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DE69331832T2 - Diagnostische verfahren und pharmazeutische zusammensetzungen auf der basis von notch-proteinen und nukleinsäuren - Google Patents

Diagnostische verfahren und pharmazeutische zusammensetzungen auf der basis von notch-proteinen und nukleinsäuren

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Publication number
DE69331832T2
DE69331832T2 DE69331832T DE69331832T DE69331832T2 DE 69331832 T2 DE69331832 T2 DE 69331832T2 DE 69331832 T DE69331832 T DE 69331832T DE 69331832 T DE69331832 T DE 69331832T DE 69331832 T2 DE69331832 T2 DE 69331832T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
notch
protein
cell
delta
pharmaceutically acceptable
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69331832T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69331832D1 (de
DE69331832T3 (de
Inventor
Spyridon Artavanis-Tsakonas
Christine Marie Blaumueller
Richard Grant Fehon
Panayiotis Zagouras
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yale University
Original Assignee
Yale University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26769466&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=DE69331832(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Yale University filed Critical Yale University
Publication of DE69331832D1 publication Critical patent/DE69331832D1/de
Publication of DE69331832T2 publication Critical patent/DE69331832T2/de
Application granted granted Critical
Publication of DE69331832T3 publication Critical patent/DE69331832T3/de
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Expired - Lifetime legal-status Critical Current

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Description

    1. EINLEITUNG
  • Die Erfindung betrifft therapeutische Zusammensetzungen, die Notch-Proteine, Analoge und Derivate hiervon, Antikörper dagegen, Nukleinsäuren, die die Notch-Proteine, Derivate oder Analoge codieren, Notch-Antisinn-Nukleinsäuren enthalten. Therapeutische Anwendungen und Diagnoseverfahren sind ebenfalls bereitgestellt.
    • 2. HINTERGRUND DER ERFINDUNG 2. 1. DAS NOTCH-GEN UND -PROTEIN
  • Nullmutationen an einem der zygotischen neurogenen Loci -- Notch (N), Delta (DI), mastermind (mam), Enhancer of Split (E(spl)), neuralized (neu), und big brain (bib) -- bewirken eine Hypertrophie des Nervensystems auf Kosten der ventralen und lateralen epidermalen Strukturen. Dieser Effekt beruht auf der Fehlleitung von epidermalen Vorläuferzellen zu einer neuronalen Route und legt nahe, daß die neurogene Genfunktion zur Diversifizierung der Zellen in der neurogenen Region von einem neuronalen zu einem epithelialen Werdegang notwendig ist. Studien, die die Auswirkungen der Laserablation spezifischer embryonaler Neuroblasten bei Heuschrecken bewerteten (Doe und Goodman 1985, Dev. Biol. 111, 206-219), haben gezeigt, daß zelluläre Wechselwirkungen zwischen Neuroblasten und den umgebenden akzessorischen Zellen den Zweck haben, diese akzessorischen Zellen davon abzuhalten, einen Neuroblasten-Werdegang einzuschlagen. Zusammengenommen haben diese entwicklungsgenetischen Beobachtungen zu der Hypothese geführt, daß die Proteinprodukte der neurogenen Loci als Komponenten eines zellulären Interaktionsmechanismus wirken, der zur ordnungsgemäßen Entwicklung der Epidermis notwendig ist (Artavanis-Tsakonas, 1988, Trends Genet. 4, 95-100).
  • Sequenzanalysen (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108; Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735) haben gezeigt, daß zwei der neurogenen Loci, Notch und Delta, offensichtlich Transmembranproteine codieren, die sich einmal durch die Membran hindurch erstrecken. Das Drosophila-Notch-Gen codiert ein ca. 300 kd-Protein (wir verwenden "Notch" zur Bezeichnung dieses Proteins) mit einer großen N-terminalen extrazellulären Domäne, die 36 epidermale Wachstumsfaktor(EGF)-artige Sequenzwiederholungen in Tandemanordnung enthält, auf die drei weitere, cysteinreiche Sequenzwiederholungen folgen, die als Notch/lin-12-Sequenzwiederholungen bezeichnet werden (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6, 3094-3108; Yochem et al., 1988, Nature 335, 547-550). Die Sequenzen von Xenopus (Coffman et al., 1990, Science 249: 1438-1441) und einem menschlichen Notch-Homologen mit der Bezeichnung TAN-1 (Ellisen et al., 1991, Cell 66: 649-661) wurden ebenfalls beschrieben. Delta codiert ein ca. 100 kd-Protein (wir verwenden "Delta" zur Bezeichnung von DLZM), das Proteinprodukt der vorherrschenden zygotischen und materen Transkripte; Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735), das neun EGF-artige Sequenzwiederholungen in seiner extrazellulären Domäne aufweist (Vassin et al., 1987, EMBO J. 6, 3431-3440, Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735). Obwohl über die funktionelle Bedeutung dieser Sequenzwiederholungen wenig bekannt ist, wurde das EGF-artige Motiv bei einer Vielzahl von Proteinen gefunden, einschließlich derjenigen, die an der Blutgerinnungskaskade beteiligt sind (Furie und Furie, 1988, Cell 53, 505-518). Insbesondere wurde dieses Motiv in extrazellulären Proteinen nachgewiesen, wie in den Blutgerinnungsfaktoren IX und X (Rees et al., 1988, EMBO J. 7, 2053- 2061; Furie und Furie, 1988, Cell 53, 505-518), in weiteren Drosophila-Genen (Knust et al., 1987, EMBO J. 761-766; Rothberg et al., 1988, Cell 55, 1047-1059) und in einigen Zelloberflächen-Rezeptorproteinen, wie Thrombomodulin (Suzuki et al., 1987, EMBO J. 6, 1891-1897), und im LDL-Rezeptor (Sudhof et al., 1985, Science 228, 815-822). In Thrombomodulin und Urokinase wurde eine Proteinbindungsstelle der EGF-Sequenzwiederholungsdomäne zugeordnet (Kurosawa et al., 1988, J. Biol. Chem. 263, 5993-5996; Appella et al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 4437-4440).
  • Es wurde bereits eine interessante Reihe von Wechselwirkungen zwischen Notch- und Delta-Mutationen beschrieben (Vassin, et al., 1985, J. Neurogenet. 2, 291-308; Shepard et al., 1989, Genetics 122, 429-438; Xu et al., 1990, Genes Dev., 4, 464- 475). Eine Reihe genetischer Studien (Zusammenfassung bei Alton et. al., 1989, Dev. Genet. 10, 261-272) hat gezeigt, daß die Gen-Dosierungen von Notch und Delta in Relation zueinander für die normale Entwicklung wesentlich sind. Eine 50%ige Verminderung in der Dosis von Delta bei einem Notch-Wild-Typ- Hintergrund verursacht eine Verbreiterung der Flügelvenen unter Erzeugung eines "Delta" an der Basis (Lindsley and Grell, 1968, Veröffentlichungsnummer 627, Washington, D. C., Carnegie Institute of Washington). Ein ähnlicher Phänotyp kommt durch eine 50%ige Erhöhung der Dosis von Notch bei einem Delta- Wildtyp-Hintergrund zustande (ein "konfluenter" Phänotyp; Welshons, 1965, Science 150, 1122-1129). Dieser Delta- Phänotyp wird durch eine verminderte Notch-Dosis teilweise unterdrückt. Arbeiten haben gezeigt, daß letale Wechselwirkungen zwischen Allelen, die mit Änderungen in den EGF- artigen Sequenzwiederholungen in Notch korrelieren, durch Verminderung der Dosis von Delta verhindert werden können, (Xu et al., 1990, Genes Dev. 4, 464-475). Xu et al. (1990, Genes Dev. 4, 464-475) haben festgestellt, daß die als Abruptex-(Ax)-Mutationen bekannten Null-Mutationen entweder bei Delta oder bei mam die letalen Wechselwirkungen zwischen Heterozygoten-Kombinationen bestimmter Notch-Allele unterdrücken. Ax-Allele hängen mit Fehlsinn-Mutationen in den EGF- artigen Sequenzwiederholungen der extrazellulären Notch- Domäne zusammen (Kelley et al., 1987, Cell 51, 539-548; Hartley et al., 1987, EMBO J. 6, 3407-3417).
  • Neuere Studien haben gezeigt, daß Notch und Delta und Notch und Serrate direkt auf molekularem Niveau wechselwirken (Fehon et al., 1990, Cell 61: 523-534; Rebay et al., 1991, Cell 67: 687-699).
  • Notch wird in Axon-Prozessen während des Herauswachsens embryonaler Neuronen exprimiert (Johansen et al., 1989. J. Cell. Biol. 109: 2427-2440; Kidd et al., 1989, Genes Dev. 3: 1113-1129; Fehon et al., 1991, J. Cell. Biol. 113: 657-669).
  • Eine Studie hat gezeigt, daß bestimmte Ax-Allele von Notch die Axon-Wegfindung während des sensorischen neuronalen Herauswachsens in den Imaginalscheiben gravierend verändern können, obwohl es bisher noch nicht bekannt ist, ob eine anormale Notch-Expression im Axon selbst oder im Epithel, an dem es entlang wächst, für diesen Defekt verantwortlich ist (Palka et al., 1990, Development 109, 167-175).
    • 2. 2. KREBS
  • Ein Neoplasma oder Tumor ist eine neoplastische Masse, die von einem abnormen unkontrollierten Zellwachstum herrührt, das ein Anschwellen auf der Körperoberfläche verursachen und gutartig oder bösartig sein kann. Gutartige Tumore bleiben in der Regel lokal. Bösartige Tumore werden kollektiv als Krebs bezeichnet. Der Begriff "bösartig" bedeutet allgemein, daß der Tumor in benachbarte Körperstrukturen eindringen und sie zerstören kann und sich zu weit entfernten Stellen ausbreiten und zum Tode führen kann (ein Überblick findet sich bei Robbins und Angell, 1976, Basic Pathology, 2. Ausg., W. B. Saunders Co., Philadelphia, Ss. 68-122).
  • Eine wirksame Behandlung und Prävention von Krebs bleibt immer noch ein lang verspürtes Bedürfnis und ein Hauptziel der biomedizinischen Forschung.
    • 3. ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft therapeutische Anwendungen und diagnostische Verfahren und Zusammensetzungen auf der Basis von Notch-Proteinen und -Nukleinsäuren. Die Erfindung stellt eine Behandlung von Störungen des zellulären Werdegangs oder der Differenzierung durch Verabreichung einer therapeutischen erfindungsgemäßen Verbindung bereit. Solche therapeutischen Verbindungen (hier als "Therapeutika" bezeichnet) umfassen: Notch-Proteine und Analoge und Derivate (einschließlich von Fragmenten) hiervon; Antikörper dagegen; Nukleinsäuren, die die Notch-Proteine codieren, Analoge oder Derivate; und Notch-Antisinn-Nukleinsäuren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes Therapeutikum zur Behandlung eines kanzerösen Zustands oder zur Verhinderung der Progression eines präneoplastischen oder nicht bösartigen Zustands zu einem neoplastischen oder bösartigen Zustand verabreicht werden. Bei weiteren speziellen Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßes Therapeutikum zur Behandlung einer Nervensystemstörung oder zur beschleunigten Gewebsregenerierung und -reparatur verabreicht werden.
  • Bei einer Ausführungsform können Therapeutika, die die Notch- Funktion antagonisieren oder hemmen (im folgenden "antagonistische Therapeutika"), zur therapeutischen Wirkung verabreicht werden; Störungen, die somit behandelt werden können, können durch in vitro Tests, wie sie in Abschnitt 5.1, infra, beschrieben sind, identifiziert werden. Solche antagonistischen Therapeutika umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Notch-Antisinn-Nukleinsäuren, Anti-Notch-Neutralisationsantikörper und kompetitive Inhibitoren der Notch-Protein-Protein-Wechselwirkungen (z. B. ein Protein, das Notch- ELR-11 und -ELR-12 und Derivate hiervon enthält), wie nachstehend ausführlich beschrieben.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform können Therapeutika, die die Notch-Funktion unterstützen (hier "agonistische Therapeutika") zur therapeutischen Wirkung verabreicht werden. Störungen, die somit behandelt werden können, können durch in vitro Tests identifiziert werden, wie in Abschnitt 5.1, infra, beschrieben. Solche agonistischen Therapeutika umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Notch-Proteine und Derivate hiervon, die die intrazelluläre Domäne enthalten, und Proteine, die mit Notch wechselwirken.
  • Störungen des zellulären Werdegangs, insbesondere hyperproliferative (z. B. Krebs) oder hypoproliferative Störungen, die anormale oder unerwünschte Expressionsniveaus oder Aktivitätsniveaus des Notch-Proteins betreffen, können durch den Nachweis solcher Niveaus, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, diagnostiziert werden.
  • Nach einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung menschliche Notch-Proteine, insbesondere diejenigen, die vom hN-Homolog codiert werden, und Proteine, die die extrazelluläre Domäne des Proteins und Untersequenzen hiervon enthalten, und Nukleinsäuren, die die Vorgenannten codieren.
    • 3. 1. DEFINITIONEN
  • Wie hier verwendet, sollen die folgenden Begriffe die angegebenen Bedeutungen haben:
  • AA = Aminosäure
  • EGF = epidermaler Wachstumsfaktor
  • ELR = EGF-artige (homologe) Sequenzwiederholung
  • IC = intrazellulär
  • PCR = Polymerasekettenreaktion
  • Wie hier verwendet, bezeichnet die Unterstreichung des Namens eines Gens das Gen, im Gegensatz zu seinem codierten Protein- Produkt, das durch den Namen des Gens ohne Unterstreichung angegeben ist. Beispielsweise bedeutet "Notch" das Notch-Gen, wohin gegen "Notch" das Proteinprodukt des Notch-Gens bezeichnet.
    • 4. BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • Fig. 1: Primäre Nukleotidsequenz der Delta-cDNA-D11 (SEQ ID NO: 1) und der Delta-Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2). Gezeigt ist die DNA-Sequenz des 5'-3'-Strangs der D11-cDNA, die im Vergleich zu der bei Kopczynski et al. angegebenen (1988, Genes Dev. 2: 1723-1735) eine Reihe von Korrekturen enthält.
  • Fig. 2: Notch-Expressionskonstrukte und Deletionskartierung der Delta/Serrate-Bindungsdomäne. S2-Zellen im log-Phasenwachstum wurden vorübergehend mit der Reihe von gezeigten Expressionskonstrukten transfiziert; die Zeichnungen stellen die vorhergesagten Proteinprodukte der verschiedenen erzeugten Notch-Deletionsmutanten dar. Sämtliche Expressionskonstrukte stammten vom Konstrukt Nr. 1, pMtNMg. Die vorübergehend transfizierten Zellen wurden mit Delta-exprimierenden Zellen aus der stabil transformierten Linie L49-6-7 oder mit vorübergehend transfizierten Serrate-exprimierenden Zellen gemischt, mit CuSO&sub4; induziert, unter Aggregationsbedingungen inkubiert und sodann unter Verwendung spezieller Antiseren und unter Anwendung der Immunfluoreszenzmikroskopie auf ihre Aggregationsfähigkeit bewertet. Aggregate wurden als Cluster von vier oder mehr Zellen, die sowohl Notch- als auch Delta/Serrate-exprimierende Zellen enthalten, definiert. Die Werte, die für die Aggregation in % angegeben sind, beziehen sich auf den Prozentsatz sämtlicher Notch-exprimierender Zellen, die in solchen Clustern entweder mit Delta (Dl) (linke Spalte) oder mit Serrate (Ser) (rechte Spalte) festgestellt wurden. Die verschiedenen Notch-Deletionskonstrukte sind diagrammartig dargestellt, wobei die geknickten Linien die Ligationsverbindungsstellen angeben. Jede EGF-Sequenzwiederholung ist als schraffierte, rechteckige Umrahmung angegeben, und die Anzahl der EGF-Sequenzwiederholungen auf jeder Seite einer Ligationsverbindungsstelle ist angegeben. An den Ligationsverbindungsstellen sind partielle EGF-Sequenzwiederholungen, die durch die verschiedenen Deletionen erzeugt werden, mit offenen Rechtecken und geschlossenen Klammern bezeichnet (siehe beispielsweise Nr. 23 ΔCla + EGF(10-12)). Die Konstrukte Nr. 3-13 stellen die ClaI-Deletionsreihe dar. Wie diagrammartig angegeben, brechen 4 der ClaI-Stellen in den Sequenzwiederholungen 7, 9, 17 und 26 die Sequenzwiederholung in der Mitte unmittelbar nach dem dritten Cystein (bezeichnet durch die offene-Rechteck-Sequenzwiederholungen; siehe Fig. 3 zur weiteren Klärung), während die fünfte und am nächsten an 3' gelegene Stelle glatt zwischen der EGF-Sequenzwiederholung 30 und der EGF-Sequenzwiederholung 31 bricht (bezeichnet durch die geschlossene Rechteck-Sequenzwiederholung 31; siehe wiederum Fig. 3). Im gestückelten Konstrukt Nr. 15 ist die EGF-Sequenzwiederholung 14, die die gestückelte Punktmutation trägt, als gestreiftes Rechteck eingezeichnet. In Konstrukt Nr. 33 ΔCla + XEGF(10-13) sind die von Xenopus-Notch stammenden EGF-Sequenzwiederholungen von den Drosophila- Sequenzwiederholungen durch ein unterschiedliches Schraffurmuster unterschieden. SP, Signalpeptid; EGF, epidermale Wachstumsfaktor-Sequenzwiederholung; N, Notch/Lin-12-Sequenzwiederholung; TM, Transmembran-Domäne; cdc10, cdc10/Ankyrin- Sequenzwiederholung; PA, vermeintliche verwandte Nukleotidbindungssequenz; Opa, Polyglutamin-Verlängerung mit der Bezeichnung Opa; Dl, Delta; Ser, Serrate.
  • Fig. 3: Ausführliche Struktur der Notch-Deletionskonstrukte Nr. 19-24: Sowohl die EGF-Sequenzwiederholungen 11 als auch 12 sind für die Notch-Delta-Aggregation erforderlich. Die EGF-Sequenzwiederholungen 10-13 sind diagrammartig oben aufgeführt und zeigen den regulären Abstand der sechs Cysteinreste (C). Die für diese Konstrukte erzeugten PCR-Produkte (Name und Anzahl wie in Fig. 2 angegeben), sind durch die fetten schwarzen Balken dargestellt und die exakten Endpunkte sind relativ zu den verschiedenen EGF-Sequenzwiederholungen bezeichnet. Die Fähigkeit zur Aggregation mit Delta ist für jedes Konstrukt mit (+) oder (-) bezeichnet. Die PCR-Fragmente brechen die EGF-Sequenzwiederholungen entweder in der Mitte, unmittelbar nach dem dritten Cystein an der gleichen Stelle wie vier der fünf ClaI-Stellen oder genau zwischen zwei Sequenzwiederholungen an der gleichen Stelle wie die am meisten C-terminale ClaI-Stelle auf.
  • Fig. 4: Vergleich der Aminosäuresequenz der EGF-Sequenzwiederholungen 11 und 12 aus Drosophila- und Xenopus-Notch. Die Aminosäuresequenz der EGF-Sequenzwiederholungen 11 und 12 von Drosophila-Notch (SEQ ID NO: 14) (Wharton et al., 1985, Cell 43: 567-581; Kidd et al., 1986, Mol. Cell Biol. 6: 3094- 3108) ist mit derjenigen der gleichen zwei EGF-Sequenzwiederholungen aus Xenopus-Notch (SEQ ID NO: 15) (Coffman et al., 1990, Science 249: 1438-1441) ausgerichtet. Identische Aminosäuren sind eingerahmt. Die sechs konservierten Cysteinreste jeder EGF-Sequenzwiederholung und die verwandten Ca&spplus;&spplus;-bindenden Reste (Rees et al., 1988, EMBO J. 7: 2053-2061) sind mit einem Stern (*) markiert. Die Änderung von Leucin zu Prolin, die im Xenopus-PCR-Klon, der nicht zu aggregieren vermochte, festgestellt wird, ist darunter gekennzeichnet.
  • Fig. 5: Nukleinsäuresequenzhomologien zwischen Serrate und Delta. Gezeigt ist ein Teil der Drosophila-Serrate-Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 3), wobei die codierte Serrate-Proteinsequenz (SEQ ID NO: 4) darunter aufgeführt ist (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4: 2188-2201 und 2193-94). Die vier Bereiche, die die hohe Sequenzhomologie mit der Drosophila- Delta-Sequenz zeigen, sind über der Zeile nummeriert und durch Klammern bezeichnet. Die homologe Gesamtregion umspannt die Nukleotidnummern 627 bis 1290 der Serrate-Nukleotidsequenz (Nummerierung wie in Fig. 4 von Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4: 2188-2201).
  • Fig. 6: Schematisches Diagramm menschlicher Notch-Klone. Gezeigt ist ein schematisches Diagramm von menschlichen Notch-Klonen. Die schwarzen Balkenlinien unter dem Diagramm zeigen den Teil der Notch-Sequenz, der in jedem der vier cDNA-Klone enthalten ist. Die Lokation der bei der PCR verwendeten Primer und ihre Orientierung sind durch Pfeile angegeben.
  • Fig. 7: Menschliche Notch-Sequenzen, die mit der Drosophila- Notch-Sequenz ausgerichtet sind. Die nummerierten vertikalen Linien entsprechen den Drosophila-Notch-Koordinaten. Die horizontalen Linien unter jeder Karte zeigen, wo relativ zu Sequenzverlängerungen (dicke horizontale Linien) Klone liegen.
  • Fig. 8: Nukleotidsequenzen des menschlichem Notch, das im Plasmid-cDNA-Klon hN2k enthalten ist. Fig. 8A: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 5) eines Teils des menschlichen Notch-Insertionen, beginnend an der EcoRI-Stelle am 3'-Ende und weiter von 3' in Richtung 5'. Fig. 8B: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 6) eines Teils des menschlichen Notch-Insertionen, beginnend an der EcoRI-Stelle am 5'-Ende und weiter von 5' in Richtung 3'. Fig. 8C: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 7) eines Teils des menschlichen Notch-Insertionen, beginnend bei 3' der in Fig. 8B gezeigten Sequenz und weiter von 5' in Richtung 3'. Die gezeigten Sequenzen sind Versuche und bedürfen einer Bestätigung durch die Bestimmung der Überlappungssequenzen.
  • Fig. 9: Nukleotidsequenzen des menschlichen Notch, enthalten im Plasmid-cDNA-Klon hN4k. Fig. 9A: Gezeigt ist die DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 8) eines Teils des menschlichen Notch- Insertionen, beginnend an der EcoRI-Stelle am 5'-Ende und weiter von 5' in Richtung 3'. Fig. 9B: Gezeigt ist die DNA- Sequenz (SEQ ID NO: 9) eines Teils der menschlichen Notch- Insertionen, beginnend nahe am 3'-Ende und weiter von 3' in Richtung 5'. Die gezeigten Sequenzen stellen Versuche dar und bedürfen einer Bestätigung durch die Bestimmung der Überlappungssequenzen.
  • Fig. 10: DNA(SEQ ID NO: 10)- und Aminosäure(SEQ ID NO: 11)- Sequenzen des menschlichen Notch, die im Plasmid-cDNA-Klon hN3k enthalten sind.
  • Fig. 11: DNA(SEQ ID NO: 12)- und Aminosäure(SEQ ID NO: 13)- Sequenzen des menschlichen Notch, die im Plasmid-cDNA-Klon hN5k enthalten sind.
  • Fig. 12: Vergleich von hN5k mit anderen Notch-Homologen.
  • Fig. 12A: Schematische Darstellung von Drosophila-Notch. Angegeben sind die Signalsequenz (Signal), die 36 EGF-artigen Sequenzwiederholungen, die 3 Notch/lin-12-Sequenzwiederholungen, die Transmembrandomäne (TM), die 6 CDC10-Sequenzwiederholungen, die OPA-Sequenzwiederholung und die PEST- (Prolin, Glutaminsäure, Serin, Threonin)-reiche Region. Fig. 12B: Ausrichtung der abgeleiteten Aminosäuresequenz von hN5k mit Sequenzen anderer Notch-Homologe. Die Aminosäuren sind links nummeriert. Die cdc10- und PEST-reichen Regionen sind beide eingerahmt, und die einzelnen cdc10-Sequenzwiederholungen sind markiert. Aminosäuren, die in drei oder mehr Sequenzen identisch sind, sind gekennzeichnet. Die zur Klonierung von hN5k verwendeten Primer sind unter den Sequenzen, aus denen sie konstruiert wurden, angegeben. Die Kern- Lokalisierungssequenz (NLS), die Caseinkinase II(CKII)- und cdc2-Kinase(cdc2)-Stellen des vermeintlichen CcN-Motivs der Vertebraten-Notch-Homologe sind eingerahmt. Die mögliche zweiteilige Kern-Zielsequenz (BNTS) und die proximalen Phosphorylierungsstellen von Drosophila-Notch sind ebenfalls eingerahmt.
  • Fig. 13: Ausgerichtete Aminosäuresequenzen der Notch- Proteine verschiedener Spezies. humN: Das menschliche Notch- Protein, das von dem hN-Homologen (teilweise im Plasmid hN5k enthalten) (SEQ ID NO: 19) codiert wird. TAN-1: Das menschliche Notch-Protein, das von dem TAN-1-Homologen (SEQ ID NO: 20) (die gezeigte Sequenz entstammt zum Teil unserer Arbeit und zum Teil der TAN-1-Sequenz, wie von Ellisen et al., 1991, Cell 66: 649-661 veröffentlicht) codiert wird; Xen N: Xenopus- Notch-Protein (Coffman et al., 1990, Science 249: 1438-1441). Dros N: Drosophila-Notch-Protein (Wharton et al., 1985, Cell 43: 567-581). Die Strukturdomänen sind angegeben.
  • Fig. 14: Immunozytochemische Anfärbung von Brustkrebsgewebe eines menschlichen Patienten. Bösartiges Brustgewebe, das aus einer Probe eines menschlichen Patienten erhalten wurde, wurde in einen Paraffinschnitt eingebettet und einer immunozytochemischen Anfärbung mit dem monoklonalen Antihuman-Notch- Antikörper P4, der gegen das TAN-1-Protein gerichtet ist, unterzogen. Nicht bösartiges Brustgewebe zeigte eine viel geringere Färbung (nicht gezeigt).
  • Fig. 15: Immunozytochemische Anfärbung von Darmgewebe aus einem menschlichen Patienten mit Darmkrebs. Eine aus einem Patienten mit Darmkrebs erhaltene Darmgewebsprobe wurde in einen Paraffinschnitt eingebettet und einer immunozytochemischen Anfärbung mit dem monoklonalen Antihuman-Notch-Antikörper P1, der gegen das hN-codierte Protein gerichtet ist, unterzogen. Die Bereiche einer verstärkten Anfärbung sind die Bereiche, in denen die bösartigen Zellen vorhanden sind, wie bestimmt durch Zellmorphologie.
  • Fig. 16: Immunozytochemische Anfärbung von Zervikalgewebe. Menschliche Gewebeproben, die Zervikalkrebs (Fig. 16A) oder gesundes Zervikalepithel (Fig. 16B) enthielten, wurden vom gleichen Patienten erhalten, in einen Paraffinschnitt eingebettet und der immunozytochemischen Anfärbung mit monoklonalem Antihuman-Notch-Antikörper, der gegen das TAN-1-Protein gerichtet ist, unterzogen. Die Bereiche, die bösartige Zellen enthielten (morphologisch bestimmt), zeigten relativ zu nicht bösartigen Zellen eine verstärkte Anfärbung. Von den nicht bösartigen Zellen färben sich das Bindegewebe und die Basalschicht des Epithels (das Stammzellen enthält), mit dem Anti- Notch-Antikörper.
  • Fig. 17: Die DNA (SEQ ID NO: 21) und die codierte Aminosäuresequenz (enthalten in SEQ ID NO: 19) des menschlichen Notch-Homologen hN. Die gesamte DNA-codierende Sequenz (sowie eine nicht codierende Sequenz) ausschließlich derjenigen, die das Starter-Met codiert, ist dargestellt. Die letzten 8 Nukleotide, die gezeigt sind (Nummern 9716-9723), sind Vektor- und keine hN-Sequenzen.
    • 5. AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung betrifft therapeutische Anwendungen und diagnostische Verfahren und Zusammensetzungen auf der Basis von Notch-Proteinen und -Nukleinsäuren. Die Erfindung stellt die Behandlung von Störungen des zellulären Werdegangs oder der zellulären Differenzierung durch Verabreichung einer erfindungsgemäßen therapeutischen Verbindung bereit. Solche therapeutischen Verbindungen (hier als "Therapeutika" bezeichnet) umfassen: Notch-Proteine und Analoge und Derivate (einschließlich von Fragmenten) hiervon; Antikörper dagegen; Nukleinsäuren, die die Notch-Proteine, Annaloge oder Derivate codieren; und Notch-Antisinn-Nukleinsäuren. Ebenfalls eingeschlossen sind Proteine und Derivate und Analoge hiervon, die in der Lage sind, die Wechselwirkungen eines Notch-Proteins mit einem anderen toporhythmischen Protein zu hemmen. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes Therapeutikum zur Behandlung eines kanzerösen Zustands oder zur Verhinderung des Fortschreitens eines präneoplastischen oder nicht bösartigen Zustands (z. B. metaplastischer Zustand) zu einem neoplastischen oder bösartigen Zustand verabreicht werden. Bei einer weiteren speziellen Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes Therapeutikum zur Behandlung einer nervösen systemischen Störung, wie eine Nervenverletzung, oder einer degenerativen Erkrankung verabreicht werden. Bei noch einer weiteren speziellen Ausführungsform kann ein erfindungsgemäßes Therapeutikum zur beschleunigten Geweberegenerierung und Reparatur, zur Behandlung verschiedener Zustände verabreicht werden.
  • Bei einer Ausführungsform können Therapeutika, die die Notch- Funktion antagonisieren oder hemmen (im folgenden "antagonistische Therapeutika"), zur therapeutischen Wirkung verabreicht werden; Störungen, die so behandelt werden können, können durch in vitro Tests, wie sie in Abschnitt 5.1, nachstehend, beschrieben sind, identifiziert werden. Solche antagonistischen Therapeutika umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Notch-Antisinn-Nukleinsäuren, Anti-Notch- Neutralisationsantikörper, kompetitive Inhibitoren der Notch- Protein-Protein-Wechselwirkungen (z. B. ein Protein, das Notch-ELR-11 und Notch-ELR-12 enthält) und Moleküle, die eine intrazelluläre Notch-Funktion, wie diejenige, die durch die cdc10-Sequenzwiederholungen vermittelt wird, wie nachstehend ausführlich beschrieben, beeinflussen.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform können Therapeutika, die die Notch-Funktion beschleunigen (im folgenden "agonistische Therapeutika" genannt), zur therapeutischen Wirkung verabreicht werden; Störungen, die so behandelt werden können, können durch in vitro Tests, wie in Abschnitt 5.1, nachstehend, beschrieben, identifiziert werden. Solche agonistischen Therapeutika umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Notch-Proteine und Derivate hiervon, die die intrazelluläre Domäne enthalten, Notch-Nukleinsäuren, die die Vorgenannten codieren.
