DK174927B1

DK174927B1 - DNA, der koder for human faktor VIII:C, vektor omfattende denne DNA, transformeret vært omfattende denne DNA, og fremgangsmåde til fremstilling af human faktor VIII:C

Info

Publication number: DK174927B1
Application number: DK198502923A
Authority: DK
Inventors: J Toole John Jr
Original assignee: Inst Genetics Llc
Priority date: 1983-10-28
Filing date: 1985-06-27
Publication date: 2004-03-01
Also published as: FI86436C; ES8800987A1; ES537146A0; FI852547L; ES8700868A1; EP0162067A1; JP2549049B2; ES546655A0; MX9203437A; DK292385A; EP0162067A4; IT8423351A0; WO1985001961A1; ES546653A0; ES8704546A1; FI852547A0; ES8800359A1; DK292385D0; JPH02227078A; IT1177066B

Description

DK 174927 B1

Den foreliggende opfindelse angår rekombinant deoxyribonukleinsyre (DNA), der koder for cellulær fremstilling af human faktor VIII:C og ekspression af human faktor VIII:C under anvendelse af sådan DNA.

5 Faktor VIII:C er et blodplasmaprotein, som er defekt eller fraværende ved Hæmofilia A. Denne sygdom er en arvelig blødningslidelse, som rammer ca. én af 20.000 mænd. Faktor VIII:C kendes eller omtales også som faktor VIII, den ^ antihæmofile faktor (faktor VIII:C), antihæmofilt globulin 10 (AHG), hæmofil faktor A, blodbladecofaktor, thromboplastinogen og thrombocytolysin. Den betegnes som "faktor VIII:C" for at angive, at det er den forbindelse, som påvirker størkningsaktiviteten.

Selvom isoleringen af faktor VIII:C fra blodplasma er 15 blevet beskrevet i litteraturen, er den præcise struktur af faktor VIII:C ikke tidligere blevet identificeret, til dels p.g.a. den manglende tilgængelighed af tilstrækkelige mængder rent materiale og den proteolytiske natur af mange kontaminanter og rensningsmidler. Selvom urent faktor VIII:C 20 har været tilgængelig i visse mængder som et koncentreret “ præparat fremstillet ud fra frisk frosset humant plasma, gør den ekstremt lave koncentration af faktor VIII:C i humant plasma og de høje omkostninger ved opnåelse og behandling af humant plasma prisen på dette materiale prohibitiv for en 25 omfattende behandling af hæmofili.

Den foreliggende opfindelse gør det muligt at fremstille human faktor VIII:C ved anvendelse af rekombinant DNA-teknik.

Faktor VIII:C er som andre proteiner opbygget af 30 omkring 20 forskellige aminosyrer arrangeret i en specifik rækkefølge. Ved at anvende genmanipulationsteknik er der ^ udviklet en fremgangsmåde, som muliggør fremstilling af * faktor VIII:C ved identifikation og kloning af genet, der koder for human faktor VIII:C-protein, kloning af dette gen, 35 inkorporering af dette gen i en rekombinant DNA-vektor, transformering af en passende vært med vektoren, der indeholder dette gen, ekspression af human faktor VIII:C-genet i en sådan vært og udvinding af det derved fremstillede human faktor VIII:C.

40 Teknikker, der er udviklet for nylig, har gjort det 2 DK 174927 B1 muligt at anvende mikroorganismer, som kan undergå hurtig og omfattende vækst, til syntese af kommercielt værdifulde proteiner og peptider uden hensyn til den naturlige kilde.

Disse teknikker gør det muligt, genetisk at udruste en 5 passende mikroorganisme med evne til at syntetisere et protein eller peptid, som normalt fremstilles af en anden organisme. Teknikken gør brug af fundamentale relationer, som eksisterer i alle levende organismer, mellem det genetiske materiale, sædvanligvis DNA, og de af organismen 10 syntetiserede proteiner. Denne relation er således, at en række af tre nukleotidsekvenser i DNA'en koder for fremstilling af aminosyresekvensen i proteinet. Der er én eller flere trinukleotidsekvensgrupper (kaldet kodoner), som specifikt koder for fremstillingen af hver af de 20 15 aminosyrer, der hyppigst forekommer i proteiner. Den specifikke relation mellem hver given trinukleotidsekvens og den tilsvarende aminosyre, for hvilken den koder, udgør den genetiske kode. Som følge deraf afspejles hvert protein eller peptids aminosyresekvens af en tilsvarende nu-20 kleotidsekvens efter en velkendt relation. Endvidere kan denne sekvens af nukleotider i princippet translateres af enhver levende organisme. For en redegørelse for den genetiske kode henvises til J.D. Watson, Molecular Biology of the Gene, (W.A. Benjamin, Inc., 1977), hvis indhold 25 inkorporeres heri ved henvisning, specielt 347-77; C.F.

Norton, Microbiology (Addison, Wesley 1981) og US-patentskrift nr. 4.363.877, hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning.

De 20 aminosyrer, hvoraf proteiner opbygges, er 30 phenylalanin (i det følgende af og til omtalt som "Phe" eller "F"), leucin ("Leu", "L"), isoleucin ("Ile", "I"), methionin ("Met", "M"), valin ("Val", "V"), serin ("Ser", "S"), prolin ("Pro", "P"), threonin ("Thr", "T"), alanin f ("Ala", "A"), tyrosin ("Tyr", "Y"), histidin ("His", "H"), 35 glutamin ("Gin", "Q"), asparagin ("Asp", "N"), glutaminsyre ("Glu", "E"), cystein ("Cys", "C"), tryptophan ("Trp", "W"), arginin ("Arg", "R”) og glycin ("Gly", "G"). De aminosyrer, de forskellige kombinationer af trinukleotider, som kan være indeholdt i et givet kodon, koder for, fremgår af tabel 1: 40 3 DK 174927 B1

Tabel 1

Den genetiske kode 1. position 2. position 3. position

5 T C A G

T Phe Ser Tyr Cys T

Phe Ser Tyr Cys C

Leu Ser Stop* Stop* A

10 Leu Ser Stop* Trp G

C Leu Pro His Arg T

Leu Pro His Arg C

Leu Pro Gin Arg A

Leu Pro Gin Arg G

15

A Ile Thr Asp Ser T

Ile Thr Asp Ser C

Ile Thr Lys Arg A

Met Thr Lys Arg G

2 0 G Val Ala Asp Gly T

Asp —Gry C '

Val Ala Glu Gly A

Val Ala Glu Gly G

25 * "Stop" eller termineringskodonet afslutter ekspressionen af proteinet.

Med kendskab til deoxyribonukleotidsekvensen for genet eller DNA-sekvensen, der koder for et bestemt protein, er 30 det muligt nøjagtigt at beskrive dette proteins aminosyresekvens. Det modsatte er imidlertid ikke muligt.

Mens der kun er 1 kodon, der koder for metheonin, kan der være op til 6 kodoner, der koder for de andre aminosyrer (fx. serin), således som det fremgår af tabel 1. Der er 35 således en betragtelig flertydighed ved forudsigelse af nukleotidsekvensen ud fra aminosyresekvensen.

Alt i alt vidstes der forud for den foreliggende opfindelse kun lidt om strukturen af faktor VIII:C og til trods for, at der over mange år er udført et betydeligt 40 arbejde, var fagmanden ude af stand til at bestemme • 4 DK 174927 B1 strukturen af faktor VIII:C eller dens gen eller tilvejebringe nogen procedure, ved hvilken faktor VIII:C kunne fremstilles i en i det væsentlige ren form i væsentlige mængder.

