In vitro-Experimente zeigten, dass ein Synergismus zwischen HIV-1- gp120 und gp120-spezifischen Antikörpern eine menschliche T-Zellaktivierung blockieren (1). Dieses Ergebnis unterstützt die Hypothese, dass auch in vivo die humorale Immunantwort gegen gp120 von HIV-1 die T-Zellenaktivierung unter drückt und könnte ein Grund für die Immunschwäche sein. Der vorgeschlagene Mechanismus für diese Phänomen ist Quervernetzung und Moduation von CD4 Molekülen durch gp120 und anti-gp120. Experimente von Kion et al. (2) legen nahe, dass Sequenzhomologien zwischen gp160 und Klasse II MHC Molekülen zu Immunschwäche führen. Ausserdem ist es bekannt, dass eine Anzahl von antigenen Domänen auf gp160 Antikörper induzieren, welche eine HIV-1 Infektion beschleunigen (3). Solche im Zusammenhang mit gp160 bekannten Effekte könnten durch die Benützung von synthetischen Peptiden oder anderen Untereinheiten-Vakzinen, welche nur immunogene -und neutralisierende Epitope als Immunogene enthalten, verhindert werden. Immunogene Peptide, die Teilen verschiedener viraler Proteine entsprechen, wurden bereits zur erfolgreichen Immunisierung eingesetzt (4, 5, 6). Die Verwendung synthetischer Peptide als Immunogene bietet eine Vielzahl von Vorteilen Die produzierten Antikörper haben eine vorbestimmte Spezifität und im Fall von Viren können sie ausgewählt werden, um Strukturen auf der Oberfläche von Virionen zu repräsentieren. Die synthetischen Polypeptide sind auch insofern interessant, als sie Antikörperantworten induzieren können, welche unter normalen Umständen nicht zu sehen sind. Zum Beispiel wurde gefunden, dass im Hämagglutinin von Influenzavirus fünf bedeutende Antigenregionen vorhanden sind und dass unter Bedingungen natürlicher Infektion die Immunantwort Antikörper nur gegen diese Regionen einschliesst. Mit synthetischen Polypeptiden kann eine Immunantwort gegen andere Regionen des Hämagglutinin-Polypeptids erzeugt werden, und es wurde gefunden, dass diese Antikörper in der Lage sind, das Virus zu neutralisieren. Daher ist es möglich, neutralisierende Antikörper zu induzieren, welche eine breitere Reaktivität aufweisen als Antikörper, welche durch ganze Proteine induziert wurden (4). Weiters werden Immunisierungen mit Peptiden beschrieben, welche aus der Nukleotidsequenz des Maul- und Klauenseuchevirus (FMDV) abgeleitet wurden. Im Gegensatz zu Immunisierungen mit dem entsprechenden ganzen Protein von FMDV, führen Immunisierungen mit diesen Peptiden zu neutralisierenden Antikörpern, welche ebenfalls Schutz ergaben (5). Därüber hinaus wurde gezeigt, dass ein Peptid, welches einen Teil der V3 Schleife von gp120 des HIV-1 Isolates HIV-1 IIIB enthält, eine schützende Immunantwort gegen einen Virusangriff mit demselben HIV-1 Isolat induziert (7, 8).
Weil synthetische Peptide selbst nur eine geringe Immunogenität haben, müssen sie an Moleküle gekoppelt werden, welche einen Adjuvanseffekt ergeben wie Tetanustoxoid oder Keyhole Limpet Hemocyan (5). Eine andere Möglichkeit besteht darin, kleine Peptide als Fusionspeptide mit Glutathion-S-transferase von Schistosoma japonicum (9, 10) zu klonieren. Zusätzlich können abgeschwächte Viren wie Vaccinia, Polio Sabin Typ 1 oder Influenza NA/B-NS als Vektoren für Immunogene verwendet werden. Vacciniavirus wird häufig als ein Vektor für Fremdgene von multiplen Pathogenen verwendet. Zum Beispiel produzierten Kaninchen, welche mit rekombinantem, Sequenzen aus dem Hepatitis B Oberflächenantigen (HBsAg) enthaltendem Vacciniavirus, Glycoprotein D von Herpes- Simplex-Virus, und mit Hämagglutinin aus lnfluenzavirus inokuliert wurden, Antikörper gegen alle drei Fremdantigene (11). Weiters induzierte ein schimärisches Poliovirus, welches ein Epitop von gp41 aus HIV-1 exprimierte, neutralisierende Antikörper gegen gp41 in Kaninchen (12). Seit kurzem ist es auch möglich, das Genom von Influenzavirus durch in-vitro-Mutagenese (13) zu verändern. Mit Hilfe dieser Technik war es möglich, ein stabiles, abgeschwächtes lnfluenza-A-Virus zu konstruieren (14). Zusätzlich war es durch die Benutzung dieser Technik möglich, ein intertypisches schimärisches Virus zu konstruieren, in welchem eine Schlaufe aus sechs Aminosäuren, welche sich in der Antigenstelle B des Hämagglutinin eines H1 Subtypus befindet, durch die entsprechenden Strukturen der Subtypen H2 und H3 ersetzt wurde (15). Ein Vorteil von Influenzavirus in diesem Zusammenhang ist die Verfügbarkeit vieler Varianten, sodass wiederholte Impfung möglich ist. Darüber hinaus induziert Influenzavirus eine starke sekretorische und zelluläre Immunantwort, was für den Zugang zu einer anti-HIV-1-Vakzine vorteilhaft sein kann. Zudem ist es unwahrscheinlich, dass Influenzavirus mit der Entwicklung von bösartigen Krankheiten verbunden ist. Es ist keine DNA Phase in der Replikation von Infenzaviren involviert, was die Möglichkeit einer chromosomalen Integration von viralen Influenzagenen ausschliesst.
Die Verwendung von antiidiotypischen Antikörpern ist eine andere Möglichkeit, eine spezifische Immunreaktion zu erhalten. Antudiotypische Antikörper sind Antikörper, die die Antigenbindungsstelle eines anderen Antikörpers spezifisch erkennen und binden. Nachdem die Bindungsstellen der Antikörper strukturell als ein Spiegelbild des daran bindenden Epitops angesehen werden können, ent spricht ein antiidiotypischer Antikörper dem Spiegelbild dieses ersten Spiegelbildes, was bedeutet, dass ein antudiotypischer Antikörper das interne Bild des Epitops aufweist, welches vom idiotypischen Antikörper gebunden wird. Obwohl man nicht immer erwarten kann, eine komplette Identität der Struktur oder der Aminosäuresequenz zwischen dem antudiotypischen Antikörper und dem Epitop zu finden, kann man jedoch in der Praxis Effekte sehen, welche die Schlussfolgerung erlauben, dass es eine strukturelle, sequenzielle oder funktionelle Ähnlichkeit zwischen antudiotypischen Antikörpern und den entsprechenden Epitopen gibt. Die Verwendung von antudiotypischen Antikörpern als Vakzine wurde ursprünglich von Nisonoff und Lamoyi (16) vorgeschlagen. Im Falle der afrikanischen Schlafkrankheit wurde zum ersten Mal gezeigt, dass eine schützende Immunantwort gegen die verursachenden Agenzien, Trypanosoma brucei rhodesiense, in BALB/c Mäusen ausgelöst werden konnte, indem man die Mäuse mit antiidiotypischen Antikörpern impfte (17). Im Falle viraler Antigene wurde die Bildung von antudiotypischen Antikörpern für ein neutralisierendes Epitop auf dem Hämagglutinin-Molekül von Reovirus Typ III untersucht. Diese antiidiotypischen Antikörper erkannten den Zellrezeptor von Reovirus-Hämagglutinin sowohl auf zytolytischen T-Zeiien als auch auf neuronalen Zellen und waren in der Lage, in Mäusen sowohl eine humorale als auch eine zelluläre Immunantwort zu induzieren, welche spezifisch gegen Reovirus-Hämagglutinin gerichtet war (18, 19, 20).