  • Störungen des zellulären Werdegangs, insbesondere präkanzeröse Zustände, wie Metaplasie und Dysplasie, und hyperproliferative (z. B. Krebs) oder hypoproliferative Störungen, an denen anormale oder unerwünschte Expressions- oder Aktivitätsniveaus des Notch-Proteins beteiligt sind, können, wie nachstehend ausführlicher beschrieben, durch den Nachweis solcher Niveaus diagnostiziert werden.
  • Nach einem bevorzugten Aspekt ist ein erfindungsgemäßes Therapeutikum ein Protein, bestehend aus mindestens einem Fragment (im folgenden hier als "Adhäsionsfragment" bezeichnet) der Proteine, die von toporhythmischen Genen codiert werden, das die Bindung an Notch-Proteine oder Adhäsionsfragmente hiervon vermittelt. Toporhythmische Gene, wie hier verwendet, sollen Notch-Gene bedeuten.
  • Die Erfindung stellt ferner Anwendungen, pharmazeutische Zusammensetzungen oder die Herstellung eines Medikaments aus einem menschlichen Notch-Protein, das von dem hN-Homolog codiert wird, und Proteinen, die die extrazelluläre Domäne des Notch-Proteins und Untersequenzen hiervon enthalten, bereit. Nukleinsäuren, die die Vorgenannten codieren, und rekombinante Zellen sind ebenfalls bereitgestellt.
  • Zur Klarheit der Offenbarung und nicht zur Einschränkung ist die ausführliche Beschreibung der Erfindung in die folgenden Unterabschnitte eingeteilt:
  • (i) Therapeutische Anwendungen;
  • (ii) Prophylaktische Anwendungen;
  • (iii) Demonstration der therapeutischen oder prophylaktischen Brauchbarkeit;
  • (iv) Therapeutische/prophylaktische Verabreichung und Zusammensetzungen;
  • (v) Antisinn-Regulierung der Notch-Expression;
  • (vi) Diagnostische Brauchbarkeit;
  • (vii) Notch-Nukleinsäuren;
  • (viii) Rekombinationsproduktion von Protein-Therapeutika;
  • (ix) Derivate und Analoge von Notch- und anderen toporhythmischen Proteinen;
  • (x) Tests auf Notch-Proteine, -Derivate und -Analoge;
  • und
  • (xi) Antikörper gegen Notch-Proteine, -Derivate und - Analoge.
    • 5. 1. THERAPEUTISCHE ANWENDUNGEN
  • Wie oben angegeben, sind die antagonistischen erfindungsgemäßen Therapeutika, diejenigen Therapeutika, die eine Notch- Funktion antagonisieren oder hemmen. Solche antagonistischen Therapeutika werden besonders bevorzugt unter Anwendung bekannter zweckmäßiger in vitro Tests identifiziert, z. B. auf der Basis ihrer Fähigkeit zur Hemmung der Bindung von Notch- oder anderen Proteinen (siehe Abschnitte 6-8 hier), oder zur Hemmung einer beliebigen bekannten Notch-Funktion, wie in vitro getestet; obwohl auch Gentests (z. B. mit Drosophila) eingesetzt werden können. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das antagonistische Therapeutikum ein Protein oder ein Derivat hiervon, das ein funktionell aktives Fragment, wie ein Adhäsionsfragment von Notch, enthält. Bei speziellen Ausführungsformen kann ein solches antagonistisches Therapeutikum diejenigen Adhäsionsproteine, die von den entsprechenden, in den Abschnitten 6 und 7 nachstehend beschriebenen Konstrukten codiert werden, oder Proteine, die die extrazelluläre Notch-Region enthalten, insbesondere ELR-11 und ERL- 12, oder ein Antikörper hierfür, oder ein analoger/kompetitiver Inhibitor einer intrazellulären Signal-transduzierenden Notch-Region, eine Nukleinsäure, die zur Expression eines Notch-Adhäsionsfragments in der Lage ist, oder eine Notch- Antisinn-Nukleinsäure (siehe Abschnitt 5.5 hier) sein. Es sollte angemerkt werden, daß in bestimmten Fällen ein Notch- Adhäsionsfragment (oder möglicherweise weitere vermutete antagonistische Therapeutika) alternativ als antagonistisches Therapeutikum, je nach Entwicklungsgeschichte des Gewebes, das dem Therapeutikum ausgesetzt ist, wirken kann; vorzugsweise sollten geeignete in vitro oder in vivo Tests, wie nachstehend beschrieben, angewandt werden, um die Wirkung eines bestimmten Therapeutikums und ob seine Verabreichung zur Behandlung des betroffenen Gewebes indiziert ist, zu bestimmen.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird eine Nukleinsäure, die ein Teil eines Notch-Gens enthält, als antagonistisches Therapeutikum zur Beschleunigung der Notch- Inaktivierung durch homologe Rekombination verwendet (Kollen und Smithies, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 8932-8935; Zijlstra et al., 1989, Nature 342: 435-438).
  • Die erfindungsgemäßen antagonistischen Therapeutika, wie vorstehend beschrieben, beschleunigen die Notch-Funktion.
  • Weitere Beschreibungen und Quellen für die erfindungsgemäßen Therapeutika werden hier in den Abschnitten 5.4 bis 5.8 gefunden.
  • Die erfindungsgemäßen agonistischen und antagonistischen Therapeutika besitzen therapeutische Anwendbarkeit gegen Störungen des zellulären Werdegangs. Die antagonistischen Therapeutika können therapeutisch (einschließlich prophylaktisch) verabreicht werden: (1) bei Krankheiten oder Störungen, die ein Fehlen oder eine Abnahme des Niveaus der Notch-Funktion (relativ zum normalen oder gewünschten Niveau) betreffen, beispielsweise bei Patienten, bei denen das Notch-Protein fehlt, genetisch defekt, biologisch inaktiv oder wenig aktiv oder unterexprimiert ist; und (2) bei Krankheiten oder Störungen, wobei die Brauchbarkeit der Notch-Agonisten-Verabreichung durch in vitro (oder in vivo) Tests (siehe nachstehend) angezeigt wird. Fehlende oder verminderte Niveaus der Notch-Funktion können leicht nachgewiesen werden, z. B. durch Erhalt einer Patienten-Gewebeprobe (z. B. aus Biopsiegewebe) und durch ihr Testen in vitro auf Proteinkonzentrationen, Struktur und/oder Aktivität des exprimierten Notch-Proteins. Es können somit viele technische Standardverfahren angewandt werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Immuntests zum Nachweis und/oder zur Visualisierung des Notch- Proteins (z. B. Western-Blots, Immunfällung und anschließende Natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgelelektrophorese, Immunozytochemie etc.; siehe auch die in Abschnitt 5.6 nachstehend aufgeführten Tests) und/oder Hybridisierungstests zum Nachweise der Notch-Expression durch Nachweis und/oder Visualisierung von Notch-mRNA (z. B. Northern-Tests, Dotblots, in situ Hybridisierung etc.).
  • In vitro Tests, die verwendet werden können, um zu bestimmen, ob die Verabreichung eines speziellen agonistischen oder antagonistischen Therapeutikums angezeigt ist, umfassen in vitro Zellkulturtests, wobei eine Patienten-Gewebeprobe in Kultur gezüchtet und einem Therapeutikum ausgesetzt wird, oder an die ein Therapeutikum anderweitig verabreicht, und die Wirkung eines solchen Therapeutikums auf die Gewebeprobe festgestellt wird. Bei einer Ausführungsform, wobei der Patient eine Bösartigkeit aufweist, wird eine Probe von Zellen einer solchen Bösartigkeit in Kultur ausplattiert oder gezüchtet, und die Zellen werden anschließend einem Therapeutikum ausgesetzt. Ein Therapeutikum, das das Überleben oder Wachstum der bösartigen Zellen hemmt (z. B. durch Beschleunigung der terminalen Differenzierung), wird zur therapeutischen Verwendung in vivo gewählt. Viele Standardtests der Technik können zur Bewertung eines solchen Überlebens und/oder Wachstums verwendet werden; beispielsweise kann die Zellproliferation durch Messen des ³H-Thymidineinbaus, durch direkte Zellzählung, durch Nachweis von Änderungen der transkriptionalen Aktivität bekannter Gene, wie Proto- Onkogene (z. B. fos, myc) oder durch Zellzyklus-Marker geprüft werden; die Zell-Überlebensfähigkeit kann durch Trypanblau- Anfärbung geprüft werden, die Differenzierung kann visuell auf der Basis von Änderungen in der Morphologie etc. geprüft werden. Bei einem bestimmten Aspekt werden die bösartigen Zellkulturen getrennt (1) einem agonistischen Therapeutikum und (2) einem antagonistischen Therapeutikum ausgesetzt; das Ergebnis des Tests kann anzeigen, welcher Typ von Therapeutikum therapeutisch wirksam ist.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform ist ein Therapeutikum zur Verwendung indiziert, das die gewünschte Wirkung zeigt, die Hemmung oder Beschleunigung des Zellwachstums in einer Patienten-Zellprobe aus Gewebe mit einer hyper- bzw. hypoproliferativen Störung bzw. mit einer vermuteten hyper- bzw. hypoproliferativen Störung. Solche hyper- oder hypoproliferativen Störungen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die in den Abschnitten 5.1.1 bis 5.1.3 nachstehend beschrieben sind.
  • Bei einer weiteren speziellen Ausführungsform ist ein Therapeutikum zur Verwendung bei der Behandlung von Nervenverletzungen oder einer Nervensystem-Degenerationsstörung indiziert (siehe Abschnitt 5.1.2), das in vitro eine beschleunigte Nerven-Regenerierung/Neuriten-Extension aus Nervenzellen des betroffenen Patiententyps zeigt.
  • Zusätzlich ist auch die Verabreichung eines erfindungsgemäßen antagonistischen Therapeutikums bei Krankheiten oder Störungen indiziert, von denen bestimmt wurde oder von denen bekannt ist, daß an ihnen ein aktiv-dominanter Notch-Phänotyp ("Funktionsgewinn"-Mutationen) beteiligt ist. Die Verabreichung eines agonistischen Therapeutikums ist bei Krankheiten oder Störungen indiziert, von denen bestimmt wurde oder von denen bekannt ist, daß an ihnen ein negativ-dominanter Notch- Phänotyp beteiligt ist ("Funktionsverlust"-Mutationen). Wir haben die Funktionen verschiedener struktureller Domänen des Notch-Proteins in vivo durch epitope Expression einer Reihe von Drosophila-Notch-Deletionsmutanten unter dem hsp70- Hitzeschock-Promotor sowie unter visuell-spezifische Promotoren erforscht. Es wurden zwei Klassen von dominanten Phänotypen festgestellt, wovon eine für die Notch-Funktionsverlust- Mutationen und die andere für die Notch-Funktionsgewinn- Mutationen naheliegend sind. "Aktiv"-dominante Phänotypen beruhen auf der Überexpression eines Proteins, dem die meisten extrazellulären Sequenzen fehlen, während "negativ"-dominante Phänotypen auf der Überexpression eines Proteins, dem die meisten intrazellulären Sequenzen fehlen, beruhen. Weitere Ergebnisse zeigen, daß Notch als Rezeptor fungiert, dessen extrazelluläre Domäne Ligandenbindung vermittelt, die die Weiterleitung von Entwicklungssignalen durch die cytoplasmatische Domäne bewirken. Die beobachteten Phänotypen legten auch nahe, daß die cdc10/Ankyrin-Sequenzwiederholungsregion in der intrazellulären Domäne bei den Notch-vermittelten Signaltransduktionsereignissen eine essentielle Rolle spielt (intrazelluläre Funktion).
  • Bei verschieden speziellen Ausführungsformen können in vitro Tests mit repräsentativen Zellen von Zelltypen, die an einer Störung im Patienten beteiligt sind, durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob ein Therapeutikum eine gewünschte Wirkung auf solche Zelltypen ausübt.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform werden auch Zellen aus Patienten-Gewebeproben, die vermutlich präneoplastisch sind, ausplattiert oder in vitro wachsen gelassen und einem Therapeutikum ausgesetzt. Das Therapeutikum, das einen Zellphänotyp bewirkt, der normaler (das heißt, weniger repräsentativ für einen präneoplastischen Zustand, einen neoplastischen Zustand, einen bösartigen Zustand oder einen transformierten Phänotyp) ist, wird zur therapeutischen Verwendung gewählt. Es können viele Standardtests aus der Technik angewandt werden, um zu bewerten, ob ein präneoplastischer Zustand, ein neoplastischer Zustand oder eine transformierter oder bösartiger Phänotyp vorliegt (siehe Abschnitt 5.2.1). Beispielsweise umfassen die Merkmale, die mit einem transformierten Phänotyp (eine Reihe von in vitro Merkmalen, die in vivo mit einer Tumor-erzeugenden Fähigkeit zusammenhängen) zusammenhängen, eine eher rundliche Zellmorphologie, eine losere Substrat-Haftung, einen Verlust an Kontakthemmung, einen Verlust an Verankerungsabhängigkeit, eine Freisetzung von Proteasen, wie von Plasminogenaktivator, einen erhöhten Zuckertransport, eine vermindertes Serum-Erfordernis, eine Expression von fetalen Antigenen, ein Verschwinden des 250000 Dalton-Oberflächenproteins etc. (sich Luria et al., 1978, Genral Virology, 3. Ausg., John Wiley & Sons, New York, Ss. 436-446).
  • Bei weiteren speziellen Ausführungsformen können die vorstehend beschriebenen in vitro Tests unter Verwendung einer Zellinie statt einer Zellprobe durchgeführt werden, die sich von dem speziellen, zu behandelnden Patienten ableitet, wobei die Zellinie auf Merkmal(en) beruht oder aufweist, die mit der bösartigen neoplastischen oder präneoplastischen Störung zusammenhängen, deren Behandlung oder Prävention gewünscht ist, oder sie stammt vom neutralen Zelltyp oder einem anderen Zelltyp, auf den erfindungsgemäß eine Wirkung erwünscht ist.
  • Die antagonistischen Therapeutika können therapeutisch (einschließlich prophylaktisch) verabreicht werden: (1) bei Krankheiten oder Störungen, die erhöhte (relativ zu normalen oder erwünschten) Niveaus der Notch-Funktion aufweisen, beispielsweise wobei das Notch-Protein überexprimiert oder überaktiv ist; und (2) bei Krankheiten oder Störungen, wobei in vitro (oder in vivo) Tests die Anwendbarkeit einer Notch- Antagonisten-Verabreichung anzeigen. Die erhöhten Niveaus der Notch-Funktion können leicht durch Methoden, wie durch diejenigen, die vorstehend beschrieben sind, durch Quantifizierung von Protein und/oder RNA nachgewiesen werden. In vitro Tests mit Zellen aus Patienten-Gewebeproben oder mit der entsprechenden Zellinie oder mit dem entsprechenden Zelltyp zur Bestimmung der therapeutischen Brauchbarkeit können wie vorstehend beschrieben durchgeführt werden.
    • 5.1.1 BÖSARTIGKEITEN
  • Bösartige und präneoplastische Zustände, die wie vorstehend beschrieben auf die Wirksamkeit eines Eingreifens mit Hilfe eines Antagonisten- oder Agonisten-Therapeutika getestet und beim Feststellen eines Anzeichens für therapeutische Anwendbarkeit behandelt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die nachstehend in den Abschnitten 5.1.1 und 5.2.1 beschrieben sind.
  • Bösartigkeiten und damit zusammenhängende Störungen, Zellen, deren Typ in vitro (und/oder in vivo) getestet werden kann und die bei Feststellung des entsprechenden Testergebnisses erfindungsgemäß behandelt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die in Tabelle 1 aufgeführt sind (eine Übersicht über solche Störungen findet sich bei Fishman et al., 1985, Medicine, 2. Ausg., J. B. Lippincott Co., Philadelphia):
    • TABELLE 1 BÖSARTIGKEITEN UND DAMIT ZUSAMMENHÄNGENDE STÖRUNGEN
  • Leukämie
  • akute Leukämie
  • akute lymphozytäre Leukämie
  • akute myelozytäre Leukämie
  • Myeloblastenleulämie
  • Promyelozytenleukämie
  • myelomonozytäre Leukämie
  • Monozytenleukämie
  • Erythroleukämie
  • chronische Leukämie
  • chronische myelozytäre (granulozytäre)
  • Leukämie
  • chronische lymphozytäre Leukämie
  • Polycythaemia vera
  • Lymphonom
  • Morbus Hodgkin
  • Non-Morbus Hodgkin
  • multiples Myelom
  • Waldenström Makroglobulinämie
  • Schwerkettenkrankheit
  • solide Tumore
  • Sarcome und Karzinome
  • Fibrosarcom
  • Myxosarcom
  • Liposarcom
  • Chondrosarcom
  • Osteogenes Sarcom
  • Chordom
  • Angiosarcom
  • Endothelsarcom
  • Lymphangiosarcom
  • Lymphangioendothelsarcom
  • Synoviom
  • Mesotheliom
  • Ewing Tumor
  • Leiomyosarcom
  • Rhabdomyosarcom
  • Darmkarzinom
  • Pankreaskrebs
  • Brustkrebs
  • Eierstockkrebs
  • Prostatakrebs
  • Plattenepithelkarzinom
  • Basalzellenkarzinom
  • Adenokarzinom
  • Schweißdrüsenkarzinom
  • Talgdrüsenkarzinom
  • Papillenkarzinom
  • Papillenadenokarzinome
  • Zystadenokarzinom
  • Medullokarzinom
  • bronchiogenes Karzinom
  • Nierenzellkarzinom
  • Hepatom
  • Gallengangkarzinom
  • Chorionkarzinom
  • Seminom
  • Embryonalkarzinom
  • Willms Tumor
  • Zervikalkrebs
  • Hodentumor
  • Lungenkarzinom
  • kleinzelliges Karzinom
  • Blasenkarzinom
  • Epithelialkarzinom
  • Gliom
  • Astrozytom
  • Medulloblastom
  • Kraniopharyngiom
  • Ependymom
  • Pinealom
  • Hämangioblastom
  • akustisches Neurom
  • Oligodendrogliom
  • Menangiom
  • Melanom
  • Neuroblastom
  • Retinoblastom
  • Bei speziellen Ausführungsformen werden die Bösartigkeit oder dysproliferative Änderungen (wie Metaplasie und Dysplasie) in Epithelgeweben, wie die Gewebe in Zervix, Ösophagus und in der Lunge, behandelt oder präventiv behandelt.
  • Wie in den Beispielen im Abschnitt 10.1 nachstehend ausgeführt, zeigten die Bösartigkeiten von Brust, Darm und Zervix eine erhöhte Expression des menschlichen Notch relativ zu einem solchen nicht bösartigen Gewebe. Somit werden bei speziellen Ausführungsformen Bösartigkeiten von Brust, Darm oder Zervix durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen antagonistischen Therapeutikums behandelt oder vorgebeugt. Das Vorliegen einer erhöhten Notch-Expression bei Brust, Darm und Zervikalkrebs legt nahe, daß viel mehr kanzeröse Zustände überreguliertes Notch aufweisen. Somit sind wir davon ausgegangen, daß viel mehr Krebsarten, z. B. Seminom, Melanom und Lungenkrebs, durch Verabreichung eines antagonistischen Therapeutikums behandelt oder vorgebeugt werden können.
    • 5.1.2 NERVENSYSTEMSTÖRUNGEN
  • Nervensystemstörungen, die Zelltypen betreffen, die wie vorstehend beschrieben auf ein wirksames Eingreifen antagonistischer oder agonistischer Therapeutika getestet werden können und die dann bei Beobachtung eines Anzeichens für eine therapeutischen Brauchbarkeit behandelt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Nervensystem-Verletzungen und Krankheiten oder Störungen, die entweder zu einer Axon- Verbindungsunterbrechung, einer Verminderung oder Degenerierung von Neuronen oder zu einer Demyelierung führen. Nervensystem-Läsionen, die bei einem Patienten (einschließlich einem menschlichen und nicht menschlichen Säugerpatienten) erfindungsgemäß behandelt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die folgenden Läsionen entweder des zentralen (einschließlich Rückenmark, Gehirn) oder peripheren Nervensystems:
  • (i) traumatische Läsionen, einschließlich Läsionen auf Grund physikalischer Verletzungen oder Läsionen in Verbindung mit einem chirurgischen Eingriff, beispielsweise Läsionen, die einen Teil des Nervensystems durchtrennen, oder Kompressionsläsionen;
  • (ii) ischämische Läsionen, wobei ein Sauerstoffmangel in einem Teil des Nervensystems zu einer neuronalen Verletzung oder Absterben führt, einschließlich Zerebralinfarkt oder -ischämie oder Rückenmarksinfarkt oder -ischämie;
  • (iii) bösartige Läsionen, wobei ein Teil des Nervensystems durch bösartiges Gewebe zerstört oder verletzt ist, das entweder eine mit dem Nervensystem verbundene Bösartigkeit oder eine Bösartigkeit ist, die von einem Nichtnervensystemgewebe herrührt;
  • (iv) infektiöse Verletzungen, wobei ein Teil des Nervensystems als Ergebnis einer Infektion, beispielsweise durch einen Abszeß oder bedingt durch eine Infektion mit dem Humanimmundefizienz-Virus, Herpeszoster- oder Herpessimplex-Virus oder mit der Lyme- Krankheit, Tuberkulose, Syphilis zerstört oder verletzt wird;
  • (v) degenerative Läsionen, wobei ein Teil des Nervensystems als Ergebnis eines degenerativen Prozesses, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Degenerierung durch Parkinson Krankheit, Alzheimer Krankheit, Huntington Chorea oder amyotrophe Lateralsklerose, zerstört oder verletzt wird;
  • (vi) Läsionen auf Grund von Ernährungskrankheiten oder -störungen, wobei ein Teil des Nervensystems durch Ernährungsstörungen oder Störungen des Metabolismus, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Vitamin B12-Mangel, Folsäuremangel, Wernicke Krankheit, Tabak-Alkohol-Amblyopie, Marchiafava-Bignami- Krankheit (Primärdegeneration des Corpus callosum) und alkoholische Zerebellum-Degenerierung, zerstört oder verletzt wird;
  • (vii) Neurologische Läsionen auf Grund von systemischen Krankheiten, einschließlich Diabetes (diabetische Neuropathie, Bellsche Lähmung), systemischer Lupus erythematodes, Karzinom oder Sarkoidose, jedoch nicht darauf beschränkt;
  • (viii) Läsionen auf Grund von toxischen Substanzen, einschließlich Alkohol, Blei oder bestimmter Neurotoxine; und
  • (ix) Demyelinierungsläsionen, wobei ein Teil des Nervensystems durch eine demyelierende Krankheit zerstört oder verletzt wird, einschließlich Multipler Sklerose, Humanimmundefizienzvirus-bedingter Myelopathie, transverser Myelopathie oder verschiedener Ethiologien, progressiver multifokaler Leukoenzephalopathie und Zentralbrücken-Myelinolyse, jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Therapeutika, die erfindungsgemäß zur Behandlung einer Nervensystemstörung geeignet sind, können durch Testen der biologischen Wirksamkeit im Hinblick auf die Unterstützung des Überlebens oder der Differenzierung von Neuronen ausgewählt werden (siehe auch Abschnitt 5.1), beispielsweise, jedoch nicht einschränkend, können Therapeutika, die eine der folgenden Wirkungen hervorrufen, erfindungsgemäß geeignet sein:
  • (i) erhöhte Überlebensdauer von Neuronen in Kultur;
  • (ii) erhöhtes Sprießen von Neuronen in Kultur oder in vivo;
  • (iii) erhöhte Produktion eines Neuronen-bedingten Moleküls in Kultur oder in vivo, z. B. Cholinacetyltransferase oder Acetylcholinesterase, bezüglich Motorneuronen; oder
  • (iv) verminderte Symptome einer neuronalen Fehlfunktion in vivo.
  • Solche Wirkungen können durch jedes beliebige aus der Technik bekannte Verfahren gemessen werden. Bei bevorzugten nicht einschränkenden Ausführungsformen können ein erhöhtes Überleben von Neuronen durch das bei Arakawa et al. (1990, J. Neurosci. 10: 3507-3515) ausgeführte Verfahren gemessen werden; ein vermehrtes Sprießen von Neuronen kann durch die bei Pestronk et al. (1980, Exp. Neurol. 70: 65-82) oder Brown et al. (1981, Ann. Rev. Neurosci. 4: 17-42) ausgeführten Verfahren nachgewiesen werden; eine vermehrte Produktion von Neuronen- bedingten Molekülen kann durch Biotests, enzymatische Tests, Antikörperbindung, Northern-Blot-Tests etc., in Abhängigkeit von dem zu messenden Molekül, gemessen werden; und eine Motorneuron-Fehlfunktion kann durch Testen der physikalischen Manifestation von Motorneuronen-Störungen, z. B. Schwäche der Motorneuronen-Leitungsgeschwindigkeit oder durch Funktionsuntüchtigkeit gemessen werden.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform umfassen Motorneuronen- Störungen, die erfindungsgemäß behandelt werden können, Störungen, die Infarkt, Infektion, Toxinexposition, Trauma, Schäden durch einen operativen Eingriff, degenerative Erkrankungen oder Bösartigkeit, die die motorischen Neuronen, sowie andere Komponenten des Nervensystems beeinflussen können, sowie Störungen, die Neuronen selektiv beeinflussen, wie amyotrophe Lateralsklerose, und einschließlich progressiver spinaler Muskelatrophie, progressiver Bulbärparalyse, primärer Lateralsklerose, infantiler und juveniler Muskelatrophie, progressiver Bulbärparalyse in der Kindheit (Fazio-Londe Syndrom), Poliomyelitis und des Postpoliosyndroms und der erblich bedingten motorsensorischen Neuropathie (Charot- Mariesche Krankheit), jedoch nicht darauf beschränkt.
    • 5.1.3 GEWEBEREPARATUR UND -REGENERIERUNG
  • Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein erfindungsgemäßes Therapeutikum zur Beschleunigung der Geweberegenerierung und -reparatur verwendet, einschließlich der Behandlung gutartiger dysproliferativer Störungen, jedoch nicht darauf beschränkt. Spezielle Ausführungsformen betreffen die Behandlung von Leberzirrhose (ein Zustand, wobei die Vernarbung über die normalen Leber-Regenerierungsprozesse überhand genommen hat), Behandlung von Keloidbildung (hypertrohe Grindbildung) (Fehlfiguration der Haut, wobei der Grindbildungsprozess in die normale Erneuerung eingreift), Psoriasis (ein häufiger Hautzustand, der durch eine übermäßige Proliferation der Haut und eine verzögerte Bestimmung des ordnungsgemäßen zellulären Werdegangs gekennzeichnet ist) und Kahlköpfigkeit (ein Zustand, wobei terminaldifferenzierte Haarfollikel (ein Gewebe, das reich ist an Notch) nicht ordnungsgemäß funktionieren).
    • 5.2 PROPHYLAKTISCHE ANWENDUNGEN 5.2.1 BÖSARTIGKEITEN
  • Die erfindungsgemäßen Therapeutika können zur Verhinderung der Progression zu einem neoplastischen oder bösartigen Zustand, einschließlich der in Tabelle 1 aufgeführten Störungen, jedoch nicht darauf beschränkt, verabreicht werden. Eine solche Verabreichung ist indiziert, wenn sich erweist, daß das Therapeutikum in Tests, wie nachstehend beschrieben, zur Behandlung oder Prävention solcher Störungen brauchbar ist. Eine solche prophylaktische Anwendung ist bei Zuständen indiziert, die bekanntlich oder vermutlich der Progression zu Neoplasie oder Krebs vorausgehen, insbesondere bei denen, wobei nicht-neoplastisches Zellwachstum, bestehend aus Hyperplasie, Metaplasie oder insbesondere Dysplasie, aufgetreten ist (ein Überblick über solche abnormen Wachstumsbedingungen findet sich bei Robbins und Angell, 1976, Basic Pathology, 2. Ausg., W. B. Saunders Co., Philadelphia, Ss. 68-79). Die Hyperplasie ist eine Form der kontrollierten Zellproliferation, die eine Zunahme in der Zellanzahl in einem Gewebe oder einem Organ ohne signifikante Änderung in Struktur oder Funktion betrifft. Nur als Beispiel geht die endometriale Hyperplasie oft dem Endometrialkrebs voraus. Die Metaplasie ist eine Form des kontrollierten Zellwachstums, wobei ein Typ einer ausgewachsenen oder vollständig differenzierten Zelle einen anderen Typ von ausgewachsener Zelle ersetzt. Metaplasie kann in Epithel- oder Bindegewebszellen auftreten. An der atypischen Metaplasie ist ein etwas ungeordnetes metaplastisches Epithel beteiligt. Die Dysplasie ist häufig ein Vorläufer von Krebs und wird hauptsächlich im Epithel festgestellt. Es ist die besonders ungeordnete Form des neoplastischen Zellwachstums und umfaßt einen Verlust der individuellen Zellgleichmäßigkeit und architektonischen Ausrichtung der Zellen. Dysplastische Zellen besitzen oft abnorm große, stark gefärbte Kerne und zeigen Pleomorphismus. Die Dysplasie tritt charakteristischerweise dann ein, wenn chronische Irritation oder Entzündung vorliegt und wird oft im Zervix, in den Atemwegen, der Mundhöhle und in der Gallenblase festgestellt.
  • Alternativ oder zusätzlich zum Vorliegen eines abnormen Zellwachstums, das als Hyperplasie, Metaplasie oder Dysplasie gekennzeichnet ist, kann das Vorliegen eines oder mehrerer Merkmale eines transformierten Phänotyps oder eines bösartigen Phänotyps, der in vivo oder in vitro von einer Zellprobe eines Patienten gezeigt wird, anzeigen, daß eine prophylaktische/therapeutische Verabreichung eines erfindungsgemäßen Therapeutikums erwünscht ist. Wie vorstehend erwähnt, umfassen solche Merkmale eines transformierten Phänotyps morphologische Änderungen, losere Substrat-Haftung, Verlust von Kontakthemmung, Verlust von Verankerungsabhängigkeit, Protease- Freisetzung, verstärkter Zuckertransport, geringeres Serum- Erfordernis, Expression fetaler Antigene, Verschwinden des 250000 Dalton-Zelloberflächenproteins etc. (siehe auch id., Ss. 84-90 bezüglich Merkmalen im Zusammenhang mit einem transformierten oder bösartigen Phänotyp).