5 Den heri beskrevne fremgangsmåde, ved hvilken genet for human faktor VIII:C klones og udtrykkes, indbefatter følgende trin: (1) Rensning af svine-faktor VIII:C, (2) Bestemmelse af aminosyresekvensen i svine-faktor 10 VIII:C, (3) Dannelse af oligo-nukleotidprober og anvendelse af disse prober til at identificere og/eller isolere mindst et fragment af genet, der koder for svine-faktor VIII:C, (4) Anvendelse af svine-faktor VIII:C-genfragmentet til 15 at identificere og isolere humant genetisk materiale, der koder for human faktor VIII:C, (5) Anvendelse af de tidligere beskrevne faktor VIII:C DNA-fragmenter til at bestemme stedet for syntese af faktor VIII:C blandt de forskellige pattedyrsvæv, 20 (6) Fremstilling af cDNA-segmenter, der koder for human faktor VIII:C under anvendelse af budbringer-RNA opnået ud fra vævsidentifikationen under trin (5), (7) Konstruktion af humane cDNA-kloner i fuld længde ud fra de under trin (6) fremstillede cDNA-segmenter, fx. ved 25 ligering sammen af cDNA-segmenter, som overskæres af samme restriktionsenzymer, (8) Dannelse af DNA-ekspressionsvektorer, som er i stand til at dirigere syntesen af faktor VIII:C, (9) Transformering af en passende vært med 30 ekspressionsvektorerne, som bærer hele længden af cDNA for human faktor VIII:C, (10) Ekspression af human faktor VIII:C i værten, og (11) Udvindelse af den udtrykte faktor VIII:C. *

Under dette arbejde er der blevet udviklet en ny teknik 35 til screening af et genomisk DNA-bibliotek under anvendelse af oligonukleotidprober baseret på de i faktor VIII:C-molekylet indeholdte aminosyresekvenser.

Opfindelsen beskriver ovenstående fremgangsmåder samt de forskellige nukleotider, vektorer og andre produkter, som 40 er fremstillet i forbindelse dermed.

5 DK 174927 B1

Den foreliggende opfindelse tager udgangspunkt i en isoleret DNA-sekvens, der koder for human faktor VIII:C med den i figur 7 viste aminosyresekvens, og omfattende et polydeoxy-ribonukleotid med sekvensen: 5'CGC AGC TTT CAG AAG 5 AAA ACA CGA CAC TAT TTT ATT GCT GCA GTG GAG AGG 31. I en foretrukken udførelsesform opnås denne nukleotidsekvens fra human genom-DNA og kan derefter kædes direkte eller indirekte til DNA fra en non-human kilde. DNA-sekvensen kan således indgå i en rekombinant-DNA-sekvens, der koder for et 10 polypeptid, som producerer faktor VIII:C aktivitet.

DNA-sekvensen kan omfatte en eller flere DNA sekvenser udvalgt fra den i figur 7 viste nukleotidsekvens eller en eller flere DNA sekvenser, som hybridiserer til den i figur 7 viste DNA-nukleotidsekvens, og som ved ekspression koder 15 for et polypeptid, der udviser faktor VIII:C aktivitet.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer ligeledes en kloningsvektor eller ekspressionsvektor omfattende DNA-sekvensen beskrevet ovenfor. Sådanne vektorer koder for et antal aminosyregrupper i den i figur 7 viste sekvens, som er 20 tilstrækkelig til at frembringe faktor VIII:C aktivitet. Således^kan non-humane værter, såsom-m'i'kr'o'organ'i'smer-elrl'er andre cellelinier, transformeres med ekspressionsvektoren med frembringelse af faktor VIII:C aktivitet. Egnede værter er bakterier, gær, insekt- eller pattedyrsceller.

25 Yderligere omfatter den foreliggende opfindelse en fremgangsmåde til fremstilling af human faktor VIII:C, ved hvilken man transformerer en vært med den ovenfor beskrevne DNA-sekvens, der koder for et polypeptid, med et antal aminosyregrupper vist i figur 7, som er tilstrækkeligt til 30 at frembringe faktor VIII:C aktivitet og udtrykker polypeptider fra denne sekvens. Fremgangsmåden kan desuden omfatte udvindeisen af human faktor VIII:C fra transformanten.

Figur 1 er en afbildning af aminosyresekvensen (A), som 35 er bestemt for aminoterminalsekvensen i det i eksempel 1 beskrevne thrombin-spaltningsprodukt på 69.000 dalton. Den første rest kunne ikke identificeres. Denne sekvens samménlignes med sekvens (B), som man har sluttet sig til ud fra nukleotidsekvensen for det i eksempel 3 beskrevne svine-40 faktor VIll:C-exon og med den i eksempel 4 beskrevne human 6 DK 174927 B1 faktor VIII:C-exon-sekvens (C).

Figur 2 illustrerer, vist i enkeltbogstavskode, aminosyresekvensen for oksethrombin-nedbrydningsfragmenter af (A), aminoterminalen og (B) et 40 Kd 5 thrombinspaltningsprodukt af det af Fass et al., infra, isolerede 166 Kd svine-faktor VIII:C-fragment.

Figur 3 illustrerer udformningen af en oligo-nukleotidprobe til identifikation og isolering af mindst en del af svine-genet, der koder for faktor VIII:C.

10 Figur 4 illustrerer DNA-sekvensen for et Sma I DNA- fragment (34-S1), der indeholder et svine-faktor VIII:C-exon hidrørende fra bakteriofag PB34 som beskrevet i eksempel 3.

Figur 5 er en afbildning af den DNA-sekvens i Hae III indskud 34-H1, der bærer exonet for svine-faktor VIII:C som 15 beskrevet i eksempel 3. Denne sekvens indgår i den længere sekvens, der vises i figur 4 og svarer til nukleotiderne 250-615 i sekvensen i figur 4.

Figur 6 er en afbildning af DNA-sekvensen sammen med den udledte aminosyresekvens for nukleotid 34-84 for en del 20 af Sau 3AI indskuddet i klon 25-S1, der viser en del af exonet for human faktor VIII:C som beskrevet i eksempel 4.

Figur 7 illustrerer den DNA-nukleotidsekvens (kun vist i én streng), som indeholder hele den sekvens, der koder for human faktor VIII:C sammen med den udledte aminosyresekvens 25 for human faktor VIII:C.

De følgende definitioner gives for at lette forståelsen af den foreliggende sag. I det omfang, definitionerne afviger fra betydninger benyttet inden for området, hersker nedenstående definitioner.

30 Forstærkning betyder den proces, ved hvilken celler producerer gen-gentagelser inden for deres kromosomale DNA.

Cotransformation betyder den proces, hvor en celle transformeres med mere end ét exogent gen, som er fremmed for cellen, hvoraf det ene tildeler cellen en udvælgelig 35 phenotype.

Nedenstrøms betyder retningen, der går mod 31-enden af en nukleotidsekvens.

En forstærker er en nukleotidsekvens, som kan forstærke transkriptionen af gener uafhængigt af genets identitet, 40 sekvensens position i forhold til genet eller sekvensens 7 DK 174927 B1 orientering.

