DE69332652T2

DE69332652T2 - Verbesserungen in bezug auf die herstellung von malariaimpstoffen

Info

Publication number: DE69332652T2
Application number: DE69332652T
Authority: DE
Inventors: John Blackman; Andrew Chappel; Arthur Holder
Original assignee: Medical Research Council
Current assignee: Medical Research Council
Priority date: 1992-02-22
Filing date: 1993-02-22
Publication date: 2003-11-27
Anticipated expiration: 2013-02-23
Also published as: EP0627004B1; NZ249208A; US5720959A; ATE231555T1; AU666519B2; CA2128109A1; CA2128109C; ES2192556T3; DE69332652D1; JPH07504321A; EP0627004A1; KR100262624B1; DK0627004T3; AU3570493A; WO1993017107A1; GB9203821D0; KR950700415A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung von antigenen Teilen des Malariaproteins, deren Expression in Wirtszellen, insbesondere Bakterien und deren potentielle Verwendung als Impfstoff.

Hintergrund der Erfindung

Malaria wird durch einen Protozoenparasiten des Genus Plasmodium hervorgerufen. Es existieren vier Spezies, die Menschen infizieren, P. falciparum. vivax P. malariae und P. ovale. Von diesen ist P. falciparum im wesentlichen für die akute und oft tödliche Malaria verantwortlich, aber mit jeder Malariainfektion ist eine signifikante Sterblichkeit verbunden und ein großer Teil der Weltbevölkerung trägt ein Risiko, an dieser Krankheit zu erkranken. Es ist geschätzt worden, dass Malaria in den Teilen der Welt ein allgemeines Gesundheitsproblem darstellt; in denen 40% der Weltbevölkerung leben, und dass die Krankheit für diese Länder schwerwiegende soziale und ökonomische Konsequenzen hat. In letzter Zeit erfolgte ein Wiederanstieg der Erkrankungen aufgrund des Abbruchs oder des Versagens von Kontrollmaßnahmen und aufgrund der zunehmenden Resistenz des Vektors gegenüber Insektiziden und der zunehmenden Resistenz von falciparum-Malaria gegenüber Chemotherapie. Es besteht daher ein dringendes Bedürfnis an der Entwicklung eines Impfstoffs, der gegen Malaria wirksam ist.
Die meisten Versuche zur Entwicklung eines Impfstoffs waren auf den Versuch fokussiert, einzelne Proteine zu identifizieren, die zum Auslösen einer schützenden Immunantwort in dem Wirt gegen die relevante Spezies und Entwicklungsstufe des Parasiten fähig sind. Dies ist an sich bereits aufgrund der Komplexität des Lebenszyklus des Parasiten, der Zahl und Diversität der Antigene innerhalb des Spektrums der synthetisierten Polypeptide und des nur oberflächlichen Verständnisses, das man bezüglich der wichtigen Aspekte des Immunsystems, das die Malaria bekämpft, bereits eine enorme Aufgabe. Nichtsdestotrotz sind unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern, Seren aus immunisierten Lebewesen und Antikörpern für Fragment von Genen, die aus Genbanken in Bakterien exprimiert wurden, mehrere Proteine identifiziert worden. Unter Verwendung einer Vielzahl von Kriterien, einschließlich der Wirkung von Antikörpern in vitro oder in vivo auf das Wachstum und die Entwicklung des Parasiten, direkten Immunisierungsstudien und der subzellulären Lokalisierung oder möglichen Funktion eines Proteins, sind mehrere Kanndidaten für einen Impfstoff vorgeschlagen worden.
Einer dieser Kandidaten ist das Merozoit-Oberflächenprotein 1 (abgekürzt als MSP1, aber auch als MSA1, PMMSA, P.190 oder gP195 bekannt), das an der Außenseite des Merozoits, dem Stadium des Parasiten, der die Erythrozyten angreift, lokalisiert ist. MSP1 wird auf der Merozoit-Oberfläche aller Malariaparasiten Spezies gefunden und ist daher in ideales Ziel für einen möglichen Malariaimpfstoff. Das Vorläuferprotein ist proteolytisch prozessiert, um. einen Komplex aus verschiedenen Polypeptiden verschiedener Molekulargewichte zu bilden (Holder et al., [1987] Parasitology 94 199-208).
Es ist gezeigt worden, dass das aus P. falciparum gereinigtes Protein gegen einen Blutstadiumbefall schützt (Siddiqui et al., [1987] Proc. Natl. Acad. Sci. 84 3014-3018). In zwei verschiedenen Berichten ist gezeigt worden, dass monoklonale Antikörper für dieses Molekül das Eindringen in vitro inhibieren (Pirson & Perkins [1985] Journal of Immunology 134 1946-1951; Blackman et al., [1990] Journal of Experimental Medicine 172. 379-382). In dieser zweiten Studie wurde das Ziel der Antikörper als 19 kDa-Fragment identifiziert, das aus dem C-Terminus des Vorläufers abgeleitet ist und das während dem Eindringen in Erythrozyten auf der Oberfläche der Merozoiten verbleibt. Ein monoklonaler Antikörper, der für das homologe Protein spezifisch ist, das von P. yoelii exprimiert wird, inhibiert das Wachstum dieses Parasiten in vivo nach dem passiven Transfer auf infizierte Mäuse (Majarian et al. Journal of Immunology 132, 3131-3137 [1984]), und das Epitop ist auf der C-terminalen Sequenz dieses Proteins kartiert worden (Burns et al., [1989] Journal of Immunology 143, 2670-2676).
Antikörper für die C-terminale Region des Vorläufers binden nicht an das Protein, nachdem dieses mit Reduktionsmitteln wie Mercapthoethanol oder Dithiothreitol behandelt wurde, wodurch nahegelegt wird, dass die vielen Cysteinreste in diesem Bereich spezifische Disulfidbindungen eingehen. Da es zu den allgemein bekannten Erfahrungen gehört, dass als intrazelluläre Proteine in e. coli exprimierte Proteine keine korrekten Disulfide bilden, wurde die Expression und Sekretion unter Verwendung des Baculovirus/Insektenzellensystems für die terminalen 293 Aminosäuren des Vorläufers verwendet (Murphy et al., [1990] Parasitology 100, 177-183).
Bei der weiteren Entwicklung dieser Polypeptide zu einem in der Praxis verwendbaren Produkt ist ihre Isolierung aus den Parasiten kein zur Umsetzung geeigneter Vorschlag und daher entfällt ein Großteil der gegenwärtigen Forschung auf die Verwendung von rekombinanten DNA oder Peptidsynthesetechniken, um dieses Problem zu überwinden. Die Expression einer Gensequenz in Bakterien ist jedoch nicht immer ganz einfach, da die antigenen Eigenschaften des Produkts unter Umständen nicht die gleichen sind, wie die des nativen Proteins, und zwar aufgrund einer inkorrekten Faltung und eines inkorrekten Zusammenfügens der Polypeptide während der Synthese. Daher ist eine präzise Kartierung der protektiven monoklonalen Antikörper über eine Reaktion mit einer 56 kDa- Spezies (Pirson & Perkins, 1985) oder der 19 kDa-Spezies (Blackman et al [1990] Journal of Experimental Medicine 172, 379-382), die den C-terminalen 114 Aminosäuren entspricht (Blackman et al [1991] Molecular and Biochemical Parasitology 49, 29-34) hinaus genausowenig berichtet worden, wie die effektive Expression der Zielsubstanz in e. coli.
Die vorliegende Erfindung beruht auf dem überraschenden Befund, dass es möglich ist, den Zielbereich von protektiven Antikörpern, die gegen ein Merozoit-Oberflächenprotein gerichtet sind, als kurzen Bereich aus Aminosäuren zu definieren und dass dieser Zielbereich in den Bakterien in einer Form synthetisiert werden kann, der im Vergleich zum nativen Protein nicht unterscheidbar ist.

