DE69332997T2

DE69332997T2 - Monoklonale antikörper gegen den interferonrezeptor, mit neutralisierender aktivität gegen typ i-interferon

Info

Publication number: DE69332997T2
Application number: DE69332997T
Authority: DE
Inventors: Patrick Benoit; François Meyer; Debborah Maguire; Ivan Plavec; G. Micha[l TOVEY
Original assignee: Medisup International Nv Curacao; Medisup International NV
Current assignee: Medisup International Nv Curacao; Medisup International NV
Priority date: 1992-03-31
Filing date: 1993-03-30
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2013-03-31
Also published as: JP2006089494A; CA2133106A1; EP0633931A1; WO1993020187A1; DE69334158T2; PT1329459E; FI944509L; RU94045826A; ATE368055T1; EP1329459B1; US7465451B2; US20020055492A1; NO943625L; EP1329459A3; PT633931E; US20070128701A1; US20040191840A1; FI944509A0; ES2199941T3; CA2133106C

Description

Die Interferone (IFN) stellen eine Gruppe von sezernierten Proteinen dar, die einen breiten Bereich an biologischen Aktivitäten zeigen und durch ihre Fähigkeit charakterisiert sind, in Zellen von Wirbeltieren einen antiviralen Zustand zu induzieren (I. Gresser und M. G. Tovey Biochem Biophys. Acta 516: 231, 1978). Es gibt drei antigene Klassen von IFN: alpha (α), beta (β) und gamma. IFNα und IFNβ zusammen sind bekannt als das Typ 1-Interferon.
Natürliches menschliches Typ 1-Interferon umfaßt 12 oder mehr eng verwandte Proteine, die von verschiedenen Genen mit einem hohen Maß an struktureller Homologie codiert werden (Weissmann und Weber, Prog. Nucl. Acid. Res. Mol. Biol. 33: 251, 1986).
Der menschliche IFNα-Locus umfaßt zwei Subfamilien. Die erste Subfamilie besteht aus 14 nicht allelen Genen und vier Pseudogenen, die mindestens 80% Homologie haben. Die zweite Subfamilie, αII oder omega (ω) enthält fünf Pseudogene und ein funktionelles Gen, welches 70% Homologie mit den IFNα-Genen zeigt (Weissmann und Weber 1986).
Die Subtypen von IFNα haben verschiedene spezifische Aktivitäten, sie besitzen aber dasselbe biologische Spektrum (Streuli et al. PNAS-USA 78: 2848, 1981) und haben denselben zellulären Rezeptor (Agnet M. et al. in "Interferon 5" Hrsg. I. Gresser S. 1–22, Academic Press, London 1983).
Das Interferon-β (IFNβ) wird von einem einzelnen Gen codiert, das ungefähr 50% Homologie mit den IFNα-Genen hat.
Die Interferon-α-Subtypen und Interferon-β binden an denselben Rezeptor auf der Zelloberfläche.
Das Interferon gamma (IFN gamma) wird auch von einer einzelnen Kopie codiert, die wenig Homologie mit den IFNα- und IFNβ-Genen hat. Der Rezeptor für IFN gamma ist unterschiedlich vom Rezeptor für die α- und β-Interferone.
Für den Zweck der vorliegenden Erfindung wird der Rezeptor für die α- und β-Klassen von Interferon als IFN-R bezeichnet werden. Dieser stellt den natürlichen Typ I-Rezeptor dar. Die Gruppe an Proteinen, die natürliches Interferon-α bilden, wird als IFNα bezeichnet, und Typ I-IFN stellt natürliches IFNα, IFNω und IFNβ dar.
Ungeachtet der Tatsache, dass Interferon ein starkes antivirales Mittel ist, gibt es viele Hinweise, die vorschlagen, dass viele der charakteristischen Symptome der akuten Viruserkrankung, wie bei Infektionen des oberen Atemtrakts, durch eine Überproduktion an Interferon-alpha verursacht werden. Darüber hinaus ist für IFN-alpha gezeigt worden, dass es in Versuchstieren zur Pathogenese gewisser chronischer Virusinfektionen beiträgt und die zur Verfügung stehenden Beweise schlagen vor, dass dies auch bei gewissen menschlichen chronischen Viruserkrankungen der Fall ist, so wie diejenigen, die auf Masernvirus beruhen.
Die α-Interferone sind auch potente immunregulatorische Moleküle, die die polyclonale B-Zell-Aktivierung stimulieren, die NK-Zellcytotoxizität erhöhen, die T-Zellfunktionen inhibieren und die Expression des majoren Histokompatibilitätskomplexes (MHC)-Klasse-1-Antigens modulieren, was alles in die Induktion der Autoimmunität und der Transplantatabstoßung verwickelt ist. Die anormale Produktion von Interferon-α wird mit einer Reihe von Autoimmunkrankheiten und Entzündungsstörungen assoziiert, einschließlich systemischem Lupus erythematosus (SLE), Typ I-Diabetes, Psoriasis, rheumatoider Arthritis, multipler Sklerose, Behçet's Krankheit, aplastischer Anämie, dem erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS) und der schweren kombinierten Immundefizienzkrankheit. Die Anwesenheit von Interferon-α im Serum von Patienten mit systemischem Lupus korrelierte mit den klinischen und den humoralen Anzeichen für eine erhöhte Krankheitsaktivität. Die Produktion von Interferon-α in HIV-positiven Individuen ist auch von hohen Aussagewert für die Entwicklung der Krankheit.
Es wurde berichtet, dass die Verabreichung von Interferon-α an Patienten mit Psoriasis und multipler Sklerose die zugrundeliegende Krankheit verschlimmerte und bei Patienten ohne vorherige Krankheitsgeschichte einer Autoimmunkrankheit ein SLE-ähnliches Syndrom hervorriefen. Von Interferon-α wurde auch gezeigt, dass es in normalen Mäusen Glomerulonephritis induziert und dass es den Ausbruch der spontanen Autoimmunkrankheit von NZB/W-Mäusen beschleunigt.
Interferon-α wird auch im Verlauf der Graft-versus-host-Krankheit (GVHD) produziert, parallel mit erhöhter NK-Zellaktivität, die für systemische GVHD charakteristisch ist. Interferon-α ist auch der Hauptmodulator der NK-Zellcytotoxizität und es wurde gezeigt, dass die Verabreichung von Interferon-α die intestinalen Folgen der GVHD bei normalen Mäusen verstärkt.