Et gen er en deoxyribonukleotidsekvens, der koder for et givet, fuldt udviklet protein. For de foreliggende formål skal et gen ikke indbefatte utranslaterede sideområder såsom 5 RNA-transkriptionsinitieringssignaler, polyadenyleringsadditionssteder, promotore eller forstærkere.

Et udvælgelsesgen er et gen, som tildeler celler en phenotype, der udtrykker genet som et påviseligt protein.

10 Et udvælgelsesmiddel er en tilstand eller et materiale, som gør det muligt at påvise ekspressionen af et udvælgelsesgen.

Phenotype betyder de observerbare egenskaber ved en celle udtrykt ved den cellulære genotype.

15 Genotype betyder den genetiske information, som er indeholdt i en celle i modsætning til dens ekspression, der iagttages som phenotypen.

Ligering er den proces, hvor der dannes en phosphodiesterbinding mellem 5'- og 3'-enderne af to DNA-20 strenge. Dette kan opnås ved hjælp af adskillige velkendte enzymatiske teknikker,“herunder stumpendeligering med T4^ ---- ligase.

Orientering henfører til rækkefølgen af nukleotider i en DNA-sekvens. En omvendt orientering af en DNA-sekvens er 25 en orientering, hvor sekvensens 5'- til 31-rækkefølge i forhold til en anden sekvens er modsat sammenlignet med et referencepunkt i den DNA, hvorfra sekvensen blev opnået.

Sådanne referencepunkter kan indbefatte transkriptionsanvisningen for andre specificerede DNA-30 sekvenser i den som kilde anvendte DNA eller replikationsområdet for replicerbare vektorer, der indeholder sekvensen.

Transkription betyder syntese af RNA ud fra et DNA-templat.

35 Transformation betyder ændring af en celles genotype ved cellulær optagelse af exogen DNA. Transformation kan i nogle tilfælde påvises ved en ændring i cellephenotype.

Transformerede celler kaldes transformanter.

Prætransformationsceller omtales som parentalceller.

40 Translation betyder syntese af et polypeptid fra 8 DK 174927 B1 budbringer-RNA (mRNA).

Den foreliggende opfindelse gør det muligt for første gang at identificere og isolere svinefaktor VIII:C gen ved rekombinant DNA-teknik. Den gør det også muligt for første 5 gang at isolere og identificere det gen, der indkoder human faktor VIII:C ved rekombinant DNA-teknik ved at drage fordel af homologien mellem svine-faktor VIII:C-DNA og human faktor VIII:C-DNA for at lokalisere og isolere det humane gen for faktor VIII:C. Denne vej til cDNA-kloner til fremstilling af 10 faktor VIII:C via homologi med svine-faktor VIII:C-genet gør det muligt at undgå det trivielle, tidskrævende og bekostelige behov for at rense human faktor VIII:C, som er særdeles bekosteligt og praktisk taget umuligt at få fat i.

Svine-faktor VIII:C renses først kraftigt, fortrinsvis 15 ved en monoklonalt antistof-rensningsteknik som den, der er beskrevet af David Fass et al., "Monoclonal antibodies to Porcine AHF Coagulant and Their Use in the Isolation of Active Coagulent Protein", Blood 59: 594-600 (1982) og Knutsen et al., "Porcine Factor VIII:C prepared by affinity 20 Interaction with Von Willebrand Factor and Heterologous Antibodies", Blood, 59: 615-24 (1982), idet indholdet af begge disse litteratursteder inkorporeres heri ved henvisning. Svinefaktor VIII:C polypeptider bindes til anti-VIII:C monoklonale antistoffer, som immobiliseres på en 25 passende affinitetskromatografisøjle. To højmolekylære polypeptider med molekylstørrelser på ca. 166 og 130 Kd elueres med ethylendiamintetraeddikesyre. Derefter elueredes et andet proteinsegment med en molekylvægt på ca. 76 Kd fra søjlen under anvendelse af ca. 50% ethylenglycol. De 30 partielle aminosyresekvenser af disse polypeptider og/eller af fragmenter af disse polypeptider, som er opnået på kendt måde, fx. ved enzymatisk nedbrydning af proteinerne under anvendelse af oksethrombin eller andre passende midler til opdeling af proteinerne, bestemmes derefter ved hjælp af 35 kendte analysemetoder. Baseret på disse materialers aminosyresekvens syntetiseres der oligonukleotidprober, hvoraf i det mindste nogle vil hybridisere med DNA-segmenter, der koder for det tilsvarende segment af faktor VIII:C. Disse oligonukleotider anvendes derefter til 40 screening for segmenter af genet, der koder for svine-faktor 9 DK 174927 B1 VIII:C.

Når først der er opnået en del af svinegenet for faktor VIII:C, anvendes dette rekombinantmateriale til at screene et humant genomt DNA-bibliotek for at lokalisere og isolere 5 det gen, der koder for human faktor VIII:C. Ved denne procedure fastslås det, at der er væsentlige ligheder mellem human faktor VIII:C og svine-faktor VIII:C og der drages fordel af disse ligheder til at isolere og identificere human faktor VIII:C-genet eller -gensegmenterne.

10 Lighederne mellem svineproteiner og humane proteiner kan tilskrives de tilsvarende ligheder i de DNA-sekvenser, som koder for aminosyresekvenserne. De genetiske materialer, der koder for faktor VIII:C-proteiner i mennesker og svin, er identiske ved en stor procentdel af positionerne og 15 udviser således hybridisering, når de fx. underkastes proceduren ifølge Benton og Davis, "Screening gt Recombinant Clones by Hybridization to Single Plaques In Situ", Science, 196:180 (1977), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning.

20 De klonede segmenter af genet for human faktor VIII:C

anvendes derefter til at identificere en kilde-for faktor VIII:C-mRNA fra forskelligt humant væv. I lighed hermed anvendes et eller flere af de klonede segmenter for svine-faktor VIII:C til at screene potentielle vævskilder for 25 svine-mRNA. Dette trin udføres ved hjælp af konventionelle procedurer, der indbefatter RNA-ekstraktion, gel-elektroforese, overførsel til nitrocelluloselag og hybridisering til radiomærket, klonet DNA, fx. som beskrevet i Maniatis, et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 30 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Når først denne vævskilde er identificeret, fremstilles der cDNA-biblioteker (i enten plasmid eller fortrinsvis bakteriofag lambda vektorer, der begge er almindeligt tilgængelige) og de screenes for faktor VIII:C-cDNA-kloner som beskrevet 35 nedenfor. cDNA-biblioteks-screeningsprocessen gentages indtil der er opnået et sæt cDNA-kloner, som ved DNA-sekvensbestemmelse vises at omfatte hele den DNA-gensekvens, som indkoder faktor VIII:C.

Når først human eller svine-faktor VIII:C-cDNA-klonen 40 er opnået i fuld længde, anvendes kendte og passende midler 10 DK 174927 B1 til at udtrykke faktor VIII:C-proteinet, fx. indføring i en passende vektor og transfektion til en passende vært, udvælgelse af transformerede celler (transformanter) og dyrkning af disse transformanter for at udtrykke faktor 5 VIII:C-aktivitet.