Zusammenfassung der Erfindung

In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, umfassend die Sequenz wie in Fig. 1 gezeigt (Seq. ID Nr. 1) oder ein funktionelles Äquivalent davon, wobei das funktionelle Äquivalent die homologe Sequenz von dem MSP-Protein eines Plasmodium- Organismus ist, der nicht P. falciparum Stamm T9/94 ist, oder eine konservative Aminosäure-Substitution in Relation zu der in Fig. 1 gezeigten Sequenz umfaßt, wobei die Sequenz isoliert ist von Sequenzen, die natürlicherweise daran angrenzend in dem Merozoit-Oberflächenprotein 1 (MSP 1) auftreten, wobei die Sequenz die Konformation aufrechterhält, die in MSP 1 angenommen wird.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Polypeptid bereit, umfassend die Sequenz wie in Fig. 2 (Seq. ID Nr. 3) gezeigt oder ein funktionelles Äquivalent davon, wobei das funktionelle Äquivalent eine homologe Sequenz von dem MSP-Protein eines Plasmodium-Organismus ist, der nicht P. falciparum Stamm T9/94 ist, oder eine konservierte Aminosäure-Substitution in Relation zu der in Fig. 2 gezeigten Sequenz aufweist, wobei die Sequenz isoliert von Sequenzen ist, die natürlicherweise daran angrenzend in MSP 1 auftreten, wobei die Sequenz die Konformation aufrechterhält, die in MSP 1 angenommen wird.
Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz von zwei allelen Varianten (A und B, Seq. ID Nr. 1 bzw. 2) des Polypeptids, das als EGF1-ähnliche Domäne bekannt ist. Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz von zwei allelen Varianten (A und B, Seq. ID Nr. 3 bzw. 4) der Sequenz des Polypeptids, das als EGF2-ähnliche Domäne bekannt ist. Es ist für den Fachmann klar, dass andere geringfügige Änderungen an den Sequenzen der EGF1- ähnlichen oder EGF2-ähnlichen Domänen vorgenommen werden können, ohne dass deren biologische Eigenschaften wesentlich verändert werden.
Neben den allelen Varianten können die funktionellen Äquivalente auch solche einbeziehen, in denen eine oder mehrere konservative Aminosäuresubstitutionen auftreten (d. h. die Substitution einer Aminosäure gegen eine mit ähnlichen Eigenschaften). Andere Substitutionen, die durchgeführt werden können, sind solche, die eine Aminosäure aus der MSP1-Sequenz in eine solche aus der Sequenz des epidermalen Wachstumsfaktors überführen, was die EGF-ähnliche Struktur im wesentlichen erhält. Alternativ oder zusätzlich können geringfügige Additionen, Deletionen oder Kürzungen der MSP1 EGF-ähnlichen Sequenzen durchgeführt werden. Andere augenfällige funktionelle Äquivalente sind EGF-ähnliche Domänen, die im MSP-Protein andere Spezies von Plasmodium vorliegen (so wie die Spezies, von denen neben falciparum bekannt ist, dass sie Menschen infizieren, d. h. vivax, malariae und ovale oder das Mauspathogen P. yoelii), oder Stämmen von P. falciparum außer T9/94.
Es sollte festgestellt werden, dass die N-terminalen Methioninreste, die in der Sequenz der EGF1-ähnlichen (Fig. 1) und der EGF2-ähnlichen (Fig. 2) Domänen gezeigt sind, nicht essentiell sind. Sie stellen fakultative Merkmale dar, die das Abtrennen der EGFähnlichen Domänen von einer möglicherweise vorliegenden assoziierten Aminosäuresequenz durch Behandlung mit Cyanbromid (CNBr) ermöglichen.
Die Sequenz des Gens, das MSP1 kodiert, ist für zwei Stämme von P. falciparum bestimmt worden: Wellcome/T9/94 und MAD20 (Blackman et al. (1991) Molecular and Biochemical Parasitology 49 29-34 bzw. Tanabe et al. [1987] Journal of Molecular Biology 195. 273- 287). Die Erfinder haben es durch Einsatz von PCR geschafft, zwei DNA-Stränge zu erhalten, die zwei epidermale Wachstumsfaktor (EGF)-ähnliche Domänen (EGF1-ähnlich und EGF2-ähnlich), kodieren, die in diesen Genen identifiziert worden sind (Blackman et al. [1991] ibid).