Das Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Antagonisten gegen die biologischen Aktivitäten von menschlichem Typ I-IFN. Diese Antagonisten könnten für die Zwecke der Therapie, einschließlich Zwecke der Prophylaxe, in Fällen verwendet werden, bei denen das Typ I-IFN (IFN α/β) anormal produziert wird und wenn diese anormale Produktion mit pathologischen Symptomen einhergeht. Solche Antagonisten könnten auch für die Diagnose verschiedener Krankheiten oder zur Untersuchung der Entwicklung solcher Krankheiten verwendet werden.
Um solche Antagonisten zu definieren, haben die Erfinder die Tatsache berücksichtigt, dass menschliches natürliches Typ I-IFN in der Tat aus einem Gemisch an Interferonen (Subspezies) besteht und die Tatsache, dass die Zusammensetzung dieser Assoziation verschiedener Subtypen von Interferonen sowohl quantitativ als auch qualtitativ variiert,
Einige natürliche Interferone, wie diejenigen, die von Namalwa-Zellen (Namalwa-Interferon) oder Leukozyten (Leukozyten-Interferon) sezerniert werden, wurden im Detail untersucht (N. B. Finter und K. H. Fautes, Interferon 2, 1980, S. 65–79 Herausgeber I. Gresser, Academic Press; K. Cantell et al, Interferon 1, 1979, S. 2–25, Herausgeber I. Gresser, Academic Press) und wurden von den Erfindern verwendet, um natürliche Typ I-Interferone zu definieren.
Bei einigen pathologischen Fällen, wie AIDS, wurden Interferone beschrieben, die einige spezielle Eigenschaften haben (O. T. Preble et al, Annals of New-York Academie of Sciences S. 65–75). Dieses Interferon, das in pathologische Fälle wie AIDS involviert ist, bindet dennoch an denselben Rezeptor, wie vorstehend beschrieben.
Ein Ziel der vorliegenden Endung ist die Bereitstellung eines Antagonisten vom Typ I-IFN, der in der Lage wäre, in einem bestimmten Ausmaß die biologischen Eigenschaften von menschlichem Typ I-IFN zu inhibieren oder neutralisieren, sozusagen in vivo ein Gemisch von α-, β-, ω-Subspezies zu neutralisieren.
Dem gemäß haben die Erfinder Antikörper definiert, insbesondere monoclonale Antikörper, die die Eigenschaft haben, Antagonisten für das Typ I-IFN zu sein. Diese Antikörper sind gegen den menschlichen Typ I-IFN-Rezeptor gerichtet.
Der menschliche Interferon Klasse I-Rezeptor (IFN-R) und sein cDNA sind in der WO-A-91/05862 beschrieben. Das Hauptziel dieser Patentanmeldung ist die Verwendung des besagten Rezeptors zur Identifiziereung von menschlichen IFN-α-Agonisten. Dieses Dokument hält auch fest, dass Antikörper gegen den menschlichen Interferon Klasse I- Rezeptor erzeugt werden konnten. Es werden jedoch nicht die Wege gezeigt, wie solche Antikörper erhalten werden können, und nicht ihre Eigenschaften.
Die Veröffentlichung von Yonehara, S. et al. (1986 – Elsevier Science Publishers BV, Amsterdam, Niederlande, Seiten 167–171) beschreibt einen monoclonalen anti-idiotypischen Antikörper, der gegen anti-Mensch-IFN-α-Antikörper erzeugt wurde, die nach Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit IFN-α und Reinigung von anti-IFN-α-IgG erhalten worden waren. Dieser Antikörper konkurriert mit IFN-α um die Bindung an die menschliche Zelloberfläche und inhibiert die antivirale Aktivität von IFN-α in vitro. Es kann jedoch aus D2 nicht abgeleitet werden, dass dieser Antikörper in der Lage ist, die biologischen Eigenschaften eines Gemischs von α-, β-, ω-Interferonen zu neutralisieren.
Ein anderes Dokument beschreibt den Erhalt von drei monoclonalen Antikörpern (mABs), die eine der Untereinheiten des IFN-α-Rezeptors erkennen (Colamonci, O. R. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci., Bd. 87, S. 7230–7234). Diese mABs wurden wegen ihrer Fähigkeit selektiert, die IFN-α/IFN-α-Rezeptorkomplexe zu binden. Von diesen Antikörpern wurde dann gezeigt, dass sie eine Bande von 110 kDa immunpräzipitieren, die einer Untereinheit des IFN-α-Rezeptors entspricht (die nicht mit IFN-α komplexiert ist). Die Tatsache, dass die beschriebenen Antikörper sowohl eine Untereinheit des IFN-α-Rezeptors immunpräzipitieren als auch die IFN-α/IFN-α-Rezeptorkomplexe, legt nahe, dass sie an ein anderes Epitop des Rezeptors binden als die Bindungsstelle von IFN-α an den IFN-α-Rezeptor. Darüber hinaus stellen die Autoren fest, dass die beschriebenen Antikörper nicht in der Lage sind, die Bindung von IFN-α an seine Rezeptoren zu blockieren.
Die Idee der Verhinderung von IDDM durch Verwendung von IFN-α-Antagonisten wird in der WO-A-93/04699 vorgeschlagen. Unter diesen Antagonisten erwähnen die Erfinder Antikörper, die in der Lage sind, an den IFN-α-Rezeptor zu binden und in der Lage sind, die biologische Aktivität von IFN-α zu neutralisieren. Die Erfinder in dieser Patentanmeldung beschreiben jedoch in keiner Weise, wie man solche Antikörper erhält. Im Gegenteil zitieren sie nur die gewünschten Charakteristika dieser Antikörper und erwähnen als Beispiele Polypeptide, die in der EP 369,877 , WO 91/05862 und Colamonici et al., PNAS 87: 7230–7234 identifiziert wurden.
Die Erfindung betrifft somit auch die Verwendung der monoclonalen Antikörper für die Herstellung von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die für die Behandlung von Symptomen von Nutzen sind, die mit der anormalen Produktion von Typ T-Interferon assoziiert sind. Diese monoclonalen Antikörper sind auch für die Herstellung von diagnostischen Reagentien geeignet.
Ein monoclonaler Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung ist gegen menschlichen Typ I-Interferonrezeptor (IFN-R) gerichtet und ist durch die folgenden Eigenschaften charakterisiert:

– er erkennt die extrazelluläre Domäne des menschlichen IFN-R und
– er hat eine Neutralisierungsfähigkeit gegen die biologischen Eigenschaften von menschlichem Typ I-IFN.