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Peptide, welche sechs Aminosäurereste (AS) enthalten und die spezifisch an den monoklonalen Antikörper 2F5 binden, wurden als Immunogene verwendet, um neutralisierende Antikörper gegen HIV-1 zu induzieren. Zur Identifikation dieser Peptide wurden überlappende Fragmente von gp41 (HIV-1 Isolat BH10) als Fusionspeptide mit Glutathiontransferase kloniert. Die verschiedenen Fusionspeptide wurden durch Hybridisierung der dem gp41 entsprechenden Oliogonukleotide er halten, welche zwischen die Bam HI und die Eco RI Stelle des Plasmids pGEX-2T (Pharmacia) kloniert wurden. Die rekombinanten Plasmide wurden in den E. coli Stamm DH5α transformiert und die Expression der Fusionsproteine wurde durch Isopropylthiogalactosid (IPTG) induziert. Der E. coli-Extrakt wurde dann mit Glutathionsepharose-4B-Säulen gereinigt, auf Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgele geladen, durch Elektrophorese aufgetrennt und die Proteinexpression mittels Silberfärbung analysiert. Fusionspeptide, welche mit dem monoklonalen Antikörper 2F5 reagiert haben, wurden durch Immunoblotting identifiziert. Durch Verwendung dieser Methode wurden Peptide, welche an den monoklonalen Antikörper 2F5 binden, identifiziert: Figur 1 zeigt Westernblots von Fusionspeptiden mit überlappenden Fragmenten von gp160 aus HIV-1 (Isolat BH10). Im Gegensatz zu Konstrukten, welche AS 597 bis 677, 634 bis 677 und 648 bis 677 enthalten (die Numerierung der Aminosäurereste entspricht dem gp160 von HIV-1- Isolat BH10, wie im Swissprot Datenbankeintrag ENV$HIV10 beschrieben), welche mit dem Antikörper 2F5 reagierten, zeigte ein Fusionspeptid, das die AS 667 bis 677 enthält, keine positive Reaktion. Dies war das erste Anzeichen dafür, dass das Epitop des monoklonalen Antikörpers 2F5 durch AS innerhalb der Sequenz von Position 648 bis 667 von gp160 gebildet wird. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden überlappende 6-mer-Peptide dieser Region mit der Glutathion-S-transferase fusioniert. Wie in Figur Ib dargestellt, zeigte das Peptid, welches die Aminosäuresequenz GLU LEU ASP LYS TRP ALA (AS 662-667) enthält, eine starke Reaktion mit dem Antikörper 2F5, wogegen die Peptide, welche die Aminosäuresequenz LEU ASP LYS TRP ALA SER (AS 663-668) oder ASP LYS TRP ALA SER LEU (AS 664-669) enthielten, mit dem monoklonalen Antikörper wesentlich geringer reagierten. Ein Peptid, das die Aminosäuresequenz LEU GLU LEU ASP LYS TRP (AS 661-666) enthielt, zeigte überhaupt ekeine Reaktivität. Diese Daten legen nahe, dass das Epitop auf dem monoklonalen Antikörper die Aminosäuresequenz GLU LEU ASP LYS TRP ALA enthält, welche den AS 662- 667 auf gp160 des HIV-1-Isolates BH10 entspricht. In diesem Zusammenhang waren sowohl ein synthetisches Peptid, welches dieser Epitopsequenz entsprach, als auch ein Fusionsprotein, welches diese Sequenz enthielt, in der Lage, die Neutralisation zu inhibieren, welche durch den Antikörper 2F5 vermittelt wird (Figur 4). Ein Sequenzvergleich dieser Region enthüllte, dass die entsprechende Aminosäuresequenz stark konservativ zwischen ansonsten genetisch sehr ver schiedenen HIV-1-lsolaten ist (Tabelle 2a). Wir waren auch in der Lage zu zeigen, dass Fusionpeptide mit Aminosäure-Substitutionen in dieser Region - entsprechend verschiedenen HIV-1 Isolaten - ebenfalls mit dem Antikörper 2F5 reagierten (Figur 1c).
Das Vorhandensein von Antigendomänen im Bereich dieser Region wurde erst kürzlich berichtet (21, 22). Teeuwsen et al. berichteten von einem monoklonalen Antikörper, der mit einem Peptid entsprechend den AS 643-692 von gp160 reagierte. Weiters berichteten Broliden et al., dass HIV-1-Antikörper-positive menschliche Seren mit einem Peptid reagierten, welches der Region 657-671 entsprach. Jedoch wurde in beiden Fällen ein spezifisches Epitop nicht identifiziert. Der monoklonale Antikörper, der von Teeuwsen et al. erwähnt wurde, hatte keine neutralisierende Aktivität. Auch die Seren, welche mit dem Peptid 657-671 von Broliden et al. reagierten, zeigten nur teilweise neutralisierende Aktivität. In verschiedenen Neutralisationsassays war diese Gruppe in der Lage, eine neutralisierende Aktivität gegen HIV-1-Isolat IIIB zu zeigen, aber nicht gegen SF2 und RF.
Im Gegensatz zu diesen Resultaten, neutralisiert der monoklonale Antikörper 2F5 eine Vielzahl verschiedener HIV-1 Isolate einschliesslich SF2 und RF (Tabelle 1). Diese Daten legen nahe, dass die Antikörper der Seren, welche von Broliden et al. beschrieben wurden, ebenso wie der monoklonale Antikörper der von Teeuwsen et al. erwähnt wurde, eine andere Spezifität haben und ein anderes Epitop erkennen als der Antikörper 2F5.
Die Anwendung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Peptide als Immunogene hat mehrere Vorteile. Sie umfassen nur 6 AS. Dadurch können andere gp160-Peptidsequenzen vermieden werden, welche Antikörper induzieren, die eine HIV-1-Infektion beschleunigen oder zu Immunsuppression führen (2, 3). Darüber hinaus sollte eine effektive HIV-1-Vakzine eine Immunantwort gegen HIV-1-Isolate, welche sich in ihren Genomsequenzen beträchtlich unterscheiden, induzieren. In diesem Zusammenhang enthüllte ein Sequenzvergleich in der Region des 2F5-Epitops, dass das Epitop des Antikörpers 2F5 unter verschiedenen HIV-1 Isolaten stark konservativ ist (Tabelle 2a). Nachdem Peptide mit AS-Substitutionen - entsprechend den genetisch verschiedenen HIV-1 Isolaten - mit dem 2F5 Antikörper reagierten (Figur 1c), ist es wahrscheinlich, dass Antikörper, induziert durch Peptide welche in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, gegen eine Reihe verschiedener HIV-1-Isolate gerichtet sind. Zusätzlich zeigt der Antikörper 2F5 neutralisierende Aktivität gegen eine breite Vielfalt genetisch verschiedener HIV-1 Isolate, was beweist, dass Peptide, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben sind, als neutralisierende Epitope präsentiert werden (Tabelle 1).
Um herauszufinden, welche Variationen der Epitopsequenz an den monoklonalen Antikörper 2F5 binden, unternahmen wir eine Peptidkartierung mit einer Zufalls- Hexapeptid-Bank, exprimiert und präsentiert an Protein III eines filamentösen Phagen (22a). Die Hexapeptidsequenzen der eluierten Phagenpartikel wurden gesammelt (Tabelle 2b).
Es gibt einen breiten Bereich der Variation im Fortschreiten der HIV-1-bezogenen Erkrankung in verschiedenen HIV-1 infizierten Personen. In vielen Fällen endet eine HIV-1 Infektion innerhalb einiger Jahre mit AIDS-Related Complex (ARC) und AIDS, während einige HIV-1-positive Personen asymptomatisch bleiben. Es wurde gezeigt, dass Antikörpertiter gegen bestimmte Peptidepitope in AIDS- Patienten wesentlich niedriger sind als bei asymptomatischen Stadien (23). Wir fanden einen signifikanten Zusammenhang zwischen den Antikörpertitern gegen die Peptide der vorliegenden Erfindung und einer HIV-1-bezogenen Progression der Erkrankung (Figur 2). Die Patienten mit den Nummern 20, 25, 29, 35, 41, 44 und 46, die einen hohen Antikörpertiter gegen Peptide dieser Erfindung aufweisen (Figur 2), zeigten bislang kein Voranschreiten der Erkrankung innerhalb der letzten 5 Jahre. Das bedeutet, dass die Bildung von Antikörpern, welche durch Peptide induziert wurde, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden, das Voranschreiten von HIV-1-bezogener Erkrankung inhibieren oder zumindest reduzieren kann. Die Tatsache, dass nur selten hohe Antikörpertiter gegen Peptide dieser Erfindung in Seren von HIV-1 positiven Patienten gefunden wurden, zeigt, dass diese Epitope auf gp160 vom menschlichen Immunsystem nicht leicht erkannt werden, mit dem Ergebnis geringer Titer HIV-1 neutralisierender Antikörper, die spezifisch gegen diese Epitope gerichtet sind. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es auch, die Peptide, die in der Erfindung beschrieben sind, in einer geeigneten Form zu präsentieren und eine ausreichende neutralisierende Immunantwort zu induzieren.