  • Bei einer speziellen Ausführungsform sind Leukoplakie, eine gutartig erscheinende hyperplastische oder dysplastische Läsion des Epithels oder die Bowen Krankheit, ein Karzinom in situ, präneoplastische Läsionen eine Indikation dafür sind, daß der prophylaktische Eingriff erwünscht ist.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform ist die Zystofibrose (zystische Hyperplasie, Mammadysplasie, insbesondere Adenose (gutartige Epithel-Hyperplasie)) eine Indikation dafür, daß der prophylaktische Eingriff erwünscht ist.
  • Bei anderen Ausführungsformen wird ein Patient, der eine oder mehrere der folgenden Prädispositionsfaktoren für Bösartigkeit zeigt, durch Verabreichung einer wirksamen Menge eines Therapeutikums behandelt: chromosomale Translokation, verbunden mit einer Bösartigkeit (z. B. Philadelphia-Chromosom für chronische myelogene Leukämie, t(14; 18) für Follikel-Lymphom, etc.), Familiäre Polypose oder Gardner Syndrom (mögliche Vorläufer von Darmkrebs), gutartige monoklonale Gammopathie (möglicher Vorläufer für multiples Myelom) und eine Verwandschaft ersten Grades mit Personen, die von Krebs oder einer präkanzerösen Erkrankung befallen sind und ein Mendelsches (genetisches) Erbmuster zeigen (z. B. familiäre Polypose des Darms, Gardner Syndrom, erbliche Exostose, polyendokrine Adenomatose, medulläres Thyroid-Karzinom mit Amyloid-Produktion und Phäochromozytom, Peutz-Jeghers Syndrom, Von Recklinghausen-Neurofibromatose, Retinoblastom, Karotidkörpertumor, kutanes Melanokarzinom, intraokulares Melanokarzinom, Xerodermpigmentosum, ataxia telangiectasia, Chediak-Higashi Syndrom, Albinismus, aplastische Fanconi-Anämie und Bloom Syndrom; 8 siehe Robbins und Angell, 1976, Basic Pathology, 2. Ausg., W. B. Saunders Co., Philadelphia, Ss. 112-113) etc.).
  • Bei einer weiteren speziellen Ausführungsform wird ein erfindungsgemäßes antagonistisches Therapeutikum einem menschlichen Patienten zur Verhinderung der Progression von Brust-, Darm- oder Zervikalkrebs verabreicht.
    • 5.2.2 WEITERE STÖRUNGEN
  • Bei weiteren Ausführungsformen kann ein erfindungsgemäßes Therapeutikum zur Verhinderung einer Nervensystemstörung, die in Abschnitt 5.1.2 beschrieben ist, oder einer anderen Störung (z. B. Leberzirrhose, Psoriasis, Keloide, Kahlköpfigkeit) die in Abschnitt 5.1.3 beschrieben ist, verabreicht werden.
    • 5.3 DEMONSTRATION DER THERAPEUTISCHEN ODER PROPHYLAKTISCHEN BRAUCHBARKEIT
  • Die erfindungsgemäßen Therapeutika können in vivo auf die gewünschte therapeutische oder prophylaktische Wirksamkeit getestet werden. Beispielsweise können solche Verbindungen vor dem Testen an Menschen in geeigneten Tiermodellsystemen getestet werden, die Ratten, Mäuse, Hühner, Kühe, Affen, Kaninchen etc. einschließen, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Für den in vivo Test, vor der Verabreichung an Menschen, kann jedes aus der Technik bekannt Tiermodellsystem angewandt werden.
    • 5.4 THERAPEUTISCHE/PROPHYLAKTISCHE VERABREICHUNG UND ZUSAMMENSETZUNGEN
  • Die Erfindung stellt pharmazeutische Zusammensetzungen zur Behandlung (und Prophylaxe) durch Verabreichung an ein Subjekt, einer wirksamen Menge eines erfindungsgemäßen Therapeutikums bereit. Bei einem bevorzugten Aspekt ist das Therapeutikum im wesentlichen rein. Das Subjekt ist vorzugsweise ein Tier, einschließlich von Tieren, wie Kühe, Schweine, Hühner etc., jedoch nicht darauf beschränkt, und ist vorzugsweise ein Säuger und besonders bevorzugt ein Mensch.
  • Verschiedene Abgabesysteme sind bekannt und können zur Verababreichung eines erfindungsgemäßen Therapeutikums verwendet werden, z. B. Einkapselung in Liposomen, Mikroteilchen, Mikrokapseln, Expression durch rekombinante Zellen, Rezeptorvermittelte Endozytose (siehe z. B. Wu und Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432), Konstruktion einer therapeutischen Nukleinsäure als Teil eines retroviralen oder eines anderen Vektors etc. Verfahren zum Einbringen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subkutane, intranasale und orale Wege. Die Verbindungen können durch jeden zweckmäßigen Weg verabreicht werden, beispielsweise durch Infusion oder Bolus- Injektion, durch Absorption über epitheliale oder mukokutane Auskleidungen (z. B. Mundschleimhaut, Rektal- und Intestinalschleimhaut etc.) und können zusammen mit anderen biologisch wirksamen Mitteln verabreicht werden. Die Verabreichung kann systemisch oder lokal erfolgen. Zusätzlich kann es erwünscht sein, die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen durch einen beliebigen geeigneten Weg in das Zentralnervensystem einzuschleusen, einschließlich der intraventrikulären und intrathekalen Injektion; die intraventrikuläre Injektion kann durch einen Intraventrikulärkatheter erleichtert werden, der beispielsweise an ein Reservoir, wie ein Ommaya-Reservoir, angeschlossen ist.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform kann die Verabreichung der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen lokal auf den Bereich, der der Behandlung bedarf, erwünscht sein. Dies kann beispielsweise durch lokale Infusion während eines chirurgischen Eingriffs, topisches Aufbringen, z. B. in Verbindung mit einem Wundpflaster nach dem chirurgischen Eingriffs, durch Injektion über einen Katheter, ein Zäpfchen oder über ein Implantat, wobei das Implantat aus einem porösen, nicht porösen oder aus gelartigem Material ist, einschließlich Membranen, wie sialastische Membranen oder Fasern, erreicht werden, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Bei einer Ausführungsform kann die Verabreichung durch direkte Injektion an die Stelle (oder ehemalige Stelle) eines bösartigen Tumors oder von neoplastischem oder präneoplastischem Gewebe erfolgen.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform wird die Verabreichung eines Therapeutikums in eine Notch-Expressionszelle durch Binden des Therapeutikums an ein Delta (oder an ein anderes toporhythmisches) Protein oder an einen Teil hiervon, der in der Lage ist, die Bindung an Notch zu vermitteln, erreicht. Der Kontakt einer Notch-exprimierenden Zelle mit dem gebundenen Therapeutikum führt zum Binden des gebundenen Therapeutikums über seinen Deltateil an Notch an der Oberfläche der Zelle und zur anschießenden Aufnahme des gebundenen Therapeutikums in die Notch-exprimierende Zelle.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform, wobei ein Analoges einer intrazellulären, signaltransduzierenden Notch-Domäne so als Therapeutikum eingesetzt wird, daß die Notch-Signaltransduktion gehemmt werden kann, wird das Analoge vorzugsweise intrazellulär abgegeben (z. B. durch Expression aus einem Nukleinsäurevektor oder durch Binden an ein Delta-Protein, das zum Binden an Notch und anschließendes Binden und Internalisieren in der Lage ist, oder durch Rezeptor-vermitteltem Mechanismen).
  • Bei einer speziellen Ausführungsform, wobei das Therapeutikum eine Nukleinsäure ist, die ein Protein-Therapeutikum codiert, kann die Nukleinsäure in vivo zur beschleunigten Expression ihres codierten Proteins verabreicht werden, durch ihre Konstruktion als Teil eines entsprechenden Nukleinsäure-Expressionsvektors und durch ihr Verabreichen, so daß sie intrazellulär wird, z. B. durch Verwendung eines retroviralen Vektors (siehe U.S. Patentschrift Nr. 4 980 286) oder direkte Injektion oder durch Verwendung von Mikroteilchen-Bombardierung (z. B. eine Genpistole, Biolistik, Dupont) oder durch Überziehen mit Lipiden oder Zelloberflächen-Rezeptoren oder Transfektionsmitteln oder durch ihr Verabreichen in Bindungen an ein Homöobox-artiges Peptid, das bekanntlich in den Zellkern eindringt (siehe z. B. Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868), etc. verabreicht werden. Alternativ kann ein Nukleinsäure-Therapeutikum intrazellulär eingeschleust und zur Expression durch homologe Rekombination in die Wirtszellen DNA eingebaut werden.
  • Bei speziellen Ausführungsformen, die die Behandlung oder Prävention bestimmter Störungen betreffen, werden vorzugsweise die folgenden Verabreichungsformen angewandt:
    • Krankheit Bevorzugte Verabreichungsformen
  • Zervikalkrebs topisch
  • Gastrointestinalkrebs oral; intravenös
  • Lungenkrebs Inhalation; intravenös
  • Leukämie intravenös; extrakorporal
  • Metastasenkarzinome intravenös; oral
  • Hirntumor gezielt; intravenös; intrathekal
  • Leberzirrhose oral; intravenös
  • Psoriasis topisch
  • Keloide topisch
  • Kahlköpfigkeit topisch
  • Rüchkenmarksverletzung gezielt; intravenös; intrathekal
  • Parkinson Krankheit gezielt; intravenös; intrathekal
  • Motorneuronenkrankheit gezielt; intravenös; intrathekal
  • Alzheimer Krankheit gezielt; intravenös; intrathekal
  • Die Erfindung stellt auch pharmazeutische Zusammensetzungen bereit. Solche Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge eines Therapeutikums und einen pharmazeutisch verträglichen Träger oder Hilfsstoff. Ein solcher Träger umfaßt Salzlösung, gepufferte Salzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol und Kombinationen hiervon, ist jedoch nicht darauf beschränkt. Der Träger und die Zusammensetzung können steril sein. Die Formulierung sollte der Verabreichungsweise angepaßt sein.
  • Die Zusammensetzung, kann falls gewünscht auch geringe Mengen an Netz- oder Emulgationsmitteln oder pH-Puffermitteln enthalten. Die Zusammensetzung kann eine flüssige Lösung, Suspension, Emulsion, Tablette, Pille, Kapsel, eine Langzeit- Formulierung oder ein Pulver sein. Die Zusammensetzung kann als Zäpfchen mit traditionellen Bindemitteln und Trägern, wie Triglyceriden, formuliert sein. Die orale Formulierung kann Standardträger, wie Mannit, Laktose, Stärke, Magnesiumstaerat, Natriumsaccharin, Cellulose, Magnesiumcarbonat etc. in pharmazeutischer Qualität enthalten.
  • Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zusammensetzung in Übereinstimmung mit den routinemäßigen Verfahrensweisen als pharmazeutische Zusammensetzung, die zur intravenösen Verabreichung an Menschen geeignet ist, formuliert. Typischerweise sind die Zusammensetzungen zur intravenösen Verabreichung Lösungen in einem sterilen, isotonen, wäßrigen Puffer. Wo notwendig, kann die Zusammensetzung auch ein Solubilisierungsmittel und ein Lokalanästhetikum, wie Lidocain, zur Schmerzlinderung an der Injektionsstelle enthalten. In der Regel werden die Bestandteile entweder getrennt oder miteinander vermischt in einer Dosierungseinheitsform, beispielsweise als trockenes lyophilisiertes Pulver oder als wasserfreies Konzentrat in einem hermetisch verschlossenen Behälter, wie eine Ampulle oder ein Beutel, wobei die Menge des Wirkstoffs angegeben ist, geliefert. Wenn die Zusammensetzung durch Infusion verabreicht werden soll, kann sie mit einem Infusionsbeutel, der steriles Wasser oder Salzlösung von pharmazeutischer Qualität enthält, abgegeben werden. Wenn die Zusammensetzung durch Injektion verabreicht wird, kann eine Ampulle mit sterilem Wasser zur Injektion oder mit Salzlösung bereitgestellt werden, so daß die Bestandteile vor der Verabreichung gemischt werden können.
  • Die erfindungsgemäßen Therapeutika können als neutrale Formen oder als Salzformen formuliert sein. Pharmazeutisch verträgliche Salze umfassen diejenigen, die mit freien Aminogruppen gebildet sind, wie diejenigen, die sich von Chlorwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Oxalsäure, Weinsäure etc. ableiten, und diejenigen, die mit freien Carboxylgruppen gebildet sind, wie diejenigen, die sich von Natrium-, Kalium-, Ammonium-, Calcium-, Eisen(III)-hydroxiden, Isopropylamin, Triethylamin, 2-Ethylaminoethanol, Histidin, Procain etc. ableiten.
  • Die Menge des erfindungsgemäßen Therapeutikums, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustandes wirksam ist, hängt von der Natur der Störung oder des Zustands ab und kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. Außerdem können gegebenenfalls in vivo Tests zur Unterstützung der Identifizierung der optimalen Dosisbereiche angewandt werden. Die exakte, in der Formulierung zu verabreichende Dosis hängt auch vom Verabreichungsweg und von der Schwere der Krankheit oder Störung ab und sollte nach dem Urteil des Arztes in Abhängigkeit vom Befinden eines jeden Patienten entschieden werden. Allerdings betragen geeignete Dosisbereiche zur intravenösen Verabreichung in der Regel etwa 20-500 ug wirksame Verbindung/kg Körpergewicht. Geeignete Dosisbereiche zur intranasalen Verabreichung betragen in der Regel etwa 0,01 pg/kg Körpergewicht bis 1 mg/kg Körpergewicht. Die wirksamen Dosen können aus Dosis-Reaktionskurven, die sich aus in vitro Testmodellsystemen oder aus Tiermodelltestsystemen ergeben, extrapoliert werden.
  • Suppositorien enthalten in der Regel den Wirkstoff im Bereich von 0,5 bis 10 Gew.-%.; orale Formulierungen enthalten vorzugsweise 10 bis 95% Wirkstoff.
  • Die Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Packung oder ein pharmazeutisches Kit bereit, das einen oder mehrere Behälter enthält, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen befüllt sind. Gegebenenfalls kann zusammen mit solchen Behälter(n) eine Notiz in der Form vorhanden sein, wie sie von einer Regierungsbehörde vorgeschrieben ist, die die Herstellung, die Verwendung oder den Verkauf der Pharmazeutika oder der biologischen Produkte regelt, wobei die Notiz die behördlich zugelassene Herstellung, Verwendung oder den Verkauf zur menschlichen Verabreichung erläutert.
    • 5.5 ANTISINN-REGULIERUNG DER NOTCH-EXPRESSION
  • Die Erfindung stellt die therapeutische oder prophylaktische Verwendung von Nukleinsäuren oder von mindestens sechs Nukleotiden bereit, die zu einem Gen oder einer cDNA, die das Notch oder einen Teil hiervon codiert, Antisinn sind. "Antisinn", wie hier verwendet, bezieht sich auf eine Nukleinsäure, die mit einem Teil einer Notch-RNA (vorzugsweise mRNA) aufgrund von einiger Sequenzkomplementarität zu hybridisieren vermag. Solche Antisinn-Nukleinsäuren sind als erfindungsgemäße antagonistische Therapeutika brauchbar und können bei der Behandlung oder Prävention von Störungen, wie supra in Abschnitt 5.1 und in seinen Unterabschnitten beschrieben, verwendet werden.
  • Die erfindungsgemäßen Antisinn-Nukleinsäuren können Oligonukleotide, die doppelt- oder einzelsträngig RNA oder DNA oder eine Modifikation oder Derivat hiervon, die direkt an eine Zelle verabreicht werden können oder intrazellulär durch Transkription exogener, eingebauter Sequenzen produziert werden kann, sein.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform können die erfindungsgemäß bereitgestellten Notch-Antisinn-Nukleinsäuren zur Behandlung von Tumoren oder anderen Störungen verwendet werden, wobei (in vitro oder in vivo) gezeigt werden kann, daß die Zellen des Tumortyps oder der Störung das Notch-Gen exprimieren. Eine solcher Beweis kann durch den Nachweis von Notch-RNA oder von Notch-Protein erfolgen.
  • Die Erfindung stellt ferner pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine wirksame Menge der erfindungsgemäßen Notch- Antisinn-Nukleinsäuren in einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten, wie vorstehend in Abschnitt 5.4 beschrieben.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform betrifft die Erfindung die Verwendung einer Antisinn-Notch-Nukleinsäure zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der Expression einer Notch- Nukleinsäuresequenz in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Zelle, die die Versorgung der Zelle mit einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die eine erfindungsgemäße Antisinn-Notch-Nukleinsäure enthält, umfaßt.
  • Bei einer weiteren Ausführungsform kann die Identifizierung von Zellen, die funktionelle Notch-Rezeptoren exprimieren, durch Beobachtung der Fähigkeit von Notch zur "Rettung" solcher Zellen vor den cytotoxischen Wirkungen einer Notch-Antisinn-Nukleinsäure durchgeführt werden.
  • Notch-Antisinn-Nukleinsäuren und ihre Verwendungen sind ausführlich nachstehend beschrieben.
    • 5.5.1 NOTCH-ANTISINN-NUKLEINSÄUREN
  • Die Notch-Antisinn-Nukleinsäuren bestehen aus mindestens sechs Nukleotiden, und es sind vorzugsweise Oligonukleotide (im Bereich von 6 bis etwa 50 Oligonukletiden). Bei speziellen Aspekten weist das Nukleotid mindestens 10 Nukleotide, mindestens 15 Nukleotide, mindestens 100 Nukleotide oder mindestens 200 Nukleotide auf. Die Oligonukleotide können DNA oder RNA oder chimäre Gemische oder Derivate oder modifizierte Versionen hiervon, einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Das Oligonukleotid kann an der Basengruppierung, Zuckergruppierung oder am Phosphatskelett modifiziert sein. Das Oligonukleotid kann weitere Seitengruppen, wie Peptide oder Mittel, die den Transport durch die Zellmembran (siehe z. B. Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553-6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648-652; PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 88/09810, veröffentlicht am 15. Dezember 1988), oder die Blut-Hirn-Schranke (siehe z. B. PCT-Veröffentlichungs-Nr. WO 89/10134, veröffentlicht am 25. April 1988) erleichtern, durch Hybridisierung ausgelöste Spaltungsmittel (siehe z. B. Krol et al., 1988, Bio Techniques 6: 958-976) oder Interkalationsmittel (siehe z. B. Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539-549) enthalten.
  • Bei einem bevorzugten Aspekt der Erfindung ist ein Notch- Antisinn-Oligonukleotid, vorzugsweise von einzelsträngiger DNA, bereitgestellt. Bei einem besonders bevorzugten Aspekt enthält ein solches Oligonukleotid eine Sequenz, die zur Sequenz, die ELR 11 und ELR 12 von Notch, besonders bevorzugt von menschlichem Notch codiert, Antisinn ist. Das Oligonukleotid kann an jeder Position seiner Struktur mit aus der Technik allgemein bekannten Substituenten modifiziert sein.
  • Das Notch-Antisinn-Oligonukleotid kann mindestens eine modifizierte Basengruppierung enthalten, die aus der Gruppe ausgewählt ist, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, 5- Fluorouracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xantin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)- uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, β-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, β-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5- oxyessigsäure(v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5- oxyessigsäure(v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2- carboxyprophyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin.
  • Bei einer anderen Ausführungsform enthält das Oligonukleotid mindestens eine modifizierte Zuckergruppierung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose umfaßt, jedoch nicht darauf beschränkt ist.
  • Bei noch einer weiteren Ausführungsform enthält das Oligonukleotid mindestens ein modifiziertes Phosphatskelett, das aus der Gruppe, bestehend aus einem Phosphorthioat, einem Phosphordithioat, einem Phosphoramidothioat, einem Phosphoramidat, einem Phosphordiamidat, einem Methylphosphonat, einem Alkylphosphortriester und einem Formacetal hiervon, oder einem Analogen hiervon ausgewählt ist.
  • Bei einer noch weiteren Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein α-anomeres Oligonukleotid. Ein α-anomeres Oligonukleotid bildet mit komplementärer RNA spezielle doppelsträngige Hybride, wobei die Stränge im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten parallel zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625-6641).
  • Das Oligonukleotid kann mit einem anderen Molekül konjugiert sein, z. B. einem Peptid, einem durch Hybridisierung ausgelösten Vernetzungsmittel, Transportmittel, durch Hybridisierung ausgelösten Spaltungsmittel etc.
  • Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide können durch aus der Technik bekannte Standardverfahren synthetisiert werden, z. B. unter Verwendung eines automatischen DNA-Synthesegerätes (wie diejenigen, die von der Firma Biosearch, Applied Biosystems, im Handel sind etc.). Als Beispiele können Phosphorthioat- Oligonukleotide durch das Verfahren von Stein et al., (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209) synthetisiert werden, Methylphosphonat-Oligonukleotide können unter Verwendung von kontrollierten porösen Glas-Polymerträgern hergestellt werden (Sarm et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7448-7451), etc.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform enthält das Notch-Antisinn-Oligonukleotid katalytische RNA oder ein Ribozym (siehe z. B. PCT Internationale Veröffentlichung WO 90/11364, veröffentlicht am 4. Oktober 1990; Sarver et al. 1990, Science 247: 1222-1225). Bei einer anderen Ausführungsform ist das Oligonukleotid ein 2'-O-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131-6148) oder ein chimäres RNA- DNA-Analoges (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327-330).
  • Bei einer alternativen Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Notch-Antisinn-Nukleinsäure intrazellulär durch Transkription aus einer exogenen Sequenz hergestellt. Beispielsweise kann ein Vektor in vivo so eingebaut werden, daß er von einer Zelle aufgenommen wird, wobei der Vektor oder ein Teil hiervon unter Produktion einer erfindungsgemäßen Antisinn- Nukleinsäure (RNA) transkribiert wird. Ein solcher Vektor enthält eine Sequenz, die die Notch-Antisinn-Nukleinsäure codiert. Ein solcher Vektor kann episomal bleiben oder kann chromosomal eingebaut werden, solang er unter Produktion der gewünschten Antisinn-RNA transkribiert werden kann. Solche Vektoren können durch DNA-rekombinationstechnische Standardverfahren konstruiert werden. Die Vektoren können Plasmidvektoren, virale Vektoren oder andere aus der Technik bekannte Vektoren sein, die zur Replikation und Expression in Säugerzellen verwendet werden. Die Expression der Sequenz, die die Notch-Antisinn-RNA codiert, kann durch jeden beliebigen aus der Technik bekannten Promotor erfolgen, der in Säugerzellen, vorzugsweise in menschlichen Zellen, wirkt. Solche Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Solche Promotoren umfassen: die frühe SV40-Promotorregion (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), der in der langen, terminalen 3'-Sequenzwiederholung von Rous Sarcomavirus enthaltene Promotor (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787-797), der Herpes- Thymidinkinase-Promotor (Wagner, et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441-1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42) etc., sind jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Die erfindungsgemäßen Antisinn-Nukleinsäuren enthalten eine Sequenz, die zu mindestens einem Teil eines RNA-Transkripts eines Notch-Gens, vorzugsweise eines menschlichen Notch-Gens, komplementär ist. Allerdings ist eine absolute Komplementarität, obwohl bevorzugt, nicht erforderlich. Eine Sequenz, "die zu mindestens einem Teil einer RNA komplementär ist", wie hier beschrieben, bedeutet eine Sequenz mit ausreichender Komplementarität, die mit der RNA unter Bildung eines stabilen Doppelstrangs zu hybridisieren vermag; im Falle von doppelsträngigen Notch-Antisinn-Nukleinsäuren kann somit ein EinzelStrang der Doppelstrang-DNA getestet werden, oder es können Dreifachstrang-Formationen getestet werden. Die Fähigkeit der Hybridisierung hängt sowohl vom Komplementaritätsgrad als auch von der Länge der Antisinn-Nukleinsäure ab. Je länger die hybridisierende Nukleinsäure, desto mehr Basen- Fehlpaarungen mit einer Notch-RNA kann sie in der Regel enthalten und immer noch einen stabilen Doppelstrang (oder gegebenenfalls Dreifachstrang) bilden. Ein Fachmann kann unter Anwendung von Standardverfahren zur Bestimmung des Schmelzpunkts des hybridisierten Komplexes einen annehmbaren Fehlpaarungsgrad garantieren.
    • 5.5.2 THERAPEUTISCHE BRAUCHBARKEIT VON NOTCH-ANTISINN-NUKLEINSÄUREN
  • Die Notch-Antisinn-Nukleinsäuren können zur Behandlung (oder Verhinderung) von Bösartigkeiten eines Zelltyps verwendet werden, von dem gezeigt wurde, daß er Notch-RNA exprimiert. Bösartige, neoplastische und präneoplastische Zellen, die auf eine solche Expression getestet werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die supra in den Abschnitten 5.1.1 und 5.2.1 beschrieben sind. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird ein einzelsträngiges DNA-Antisinn-Notch-Oligonukleotid verwendet.
  • Bösartige (insbesondere Tumor)-Zelltypen, die Notch-RNA exprimieren, können durch verschiedene aus der Technik bekannte Verfahren identifiziert werden. Solche Verfahren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Hybridisierung mit einer Notch spezifischen Nukleinsäure (z. B. durch Northern- Hybridisierung, Dotblot-Hybridisierung, in situ Hybridisierung) unter Beobachtung der Fähigkeit der RNA aus dem Zelltyp in vitro in Notch translatiert zu werden etc. Bei einem bevorzugten Aspekt kann primäres Tumorgewebe von einem Patienten vor der Behandlung auf die Notch-Expression getestet werden.
  • Die pharmazeutischen erfindungsgemäßen Zusammensetzungen (siehe Abschnitt 5.1.4), die eine wirksame Menge einer Notch- Antisinn-Nukleinsäure in einem pharmazeutisch verträglichen Träger enthalten, können an einen Patienten mit einer Bösartigkeit, die von einem Notch-RNA exprimierenden Typ ist, verabreicht werden.
  • Die Menge an Antisinn-Nukleinsäure, die bei der Behandlung einer bestimmten Störung oder eines bestimmten Zustands wirksam ist, hängt von der Natur der Störung oder des Zustandes ab und kann durch klinische Standardtechniken bestimmt werden. Wo möglich, ist es erwünscht, die Antisinn-Zytotoxizität des zu behandelnden Tumortyps in vitro und anschließend vor den Testen und vor der Anwendung beim Menschen in geeigneten Tiermodellsystemen zu bestimmen.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform werden pharmazeutische Zusammensetzungen, die Notch-Antisinn-Nukleinsäuren enthalten, über Liposomen, Mikroteilchen oder Mikrokapseln verabreicht. Bei verschiedenen Ausführungsformen der Erfindung kann die Verwendung solcher Zusammensetzungen zum Erreichen einer Langzeit-Freisetzung der Notch-Antisinn-Nukleinsäuren geeignet sein. Bei einer speziellen Ausführungsform kann es wünschenswert sein, Liposomen, die über Antikörper auf spezielle identifizierbare Tumor-Antigene gerichtet sind, zu verwenden (Leonetti et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 2448-2451; Renneisen et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 16337-16342).
    • 5.6 DIAGNOSTISCHE BRAUCHBARKEIT
  • Notch-Proteine, Analoge und Derivate und Sequenzen hiervon, Notch-Nukleinsäuren (und hierzu komplementäre Sequenzen), Anti-Notch-Antikörper finden in der Diagnostik Anwendung. Solche Moleküle können bei Tests, wie Immuntests, zum Nachweis, zur Prognose, Diagnose oder Überwachung verschiedener, die Notch-Expression betreffender Zustände, Krankheiten und Störungen, oder zur Überwachung der Behandlung hiervon, eingesetzt werden. Insbesondere wird ein solcher Immuntest durch ein Verfahren durchgeführt, das den Kontakt einer Probe, die aus einem Patienten mit einem Anti-Notch-Antikörper stammt, unter solchen Bedingungen, daß eine immunspezifische Bindung auftreten kann, und den Nachweis oder das Messen der Menge einer immunspezifischen Bindung durch den Antikörper umfaßt. Bei einer speziellen Ausführungsform kann ein Antikörper gegen Notch zum Test einer Patienten-Gewebe- oder Serumprobe auf das Vorliegen von Notch verwendet werden, wo eine anormaler Notch-Konzentration ein Anzeichen für einen Krankheitszustand ist.
  • Die Immuntests, die angewandt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, kompetitive und nicht-kompetitive Testsysteme unter Verwendung von Techniken, wie Western- Blots, Radioimmuntests, ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay). "Sandwich"-Immuntests, Immunfällungstests, Fällungsreaktionen, Geldiffusionsfällungsreaktionen, Immundiffusionstests, Agglutinationstests, Komplement-Fixierungstests, Immunradiometrietests, Fluoreszenzimmuntests, Protein A-Immuntests, um nur einige aufzuzählen.
  • Notch-Gene und verwandte Nukleinsäuresequenzen und Untersequenzen, einschließlich der Komplementärsequenzen und anderer toporhythmischer Gensequenzen, können ebenfalls bei Hybridisierungstests verwendet werden. Notch-Nukleinsäuresequenzen oder Untersequenzen hiervon, die mindestens etwa 8 Nukleotide enthalten, können als Hybridisierungssonden verwendet werden. Hybridisierungstests können zum Nachweis, zur Prognose, Diagnose oder zur Aufzeichnung von Zuständen, Störungen oder Krankheitszuständen verwendet werden, die mit anormalen Änderungen der Notch-Expression und/oder Aktivität, wie vorstehend beschrieben, einhergehen. Insbesondere wird ein solcher Hybridisierungstest durch ein Verfahren durchgeführt, das den Kontakt einer Probe, die Nukleinsäure enthält, mit einer Nukleinsäuresonde, die in der Lage ist, an Notch-DNA oder RNA zu hybridisieren, unter solchen Bedingungen, daß die Hybridisierung auftreten kann, und den Nachweis oder das Messen einer resultierenden Hybridisierung umfaßt.
  • Wie in den Beispielen in Abschnitt 10.1 nachstehend ausgeführt, tritt eine verstärkte Notch-Expression bei menschlichem Brustkrebs, Darmkrebs und Zervikalkrebs auf. Demnach wird bei speziellen Ausführungsformen menschlicher Brustkrebs, Darmkrebs oder Zervikalkrebs oder prämaligne Änderungen in solchen Geweben durch den Nachweis erhöhter Notch- Expression (oder Menge) in Patientenproben relativ zu dem Niveau der Notch-Expression (oder Menge) je nach Fall in einer analogen nicht malignen oder nicht prämalignen Probe (vom Patienten oder von einer anderen Person, wie experimentell bestimmt, oder wie es als Standardniveau in solchen Proben bekannt ist) diagnostiziert.