Vært-vektorsystemer til ekspressionen af faktor VIII:C kan være prokaryotiske, men kompleksiteten af faktor VIII:C bevirker, at det foretrukne ekspressionssystem er eukaryotisk, fortrinsvis (i det mindste for biologisk aktiv 10 faktor VIII:C med koagulationsaktivitet) et pattedyrssystem. Dette fås let ved eukaryotisk (sædvanligvis pattedyrs- eller hvirveldyrsceller) transformation med en passende faktor VIII:C-vektor. Eukaryotisk transformation er i almindelighed en velkendt proces og kan udføres ved hjælp af forskellige 15 standardmetoder. Disse indbefatter anvendelse af protoplastfusion, DNA-mikroinjektion, kromosomtransfektion, lytiske og ikke-lytiske virusvektorer (fx. Mulligan et al., "Nature" (London) 277:108-114 (1979), celle-celle fusion (Fournier et al., "Proc. Nat. Acad. Sci.", 74:319-323 20 (1977), lipidstrukturer (US-patentskrift nr. 4.394.448) og cellulær endocytosis af DNA-præcipitater (Bachetti et al., "Proc. Nat. Acad. Sci. 74:1590-1594 (1977). Andre eukaryotiske celler såsom gær eller insektceller kan også anvendes med fordel.

25 Transformation, som bringes i stand med lytiske virusvektorer, er effektiv, men ufordelagtig af en række årsager: Den maksimale størrelse af transficeret DNA begrænses af viruscapsidpakningens geometri, de exogene gener udelades hyppigt under virusreplikation, der er et 30 behov for hjælpevirus eller specialiserede værter, værtsceller må være tolerante og værterne dræbes under virusinfektionen.

Ikke-lytiske transformationer baseres på transkriptionen og translationen af virusvektorer, som er 35 blevet inkorporeret i en cellelinie som et stabilt episom.

Disse systemer kræver i almindelighed unikke cellelinier og lider af en række ulemper. Se "Trends i Biochemical Sciences", juni 1983, pp. 209-212.

På den anden side har andre transformationsmetoder, 40 hvor.extrakromatomal DNA optages i kromosomerne i 11 DK 174927 B1 værtsceller, været karakteriseret ved lave transformationshyppigheder og dårlige ekspressionsniveauer.

Disse indledende vanskeligheder er blevet afhjulpet ved transformation med gener, der som en iboende egenskab giver 5 udvælgelige phenotyper på den lille subpopulation af celler, som faktisk transformeres (udvælgelsesgener). Hele populationen af transformerede celler kan dyrkes under betingelser, der favoriserer celler, som har erhvervet phenotypen, hvilket gør det muligt bekvemt at lokalisere 10 transformerede celler. Derefter kan transformanterne screenes for deres evne til at udtrykke phenotypen mere intenst. Dette udføres ved at ændre et udvælgelsesmiddel på en sådan måde, at der påvises højere ekspression.

Udvælgelsesgener opdeles i tre kategorier: Påviseligt 15 forstærkede udvælgelsesgener, dominerende udvælgelsesgener og påviseligt forstærkede dominerende udvælgelsesgener.

Påviseligt forstærkede udvælgelsesgener er gener, hvori forstærkningen kan påvises ved at eksponere værtsceller for ændringer i udvælgelsesmidlet. Påviseligt forstærkede gener, 20 som ikke virker dominerende, kræver i almindelighed en parental cellelinie, som er genotyp'islc mangelfuld, i udvælgelsesgenet. Blandt eksempler er generne for hydroxymetholglutanyl CoA reduktase (Sinensky, "Biochem.

Biophys. Res. Commun.", 78: 863 (1977), 25 ribonukleotidreduktase (Meuth et al., "Cell:3:367 (1943), asparaginattranscarbamylase (Kemp et al., "Cell", 9:541 (1976), adenylatdeaminase (DeBatisse et al., "Mol and Cell Biol.", 2(11): 1346-1353 (1982), musedihydrofolatreduktase (DHFR) og, med en mangelfuld promoter, musethymidinkinase 3 0 (TK) .

Dominerende udvælgelsesgener er sådanne, som udtrykkes i transformanter uanset parentalcellens genotype. De fleste dominerende udvælgelsesgener er ikke påviseligt forstærkede, fordi phenotypen er så effektiv til at behandle 35 udvælgelsesmidlet, at det er vanskeligt at skelne mellem cellelinier, som har forstærket genet, og cellelinier, som ikke har. Eksempler på dominerende udvælgelsesgener af denne type er generne for prokaryotiske enzymer såsom xanthin-guanin-phosphoribosyltransferase (Mulligan et al., "Proc.

40 Nat. Acad. Sci.", 78(4):2072-2076 (1981)) og aminoglycosid- 12 DK 174927 B1 3'-phosphotransferase (Colbere-Garapin et al·, "J. Mol.

Biol.", 150:1-14 (1981)).

Nogle dominerende udvælgelsesgener forstærkes også påviseligt. Blandt passende eksempler er det af Haber et 5 al,, "Somatic Cell Genet", 4:499-508 (1982) beskrevne mutant DHFR-gen, celleoverflademarkører såsom HLA-antigener og gener, der koder for enzymer såsom specifikke esteraser, der fremstiller fluorescente eller farvede produkter ud fra fluorogene eller kromogene substrater på kendt måde.

10 Påviseligt forstærkede, dominerende udvælgelsesgener foretrækkes til anvendelse i den foreliggende sammenhæng.

Det må forstås, at et dominant udvælgelsesgen i nogle tilfælde kan omdannes til et påviseligt forstærket gen ved passende mutationer i genet, 15 I starten var udvælgelsesgener af begrænset kommerciel nytte. Selvom de gjorde det muligt at udvælge transformanter med tendens til at forstærke optaget DNA, gav de fleste udvælgelsesgener produkter uden kommerciel værdi. På den anden side gav gener for produkter, som var kommercielt 20 værdifulde, i almindelighed ikke deres transformanter let udvælgelige (eller blot påviselige) phenotyper. Dette vil fx. være tilfælde med enzymer eller hormoner, som ikke giver transformerede celler med enestående evne til næringsstofmetabolisering eller afgiftning. De fleste 25 proteiner af kommerciel interesse ligger i denne gruppe, fx. hormoner, proteiner, der deltager i blodkoagulation, og fibrinolytiske enzymer.

Senere viste det sig, at eukaryotiske celler med tilbøjelighed til at blive transformeret med og forstærke 30 udvælgelsesgenet, ville gøre det samme i forbindelse med produktgenet. Ved at følge udvælgelsesgenet kunne man identificere en subpopulation af transformantceller, som coudtrykker og coforstærker produktgenet, sammen med udvælgelsesgenet. Det har været praksis at dyrke 35 transformanterne i nærvær af udvælgelsesgenet og at konkludere, at transformanter med øget ekspression af udvælgelsesgenet også vil vise øget ekspression af produktgenet. Dette er ikke altid tilfældet, således som det vil blive forklaret nærmere nedenfor. Axel et al. (US-40 patentskrift nr. 4.399.216) anvender udtrykket cotrans- DK 174927 B1 13 formation til at beskrive den proces, hvor en celle transformeres med mere end ét andet gen uanset, om det er ved hjælp af vektorsysterner, der indeholder covalent bundne eller ubundne gener og i sidstnævnte tilfælde uanset om 5 generne indføres sekventielt eller samtidigt i værtscellerne. Cotransformation skulle "allow the introduction and stable integration of virtually any defined gene into cultured cells" (Wigler et al., "Cell", 16:777-785, (1975)) og "by use of the cotransformation process it 10 is possible to produce eucaryotic cells which synthesize desired proteinaceous and other materials" (US-patentskrift nr. 4.399.216, spalte 3, linie 37-42).