Beispiel 1

Es wird das Klonieren und Exprimieren von in der Erfindung beschriebenen Peptiden als Fusionsproteine mit Glutathion-S-transferase (GST) und das Immunisieren von Mäusen mit diesen Peptiden beschrieben. Alle Klonierungsmethoden wurden gemäss Standardverfahren vorgenommen (24). Oligonukleotide, die den in der Erfindung beschriebenen Peptiden entsprechen, wurden hybridisiert und zwischen der Bam HI- und der Eco RI-Stelle des Plasmids pGEX-2T (Pharmacia) kloniert. Dadurch wurden die NH&sub2;-terminalen Enden dieser Peptide mit den COOH-terminalen Enden von GST fusioniert. Zusätzlich wurde ein Stopcodon an die COOH- terminalen Enden der gp41-Peptidsequenzen angefügt. Diese Konstrukte wurden in E. coli DH5α transformiert und die Expression der Fusionsproteine wurde mit Isopropylthiogalaktosid (IPTG) induziert. Nach drei Stunden Induktion wurden die Bakterien durch Zentrifugation geerntet, in phosphatgepufferter Kochsalzlt sung (PBS; pH 7,2), welche 1 % Triton-X-100 enthielt, suspendiert und ultrabeschallt. Bakterielle Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation sedimentiert und der Überstand wurde auf Glutathion-Sepharose-4B-Säulen (Pharmacia) geladen. Die Elution der Fusionsproteine wurde mit 20 mM Glutathion und 120 mM NaCl in 10 0mM Tris HCl (pH 8,0) durchgeführt. Die gereinigten Fusionsproteine, welche mit diesem Verfahren erhalten wurden, wurden zur Immunisierung von Mäusen gemäss Standardverfahren verwendet. Als Kontrolle wurden Mäuse mit GST, welche auf dieselbe Art wie die Fusionsproteine erzeugt wurde, immunisiert. Mäuseseren, die eine Woche nach der letzten Immunisierung entnommen wurden, zeigten hohe neutralisierende Titer gegen die in der Erfindung beschriebenen Peptide und inhibierten eine HIV-1-Replikation in vitro (Figuren 3b und 3c).