Die Fähigkeit der Neutralisation der biologischen Eigenschaften von Typ I-IFN kann als eine Funktion der Fähigkeit des monoclonalen Antikörpers abgeschätzt werden, die antivirale Aktivität von Typ I-IFN zu neutralisieren. Ein solcher Test ist relevant, um zu bestimmen, ob der getestete Antikörper im Umfang der Erfindung eingeschlossen ist, obwohl klar ist, dass die biologischen Eigenschaften von Typ I-IFN nicht auf seine antiviralen Eigenschaften beschränkt sind. Detaillierte Verfahren werden in den Beispielen beschrieben, um die Durchführung eines solchen Tests auf die antiviralen Eigenschaften zu ermöglichen. Die getesteten Zellen können vorteilhaft Daudi-Zellen sein, deren Affinität für Typ I-IFN wohlbekannt ist. Die Hauptschritte eines solchen Tests würden bestehen aus:

– Inkubieren einer bestimmten Konzentrationen von menschlichen Zellen, die auf menschliches Typ I-IFN reagieren, mit menschlichem Typ I-IFN in der Gegenwart einer bestimmten Konzentration von zu testenden monoclonalen Antikörpern für einen genügend langen Zeitraum, um die Bildung eines Komplexes zwischen den monoclonalen Antikörpern und dem IFN-R der menschlichen Zellen und/oder zwischen dem Typ I-IFN und dem IFN-R der menschlichen Zellen zu erlauben;
– Infizieren der inkubierten Zellen mit einer bestimmten Konzentration eines Virus;
– Waschen der Zellen;
– Resuspendieren der Zellen in Kulturmedium;
– Inkubieren für einen genügend langen Zeitraum, dass die Replikation des Virus möglich ist;
– Lysieren der Zellen, und
– Messen der Virusreplikation oder Messen der Hemmung des cytopathischen Effektes.

Die Fähigkeit der monoclonalen Antikörper der Erfindung, die biologischen Eigenschaften von menschlichem Typ I-IFN zu neutralisieren, kann als eine Funktion der Dosis an verwendetem Antikörper moduliert werden. Dem gemäß kann eine 100%-ige Inhibierung der biologischen Eigenschaften oder eine partielle Inhibierung erhalten werden.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die monoclonalen Antikörper, die gegen den menschlichen Typ I-IFN-Rezeptor gerichtet sind, weiterhin durch die Tatsache charakterisiert, dass sie zur Inhibierung der Bindung von menschlichem Typ I-IFN an den menschlichen IFN-R in der Lage sind.
Ein monoclonaler Antikörper, der die Fähigkeit hat, die extrazelluläre Domäne des menschlichen IFN-R zu erkennen und der in der Lage ist, die Bindung von menschlichem Typ I-IFN an seinen Rezeptor zu inhibieren, kann mittels der folgenden Schritte selektiert werden:

– Vorinkubieren einer bestimmten Konzentration von gereinigten monoclonalen Antikörpern oder eines Hybridom-Kultur-Überstandes, welcher zu testende monoclonale Antikörper enthält, mit menschlichen Zellen, die IFN-R beinhalten können;
– Hinzufügen von markiertem menschlichem Typ I-IFN in einer bestimmten Konzentration zu dem obigen Vorinkubationsmedium;
– Inkubieren des Mediums, welches die menschlichen Zellen, monoclonale Antikörper und markiertes Typ I-IFN enthält, mit dem zellulären IFN-R für einen genügend langen Zeitraum, dass ein Gleichgewicht zwischen den monoclonalen Antikörpern auf der einen Seite und dem Typ I-IFN auf der anderen Seite entsteht;
– Waschen der Zellen;
– Bestimmen der Bildung eines Bindungskomplexes zwischen den menschlichen Zellen und dem markierten Typ I-IFN durch Zählen der Menge an verknüpftem markiertem Typ I-IFN.

Einige der monoclonalen Antikörper der Erfindung haben auch die Fähigkeit, die antiproliferativen Eigenschaften von menschlichem Typ I-IFN zu neutralisieren. Diese Eigenschaften können auch mit Daudi-Zellen unter Durchführung der folgenden Schritte getestet werden:

– Wachsenlassen der Zellen in Anwesenheit des menschlichen Typ I-IFNs und in Anwesenheit einer bestimmten Konzentration von mAb
– Zählen der Zellen, um eine Hemmung des antiproliferativen Effekts des menschlichen Typ I-IFNs zu ermitteln.