Transformationsvektorer 15 Vektorer, der anvendes ved faktor VIII:C- cotransformation, vil indeholde et udvælgelsesgen og faktor VIII:C-genet. Desuden vil der sædvanligvis i transformations- eller cotransformationsvektorerne forefindes andre elementer såsom forstærkere, promotere, introner, 20 accesorisk DNA, polyadenyleringssteder og 3'-ikke- ----- - - — -kodningsområder-som—beskrevet—nedenfor·;----------------

Passende udvælgelsesgener beskrives ovenfor. Det foretrækkes, at udvælgelsesgenet er et sådant, som forebygger cellevækst i fravær af udvælgelsesgenet. På denne 25 måde vil revertantceller, som ved dyrkning i stor målestok mister udvælgelsesgenet (og formodentlig også faktor VIII:C-genet), ikke overgro fermenteringen. Det vil imidlertid være ønskeligt ved kommerciel fremstilling af faktor VIII:C at undgå brugen af celletoxiner for derved at lette 30 produktrensningstrinnene. Et ønskeligt udvælgelsesgen vil således være et sådant, som gør det muligt for transformanter at anvende et næringsstof, der er kritisk for væksten, og som de ellers ikke vil være i stand til at anvende. Det ovenfor beskrevne TK-gen er et eksempel.

35 To kategorier vektorer er blevet anvendt til cotransformation. Den første kategori er de ukædede vektorer. Her er udvælgelsesgenet og faktor VIII:C-genet ikke bundet covalent. Denne vektorkategori foretrækkes, fordi trinnet til ligering eller sammenbinding af de to 40 gener på anden måde ikke kræves. Dette letter 14 DK 174927 B1 transformationsprocessen, fordi udvælgelses- og produktgenerne sædvanligvis fås fra separate kilder og ikke ligeres i deres "vilde" miljø. Desuden kan mol-forholdet mellem faktor VIII:C og udvælgelsesgenerne, der anvendes 5 under cotransformationen, indstilles for at øge cotransformationseffektiviteten.

Den anden kategori cotransformationsvektorer er kædede vektorer. Disse vektorer adskiller sig fra ukædede vektorer ved, at udvælgelses- og faktor VIII:C-generne bindes 10 covalent, fortrinsvis ved ligering.

Vektorerne her kan også indbefatte forstærkere.

Forstærkere adskiller sig funktionelt fra promotere, men viser sig at fungere i samråd med promotere. Deres funktion på celleniveauet forstås ikke særlig godt, men deres 15 særkende er evnen til at aktivere eller forstærke transkription uden at være positions- eller orienteringsafhængige. Promotere skal være ovenstrøms for genet, mens forstærkere kan forefindes ovenstrøms eller 5' for promotoren, i genet som en intron eller nedenstrøms for 20 genet mellem genet og et polyadenyleringssted eller 3' for polyadenyleringsstedet. Omvendte promotere er ikke funktionelle, men omvendte forstærkere er. Forstærkere er cis-virkende, dvs. at de kun har en virkning på promotere, hvis de forefindes på samme DNA-streng. For en generel 25 omtale af forstærkere henvises til Khoury et al,, "Cell", 33:313-314 (1983).

Foretrukne forstærkere fås fra dyrevira såsom simian virus 40, polyoma virus, kvæg-papilloma virus, retrovirus eller adenovirus. Virusforstærkere kan fås umiddelbart fra 30 offentligt tilgængelige vira. Forstærkerområderne for adskillige vira, fx. Rous sarcoma virus og simian virus 40 er velkendte. Se Luciw et al., "Cell" 33:705-716 (1983). Det vil være en rutinemæssig kemisk opgave at udskære disse områder på basis af publicerede restriktionskort for det 35 pågældende virus og om nødvendigt modificere stederne for at muliggøre splejsning af forstærkeren til vektoren efter ønske. Se fx. Kaufman et al., "J. Mol. Biol.", 159:601-621 (1982) og "Mol. Cell Biol." 2(11):1304-1319 (1982), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning. Som alternativ kan 40 forstærkeren syntetiseres ud fra sekvensdata, idet 15 DK 174927 B1 størrelsen af virusforstærkere (i almindelighed mindre end ca. 150 bp) er tilstrækkelig lille til at dette vil være praktisk gennemførligt.

Et andet element, som bør være til stede i 5 vektorarrangementet, er et polyadenyleringssplejsnings-(eller additions-) sted. Dette er en DNA-sekvens, som befinder sig nedenstrøms for de translaterede områder af et gen, kort nedenstrøms for hvilket der så tilføjes transkriptionsstop og adeninribonukleotider til dannelse af 10 en polyadeninnukleotidhale ved 31-enden af budbringer-RNA'en. Polyadenylering er vigtig af hensyn til stabilisering af budbringer-RNA'en mod nedbrydning i cellen, en begivenhed, der reducerer indholdet af budbringer-RNA og dermed indholdet af produktprotein.

15 Eukaryotiske polyadenyleringssteder er velkendte. En sekvens forekommer almindeligt i eukaryotiske gener:

Hexanukleotidet 5'-AAUAAA-3' findes 11-30 nukleotider fra det punkt, hvor polyadenylering indledes. DNA-sekvenser, der indeholder polyadenyleringssteder, kan fås fra vira iht.

20 publicerede rapporter. Eksempelvise -p-Qχy^d^y leringssekvenser kan fas“fra muse-beta-glbbuTih-og ~ simian virus 40 sent eller tidligt områdegener, men viruspolyadenyleringssteder foretrækkes. Da disse sekvenser er kendte, kan de syntetiseres in vitro og ligeres til 25 vektorerne på konventionel måde.

Et polyadenyleringsområde skal befinde sig nedenstrøms for enten faktor VIII:C- og/eller udvælgelsesgenet, men kan være ligeret til ethvert af generne. Det kan være ligeret kun til udvælgelsesgenet og ikke til produktgenet og dette 30 vil være tilfældet uanset om vektorerne er kædede eller ukædede. Den sekvens, som adskiller polyadenyleringsstedet fra translationsstopkodonet, er fortrinsvis et utranslateret DNA-oligonukleotid såsom et ikke-promotet eukaryotisk gen.

Da sådanne oligonukleotider og gener ikke er udstyret med en 35 promoter, vil de ikke blive udtrykt. Oligonukleotidet bør strække sig over en betragtelig afstand af størrelsesordenen op til ca. 1.000 baser fra stopkodonet til polyadenyleringsstedet. Dette 3' utranslaterede oligonukleotid resulterer i almindelighed i en forøgelse af 40 produktudbyttet. Vektoren kan slutte fra ca. 10 til ca. 30 16 DK 174927 B1 bp nedenstrøms for den almindelige sekvens, men det er at foretrække at bibeholde de 3-sekvenser, der findes nedenstrøms for polyadenyleringsstedet i dettes "vilde" miljø. Disse sekvenser forløber typisk ca. fra 200-600 5 basepar nedenstrøms for polyadenyleringsstedet.