Beispiel 2:

Beispiel 2 beschreibt die Expression von in der Erfindung beschriebenen Peptidsequenzen als Teil des Hämagglutinins von Influenza A-Virus. In vitro- Mutagenese wurde eingesetzt, um diese Peptidsequenzen in die Antigenstelen A, B, C, D und E des Hämagglutinins von Influenza A-Virus einzuführen (26, 27). Diese schimärischen DNA-Konstrukte wurden dann in Influenzavirus HK/WSN "RNP- transfiziert" (13). Diese schimärischen Influenza/HIV-Viren hatten die antigenen Eigenschaften des besagten Peptids. In Antikörper-Adsorptionsexperimenten inhibierten diese schimärischen Viren die HIV-1-Neutralisierung durch den Antikörper 2F5 (Figur 3a). Antiseren von Mäusen, die mit den schimärischen Viren immunisiert waren, reagierten mit den besagten Peptiden (Figur 3b). Weiters neutralisierten diese Antiseren verschiedene HIV-1-Isolate in vitro (Figur 3c).

Beispiel 3:

Beispiel 3 beschreibt die Expression von in der Erfindung beschriebenen Peptiden als Teil eines sogenannten "immunologischen Supermoleküls", in welchen die Peptidsequenz in den Verbindungsteil inseriert ist, welcher die variablen Regionen der schweren und leichten Kette eines Immunglobulin-Moleküls verbindet. Insbesondere wurde ein Einzelketten-Fv-Konstrukt eines neutralisierenden anti-HIV- gp120-Antikörpers nach Standardverfahren hergestellt (27). In diesem Konstrukt wurden in der Erfindung beschriebene Peptidsequenzen in den Verbindungsteil inseriert, der die variable Region der leichten Kette mit der variablen Region der schweren Kette verbindet. Dieses rekombinante Protein wurde in E. coli exprimiert und nach Standardverfahren gereinigt. Zwei Funktionen konnten an diesem Konstrukt beobachtet werden. Erstens zeigt dieses Konstrukt die antigenbindenden Eigenschaften des ursprünglichen Antikörpers und ausserdem induzierte dieses Konstrukt wenn es in Mäuse injiziert wurde, Antikörper, welche verschiedene HIV-1-Isolate neutralisierte (Figur 3c).
Dieses "immunologische Supermolekül" schafft die Möglichkeit, gleichzeitig eine aktive und passive Immunisierung zu erhalten. Grundsätzlich sind in einem solchen Konstrukt die antigenbindenden, neutralisierenden Eigenschaften eines Antikörpers und die Präsentation eines neutralisierenden Epitops kombiniert. In bereits HIV-1-infizierten Personen konnte das Voranschreiten der Infektion in der ersten Anwendung durch die antigenbindenden neutralisierenden Eigenschaften verlangsamt werden, noch bevor der effektive Start des Immunsystems durch die neutralisierenden Epitope dieses Moleküls ausgelöst wird. Auf diese Weise konnte die gewöhnlich beobachtete Zeitverzögerung zwischen Immunisierung und effektiver Immunantwort einer typischen aktiven Immunisierung überwunden werden. Zusätzlich ist es sehr wahrscheinlich, dass während der Neutralisierung von bereits vorhandenen HIV-1-Virionen die Präsentation des Epitops sehr effizient ist.

Beispiel 4:

Beispiel 4 beschreibt sowohl die Bildung von antudiotypischen Antikörpern gegen Antikörper 2F5, als auch die Produktion eines antudiotypischen Antikörpers mittels in vitro-Rekombinationstechniken.
Antikörper 2F5 wurde verwendet, um Mäuse zu immunisieren und um die Bildung von antudiotypischen Antikörpern zu induzieren. Das angewandte Immunisierungsschema entsprach Standardverfahren, um die Frequenz, bei der im Tier antiidiotypische Antikörper entwickelt werden, zu steigern. Die polyklonalen Seren, die auf diese Weise erhalten wurden, wurden auf ihre Immunreaktivität getestet, wobei mittels Antigen-Kompetitions-ELISA bestimmt wurde, dass ein Teil der humoralen Immunantwort tatsächlich gegen die Kombinationsstelle des Antikörpers 2F5 gerichtet ist. Auf diese Weise wurde bewiesen, dass in jenen Seren antiidiotypische Antikörper vorhanden waren. Um das Konzept der Impfung mittels antudiotypischer Antikörper zu testen, wurden die Seren, welche antiidiotypische Antikörper enthielten, nachfolgend zur Immunisierung einer anderen Gruppe von Mäusen eingesetzt. Nach Abschluss dieser Immunisierungsprozedur war es möglich, eine Immunantwort auf die antudiotypischen Seren festzustellen, welche qualitativ vergleichbar war mit der oben beschriebenen Immunreaktion gegen den HIV-1-Peptidteil des Glutathion-S-transferase Fusionsproteins, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist.
Nachdem es nun bewiesen war, dass das beschriebene Peptid die Qualität besitzt, um als Immunogen zu agieren, und nachdem ausserdem gezeigt wurde, dass es durch die Verwendung antiidiotypischer Antikörper mit der Eigenschaft der inneren Abbildung des beschriebenen Peptids möglich war, eine HIV-1-neutralisierende Immunantwort zu induzieren, wurde ein antudiotypischer Antikörper mit Hilfe von in vitro-Rekombinationstechniken konstruiert. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden eine oder mehrere hypervariable Regionen (oder Teile davon) eines bestehenden, molekular kollerten Antikörpers durch in der Erfindung beschriebene Peptidsequenzen ersetzt. Die jeweiligen Konstrukte wurden als Einzelketten-Fv-Fragmente in E. coli exprimiert und die rekombinanten Proteine wurden gemäss Standardverfahren gereinigt. Die Immunisierung von Mäusen mit den antudiotypischen Proteinen, die auf diese Weise produziert wurden, führen zu einer HIV-1-neutralisierenden Immunantwort (Figur 3c).