  • Bei einer Ausführungsform befindet sich das Notch-Protein (oder ein Derivat mit Notch-Antigenität), das nachgewiesen oder gemessen wird, auf der Zelloberfläche. Bei einer anderen Ausführungsform ist das Notch-Protein (oder ein Derivat) ein zellfreies, lösliches Molekül (z. B. wird es im Blut oder in einer Serumprobe gemessen) oder ist intrazellulär. Ohne daß die Absicht besteht, mechanistisch festgelegt zu werden, glauben die Anwender, daß zellfreies Notch von der Sekretion oder dem Abstoßen von der Zelloberfläche herrührt. Bei noch einer anderen Ausführungsform werden lösliche, zelloberflächliche und intrazelluläre Mengen an Notch-Protein oder Derivat nachgewiesen oder gemessen.
    • 5.7 NOTCH-NUKLEINSÄUREN
  • Die erfindungsgemäßen Therapeutika, die Notch-Nukleinsäuren oder Notch-Antisinn-Nukleinsäuren sind, sowie Nukleinsäuren, die Protein-Therapeutika codieren, umfassen diejenigen, die nachstehend beschrieben sind, die durch aus der Technik bekannte Verfahren und insbesondere, wie nachstehend beschrieben, erhalten werden können.
  • Bei bestimmten Aspekten stellt die Erfindung Aminosäurensequenzen von Notch, vorzugsweise von menschlichem Notch und Fragmente und Derivate hiervon, die eine Antigen-Determinante enthalten (d. h. Erkennung durch einen Antikörper ist möglich) oder die funktionell aktiv sind, sowie Nukleinsäuresequenzen die die Vorgenannten codieren, bereit. "Funktionell aktives" Material, wie hier verwendet, bezieht sich auf das Material, das eine oder mehrere bekannte funktionelle Aktivitäten aufweist, die mit dem Notch-Vollängen-Protein (Wildtyp) im Zusammenhang stehen, z. B. Bindung an Delta, Bindung an Serrate, Bindung an einen anderen Notch-Liganden, Antigemät (Bindung an Anti-Notch-Antikörper) etc.
  • Bei speziellen Ausführungsformen stellt die Erfindung Fragmente eines Notch-Proteins bereit, bestehend aus mindestens 40 Aminosäuren oder aus mindestens 75 Aminosäuren. Bei anderen Ausführungsformen enthalten die Proteine die intrazellulären Domäne, Transmembranregion, extrazelluläre Domäne, cdc10-Region, Notch/lin-12-Sequenzwiederholungen oder die EGF-homologen Sequenzwiederholungen, oder einer Kombination der Vorgenannten, von einem Notch-Protein, oder bestehen im wesentlichen daraus. Fragmente oder Proteine, die Fragmente enthalten, denen einige oder sämtliche EGF-homologen Sequenzwiederholungen von Notch fehlen, sind ebenfalls bereitgestellt. Nukleinsäuren, die Vorgenanntes codieren, sind bereitgestellt.
  • Bei anderen spezifischen Ausführungsformen stellt die Erfindung Nukleotidsequenzen und Untersequenzen von Notch, vorzugsweise von menschlichem Notch, bereit, bestehend aus mindestens 25 Nukleotiden, mindestens 50 Nukleotiden oder mindestens 150 Nukleotiden. Nukleinsäuren, die die vorstehend beschriebenen Proteine und Proteinfragmente codieren, sowie Nukleinsäuren, die zu solchen Nukleinsäuren komplementär sind und in der Lage sind, mit ihnen zu hybridisieren, sind bereitgestellt. Bei einer Ausführungsform kann eine solche komplementäre Sequenz zu einer Notch-cDNA-Sequenz von mindestens 25 Nukleotiden oder von mindestens 100 Nukleotiden komplementär sein. Bei einem bevorzugten Aspekt verwendet die Erfindung cDNA-Sequenzen, die menschliches Notch oder einen Teil hiervon codieren. Bei einer speziellen Ausführungsform sind solche Sequenzen des menschlichen Notch-Gens oder der cDNA so, wie sie in den Plasmiden, hN3k, hN4k oder hN5k (siehe Abschnitt 9, nachstehend) oder in dem hierzu entsprechenden Gen enthalten sind; eine solche menschliche Notch-Proteinsequenz kann so sein, wie in den Fig. 10 (SEQ ID NO: 11) oder 11 (SEQ ID NO: 13) gezeigt. Bei anderen Ausführungsformen weist die Notch-Nukleinsäure und/oder ihr codiertes Protein mindestens einen Teil der in einer der folgenden Publikationen gezeigten Sequenz auf: Wharton et al., 1985, Cell 43: 567-581 (Drosophila-Notch); Kidd et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6: 3094-3108 (Drosophila-Notch); Coffman et al., 1990, Science 249: 1438-1441 (Xenopus Notch); Ellisen et al., 1991, Cell 66: 649-661 (ein menschliches Notch). Bei einem anderen Aspekt sind die Sequenzen von menschlichem Notch diejenigen, die die menschlichen Notch-Aminosäuresequenzen oder einen Teil hiervon, wie in Fig. 13 gezeigt, codieren. Bei einem bestimmten Aspekt sind die menschlichen Notch-Sequenzen diejenigen des hN-Homologen (zum Teil durch das Plasmid hN5k dargestellt) oder des TAN-1-Homologen.
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung betrifft die Erfindung das menschliche Vollängen-Notch-Protein, das von dem hN- Homologen, wie in Fig. 13 beschrieben, codiert wird, bei dem die Signalsequenz sowohl enthalten ist (d. h. das Vorläuferprotein, Aminosäuren 1-2169) als auch fehlt (d. h. das reife Protein, Aminosäuren ca. 26-2169), sowie Teile des Vorgenannten (z. B. extrazelluläre Domäne, die EGF-homologe Sequenzwiederholungsregion, die EGF-artigen Sequenzwiederholungen 11 und 12, die cdc-10/Ankyrin-Sequenzwiederholungen, etc.) und Proteine, die das Vorgenannten enthalten, sowie Nukleinsäuren, die das Vorgenannten codieren.
  • Wie leicht offensichtlich ist, soll, wie hier verwendet, eine "Nukleinsäure, die ein Fragment oder einen Teil eines Notch- Proteins codiert", so aufgebaut sein, daß eine Nukleinsäure gemeint ist, die nur das aufgeführte Fragment oder ein Teil des Notch-Proteins und keine anderen Teile des Notch-Proteins codiert.
  • Bei einem bevorzugten, allerdings nicht einschränkenden Aspekt der Erfindung kann eine menschliche Notch-DNA-Sequenz kloniert und durch das in Abschnitt 9, nachstehend, beschriebene Verfahren sequenziert werden.
  • Bei einem weiteren bevorzugten Aspekt wird die PCR zur Amplifikation der gewünschten Sequenz in der Bibliothek vor der Selektion angewandt. Beispielsweise können Oligonukleotid- Primer, die einen Teil der Adhäsionsdomänen darstellen, die von einem Homologen des gewünschten Gens codiert werden, als Primer bei der PCR eingesetzt werden.
  • Die obigen Verfahren sollen für die folgende allgemeine Beschreibung der Verfahren, durch die Notch-Klone erhalten werden können, nicht einschränkend sein.
  • Jede eukaryotische Zelle kann potentiell als Nukleinsäurequelle für das molekulare Klonieren des Notch-Gens dienen. Die DNA kann durch aus der Technik bekannte Standardverfahrensweisen aus klonierter DNA (z. B. einer DNA-"Bibliothek"), durch chemische Synthese, cDNA-Klonierung oder durch Klonieren von Genom-DNA oder von Fragmenten hiervon, die aus der gewünschten menschlichen Zelle gereinigt wurden (siehe beispielsweise Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 2. Ausg. Cold Spring Harbor, New York; Glover, D. M. (Hrsg.), 1985, DNA Cloning: A Practical Approach, MRL Press Ltd., Oxford, U. K. Vol. I, II.) erhalten werden. Klone, die aus Genom-DNA stammen, können zusätzlich zu den codierenden Regionen regulatorische und Intron-DNA-Regionen enthalten; Klone, die von cDNA stammen, enthalten nur Exon-Sequenzen. Ohne Rücksicht auf die Quelle sollte das Gen molekular in einen geeigneten Vektor zur Propagation des Gens kloniert werden.
  • Beim molekularen Klonieren des Gens aus Genom-DNA werden DNA- Fragmente erzeugt, von denen einige das gewünschte Gen codieren. Die DNA kann unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme an bestimmten Stellen gespalten werden. Alternativ kann DNAse in Gegenwart von Mangan zur Fragmentierung der DNA verwendet werden, oder die DNA kann physikalisch geschert werden, wie beispielsweise durch Ultraschall. Anschließend können die linearen DNA-Fragmente durch Standardtechniken, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Agarose- und Polyacrylamidgelelektrophorese und Säulenchromatographie, der Größe nach aufgetrennt werden.
  • Nach Erzeugung der DNA-Fragmente kann die Identifizierung des speziellen DNA-Fragments, das das gewünschte Gen enthält, auf einer Reihe von Wegen erreicht werden. Wenn beispielsweise ein Teil eines Notch(von einer beliebigen Spezies)-Gens oder seine spezielle RNA oder ein Fragment hiervon, z. B. die Adhäsionsdomäne, verfügbar ist und gereinigt und markiert werden kann, können die erzeugten DNA-Fragmente durch Nukleinsäure- Hybridisierung mit der markierten Sonde durchmustert werden (Benton, W. und Davis, R., 1977, Science 196, 180; Grunstein, M. und Hogness, D., 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3961). Diejenigen DNA-Fragmente mit nennenswerter Homologie zur Sonde hybridisieren. Es ist auch möglich, das entsprechende Fragment durch Restriktionsenzymverdauung(en) zu identifizieren und die Fragmentgrößen mit denjenigen zu vergleichen, die nach einer bekannten Restriktionskarte, sofern verfügbar, erwartet werden. Eine weitere Selektion kann auf der Grundlage der Eigenschaften des Gens erfolgen. Alternativ kann das Vorliegen des Gens durch Tests auf der Basis der physikalischen, chemischen oder immunologischen Eigenschaften seines exprimierten Produkts nachgewiesen werden. Beispielsweise können cDNA-Klone oder DNA-Klone gewählt werden, die durch Hybridisierung die richtigen mRNAs selektieren, die ein Protein produzieren, das z. B. ein ähnliches oder identische elektrophoretische Migrations-, isoelektrisches Fokussierungsverhalten, proteolytische Verdau-Muster, in vitro Aggregationsaktivität ("Adhäsionsvermögen") oder Antigen-Eigenschaften, wie sie für Notch bekannt sind, aufweist. Wenn ein Antikörper auf Notch verfügbar ist, kann das Notch-Protein durch Binden des markierten Antikörpers an die vermeintlichen Notch-synthetisierenden Klone durch ein Verfahren vom Typ ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) identifiziert werden.
  • Das Notch-Gen kann auch durch mRNA-Selektion durch Nukleinsäure-Hybridisierung und anschließende in vivo Translation identifiziert werden. Bei diesem Verfahren werden Fragmente zur Isolierung komplementärer mRNAs durch Hybridisierung verwendet. Solche DNA-Fragmente können verfügbare, gereinigte Notch-DNA einer anderen Spezies (z. B. Drosophila) darstellen. Immunfällungsanalyse oder Funktionstests (z. B. Aggregationsvermögen in vitro; siehe Beispiele nachstehend) mit den in vitro Translationsprodukten der isolierten Produkte der isolierten mRNAs identifizieren die mRNA und darum die komplementären DNA-Fragmente, die die gewünschten Sequenzen enthalten. Zusätzlich können spezielle mRNAs durch Adsorption von aus Zellen isolierten Polysomen unter Immobilisierung von Antikörpern, die spezifisch gegen Notch- oder Deltaprotein gerichtet sind, selektiert werden. Eine radioaktiv markierte Notch-cDNA kann unter Verwendung der gewählten mRNA (aus den adsorbierten Polysomen) als Templat synthetisiert werden. Sodann kann die radioaktiv markierte mRNA oder cDNA als Sonde zur Identifizierung der Notch-DNA-Fragmente unter anderen genomischen DNA-Fragmenten verwendet werden.
  • Alternativen zur Isolierung der Notch-Genom-DNA umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, chemische Synthese der Gensequenz selbst aus einer bekannten Sequenz oder Überführen von cDNA in die mRNA, die das Notch-Gen codiert. Beispielsweise kann RNA zum cDNA-Klonieren des Notch-Gens aus Zellen, die Notch exprimieren, isoliert werden. Weitere Methoden sind möglich und liegen im Umfang der Erfindung.
  • Das identifizierte und isolierte Gen kann dann in einen geeigneten Klonierungsvektor inseriert werden. Eine große Anzahl aus der Technik bekannter Vektor-Wirt-Systeme kann verwendet werden. Mögliche Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Plasmide oder modifizierte Viren, allerdings muß das Vektorsystem mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Solche Vektoren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Bakteriophagen, wie Lambda-Derivate oder Plasmide, wie PBR322, oder pUC-Plasmidderivate. Die Insertion in einen Klonierungsvektor kann beispielsweise durch Ligation des DNA-Fragments in einem Klonierungsvektor, der komplementäre, klebrige Enden aufweist, erreicht werden. Wenn allerdings die komplementären, zur Fragmentierung der DNA verwendeten Restriktionsstellen nicht in dem Klonierungsvektor vorhanden sind, können die Enden der DNA-Moleküle enzymatisch modifiziert werden. Alternativ kann eine beliebige gewünschte Stelle durch Ligation von Nukleotidsequenzen (Linker) an die DNA-Termini produziert werden; diese ligierten Linker können spezielle chemisch synthetisierte Oligonukleotide enthalten, die Restriktionsendonuklease-Erkennungssequenzen codieren. Bei einem alternativen Verfahren, können der gespaltene Vektor und das Notch-Gen durch homopolymere Schwanzbildung modifiziert werden. Rekombinante Moleküle können über Transformation, Transfektion, Infektion, Elektroporation, etc. in Wirtszellen eingeschleust werden, so daß viele Kopien der Gensequenz erzeugt werden.
  • Bei einem alternativen Verfahren kann das gewünschte Gen identifiziert und nach Insertion in einen geeigneten Klonierungsvektor "shot gun"-artig isoliert werden. Die Anreicherung mit dem gewünschten Gen, beispielsweise durch Größenfraktionierung, kann vor der Insertion in den Klonierungsvektor erfolgen.
  • Bei speziellen Ausführungsformen ermöglicht die Transformation von Wirtszellen mit rekombinanten DNA-Molekülen, in die das isolierte Notch-Gen, die cDNA oder die synthetisierte DNA-Sequenz eingeschleust ist, die Erzeugung von Mehrfachkopien des Gens. Somit kann das Gen durch Züchten von Transformanten, Isolieren der rekombinanten DNA-Moleküle aus den Transformanten und wenn notwendig, Gewinnung des inserierten Gens aus der isolierten rekombinanten DNA in großen Mengen erhalten werden.
  • Die erfindungsgemäß bereitgestellten Notch-Sequenzen umfassen diejenigen Nukleotidsequenzen, die praktisch die gleichen Aminosäuresequenzen codieren, wie sie in nativem Notch- Protein vorkommen, und die codierten Aminosäuresequenzen mit funktionell equivalenten Aminosäuren, alles wie in Abschnitt 5.6, nachstehend für Notch-Derivate beschrieben.
    • 5.8 REKOMBINANTE HERSTELLUNG VON PROTEINTHERAPEUTIKA
  • Die Nukleinsäure, die ein erfindungsgemäßes Protein- Therapeutikum codiert, kann in einen geeigneten Expressionsvektor, das heißt, einen Vektor, der die zur Transkription und Translation der inserierten Protein-Kodierungssequenz notwendigen Elemente enthält, inseriert werden. Die notwendigen Transkriptions- und Translationssignale können auch von dem nativen toporhythmischen Gen und/oder seinen Flankierungsregionen bereitgestellt werden. Eine Vielzahl von Wirt- Vektor-Systemen kann zur Expression der Protein-codierenden Sequenz verwendet werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Säugerzellsysteme, die mit einem Virus infiziert worden sind (z. B. Vacciniavirus, Adenovirus, etc.); Insektenzellen, die mit einem Virus infiziert worden sind (z. B. Baculovirus); Mikroorganismen, wie Hefe, die Hefevektoren enthalten, oder Bakterien, die mit Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA transformiert worden sind. Die Expressionselemente von Vektoren variieren in ihrer Stärke und Spezifität. In Abhängigkeit von dem verwendeten Wirt-Vektor- System kann eine beliebige Anzahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden. Bei einer speziellen Ausführungsform wird der klebrige Teil des Notch- Gens, z. B. die codierenden EGF-artigen Sequenzwiederholungen (ELR)-11 und -12, exprimiert. Bei weiteren speziellen Ausführungsformen wird das menschliche Notch-Gen oder eine Sequenz, die einen funktionell aktiven Teil des menschlichen Notch codiert, exprimiert.
  • Jedes der zuvor zur Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor beschriebenen Verfahren kann zur Konstruktion von Expressionsvektoren angewandt werden, die ein chimäres Gen enthalten, bestehend aus geeigneten Transkriptions/Translations- Kontrollsignalen und den Protein-codierenden Sequenzen. Diese Verfahren können in vitro DNA-Rekombinationstechniken und Synthesetechniken und in vivo Rekombinationen (genetische Rekombination) einschließen. Die Expression einer Nukleinsäuresequenz, die ein Notch-Protein oder ein Peptidfragment codiert, kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz reguliert werden, so daß das Notch-Protein oder -Peptid in einem mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Wirt exprimiert wird. Beispielsweise kann die Expression eines Notch-Proteins durch ein beliebiges, aus der Technik bekanntes Promotor/Enhancer-Element kontrolliert werden. Promotoren, die zur Kontrolle der toporhythmischen Genexpression verwendet werden, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die frühe SV40- Promotorregion (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290, 304- 310), den Promotor, der in der langen 3'-terminalen Sequenzwiederholung des Rous-Sarcom-Virus enthalten ist (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22, 787-797), den Herpes-Thymidinkinase- Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78, 1441-1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., 1982, Nature 296, 39-42); die prokaryotischen Expressionsvektoren, wie der β-Lactamase- Promotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 3727-3731), oder den tac-Promotor (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80, 21-25); siehe auch "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American, 1980, 242, 74-94; pflanzliche Expressionsvektoren, die die Nopalinsynthetase-Promotorregion enthalten (Herrera-Estrella et al., Nature 303, 209-213) oder den Blumenkohlmosaikvirus-35S-RNA-Promotor (Gardner, et al., 1981, Nucl. Acids Res. 9, 2871) und den Promotor des Photosynthese- Enzyms Ribulosebiphosphatcarboxylase (Herrera-Estrella et al., 1984, Nature, 310, 115-120); Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen, wie der Gal-4-Promotor, der ADC (Alkoholdehydrogenase)-Promotor, der PGK (Phosphoglycerinkinase)- Promotor, der alkalische Phosphatasepromotor, und die folgenden tierischen Transkriptionskontrollregionen, die Gewebespezifität aufweisen und in transgenen Tieren eingesetzt werden: die Elastase-1-Genkontrollregion, die in pankreatischen Azinuszellen aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38, 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50, 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7, 425-515); Insulin-Gen-Kontrollregion, die in pankreatischen β-Zellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315, 115-122), Immunglobulin-Gen- Kontrollregion, die in Lymphoidzellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38, 647-658; Adames et al., 1985, Nature 318, 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 1436-1444), Maus-Mammatumorvirus-Kontrollregion, die in Hoden, Brust, Lymphoid und Mastzellen aktiv ist (Leder et al., 1986, Cell 45, 485-495), Albumin-Gen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes und Devel. 1, 268-276), Alpha-Fetoprotein-Gen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al. 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235, 53-58); Alpha-1- Antitrypsin-Gen-Kontrollregion, die in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes und Devel. 1, 161-171), β-Globin- Gen-Kontrollregion, die in Myeloidzellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315, 338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46, 89-94); Myelinbasisprotein-Gen-Kontrollregion, die in Oligodendrozytzellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48, 703-712); Myosin-leichte Kette 2-Gen-Kontrollregion, die im Skelettmuskel aktiv ist (Scani, 1985, Nature 314, 283-286) und Gonadotropinfreisetzungshormon-Gen- Kontrollregion, die im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234, 1372-1378).
  • Expressionsvektoren, die Notch-Gen-Insertionen enthalten, können durch drei Möglichkeiten identifiziert werden: (a) Nukleinsäure-Hybridisierung, (b) Vorliegen oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen und (c) Expression von inserierten Sequenzen. Bei der ersten Möglichkeit kann das Vorliegen eines in einen Expressionsvektor eingebauten Fremdgens durch Nukleinsäure-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden, die Sequenzen enthalten, die zu einem inserierten toporhythmischen Gen homolog sind. Bei der zweiten Möglichkeit kann das rekombinante Vektor/Wirtssystem auf der Basis des Vorliegens und Fehlens bestimmter "Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidinkinase-Aktivität, Antibiotika-Resistenz, Transformations-Phänotyp, Occlusionskörperbildung in Baculovirus, etc.), die durch die Insertion der Fremdgene in den Vektor verursacht werden, identifiziert und selektiert werden. Wenn beispielsweise das Notch-Gen in die Markergensequenz des Vektors inseriert wird, können Rekombinanten, die die Notch-Insertion enthalten, durch das Fehlen der Markergenfunktion identifiziert werden. Bei der dritten Möglichkeit können rekombinante Expressionsvektoren durch Testen des durch die Rekombinante exprimierten Fremdgenprodukts identifiziert werden. Solche Tests können beispielsweise auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Notch- Gen-Produkts in in vitro Testsystemen, z. B. Aggregations(Adhäsions)-Vermögen (siehe Abschnitt 6-7, nachstehend) beruhen.
  • Nach der Identifizierung und Isolierung eines bestimmten rekombinanten DNA-Moleküls können mehrere aus der Technik bekannte Verfahren zu seiner Propagation angewandt werden. Nach Einrichten eines geeigneten Wirtssystems und der Wachstumsbedingungen können rekombinante Expressionsvektoren propagiert und quantitativ hergestellt werden. Wie bereits erklärt, umfassen die Expressionsvektoren, die verwendet werden können, die folgenden Vektoren oder ihre Derivate, sind jedoch nicht darauf beschränkt: menschliche oder tierische Viren, wie Vacciniavirus oder Adenovirus; Insektenviren, wie Baculovirus; Hefevektoren; Bakteriophagenvektoren (z. B. Lambda) und Plasmid- und Cosmid-DNA-Vektoren, um nur einige zu nennen.
  • Zusätzlich kann ein Wirtszellenstamm gewählt werden, der die Expression der inserierten Sequenzen moduliert oder das Genprodukt in der speziellen gewünschten Weise modifiziert und weiter verarbeitet. Die Expression aus bestimmten Promotoren kann in Gegenwart bestimmter Induktoren gesteigert werden; somit kann die Expression von gentechnisch hergestelltem Notch-Protein kontrolliert werden. Außerdem haben verschiedene Wirtszellen charakteristische und spezielle Mechanismen für die Translations- und Posttranslationsverarbeitung und Modifikation (z. B. Glycosylierung, Spaltung) der Proteine. Geeignete Zell-Linien oder Wirtssysteme können zur Sicherstellung der gewünschten Modifikation und Weiterverarbeitung des exprimierten Fremdproteins gewählt werden. Beispielsweise kann die Expression in einem Bakteriensystem zur Produktion eines nicht glycosylierten Kernproteinprodukts angewandt werden. Die Expression in Hefe erzeugt ein glycosyliertes Produkt. Die Expression in Säugerzellen kann angewandt werden, um eine "native" Glycosylierung eines heterologen toporhythmischen Säugerproteins sicherzustellen. Außerdem können verschiedene Vektor/Wirtsexpressionssysteme Verarbeitungsreaktionen bewirken, wie proteolytische Spaltungen in unterschiedlichem Ausmaß.
  • Bei weiteren speziellen Ausführungsformen kann das Notch- Protein, das Fragment-Analoge oder Derivat als Fusionsprodukt oder chimäres Proteinprodukt, das das Protein, Fragment, Analoge oder Derivat enthält, das über eine Peptidbindung an eine heterologe Proteinsequenz (von einem unterschiedlichen Protein) gebunden worden ist, exprimiert werden. Ein solches chimäres Produkt kann durch Ligation der geeigneten Nukleinsäuresequenzen, die die gewünschten Aminosäuresequenzen miteinander codieren, durch aus der Technik bekannte Verfahren im richtigen Codierungsrahmen und Expression des chimären Produkts durch üblicherweise aus der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Alternativ kann ein solches chimäres Produkt durch Proteinsynthesetechniken hergestellt werden, z. B. unter Verwendung eines Peptidsynthesegerätes.
  • Sowohl cDNA- als Genomsequenzen können kloniert und exprimiert werden. Bei anderen Ausführungsformen kann eine Notch- cDNA-Sequenz chromosomal integriert und exprimiert werden. Aus der Technik bekannte homologe Rekombinationsverfahren können verwendet werden.
    • 5.8.1 IDENTIFIZIERUNG UND REINIGUNG DES EXPRIMIERTEN GENPRODUKTS
  • Nach Identifizierung einer Rekombinante, die die Notch-Gen- Sequenz exprimiert, kann das Genprodukt analysiert werden. Dies kann durch Tests auf der Basis der physikalischen oder funktionellen Eigenschaften des Produkts, einschließlich radioaktiver Markierung des Produkts und anschließende Analyse durch Genelektrophorese, erfolgen.
  • Nach der Identifizierung des Notch-Proteins kann es isoliert und durch Standardverfahren, einschließlich Chromatographie (z. B. Ionenaustausch-, Affinitätschromatographie und Größenausschlußsäulenchromatographie), Zentrifugation, differenzielle Löslichkeit, oder durch jedes andere Standardverfahren zur Reinigung von Proteinen, gereinigt werden. Die funktionellen Eigenschaften können unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Tests, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Aggregationstests (siehe Abschnitte 6-7) bewertet werden.
    • 5.9 DERIVATE UND ANALOGE VON NOTCH- UND ANDEREN TOPORHYTHMISCHEN PROTEINEN
  • Die Erfindung stellt weiterhin als Therapeutika Derivate (einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Fragmente) und Analoge von Notch-Proteinen bereit.
  • Die Produktion und Verwendung von mit Notch verwandten Derivaten und Analogen liegen im Umfang der Erfindung. Bei einer speziellen Ausführungsform ist das Derivat oder Analoge funktionell aktiv, das heißt, es kann eine oder mehrere funktionellen Aktivitäten aufweisen, die mit einem Vollängen-Wildtyp-Notch-Protein zusammenhängen. Als Beispiel können solche Derivate oder Analoge verwendet werden, die die gewünschte Antigenität, beispielsweise in diagnostischen Immuntests, wie in Abschnitt 5.3 beschrieben, aufweisen. Moleküle, die eine gewünschte Notch-Eigenschaft bewahren oder alternativ hemmen, z. B. die Bindung an Delta- oder an andere toporhythmische Proteine, Bindung an einen intrazellulären Liganden, können therapeutisch als Induktoren bzw. als Inhibitoren einer solchen Eigenschaft und seiner physiologischen Korrelierungen verwendet werden. Derivate oder Analoge von Notch können durch aus der Technik bekannte Verfahren, einschließlich der nachstehend beschriebenen Tests, jedoch nicht darauf beschränkt, auf die gewünschte Aktivität getestet werden. Bei einer speziellen Ausführungsform können Peptid-Bibliotheken zur Selektion eines Peptids mit der gewünschten Aktivität durchmustert werden. Eine solche Durchmusterung kann durch Testen, z. B. auf die Bindung an Notch, durchgeführt werden.
  • Insbesondere können Notch-Derivate durch Änderung der Notch- Sequenzen durch Substitutionen, Additionen oder Deletionen, die funktionell equivalente Moleküle bereitstellen, hergestellt werden. Aufgrund der Degeneration Nukleotid-codierender Sequenzen können andere DNA-Sequenzen, die praktisch die gleiche Aminosäuresequenz wie das Notch-Gen codieren, in der Praxis der Erfindung verwendet werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Nukleotidsequenzen, die alles oder Teile von Notch-Genen enthalten, die durch den Ersatz verschiedener Codons geändert worden sind, die einen funktionell equivalenten Aminosäurerest innerhalb der Sequenz codieren und so eine stumme Änderung erzeugen. Gleichermaßen umfassen die erfindungsgemäßen Notch-Derivate, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die als primäre Aminosäuresequenz alles oder ein Teil der Aminosäuresequenz eines Notch-Proteins enthalten, einschließlich geänderter Sequenzen, in denen funktionell equivalente Aminosäurereste durch Reste innerhalb der Sequenz, die eine stumme Änderung herbeiführen, ersetzt worden sind. Beispielsweise können eine oder mehrere Aminosäurereste in der Sequenz durch eine andere Aminosäure ähnlicher Polarität, die als funktionelles Äquivalent wirkt, ersetzt werden, was zu einer stummen Änderung führt. Ersatz-Aminosäuren für eine Aminosäure in der Sequenz können aus anderen Elementen der Klasse ausgewählt werden, der die Aminosäure angehört. Beispielsweise umfassen die nichtpolaren (hydrophoben) Aminosäuren Alanin, Leucin, Isoleucin, Valin, Prolin, Phenylalanin, Tryptophan und Methionin. Die polaren neutralen Aminosäuren umfassen Glycin, Serin, Threonin, Cystein, Tyrosin, Asparagin und Glutamin. Die positiv geladenen (basischen) Aminosäuren umfassen Arginin, Lysin und Histidin. Die negativ geladenen (sauren) Aminosäuren umfassen Aspartamsäure und Glutaminsäure.
  • Derivate oder Analoge von Notch umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen Peptide, die praktisch zu Notch oder zu Fragmenten hiervon homolog sind, oder deren codierende Nukleinsäure zur Hybridisierung an eine Notch-Nukleinsäuresequenz in der Lage ist.