Eine Eigenschaft eines monoclonalen Antikörpers gemäß der Erfindung steckt in seiner Fähigkeit des Erkennens der extrazellulären Domäne des menschlichem IFN-Rezeptors. Diese Eigenschaft des monoclonalen Antikörpers kann mit menschlichen Zellen getestet werden, die den natürlichen menschlichen Rezeptor tragen, aber auch mit der extrazellulären Domäne eines rekombinanten IFN-R, wie er in einer prokaryontischen Zelle exprimiert wird, zum Beispiel in E. coli, oder mit einem rekombinanten IFN-R, wie er in einer eukaryontischen Zelle exprimiert wird, wie Säugerzellen, zum Beispiel eine CHO-Zelle.
Dieser Rezeptor kann in der Tat verschiedene Eigenschaften darbieten, in Abhängigkeit von der Tatsache, ob er in einer prokaryontischen oder eukaryontischen Zelle produziert wird und entsprechend in Abhängigkeit von der Tatsache, ob die posttranslationale Reifung eintrat oder nicht. Die Erfinder zeigten interessanterweise, dass relevante Tests, um die Fähigkeit eines monoclonalen Antikörper gemäß der Erfindung zu bewerten, d. h. den zellulären IFN-R zu erkennen, mit einem rekombinanten Rezeptor durchgeführt werden können, der in Säugerzellen exprimiert wird. In der Tat hat ein solcher rekombinanter Rezeptor dieselben Eigenschaften als der zelluläre Rezeptor, insoweit es seine erkennende Aktivität betrifft.
Monoclonale Antikörper der Erfindung können gegen verschiedene Formen des Rezeptors erhalten werden, einschließlich des vollständigen Rezeptors, einer speziellen Domäne oder eines Peptids mit der charakteristischen Aminosäuresequenz des Rezeptors, wie in 3 dargestellt ist.
Monoclonale Antikörper der Erfindung können zum Beispiel gegen die lösliche Form des Rezeptors hergestellt werden. Ein wasserlösliches Polypeptid, das der löslichen Form des IFN-R entspricht, ist in 2 beschrieben. Gemäß der vorliegenden Erfindung entspricht eine lösliche Form des IFN-R einem Peptid oder einem Polypeptid, das in der Lage ist, im Körper zu zirkulieren.
Andere monoclonale Antikörper gemäß der Erfindung können auch gegen ein Peptid gewonnen werden, das in der extrazellulären Domäne des Rezeptors vorkommt, wie in 2 beschrieben. Ein vorteilhaftes Peptid entspricht zum Beispiel der Aminosäuresequenz zwischen Aminosäure 1 und Aminosäure 229. Gemäß einer andern Ausführungsform der Erfindung können die Antikörper gegen ein Polypeptid gewonnen werden, das durch Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren modifiziert ist, mit der Maßgabe, dass Antikörper, die gegen die nicht modifizierte extrazelluläre Domäne des IFN-R gerichtet sind, das modifizierte Polypeptid oder Peptid erkennen.
Bevorzugte monoclonale Antikörper gemäß der Endung sind diejenigen vom Typ IgG1.
Unter den Antikörpern der Erfindung ist ein Antikörper, der die Fähigkeit hat, die Bindung des Typ I-IFN an seinen Rezeptor zu inhibieren, bevorzugt dadurch charakterisiert, dass er die Bindung in vitro von menschlichem Typ IFN an den menschlichen zellulären IFN-R inhibiert, wenn er zusammen mit Zellen inkubiert wird, die den hu-IFN-R tragen, bei einer Konzentration an Antikörpern gleich oder niedriger als 100 μg/ml, vorzugsweise gleich oder niedriger als 50 μg/ml, vorteilhaft niedriger als 20 μg/ml und mehr bevorzugt im Bereich von etwa 0,5 bis 2 μg/ml.
Die Erfinder haben gezeigt, dass die Fähigkeit der Bindung mit hoher Affinität eines monoclonalen Antikörpers nicht ausreichend ist um sicherzustellen, dass dieser Antikörper in der Lage sein wird, die Bindungsaktivität des menschlichem Typ I-IFN an den IFN-R zu inhibieren. Trotzdem ist die Fähigkeit der Bindung mit hoher Affinität eines monoclonalen Antikörpers notwendig, um weiter die Fähigkeit des Antikörpers zu untersuchen, die Bindung des Typ I-IFN an seinen zellulären Rezeptor zu inhibieren.
Ein anderer monoclonaler Antikörper ist dadurch charakterisiert, dass er in vitro bei Zellen, die auf dieses menschliche Typ I-IFN sehr empfindlich sind, zum Beispiel Daudi-Zellen bei einer Konzentration im Bereich 1 bis 10 μg/ml, die antiproliferative Aktivität von menschlichem Typ I-IFN neutralisiert.
Gemäß einer anderen Ausführungsform ist ein monoclonaler Antikörper auch dadurch charakterisiert, dass er in vitro bei Zellen, die auf dieses menschliche Typ IFN wenig empfindlich sind, zum Beispiel Ly28-Zellen bei einer Konzentration im Bereich 50 bis 100 μg/ml, die antiproliferative Aktivität von menschlichem Typ IFN neutralisiert.
Eine besondere Gruppe von monoclonalen Antikörpern gemäß der Erfindung ist dadurch charakterisiert, dass sie die antivirale Aktivität von menschlichem Typ I-IFN bei Zellen neutralisiert, die auf dieses menschliche Typ I-IFN sehr empfindlich sind. Zum Beispiel Daudi-Zellen bei einer Konzentration im Bereich 1 bis 50 μg/ml, vorzugsweise 1 bis 20 μg/ml, bei einer Konzentration an Typ I-IFN im Bereich von 1 bis 1000 Einheiten bezüglich des internationalen Standards MRC 69/19.