De heri beskrevne vektorer kan syntetiseres ved hjælp af teknikker, der er velkendte for fagmanden. Komponenterne i vektorerne såsom udvælgelsesgener, forstærkere, promotere o.l. kan fås fra naturlige kilder eller syntetiseres som 10 ovenfor beskrevet. Grundlæggende kan der, hvis komponenterne findes i DNA, der er tilgængeligt i stor mængde, fx. komponenter såsom virusfunktioner, eller hvis de kan syntetiseres, fx. polyadenyleringssteder, ved passende brug af restriktionsenzymer, opnås store mængder vektor ved 15 simpelthen at dyrke den som kilde anvendte organisme, nedbryde dens DNA med en passende endonuklease, fraskille DNA-fragmenterne, identificere den DNA, der indeholder det interessante element, og udvinde samme. Almindeligvis vil en transformationsvektor blive konstrueret i lille mængde og 20 derefter ligeret til en passende autonomt replikerende syntesevektor såsom et prokaryotisk plasmid eller fag. pBR322-plasmidet kan anvendes i de fleste tilfælde. Se Kaufman et al., op. cit.

Syntesevektorerne anvendes til kloning af de ligerede 25 transformationsvektorer på konventionel måde, fx. ved transfektion af en tolerant prokaryotisk organisme, replikation af syntesevektoren til højt kopiantal og udvinding af syntesevektoren ved cellelyse og adskillelse af syntesevektoren fra cellerester.

30 Den resulterende syntesevektorhøst kan transficeres direkte i eukaryotiske celler eller transformationsvektoren kan bjerges fra syntesevektoren ved passende endonukleasenedbrydning, adskillelse ved hjælp af molekylvægt og udvinding af transformationsvektoren. Det er 35 ikke nødvendigt at bjerge transformationvektoren så længe resten af syntesevektoren ikke ugunstigt påvirker eukaryotisk genforstærkning, transkription eller translation. Fx. er den her foretrukne syntesevektor en mutant af E. coli plasmidet pBR322, hvori sekvenser, som er 40 skadelige for eukaryotiske celler, er udeladt. Se Kaufman et 17 DK 174927 B1 al., op. cit. Anvendelse af denne mutant forebygger ethvert behov for at udelade plasmidresten før cotransformation.

Cotransformation, udvælgelse og påvisning af forstærkning 5 Cellerne, som skal transformeres, kan være en hvilken som helst eukaryotisk celle, herunder gærprotoplaster, men er sædvanligvis en ikke-svampecelle. Primære eksplantater (inkl. forholdsvis udifferentierede celler såsom stængelceller) og udødelige og/eller transformerede celle-10 linier er egnede. Celleemner behøver ikke genotypisk at mangle udvælgelsesgenet, sålænge udvælgelsesgenet er dominant virkende.

Cellerne vil fortrinsvis være stabile pattedyrscellelinier som ovenfor omtalt. Cellelinier, som 15 vides stabilt at integrere udvælgelsesgener i deres kromosomal-DNA, er bedst, fx. kinesisk hamster ovarie- (CHO) cellelinier. Også HeLa, COS-abeceller, melanoma-cellelinier såsom Bowes cellelinie, muse-L-celler, muse-fibroblaster og muse-NIH-3T3-celler kan anvendes.

20 Cotransformation med ukædede vektorer kan gennemføres rækkevis (se US-patentskrif t nr. 4.399.2T6T: Fremgangsmåder--------- til at lette cellulær optagelse af DNA beskrives ovenfor. Mikroinjektion af vektoren i cellekernen vil give de højeste transformationseffektiviteter, men eksponering af parentale 25 celler for DNA i form af et calciumphosphatpræcipitat er mest bekvem. Der fås betragteligt bedre cotransformationeffektiviteter ved cotransformation med et molært overskud af produkt i forhold til udvælgelsesgen af størrelsesordenen 100:1.

30 Populationen af celler, som har været eksponeret for transformationsbetingelser, viderebehandles derefter for at identificere transformanterne. Kun en lille subpopulation af en vilkårlig kultur, som er blevet behandlet til cotransformation, vil udvise udvælgelsesgenets phenotype.

35 Cellerne i kulturen screenes for phenotypen. Dette kan gennemføres ved at analysere cellerne individuelt med en cellesorteringsindretning, når phenotypen er af en sådan art, at den vil frembringe et signal, fx. fluorescens, ved spaltning af et fluorogent substrat med et enzym fremstillet 40 af udvælgelsesgenet. Fortrinsvis gør phenotypen det 18 DK 174927 B1 imidlertid kun muligt for transformanter at gro eller overleve i specialiserede vækstmedier som omtalt nærmere ovenfor.

Udvælgelsestransformanter vil derefter blive screenet 5 for ligering af produktgenet i deres kromosomer eller for ekspression af celleproduktet. Førstnævnte kan gennemføres ved anvendelse af Southern blot-analyse, sidstnævnte ved immunologiske eller enzymatiske standardanalyser.

Når først transformanterne er blevet identificeret 10 tages der skridt til at forstærke ekspression af produktgenet ved yderligere kloning i nærvær af et udvælgelsesmiddel såsom MTX. Se US-patentskrift nr.

4.399.216.

Cotransformanter, der kan fremstilles i 15 overensstemmelse med de heri beskrevne fremgangsmåder, er egnede til in vivo transfektion af højere organismer iht. kendte teknikker. Primære explantater eller stabile cellelinier fra et potentielt værtsdyr cotransformeres og inokuleres i værten eller en i det væsentlige på anden måde 20 syngenisk vært, som er genotypisk mangelfuld med hensyn til produktproteinet.

En øget forståelse af opfindelsen vil kunne fås ved hjælp af de følgende illustrerende udførelsesformer, der udelukkende tjener som eksempler og ikke skal anses som 25 begrænsende for det virkelige omfang af opfindelsen som beskrevet i kravene.

Med mindre andet er anført anvendes restriktionsendonukleaser under de betingelser og på den måde, der anbefales af de kommercielle leverandører.

30 Ligeringsreaktioner udføres som beskrevet af Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Laboratory 1982) på s. 245-6, hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning, under anvendelse af den på side 246 deri beskrevne puffer og en DNA-koncentration på 1-35 100 /ig/ml ved en temperatur på 23°C til stump-endet DNA og 16°C til DNA med komplementære ender. "Phosphatasering" henviser i den foreliggende sammenhæng til dephosphorylering af DNA og udføres på den af Maniatis et al., supra, fx. på side 133 et seq. beskrevne måde. "Kinasering" henviser til 40 phosphorylering af DNA. Elektroforese udføres i 0,1 til 1,5% 19 DK 174927 B1 agarosegeler indeholdende 90 mM Tris-borat, 10 rnM EDTA.

"Nick-translatering" henviser til metoden til mærkning af 32 DNA med P som beskrevet af Rigby et al., J. Mol. Biol., 113:237 (1977). Alt radiomærket DNA mærkes med 32P uanset 5 den anvendte mærkningsteknik.

Ved "hurtig-præp" menes en hurtig fremstilling i lille målestok af bakteriofag eller plasmid-DNA, fx. som beskrevet af Maniatis et al., supra, på s. 365-373.

Human faktor VIII:C kan formuleres til et farmaceutisk 10 præparat til parenteral administration i overensstemmelse med velkendte procedurer.

Det farmaceutiske præparat til human brug omfatter steriliseret faktor VIII:C udvundet fra transformerede celler. Udover faktor VIII:C-polypeptidet eller en 15 tilstrækkelig del deraf, som frembringer faktor VIII:C-aktivitet, kan der inkluderes én eller flere acceptable bærere derfor og eventuelt andre terapeutiske ingredienser.

Bæreren eller bærerne skal være "acceptable" i den forstand, at de er kompatible med andre ingredienser i præparater og 20 ikke skadelige for modtageren af dette. Præparatet kan 5^νβΙΤΙ£ præSenteres T. enhedsdosisform og^k^n~fremsti_rxes_ve'd - en hvilken som helst af de velkendte metoder inden for farmacien.