Die die EGF1-ähnlichen und EGF2-ähnlichen Domänen kodierenden Sequenzen wurden in Plasmide insertiert. Die resultierenden Plasmidkonstrukte waren fähig, die Expression der EGF-ähnlichen Domänen als Fusionsproteine mit Gluthein S-Transferase zu steuern. Daher stellt die Erfindung in einem anderen Aspekt einen Vektor bereit, der die Sequenz umfaßt, · die die EGF1-ähnliche und/oder EGF2-ähnliche Domäne isoliert von Sequenzen umfaßt, die natürlicherweise in dem MSP1-Protein daran angrenzend vorkommen und worin die exprimierten Sequenz die in MSP1 angenommene Konformation beibehalten.
Im allgemeinen ist der oben definierte Vektor zur Expression der EGF1-ähnlichen und/oder der EGF2-ähnlichen Sequenzen fähig.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der EGF1- ähnlichen Domäne und/oder der EGF2-ähnlichen Domäne isoliert von anderen MSP1 Sequenzen bereit, und zwar in der Konformation, die in MSP1 angenommen wird, umfassend das Insertieren des oben definierten Vektors, der zur Expression der EGF1- ähnlichen und/oder EGF2-ähnlichen Domäne fähig ist, in eine geeignete Wirtszelle, das Kultivieren der Wirtszelle und das Isolieren der so produzierten EGF1-ähnlichen und/oder EGF2-ähnlichen Domäne.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Nukleotidsequenz bereit, die ein Polypeptid gemäß dem ersten und/oder dem zweiten Aspekt der oben definierten Erfindung kodiert.
Typischerweise werden die EGF-ähnlichen Domänen als Fusionsproteine exprimiert.
Vorzugsweise sollte das Fusionsprotein eines sein, das eine einfache Aufreinigung ermöglicht wie bei einer Fusion mit Glutathion S-Transferase, wie in den Beispielen beschrieben. Dem Fachmann sind weitere solcher einfach aufzureinigenden Fusionsproteine bekannt.
In der in Beispiel 1 beschriebenen Ausführungsform ist das Fusionsprotein eines, bei dem die EGF-ähnliche Domänen von der nicht MSP1 Polypeptidsequenz abgespalten werden können.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit, die mit dem oben definierten Vektor transformiert ist. Die transformierte Wirtszelle kann bakteriellen Ursprungs sein oder ihren Ursprung in Pflanzen, Pilzen oder Tieren haben.
Die Expression der EGF-ähnlichen Domänen in ihrer nativen Konformation, wie in Beispiel 1 beschrieben, (beurteilt durch ihre Reaktion mit Antikörpern, von denen bekannt ist, dass sie die Replikation des Malariaparasiten in vitro inhibieren) kann die Verwendung eines rekombinanten DNA-abgeleiteten Materials als Impfstoff ermöglichen, um eine protektive Immunantwort gegen Malaria zu induzieren, was durch die in den Beispielen ·2 und 3 präsentierten Daten gestützt wird.
Daher stellt die Erfindung in einem anderen Aspekt einen Impfstoff dar, umfassend ein Polypeptid gemäß dem ersten und/oder zweiten Aspekt der Erfindung, wie oben definiert. Vorzugsweise umfaßt der Impfstoff die Sequenz von beiden EGF-ähnlichen Domänen oder funktionelle Äquivalente (wie oben definiert) davon. Zweckmäßigerweise wird der Impfstoff im allgemeinen mit einem geeigneten Adjuvanz (z. B. Alaun) verabreicht. Typischerweise werden die EGF-ähnlichen Domänen in einem physiologisch verträglichen Träger eingebracht und/oder mit einem anderen Immunogen fusioniert.
Die Erfindung kann durch Verweis auf die Beispiel und die folgenden Zeichnungen besser verstanden werden, in denen:
Fig. 1 die Sequenz von zwei allelen Varianten der EGF1-ähnlichen Domäne zeigt,
Fig. 2 die Sequenz von zwei allelen Varianten der EGF2-ähnlichen Domäne zeigt,
Fig. 3 die vorhergesagte Struktur von MSP1 EGF, basierend auf der Struktur von humanem EGF, zeigt,
Fig. 4 die Sequenz der Oligonukleotidprimer (Seq. ID Nrn. 5-8) zeigt, die zur Amplifizierung der EGF1-ähnlichen und EGF2-ähnlichen kodierenden Sequenzen verwendet wurden und ihre Lokalisierung in Relation zum MSP1-Protein,
Fig. 5 die Resultate der Immunoblot ("Western-Blot") Analyse von Merozoitextrakten und EGF-ähnlichen Domänen enthaltenden Fusionsproteinen zeigt, und
Fig. 6 die Aminosäuresequenz (Seq. ID Nr. 11) der kombinierten EGF-ähnlichen Domänen aus P. yoelii zeigt.