Vorteilhaft ist der monoclonale Antikörper gemäß der Erfindung so, das diese Antikörper nicht an den menschlichen Rezeptor für IFN gamma binden.
Ein spezieller Antikörper, der die Erfordernisse der Erfindung erfüllt, ist so, dass er gegen ein Epitop auf der Aminosäuresequenz gerichtet ist, das zwischen Aminosäure 27 und Aminosäure 427 der extrazellulären Domäne von menschlichem IFN-R liegt, wie dargestellt in 2.
Ein besonders interessanter monoclonale Antikörper gemäß der Erfindung ist der Antikörper, der als 64G12 unter n° 92022605 bezeichnet wird und der bei der ECACC (European Collection of Animal Cell Cultures Porton Down Salisbury, Wiltshire SP4 056, Vereinigtes Königreich) am 26. Februar 1992 hinterlegt wurde.
Diese Antikörper können mittels herkömmlicher Verfahren hergestellt werden, einschließlich der Herstellung von Hybridomzellen durch Fusion von Myelomzellen und Milzzellen eines Tiers, das zuvor mit dem Peptidantigen immunisiert wurde, unter solchen Bedingungen, dass das Antigen, gegen das diese Antikörper sich bilden, durch die extrazelluläre Domäne von IFN-R oder jedes Polypeptid oder Peptid dieser Domäne dargestellt wird.
Die Hybridome werden gemäß dem Protokoll von Kohler und Milstein (Nature, 1974, 256: 495–497) konstruiert. Zum Beispiel werden die Hybridome aus der Fusion der vorstehend beschriebenen Milzzellen mit NS1 (BaIbC) HGPRT der Maus als Myelomzelle abgeleitet.
Ein zweites Verfahren für die Produktion von monoclonalen Antikörpern gemäß der Erfindung besteht in der Durchführung der Fusion zwischen B-Zellen des Bluts, die mit Epstein/Barr-Virus immortalisiert wurden, und menschlichen B-Lymphocyten, die zuvor mit der extrazellulären Domäne von IFN-R oder eines Fragments davon in Kontakt gebracht wurden, gegen die man beschlossen hat, monoclonale Antikörper zu bilden. B-Zellen, die zuvor mit der extrazellulären Domäne von IFN-R oder eines Fragments davon in Kontakt gebracht wurden, gegen die man beschlossen hat, monoclonale Antikörper zu bilden, können durch in vitro-Kultur in Kontakt mit den Antigenen erhalten werden, der Gewinnung der B-Zellen, die mit diesen Antigenen bedeckt sind, wobei einer oder mehrere Zyklen der Stimulierung vorausgehen.
Die Erfindung betrifft somit menschliche Antikörper, die bei Durchführung des vorstehenden Verfahrens erhalten wurden und die die vorstehend definierten Eigenschaften haben.
Die Erfindung zielt auch auf die Bereitstellung eines monoclonalen Antikörpers, der dadurch charakterisiert ist, dass die variablen oder komplementär bestimmenden Regionen seiner schweren und/oder leichten Ketten auf den Rahmen und/oder die konstanten Regionen eines menschlichen Antikörpers verpflanzt sind.
Die Erfindung stellt weiterhin eine Zusammensetzung bereit, die für die biologischen Eigenschaften von menschlichem Typ I-IFN antagonistische Eigenschaften hat, dadurch charakterisiert, dass sie vorstehend definierte monoclonale Antikörper umfaßt.
Dem entsprechend stellt die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die dadurch charakterisiert ist, dass sie vorstehend definierte monoclonale Antikörper zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger umfaßt.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines vorstehend definierten monoclonalen Antikörpers für die Herstellung eines Medikaments für die Behandlung oder Prophylaxe eines pathologischen Zustands oder von Symptomen, die mit einer Überproduktion von Typ I-IFN assoziiert sind.
Gemäß einem ersten Beispiel können die Antikörper in einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung einer Transplantatabstoßung verwendet werden.
Gemäß einem anderen Beispiel werden die Antikörper der Erfindung als aktives Prinzip in einer pharmazeutischen Zusammensetzung für die Behandlung von Autoimmun- und entzündlichen Krankheiten verwendet. Solche Krankheiten umfassen systemischen Lupus erythematosus (SLE), Typ I-Diabetes, Psoriasis, rheumatoide Arthritis, multiple Sklerose, Behçet's Krankheit, aplastische Anämie, das erworbenen Immundefizienzsyndrom (AIDS) und die schwere kombinierte Immundefizienzkrankheit.
Die Behandlung von akuten Viruserkrankungen kann auch mit den Antikörpern der Endung durchgeführt werden. Als Beispiele können Behandlungen von Infektionen des oberen Atemtrakts und chronische Virusinfektionen, wie diejenigen, die von Masernvirus verursacht sind, durchgeführt werden.
Die Antikörper der Endung können auch für die in vitro-Diagnose der Anwesenheit des menschlichen Typ I-IFN-Rezeptors auf Zellen verwendet werden.
FIGUREN
1: Bindung von mit ¹²⁵I markierten monoclonalen Antikörpern 34F10 und 64G12 an:

– A: Daudi-Zellen
– B: Ly28-Zellen

Kurz gesagt wurden 10⁶ Zellen 2 Stunden bei 4°C in der Gegenwart von verschiedenen Mengen der markierten Antikörper, die mit RPMI-Medium verdünnt waren, das 10% fötales Kälberserum (FCS) enthielt, inkubiert. Die Zellen wurden 4 mal mit RPMI-1% FCS gewaschen und die gebundene Radioaktivität gemessen. Unspezifische Bindung wurde durch Inkubation mit einem 100-fachen Überschuß an kalten Antikörpern und Subtraktion von dem Ergebnis gemessen.
2: die Nucleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz der extrazellulären Domäne von menschlichem IFN-R.
Die monoclonalen Antikörper wurden gegen rekombinante lösliche Formen des menschlichen Interferon alpha-beta-Rezeptors (IFN-R) produziert, synthetisiert entweder in prokaryontischen Zellen E. coli) oder einem Säugerzellsystem (Cos-Zellen). Diese löslichen Formen basierten auf den in 2 beschriebenen DNA-Sequenzen.
3: die Nucleotidsequenz und die entsprechende Aminosäuresequenz von menschlichem IFN-R.
BEISPIELE
BEISPIEL 1
Synthese von löslichen Rezeptoren
Synthese in E. coli
Ein DNA-Fragment, das die Sequenz enthält, die die extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 27 bis 427) des menschlichen IFN-R (2) codiert, in die eine Extrasequenz, die 5 Histidinreste codiert, genau vor dem Terminationscodon eingeführt wurde, wurde in den Expressionsvektor pKK233-2 cloniert. Dieses Fragment wurde durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) produziert und die resultierenden Plamide wurden sequenziert, um die Inserierung im Rahmen mit der Shine-Dalgarno-Sequenz zu bestätigen und die entsprechende Sequenz, die den Rezeptor codiert.
Der Poly-Histidin-Schwanz, der in das rekombinante Protein eingeführt worden war, ermöglicht die rasche Reinigung mittels Affinitätschromatographie an einem chelatierten Nickelträger (NTA-Säule), wie zuvor beschrieben (Hochuli E. et al, Bio/technology, 1988, 1321–1325).
Das Plasmid wurde in einen E. coli-Stamm, JM105, eingebracht und die Proteinsynthese durch Zugabe von IPTG zum Kulturmedium (pKK233-2, tac-Promotor) induziert.
Die Proteine wurden aus dem Bakterienpellet extrahiert und der lösliche Rezeptor mittels Affinitätschromatographie, wie nachstehend beschrieben, zur Homogenität gereinigt. Dieses Verfahren ergab ein Protein, das unter reduzierenden Bedingungen als 2 Banden um 50 kDa wandert und als drei Banden unter nicht reduzierenden Bedingungen. Die maximale Konzentration des mittels verschiedener Verfahren erhaltenen Proteins war etwa 20 μg/ml.
Die N-terminale Sequenz der zwei Proteine, die mittels Gelelektrophorese nachgewiesen wurden, zeigte, dass beide Proteine das erwartete Fragment des Rezeptors sind.
Synthese und Reinigung eines nicht glycosylierten löslichen Rezeptors:
Unter Verwendung desselben PCR-Weges konstruierten wir auch einen Expressionsvektor, der die Aminosäuresequenz 1-427 von IFN-R codiert, mit zusätzlichen 5 Histidinresten am C-Terminus, inseriert in den Expressionsvektor pXMT-3. Die exakte Nucleotidsequenz der Inserierung wurde auch bestätigt.
Das resultierende Plasmid wurde mittels Elektroporation für die transiente Expression in Cos7-Zellen eingebracht und das rekombinante Protein wurde mittels Affinitätschromatographie, gefolgt von Ionenaustauscherchromatographie auf mono-Q (Pharmacia), zur Homogenität gereinigt, wie nachstehend beschrieben.
Reinigung des löslichen IFN-R aus Cos7-Zellen
Diese Reinigung ergab ein Protein von 76 kDa, dessen N-terminale Sequenz der vorhergesagten Rezeptorsequenz entspricht, mit einer gewissen Heterogenität bei der Prozessierung der Leadersequenz.
BEISPIEL 2:
Produktion von monoclonalen Antikörpern gegen den Interferon-Typ I-Rezeptor.
1) Produktion der monoclonalen Antikörper
Mäuse wurden durch Injektion von rekombinantem löslichem Interferon (r sIFN-R) immunisiert, gereinigt aus E. coli oder aus einem Kulturüberstand von Cos7-Zellen. Ursprünglich wurde den Mäusen intraperitoneal und subkutan das gereinigte Protein in vollständigem Freund's Adjuvans injiziert. Danach wurde den Mäusen einmal die Woche das gereinigte Protein, das mit gepufferter Salzlösung verdünnt war, intraperitoneal injiziert. Es wurden jedesmal zehn Mikrogramm der rekombinanten Proteine injiziert.
Nach der vierten Injektion wurde Blut entnommen und die Anwesenheit von spezifischen Serumantikörpern gegen den rekombinanten Rezeptor wurde mit ELISA und Western Blot getestet. Die am stärksten Reaktiven wurden dann mit insgesamt 10 μg Antigen verstärkt, von dem die Hälfte intravenös und die Hälfte intraperitoneal injiziert wurde.
2) Zellfusion
Vier Tage nach der Verstärkung wurden Milzzellen von dem immunisierten Tier entnommen und entsprechend dem von S. Fazekas et al. (J. Immunol. Methods 35: 1–32, 1980) beschriebenen Verfahren mit NS1 (Balbc) HGPRT (Maus)-Myelomzellen fusioniert. Kurz gesagt wurden 5 × 10⁷ Milzzellen mit 3 × 10⁷ Myelomzellen in 1 ml Polyethylenglycol-Lösung fusioniert und in fünf Platten mit 96 Mulden auf einer Futterschicht für Peritoneal-Makrophagen in HAT (Hypoxanthin, Aminoprotein und Thymidin)-Medium verteilt. Dieser Vorgang wurde 4 mal wiederholt, da 20 × 10⁷ Milzzellen von der immunisierten Maus erhalten wurden. Die Durchmusterung nach spezifischen Hybridomen wurde durchgeführt, wenn in den Kulturmulden große Kolonien zu sehen waren.
Bei der Durchmusterung wurde die Anwesenheit von spezifischen Antikörpern mittels eines direkten ELISA-Verfahrens nachgewiesen:

a) ELISA-Platten wurden übernacht bei 4°C mit in E. coli oder in Cos7-Zellen exprimiertem gereinigtem sIFN-R beschichtet, der mit PBS verdünnt war. Mit BSA beschichtete Platten wurden verwendet, um unspezifische Bindung nachzuweisen,
b) die Platten wurden durch Inkubation mit 3%-igem BSA in PBS 1 Stunde bei 37°C gesättigt,
c) die Platten wurden 4 Stunden bei Raumtemperatur mit Hybridomüberständen inkubiert, die 1 zu 4 mit PBS-0,05% Tween 20 verdünnt waren,
d) gebundene Antikörper wurden mittels eines zweistufigen Verfahrens nachgewiesen, welches zunächst die Inkubation mit biotinyliertem Ziege-anti-Maus-Immunglobulin umfaßte, gefolgt von einem Streptavidin-Meerrettichperoxidase-Komplex (beides von Amersham und 1/1000 verdünnt mit PBS-0,05% Tween 20).

Hybridome, die positiv Antikörper sezernierten, wurden auf Platten mit 24 Mulden auf eine Milzzell-Futterschicht verbracht und ihre Reaktivität wurde erneut mittels ELISA und Western Blot überprüft.
3) Identifizierung der Reaktivität auf den natürlichen Interferon-Typ I-Rezeptor
Die Reaktivität der monoclonalen Antikörper (mAbs), die den rekombinanten sIFN-R erkennen, gegen den natürlichen Klasse I-Rezeptor, der auf der Oberfläche von Daudi-Zellen exprimiert wurde, wurde mittels Membran-Immunflureszenz getestet. Kurz gesagt wurden 5 × 10⁵ Daudi-Zellen mit 100 μl Kulturüberstand von ausgewählten Hybridomen 30 Min. bei 4°C inkubiert. Die Zellen wurden dann 4 mal mit RPMI-Medium, das 1% BSA enthielt, gewaschen und weitere 30 Min. bei 4°C mit einem verdünnten, mit FITC markierten Ziege-anti-Maus F(ab')₂ inkubiert. Die Zellen wurden letztlich nach dem Waschen mit Durchflusscytometrie analysiert. Bei einem der 35 getesteten Antikörper, die gegen den rekombinanten Rezeptor aus E. coli produziert worden waren, und bei 5 von 6 der getesteten Antikörper, die gegen den rekombinanten Rezeptor aus COS produziert worden waren, wurde gefunden, dass sie den natürlichen Rezeptor auf den Daudi-Zellen erkannten,
Die Clonierung dieser Hybridome wurde dann mittels der limitierenden Verdünnung durchgeführt. Der Isotyp dieser mAbs wurde mittels eines ELISA-Verfahrens unter Verwendung von Isotyp-spezifischen Antikörpern bestimmt. Bei allen 6 mAbs wurde gefunden, dass sie Igel mit kappa leichten Ketten waren. Eine Zusammenfassung der Reaktivität dieser 6 mAbs ist in Tabelle 1 gezeigt.
Die monoclonalen Antikörper wurde mittels Protein G-Chromatographie aus Kulturüberständen gereinigt.
Tabelle 1: Reaktivität der anti-IFN-R monoclonalen Antikörper
BEISPIEL 3
Inhibierung der Bindung von Interferon an menschliche Zelllinien
Die Inhibierung der Bindung von Interferon an menschliche Zelllinien wurde wie folgt getestet. 10⁶ Zellen wurden 30 Min. bei 4°C mit verschiedenen Verdünnungen von Kulturüberständen von Hybridomen oder gereinigten mAbs oder mit Medium allein vorinkubiert. Mit ¹²⁵I markiertes IFN alpha 8 oder alpha 2 wurde mit der Konzentration von 100 pM zugegeben und die Zellen weiter 2 Stunden bei 4°C inkubiert. Diese Inkubationen wurden in RPMI-Medium durchgeführt, das 20 mM HEPES, pH 7,4 und 10% fötales Kälberserum (FCS) enthielt. Die Zellen wurden letztlich 4 mal mit RPMI –1% FCS gewaschen und gemessen, um die gebundene Radioaktivität zu bestimmen.
Von dem mAb, der von der Hybridomlinie 64G12 sezerniert wird (der letztere mAb 64G12 genannt), wurde bei diesem Test gezeigt, dass er in dosisabhängiger Weise die Bindung von markiertem IFN an die Zellen inhibiert. 50% Inhibierung der Bindung an die Daudi-Zellen (Burkitt-Lymphom-Zelllinie; Klein et al., Cancer Research, 28: 1300–1310, 1968) wurde bei einer mAb-Konzentration von 0,4 μg/ml erhalten. Dieselbe Inhibierung wurde mit K562-Zellen (chronische myelogene Leukämie, Lozzio und Lozzio, Cell, 45: 321–334, 1975) erhalten, aber bei HL60-Zellen (promyelocytische Leukämie, Collins S. J. et al., Nature, 270: 347–349, 1977) wurde 50% Inhibierung bei 11 μg/ml erhalten und bei Ly28-Zellen bei 60 μg/ml (Klein G. et al. Int. J. Cancer, 10: 44–57, 1972).
Tabelle 2: Die Inhibierung der Bindung von markiertem IFN alpha 2 an verschiedene Zelllinien durch mAB64G12
Die Unterschiede bei der Konzentration an mAb, bei der 50% Inhibierung der Bindung von IFN erhalten wird, wurde direkte Bindung der mit ¹²⁵I markierten mAbs 64G12 und 34F10 an dieselbe Zelllinie und einer Scatchard Plot-Analyse der Ergebnisse untersucht. Im Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1,5 μg/ml wurde eine Bindung mit hoher Affinität des mAb 34F10 (~10 nM) an alle Zelllinien gesehen, während eine Bindung mit hoher Affinität des mAb 64G12 nur an Daudi- und K562-Zellen nachgewiesen wurde (1).
BEISPIEL 4:
Inhibierung der Funktion von Typ I-Interferon
Die funktionelle Inhibierung von Typ I-Interferon durch gereinigten mAb 64G12 wurde in einem antiviralen Test mit Daudi-Zellen unter Verwendung rekombinantem IFN alpha 2, IFN Beta und IFN omega oder gereinigten Namalwa- und Leukozyten-Interferonen gezeigt und in einem antiproliferativen Test mit rekombinantem IFN alpha 2.
* Antivirale Aktivität
Ein antiviraler Test mit Daudi-Zellen wurde wie beschrieben durchgeführt (M. Dron und M. G. Tovey, J. Gen. Virol. 64: 2641–2647, 1983). Zellen (0,5 × 10⁶/ml) wurden 24 Stunden in der Gegenwart von Interferon und Antikörpern inkubiert. 10⁶ Zellen in 1 ml wurden dann eine Stunde bei 37°C mit vesikulärem Stomatitis-Virus (VSV) infiziert, dann 3 mal gewaschen, in Kulturmedium resuspendiert und 18 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden dann durch Einfrieren/Auftauen lysiert und die Virusreplikation durch Titration des Überstands auf L929-Zellen gemessen. Eine dosisabhängige Inhibierung der antiviralen Aktivität der verschiedenen Subtypen von Typ I-IFN wurde für den gereinigten mAb 64G12 gezeigt.
Für den antiviralen Test mit Wish-Zellen wurden Zellen 24 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen an Interferonen in der Gegenwart der mAbs vor der Challenge mit VSV inkubiert. Bei diesem Test wurde von dem mAb 64G12 gezeigt, dass er die antivirale Aktivität von Leukozyten-IFN (50 U/ml), rekombinantem IFN alpha 2 (50 U/ml) und Interferon aus dem Serum von AIDS-Patienten (50, 75 und 150 U/ml) vollkommen blockiert.
* Antiproliferative Aktivität
Für den antiproliferativen Test wurden Daudi-Zellen mit einer Konzentration von 10⁵ Zellen pro ml in der Gegenwart von Interferon und gereinigtem inhibitorischem oder Kontrollantikörper in eine Platte mit 96 Mulden gesät. Die Zellen wurden dann nach 24, 48 und 72 Stunden mit einem Coulter Counter gezählt und durch Trypanblau-Ausschluß auf ihre Lebensfähigkeit überprüft. Gereinigter mAb 64G12 zeigte eine dosisabhängige Inhibierung der antiproliferativen Aktivität von Interferon alpha 2.