Det farmaceutiske præparat, som er egnet til parenteral 25 administrering, kan bekvemt omfatte et sterilt lyofiliseret præparat af faktor VIII:C-polypeptidet, som kan rekonstitueres ved tilsætning af en steriliseret opløsning til frembringelse af opløsninger, som fortrinsvis er isotoniske med modtagerens blod. Præparatet kan præsenteres 30 i enheds- eller multidosisbeholdere, fx forseglede ampuller eller hætteglas.

Det må forstås, at udover den sterile faktor VIII:C eller en opløsning deraf kan det farmaceutiske præparat indeholde én eller flere yderligere ingredienser såsom 35 fortyndingsmidler, puffere, bindemidler, overfladeaktive midler, fortykningsmidler, smøremidler, konserveringsmidler (herunder antioxidanter) o.l. Gelatine, laktose, stivelse, magnesiumstearat, mikroniseret silicagel, kakaosmør, talkum, vegetabilske og animalske fedtstoffer og olier, vegetabilsk 40 gummi og polyalkylenglycol og andre kendte bærere for 20 DK 174927 B1 lægemidler er også egnede til fremstilling af de farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen. Blandt præparater til parenteral brug er en ampul af en steril opløsning eller suspension med vand eller en anden 5 farmaceutisk acceptabel væske som bærer derfor eller en ampul af steril fast faktor VIII:C til fortynding med en farmaceutisk acceptabel væske.

Det farmaceutiske præparat er værdifuldt til behandling af hæmofilia A. Disse præparater tilvejebringer også et 10 vigtigt værktøj ved såvel in vivo som in vitro undersøgelse af de processer, der er involveret i blodkoagulation og ved undersøgelsen af faktor VIII:C-molekylets immunologiske og biologiske egenskaber.

15 Eksempel 1

Proteinsekvensanalvse

Svinefaktor VIII:C rensedes af Dr. David Fass iht. publicerede procedurer, Knutsen og Fass (1982); Fass et al., (1982), supra. Aminosyresekvensanalyse udføres på et 20 oksethrombin-nedbrydningsprodukt af 76.000 dalton proteinet som nedenfor beskrevet.

Svine-faktor VIII:C-polypeptider bundet til anti-VIII:C monoklonalt anti stof søjlen kan elueres successivt i to trin (Fass et al., 1982). De to typer med højere 25 molekylvægt, 166.000 og 130.000 dalton, kan elueres med EDTA. Det resterende polypeptid med en molekylvægt på ca.

36.000 dalton kan derefter elueres med 50% ethylenglycol.

76.000 dalton proteinet nedbrydes med thrombin efter ekstensiv dialyse i 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M NaCl.

30 Oksethrombinnedbrydninger udføres ved stuetemperatur i 60 minutter under anvendelse af 1 enhed/ml oksethrombin efterfulgt af tilsætning af yderligere 1 enhed/ml thrombin og inkubation i yderligere 60 minutter.

Thrombinnedbrydningerne afsluttes ved opvarmning til 90°C i 35 0,01 SDS i 10 minutter. Hovedthrombin-nedbrydningsproduktet af 76.000 dalton proteinet er et polypeptid, 69.000 dalton (69 Kd).

Mindre end 1 /ig af den ovenfor beskrevne 69 Kd polypeptidtype ioderes for at tjene som radioaktiv markør 40 efter SDS-gel elektroforese iht. proceduren ifølge U.K.

21 DK 174927 B1

Laemmli, Nature, 227:680 (1970), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning. Polypeptidet sættes opløst i TAS-puffer (50 mM Tris-acetat (pH 7,8), 0,1% SDS) til 100 Mg af samme puffer indeholdende 5 mCi bærerfrit iod-125. 50 μΐ 2,5 mg/ml 5 chloramin T (Baker) i TAS-puffer tilsættes og opløsningen omrøres i 1 minut. Reaktionerne afbrydes ved tilsætning af 50 μΐ 2,5 mg/ml natriummetabisulfat i TAS-puffer efterfulgt af 1 minuts omrøring. Mærket protein adskilles fra uin-125 korporeret I ved kromatografi under anvendelse af en 10 "Sephadex G-25 M" søjle med lille volumen ("PD-10",

Pharmacia). Søjlen ligevægtsindstilles på forhånd med flere søjlevolumener TAS-puffer indeholdende 2,5 mg/ml natriumiodid. Det tomme volumen opsamles og proteinintegritet analyseres ved SDS-gel elektroforese iht.

15 procedurerne ifølge Laemmli, (1970), supra.

Det radioaktivt mærkede 69 Kd protein sættes til den umærkede modpart for efterfølgende overvågning. Derefter koncentreres proteinet individuelt elektroforetisk. Proteinopløsningerne indstilles til 0,1% SDS, 10 mM 20 dithiothreitol og "Coomassie brilliant blue" (Serva) tilsættes for at gøre opløsningen meget svagt J5TåT “

Opløsningerne dialyseres derefter kortvarigt (1-2 timer) i TAS-puffer under anvendelse af "Spectrapore" dialyserør (fremstillet af Spectrum Medical Industries, 25 Inc., med molekylvægtsafskæring ved ca. 14.000). De dialyserede proteinprøver anbringes derefter i et elektroforetisk koncentreringsanlæg af den af Hunkapiller, et al.,

Meth. Enzymol., Enzyme Structures, del I, 91:227 (1983) foreslåede udformning og koncentreres elektroforetisk i 30 TAS-puffer ved 50 volt i 24 timer.

Det ved ovenstående procedure koncentrerede 69 Kd faktor VIII:C-polypeptid underkastes elektroforese gennem en SDS-polyacrylamidgel iht. Laemmli, supra. Det rensede protein, identificeret ved autoradiografi af det radioaktivt 35 mærkede sporpolypeptid udskæres fra gelen og elektroelueres og koncentreres som beskrevet af Hunkapiller et al., supra.

Den koncentrerede prøve er egnet til direkte aminosyresekvensanalyse under anvendelse af gasfasesekvenatoren som beskrevet i Hewick et al., J. biol.

40 Chem. 256:7990 (1981).

22 DK 174927 B1

Aminoterrainalsekvensen, der udgår fra 2-42 resten af 69.000 dalton thrombinspaltningsproduktet, er afbildet i figur 1. Den første rest "X" kunne ikke identificeres. Aminosyresekvenserne for (A) aminoterminalen og (B) et 40 kd 5 oksethrombin-nedbrydriingsprodukt fra det af Fass et al., supra, bemærkede 166 kd faktor VIII ·.C-fragment vises i figur 2. Aminosyresekvensen for aminoterminalen af 76 Kd polypeptidet er: X-Ile Ser Leu Pro Thr Phe Gin Pro Glu Glu Asp Lys Met Asp Tyr Asp Asp Ile Phe.