Beispiel I

Von der Sequenz von T9/94 abgeleitete Oligonukleotide wurden verwendet, um als Primer für die Polymerase-Kettenreaktion zu dienen. Die Sequenzen dieser Primer sind unten gezeigt: EGF1 5' Primer (Seg. ID Nr. 5 in der angefügten Sequenzauflistung): EGF1 3' Primer (Seq. ID Nr. 6): EGF2 5' Primer (Seq. ID Nr. 7): EGF2 3' Primer (Seq. ID Nr. 8):
Am 5' Ende der S' Primer liegt eine Extension um die Restriktionsstellen für SacI und BamHI einzufügen, gefolgt von einem ATG-Methionin (Met) Kodon. Die Signifikanz des Met-Kodons wird unten diskutiert. Unmittelbar 3' von dem Met-Kodon liegt eine Sequenz von 21 Basen, die zum Start von entweder der EGF1-ähnlichen Sequenz (859-879) oder zum Start der EGF2-ähnlichen Sequenz (988-1008) komplementär ist. Jeder 3' Primer enthält, in der 5' - 3' Richtung, eine Extension, um die Restriktionsstellen für SacI und Bgl II einzufügen und ein TAA Stoppkodon, gefolgt von einer Sequenz von 18 Basen, die entweder mit dem 3' Ende der EGF1-ähnlichen Sequenz (985-1002) oder dem 3' Ende der EGF2-ähnlichen Sequenz (1129-1146) komplementär ist.
Die PCR-Produkte wurden mit BamHI und BglLII geschnitten und in BamHI- restriktionsgeschnittenem pGex-3x (Smith & Johnson, [1988], Gene 67, 31-40) insertiert. Die Reaktionsprodukte der Ligation wurden zur Transformation des E. coli Stamms DH5alpha verwendet. Rekombinante mit dem Insert in der korrekten Orientierung wurden durch Restriktionsenzymanalyse identifiziert. Die Anbindungen der neuen Konstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt.
Fig. 1 zeigt die Aminosäuresequenz der Region, die als erste EGF-ähnliche Domäne der beiden allelischen Typen MSPIEGF1A (z. B. Wellcome T9/94 Stämme) und MSPIEGF1B (z. B. MAD20 Stamm) amplifiziert wurde. Das aminoterminale Methionin war ein fakultatives Merkmal, das eingeführt wurde, um die Spaltung von dem rekombinanten Protein zu erleichtern.
Fig. 2 zeigt die Aminosäuresequenz der Region, die als zweite EGF-ähnliche Domäne der beiden allelischen Typen MSPIEGF2A (z. B. Wellcome T9/94 Stämme) und MSPIEGF2B (z. B. MAD20 Stamm) amplifiziert wurde. Das aminoterminale Methionin war ein optionales Merkmal, das eingeführt wurde, um die Abspaltung von dem rekombinanten Protein zu erleichtern.
Fig. 3 zeigt die Aminosäuren 1631-1678 der P. falciparum MSPIEGF1-ähnlichen Domäne, gemodelt auf die Struktur des humanen EGF in Lösung. In EGF sind die Cysteine in Disulfiden gepaart (gezeigt in Fig. 3 als feste Linien): C&sub1; an C3; C&sub2; an C&sub4; und C&sub5; an C&sub6;. Die Nettoladung bei neutralem pH ist für jede Aminosäure als entweder positiv, negativ oder als keine Nettoladung gezeigt. In P. falciparum MSPIEGF1 variiert zwischen den Stämmen nur eine Aminosäure; entweder Q1644 (ohne Nettoladung) in A-Typ Stämmen oder E1644 (mit negativer Nettoladung) in B-Typ Stämmen.
Für die Expressionsstudien wurden rekombinante Bakterien über Nacht bei 37ºC in L- Brühe kultiviert. Die Kulturen wurden dann fünffach mit frischem Medium verdünnt und es wurde IPT6 bis zu einer Endkonzentration von 0,25 mM zugegeben. Nach weiterem 3- Stunden Wachstum wurden die Zellen geerntet. Die Zellpellets wurden in 25 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0, enthaltend 0,2% (V/V) Nonidet P40 resuspendiert und PMSF in Isopropanol wurde bis zu einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben. Es wurde 1 mg pro ml Lysozym zugegeben, und man ließ die Probe für 2 Stunden auf Eis stehen, dann wurde MgSO&sub4; auf 2 mM und DNAse auf 20 mg pro ml zugesetzt und die Mischung wurde für weitere 2 Stunden stehengelassen. Das Lysat wurde bei 17.000 g für 20 Minuten bei 4ºC zentrifugiert. Die löslichen GST Fusionsproteine wurden aus dem Überstand durch Chromatographie an Glutathion-Agarose (erhalten von Sigma Chemical Company, Katalognummer G9761) gereinigt und mit 8 M Harnstoff eluiert. Die unlöslichen Proteine in der Pelletfraktion wurden zweimal mit 50 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM PMSF pH 8,0, enthaltend zunächst 1% (V/V) NP-40 und dann 0,5 M KSCH, gewaschen und in 25 mM Tris-HCL, 1 mM EDTA pH 8,0 resuspendiert. Um die Proteine biosynthetisch zu markieren, wurden die Rekombinanten wie oben beschrieben kultiviert und die Synthese in Gegenwart von 35S Cystein im Minimalmedium induziert.