  • Die erfindungsgemäßen Notch-Derivate und -Analoge können durch verschiedene aus der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Manipulationen, die zu ihrer Herstellung führen, können auf Gen- oder Proteinniveau erfolgen. Beispielsweise kann die klonierte Notch-Gen-Sequenz durch eine der zahlreichen, aus der Technik bekannten Strategien modifiziert werden (Maniatis. T., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Die Sequenz kann an geeigneten Stellen mit Restriktionsendonuklease(n) gespalten und anschließend, wenn gewünscht, enzymatisch modifiziert werden und isoliert und in vitro ligiert werden. Bei der Herstellung des Gens, das ein Derivat oder Analoges von Notch codiert, ist Vorsicht geboten, um zu sicherzustellen, daß das modifizierte Gen im gleichen Translationsleserahmen wie Notch, nicht von Translationsstoppsignalen unterbrochen, in der Genregion, in der die gewünschte Notch-Aktivität codiert wird, verbleibt.
  • Zusätzlich kann die Notch-codierende Nukleinsäuresequenz in vitro oder in vivo unter Erzeugung und/oder Zerstörung von Translations-, Start- und/oder Terminationssequenzen oder Erzeugung von Variationen in den codierenden Regionen und/oder Bildung neuer Restriktionsendonukleasestellen oder Zerstörung der bereits existierenden zur leichteren weiteren in vitro Modifikation, mutiert werden. Jede Technik, die aus der Technik zur Mutagenese bekannt ist, kann angewandt werden, einschließlich ortsgerichteter in vitro Mutagenese (Hutchinson, C., et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551), Verwendung von TAB®-Linkern (Pharmacia), etc., jedoch nicht darauf beschränkt.
  • Manipulationen der Notch-Sequenz können auch auf Protein- Niveau vorgenommen werden. Eingeschlossen im Umfang der Erfindung sind Notch-Proteinfragmente oder andere Derivate oder Analoge, die während oder nach der Translation, z. B. durch Glycosylierung, Acetylierung, Phosphorylierung, Amidierung, Derivatisierung durch bekannte Schutz/Blockierungsgruppen, proteolytsche Spaltung, Verknüpfung mit einem Antikörpermolekül oder einem anderen Zelliganden etc. differentiell modifiziert werden. Jede der zahlreichen chemischen Modifikationen kann durch bekannte Techniken, einschließlich spezifischer chemischer Spaltung durch Cyanogenbromid, Trypsin, Chymotrypsin, Papain, V8-Protease, NaBH&sub4;; Acetylierung, Formulierung, Oxidation, Reduktion; metabolischer Synthese in Gegenwart von Tunicamycin; etc., jedoch nicht darauf beschränkt, durchgeführt werden.
  • Zusätzlich können Analoge und Derivate von Notch chemisch synthetisiert werden. Beispielsweise kann ein Peptid, entsprechend einem Teil eines Notch-Proteins, das die gewünschte Domäne enthält oder das die gewünschte Aggregationsaktivität in vitro vermittelt, oder das an einen Rezeptor bindet, durch Verwendung eines Peptidsynthesegeräts synthetisiert werden. Wenn gewünscht, können außerdem nicht klassische Aminosäuren oder chemische Aminosäure-Analoge als Substitution oder Addition in die Notch-Sequenz eingebaut werden. Nicht klassische Aminosäuren umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, die D-Isomere der üblichen Aminosäuren, α-Aminoisobuttersäuren, 4-Aminobuttersäure, Hydroxyprolin, Sarcosin, Citrullin, Cysteinsäure, t-Butylglycin, t-Butylalanin, Phenylglycin, Cyclohexylalanin, β-Alanin, Designer-Aminosäuren, wie β-Methylaminosäuren, Cα-Methylaminosäuren und Nα-Methylaminosäuren.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform ist das Notch-Derivat ein chimäres Protein oder ein Fusionsprotein, das ein Notch- Protein oder ein Fragment hiervon enthält, das über eine Peptidbindung an seinem Amino- und/oder Carboxyterminus an eine Nicht-Notch-Aminosäuresequenz fusioniert ist. Bei einer Ausführungsform wird ein solches chimäres Protein durch rekombinante Expression einer Nukleinsäure, die das Protein (umfassend eine Notch-codierende Sequenz, die im Raster mit einer Nicht-Notch-codierender Sequenz verbunden ist) codiert, hergestellt. Ein solches chimäres Produkt kann durch Ligation der geeigneten Nukleinsäuresequenzen hergestellt werden, die die gewünschte Aminosäuresequenzen füreinander codieren, durch aus der Technik bekannte Verfahren im richtigen Codierungsraster und Expression des chimären Produkts durch aus der Technik allgemein bekannte Verfahren hergestellt werden. Alternativ kann ein solches chimäres Produkt durch Proteinsynthesetechniken hergestellt werden, z. B. Verwendung eines Peptidssynthesegerätes. Bei einer speziellen Ausführungsform wird eine chimäre Nukleinsäure, die ein reifes Notch-Protein mit einer heterologen Signalsequenz codiert, so exprimiert, daß das chimäre Protein exprimiert und durch die Zelle zum reifen Notch-Protein weiter verarbeitet wird. Als anderes Beispiel, jedoch nicht als Einschränkung, kann erfindungsgemäß ein rekombinantes Molekül konstruiert werden, das codierende Portionen von Notch und einem anderen toporhythmischen Genen, z. B. Delta, enthält. Das codierte Protein eines solchen rekombinanten Moleküls kann Eigenschaften aufweisen, die sowohl mit Notch als auch Delta in Verbindung stehen, und ein neues Profil von biologischen Aktivitäten porträtieren, einschließlich Agonisten und Antagonisten. Die Primärsequenz von Notch und Delta kann auch zur Vorhersage der Tertiärstruktur der Moleküle unter Anwendung von Computersimulation eingesetzt werden (Hopp und Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 3824-3828); chimäre Notch/Delta-Rekombinationsgene können im Hinblick auf die Korrelationen zwischen Tertiärstruktur und biologischer Funktion entworfen werden. Gleichermaßen können chimäre Gene, die Teile von Notch enthalten, die mit einer heterologen (Nicht-Notch)-Protein-codierenden Sequenz fusioniert sind, konstruiert werden. Eine spezielle Ausführungsform betrifft ein chimäres Protein, das ein Fragment von Notch mit mindestens sechs Aminosäuren enthält.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform ist das Notch-Derivat ein Notch-Fragment, das mit einem anderen toporhythmischen Protein eine homologe Region aufweist. Wie hier verwendet, soll eine Region eines ersten Proteins als "homolog" mit einem zweiten Protein angesehen werden, wenn die Aminosäuresequenz der Region zu mindestens 30% identisch ist oder zu mindestens 75% entweder identisch ist oder im Vergleich zu einer Sequenz im zweiten Protein mit einer gleichen Anzahl von Aminosäuren, wie die Anzahl, die in der Region enthalten ist, konservative Änderungen aufweist.
    • 5.9.1 DERIVATE VON NOTCH, DIE EINE ODER MEHRERE DOMÄNEN DES PROTEINS ENTHALTEN
  • Bei einer speziellen Ausführungsform stellt die Erfindung Therapeutika bereit, die Notch-Derivate und Analoge sind, insbesondere Notch-Fragmente und -Derivate von solchen Fragmenten, die eine oder mehrere Domänen des Notch-Proteins enthalten, einschließlich der extrazellulären Domäne, Transmembrandomäne, intrazellulären Domäne, Membran-assoziierten Region, einer oder mehrerer der EGF-artigen Sequenzwiederholungen (ELR) des Notch-Proteins, der cdc10-Sequenzwiederholungen und der Notch/lin-12-Sequenzwiederholungen, jedoch nicht darauf beschränkt. Bei speziellen Ausführungsformen können dem Notch-Derivat alle oder ein Teil der ELRs oder eine oder mehrere andere Regionen des Proteins fehlen.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform, bezüglich eines Notch- Proteins, einer Spezies, die anders als D. Melanogaster und vorzugsweise menschlich ist, sind Fragmente, die spezielle Teile von Notch enthalten, diejenigen Fragmente, die in dem entsprechenden Notch-Protein Teile enthalten, die zu speziellen Fragmenten des Drosophila-Notch-Proteins (z. B. ELR-11 und ELR-12) besonders homolog sind.
    • 5.9.2 DERIVATE VON NOTCH ODER ANDERE TOPORHYTHMISCHE PROTEINE, DIE DIE BINDUNG AN TOPORHYTHMISCHE PROTEINDOMÄNEN VERMITTELN, UND INHIBITOREN HIERFÜR
  • Die Erfindung stellt auch Notch-Fragmente und Analoge oder Derivate solcher Fragmente bereit, die die Bindung an toporhythmische Proteine vermitteln (und somit hier als "klebend" bezeichnet werden), und Nukleinsäuresequenzen die die Vorgenannten codieren.
  • Ebenfalls als erfindungsgemäße Therapeutika eingeschlossen, sind Inhibitoren (z. B. Peptid-Inhibitoren) der vorgenannten toporhythmischen Protein-Wechselwirkungen mit Notch.
  • Die Fähigkeit zur Bindung an ein toporhythmisches Protein kann durch in vitro Aggregationstests mit Zellen gezeigt werden, die ein solches toporhythmisches Protein exprimieren, sowie Zellen die Notch oder ein Notch-Derivat exprimieren (siehe Abschnitt 6). Das heißt, die Fähigkeit eines Proteinfragments zur Bindung an ein Notch-Protein kann durch Nachweis der Fähigkeit des Fragments gezeigt werden, bei Expresseion auf der Oberfläche einer ersten Zelle an ein Notch- Protein zu binden, das auf der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiert wird. Inhibitoren der vorgenannten Wechselwirkungen können durch ihre Fähigkeit zur Hemmung einer solchen Aggregation in vitro nachgewiesen werden.
  • Die Nukleinsäuresequenzen, die toporhythmische Proteine oder die klebenden Domänen hiervon codieren, können aus Menschen, Schweinen, Rindern, Katzen, Vögeln, Pferden, Hunden oder Insekten, sowie Primatenquellen und aus jeder anderen Spezies isoliert werden, bei denen Homologe bekannter toporhythmischer Gene identifiziert werden können.
  • Bei einer speziellen Ausführungsform ist das klebende Fragment von Notch dasjenige, das den Teil von Notch enthält, der zu ELR-11 und ELR-12 besonders homolog ist, das heißt zu den Aminosäuren mit den Nummern 447 bis 527 (SEQ ID NO: 14) der Drosophila-Notch-Sequenz (siehe Fig. 4).
  • Auf Grund der Degeneration der Nukleotid-codierenden Sequenz können andere DNA-Sequenzen, die im wesentlichen die gleiche Aminosäuresequenz codieren wie die Adhäsionssequenzen, in der Praxis der Erfindung eingesetzt werden. Diese umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Nukleotidseguenzen, die alles oder Teile des Notch enthalten, die durch Ersatz verschiedener Codons, die einen funktionell äquivalenten Aminosäurerest innerhalb der Sequenz codieren und somit eine stumme Änderung erzeugen, geändert wurden. Gleichermaßen umfassen die erfindungsgemäßen klebenden Proteinfragmente oder Derivate hiervon, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen, die als primäre Aminosäuresequenz alles oder einen Teil der Aminosäuresequenz der klebenden Domänen enthalten, einschließlich geänderter Sequenzen, in denen die Reste innerhalb der Sequenz durch funktionell äquivalente Aminosäurereste ersetzt worden sind, was zu einer stummen Änderung führt.
  • Klebende Fragmente toporhythmischer Proteine und potentielle Derivate, Analoge oder Peptide, die mit klebenden toporhythmischen Proteinsequenzen verwandt sind, können auf die gewünschte Bindungsaktivität getestet werden, z. B. durch die in den folgenden Beispielen beschriebenen in vitro Aggregationstests. Klebende Derivate oder klebende Analoge von klebenden Fragmenten toporhythmischer Proteine umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, diejenigen Peptide, die im wesentlichen zu den klebenden Fragmenten homolog sind oder deren codierende Nukleinsäure in der Lage ist, mit der Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, die die klebenden Fragmente codiert, und wobei Peptide und Peptidanaloge positive Bindungsaktivität aufweisen, z. B. wie in vitro durch einen Aggregationstest, wie nachstehend in den Abschnitten für die Beispiele beschrieben, getestet. Solche Derivate und Analoge werden als Therapeutika in Betracht gezogen und liegen im Umfang der Erfindung.
  • Die mit dem Adhäsionsprotein verwandten erfindungsgemäßen Derivate, Analoge und Peptide können durch verschiedene, aus der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Die Manipulationen, die zu ihrer Herstellung führen, können auf dem Gen- oder Proteinniveau erfolgen (siehe Abschnitt 5.6).
  • Zusätzlich können die Adhäsionsprotein-codierenden Nukleinsäuresequenzen in vitro oder in vivo mutiert werden; und Manipulationen an der klebenden Sequenz können ebenfalls auf Proteinniveau vorgenommen werden (siehe Abschnitt 5.6).
  • Zusätzlich können Analoge und Peptide, die mit den klebenden Fragmenten verwandt sind, chemisch synthetisiert werden.
    • 5.10 TESTS VON NOTCH-PROTEINEN, -DERIVATEN UND -ANALOGEN
  • Die in vitro Aktivität von Notch-Proteinen, -Derivaten und -Analogen und anderen toporhythmischen Proteinen, die an Notch binden, kann durch verschiedene Verfahren getestet werden.
  • Bei einer Ausführungsform, wobei die Fähigkeit zur Bindung oder zur Konkurrenz mit Wild-Typ-Notch und die Bindung an Anti-Notch-Antikörper getestet wird, können verschiedene, aus der Technik bekannte Immuntests eingesetzt werden, einschließlich kompetitiver und nicht kompetitiver Testsysteme, unter Anwendung von Techniken, wie Radioimmuntests, ELISA (enzyme linked Immunosorbent assay), "Sandwich"-Immuntests, Immunradiometrie-Tests, Geldiffusionfällungsreaktionen, Immundiffusionstests, in situ Immuntests (unter Verwendung beispielsweise von kolloidalem Gold, enzymatischer oder Radioisotopen-Markierung), Western-Blots, Fällungsreaktionen, Agglutinationstests (z. B. Gelagglutinationstests, Hämagglutinationstests), Komplementfixierungstests, Immunfluoreszenztests, Protein-A-Tests und Immunelektrophoresetests, etc., jedoch nicht darauf beschränkt. Bei einer Ausführungsform wird die Antikörperbindung durch Nachweis einer Markierung auf dem primären Antikörper nachgewiesen. Bei einer anderen Ausführungsform wird der primäre Antikörper durch Nachweis der Bindung eines sekundären Antikörpers oder Reagenz an den primären Antikörper nachgewiesen. Bei einer weiteren Ausführungsform wird der sekundäre Antikörper markiert. Aus der Technik sind viele Mittel zum Nachweis der Bindung bei einem Immuntest bekannt und liegen im Umfang der Erfindung.
  • Bei einer anderen Ausführungsform, wobei die Fähigkeit zur Vermittlung der Bindung an Notch getestet wird, kann ein in vitro Aggregationstest durchgeführt werden, wie infra in Abschnitt 6 oder 7 beschrieben (siehe auch Fehon et al., 1990, Cell 61: 523-534; Rebay et al., 1991, Cell 67: 687-699).
  • Bei einer anderen Ausführungsform, wobei ein anderer Ligand für Notch identifiziert wird, kann die Ligandenbindung getestet werden, z. B. durch aus der Technik gut bekannte Bindungstests. Bei einer anderen Ausführungsform können physiologische Korrelate von Ligandenbindung an Zellen, die einen Notch-Rezeptor exprimieren, (Signaltransduktion) getestet werden.
  • Bei einer anderen Ausführungsform in einem Insekten- oder einem anderen Modellsystem können genetische Studien zum Studium des phänotypischen Effekts einer Notch-Mutante, die ein Derivat oder Analoges von Wild-Typ-Notch ist, vorgenommen werden.
  • Weitere Verfahren sind dem Fachmann bekannt und liegen im Umfang der Erfindung.
    • 5.11 ANTIKÖRPER AUF NOTCH-PROTEINE, -DERIVATE UND -ANALOGE
  • Bei einer Ausführungsform der Erfindung sind Antikörper und Fragmente, die die gegen Notch gerichtete Bindungsdomäne hiervon enthalten, Therapeutika. Demnach können Notch- Proteine, Fragmente oder Analoge oder Derivate hiervon, insbesondere menschliche Notch-Proteine oder Fragmente hiervon, als immunogene Erzeugung von Anti-Notch-Proteinantikörpern verwendet werden. Solche Antikörper können polyklonal, monoklonal, chimär, einzelkettig, Fab-Fragmente sein oder aus einer Fab-Expressionsbibliothek stammen. Bei einer speziellen Ausführungsform können Antikörper, die auf die EGF-artigen Sequenzwiederholungen 11 und 12, von Notch spezifisch sind, produziert werden. Bei anderen Ausführungsformen können Antiköper, die mit der extrazellulären Domäne von Notch reaktiv sind, produziert werden. Ein Beispiel für solche Antikörper kann die Aggregation bei einem in vitro Test verhindern. Bei einer anderen Ausführungsform werden Antikörper, die auf menschliches Notch spezifisch sind, produziert.
  • Verschiedene, aus der Technik bekannte Verfahrensweisen können zur Produktion von polyklonalen Antikörpern auf ein Notch-Protein oder -Peptid angewandt werden. Bei einer besonderen Ausführungsform können polyklonale Kaninchen-Antikörper auf ein Epitop des menschlichen Notch-Proteins, das von einer in Fig. 10 oder 11 abgebildeten Sequenz oder einer Untersequenz hiervon codiert wird, erhalten werden. Zur Produktion von Antikörpern können verschiedene Wirtstiere durch Injektion mit dem nativen Notch-Protein oder einer synthetischen Version oder einem Fragment hiervon immunisiert werden, einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf, Kaninchen, Mäuse, Ratten, etc. Verschiedene Hilfsstoffe können zur Steigerung der Immunantwort in Abhängigkeit von der Wirtsspezies verwendet werden und umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf, Freund Medium (komplett und inkomplett), mineralische Gele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic-Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schloß-und-Schlüssel-Hämocyanine, Dinitrophenol und potentiell geeignete menschliche Hilfsstoffe, wie BCG (Bacillus Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
  • Zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern, die gegen eine Notch-Proteinsequenz gerichtet sind, kann jede Technik eingesetzt werden, die die Produktion von Antikörpermolekülen durch kontinuierliche Zell-Linien in Kultur bereitstellt; beispielsweise die Hybridomtechnik, die ursprünglich von Kohler und Milstein entwickelt wurde (1975, Nature 256, 495- 497), sowie die Triomtechnik, die menschliche B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4, 72) und die EBV-Hybridomtechnik zur Produktion von menschlichen monoklonalen Antikörpern (Cole et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., Ss. 77-96).
  • Antikörperfragmente, die den Idiotyp (Bindungsdomäne) des Moleküls enthalten, können durch bekannte Techniken erzeugt werden. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, sind jedoch nicht beschränkt auf, das F(ab')&sub2;-Fragment, das durch Pepsinverdau des Antikörpermoleküls erzeugt werden kann; die Fab'- Fragmente, die durch eine Verminderung der Disulfidbrücken des F(ab')&sub2;-Fragments erzeugt werden können, und die Fab- Fragmente, die durch Behandeln des Antikörpermoleküls mit Papain und einem Reduktionsmittel erzeugt werden können.
  • Bei der Produktion von Antikörpern kann die Durchmusterung auf den gewünschten Antikörper, durch aus der Technik bekannte Verfahren erreicht werden, z. B. ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Beispielsweise können zur Selektion von Antikörpern, die die klebende Domäne eines Notch-Proteins erkennen, erzeugte Hybridome auf ein Produkt getestet werden, das an ein Proteinfragment bindet, das eine solche Domäne enthält. Zur Selektion eines auf menschliches Notch spezifischen Antikörpers kann ein Antikörper auf der Grundlage der positiven Bindung an menschliches Notch und einer fehlenden Bindung an Drosophila-Notch gewählt werden.
  • Zusätzlich zur therapeutischen Brauchbarkeit besitzen die vorgenannten Antikörper Brauchbarkeit bei diagnostischen Immuntests, wie in Abschnitt 5.6 vorstehend beschrieben.
  • Ähnliche Verfahren wie diejenigen, die vorstehend beschrieben worden sind, können zur Herstellung von Therapeutika angewandt werden, die Antiköper auf Domänen anderer Proteine (insbesondere toporhythmischer Proteine) sind, die an Notch binden oder anderweitig mit Notch wechselwirken (z. B. klebende Fragmente von Delta oder Serrate).
    • 6. DOMÄNEN VON NOTCH VERMITTELN DIE BINDUNG MIT DELTA
  • Die intermolekulare Assoziation zwischen den Produkten der Notch- und Delta-Gene wurde durch das Studium der Wirkungen ihrer Expression auf die Aggregation in Drosophila-Schneider- 2(52)-Zellen (Fehon et al., 1990, Cell 61, 523-534) nachgewiesen. Ein direkter Nachweis der intermolekularen Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta sowie ein Testsystem, das zur Zerlegung der erfindungsgemäßen Komponenten angewandt werden kann, ist hier beschrieben. Normalerweise binden nicht klebende Drosophila-52-Kulturzellen, die Notch exprimieren, spezifisch Calcium-abhängig an Zellen, die Delta exprimieren.
  • Während Zellen, die Notch exprimieren, nicht aneinander binden, binden Zellen, die Delta exprimieren, doch aneinander, was zudem nahe legt, daß Notch und Delta um die Bindung an Delta an der Zelloberfläche konkurrieren können. Notch und Delta bilden sowohl in Kulturzellen als auch embryonalen Zellen Detergenz-lösliche Komplexe, was nahe legt, daß Notch und Delta direkt auf molekularem Niveau in vitro und in vivo wechselwirken. Die Analysen legen nahe, daß Notch- und Delta- Proteine an der Zelloberfläche über ihre extrazellulären Domänen wechselwirken.
    • 6.1 EXMPERIMENTELLE VERFAHREN 6.1.1 EXPRESSIONSKONSTRUKTE
  • Expressionskonstrukte sind bei Fehon et al., 1990, Cell 61: 523-534, beschrieben. Kurz gesagt wurde Notch, das durch das MgIIa-Miniaturgen, ein cDNA/Genom-Chimärkonstrukt, (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337-348) codiert wurde, exprimiert und anschließend in pRmHa-3 inseriert (Bunch, et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16, 1043-1061). In dem resultierenden Konstrukt, das mit pMtNMg bezeichnet wurde, ist der Metallothionein-Promotor in pRmHa-3 an die Notch-Sequenzen, ausgehend 20 Nukleotide, stromaufwärts der Translationsstartstelle fusioniert.
  • Das extrazelluläre Notch-Konstrukt (ECN1) wurde von einem Notch-Cosmid abgeleitet (Ramos et al., 1989, Genetics 123, 337-348) und weist eine interne Deletion der Notch-codierenden Sequenzen von Aminosäure 1790 bis einschließlich 2625 (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581) und eine vorhergesagte Rahmenverschiebung, die einen neuen 59 Aminosäurecarboxyl-Terminus erzeugt, auf.
  • Für das Delta-Expressionskonstrukt, wurde die D11-cDNA (Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735; Fig. 1; SEQ ID NO: 1), die die vollständige Kodierungskapazität für Delta enthält, in die EcoRI-Stelle von pRmHa-3 inseriert. Dieses Konstrukt wurde pMTDI1 genannt.
    • 6.1.2 ANTIKÖRPER HERSTELLUNG
  • Die Hybridomzellinie C17.9C6 wurde aus Mäusen erhalten, die mit einem Fusionsprotein auf der Basis eines 2,1 kb-SaII- HindIII-Fragments immunisiert wurden, das die Kodierungssequenzen für den größten Teils der intrazellulären Domäne von Notch (Aminosäuren 1791-2504; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581) enthält. Das Fragment wurde in pUR289 subkloniert (Ruther und Muller-Hill, 1983, EMBO J. 2, 1791-1794) und anschließend in den pATH1-Expressionsvektor (Dieckmann und Tzagoloff, 1985, J. Biol. Chem. 260, 1513-1520) als BgIII- HindIII-Fragment transferiert. Lösliches Fusionsprotein wurde exprimiert mit 25% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gefällt, in 6 M Harnstoff resuspendiert und durch präparative isoelektrische Fokussierung unter Verwendung eines Rotofor (Bio-Rad) (ausführliche Angaben, siehe Fehon, 1989, Rotofor Review No. 7, Bulletin 1518, Richmond, California; Bio-Rad Laboratories) gereinigt.
  • Polyklonale Maus-Antiseren wurden gegen die extrazelluläre Domäne von Notch unter Verwendung von vier BstY1-Fragmenten einer Länge von 08 kb (Aminosäuren 237-501; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581), 1,1 kb (Aminosäuren 501-868), 0,99 kb (Aminosäuren 868-1200) und 1,4 kb (Aminosäuren 1465-1935), die sich von der fünften EGF-artigen Sequenzwiederholung über die Transmembrandomäne erstreckten, und einzeln rahmenkonform in den geeigneten pGEX-Expressionsvektor inseriert wurden (Smith und Johnson, 1988, Gene 67, 31-40), hergestellt. Die Fusionsproteine wurden über Glutathionagaroseperlen (SIGMA) gereinigt. Die Maus- und Ratten-Antiseren wurden mit 50% (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; gefällt und in PBS (150 mM NaCl, 14 mM Na&sub2;HPO&sub4;, 6 mM NaH&sub2;PO&sub4;) mit 0,02% NaN&sub3; resuspendiert.
  • Die Hybridomzellinie 201 wurde aus einer Maus erhalten, die mit einem Fusionsprotein immunisiert war, das Codierungssequenzen aus der extrazellulären Domäne von Delta (Kopczynski et al., 1988, Genes Dev. 2, 1723-1735), einschließlich Sequenzen, die von der vierten bis zur neunten EGF-artigen Sequenzwiederholung in Delta verlaufen (Aminosäuren 350-529), enthält.
  • Die polyklonalen Ratten-Antiseren wurden nach Immunisierung mit Antigen erhalten, das aus dem gleichen Fusionsproteinkonstrukt stammte. In diesem Fall wurde das Fusionsprotein durch Lyse IPTG-induzierte Zellen in SDS-Laemmli-Puffer hergestellt (Carroll und Laughon, 1987, in DNA Cloning, Band III, D. M. Glover, Hrsg. (Oxford: IRL Press), Ss. 89-111), die Proteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt, die entsprechenden Banden wurden aus dem Gel ausgeschnitten und das Antigen aus der Gelscheibe zur Verwendung bei der Immunisierung elektroeluiert (Harlow und Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory)).
    • 6.1.3 ZELLKULTUR UND TRANSFEKTION
  • Die 52-Zell-Linie (Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365) wurde in M3-Medium (hergestellt von Hazleton Co.), angereichert mit 2,5 mg/ml Bacto-Pepton (Difco), 1 mg/ml TC Yeastolate (Difco), 11% wärmeinaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS) (Hyklone) und 100 U/ml Penizillin, 100 ug/ml Streptomycin-0,25 ug/ml Fungizone (Hazelton), gezüchtet. Zellen, die in der Log-Phase bei ca. 2 · 10&sup6;-Zellen/ml wachsen, wurden mit 20 ug DNA-Calciumphosphat-Kopräzipitat in 1 ml/5 ml Kultur, wie bereits beschrieben (Wigler et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 1373-1376), mit der Ausnahme, daß BES-Puffer (SIGMA) anstelle von HEPES-Puffer (Chen und Okayama, 1987, Mol. Cell. Biol. 7, 2745-2752) verwendet wurde, transfiziert. Nach 16-18 h wurden die Zellen in konische Zentrifugenröhrchen übergeführt, in einer klinischen Zentrifuge bei höchster Geschwindigkeit 30 s pelletiert, einmal mit 1/4 Volumen frischem Komplettmedium gespült in ihrem Originalvolumen an Komplettmedium resuspendiert und wieder in den Originalkolben übergeführt. Die transfizierten Zellen wurden dann vor der Inkubation 24 h ruhen gelassen.
    • 6.1.4 AGGREGATIONSTESTS
  • Die Expression der Notch- und Delta-Metallothionein-Konstrukte wurde durch die Zugabe von CuSO&sub4; bis auf 0,7 mM induziert. Zellen, die mit dem ECN1-Konstrukt transfiziert worden sind, wurden ähnlich behandelt. Die Zellen wurden anschließend gemischt, unter Aggregationsbedingungen inkubiert und unter Verwendung spezifischer Antiseren und Immunfluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung exprimierender Zellen auf ihre Fähigkeit zur Aggregation bewertet.
  • Zwei Typen von Aggregationstests wurden angewandt. Beim ersten Test wurden insgesamt 3 ml Zellen (5-10 · 10&sup6;&supmin; Zellen/ml) in einen 25-ml-Erlenmeyerkolben vorgelegt und bei 40 bis 50 u/min auf einem Rotationsschüttler 24-48 h bei Raumtemperatur rotiert. Für diese Experimente wurden die Zellen 1 -4 h nach Induktionsbeginn gemischt, und die Induktion wurde während der gesamten Aggregationsdauer fortgesetzt. Im zweiten Test wurden ca. 0,6 ml Zellen nach einer Über-Nacht-Induktion (12-16 h) bei Raumtemperatur in ein 0,6-ml-Eppendorfröhrchen (wobei eine kleine Luftblase zurückblieb) gegeben und vorsichtig 1-2 h bei 4ºC hin und her geschüttelt. Die Antikörper-Hemmungs- und Ca²&spplus;-Abhängigkeitsexperimente wurden unter Anwendung von letzterem Test durchgeführt. Für die Ca²&spplus;-Abhängigkeitsexperimente wurden die Zellen zuerst gesammelt und in ausgewogener Salzlösung (BSS) mit 11% FCS (BSS-FCS; FCS wurde gegen 0,9% NaCl, 5 mM-Tris [pH 7,5] dialysiert) oder in Ca²&spplus;-freiem BSS-FCS, das 10 mM EGTA enthielt (Snow et al., 1989, Cell 59, 313-323), gespült und dann im gleichen Medium bis zum ursprünglichen Volumen resuspendiert. Für die Antiköper-Hemmungsexperimente wurden die Notch- transfizierten Zellen gesammelt und in M3-Medium gespült und so dann vor der Aggregation in M3-Medium 1 h bei 4ºC mit einer 1 : 250-Verdünnung von Immun- oder Präimmunserum aus jedem der vier Mäuse, die mit Fusionsproteinen, die Segmente aus der extrazellulären Domäne von Notch enthielten (siehe Antikörperherstellung vorstehend), immunisiert worden sind, behandelt.