Claims

Monoclonaler Antikörper gegen den menschlichen Interferon Klasse I-Rezeptor (IFN-R), gekennzeichnet durch die folgenden Eigenschaften: – er erkennt die extrazelluläre Domäne des menschlichen IFN-R und – er hat eine Neutralisierungsfähigkeit gegen die biologischen Eigenschaften von menschlichen natürlichen Interferonen-α, -β und -ω (Typ I-IFN).
Monoclonaler Antikörper gegen den menschlichen Typ I-IFN-R nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch seine Fähigkeit, die Bindung eines menschlichen pathologischen Typ I-IFNs an den IFN-R zu hemmen.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 1 oder 2, welcher erhältlich ist aus einer Hybridomzelle, hergestellt durch Fusion einer Myelomzelle mit Milzzellen eines Tieres, welches zuvor mit der löslichen Form des menschlichen IFN-R immunisiert wurde.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Epitop auf einer löslichen Form des menschlichen zellulären IFN-R oder eines recombinanten IFN-R erkennt.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass er in vitro die Bindung von menschlichem Typ I-IFN an den menschlichen zellulären IFN-R hemmt, wenn er mit Zellen co-inkubiert wird, welche den hu-IFN-R beinhalten, bei einer Antikörperkonzentration, die gleich oder niedriger als 100 μg/ml ist.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er in vitro die Bindung von menschlichem Typ I-IFN an den menschlichen zellulären IFN-R hemmt, wenn er mit Zellen co-inkubiert wird, die den hu-IFN-R beinhalten, bei einer Antikörperkonzentration, die gleich oder niedriger als 50 μg/ml ist.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er in vitro die Bindung von menschlichem Typ I-IFN an den menschlichen zellulären IFN-R hemmt, wenn er mit Zellen co-inkubiert wird, welche den hu-IFN-R beinhalten, bei einer Antikörperkonzentration, welche geringer als 20 μg/ml ist.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass er in vitro die Bindung von menschlichem Typ I-IFN an den menschlichen zellulären IFN-R hemmt, wenn er mit Zellen co-inkubiert wird, welche den hu-IFN-R beinhalten, bei einer Antikörperkonzentration im Bereich von 0,5 bis 2 μg/ml.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass er in vitro die antiproliferative Aktivität des menschlichen Typ I-IFNs neutralisiert, auf Zellen, welche auf diesen menschlichen Typ I-IFN stark reagieren, bei einer Konzentration in einem Bereich von 1 bis 10 μg/ml.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass er in vitro die antiproliferative Aktivität des menschlichen Typ I-IFNs neutralisiert, auf Zellen, welche auf diesen menschlichen Typ I-IFN schwach reagieren, bei einer Konzentration in einem Bereich von 50 bis 100 μg/ml.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass er nicht an den menschlichen Rezeptor des IFN-γ bindet.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass er ein Epitop auf der Aminosäuresequenz 27 bis 427 des menschlichen IFN-R erkennt.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass er in vitro die antivirale Aktivität des menschlichen Typ I-IFNs neutralisiert, auf Zellen, welche stark auf diesen menschlichen Typ I-IFN reagieren, bei einer Konzentration im Bereich von 1 bis 10 μg/ml.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 9 oder Anspruch 13, wobei die Zellen, welche stark auf den menschlichen Typ I-IFN reagieren, Daudi-Zellen sind.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass er in vitro die antivirale Aktivität von menschlichem Klasse I-IFN neutralisiert, auf Zellen, welche schwach auf dieses menschliche IFN reagieren, bei einer Konzentration in einem Bereich von 50 bis 100 μg/ml.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 10 oder Anspruch 15, wobei die Zellen, welche schwach auf den menschlichen Typ I-IFN reagieren, Ly28-Zellen sind.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass er der 64G12-Antikörper ist, hinterlegt bei der ECACC am 26. Februar 1992 unter der Nr. 92022605.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass er ein humanisierter Antikörper ist.
Monoclonaler Antikörper nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die variablen oder komplementaritätsbestimmenden Regionen seiner schweren und leichten Ketten transplantiert sind auf das Gerüst und die konstanten Regionen eines menschlichen Antikörpers.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass er ein menschlicher Antikörper ist.
Monoclonaler Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass er ein IgG1 Typ-Antikörper ist.
Hybridomzelle, dadurch gekennzeichnet, dass sie monoclonale Antikörper nach den Ansprüchen 1 bis 19 produziert.
Zusammensetzung mit Antagonisteigenschaften gegen den Typ I-IFN, dadurch gekennzeichnet, dass sie monoclonale Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 21 umfasst.
Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, dass es monoclonale Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 21 umfasst, zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger.
Verwendung eines monoclonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 21, für die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung oder Prophylaxe eines pathologischen Zustandes, der mit proliferativer Zellaktivität und/oder viraler Zellinfektion assoziiert ist.
Verfahren zur Selektion eines monoclonalen Antikörpers, welcher die Fähigkeit hat, die extrazelluläre Domäne des menschlichen IFN-R zu erkennen, und in der Lage ist, die Bindung des menschlichen Typ I-IFNs an den IFN-R zu hemmen, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte: – Vorinkubieren einer bestimmten Konzentration von gereinigten monoclonalen Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 21 oder eines Hybridom-Kultur-Überstandes, welcher monoclonale Antikörper enthält, mit menschlichen Zellen, die IFN-R beinhalten können; – Hinzufügen von markiertem menschlichem Typ I-IFN in einer bestimmten Konzentration zu dem obigen Vorinkubationsmedium; – Inkubieren des Mediums, welches die menschlichen Zellen, monoclonale Antikörper und markiertes Typ I-IFN enthält, mit dem zellulären IFN-R für einen genügend langen Zeitraum, dass ein Gleichgewicht zwischen den monoclonalen Antikörpern auf der einen Seite und dem Typ I-IFN auf der anderen Seite entsteht; – Waschen der Zellen; – Bestimmen der Bildung eines Bindungskomplexes zwischen den menschlichen Zellen und dem Typ I-IFN durch Zählen der Menge an verknüpftem markiertem Typ I-IFN.
Verfahren zur Selektion eines monoclonalen Antikörpers mit der Fähigkeit, die extrazelluläre Domäne des menschlichen IFN-R zu erkennen, und mit einer neutralisierenden Fähigkeit gegenüber den antiproliferativen Aktivitäten des Typ I-IFNs, auf menschlichen Zellen, gekennzeichnet durch die Schritte: – Wachsenlassen der Zellen in Anwesenheit des menschlichen Typ I-IFNs und in Anwesenheit einer bestimmten Konzentration von monoclonalen Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 21; – Zählen der Zellen, um eine Hemmung des antiproliferativen Effekts des Typ I-IFNs zu ermitteln.
Verfahren zur Selektion eines monoclonalen Antikörpers mit der Fähigkeit, die extrazelluläre Domäne des menschlichen IFN-R zu erkennen, und mit einer neutralisierenden Fähigkeit gegenüber den antiviralen Aktivitäten des natürlichen nicht-pathologischen oder pathologischen Typ I-IFNs auf menschlichen Zellen, gekennzeichnet durch die Schritte: – Inkubieren der Zellen mit Typ I-IFN und monoclonalen Antikörpern nach einem der Ansprüche 1 bis 21, in bestimmten Konzentrationen, für einen genügend langen Zeitraum, um die Bildung eines Komplexes zwischen den monoclonalen Antikörpern und dem IFN-R der menschlichen Zellen und/oder zwischen dem Typ I-IFN und dem IFN-R der menschlichen Zellen zu erlauben; – Infizieren der obigen inkubierten Zellen mit einer bestimmten Konzentration eines Virus; – Waschen der Zellen; – Resuspendieren der Zellen in Kulturmedium; – Inkubieren für einen genügend langen Zeitraum, dass die Replikation des Virus möglich ist; – Lysieren der Zellen, und – Messen der Virusreplikation oder Messen der Hemmung des cytopathischen Effektes.
Verwendung eines monoclonales Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 21, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Allotransplantat-Abstoßung oder der „Graft-versus-host"-Erkrankung.
Verwendung eines monoclonalen Antikörpers nach einem der Ansprüche 1 bis 21 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von Autoimmun- und Entzündungserkrankungen.
Verwendung eines monoclonalen Antikörpers nach Anspruch 30 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung oder Prophylaxe von rheumatoider Arthritis.