Das Design der PCR Oligonukleotidprimer (um einen Met-Rest am Beginn der EGF- ähnlichen Domäne einzuführen) ermöglichte die Abspaltung der MSP1-Sequenzen aus dem Fusionsprotein durch Verwendung von Cyanbromid (CNBr), was Polypeptidketten an Met-Resten spaltet.
Die Fig. 4 zeigt die zur Amplifikation vom MSPIEGF1 (1 und 2) und MSPIEGF2 (3 und 4) verwendeten Primer, enthaltend die geeigneten Restriktionsenzymspaltstellen und die Methioninkodons. Im Falle der Primer 2 und 4 wird die reverse Komplementsequenz gezeigt. In der zweiten Hälfte dieser Figur wird ein schematisches Diagramm von MSP1 gezeigt, das die Positionen der natürlichen Fragmente zeigt, die durch Prozessierung dieses Vorläufers zustande kamen, sowie die Positionen der EGF-ähnlichen Domänen und die Lokalisierung der Oligonukleotidprimer, die zu deren Amplifizierung verwendet wurden.
Das Hybridprotein wurde mit 5 mg pro ml in 70% (V/V) Ameisensäure gelöst und mit Cyanbromid (1000-facher molarer Überschuß, 3,3 mg CNBr/mg Protein) bei Raumtemperatur für 24 Stunden bei Dunkelheit behandelt. Nach 5-facher Verdünnung mit Wasser wurde das überschüssige Reagenz durch Lyophilisierung oder Dialyse gegen 0,1 M Ammoniumacetat, pH 5,0 ohne vorherige Verdünnung unter Verwendung einer Spectrapore 7 Dialysemembran entfernt.
Um die erste EGF Domäne weiter zu reinigen, wurde der CNBr-Verdau in 0,1 M Ammoniumacetat, pH 5,0 gelöst und auf eine Affinitätssäule mit monoklonalem Antikörper 111,4 (Holder et al., [1985] Nature 317, 270-273) gekoppelt an Sepharose und äquilibriert mit diesem Puffer, aufgebracht. Nach dem Waschen wurde das gebundene Material mit 0,1 M Glycin, mit HCl auf pH 2,5 eingestellt, eluiert.
Es wurde gefunden, dass die Expression der EGF-ähnlichen Domänen auf diese Art das Aufrechterhalten der nativen Konformation ermöglicht haben, was aus ihrer Reaktion mit den unten beschriebenen Antikörpern geschlossen wurde.
Die Proteine wurden durch Polyacrylamidgelelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat (SDS-PAGE) oder SDS und Harnstoff (Swank & Munkres, 1971) analysiert. Nach Transfer der Proteine auf Nitrocellulose wurde die Bindung von Antikörper unter Verwendung von alkalischem Phosphat-konjugiertem zweiten Antikörper und einem chromogenen Substrat nachgewiesen. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 gezeigt. Radiomarkierte Proteine in Immunoprecipitaten, die mit den spezifischen Antikörpern gebildet wurden, wurden ebenfalls auf Polyacrylamidgelen analysiert.
Die Fig. 5 zeigt die Reaktion einer Vielzahl von Antikörperpräparationen mit Proteinen auf einem Westernblot. Die Proteine waren entweder Extrakte von Merozoiten (Spur 1, aus Klon T9/94; Spur 2, aus Klon T9/96) oder gereinigtes GST Fusionsprotein mit MSPIEGF1A (Spur 3) und MSPIEGF2A (Spur 4). Nach der Abtrennung durch Elektrophorese in Gegenwart von SDS wurden die Proteine entweder mit Coomassie blau gefärbt oder auf Nitrocellulose transferriert und mit Polyklonalen (anti-MSP1) oder monoklonalen Antikörpern getestet.
Die Proteine wurden auch einer Chromatographie auf einem HPLC-System, unter Verwendung einer Vydax C4 Säule, unterzogen, wobei die Elutionen 0,1% Trifluoressigsäure und Acetonitril über einen 0% bis 100% Gradienten von Acetonitril erfolgte.
Diese Experimente zeigten, dass die EGF-ähnlichen Domänen in ihrer nativen Konformation vorliegen und mit Antikörpern reagieren, von denen bekannt ist, dass sie die Replikationen des Malariaparasiten in in vitro inhibieren.
Wie bereits beschreiben, ist es möglich, die EGF-ähnlichen Polypeptide von anderen Teilen des Fusionsproteins zu isolieren. Es kann jedoch vorteilhaft sein, die EGF-ähnlichen Domänen in ihrer an andere Polypetide oder andere Substanzen gekoppelten Form zu belassen, um so die protektive Immunantwort gegen Malaria zu verstärken. Z. B. könnten die EGF-ähnlichen Domänen an andere protektive Antigene oder Epitope aus dem Malariaparasiten gekoppelt werden.