Beispiel 5:

Beispiel 5 beschreibt die Peptidkartierung mit einer Zufalls-Hexapeptid-Bank und Immunisierungen von Mäusen, welche Peptide gemäss SEQ ID NO: 10 bis SEQ ID NO: 25 enthalten. Der monoklonale Antikörper 2F5 wurde über Nacht bei 4ºC in einer Konzentration von 5 µg/ml in Beschichtungspuffer (0,1 M Na-Carbonat- Puffer, pH 9,6) auf Polystyrolröhrchen (Maxiscorp, Nunc, Dänemark) aufgebracht. Nach Waschen mit PBS wurde die Oberfläche mit PBS inklusive 5 Gew.% Magermilchpulver bei 36ºC zwei Stunden lang blockiert. Nach Waschen mit PBS folgte die Inkubation einer Phagen-exprimierten und -präsentierten Hexapeptid-Bank (1011 Transduktionseinheiten in TPBS [=PBS einschliesslich 0,5 Vol.% Tween 20]) bei 5ºC über Nacht. Extensivem Waschen mit TPBS folgte die Phagenelution mit Elutionspuffer (0,1N HCI/Glycin pH 2,2; 1 mg BSA/ml). Das Eluat wird mit 1M Tris neutralisiert und zur Infektion von E.coli K91Kan verwendet. Aus der infizierten Kultur werden die Phagen nach den beschriebenen Methoden gewonnen (22a). Die Prozedur wird dreimal wiederholt. Das letzte Eluat wurde dazu verwendet, transduzierten E.coli Kglkan herzustellen. DNA dieser Klone wurde sequenziert und die jeweilige vom Phagen exprimierte und präsentierte Hexapeptidsequenz daraus mittels Computertranslation abgeleitet.
Klone mit den SEQ ID NO:10 bis SEQ ID NO:25 (Tabelle 2) wurden zur Phagenherstellung verwendet und die jeweiligen Phagen in Mäuse injiziert. Nach zwei Verstärkungsinjektionen wurden die jeweiligen Seren auf HIV-1-neutralisierende Aktivität hin untersucht. In vitro waren alle diese Seren neutralisierend. Das Kontrollserum wurde durch Immunisierung mit Wildtyp-Phagen f1 erzeugt und neutralisierte HIV-1 nicht. Zusätzlich wurden Oligonukleotide, die für die SEQ ID NO: 10 bis 25 kodieren, mittels Standardkloniertechniken in Gen VIII des fd-tet zwischen AS 27 und 28 des unreifen Proteins VIII einkloniert. Die rekombinanten Phagen wurden in E. coli K91Kan produziert, nach Standardtechniken gereinigt (PEG-vermittelte Fällung gefolgt von CsCl-Gradientenzentrifugation) und als Immunogen eingesetzt. Die jeweiligen Seren stellten sich in HIV-1-Neutralisationsassays als neutralisierend heraus, nicht jedoch anti-Wildtyp fd-tet.

Sequenzdrotokoll:

SEQ ID No: 1:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat BH10 POSITION DER SEQUENZ IN GP160: von Aminosäurerest 662 bis 667
EIGENSCHAFTEN: Epitop eines menschlichen monoklonalen Antikörpers gerichtet gegen HIV-1 GP160
REFERENZ: Transation aus Genbank Hinterlegungsnummer M15654, Nucleotide 7563 bis 7580
Glu Leu Asp Lys Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 2:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat js4/26 POSITION DER SEQUENZ IN GP16O: von Aminosäurerest 655 bis 660
EIGENSCHAFTEN: Epitop eines menschlichen monoklonalen Antikörpers gerichtet gegen HIV-1 GP160
REFERENZ: Translation aus Genbank Hinterlegungsnummer M37576, Nukleotide 1963 bis 1980
Glu Leu Asn Lys Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 3:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat (Patient 3L) POSITION DER SEQUENZ IN GP160: von Aminosäurerest 164 bis 169
EIGENSCHAFTEN: Epitop eines menschlichen monoklonalen Antikörpers gerichtet gegen HIV-1 GP160
REFERENZ: Transation aus Genbank Hinterlegungsnummer X61352, Nucleotide 490 bis 507
Glu Leu Asp Lys Trp Asp
1 5 6
SEQ ID No: 4:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat SF170 POSITION DER SEQUENZ IN GP160: von Aminosäurerest 667 bis 672
EIGENSCHAFTEN: Epitop eines menschlichen monoklonalen Antikörpers gerichtet gegen HIV-1 GP160
REFERENZ: Transation aus Genbank Hinterlegungsnummer M66533, Nukleotide 1999 bis 2016
Ala Leu Asp Lys Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 5:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat JH3 POSITION DER SEQUENZ IN GP160: von Aminosäurerest 673 bis 678
EIGENSCHAFTEN: Epitop eines menschlichen monoklonalen Antikörpers gerichtet gegen HIV-1 GP160
REFERENZ: Transation aus Genbank Hinterlegungsnummer M21138, Nukleotide 2263 bis 2280
Gly Leu Asp Lys Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 6:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat Z-84 POSITION DER SEQUENZ IN GP160: von Aminosäurerest 669 bis 674
EIGENSCHAFTEN: Epitop eines menschlichen monoklonalen Antikörpers gerichtet gegen HIV-1 GP160
REFERENZ: Transiation aus Genbank Hinterlegungsnummer J03653, Nukleotide 2037 bis 2054
Gln Leu Asp Lys Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 7:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat CAM1 provirales Genom POSITION DER SEQUENZ IN GP160: von Aminosäure rest 662 bis 667
EIGENSCHAFTEN: Epitop eines menschlichen monoklonalen Antikörpers gerichtet gegen HIV-1 GP160
REFERENZ: Transation aus Genbank Hinterlegungsnummer D10112, Nukleotide 8209 bis 8226
Glu Leu Asp Thr Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 8:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat JS4/6 POSITION DER SEQUENZ IN GP160: von Aminosäurerest 659 bis 664
EIGENSCHAFTEN: Epitop eines menschlichen monoklonalen Antikörpers gerichtet gegen HIV-1 GP160
REFERENZ: Transation aus Genbank Hinterlegungsnummer M37491, Nukleotide 2416 bis 2433
Ala Leu Asp Thr Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 9:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat SBB POSITION DER SEQUENZ IN GP160: von Aminosäurerest 413 bis 418 (Teilsequenz)
EIGENSCHAFTEN: Epitop eines menschlichen monoklonalen Antikörpers gerichtet gegen HIV-1 GP160
REFERENZ: Transiation aus Genbank Hinterlegungsnummer M77229, Nukleotide 1239 bis 1256
Lys Leu Asp Glu Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 10:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Ser Leu Asp Lys Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 11:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Gly Arg Asp Lys Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 12:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Gly Ala Asp Lys Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 13:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Ala His Glu Lys Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 14:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Ala Cys Asp Gln Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 15:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Gly Ala Asp Lys Trp Gly
1 5 6
SEQ ID No: 16:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Gly Ala Asp Lys Trp Asn
1 5 6
SEQ ID No: 17:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Gly Ala Asp Lys Trp Cys
1 5 6
SEQ ID No: 18:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Gly Ala Asp Lys Trp Val
1 5 6
SEQ ID No: 19:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Gly Ala Asp Lys Trp His
1 5 6
SEQ ID No: 20:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Gly Ala Asp Lys Cys His
1 5 6
SEQ ID No: 21:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Gly Ala Asp Lys Cys Gin
1 5 6
SEQ ID No: 22:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Ala Tyr Asp Lys Trp Ser
1 5 6
SEQ ID No: 23:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Ala Phe Asp Lys Trp Val
1 5 6
SEQ ID No: 24:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Gly Pro Asp Lys Trp Gly
1 5 6
SEQ ID No: 25:
LÄNGE DER SEQUENZ: 6 Aminosäurereste
ART DER SEQUENZ: Aminosäuresequenz
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5 POSITION DER SEQUENZ IN p3: von Aminosäurerest 4 bis 9
EIGENSCHAFTEN: Hexapeptid das an monoklonalen Antikörper 2F5 bindet
Ala Arg Asp Lys Trp Ala
1 5 6
SEQ ID No: 26:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzeltrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: cDNA zu viraler RNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 ISOLAT BH10
REFERENZ: Genbank Hinterlegungsnummer M15654
POSITION DER SEQUENZ IM DATENBANKEINTRAG: 7564 bis 7580
gaattagata aatgggca
18
1 11
SEQ ID No: 27:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: cDNA zu viraler RNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GPI 60 von HIV-1 ISOLAT JS4/26
REFERENZ; Genbank Hinterlegungsnummer M37576
POSITION DER SEQUENZ IM DATENBANKEINTRAG: 1963 bis 1980
gaattgaata agtgggca
18
1 11
SEQ ID No: 28:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzetrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: cDNA zu viraler RNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat (Patient 3L)
REFERENZ: Genbank Hinterlegungsnummer X61352
POSITION DER SEQUENZ IM DATENBANKEINTRAG: 490 bis 507
gaattagata agtgggac
18
1 11
SEQ ID No: 29:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzetrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKULS: cDNA zu viraler RNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat SF170
REFERENZ: Genbank Hinterlegungsnummer M66533
POSITION DER SEQUENZ IM DATENBANKEINTRAG: 1999 bis 2016
gcattggaca agtgggca
18
1 11
SEQ ID No: 30:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzeltrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: cDNA zu viraler RNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat JH3
REFERENZ: Genbank Hinterlegungsnummer M21138 POSITION DER SEQUENZ IM DATENBANKEINTRAG: 2263 bis 2280
gggttagata aatgggca
18
1 11
SEQ ID No: 31:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: cDNA zu viraler RNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GPI 60 von HIV-1 Isolat Z-84
REFERENZ: Genbank Hinterlegungsnummer J03653
POSITION DER SEQUENZ IM DA TENBANKEINTRAG: 2037 bis 2054
caattggaca aatgggca
18
1 11
SEQ ID No: 32:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzetrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: cDNA zu viraler RNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat CAM1 provirales Genom
REFERENZ: Genbank Hinterlegungsnummer D10112
POSITION DER SEQUENZ IM DATENBANKEINTRAG: 8209 bis 8226
gaattggata cgtgggca
18
1 11
SEQ ID No: 33:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzeltrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: cDNA zu viraler RNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat JS4/6
REFERENZ: Gen Bank Hinterlegungsnummer M37491
POSITION DER SEQUENZ IM DATENBANKEINTRAG: 2416 bis 2433
gcattggata cgtgggca
18
1 11
SEQ ID No: 34:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: cDNA zu viraler RNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: GP160 von HIV-1 Isolat SBB
REFERENZ: Genbank Hinterlegungsnummer M77229
POSITION DER SEQUENZ IM DATENBANKEINTRAG: 1239 bis 1256
aagttagatg agtgggca
18
1 11
SEQ ID No: 35:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzetrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
tcgcttgata agtgggcc
18
1 11
SEQ ID No: 36:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
gggcgtgata agtgggcg
18
1 11
SEQ ID No: 37;
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3; 10 bis 27
ggggctgata agtgggcg
18
1 11
SEQ ID No: 38:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzetrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
gctcatgaaa agtgggcg
18
1 11
SEQ ID No: 39:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
gcttgtgatc agtgggcg
18
1 11
SEQ ID No: 40:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
ggagctgata agtggggt
18
1 11
SEQ ID No: 41:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
ggagctgata agtggaat
18
1 11
SEQ ID No: 42:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
ggcgctgata aatggtgt
18
1 11
SEQ ID No: 43:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
ggcgctgata aatgggtt
18
1 11
SEQ ID No: 44;
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
ggggctgata agtggcat
18
1 11
SEQ ID No: 45:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
ggagctgata aatgtcat
18
1 11
SEQ ID No: 46:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
ggagctgata aatgtcag
18
1 11
SEQ ID No: 47:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
gcttatgata agtggagt
18
1 11
SEQ ID No: 48:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
gcttttgata agtgggtt
18
1 11
SEQ ID No: 49:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS: Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
gggcctgata aatggggt
18
1 11
SEQ ID No: 50:
LÄNGE DER SEQUENZ: 18 Basenpaare
ART DER SEQUENZ: Nukleotidsequenz
ART DES STRANGES: Einzelstrang
TOPOLOGIE DER SEQUENZ: linear
ART DES SEQUENZIERTEN MOLEKÜLS Phagen-DNA
ART DES FRAGMENTS: inneres Fragment
HERKUNFT: Gen codierend für das p3 Fusionsprotein des filamentösen Phagen fUSE5
POSITION DER SEQUENZ IN p3: 10 bis 27
gctcgtgata agtgggcg
18
1 11

Literatur:

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26. Wiley, DC., l.A. Wilson and J.j. Shekel. 1961. Structural identification of the antibody binding sites of Hong Kong lnfluenza Hemagglutinin and their involvement in the antigenic variation, Nature 289: 373-378
27. Kohl, J., F. Rüker, G. Himmler, E. Razazzi, and H. Katinger. 1991. Cloning and expression of a HIV-1 specific single-chain Fv region fused to Escherichia coli Alkaline Phosphatase, Ann. New York Acad. Sci. 646:106-114 Tabelle 1:
a) in vitro Neutralisationsassay: Verschiedene Konzentrationen des Antikörpers 2F5 wurden mit zellfreien Viruspräparationen (10²-10³ TCID&sub5;&sub0;) 1 h lang bei 37ºC inkubiert. Aliquote von 10&sup5; H9-Zellen wurden zu Virus/Antikörper-Mischungen zugesetzt und eine zusätzliche Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Nach 20 Tagen wurde die Konzentration von Antigen p24 als Mass für die Virusreplikation aus den Überständen nach Standardverfahren bestimmt.
b) Synzytien-Inhibitionsassay: Antikörperlvirus-Mischungen wurden wie in Tabelle 1a beschrieben hergestellt. Zu diesen Mischungen wurden 10&sup5; AA2-Zellen hinzugefügt und bei 37ºC inkubiert. Nach 5 Tagen wurde die Synzytienbildung als Mass für die HIV-1-Replikation ausgewertet.
Abkürzungen: A und C sind klinische Isolate aus Wien. Tabelle 2: Peptidsequenzen, die von Antikörper 2F5 gebunden werden:
a: Sequenzen, die auf gp160 verschiedener HIV-1-Isolate vorhanden sind. Die Nummer auf der rechten Seite jeder Sequenz zeigt die Häufigkeit des Vorkommens in den überprüften Datenbanken (SwissProt und GenPept) an.
b: Bindende Sequenzen, die durch Überprüfung einer an der Oberfläche eines filamentösen Phagen exprimierten Zufalls-Hexapeptid-Bank aufgefunden wurden (Sequenzen, die bereits in a) beschrieben sind, sind nicht eingeschlossen).