    • 6.1.5 IMMUNFLUORESZENZ
  • Die Zellen wurden durch Zentrifugation (3000 U/min für 20 s in einer Eppendorf-Mikrozentrifuge) gesammelt und in 0,6-ml- Eppendorfröhrchen mit 0,5 ml frisch hergestelltem 2% Paraformaldehyd in PBS 10 min bei Raumtemperatur fixiert. Nach dem Fixieren wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, zweimal in PBS gespült und 1 h mit primärem Antikörper in PBS mit 0,1% Saponin (SIGMA) und 1% normalem Ziegenserum (Pocono Rabbit Farm. Canadensis. PA) angefärbt. Monoklonale Antikörper-Überstände wurden 1 : 10 verdünnt, und Maus- oder Rattenserum wurde für diesen Schritt 1 : 1000 verdünnt. Die Zellen wurden dann einmal in PBS gespült und 1 h mit speziellen sekundären Antikörpern (Ziegen-Anti-Maus- und Ziegen- Anti-Ratten-Antikörper von Doppelmarkierungsqualität, Jackson Immunoresearch) in normalem PBS-Saponin-Ziegenserum angefärbt. Nach dieser Inkubation wurden die Zellen zweimal in PBS gespült und in 90% Glycerin, 10% 1M-Tris (pH 8,0) und 0,5% n-Propylgallat auf Deckgläser aufgebracht. Die Zellen wurden unter Epifluoreszenz auf einem Leitz-Orthoplan-2- Mikroskop betrachtet.
  • Konfokale Mikrographien wurden unter Verwendung des Bio-Rad MRC 500-Systems aufgenommen, das mit einem Zeiss Axiovert- Verbindungsmikroskop gekoppelt war. Die Bilder wurden unter Verwendung der BHS und GHS-Filterserien gesammelt, die unter Verwendung des ALIGN-Programms ausgerichtet und unter Verwendung von MERGE zusammengeführt wurden. Fluoreszenz-Ausbluten aus dem grünen in den roten Kanal wurde unter Verwendung des BLEED-Programms (sämtliche Software bereitgestellt von Bio- Rad) vermindert. Die Fotografien wurden direkt auf dem Computermonitor unter Verwendung eines Kodak Ektar 125-Films erhalten.
    • 6.1.6 ZELLLYSATE, IMMUNFÄLLUNGEN UND WESTERN-BLOTS
  • Nicht denaturierende Detergens-Lysate von Gewebekulturen und Wild-Typ-Canton-S-Embryonen wurden auf Eis in ca. 10 Zellvolumen Lysepuffer (300 mM NaCl, 50 mM Tris [pH 8,0], 0,5% NP- 40, 0,5% Deoxycholat, 1 mM CaCl&sub2;, 1 mM MgCl&sub2;) mit 1 mM Phenylmethysulfonylfluorid (PMSF) und Diisopropylfluorphosphat, verdünnt 1 : 2500, als Proteaseinhibitoren, hergestellt. Die Lysate wurden unter Verwendung von 18G, 21G und 25G Nadeln, die an 1 cc-Tuberkulinspritzen angeschlossen waren, nach und nach verrieben und anschließend bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge 10 min bei 4ºC zur Entfernung von unlöslichem Material zentrifugiert. Die Immunfällung wurde durch Zugabe von ca. 1 ug Antikörper (1-2 ul polyklonales Antiserum) zu 250-500 ul Zelllysat und Inkubation für 1 h bei 4ºC unter Rühren durchgeführt. Diesem Gemisch wurden 15 ug Ziegen-Antimaus-Antikörper (Jackson Immunoresearch; diese Antikörper erkennen sowohl Maus- als auch Ratten-IgG) zugesetzt und man ließ 1 h bei 4ºC unter Rühren inkubieren. Hierauf folgt die Zugabe von 100 ul fixierten Staphylococcus aureus (Staph A)-Bakterien (Zysorbin, Zymed; resuspendiert nach den Anleitungen des Herstellers), die gesammelt, fünfmal in Lysepuffer gewaschen und noch 1 h inkubiert worden waren. Die Staph A-Antikörperkomplexe wurden dann durch Zentrifugation pelletiert und dreimal in Lysepuffer gewaschen, gefolgt von zwei 15 min-Waschvorgängen in Lysepuffer. Nach der Überführung in ein neues Röhrchen wurde das ausgefällte Material in 50 ul SDS-PAGE-Probenpuffer suspendiert, sofort 10 min gekocht, auf 3- bis 15%-igen Gradientengelen laufen gelassen, auf Nitrocellulose geblottet und unter Verwendung monoklonaler Antikörper und HRP-konjugierter, sekundärer Ziegen-Anti- Maus-Antikörper, wie bereits beschrieben (Johansen et al., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440), nachgewiesen. Für die Gesamtzellproteinproben, die aus den Western-Blots verwendet wurden, wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in 10 Zellvolumina Probenpuffer, der 1 mM PMSF enthielt, lysiert und sofort gekocht.
  • nach verrieben und anschließend bei voller Geschwindigkeit in einer Mikrozentrifuge 10 min bei 4ºC zur Entfernung von unlöslichem Material zentrifugiert. Die Immunfällung wurde durch Zugabe von ca. 1 ug Antikörper (1-2 ul polyklonales Antiserum) zu 250-500 ul Zelllysat und Inkubation für 1 h bei 4ºC unter Rühren durchgeführt. Diesem Gemisch wurden 15 ug Ziegen-Antimaus-Antikörper (Jackson Immunoresearch; diese Antikörper erkennen sowohl Maus- als auch Ratten-IgG) zugesetzt und man ließ 1 h bei 4ºC unter Rühren inkubieren. Hierauf folgt die Zugabe von 100 ul fixierten Staphylococcus aureus (Staph A)-Bakterien (Zysorbin, Zymed; resuspendiert nach den Anleitungen des Herstellers), die gesammelt, fünfmal in Lysepuffer gewaschen und noch 1 h inkubiert worden waren. Die Staph A-Antikörperkomplexe wurden dann durch Zentrifugation pelletiert und dreimal in Lysepuffer gewaschen, gefolgt von zwei 15 min-Waschvorgängen in Lysepuffer. Nach der Überführung in ein neues Röhrchen wurde das ausgefällte Material in 50 ul SDS-PAGE-Probenpuffer suspendiert, sofort 10 min gekocht, auf 3- bis 15%-igen Gradientengelen laufen gelassen, auf Nitrocellulose geblottet und unter Verwendung monoklonaler Antikörper und HRP-konjugierter, sekundärer Ziegen-Anti- Maus-Antikörper, wie bereits beschrieben (Johansen et al., 1989, J. Cell Biol. 109, 2427-2440), nachgewiesen. Für die Gesamtzellproteinproben, die aus den Western-Blots verwendet wurden, wurden die Zellen durch Zentrifugation gesammelt, in 10 Zellvolumina Probenpuffer, der 1 mM PMSF enthielt, lysiert und sofort gekocht.
    • 6.2 ERGEBNISSE 6.2.1 DIE EXPRESSION VON NOTCH UND DELTA IN KULTIVIERTEN ZELLEN
  • Zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta überprüften wir das Verhalten der Zellen, die diese Proteine auf ihren Oberflächen exprimieren, unter Anwendung eines Aggregationstests. Für diese Studien wählten wir die S2-Zelllinie (Schneider, 1972, J. Embryol. Exp. Morph. 27, 353-365). S2-Zellen exprimieren eine anormale Notch-Botschaft und kein nachweisbares Notch, aufgrund einer Umlagerung des 5'-Endes der Notch-codierenden Sequenz. Diese Zellen exprimieren auch kein nachweisbares Delta.
  • Die Ergebnisse des Western-Blot und der Immunfluoreszenzanalyse zeigten eindeutig, daß die Notch- und Delta-Konstrukte die Expression von Proteinen der erwarteten Größen und subzellulären Lokalisation unterstützen.
    • 6.2.2 ZELLEN, DIE NOTCH UND DELTA EXPRIMIEREN AGGREGIEREN
  • Ein einfacher Aggregationstest wurde zum Nachweis von Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta, die auf der Oberfläche von S2-Zellen exprimiert wurden, angewandt.
  • S2-Zellen im Log-Phasenwachstum wurden entweder mit dem Notch- oder Delta-Metallothionein-Promotorkonstrukt getrennt transfiziert. Nach Induktion mit CuSO&sub4; wurden die transfizierten Zellen in gleicher Anzahl gemischt, und man ließ sie über Nacht bei Raumtemperatur aggregieren (ausführliche Angaben, siehe experimentelle Verfahren, Abschnitt 6.1). Alternativ wurden bei einigen Experimenten, die die Verminderung der metabolischen Aktivität beabsichtigten, die Zellen vorsichtig bei 4ºC 1-2 h gemischt. Um zu bestimmen, ob sich Aggregate sich gebildet hatten, wurden die Zellen für die Immunfluoreszenzmikroskopie unter Verwendung von Antikörpern, die für jedes Genprodukt spezifisch waren, und verschieden markierten fluoreszierenden sekundären Antikörpern aufgearbeitet. Die exprimierenden Zellen machten in der Regel weniger als 5% der gesamten Zellpopulation aus, da transiente statt stabile Transformanten verwendet wurden. Die verbleibenden Zellen exprimierten entweder ein gegebenes Protein nicht oder exprimierten auf Niveaus, die zum Nachweis durch Immunfluoreszenzmikroskopie zu gering waren. Als Kontrollen führten wir Aggregationen mit nur einem einzigen transfizierten Zelltyp durch.
  • Die Ergebnisse (Fehon et al., 1990, Cell 61: 523-534) zeigten, daß, obgleich bei dem Test Notch-exprimierende (Notch&spplus;)- Zellen allein keine Aggregate bildeten, dies mit Delta- exprimierenden (Delta&spplus;)-Zellen erfolgte. Das Bestreben der Delta&spplus;-Zellen zur Aggregation war auch in den nicht aggregierten Kontrollproben offensichtlich, wo üblicherweise Zellcluster von 4-8 Zellen, die wahrscheinlich von der Adhäsion zwischen mitotischen Schwesterzellen herrührten, auftraten. Allerdings befanden sich die Cluster nach der Inkubation in der Regel unter Aggregationsbedingungen (z. B. 19% Delta&spplus;- Zellen in Aggregaten vor der Inkubation, gegenüber 37% Delta&spplus;-Zellen in Aggregaten nach Inkubation), was anzeigt, daß die Delta&spplus;-Zellen in der Lage sind, bei diesen Tests untereinander stabile Kontakte zu bilden.
  • In bemerkenswertem Kontrast zu Kontrollexperimenten mit Notch&spplus;-Zellen allein ergab die Aggregation von Gemischen von Notch&spplus;- und Delta&spplus;-Zellen die Bildung von Clustern von bis zu 20 oder mehr Zellen. Die Fraktion exprimierender Zellen, die nach 24 h Aggregation in Clustern von vier oder mehr angefärbten Zellen vorgefunden wurde, reichte in Gemischen von Notch&spplus;- und Delta&spplus;-Zellen von 32% bis 54%. Dieser Bereich entsprach demjenigen, der für Delta&spplus;-Zellen allein (37-40 %) festgestellt wurde, unterschied sich jedoch sehr von demjenigen für Notch&spplus;-Zellen allein (nur 0%-5%). Obwohl einige Cluster, die nur aus Delta&spplus;-Zellen bestanden, gefunden wurden, wurden in Clustern von mehr als vier bis fünf Zellen niemals Notch&spplus;-Zellen gefunden, wenn nicht auch Delta&spplus;-Zellen vorhanden waren. Wiederum exprimierten sämtliche Zellen in diesen Clustern entweder Notch oder Delta, auch wenn transfizierte Zellen nur eine kleine Fraktion der Gesamtzellpopulation ausmachten. Nach 48 h war der Aggregationsgrad offenbar höher (63-71%), was nahe legt, daß die Aggregation nach 24 h unter diesen Bedingungen noch kein Maximum erreicht hatte. Ferner aggregierten Zellen, die mit Notch- und Delta-Konstrukten kotransfiziert worden waren (so daß sämtliche transfizierten Zellen beide Proteine exprimieren), unter den gleichen experimentellen Bedingungen auf ähnliche Weise.
  • Die Notch-Beteiligung am Aggregationsprozeß wurde direkt durch Überprüfen der Wirkung eines Gemisches von polyklonalen Antiseren getestet, die gegen Fusionsproteine gerichtet waren, die fast die gesamte extrazelluläre Domäne von Notch bei der Aggregation umspannten (siehe experimentellen Verfahrensweisenabschnitt 6.1). Zur Minimierung von Artefakten, die auf Grund einer metabolischen Reaktion das Patching von Oberflächen-Antigene entstehen könnten, wurden bei diesen Experimenten eine Antikörperbehandlung und der Aggregationstest bei 4 ºC durchgeführt. Notch&spplus;-Zellen wurden entweder mit Maus- Vorimmun- oder -Immunserum 1 h inkubiert, Delta&spplus;-Zellen wurden zugesetzt, und die Aggregation wurde 1 bis 2 h durchgeführt. Obgleich Notch&spplus;-Zellen, die mit Präimmunseren vorbehandelt worden waren, mit Delta&spplus;-Zellen aggregierten (bei einem von drei Experimenten, befanden sich 23% der Notch&spplus;- Zellen in Notch&spplus;-Delta&spplus;-Zellaggregaten), erfolgte dies bei denjenigen, die mit Immunserum behandelt worden waren, nicht (nur 2% der Notch&spplus;-Zellen befanden sich in Aggregaten). Dieses Ergebnis legt nahe, daß die extrazelluläre Domäne von Notch für die Notch&spplus;-Delta&spplus;-Zellaggregation erforderliche war.
    • 6.2.3 DIE NOTCH-DELTA-VERMITTELTE AGGREGATION IST CALCIUMABHÄNGIG
  • Die Fähigkeit von Zellen zur Aggregation in Gegenwart oder Abwesenheit von Ca²&spplus;-Ionen wurde getestet, um zu bestimmen, ob eine Calcium²&spplus;-Ionen-Anforderung für die Notch-Delta- Aggregation besteht. Zur Minimierung möglicher nichtspezifischer Effekte aufgrund metabolischer Reaktionen auf die Entfernung von Ca²&spplus; wurden diese Experimente bei 4ºC durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten eindeutig eine Abhängigkeit der Notch-Delta-vermittelten Aggregation von exogenem Ca²&spplus;.
    • 6.2.4 NOTCH UND DELTA WECHSELWIRKEN MIT EINER EINZELNEN ZELLE
  • Die Frage, ob Notch und Delta innerhalb der Membran von einer Zelle, die beide Proteine exprimiert, assoziiert sind, wurde durch Überprüfen der Verteilungen von Notch und Delta in kotransfizierten Zellen gestellt. Um zu testen, ob die beobachtete Kolokalisation zufällig war oder eine stabile Wechselwirkung zwischen Notch und Delta darstellte, wurden lebende Zellen mit einem Überschuß an polyklonalem Anti-Notch- Antiserum behandelt. Diese Behandlung führte zu einem "Patching" von Notch auf der Oberfläche exprimierender Zellen in diskreten Flicken, wie durch Immunfluoreszenz nachgewiesen. Es bestand eine distinkte Korrelation zwischen den Verteilungen von Notch und Delta auf der Oberfläche dieser Zellen nach dieser Behandlung, was anzeigte, daß diese Proteine in der Membran assoziiert sind.
    • 6.2.5 WECHSELWIRKUNGEN MIT DELTA ERFORDERN DIE INTRAZELLULÄRE DOMÄNE VON NOTCH NICHT
  • Zusätzlich zu der großen extrazellulären Domäne, die EGF- artige Sequenzwiederholungen enthält, besitzt Notch eine anpaßbare intrazelluläre (IC)-Domäne von ca. 940 Aminosäuren. Die IC-Domäne umfaßt eine Phosphorylierungsstelle (Kidd et al., 1989, Genes Dev. 3, 1113-1129), eine vermeintliche Nukleotidbindungsdomäne, eine Polyglutaminverlängerung (Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581; Kidd, et al., 1986, Mol. Cell. Biol. 6, 3094-3108) und Sequenzen, die zu dem Hefe- cdc10-Gen homolog sind, das an der Zellzykluskontrolle in Hefe beteiligt ist (Breeden und Nasmyth, 1987, Nature 329, 651- 654). Eine Notch-Konstrukt-Variante wurde verwendet, bei der die codierenden Sequenzen für die ca. 835 Aminosäuren der IC- Domäne, einschließlich sämtlicher struktureller Merkmale, die vorstehend vermerkt sind, deletiert worden sind (wobei 25 membranproximale Aminosäuren und ein neuer 59 Aminosäure- Carboxyl-Terminus zurückblieben; siehe experimentielle Verfahrensweisen).
  • In Aggregationstests bildeten die Zellen, die das ECN1-Konstrukt exprimierten, mit Delta&spplus;-Zellen konsistente Aggregate, jedoch nicht mit sich selbst, ebenso wie es für die Zellen festgestellt wurde, die intaktes Notch exprimierten. Scharfe Banden von angefärbtem ECN1 wurden in Regionen des Kontakts mit Delta&spplus;-Zellen festgestellt, was wiederum eine Lokalisierung von ECN1 innerhalb von Regionen des Kontakts zwischen den Zellen anzeigte. Zum Testen auf Wechselwirkungen innerhalb der Membran wurden Oberflächenantigen-Copatching-Experimente unter Verwendung von Zellen durchgeführt, die mit den ECN1- und Delta-Konstrukten kotransfiziert worden sind. Wie für intaktes Notch festgestellt, wenn ECN1 unter Verwendung polyklonaler Antiseren gegen die extrazelluläre Domäne von Notch gepatcht wurde, kolokalisierten ECN1 und Delta an der Zelloberfläche. Diese Ergebnisse zeigen, daß die beobachteten Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta in der Membran nicht den deletierten Teil der IC-Domäne von Notch erfordern und darum wahrscheinlich durch die extrazelluläre Domäne vermittelt werden.
    • 6.2.6 NOTCH UND DELTA BILDEN DETERGENSLÖSLICHE INTERMOLEKULARE KOMPLEXE
  • Die vorgenannten Ergebnisse zeigten molekulare Wechselwirkungen zwischen Notch und Delta, die innerhalb der gleichen Membran und zwischen diesen Proteinen vorhanden sind, die auf verschiedenen Zellen exprimiert wurden. Ein weiterer Test solcher Wechselwirkungen besteht in der Kopräzipitation dieser Proteine aus nicht denaturierenden Detergensextrakten von Zellen, die Notch und Delta exprimieren. Wenn Notch und Delta einen stabilen intermolekularen Komplex, entweder zwischen oder innerhalb von Zellen, bilden, sollte es möglich sein, beide Proteine aus Zellextrakten unter Verwendung spezifischer Antiseren, die gegen eines dieser Proteine gerichtet sind, auszufällen. Diese Analyse wurde durch Immunfällung von Delta mit polyklonalem Antiserum aus NP-40/Deoxycholat- Lysaten (siehe experimentelle Verfahren) aus Zellen, die mit den Notch- und Delta-Konstrukten cotransfiziert worden waren, die man über Nacht aggregieren ließ, oder von 0-24 h Wild- Typ-Embryos durchgeführt.
  • Die Kopräzipitation von Notch wurde in Delta-Immunpräzipitaten aus kotransfizierten Zellen und Embryonen nachgewiesen. Allerdings ist kopräzipitierendes Notch anscheinend in viel geringeren Mengen vorhanden als Delta, und es war darum schwer nachzuweisen. Die Tatsache, daß die Immunfällung von Delta zur Kopräzipitation von Notch führt, stellt einen direkten Beweis dafür dar, daß diese beiden Proteine in transfizierten 52-Zellen und in Embryonenzellen stabile intermolekulare Komplexe bilden.
    • 6.3 DISKUSSION
  • Die Anwendung eines in vitro Aggregationstests, der normalerweise nicht klebende S2-Zellen einsetzt, zeigte, daß Zellen, die Notch und Delta exprimieren, spezifisch aneinander haften.
    • 7. EGF-SEQUENZWIEDERHOLUNGEN 11 UND 12 VON NOTCH SIND ZUR NOTCH-DELTA-VERMITTELTEN AGGREGATION ERFORDERLICH UND AUSREICHEND
  • Der gleiche Aggregationstest, wie in Abschnitt 6 beschrieben, wurde zusammen mit Deletionsmutanten von Notch zur Identifizierung von Regionen in der extrazellulären Domäne von Notch, die für die Wechselwirkungen mit Delta notwendig sind, verwendet. Der Beweis zeigt, daß die EGF-Sequenzwiederholungen von Notch direkt an dieser Wechselwirkung beteiligt sind und daß nur zwei (ELR-11 und 12) der 36 EGF-Sequenzwiederholungen notwendig erscheinen. Diese zwei EGF-Sequenzwiederholungen sind zum Binden an Delta und dafür, daß die Calcium-Abhängigkeit der Notch-Delta-vermittelten Aggregation ebenfalls mit diesen zwei Sequenzwiederholungen assoziiert ist. Schließlich vermitteln die zwei entsprechenden EGF-Sequenzwiederholungen aus dem Xenopus-Homolog von Notch auch die Aggregation mit Delta, was impliziert, das nicht nur die Struktur von Notch, sondern auch ihre Funktion evolutionär konserviert worden ist. Diese Ergebnisse legen nahe, daß die extrazelluläre Domäne von Notch überraschenderweise modular ist und zusätzlich zu Delta potentiell eine Vielzahl von Proteinen binden könnte. (See Rebay et al., 1991, Cell 67: 687-699).
    • 7.1 EXPERIMENTIELLE VERFAHREN 7.1.1 EXPRESSIONSKONSTRUKTE
  • Die beschriebenen Konstrukte sind alles Derivate des Notch- Vollängen-Expressionsprodukts Nr. 1, pMtNMg (siehe Abschnitt 6, vorstehend), und wurden wie beschrieben (Rebay et al., 1991, Cell 67: 687-699) hergestellt.
    • 7.1.2 ZELLKULTUR UND TRANSFEKTION
  • Die Drosophila-S2-Zell-Linie wurde gezüchtet und wie in Abschnitt 6, vorstehend beschrieben, transfiziert. Die Delta- exprimierende stabil transformierte S2-Zelllinie L-49-6-7 (freundlicherweise zu Verfügung gestellt von L. Cherbas), wurde in M3-Medium (hergestellt von Hazleton Co.), angereichert mit 11% Hefe-inaktiviertem fetalem Kälberserum (FCS) (Hyclone), 100 U/ml Penizillin-100 ug/ml Streptomycin-0,25 ug/ml Fungizone (Hazelton), 2 · 10&supmin;&sup7; M Methotrexat, 0,1 mM Hypoxanthin und 0,016 mM Thymidin, gezüchtet.
    • 7.1.3 AGGREGATIONSTESTS UND IMMUNFLUORESZENZ
  • Aggregationsstest und Ca&spplus;&spplus;-Abhängigkeitsexperimente wurden, wie vorstehend in Abschnitt 6 beschrieben, durchgeführt. Die Zellen wurden mit dem monoklonalen Anti-Notch-Antikörper 9C6.C17 und polyklonalem Anti-Delta-Ratten-Antiserum (ausführlich in Abschnitt 6, vorstehend beschrieben), angefärbt. Die Oberflächenexpression von Notch-Konstrukten in nicht permeabilisierten Zellen wurde unter Verwendung von polyklonalem Ratten-Antiserum, das gegen das 0,8 kb (Aminosäuren 237-501; Wharton et al., 1985, Cell 43, 567-581)-BstY1-Fragment aus der extrazellulären Domäne von Notch gezüchtet worden war, durchgeführt. Die Zellen wurden unter Epifluoreszenz auf einem Leitz-Orthoplan-2-Mikroskop betrachtet.
    • 7.2 ERGEBNISSE 7.2.1 EGF-SEQUENZWIEDERHOLUNGEN 11 UND 12 VON NOTCH SIND ZUR NOTCH-DELTA-VERMITTELTEN AGGREGATION ERFORDERLICH
  • Eine breit angelegte Deletionsanalyse wurde für die extrazelluläre Domäne des Notch-Proteins, von der sich erwiesen hatte, daß sie an den Notch-Delta-Wechselwirkungen beteiligt war (vorstehend Abschnitt 6; Fehon et al., 1990, Cell 61: 523- 534), zur Identifizierung der exakten Domäne von Notch, die diese Wechselwirkungen vermittelt, durchgeführt. Die Fähigkeit von Zellen, die mit den verschiedenen Deletionskonstrukten transfiziert worden waren, zur Wechselwirkung mit Delta, wurde unter Anwendung des Aggregationstest, der in Abschnitt 6 beschrieben ist, getestet. Kurz gesagt, wurden Notch-Deletionskonstrukte vorübergehend in Drosophila-S2- Zellen transfiziert, mit CuSO&sub4; induziert und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur mit einer kleinen Menge an Zellen aus der stabil transformierten Delta-exprimierenden Zell- Linie L49-6-7 (Cherbas) aggregiert, was eine Population ergab, die typischerweise aus ca. 1% Notch-exprimierenden Zellen und ca. 5% Delta-exprimierenden Zellen bestand, wobei die restlichen Zellen keines der beiden Proteine exprimierten.
  • Schematische Zeichnungen der getesteten Konstrukte und die Ergebnisse der Aggregationsexperimente sind in Fig. 2 gezeigt. Zum Testen des Aggregationsgrads wurden die Zellen mit Antiseren, die auf jedes Genprodukt spezifisch waren, angefärbt und mit Immunfluoreszenzmikroskopie geprüft. Die Aggregate wurden als Cluster von vier oder mehr Zellen definiert, die sowohl Notch- als auch Delta-exprimierende Zellen enthielten, und die in Fig. 2 gezeigten Werte stellen den Prozentsatz von sämtlichen Notch-exprimierenden Zellen dar, der in solchen Clustern festgestellt wurde. Sämtliche Zahlen spiegeln das Durchschnittsergebnis von mindestens zwei getrennten Transfektionsexperimenten wider, wobei mindestens 100 Notch-exprimierende Zelleinheiten (entweder einzelne Zellen oder Cluster) bewertet wurden.
  • Die Ursprungskonstrukte (Nr. 2 DSph und Nr. 3 ΔCla) deletierten große Teile der EGF-Sequenzwiederholungen. Ihre Fähigkeit zur Beschleunigung der Notch-Delta-Aggregation legte nahe, daß die EGF-Sequenzwiederholungen von Notch an der Wechselwirkung mit Delta beteiligt waren. Eine Reihe von sechs rahmenkonformen ClaI-Restriktionsstellen wurde zur weiteren Aufspaltung des Bereiches der Region zwischen den EGF- Sequenzwiederholungen 7 und 30 verwendet. Aufgrund einer Sequenzhomologie zwischen den Sequenzwiederholungen traten fünf der ClaI-Stellen an der gleichen relativen Stelle in der EGF- Sequenzwiederholung, unmittelbar nach dem dritten Cystein auf, während die sechste Stelle unmittelbar vor dem ersten Cystein der EGF-Sequenzwiederholung 31 auftrat (Fig. 3). Somit wurden durch Durchführung eines ClaI-Teilverdaus und durch anschließende Religation Deletionen erhalten, die nicht nur den offenen Leserahmen des Notch-Proteins beibehielten, sondern zusätzlich häufig die Strukturintegrität aufrecht erhielten und den Abstand der drei Disulfidbindungen in den chimären EGF-Sequenzwiederholungen, die durch die Religation produziert worden waren (Fig. 2, Konstrukte-Nr. 4-14), mindestens theoretisch konservierten. Leider war die am meisten 3' gelegene ClaI-Stelle gegenüber dem Abbau resistent, während die nächste, 3'-nahe ClaI-Stelle die EGF-Sequenzwiederholungen 30 und 31 aufbrach. Wenn darum verschiedene ClaI-Verdauungsfragmente wieder in das Rahmenwerk des vollständigen ClaI-Verdaus (Konstrukt Nr. 3, Δ-Cla) inseriert wurden, war die Gesamtstruktur der EGF-Sequenzwiederholungen offensichtlich an der 3'-Verbindungsstelle unterbrochen.
  • Mehrere Punkte hinsichtlich dieser Serie von Konstrukten sind bemerkenswert. Zuerst hob die Entfernung des ClaI-Restriktionsfragments, das die EGF-Sequenzwiederholungen 9 und 17 aufbricht (Konstrukt Nr. 8, ΔEGF9-17), die Aggregation mit Delta auf, während die Reinsertion dieses Stücks in Konstrukt Nr. 3 Δ-Cla, dem die EGF-Sequenzwiederholungen 7-30 fehlen, die Aggregation etwa auf Wild-Typ-Niveau wieder herstellte (Konstrukt Nr. 13, Δ - Cla + EGF9-17), was nahe legt, daß die EGF-Sequenzwiederholungen 9-17 Sequenzen enthalten, die zur Bindung an Delta wichtig sind. Zweitens standen sämtliche Konstrukte dieser Serie (Nr. 4-14) mit der Bindungsstellen-Zuordnung zu den EGF-Sequenzwiederholungen 9-17 im Einklang. Expressionskonstrukte, die diese Sequenzwiederholungen enthalten (Nr. 6, 7, 9, 10, 13), beschleunigten die Notch-Delta-Wechselwirkungen, während bei Konstrukten, denen diese Sequenzwiederholungen fehlten (Nr. 4, 5, 8, 11, 12, 14), dies nicht auftrat. Um zu bestätigen, daß das Unvermögen zur Aggregation mit Delta-Zellen nicht einfach auf dem Unvermögen des mutagenierten Notch-Proteins zum Erreichen der Zelloberfläche beruhte, sondern tatsächlich die Deletion der notwendigen Bindungsstelle widerspiegelte, wurde die Zelloberflächenexpression sämtlicher Konstrukte durch Immunfluoreszenzanfärben lebender transfizierter Zellen mit Antikörpern, die spezifisch auf die extrazelluläre Domäne von Notch sind, getestet. Sämtlich Konstrukte versagten bei der Vermittlung von Notch-Delta-Wechselwirkungen, die ein Protein produzierte, das anscheinend normalerweise an der Zelloberfläche exprimiert wird. Obwohl der Aggregationstest nicht quantitativ ist, aggregierten drittens zwei Konstrukte, die die EGF-Sequenzwiederholungen 9-17, Nr. 9 ΔEGF17-26, oder am bemerkenswertesten Nr. 10 ΔEGF26-30 enthielten, auf einem offenbar niedrigeren Niveau. Die Zellen, die mit den Konstrukten-Nr. 9 ΔEGF17-26 und 10 ΔEGF26-30 transfiziert worden waren, zeigten eine beträchtlich geringere Oberflächenanfärbung als normale Zellen, obwohl fixierte und permeabilisierte Zellen, die mit dem gleichen Antikörper reagierten, sich normalerweise färbten, was zeigt, daß die Epitope, die von den Antiseren erkannt wurden, nicht einfach deletiert worden sind. Durch Vergleich des Prozentgehalts transfizierter Zellen in entweder permeabilisierten oder lebenden Zellpopulationen, wurde festgestellt, daß für das Konstrukt Nr. 9 ΔEGF17-26 etwa 50% der transfizierten Zellen und für das Konstrukt Nr. 10 ΔEGF26-30 10% nachweisbares Protein an der Zelloberfläche produzierte. Somit produzierten diese beiden Konstrukte Proteine, die oft nicht die Zelloberfläche zu erreichen vermochten, vielleicht aufgrund von Fehlfaltung, wodurch die Fähigkeit von transfizierten Zellen zur Aggregation mit Delta-exprimierenden Zellen vermindert, jedoch nicht aufgehoben war.