Beispiel 2

Die erfolgreiche Expression der MSPI EGF-artigen Domänen in ihrer natürlichen Konformation löste Experimente aus, durch die die Fähigkeit der EGF-ähnlichen Domänen untersucht werden sollte, eine protektive Immunantwort zu stimulieren.
Die Maus, die mit P. yoelii infiziert werden kann, ist ein akzeptiertes Modell für die Humanmalaria im Menschen und ist in weitem Umfang untersucht worden. Daher bestand der erste Schritt darin, die EGF-ähnlichen Domänen aus P. yoelii MSP1 zu klonieren.
DNA, die für die kombinierten EGF-ähnlichen Domänen aus P. yoelii aus MSPI kodiert, wurde durch PCR Amplifikation von P. yoelii genomischer DNA unter Verwendung der unten gezeigten Primer synthetisiert. Primer PyMSPEGF1 5' Primer (42 mer, Seq. ID No.9):
Die Amplifikationsprodukte wurden mit den Restriktionsenzymen BamH1 und Bgl11, gereinigt, und dann in den Expressionsvektor pGex3x ligiert. Nach Transformation von E. coli DH5 alpha zu Ampicillinresistenz wurden individuelle Klone durch Restriktionsenzymverdau und Analyse der Proteinproduktion gescreent. Es wurde ein einzelner Klon selektiert, der das geeignete Fusionsprotein (d. h. die beiden EGF-ähnlichen Domänen, fusioniert an den C-Terminus der Glutathion S-Transferase (GST)) exprimiert, und die DNA Sequenz des Inserts wurde durch DNA Sequenzierung bestätigt. Die Aminosäuresequenz der amplifizierten Region aus P. yoelii MSP1, enthaltend die kombinierten EGF-ähnlichen Domänen, ist in Fig. 6 gezeigt (Seq. ID No. 12).
Die bakteriellen Kulturen des erwünschten Klons wurden über Nacht bei 37ºC in L-Brühe kultiviert und 1 : 5 (Vol./Vol.) auf ein Endvolumen von 500 ml in frischem vorgewärmten Medium verdünnt und für eine weitere Stunde kultiviert, bevor die Proteinsynthese durch Addition von IPTG auf 0,1 mM induziert wurde. Nach einer weiteren dreistündigen Inkubation wurden die bakteriellen Zellen durch Zentrifugation bei 5.000 g für 10 min geerntet und die Bakterienzellen wurden bei -70ºC gefroren. Die Kontrollkulturen, die das.
GST Protein alleine exprimierten, wurden auch kultiviert und die Zellen aus diesen Kulturen wurden ebenfalls bei -70ºC gelagert.
GST und GST/EGF-ähnliche Fusionsproteine wurden aus den bakteriellen Lysaten durch Bindung an und Elution von Glutathionagarose gereinigt. Die Zellpaste, äquivalent zu 500 ml induzierter Kultur, wurde auf Eis in 10 ml "Zell Lysis Puffer" (25 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,2% (Vol./Vol.) Nonidet P40), 1 mM EDTA), enthaltend 1 mM PMSF, resuspendiert. Es wurde Lysozym auf 1 mg ml&supmin;¹ zugesetzt und nach 2 Stunden auf Eis wurden MgSO&sub4; und Deoxyribonuklease (Typ 1) auf Endkonzentrationen von 2 mM bzw. 20 ug ml&supmin;¹ zugesetzt. Nach weiteren 2 Stunden auf Eis wurde das Zelllysat bei 39.000 g für 20 Minuten zentrifugiert. Die Überstandsfraktion wurde über eine chromatographische Säule geleitet, die 50 ml Glutathion-Agarose enthielt und anschließend wurde die Säule ausgiebig mit phosphatgepufferter Saline (PBS) gewaschen. Es wurden das GST oder das GST- Fusionsprotein von der Säule unter Verwendung von 8 M Harnstoffen in 50 mM Tris pH 7,5 eluiert. Die eluierten Fraktionen, die das Fraktionsprotein enthielten, wurden durch SDS PAGE mit Coomassie blau Anfärbung identifiziert. Die Spitzenfraktionen wurden vereinigt und ausgiebig gegen PBS dialysiert. Die Reinheit des Proteins wurde durch gelelektrophoretische Analyse und Aminsosäureanalyse bestätigt.
Es wurde beschlossen, neben der Immunisierung von Mäusen mit GST (Kontrollgruppe) und GST-Fusionsprotein (Versuchsgruppe) kombinierte MSPEGF-ähnliche Domänen isoliert von GST herzustellen und eine dritte Gruppen von Mäusen mit dieser Substanz zu immunisierten. Um das Inoculum herzustellen, wurden bakterielle Lysate, die die GST- EGF-Fusion enthielten, über eine Säule aus Glutathion-Agarose, wie oben beschrieben, geleitet. Der Laufpuffer der Säule wurde gegen einen Faktor Xa Verdaupuffer (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 mm NaCl, 1 mM CaCl&sub2;) ausgetauscht. Der den Faktor Xa (25 ug Protein) enthaltende Puffer wurde aufgebracht und man ließ die Säule anschließend für 8 Stunden bei 4ºC stehen. Das freigesetzte kombinierte Domänenprotein wurde eluiert und dann wurde das Verfahren wiederholt. Die Fraktionen wurden unter Verwendung von Polyacrylamidgeleletrophorese in Gegenwart von SDS analysiert und dann vereinigt.
Nach der Dialyse gegen 50 mM Amoniumbicarbonat wurden die Proben lyophilisiert und erneut in PBS gelöst. Die Reinheit des Proteins wurde durch Gelelektrophorese, Aminosäureanalyse und Sequenzanalyse bestätigt. Die N-terminale Aminosäuresequenz des abgespalteten Fragments wurde bestimmt und lautete: G I H M D G M D L L G (Seq. ID No. 11). Diese stimmt überein mit der vorhergesagten Spaltstelle des Faktors Xa und der abgeleiteten Aminosäuresequenz aus der klonierten DNA am Beginn der kombinierten EGF-ähnlichen Domäne.
In einem ersten Satz von Immunisierungs/Infektionsexperimenten wurden die gereinigten Proteine verwendet, um Gruppen von Mäusen zu immunisieren, die anschließend mit 5.000 parasiteninfizierten roten Blutzellen aus einer Spendermaus gemäß dem unten gezeigten Plan infiziert wurden.
Die Gruppe 1 wurde mit kombinierten EGF-ähnlichen Domänen immunisiert, die von GST abgespalten waren, die Gruppe 2 wurde mit dem intakten Fusionsprotein (GST-kombiniert mit EGF-ähnlichen Domänen) immunisiert, während die Gruppe 3 das GST Trägerprotein alleine enthielt. Am Tag 54 wurde eine Serumprobe von jeder Maus genommen, um den Gehalt an Antikörper gegen den Blutstadiumparasiten durch indirekten Immunofluoreszenzassay (IFA) zu messen.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt, die für jede Gruppe die Entwicklung der Infektion (% Parasitämie) in einzelnen immunisierten Mäusen zu verschiedenen Zeitpunkten (Tage) nach dem Aussetren zeigt. Die Entwicklung der Parasitämie wurde regelmäßig in Abstrichen aus Blut, die mit Giemsa's Färbung gefärbt wurden aufgezeichnet und der Prozentsatz der infizierten roten Zellen wurde berechnet. Die Abwesenheit von Parasitämie wurde keine detektierbaren Parasiten in 50 mikroskopischen Feldern (von denen jedes 200 Erythrozyten enthält) definiert.
In diesem Experiment wiesen alle Mäuse in den Gruppen 1 und 2 einen IFA Titer von mehr als 1/5120 auf.
Die Tabelle 1 zeigt, dass 11 von 12 Mäusen, die mit den kombinierten EGF-ähnlichen Domänen immunisiert waren, entweder frei oder mit dem GST verbunden (Gruppen I und 2) keine nachweisbaren Parasiten zeigten und dass ein Tier einer lediglich transienten Parasitämie unterlag. Im Gegensatz hatten in der Kontrollgruppe, die mit GST alleine immunisiert war (Gruppe 3) alle Tiere eine schwere Parasitämie entwickelt und bis auf eines starben alle Tiere aufgrund der schweren Infektion im Verlauf des Experiments. Dieses Ergebnis zeigt, dass durch die Impfung mit den EGF-artigen Domänen entweder alleine oder mit GST als Trägerprotein verbunden ein erstaunlich wirksamer Schutz erzielt wird.