Figurenbeschreibung:

Abb. 1: Westernblots von Fusionspeptiden. Rekombinante Proteine, exprimiert in E. coli, wurden wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt und 100 ng jedes Fusionspeptides wurden mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese auf einem 20% Polyacrylamid-Gel fraktioniert und mittels Elektroblotting auf ein Nitrozellulosefilter transferiert. Die Blots wurden mittels 0,5 % nicht fetter Trockenmilch in phosphatgepufferter Kochsalzlösung&sub1; die 0,1 % Tween enthält, 1 h lang bei Zimmertemperatur blockiert. Nach dem Waschen wurden die Blots mit Antikörper 2F5 (500 ng/ml) ih lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Blots mit einem Konjugat aus anti-humanem IgG-alkalischer Phosphatase 1 h lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Blots wurden mit 1 M Diäthanolaminpuffer (pH 9,6) inklusive 350 µg/ml Nitroblau-Tetrazoliumchlorid und 350 µg/ml 5-Bromo-4 chloro-3-indolylphosphat entwickelt.
Abb.1a: Bahn 1, Glutathion-S-transferase (GST); Bahn 2, Aminosäuren (AS) 597- 677 von gp160 fusioniert mit GST; Bahn 3, AS 634-677 fusioniert mit GST; Bahn 4, AS 648-677 fusioniert mit GST; Bahn 5, AS 667-677 mit GST.
Abb.1b: Bahn 1, GST; Bahn 2, GST fusioniert mit AS GLU LEU ASP LYS TRP ALA (AS 662-667); Bahn 3, GST fusioniert mit AS LEU ASP LYS TRP ALA SER (AS 663-668); Bahn 4, GST mit ASP LYS TRP ALA SER LEU (AS 664-669); Bahn 5, GST mit AS LEU GLU LEU ASP LYS TRP (AS 661-666).
Abb. 1c: Fusionspeptide mit Aminsäuresubstitutionen gemäss HIV-1-Isolaten mit Unterschieden in der Region des 2F5-Epitops. Aminosäure-Unterschiede sind unterstrichen. Bahn 1, GST; Bahn 2, GLU LEU ASP LYS TRP ALA; Bahn 3, GLN LEU ASP LYS TRP ALA; Bahn 4, GLY LEU ASP LYS TRP ALA; Bahn 5, ALA LEU ASP LYS TRP ALA; Bahn 6, GLU LEU ASN LYS TRP ALA (Reaktion dieses Fusionspeptids mit Antikörper 2F5 ist in diesem Westembiot nicht sichtbar; in ELISA- Kompetitionsassays war dieses Peptid jedoch kompetitiv mit rekombinantem gp41 bezüglich des Bindens an den Antikörper 2F5); Bahn 7, GLU LEU ASP THR TRP ALA; Bahn 8, GLU LEU ASP LYS TRP ASP Abb.1a Abb.1b Abb.1c Bestimmung peptidspezifischer Antikörpertiter in Seren HIV-1 infizierter Personen
Die Antikörper wurden durch ELISA bestimmt. Das Peptid wurde in Form eines Fusionspeptids (in Kombination mit Glutathion-S-transferase) eingesetzt. Das Fusionspeptid wurde auf 96 Mikrotiterplatten 100 µl/Vertiefung (2,5 µg/ml) aufgetragen und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer wurden HIV-1-positive Seren in Verdünnungspuffer 2n-fach (1: 40 - 1:81920) verdünnt und Aliquote auf die Testplatte (100 µl/Vertiefung) transferiert und 1 h lang bei Zimmertemperatur inkubiert. Dann wurden die Platten wieder mit Waschpuffer dreimal gewaschen. Als ein zweiter Antikörper wurde antihumane γ-Kette der Ziege, konjugiert mit Meerrettichperoxidase eingesetzt (Verdünnung 1:1000, 100 µl/Vertiefung). Nach 1 h Inkubation bei ZT wurden die Platten dreimal mit Waschpuffer gewaschen. Dann wurden die Platten mit o- Phenylendiamin-dihydrochlorid als Substrat gefärbt. Die Reaktion wurde mit 2,5 M H&sub2;SO&sub4; gestoppt und die Platten vermessen (Messwellenlänge 492 nm, Referenzwellenlänge 620 nm) und ausgewertet.
Grenzwert=der Mittelwert (4-fach) eines HIV-1 negativen Serums (1:40) + 3- fache Standardabweichung. Die Spender der Seren Nr.20, 25, 29, 35, 41, 44, 46 sind seit mindestens fünf Jahren HIV-1 positiv und immer noch asymptomatisch.
Abbildung 2: Graphik der spezifischen Antikörpertiter zum Peptid mit der Aminosäuresequenz "ELDKWA" aus 65 Seren HIV-1 positiver Spender Influenza/HIV-Inhibition der HIV-1 IIIB-Neutralisierung
Abbildung 3a: Influenza/HIV-Inhibition der HIV-1-Neutralisierung. Resultate sind dargestellt als Reziproke der Serumverdünnung, die > 90% Reduktion der HIV- Titer nach Vorinkubation mit mAK 2F5 und 2G12 mit Kulturmedium (Mock), Influenza WSN oder Influenza/HIV ergibt. 2F5 ist der monoklonale Antikörper, der spezifisch für das differente Epitop auf gpl6o ist. Verbleibende HIV-Neutralisierungsaktivität wurde durch Inkubation von Verdünnungen der Antikörper/Virus- Mischung mit 10³ infektiösen Einheiten (TCID&sub5;&sub0;) von HIV-1 IIIB 1 h lang bei 37ºC bestimmt. Aliquote (100 µl) von Medium mit 10&sup4; C8166-Zeilen wurden hinzuge fligt und die Anwesenheit von Synzytien als Mass für die HIV-Infektion nach 48 h aufgezeichnet.
Abbildung 3b: Antikörpertiter. Je drei BALB/c-Mäuse wurden mit entweder 100 µg GST (K), 100 µg Fusionsprotein (F), 100 µg des "immunologischen Supermoleküls", 100 µg des rekombinanten antildiotypischen Antikörpers (rA) oder 4,0 log&sub1;&sub0; TCID&sub5;&sub0; des rekombinanten Influenza/HIV-Virus (V) immunisiert und nach 2 und 4 Wochen nachimmunisiert. Eine Woche nach der letzten Immunisierung wurden ELISA Antikörper bestimmt. Resultate sind als reziproke Werte, die signifikante positive Werte ergaben, angegeben. Der Grenzwert war der doppelte Wert eines normalen Mäuseserums. Als Antigen wurde rekombinantes gp41 verwendet. Reziproke Neutralisationstiter von HIV-1-Isolaten
Abbildung 3c: Neutralisation der HIV-1-Infektion. Neutralisationstiter wurden bestimmt, indem 10 µl eines hitzeinaktivierten Antiserums mit 40 µl Virusüberstand, der 10³ infektiöse Einheiten an HIV-1 enthält, 1 h lang bei 37ºC inkubiert wurden. Verbleibende HIV-1-Infektiosität wurde wie in Abbildung 3a beschrieben gemessen.
Abkürzungen: P ... Fusionspeptide. V ...schimärisches Influenza/HIV-Virus. SM ... "immunologisches Supermolekül". rA ... rekombinanter Antikörper. Reziproke Neutralisationstiter aller Kontrollen waren unter 10.
Abb.4: Inhibition der Neutralisation durch Peptide. Synthetische Peptide (PEP), Fusionspeptide (FP) und Glutathion-S-transferase (GST) wurden mit humak 2F5 oder 1B1 1h lang bei 37ºC vorinkubiert und danach ein Synzytien-Inhibitionsassay durchgeführt. Antikörperverdünnungen erfolgten in 2-fachen Schritten beginnend mit 5 µg/Vertiefung.
PEP, synthetisches Peptid ELDKWA (Peptid entsprechend der SEQ ID NO:1):
a 25 µg, b 5 µg pro Vertiefung;
FP, Fusionspeptid ELDKWA mit GST: a 25 µg, b 5 µg pro Vertiefung;
GST, Glutathion-S-transferase: a 25 µg, b 5 µg pro Vertiefung;
1B1, neutralisierender anti-gp120 humAk