  • Nach dem Einordnen der Bindungsstelle in die EGF-Sequenzwiederholungen 9 bis 17, zeigten weitere Experimente (Rebay et al., 1991, Cell 67: 687-699), daß die EGF-Sequenzwiederholung 14 von Notch nicht an den Wechselwirkungen mit Delta, die im Modellversuch mit dem Gewebekulturtest dargestellt wurden, beteiligt war.
  • Um weiterhin die Delta-Bindungsdomäne in die EGF-Sequenzwiederholungen 9-17 einzuordnen, wurden spezielle Oligonukleotid-Primer und die PCR-Technik zur Erzeugung mehrerer Unterfragmente dieser Region eingesetzt. Drei überlappende Konstrukte Nr. 16, 17 und 18 wurden hergestellt, wovon nur eines, Nr. 16 ΔCla + EGF9-13, bei Transfektion in S2-Zellen die Aggregation mit Delta-Zellen zuließ. Konstrukt Nr. 19, ΔCla + EGF(10-13), dem die EGF-Sequenzwiederholung 9 fehlte, definierte weiterhin die EGF-Sequenzwiederholungen 10-13 als die für die Notch-Delta-Wechselwirkungen notwendige Region.
  • Die Konstrukte Nr. 20-24 stellten Versuche dar, diese Domäne unter Anwendung der gleichen PCR-Strategien noch weiter abzubauen (siehe Fig. 3). Das Konstrukt Nr. 20 ΔCla + EGF(11- 13), wobei die EGF-Sequenzwiederholung 12 die einzige vollständige Sequenzwiederholung ist, die hinzugefügt wurde, und das Konstrukt Nr. 21 ΔCla + EGF(10-12), wobei die EGF- Sequenzwiederholung 11 die einzige vollständige Sequenzwiederholung ist, die hinzugefügt wurde, vermittelten die Aggregation nicht, was nahe legt, daß das Vorliegen entweder der EGF-Sequenzwiederholung 11 oder 12 allein für die Notch- Delta-Wechselwirkungen nicht ausreichte. Da allerdings die 3'-Ligationsverbidnungsstelle dieser Konstrukte die Gesamtstruktur der EGF-Sequenzwiederholungen unterbrach, war es möglich, daß eine kurze "Pufferzone" benötigt wurde, um ein normales Funktionieren der essentiellen Sequenzwiederholung zu ermöglichen. Somit ist beispielsweise in Konstrukt Nr. 19 ΔCla + EGF(10-13) die EGF-Sequenzwiederholung 12 vielleicht nicht direkt an der Bindung mit Delta beteiligt, sondern könnte statt dessen zu der minimale Menge an Puffersequenz beitragen, die zum Schutze der Struktur der EGF-Sequenzwiederholung 11 benötigt wird, wodurch Wechselwirkungen mit Delta möglich sind. Die Konstrukte Nr. 22-24 sprechen dieses Thema an. Die Konstrukte Nr. 22 ΔCla + EGF(10-11), die keine Aggregation vermittelten, und Nr. 23 ΔCla + EGF(10-12), die diese vermittelten, legten wiederum nahe, daß beide Sequenzwiederholungen 11 und 12 erforderlich sind, während die flankierende Sequenz der Sequenzwiederholung 13 eindeutig nicht erforderlich ist. Schließlich zeigte das Konstrukt Nr. 24 ΔCla + EGF(11-12), obwohl nun an der 5'-Verbindungsstelle potentiell strukturell unterbrochen, überzeugend, daß die Sequenzen aus der EGF-Sequenzwiederholung 10 nicht essentiell sind. Basierend auf den vollkommen konsistenten Daten aus 24 Konstrukten definieren somit die EGF-Sequenzwiederholungen 11 und 12 von Notch zusammen die aus dieser Analyse erhältliche kleinste funktionelle Einheit, die die notwendigen Stellen zur Bindung an Delta in transfizierten D2-Zellen enthält.
    • 7.2.2 EGF-SEQUENZWIEDERHOLUNGEN 11 UND 12 VON NOTCH SIND FÜR DIE NOTCH-DELTA VERMITTELTE AGGREGATION AUSREICHEND
  • Die große ClaI-Deletion in die PCR-Fragmente inseriert wurden (Nr. 3 ΔCla), behält grob gesagt ein Drittel der ursprünglichen 36 EGF-Sequenzwiederholungen, sowie drei Notch/lin-12- Sequenzwiederholungen bei. Während diese eindeutig zur Unterstützung der Aggregation nicht ausreichen, ist es möglich, daß sie ein notwendiges Netzwerk bilden in dem spezifische EGF-Sequenzwiederholungen mit Delta wechselwirken. Um zu testen, ob tatsächlich nur einige EGF-Sequenzwiederholungen zur Unterstützung der Aggregation ausreichend waren, wurden zwei Konstrukte, Nr. 25 ΔEGF, bei dem sämtliche 36 EGF-Sequenzwiederholungen deletiert waren, mit der Ausnahme der ersten zwei Drittel von Sequenzwiederholung 1, und Nr. 30 ΔECN, bei dem der gesamte extrazellulären Teil von Notch deletiert war, mit der Ausnahme des ersten Drittels der EGF-Sequenzwiederholung 1 und der ca. 35 Aminosäuren unmittelbar vor der Transmembran-Domäne, konstruiert. Fragmente, die die Notch- Delta-Aggregation im Hintergrund von Konstrukt Nr. 3 ΔCla bei der Insertion in Konstrukt Nr. 25 ΔEGF vermittelten hatten, waren wiederum in der Lage, die Interaktionen mit Delta zu fördern (Konstrukte Nr. 26-30). Analoge Konstrukte (Nr. 31, 32), in denen die Notch/lin-12-Sequenzwiederholungen ebenfalls fehlten, vermittelten die Notch-Delta-Aggregation wiederum erfolgreich. Somit funktionieren die EGF-Sequenzwiederholungen 11 und 12 anscheinend als unabhängige molekulare Einheiten, die zur Vermittlung von Notch-Delta-Wechselirkungen in S2-Zellen ausreichen, auch in Abwesenheit des größten Teils der extrazellulären Domäne von Notch.
    • 7.2.3 Die EGF-SEQUENZWIEDERHOLUNGEN 11 und 12 VON NOTCH HALTEN DIE CALCIUMABHÄNGIGKEIT DER NOTCH-DELTA VERMITTELTEN AGGREGATION AUFRECHT
  • Die Fähigkeit von Zellen, die bestimmte Deletionskonstrukte exprimieren, zur Aggregation mit Delta-exprimierenden Zellen, wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von Ca&spplus;&spplus;-Ionen überprüft. Die Calciumabhängigkeit der Wechselwirkung wurde sogar im kleinsten Konstrukt bewahrt, was mit der Feststellung Einklang steht, daß die minimalen Konstrukte, die die EGF- Sequenzwiederholungen 11 und 12 enthalten, an Delta auf eine Weise binden, die derjenigen des Vollängen-Notch entspricht.
    • 7.2.4 DIE DELTA-BINDUNGSFUNKTION DER EGF- SEQUENZWIEDERHOLUNGEN 11 UND 12 VON NOTCH IST IM XENOPUS-HOMOLOGEN VON NOTCH KONSERVIERT
  • PCR-Primer auf der Basis der Xenopus-Notch-Sequenz (Coffman et al., 1990, Science 249, 1438-1441) wurde zum Erhalt eines ca. 350 bp-Fragments aus einer Xenopus-Stadium 17-cDNA- Bibliothek verwendet, die die EGF-Sequenzwiederholungen 11 und 12, flankiert jeweils von der Hälfte der Sequenzwiederholungen 10 und 13 auf einer Seite, enthielt. Diese Fragmente wurden in Konstrukt Nr. 3ΔCla kloniert, und drei unabhängige Klone wurden auf die Fähigkeit zur Wechselwirkung mit Delta im Zellkulturaggregationstest getestet. Zwei der Klone Nr. 33a & b ΔCla + XEGF(10-13) waren bei Transfektion in S2-Zellen in der Lage, Notch-Delta-Wechselwirkungen auf einem Niveau, das in etwa demjenigen des analogen Drosophila-Notch- Konstrukts Nr. 19 ΔCla + XEGF(10-13) entsprach, wiederum Calcium-abhängig, zu vermitteln (Tabelle III). Allerdings vermocht der dritte Klone Nr. 33c ΔCla + XEGF(10-13) nicht, die Notch-Delta-Wechselwirkungen zu vermitteln, obwohl das Protein normalerweise an der Zelloberfläche exprimiert wurde, wie durch Anfärben von lebenden unpermeabilisierten Zellen bewertet. Der Sequenzvergleich des Xenopus-PCR-Produktes in den Konstrukten Nr. 33a und 33c ergab eine Fehlsinn-Mutation, die zu einer Leucin-zu-Prolin-Änderung (Aminosäure Nr. 453, Coffman, et al., 1990, Science 249, 1438-1441) in der EGF-Sequenzwiederholung 11 des Konstrukts Nr. 33c führte. Obwohl dieser Rest nicht zwischen Drosophila- und Xenopus-Notch konserviert ist (Fig. 8), könnte der Einbau eines Prolinrestes leicht die Struktur der EGF-Sequenzwiederholung auseinanderbrechen und sie somit an der richtigen Wechselwirkung mit Delta hindern.
  • Der Vergleich der Aminosäuresequenz der EGF-Sequenzwiederholungen 11 und 12 von Drosophila- und Xenopus-Notch ergibt einen hohen Aminosäure-Identitätsgrad, einschließlich der verwandten, calciumbindenden Sequenz (Fig. 4, SEQ ID NO: 1 und NR. 2). Allerdings ist das Homologieniveau von demjenigen, der den meisten anderen EGF-Sequenzwiederholungen gemeinsam ist, die insgesamt etwa 50%ige Identität auf Aminosäureniveau aufweisen, nicht auffallend verschieden. Diese eins-zu-eins Entsprechung zwischen den einzelnen EGF-Sequenzwiederholungen von Drosophila- und Xenopus-Notch, zusammen mit der funktionellen Konservierung von ELR-11 und 12, legt nahe, daß die 36 EGF-Sequenzwiederholungen von Notch einen Bereich mit Tandern-Anordnung von konservierten funktionellen Einheiten enthalten.
    • 7.3 DISKUSSION
  • Eine umfassende Deletionsanalyse der extrazellulären Domäne von Notch wurde angewandt, um zu zeigen, daß die Regionen von Notch, die die EGF-homologen Sequenzwiederholungen 11 und 12 enthalten, für die Notch-Delta-vermittelte Aggregation sowohl notwendig als auch ausreichend sind und daß dieses Delta- Bindungsvermögen in den gleichen beiden EGF-Sequenzwiederholungen von Xenopus-Notch bewahrt wurde. Die Feststellung, daß die Aggregation, die bei den EGF-Sequenzwiederholungen 11 und 12 von Notch zugeordnet wurde, zeigt, daß die EGF-Sequenzwiederholungen von Notch auch als spezifische Proteinbindungsdomänen fungieren. Die EGF-Sequenzwiederholungen 11 und 12 allein (Nr. 32ΔECN + EGF(11-12)) waren zur Aufrechterhaltung der Ca&spplus;&spplus;-Abhängigkeit der Notch-Delta-Wechselwirkungen ausreichend.
  • Die verschiedenen Deletionskonstrukte legen nahe, daß ELR-11 und ELR-12 als modulare Einheit funktionieren, unabhängig vom unmittelbaren Zusammenhang, in dem sie angeordnet sind. Somit sind weder die restlichen 34 EGF-Sequenzwiederholungen noch die drei Notch/lin-12-Sequenzwiederholungen offensichtlich zum Erstellen eines strukturellen Rahmens notwendig, der für die EGF-SequenzSequenzwiederholungen 11 und 12 zum Funktionieren erforderlich ist. Interessanterweise wurde fast der gegenteilige Effekt festgestellt: obwohl der Aggregationstest nicht die Stärke der Wechselwirkung mißt, da sich die Bindungsstelle zu immer kleiner werdenden Fragmenten verschmälerte, wurde eine Zunahme in der Fähigkeit der transfizierten Zellen zur Aggregation mit Delta-exprimierenden Zellen festgestellt, was nahe legt, daß die normalen flankierenden EGF- Sequenzen tatsächlich die Assoziation zwischen den Proteinen behindern. Die verbleibenden 34 EGF-Sequenzwiederholungen können auch modulare Bindungsdomänen für andere Proteine bilden, die mit Notch zu verschiedenen Zeiten während der Entwicklung wechselwirken.
  • Die Feststellung, daß die EGF-Sequenzwiederholungen 11 und 12 von Notch eine diskrete Delta-Bindungseinheit bilden, stellt den ersten konkreten Beweis dar, der die Idee unterstützt, daß jede EGF-Sequenzwiederholung oder kleine Untereinheit von Sequenzwiederholungen eine einzigartige Rolle während der Entwicklung spielen kann, möglicherweise durch direkte Wechselwirkungen mit anderen Proteinen. Die zwischen der klebenden Domäne von Delta und Serrate festgestellten Homologien (Fig. 5), legen nahe, daß der homologe Teile von Serrate insofern "klebend" ist, als er die Bindung an andere toporhythmische Proteine vermittelt (siehe Abschnitt 8, nachstehend). Zusätzlich kann das Gen Scabrous, das ein sezerniertes Protein mit Ähnlichkeit zu Fibrinogen codiert, mit Notch wechselwirken.
  • Zusätzlich zu der EGF-Sequenzwiederholung treten in der Regel mehrere Kopien anderer Strukturmotive in einer Vielzahl von Proteinen auf. Ein relevantes Beispiel ist das cdc10/Ankyrin- Motiv, wovon sechs Kopien in der intrazellulären Domäne von Notch gefunden werden. Ankyrin enthält 22 dieser Sequenzwiederholungen. Vielleicht können wiederholte Anordnungen von strukturellen Motiven in der Regel einen linearen Aufbau einer Serie von modularen Proteinbindungseinheiten darstellen. Angesichts dieser Ergebnisse zusammen mit der bekannten strukturellen genetischen und entwicklungsbedingten Komplexität von Notch, kann Notch während der Entwicklung mit einer Anzahl von verschiedenen Liganden in einem exakt regulierten zeitlichen und räumlichen Muster wechselwirken. Solche Kontext-spezifische Wechselwirkungen mit extrazellulären Proteinen könnten durch die EGF- und Notch/lin-12-Sequenzwiederholungen vermittelt werden, während die Wechselwirkungen mit Cytoskelett- und Cytoplasma-Proteinen durch die intrazellulären cdc10/Ankyrin-Motive vermittelt werden könnten.
    • 8. SEQUENZEN DIE NOTCH-SERRATE-WECHSELWIRKUNGEN VERMITTELN
  • Wie hier beschrieben, bauen die zwei EGF-Sequenzwiederholungen von Notch, die die Wechselwirkungen mit Delta vermitteln, nämlich die EGF-Sequenzwiederholungen 11 und 12, auch eine Serrate-Bindungsdomäne auf (siehe Rebay et al., 1991, Cell 67: 687-699).
  • Um zu testen, ob Notch und Serrate direkt wechselwirken, wurden S2-Zellen mit einem Serrate-Expressionskonstrukt transfiziert und mit Notch-exprimierenden Zellen in einem Aggregationstest gemischt. Für das Serrate-Expressionskonstrukt wurde ein synthetischer Primer, der eine künstliche BamHI-Stelle unmittelbar 5' zum Initiator AUG an Position 442 enthielt (sämtliche Sequenznummern sind nach Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4: 2188-2201), und bis zu Position 464 homolog ist in Verbindung mit einem zweiten Primer von Position 681-698 unter Erzeugung eines DNA-Fragments von ca. 260 Basenpaaren verwendet. Dieses Fragment wurde mit BamHI und KpnI (Position 571) geschnitten und in Bluescript-KS+(Stratagene) ligiert. Dieses Konstrukt, BTSer5'PCR, wurde durch Sequenzieren geprüft, anschließend mit KpnI geschnitten. Das Serrate-KpnI- Fragment (571-2981) wurde inseriert und die richtige Orientierung selektiert, um BTSer5'PCR-Kpn zu erzeugen. Das 5'- SacII-Fragment von BTSer5'PCR-Kpn (SacII-Stellen im Bluescript-Polylinker und in Serrate (1199)) wurde isoliert und zum Ersatz des 5'SacII-Fragments von cDNA-C1 verwendet (Fleming et al., 1990, Genes & Dev. 4: 2188-2201), wodurch die Vollängen-Serrate cDNA abzüglich der 5'-untranslatierten Regionen erzeugt wurde. Diese Insertion wurde durch einen SaII- und teilweisen BamHI-Verdau isoliert und zwischen den BamHI- und SaII-Stellen von pRmHa-3 unter Erzeugung des fertigen Expressionskonstrukts Ser-mtn eingebaut.
  • Serrate-exprimierende Zellen hafteten Calcium-abhängig an Notch-exprimierenden Zellen (Fig. 2 und Rebay et al., 1991, supra). Im Gegensatz zu Delta wechselwirkte Serrate allerdings unter den getesteten experimentellen Bedingungen anscheinend nicht homotypisch. Zusätzlich wurden keine Wechselwirkungen zwischen Serrate und Delta nachgewiesen.
  • Eine Unterserie von Notch-Deletionskonstrukten wurde getestet und zeigte, daß die EGF-Sequenzwiederholungen 11 und 12, zusätzlich zum Binden an Delta, auch Wechselwirkungen mit Serrate vermitteln (Fig. 2; Konstrukte Nr. 1, 7-10, 13, 16, 17, 19, 28 und 32). Zusätzlich wurde die Serrate-Bindungsfunktion dieser Sequenzwiederholungen offensichtlich auch in den entsprechenden zwei EGF-Sequenzwiederholungen von Xenopus-Notch (Nr. 33ΔCla + XEGF(10-13)) konserviert. Diese Ergebnisse zeigen unzweideutig, daß Notch sowohl mit Delta als auch Serrate wechselwirkt und daß die gleichen zwei EGF- Sequenzwiederholungen von Notch beide Wechselwirkungen vermitteln. Die Serrate-Region, die für die Notch/Serrate- Aggregation essentiell ist, wurde ebenfalls definiert. Die Deletion der Nukleotide 676-1287 (d. h. die Aminosäuren 79- 282) (siehe Fig. 5; SEQ ID NO: 3 und NR. 4) beseitigte die Fähigkeit des Serrate-Proteins zur Aggregation mit Notch.
  • Notch und Serrate aggregieren anscheinend weniger effizient als Notch und Delta, vielleicht aufgrund der schwächeren Notch-Serrate-Wechselwirkung. Eine triviale Erklärung für diese verminderte Aggregationsmenge könnte sein, daß das Serrate-Konstrukt einfach nicht so viel Protein wie das Delta- Konstrukt an der Zelloberfläche exprimierte, wodurch die Stärke der Wechselwirkung vermindert wird. Alternativ kann der Unterschied in der Stärke der Wechselwirkung eine fundamentalen funktionellen Differenz zwischen Notch-Delta- und Notch-Serrate-Wechselwirkungen anzeigen, die in vivo signifikant sein kann.
    • 9. KLONIERUNG, SEQUENZIERUNG UND EXPRESSION VON MENSCHLICHEM NOTCH 9.1 ISOLIERUNG UND SEQUENZIERUNG VON MENSCHLICHEM NOTCH
  • Zunächst wurden Klone für die menschliche Notch-Sequenz unter Anwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) zur Amplifikation von DNA aus einer 17-18 Wochen alten menschlichen, fetalen Gehirn-cDNA-Bibliothek im Lambda-Zap II-Vektor (Stratagene) erhalten.
  • Das auf diese Weise erhaltene 400 bp-Fragment wurde anschließend als Sonde verwendet, mit der die gleiche Bibliothek nach menschlichen Notch-Klonen durchmustert wurde. Das erste Durchmustern ergab drei einzigartige Klons, hN3k, hN2k und hN5k, die alle durch anschließende Sequenzanalyse ergaben, daß sie in daß 3'-Ende von menschlichem Notch (Fig. 6) fallen. Ein zweites Durchmustern unter Verwendung des 5'-Endes von hN3k als Sonde wurde durchgeführt, um nach Klonen zu suchen, die das 5'-Ende von menschlichem Notch enthalten. Ein einziger Klon, hN4k, wurde durch diese Durchmusterung erhalten, und die vorläufigen Sequenzierungsdaten zeigen, daß er den größten Teil des 5'-Endes des Gens enthält (Fig. 6). Zusammen enthalten die Klone hN4k, hN3k und hN5k etwa 10 kb des menschlichen Notch-Homologen (der Homologen), beginnend frühzeitig in der EGF-Sequenzwiederholung und bis in die untranslatierte 3'-Region des Gens. Alle drei Klone sind cDNA-Insertionen an der EcoRI-Stelle von pBluescript-SK&supmin;(Stratagene). Der E. coli-Wirtsstamm ist XL1-Blue (siehe Maniatis, T., 1990, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, S. A12). Eine Aneinanderreihung der menschlichen Notch- Sequenzen mit Drosophila-Notch ist in Fig. 7 gezeigt.
  • Die Sequenz von verschiedenen Teilen von Notch, die in den cDNA-Klonen erhalten war, wurde bestimmt (unter Verwendung von Sequenase®, U.S. Biochemical Corp.) und ist für hN2k bzw. hN4k in den Fig. 8 (SEQ ID NO: 5-7) und 9 (SEQ ID NO: 8, 9) gezeigt. Die weitere Sequenzanalyse von hN2k ergab, daß es eine menschliche Notch-Sequenz codierte, die mit derjenigen überlappt, die in hN5k enthalten ist.
  • Die vollständigen Nukleotidsequenzen der menschlichen Notch- cDNA, die in hN3k und hN5k enthalten war, wurde durch das Disdesoxykettenterminationsverfahren unter Verwendung des Sequenase®-Kit (U.S. Biochemical Corp.) bestimmt. Diejenigen Nukleotidsequenzen, die menschliches Notch in dem entsprechenden Leserahmen codieren, wurden leicht identifiziert, da keine Introns vorhanden sind und die Translation in nur einem der drei möglichen Leserahmen eine Sequenz ergibt, die bei Vergleich mit der veröffentlichten von Drosophila-Notch abgeleiteten Aminosäuresequenz eine Sequenz mit einem wesentlichen Homologiegrad mit der Drosophila-Notch-Sequenz ergibt. Die DNA und die abgeleiteten Proteinsequenzen der menschlichen Notch-cDNA in hN3k und hN5k sind in den Fig. 10 (SEQ ID NO: 10, 11) und 11 (SEQ ID NO: 12, 13) dargestellt. Der Klon hN3k codiert einen Teil eines Notch-Polypeptids, beginnend bei ungefähr der dritten Notch/lin-12-Sequenzwiederholung bis mehrere Aminosäuren kurz vor der Carboxyl-terminalen Aminosäure. Klon hN5k codiert einen Teil eines Notch- Polypeptids, beginnend ungefähr vor der cdc10-Region bis zum Ende des Polypeptids und enthält auch eine untranslatierte 3'-Region.
  • Der Vergleich der cDNA und Proteinsequenzen, die in Fig. 10 dargestellt sind (SEQ ID NO: 10, 11), mit denjenigen in Fig. 11 (SEQ ID NO: 12, 13), ergibt wesentliche Unterschiede zwischen den Sequenzen, was nahe legt, daß hN3k und hN5k einen Teil von zwei distinkten Notch-homologen Genen darstellen. Die Daten legen somit nahe, daß das menschliche Genom mehr als ein Notch-homologes Gen beherbergt. Dies steht im Gegensatz zu Drosophila, wo Notch offenbar ein Einzelkopie-Gen ist.
  • Der Vergleich der DNA- und Aminosäuresequenzen der menschlichen Notch-Homologen, die in hN3k und hN5k enthalten sind, mit den entsprechenden Drosophila-Notch-Sequenzen (wie veröffentlicht bei Wharton et al., 1985, Cell 43: 567-581) und mit den entsprechenden Xenopus-Notch-Sequenzen (wie veröffentlicht bei Coffman et al., 1990, Science 249: 1438-1441 oder erhältlich von Genbank® (Zugangsnummer M33874)) ergab ebenfalls Unterschiede.
  • Die in Fig. 10 gezeigte Aminosäuresequenz (hN3k) wurde mit der von Ellisen et al., August 1991, Cell 66: 649-661, vorhergesagten Sequenz des TAN-1-Polypeptids verglichen, die in Fig. 2 gezeigt ist. Zwischen den abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden einige Unterschiede festgestellt, allerdings ist die hN3k-Notch-Polypeptidsequenz überall zu 99% mit der entsprechenden TAN-1-Region (TAN-1, Aminosäuren 1455 bis 2506) identisch. Vier Unterschiede wurden festgestellt: (1) in der Region zwischen der dritten Notch/lin-12-Sequenzwiederholung und dem ersten cdc10-Motiv befindet sich ein Arginin (hN3k) anstelle eines X (TAN-1, Aminosäure 1763); (2) es existiert ein Prolin (hN3k) anstelle eines X (TAN-1, Aminosäure 1787); (3) es existiert eine konservative Änderung eines Aspartamsäurerestes (hN3k) anstelle eines Glutaminsäurerestes (TAN-1, Aminosäure 2495); und (4) die Carboxyl- terminale Region unterscheidet sich wesentlich zwischen den TAN-1-Aminosäuren 2507 und 2535.
  • Die in Fig. 11 gezeigte Aminosäuresequenz (hN5k) wurde mit der von Ellisen et al., August 1991, Cell 66: 649-661, vorhergesagten Sequenz des TAN-1-Polypeptids, die in Fig. 2 gezeigt ist, verglichen. Zwischen den abgeleiteten Aminosäuresequenzen wurden Unterschiede festgestellt. Das abgeleitete Notch-Polypeptid von hN5k ist mit dem TAN-1-Polypeptid (64% identisch zu Drosophila-Notch) in der cdc10-Region, die sowohl das cdc10-Motiv (TAN-1, Aminosäuren 1860 bis 2217) als auch die gut konservierten Flankierungsregionen (Fig. 12) enthält, zu 79% identisch. Die cdc10-Region deckt die Aminosäuren 1860 bis 2217 der TAN-1-Sequenz ab. Zusätzlich ist das hN5k-codierte Polypeptid mit dem TAN-1-Polypeptid (44% identisch zu Drosophila-Notch) am Carboxyl-terminalen Ende des Moleküls, das eine PEST(Prolin, Glutaminsäure, Serin, Threonin)-reiche Region (TAN-1, Aminosäuren 2482 bis 2551) (Fig. 12B) enthält, zu 65% identisch. Die Verlängerung von 215 Aminosäuren, die zwischen den zuvor genannten Regionen liegt, ist bei keinem der durch hN3k, hN5k und TAN-1 dargestellten Notch-homologen Klone gut konserviert. Weder das hN5k-Polypeptid noch Drosophila-Notch zeigt nennenswerte Niveaus von Aminosäureidentität gegenüber den anderen Proteinen in dieser Region (z. B. hN5k/TAN-1 = 24% Identität; hN5k/Drosophila- Notch = 11% Identität; TAN-1/Drosophila-Notch = 17% Identität). Im Gegensatz dazu teilen sich Xenopus-Notch (Xotch) (SEQ ID NO: 16), Ratten-Notch (SEQ ID NO: 17) und TAN-1 (SEQ ID NO: 18) weiterhin signifikante Niveaus der Sequenzidentität (z. B. TAN-1/Ratten-Notch = 75% Identität, TAN-1/Xenopus- Notch = 45% Identität, Ratten-Notch/Xenopus-Notch = 50% Identität).
  • Die Überprüfung der Sequenz der intrazellulären Domänen der Vertebraten-Notch-Homologen, die in Fig. 12B gezeigt sind, ergab eine unerwartete Feststellung: alle diese Proteine, einschließlich hN5k, enthalten ein vermeintliches CcN-Motiv, das mit einer Kern-gerichteten Funktion in der konservierten Region verbunden ist, die auf die letzte der sechs cdc10- Sequenzwiederholungen folgt (Fig. 12B). Obwohl bei Drosophila-Notch ein solches definiertes Motiv fehlt, ergab eine nähere Überprüfung seiner Sequenz das Vorliegen einer möglichen zweiteiligen Kern-Lokalisierungssequenz (Robbins et al., 1991, Cell 64: 615-623) sowie möglicher CK II- und cdc2- Phosphorylierungsstellen, alle in relativer Nähe zueinander, wodurch möglicherweise ein alternativer Typ von CcN-Motiv definiert ist (Fig. 12B).
  • Zur Isolierung von Klonen, die das 5'-Ende von hN (dem menschlichen Notch-Homologen, das zum Teil in hN5k enthalten ist) abdecken, wurde der Klon hN2k als Sonde zur Durchmusterung von 260000 Plaques aus der Phagen-Bibliothek des menschlichen fetalen Gehirns, die im Handel von Stratagene erhältlich ist, auf Kreuzhybridisierungsklone verwendet. Vier Klone wurden identifiziert und unter Anwendung von Standardverfahren isoliert (Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Vier Klone wurden auch durch Hybridisierung mit der Notch-homologen Sequenz von Adams et al., 1992, Nature 355: 632-655 isoliert, die von der ATCC erhalten wurde.
  • Zur Isolierung von Klonen, die das 5'-Ende von TAN-1 abdeckten, wurde die Bibliothek des menschlichen fetale Gehirns, die käuflich von Stratagene erhältlich ist, auf Klone durchmustert, die die Sequenz bis zum 5'-Ende verlängern würden. 880000 Plaques wurden durchmustert, und vier Klone, die mit den hN3k-Sequenzen kreuzhybridisieren, wurden identifiziert. Die Sequenzierung bestätigte die relative Position dieser Sequenzen innerhalb des Notch-Proteins, das von TAN-1 codiert wird.