Beispiel 3

Es wurde ein weiteres Experiment durchgeführt, um die Ergebnisse des ersten Experimentes zu bestätigen und um die Wichtigkeit der sekundären Struktur des immunisierenden Proteins zu bestimmen.
Um die Sekundärstruktur des Fusionsproteins zu zerstören und seine Neubildung zu verhindern wurde eine Probe mit Dithiothreitol reduziert und dann mit einem Überschuß von Iodacetamid alkyliert. Diese Behandlung bricht die Disulfidbindungen im Protein und modifiziert die Sulphydrylgruppen der Cysteinreste durch Addition einer Carboxyamidomethylgruppe. Das Fusionsprotein (1,2 mg) wurde in PBS, enthaltend 8 mM Harnstoff und 0,2 M Dithiothreitol, gelöst und bei 37ºC für 30 Minuten inkubiert, um alle Sulphydrylgruppen zu reduzieren. Ein Überschuss aus Iodacetamid (360 ul einer 1 M Lösung in 0,1 M NaOH) wurde zugegeben und man setzte die Inkubation für weitere 30 Minuten fort, während in regelmäßigen Abständen 10 M NaOH zugesetzt wurde, um den pH über 7 zu halten. Schließlich wurde die Probe ausgiebig gegen PBS dialysiert.
In einem zweiten Satz von Aussetzungsexperimenten wurden Mäuse dann immunisiert mit: den abgespaltenen kombinierten EGF-ähnlichen Domänen (Gruppe 1), dem intakten Fusionsprotein (GST-kombiniert EGF-ähnliche Domänen) (Gruppe 2), dem reduzierten und dem carboxyamidomethylierten Fusionsprotein (Gruppe 3), dem GST Träger alleine (Gruppe 4) und PBS (Gruppe 5). Der Immunisierungsplan war mit dem im ersten Experiment identisch, außer dass die zweite Verstärkung am Tag 42 verabreicht wurde.
Das Experiment wurde in gleicher Art wie das erste durchgeführt, außer dass die Abwesenheit einer Parasitämie im zweiten Experiment so definiert wurde, dass keine nachweisbaren Parasiten in 40 mikroskopischen Feldern (jedes enthält 300 Erythrozyten) vorliegen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Die Seren der Mäuse in Gruppe 1 hatten laut IFA Analyse einen Antikörpertiter von größer als 1/5120 und die in Gruppe 2 hatten einen Titer oberhalb von 1/10.240. Eine Modifikation des Immunogens reduzierte den Gehalt an produzierten Antikörpern, der mit dem nativen Protein reagierte: Mäuse in Gruppe 3 wiesen Antikörpertiter im Serum von 1/1280 bis 1/5120 auf. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wiesen 14 von 19 Mäusen nach dem Aussetzen zu diesem Zeitpunkt keine nachweisbaren Parasiten auf, weitere 4 Mäuse unterlagen einer transienten Parasitämie von niedrigem Grad und eines der Tiere war nicht geschützt. In den Kontrollgruppen waren alle mit PBS und Adjuvants alleine immunisierten Mäuse voll empfänglich und 8 der 10 mit GST allein immunisierten Mäuse waren ebenfalls nicht geschützt. Interessanterweise reduzierte die Reduktion und Alkylierung des zur Impfung verwendeten Proteins (Gruppe 3) den den Mäusen verliehenen Schutz. In dieser Gruppe waren alle Mäuse infiziert und 3 der 10 starben, wobei die verbleibenden Mäuse eine langwierige starke Parasitämie aufwiesen. Dieses Ergebnis bestätigt den beobachteten Schutz, der durch die Impfung mit dem kombinierten EGF-ähnlichen Domänen verliehen wird und zeigt die Wichtigkeit der Tatsache, dass die Epitope durch die Disulfidbindungen erzwungen werden, bei der Auslösung dieses Schutzes. Tabelle 1 1. Kombinierte EGF-ähnliche Domänen, abgespaltenes Fragment. 2. Kombinierte EGF-ähnliche Domänen, an Glutathion S-Transferase angefügt. 3. Glutathion S-Transferase alleine
*D, gestorben. Tabelle 2 1. Kombinierte EGF-ähnliche Domänen, abgespaltenes Fragment 2. Kombinierte EGF-ähnliche Domänen, an Glutathion S-Transferase agefügt. Tabelle 2 (Forsetzung) 3. Kombinierte EGF-ähnliche Domänen, an Glutathion S-Transferase angefügt, reduziert und carboxyamidomethyliert. 4. Glutathion S-Transferase alleine. Tabelle 2 (Forsetzung) 5. Phosphatgepufferte Saline alleine.
*D, gestorben