Claims

1. Peptide, welche mit Antikörpern eine Bindung eingehen, die eine neutralisierende Aktivität gegenüber verschiedenen Stämmen und klinischen Isolaten von HIV-1 zeigen, und welche die durch HIV-l verursachte Zellfusion hemmen, dadurch gekennzeichnet, daß die Peptide gemäß einer der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 25 zusammengesetzt sind.

2. Peptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie genetisch durch die Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NO: 26 bis SEQ ID NO: 50 kodiert ist oder durch Sequenzen, welche durch Degeneration aus SEQ ID NO: 26 bis SEQ ID NO: 50 abgeleitet sind.

3. Peptide nach Anspruch 1 oder 2, welche bei Injektion in ein Säugetier, entweder alleine oder in Kombination mit einem Adjuvans, eine Immunreaktion verursachen, welche zur Erzeugung von HIV-1 neutralisierenden Antikörpern führt.

4. Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in Kombination mit einem Adjuvans, wobei das Adjuvans eine Substanz ist, an welche die Peptide durch chemische Wechselwirkung gebunden sind.

5. Peptide nach Anspruch 4, in Form von Fusionspeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß ein Protein oder ein Teil eines Proteins als Adjuvans benützt wird, an welches die Peptide durch Fusion der jeweiligen Nukleotidseguenzen und nachfolgende Expression der Fusionsgene in einem biologischen Expressionssystem gebunden sind.

6. Fusionspeptide nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Peptide gemäß einer der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 25 als Bindeglied oder als dessen Teil benutzt werden, um die variablen Domänen eines Fv-Fragmentes mit einziger Kette zu verbinden.

7. Fusionspeptide nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Peptide gemäß einer der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 25 einen oder mehrere Teile der Peptidsequenz eines monoklonalen Antikörpers substituieren.

8. Fusionspeptide nach den Ansprüchen 5 und 7, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Peptide gemäß einer der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 25 als Teil einer oder mehrerer hypervariabler Regionen eines monoklonalen Antikörpers ausgedrückt sind.

9. Fusionspeptide nach einem der Ansprüche 5, 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie entweder als Teil eines Fv- Fragmentes mit einziger Kette oder als Teil eines Fab-Fragmentes ausgedrückt oder chemisch oder enzymatisch synthetisiert sind.

10. Fusionspeptide nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß ein oder mehrere Peptide gemäß einer der SEQ ID NO: 1 bis SEQ ID NO: 25 einen oder mehrere Teile der Peptidsequenz eines viralen Proteins substituieren oder in antigene Stellen eines viralen Proteins eingesetzt sind.

11. Fusionspeptide nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß sie Teil eines Virus sind.

12. Fusionspeptide nach den Ansprüchen 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das virale Protein das Hämagglutinin oder die Neuraminidase eines Grippevirus ist.

13. Fusionspeptide nach den Ansprüchen 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das virale Protein das Oberflächenantigen oder das Kernantigen eines Hepatitis-B-Virus ist.

14. Verwendung von Peptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 5, zum Selektieren von mit HIV-l in vitro eine Bindung eingehenden Antikörpern oder Antikörperfragmenten

15. Verwendung von Peptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in einem immunologischen Test in vitro&sub1; um den Neutralisationstiter in den vollständigen Sera von Patienten oder von mit HIV-1 infizierten Versuchstieren zu bestimmen oder den Status einer Infektion zu bestimmen oder eine Prognose über den weiteren Fortschritt einer Infektion zu stellen.

16. Verwendung von Peptiden nach einem der Ansprüche 1 bis 5, zur Herstellung von antudiotypischen Antikörpern.

17. Vaccin gegen HIV-1, dadurch gekennzeichnet, daß es wenigstens ein Peptid und/oder Fusionspeptid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und/oder mindestens einen nach Anspruch 16 erhaltenen antudiotypischen Antikörper aufweist.