  • Die 5'-Sequenz unseres isolierten TAN-1-Homologen wurde durch die Nukleotidnummer 972 (wobei Nukleotidnummer 1 das A im ATG-Startcodon ist) bestimmt und mit der Sequenz (wie veröffentlicht von Ellisen et al., 1991, Cell 66: 649-661) verglichen. Bei Nukleotid 559 besitzt unser TAN-1-Homolog ein G, wohin gegen Ellisen et al. ein A offenbaren, wobei die Änderung zu einer unterschiedlich codierten Aminosäure führt. Somit unterscheidet sich unser TAN-1-codiertes Protein innerhalb den ersten 324 Aminosäuren von demjenigen, das von Ellisen et al. gelehrt wird, da unser Protein ein Gly in Position 187 aufweist, wohin gegen Ellisen et al. an dieser Position ein Arg offenbaren (wie in Fig. 13 dargestellt).
  • Die Vollängen-Aminosäuresequenzen sowohl der hN- (SEQ ID NO: 19) als auch TAN-1-codierten (SEQ ID NO: 20) Proteine, sowie der Xenopus- und Drosophila-Notch-Proteine sind in Fig. 13 gezeigt. Die Vollängen-DNA-Codierungssequenz (mit der Ausnahme derjenigen, die den Initiator Met codiert) (enthalten in der SEQ ID NO: 21), und die codierte Aminosäuresequenz (mit der Ausnahme, daß der Initiator Met nicht gezeigt ist) (enthalten in der SEQ ID NO: 19) von hN sind in Fig. 17 gezeigt.
    • 9.2 EXPRESSION VON MENSCHLICHEM NOTCH
  • Expressionskonstrukte wurden unter Verwendung der menschlichen Notch-cDNA-Klone hergestellt, die in Abschnitt 9.1 vorstehend diskutiert wurden. In den Fällen von hN3k und hN2k wurde der gesamte Klon als EcoRI-Restriktionsfragment aus seinem Vektor herausgeschnitten und in die EcoRI-Restriktionsstelle von jedem der drei pGEX-Vektoren (Glutathion-S- Transferaseexpressionsvektoren; Smith und Johnson, 1988, Gene 7, 31-40) subkloniert. Dies gestattet die Expression des Notch-Proteinprodukts aus dem Subklon in dem korrekten Leserahmen. Im Falle von hN5k enthält der Klon zwei interne Eco- RI-Restriktionsstellen, die 2,6, 1,5 und 0,6 kb-Fragmente produzieren. Sowohl das 2,6- als auch das 1,5 kb-Fragment wurden ebenfalls in jeden der pGEX-Vektoren subkloniert.
  • Das pGEX-Vektorsystem wurde zum Erhalt der Expression von menschlichen Notch-Fusions(chimären)-Proteinen aus den nachstehend beschriebenen Konstrukten verwendet. Die klonierte Notch-DNA wurde in jedem Fall in Phase in den entsprechenden pGEX-Vektor inseriert. Anschließend wurde jedes Konstrukt durch Elektroporation in Bakterien (E. coli) eingeschleust und als die Notch-Protein-Sequenzen-enthaltendes Fusionsprotein, das an den Carboxyl-Terminus des Glutathion-S-Transferase-Proteins fusioniert war, exprimiert. Die Expression der Fusionsproteine wurde durch Analyse von bakteriellen Proteinextrakten, durch Polyacrylamidgelelektrophorese unter Vergleich von Proteinextrakten, die aus Bakterien erhalten wurden, die die pGEX-Plasmide mit und ohne die inserierte Notch-DNA enthielten, bestätigt. Die Fusionsproteine waren in wässriger Lösung löslich und wurden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Glutathion-beschichteter Agarose (da der Carboxylterminus von Glutathion-S-Transferase an Glutathion bindet) aus Bakterienlysaten gereinigt. Die exprimierten Fusionsproteine wurden über einen Antikörper an Drosophila-Notch gebunden, wie durch Western-Blots geprüft.
  • Die zur Herstellung von menschlichen Notch-Glutathion-S- Transferasefusionsproteinen verwendeter Konstrukte waren wie folgt:
  • hNFP Nr. 2 - PCR wurde zum Erhalt eines Fragments, beginnend unmittelbar vor den cdc10-Sequenzwiederholungen bei Nukleotid 192 der hNSk-Insertion bis unmittelbar vor die PEST-reiche Region bei Nukleotid 1694, verwendet. Die DNA wurde anschließend mit BamHI und SmaI verdaut, und das resultierende Fragment wurde in pGEX-3 ligiert. Nach der Expression wurde das Fusionsprotein durch Binden an Glutathionagarose gereinigt. Das gereinigte Polypeptid wurde über ein 4- bis 15%iges Gradienten-Polyacrylamidgel quantifiziert. Das resultierende Fusionsprotein besaß ein ungefähres Molekulargewicht von 83 kD.
  • hN3FP-Nr. 1 - Die gesamte hN3k-DNA-Insertion (Nukleotid 1 bis 3235) wurde aus dem Bluescript (SK)-Vektor durch Verdau mit EcoRI herausgeschnitten. Die DNA wurde in pGEX-3 ligiert.
  • hNFP-Nr. 2 - Ein 3'-Segment von hN3k-DNA (Nukleotid 1847 bis 3235) plus etwas Polylinker wurde aus dem Bluescript (SK)- Vektor durch Verdau mit XmaI herausgeschnitten. Das Fragment wurde in pGEX-1 ligiert.
  • Nach der Reinigung werden diese Fusionsproteine zur Herstellung von entweder polyklonalen und/oder monoklonalen Antikörpern gegen menschliches Notch verwendet.
    • 10. NOTCH-EXPRESSION IN GESUNDEN UND BÖSARTIGEN ZELLEN
  • Verschiedene menschliche Patientengewebe-Proben und Zell- Linien, die sowohl gesundes als auch eine breite Vielzahl bösartiger Zellen darstellten, werden zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung der Expression von Notch getestet. Patientengewebe-Proben werden vom Department für Pathologie der Yale University School of Medicine erhalten.
  • Die folgenden Test werden zum Messen der Notch-Expression in Patientengewebe-Proben verwendet: (a) Northern-Hybridisierung; (b) Western-Blots; (c) in situ Hybridisierung; und (d) Immunozytochemie. Die Tests werden unter Anwendung von Standardtechniken durchgeführt. Die Northern-Hybridisierung und in situ Hybridisierung werden (i) unter Verwendung einer DNA-Sonde, die auf die Notch-Sequenz des Klons hN3k spezifisch ist; und (ü) unter Verwendung einer DNA-Sonde, die auf die Notch-Sequenz von Klon hN5k spezifisch ist, durchgeführt. Western-Blots und Immunozytochemie werden unter Verwendung eines Antikörpers auf Drosophila-Notch-Protein (der auch menschliche Notch-Proteine erkennt) durchgeführt.
  • Northern-Hybridisierung und Western-Blots, wie vorstehend beschrieben, werden ebenfalls zur Analyse zahlreicher menschlicher Zell-Linien verwendet, die verschiedene gesunde oder kanzeröse Gewebe darstellen. Die getesteten Zell-Linien sind in Tabelle 2 aufgeführt.
    • TABELLE 2 MENSCHLICHE ZELLINIEN Gewebe/Tumor Zellinie
  • Knochenmark IM-9
  • KG-1
  • Gehirn A-172
  • HS 683
  • U-87MG
  • TE 671
  • Brust BT-20
  • Hs 578Bs
  • MDA-MB-330
  • Darm Caco-2
  • SW 48
  • T84
  • WiDr
  • Embryo FHs 173We
  • Nieren A-498
  • A-704
  • Caki-2
  • Leukämie ARH-77
  • KG- 1
  • Leber Hep G2
  • WRL 68
  • Lunge Calu-1
  • HLF-a
  • SK-Lu-I
  • Lymphoblasten CCRF-CEM
  • HuT 78
  • Lymphome Hs 445
  • MS116
  • U-937
  • Melanome A-375
  • G-361
  • Hs 294T
  • SK-MEL-1
  • Myelome IM-9
  • RPMI 8226
  • Neuroblastome IMR-32
  • SK-N-SH
  • SK-N-MC
  • Eierstock Caov-3
  • Caov-4
  • PA-1
  • Plasmazellen ARH-77
  • Sarkom A-204
  • A673
  • HOS
  • Haut Amdur II
  • BUD-8
  • Hoden Tera-1
  • Tera-2
  • Thymus Hs67
  • Uterus AN3 Ca
  • HEC-1-A
  • Die Bösartigkeit bösartiger Zellgewebstypen, bei denen sich gezeigt hat, daß sie Notch spezifisch exprimieren, kann wie in Abschnitt 5.1 et seq. beschrieben behandelt werden.
    • 10.1 DIE EXPRESSION VON MENSCHLICHEM NOTCH-PROTEIN IST BEI VERSCHIEDENEN BÖSARTIGKEITEN ERHÖHT
  • Wie nachstehend beschrieben, haben wir festgestellt, daß die menschliche Notch-Proteinexpression bei mindestens drei menschlichen Krebsarten, nämlich Zervikal-, Brust- und Darmkrebs, erhöht ist. Die immunozytochemische Anfärbung von Gewebeproben aus Zervikal-, Brust- und Darmkrebs von menschlichen Patienten zeigte eindeutig, daß das bösartige Gewebe hohe Konzentrationen an Notch, auf im Vergleich zu nicht bösartigen Gewebeschnitten erhöhten Niveaus, exprimieren. Dieses breite Spektrum an diversen Neoplasien mit erhöhter Notch- Expression, legt nahe, daß viel mehr kanzeröse Zustände mit Notch-Überregulierung vorkommen.
  • Scheiben von menschlichen Tumorproben (aus Brust-, Darm- und Zervikaltumoren) wurden von der Gewebebank der pathologischen Abteilung der Yale Medical School erhalten. Die Anfärbungen erfolgten unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die gegen die P1- und P4-Fusionsproteine gezüchtet wurden, die aus Sequenzen von hN bzw. TAN-1 erzeugt worden sind.
  • Die P1- und P4-Fusionsproteine wurden durch Insertion der gewünschten menschlichen Notch-Sequenz in den entsprechenden pGEX-Expressionsvektor erhalten (Smith und Johnson, 1988, Gene 7: 31-40; AMRAD Corp., Melbourne, Australia) und wurden nach den Anweisungen des Herstellers (AMRAD Corp.) affinitätschromatographisch gereinigt. Zur Herstellung des P1- Fusionsproteins wurde pGEX-2 mit BamHI geschnitten und an ein Concatamer ligiert, das aus drei Kopien eines 518 bp-BamHI- BgIII-Fragment von hN besteht. Ratten wurden mit dem exprimierten Gen immunisiert, und monoklonale Antikörper wurden durch Standardverfahren produziert. Zur Produktion des P4- Fusionsproteins wurden pGEX-2 mit BamHI geschnitten und mit einem Concatamer ligiert, das aus drei Kopien eines 473 bp- BamHI-BgIII-Fragments von TAN-1 besteht. Mit dem exprimierten Gen wurden Ratten immunisiert, und monoklonale Antiköper wurden durch Standardverfahren produziert.
  • In sämtlichen getesteten Tumoren waren die Notch-Proteine, die sowohl von dem menschlichen Notch-Homologen TAN-1 als auch von hN codiert wurden, im bösartigen Teil des Gewebes im Vergleich zum gesunden Teil in erhöhten Konzentrationen vorhanden. Repräsentative Anfärbungen sind in den bereitgestellten Bildern gezeigt (Fig. 14-16).
  • Das Anfärbeverfahren war wie folgt: Die Gewebe wurden in Paraformaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet, in 5 um dicke Schnitte geschnitten und auf Glasträger gelegt. Anschließend wurden die folgenden Schritte durchgeführt:
  • 1. Paraffinentfernung durch viermaligen Xylolaustausch jeweils 4 min.
  • 2. Entfernung von Xylol durch dreimaligen Austausch mit absolutem Ethanol, jeweils 4 min.
  • 3. Stufenweise Rehydratation der Gewebe durch Eintauchen der Scheiben in 95%, 90%, 80%, 60% und 30% Ethanol, jeweils 4 min lang. Am Ende wurden die Scheiben 5 min in destilliertem Wasser gespült.
  • 4. Stoppen von endogener Peroxidase durch Inkubation für 30 min in 0,3% Wasserstoffperoxid in Methanol.
  • 5. Waschen in PBS (10 mM Natriumphosphat, pH 7,5, 0,9% NaCl) für 20 min.
  • 6. Inkubation für 1 h in Blockierungslösung. (Blockierungslösung: PBS, enthaltend 4% normales Kaninchenserum und 0,1% Triton X-100).
  • 7. Inkubation über Nacht bei 4ºC mit primärem Antikörper, verdünnt in Blockierungslösung. Endkonzentration von primärem Antikörper 20-50 ug/ml.
  • 8. Waschen für 20 min mit PBS + 0,1% Triton X-100 (dreimal ausgetauscht).
  • 9. Inkubation für 30 min mit biotinyliertem Kaninchen-Anti-Ratten-Antikörper: 50 ul biotinylierter Antiköper (VECTOR) in 10 ml Blockierungslösung.
  • 10. Waschen für 20 min in PBS + 0,1% Triton X-100 (dreimal ausgetauscht).
  • 11. Inkubation mit ABC-Reagenz (VECTOR) für 30 min (das Reagenz wird in PBS + 0,1% Triton-X-100 hergestellt).
  • 12. Waschen für 20 min in PBS + 0,1% Triton-X-100. Anschließend Inkubation für 2 min in PBS + 0,5% Triton-X-100.
  • 13. Inkubation für 2-5 min in Peroxidasesubstratlösung. Peroxidasesubstratlösung: Gleiche Volumina von 0,02% Wasserstoffperoxid in destilliertem Wasser und 0,1% Diaminobenzidintetrahydrochlorid (DAB) in 0,1 M Trispuffer, pH 7,5 werden unmittelbar vor der Inkubation mit den Geweben gemischt. Triton X-100 wird der Endlösung in einer Konzentration von 0,5% zugesetzt.
  • 14. Waschen für 15 min in Leitungswasser.
  • 15. Gegenfärben für 10 min mit Mayer's Hämatoxylin.
  • 16. Waschen für 15 min in Leitungswasser.
  • 17. Dehydratation durch Austausch mit 30%, 60%, 80%, 90%, 95% und absoluten Ethanol (jeweils 4 min).
  • 18. Eintauchen in Xylol (2maliger Austausch, jeweils 4 min).
  • 19. Fixieren, Lichtmikroskopie.
    • 11. HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN
  • Die folgenden rekombinanten Bakterien, die jeweils ein Plasmid tragen, das einen Teil des menschlichen Notch codiert, wurden am 2. Mai 1991 bei der American Type Culture Collection, 1201 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, unter den Auflagen des Budapester Vertrags über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zu Patentierungszwecken hinterlegt.
  • Es sind hier verschiedene Veröffentlichungen zitiert, die der Fachmann wegen weiterer Informationen über das besprochene Problem heranziehen könnte.

Claims (69)

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, das ein Notch-Protein und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das Notch- Protein ein humanes Notch-Protein ist.
3. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Protein, wobei das genannte Protein eine Aminosäuresequenz aufweist, für die eine DNA-Sequenz codiert, die dargestellt ist in Fig. 8A (SEQ ID NO: 5), 8B (SEQ ID NO: 6), 8C (SEQ ID NO: 7), 9A (SEQ ID NO: 8), oder 9B (SEQ ID NO: 9), und von einem Antikörper gegen ein Notch- Protein gebunden werden kann, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
4. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Protein, wobei das Protein eine Notch-Aminosäuresequenz aufweist, die dargestellt ist in Fig. 8A (SEQ ID NO: 5), 8B (SEQ ID NO: 6), 8C (SEQ ID NO: 7), 9A (SEQ ID NO: 8), oder 9B (SEQ ID NO: 9), und eine oder mehrere funktionale Aktivitäten zeigt, die mit einem Notch- Protein voller Länge assoziiert sind, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Protein, wobei das Protein ein Fragment eines humanen Notch-Proteins aufweist, das im wesentlichen aus der extrazellulären Domäne des Proteins besteht, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Protein, wobei das Protein einen Abschnitt eines Notch- Proteins aufweist, der die EGF-homologen Wiederholungseinheiten des Proteins umfaßt, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Fragment eines Notch-Proteins, dem ein Abschnitt der EGF- homologen Wiederholungseinheiten des Proteins fehlt, wobei das Fragment von einem Antikörper gegen ein Notch-Protein gebunden werden kann, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
8. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Protein, wobei das Protein einen funktional aktiven Abschnitt eines Notch-Proteins aufweist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
9. Zusammensetzung nach Anspruch 8, worin das Notch- Protein ein humanes Notch-Protein ist.
10. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein chimäres Protein, wobei das genannte chimäre Protein einen funktional aktiven Abschnitt eines humanen Notch- Proteins aufweist, der mittels einer Peptid-Bindung mit einer Sequenz eines Proteins verbunden ist, das sich von dem Notch-Protein unterscheidet, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, worin für den funktional aktiven Abschnitt des Notch-Proteins die humane cDNA-Sequenz codiert, die in dem Plasmid hN3k enthalten ist, wie es bei ATCC hinterlegt ist und dem die Zugangs-Nr. 68609 zugeordnet wurde, oder für den die humane cDNA-Sequenz codiert, die in dem Plasmid hNSk enthalten ist, wie es bei ATCC hinterlegt ist und dem die Zugangs-Nr. 68611 zugeordnet wurde.
12. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Protein, wobei das Protein die Aminosäuresequenz aufweist, die in Fig. 10 (SEQ ID NO: 11) gezeigt ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
13. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Protein, wobei das Protein die Aminosäuresequenz aufweist, die in Fig. 11 (SEQ ID NO: 13) gezeigt ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
14. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Protein, wobei das Protein den Abschnitt eines humanen Notch-Proteins aufweist, der die größte Homologie zu den Epidermiswachstumsfaktor-artigen Wiederholungseinheiten 11 und 12 der Drosophila Notch-Sequenz aufweist, wie sie in Fig. 4 (SEQ ID NO: 14) gezeigt ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
15. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Derivat oder ein Analoges eines Notch-Proteins, wobei das Derivat oder Analoge durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, bei der Expression an der Oberfläche einer ersten Zelle in vitro ein Delta-Protein zu binden, das an der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiert ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
16. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein chimäres Protein, wobei das chimäre Protein ein Notch- Protein aufweist, das mittels eine Peptidbindung mit einer Protein-Sequenz eines Proteins verknüpft ist, das sich von dem Notch-Protein unterscheidet, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
17. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Fragment eines Notch-Proteins, wobei das Fragment durch die Fähigkeit charakterisiert ist, wenn es an der Oberfläche einer ersten Zelle exprimiert wird, in vitro an ein Delta-Protein zu binden, das an der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiert ist, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
18. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein chimäres Protein, wobei das chimäre Protein eine Fraktion eines Notch-Proteins aufweist, die mittels einer Peptid-Bindung mit einer Protein-Sequenz eines Proteins, das sich von dem Notch-Protein unterscheidet, verknüpft ist, wobei das Fragment durch die Fähigkeit charakterisiert ist, bei der Expression an der Oberfläche einer ersten Zelle in vitro an ein Delta-Protein zu binden, das an der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiert ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
19. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Derivat oder Analoges eines Notch-Proteins, wobei das Derivat oder Analoge durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, bei seiner Expression an der Oberfläche einer ersten Zelle in vitro an ein zweites Protein zu binden, das an der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiert ist, wobei das genannte zweite Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus einem Delta-Protein und einem Serrate-Protein besteht, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
20. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Nukleinsäure, die für ein Notch-Protein codiert, sowie einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
21. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Nukleinsäure, die für einen funktional aktiven Abschnitt eines humanen Notch-Proteins codiert, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
22. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz codiert, die in Fig. 10 (SEQ ID NO: 11) gezeigt ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
23. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Nukleinsäure, die für die Aminosäuresequenz codiert, die in Fig. 11 (SEg ID NO: 13) gezeigt ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
24. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Nukleinsäure, die für ein Fragment eines Notch-Proteins codiert, wobei das Fragment durch seine Fähigkeit charakterisiert ist, bei seiner Expression an der Oberfläche einer ersten Zelle in vitro an ein Delta- Protein zu binden, das an der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiert ist, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
25. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend eine Nukleinsäure, die für ein chimäres Protein codiert, wobei das chimäre Protein ein funktional aktives Fragment eines humanen Notch-Proteins aufweist, das mittels einer Peptid-Bindung mit einer Protein-Sequenz eines Proteins verknüpft ist, das sich von dem Notch- Protein unterscheidet; und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
26. Zusammensetzung nach Anspruch 21, bei dem die Nukleinsäure ein Nukleinsäure-Vektor ist.
27. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend einen Antikörper, der ein Notch-Protein bindet, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
28. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend ein Fragment oder Derivat eines Antikörpers zu einem Notch- Protein, das den Idiotyp des Antikörpers enthält, und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
29. Verwendung einer Zusammensetzung, die ein Molekül aufweist, das im Hinblick auf die Funktion eines Notch- Proteins antagonistisch wirkt, zur Herstellung eines Medikaments zu Behandlung einer Störung oder Erkrankung.
30. Verwendung nach Anspruch 29, bei der die Störung oder Erkrankung Gebärmutterhalskrebs, Brustkrebs oder Dickdarmkrebs ist.
31. Verwendung eines Moleküls, wobei das Molekül im Hinblick auf die Funktion eines Notch-Proteins antagonistisch wirkt, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer bösartigen Erkrankung in einem Patienten, wobei die bösartige Erkrankung gekennzeichnet ist durch (i) eine erhöhte Notch-Aktivität oder (ii) eine erhöhte Expression eines Notch-Proteins oder (iii) eine erhöhte Expression eines Notch-Derivats, das in der Lage ist, von einem Anti-Notch-Antikörper gebunden zu werden, und zwar bezogen auf die genannte Notch-Aktivität oder Expression in einer analogen nicht malignen Probe.
32. Verwendung nach Anspruch 31, bei der die bösartige Erkrankung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Melanom, Seminom und Lungenkrebs besteht.
33. Verwendung nach Anspruch 31, wobei der Patient ein Mensch ist.
34. Verwendung nach Anspruch 30, bei der das Molekül ein Antikörper gegen Notch oder ein Teil des genannten Antikörpers ist, der dessen Bindungsdomäne enthält.
35. Verwendung nach Anspruch 30, bei der das Molekül ein Protein ist, das wenigstens aus der extrazellulären Domäne eines Notch-Proteins besteht, oder ein Teil davon, der in der Lage ist, einen Notch-Liganden zu binden.
36. Verwendung nach Anspruch 30, bei der das Molekül ein Protein ist, das wenigstens aus den EGF-homologen Wiederholungseinheiten eines Notch-Proteins besteht.
37. Verwendung nach Anspruch 30, bei der das Molekül ein Protein ist, das wenigstens aus einem adhäsiven Fragment eines Notch-Proteins besteht.
38. Verwendung nach Anspruch 30, bei der das Molekül ein Oligonukleotid ist, das (a) wenigstens aus sechs Nukleotiden besteht, (b) eine Sequenz umfaßt, die komplementär zu wenigstens einem Teil eines RNA- Transkripts eines Notch-Gens ist, und (c) mit dem RNA- Transkript hybridisierbar ist.
39. Verwendung eines Moleküls, das die Funktion eines Notch-Proteins unterstützt, zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder zur Behandlung einer Krankheit oder Störung bei einem Patienten.
40. Verwendung eines Notch-Protein zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder zur Behandlung einer bösartigen Erkrankung bei einem Patienten.
41. Verwendung eines funktional aktiven Abschnitts eines Notch-Proteins zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung einer bösartigen Erkrankung bei einem Patienten.
42. Verwendung nach Anspruch 40, bei der das Notch-Protein ein humanes Notch-Protein ist.
43. Verwendung eines chimären Proteins, wobei das Protein einen funktional aktiven Abschnitt eines Notch-Proteins aufweist, der mittels einer Peptid-Bindung mit einer Proteinsequenz eines Proteins verknüpft ist, das sich von dem Notch-Protein unterscheidet, zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder zur Behandlung einer bösartigen Erkrankung bei einem Patienten.
44. Verwendung nach Anspruch 42, bei der das humane Notch- Protein die Aminosäuresequenz aufweist, die in Fig. 10 (SEQ: ID NO: 11) oder Fig. 11 (SEQ ID NO: 13) gezeigt ist.
45. Verwendung eines Derivats oder Analogen eines Notch- Proteins, wobei das Derivat oder Analoge durch die Fähigkeit gekennzeichnet ist, bei seiner Expression an der Oberfläche einer ersten Zelle in vitro an ein zweites Protein zu binden, das an der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiert ist, wobei das zweite Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus einem Delta-Protein und einem Serrate-Protein, zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder Behandlung einer bösartigen Erkrankung bei einem Patienten.
46. Verwendung einer Nukleinsäure, die für Notch-Protein codiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder zur Behandlung einer bösartigen Erkrankung bei einem Patienten.
47. Verwendung einer Nukleinsäure, die für einen funktional aktiven Abschnitt eines Notch-Proteins codiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder zur Behandlung einer bösartigen Erkrankung bei einem Patienten.
48. Verwendung nach Anspruch 46, wobei der Patient menschlich ist und das Notch-Protein ein humanes Notch- Protein ist.
49. Verwendung einer Nukleinsäure, die für ein Fragment eines Notch-Protein codiert, wobei das Fragment durch die Fähigkeit charakterisiert ist, bei seiner Expression an der Oberfläche einer ersten Zelle in vitro an ein zweites Protein zu binden, das an der Oberfläche einer zweiten Zelle exprimiert ist, wobei das zweite Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus einem Delta-Protein und einem Serrate-Protein, zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder zur Behandlung einer bösartigen Erkrankung bei einem Patienten.
50. Verwendung eines Antikörpers zu einem Notch-Protein zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung oder zur Behandlung einer bösartigen Erkrankung bei einem Patienten.
51. Verwendung nach Anspruch 50, bei der der Antikörper monoklonal ist.
52. Verwendung eines Oligonukleotids, wobei dieses Oligonukleotid (a) aus wenigstens sechs Nukleotiden besteht, (b) eine Sequenz aufweist, die zu wenigstens einem Teil eines RNA-Transkripts des Notch-Gens komplementär ist, und (c) mit dem RNA-Transkript hybridisierbar ist, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumortyps, der durch die Expression eines Notch-Gens charakterisiert ist, bei einem Patienten.
53. Verwendung nach Anspruch 52, bei der der Patient ein Mensch ist und das Notch-Gen ein humanes Gen ist.
54. Isoliertes Oligonukleotid, das aus wenigstens sechs Nukleotiden besteht und eine Sequenz aufweist, die wenigstens zu einem Teil eines RNA-Transkripts eines Notch-Gens komplementär ist, wobei dieses Oligonukleotid mit dem RNA-Transkript hybridisierbar ist.
55. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend das Oligonukleotid von Anspruch 54 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.
56. Verwendung des Oligonukleotids von Anspruch 54 zur Herstellung eines Medikaments zur Inhibierung der Expression einer Nukleinsäuresequenz, die in einer Zelle für ein Notch-Protein codiert.
57. Verfahren zur Diagnose einer Krankheit oder Störung, die durch einen aberrierenden Grad an Notch-Protein oder dessen Aktivität bei einem Patienten gekennzeichnet ist, das das Messen des Grads der Notch- Protein-Expression oder -Aktivität in einer Probe umfaßt, die von dem Patienten gewonnen wurde, wobei eine Zunahme oder Abnahme an Notch-Protein oder dessen Aktivität in der Patientenprobe, bezogen auf den Grad, der in einer derartigen Probe eines normalen Individuums gefunden wird, das Vorliegen der Erkrankung oder Störung bei dem Patienten anzeigt.
58. Verfahren zur Diagnose einer bösartigen Erkrankung, die durch eine erhöhte Menge an Notch-Protein oder eines Notch-Derivats gekennzeichnet ist, das in der Lage ist, von einem Anti-Notch-Antikörper gebunden zu werden, das das Messen der Menge eines Notch-Proteins oder eines Notch-Derivats, das von einem Anti-Notch-Antikörper gebunden werden kann, in einer Probe umfaßt, die bösartige Zellen eines Patienten enthält oder im Verdacht steht, derartige Zellen zu enthalten, wobei eine Zunahme der Menge des Notch-Proteins oder des Notch- Derivats, das von einem Anti-Notch-Antikörper gebunden werden kann, in der Probe, bezogen auf die entsprechende Menge in einer analogen Probe von nicht malignen Zellen, das Vorliegen der Erkrankung oder Störung bei dem Patienten anzeigt.
59. Verfahren nach Anspruch 58, bei dem die bösartige Erkrankung Gebärmutterhalskrebs ist.
60. Verfahren nach Anspruch 58, bei dem die bösartige Erkrankung Brustkrebs ist.
61. Verfahren nach Anspruch 58, bei dem die bösartige Erkrankung Dickdarmkrebs ist.
62. Verfahren nach Anspruch 58, bei dem die bösartige Erkrankung aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Melanom, Seminom und Lungenkrebs.
63. Verfahren nach Anspruch 28, bei dem die Menge des Notch-Proteins oder des Derivats mittels eines Verfahrens gemessen wird, das das Inkontaktbringen der Probe mit einem Anti-Notch-Antikörper auf eine Weise, daß es zu einer immunspezifischen Bindung kommen kann, und das Messen der Menge jeder immunspezifischen Bindung des Antikörpers, zu der es kommt, umfaßt.
64. Verwendung eines funktional aktiven Abschnitts eines Notch-Proteins zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Verhinderung einer Störung des Nervensystems.
65. Verwendung eines funktional aktiven Abschnitts eines Notch-Proteins bei der Herstellung eines Medikaments zur Unterstützung der Geweberegeneration oder -reparatur bei einem Patienten.
66. Verwendung eines funktional aktiven Abschnitts eines Notch-Proteins zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer gutartigen dysproliferativen Störung, wobei die Störung aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Leberzirrhose, Psoriasis, Keloiden und Kahlheit.
67. Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei der das Notch- Protein die Aminosäuresequenz aufweist, für die das hN- Homologe codiert, wie es in Fig. 13 von der Aminosäure Nrn. 26 bis 2169 (wie sie in SEQ ID NO: 19 enthalten sind) gezeigt ist.
68. Zusammensetzung, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge eines Notch-Proteins oder Notch-Derivats, wobei das Derivat in der Lage ist, an einen Anti-Notch-Antikörper zu binden, zur Verwendung als ein Medikament.
69. Zusammensetzung, die eine therapeutisch wirksame Menge eines Moleküls aufweist, das im Hinblick auf die Funktion eines Notch-Proteins antagonistisch wirkt, zur Verwendung als ein Medikament.
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