Claims

1. Polypetid, umfassend die Sequenz wie in Fig. 1 gezeigt (Seq. ID Nr. 1) oder ein funktionelles Äquivalent davon, wobei das funktionelle Äquivalent die homologe Sequenz von dem MSP-Protein eines Plasmodium-Organismus ist, der nicht P. falciparum Stamm T9/94 ist, oder eine konservierte Aminosäure-Substitution in Relation zu der in Fig. 1 gezeigten Sequenz umfasst, wobei die Sequenz isoliert ist von Sequenzen, die natürlicherweise daran angrenzend in dem Merozait-Oberflächenprotein 1 (MSP 1) auftreten, wobei die Sequenz die Konformation aufrechterhält, die in MSP 1 angenommen wird.

2. Polypetid, umfassend die Sequenz wie in Fig. 2 (Seq. ID Nr. 3) gezeigt oder ein funktionelles Äquivalent davon, wobei das funktionelle Äquivalent eine homologe Sequenz von dem MSP-Protein eines Plasmodium-Organismus ist, der nicht P, falciparum Stamm T9/94 ist, oder eine konservierte Aminosäure-Substitution in Relation zu der in Fig. 2 gezeigten Sequenz aufweist, wobei die Sequenz isoliert von Sequenzen ist, die natürlicherweise daran angrenzend in MSP 1 auftreten, wobei die Sequenz die Konformation aufrechterhält, die in MSP 1 angenommen wird.

3. Nukleotid-Sequenz, die das Polypetid gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 kodiert.

4. Nukleotid-Sequenz, kodierend ein Polypetid, umfassend die in Fig. 1 (Seq. ID Nr. 1) gezeigte Sequenz, oder ein funktionelles Äquivalent davon wie in Anspruch 1 definiert, und die in Fig. 2 (Seq. ID Nr. 3) gezeigte Sequenz, oder ein funktionelles Äquivalent davon wie in Anspruch 2 definiert, wobei das kodierte Polypetid isoliert ist von anderen Sequenzen, die natürlicherweise daran angrenzend in MSP 1 auftreten und wobei die kodierten Sequenzen die Konformation aufrechterhalten, die in MSP 1 angenommen wird.

5. Vektor, der die Expression eines Polypetids steuert, umfassend die in Fig. 1 gezeigte Sequenz (Seq. ID Nr. 1) oder ein funktionelles Äquivalent davon wie in Anspruch 1 definiert, und/oder die in Fig. 2 gezeigte Sequenz (Seq. ID Nr. 3) oder ein funktionelles Äquivalent davon wie in Anspruch 2 definiert, wobei die exprimierte(n) Sequenz(en) von anderen Sequenzen isoliert ist(sind), die natürlicherweise daran angrenzend in MSP 1 auftreten und wobei die exprimierten Sequenzen die Konformation aufrechterhalten, die in MSP 1 angenommen wird.

6. Vektor gemäß Anspruch 5, wobei das Polypetid als Fusionsprotein exprimiert wird,

7. Vektor gemäß Anspruch 6, wobei das Fusionsprotein eine Einheit umfasst, die seine Reinigung erleichtert.

8. Vektor gemäß den Ansprüchen 6 oder 7, wobei das Fusionsprotein von solcher Beschaffenheit ist, dass das Polypetid nach Anspruch 1 und/oder Anspruch 2 vom Rest des Proteins abgespalten werden kann.

9. Verfahren zur Herstellung eines Polypetids, umfassend das Einführen des Vektors nach mindestens einem der Ansprüche 5 bis 8 in eine geeignete Wirtszelle, das Kultivieren der Wirtszelle und das Isolieren des so hergestellten Polypetids.

10. Wirtszelle, transformiert mit einem Vektor gemäß mindestens einem der Ansprüche 5 bis 8.

11. Impfstoff, umfassend ein Polypetid gemäß Anspruch 1 und/oder Anspruch 2 und ein physiologisch akzeptabler Träger.

12. Impfstoff gemäß Anspruch 11, wobei das Polypetid nach Anspruch 1 und/oder Anspruch 2 als Fusionsprotein vorliegt.

13. Impfstoff gemäß Anspruch 11 oder 12, wobei das Polypetid umfasst die in Fig. 1 gezeigte Sequenz (Seq. ID Nr. 1) oder ein funktionelles Äquivalent davon, wie in Anspruch 1 definiert, und die in Fig. 2 gezeigte Sequenz (Seq. ID Nr. 3) oder ein funktionelles Äquivalent davon, wie in Anspruch 2 definiert, wobei die Sequenzen von anderen Sequenzen isoliert auftreten, die natürlicherweise daran angrenzend in MSP 1 auftreten und wobei die Sequenzen die Konformation aufrechterhalten, die in MSP 1 angenommen wird.