10

Eksempel 2

Kemisk syntese af oliqonukleotidprober til et svine-faktor VIII:C-aen (a) Pentapeptidprobeforråd 15 Den delvise aminosyresekvens af et fragment af svine- faktor VIII:C, som er blevet bestemt, gør det muligt at udforme og syntetisere svine-faktor VIII:C- oligonukleotidprober. Ud fra den genetiske kode (tabel 1) er det muligt at forudsige den gensekvens, der koder for denne 20 aminosyresekvens. Da den genetiske kode er degenereret, er der mere end én mulig DNA-kodningssekvens for hver aminosyresekvens. Der tilvejebringes følgelig en mængde eller forråd af komplementære oligonukleotidprobesekvenser for et område af faktor VIII:C-molekylet, som kun kræver et 25 rimeligt antal oligonukleotider for at sikre den korrekte DNA-sekvens. Sådanne områder udvælges ved at søge efter spor af 5-8 sammenhængende aminosyrer, som har den laveste degenerering. Efter at området er udvalgt, syntetiseres et forråd af oligonukleotider, som vil fremkalde alle mulige 30 DNA-sekvenser, der kunne kode for de 5-8 aminosyrer i det udvalgte område.

I 69.000 dalton thrombinspaltningsfragmentet af svine-faktor VIII:C er der en pentapeptidsekvens, som løber fra den 18. til den 22. aminosyre fra aminoterminalen, som kunne 35 kodes for ved op til 16 forskellige DNA-sekvenser, hver med 5 kodoner, for en længde af 15 nukleotider.

40 23 DK 174927 B1

18 20 22 Trp - Asp - Tyr - Gly - Met Mulige mRNA-sekvenser UGG GAU UAU GGU AUG

eller eller eller

5 GAC UAC GGC

eller

GGA

eller

GGG

10

Proberne fremstilles ved at syntetisere et begrænset antal blandinger af oligonukleotider med 2-8 eller flere oligonukleotider per blanding. Disse blandinger omtales som forråd. Der fremstilles tilstrækkelig mange forråd til at 15 omfatte alle mulige kodningssekvenser.

Disse oligonukleotider kan syntetiseres manuelt, fx. ved phospho-tri-ester metoden, fx. som beskrevet i R.L.

Letsinger, et al., J. Am. Chem. Soc. 98:3655 (1967), hvis indhold inkorpores heri ved henvisning.. Andre metoder er 20 velkendte inden for området. Se også Matteucci og Caruthers, J. Am. "Chem. " Soc. ~ id~3T3T8~5 (T98T) “ Kvls _iTid.ho^ld“inkorporeres------- heri ved henvisning.

De syntetiske oligonukleotidprober til de ønskede polypeptidsekvenser fremstilles imidlertid fortrinsvis ved 25 identisk kemi ved hjælp af den fuldstændigt automatiserede "Applied Biosystems DNA synthesizer, Model 280A" som angivet ovenfor.

De således fremstilledes oligonukleotider kan derefter renses på en modsat HPLC-søjle som beskrevet af H. Fritz, et 30 al., Biochemistry, 17:1257 (1978), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning. Efter detritylering med 80% HOAc er det resulterende oligonukleotid normalt rent og kan anvendes direkte som probe. Hvis der er eventuelle kontamineringer, kan den syntetiske DNA renses yderligere på samme HPLc-35 søjle, fortrinsvis under anvendelse af et lidt anderledes gradientsystem.

Oligonukleotider mærkes, fx. ved anvendelse af |~ 3 2 P|ATP og T4 polynukleotidkinase og deres sekvens kontrolleres enten ved todimensionel homokromatografi som 40 beskrevet af Sanger et al., PNAS U.S.A. 70:1209 (1973) eller 24 DK 174927 B1 ved Maxam-Gilberts metode, Meth. Enzymology, 65:499 (1977), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning.

(b) 45 nukleotidprober 5 Et enestående aspekt af den foreliggende opfindelse har været anvendelsen af oligonukleotidprober til screening af et genom-DNA-bibliotek for faktor VIII:C-genet eller fragmenter deraf. Selvom oligonukleotider er blevet anvendt til screening af cDNA-biblioteker, se fx. M. Jaye, et al., 10 Nucleic Acids Research 11:2325 (1982), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning, er genom-biblioteker tidligere kun blevet screenet med held med cDNA-prober, dvs. prober, som først udvikledes efter at vævskilden for mRNA'en for et beskrevet protein var blevet identificeret og udnyttet til 15 at frembringe en cDNA-klon, som præcist passede til DNA-sekvensen af det søgte gen ved genomundersøgelsen.

I det foreliggende tilfælde har det vist sig muligt at anvende oligonukleotider til at identificere gensegmenter i et genombibliotek, som koder for aminosyresekvensen i de 20 interessante proteiner og identifikation af sådanne gensegmenter giver en exakt probe til anvendelse i mRNA, cDNA eller videre genomscreeningsteknikker.

Som her anvendes der fortrinsvis oligonukleotider, der svarer til mindst to segmenter af aminosyresekvensen af det 25 interesante protein. Fortrinsvis anvendes mindst én af oligonukelotidproberne i form af et eller flere forråd af oligonukleotider, som i aggregatet indbefatter enhver mulig DNA-sekvens, som kunne kode for de udvalgte aminosyresekvenser. Der anvendes fortrinsvis en forholdsvis kort probe, fx.

30 11-25 nukleotider, fortrinsvis 15-20 nukleotider, i forbindelse med en forholdsvis lang probe, fx. 30-200 nukleotider, fortrinsvis 40-50 nukleotider. Den anden probe kan anvendes til bekræftelse og er ikke altid nødvendig til identifikation af DNA-segmentet. Fortrinsvis udformes mindst 35 én af proberne og mere foretrukket den længste af proberne i overensstemmelse med de nedenfor beskrevne regler 1-4.

Regel 1. Kodonoræference I fravær af andre betragtninger valgtes den nukleotidsekvens, som passede til fremherskende eller lignende sekvenser i lignende 40 pattedyregener. Se Mechanisms of Ageing Dev., 18: (1982).

25 DK 174927 B1

Regel 2. Fordelagtig GT-parrina Nukleotidet G kan udover at binde til dets komplement C også danne svage bindinger med nukleotidet T. Se K.L. Agarwal et al., J.

Biol. Chem. 256:1023 (1981). Stillet over for et valg mellem 5 G og A til den tredje del af et flertydigt kodon er det at foretrække at vælge G, idet, hvis den resulterende hybridisering ville finde sted, selv hvis det virkelige nukleotid i stillingen er et T og ikke et C, hybridiseringen så fortsat ville være stabil. Hvis et A blev valgt forkert, 10 kunne den tilsvarende A:C-inkompatibilitet være tilstrækkelig til at ødelægge probens evne til at hybridisere med genom-DNA1 en.

Regel 3. Undgåelse af 51 CG-sekvenser Ved udvælgelse blandt de mulige flertydigheder vælg de nukleotider, som 15 ikke vil indeholde 51CpG-sekvensen, enten intra-kodon eller inter-kodon.

Regel 4. Umage position Ved udvælgelse af kodonsekvenserne, som skal anvendes, blev det postulat taget i betragtning, at manglende pasning nær enderne af molekylet 20 ikke påvirker hybridiseringsstabiliteten på samme måde som manglende pasning nær molekylets midte. Når Her fx-.-opstod^ væsentlig tvivl vedrørende sekvensen af et bestemt kodon og dette kodon var nær ved probens midte, var der således en tendens til at afprøve et forråd af mulige 25 nukleotidsekvenser for dette kodon, mens kodonpositioner nær probens ender med større sandsynlighed blev underkastet bestemmelser på grundlag af kodonpræference.

Den valgte sekvens for såvel 45-mer proberne som aminosyresekvenserne, de mulige DNA-sekvenser og den 30 "aktuelle probesekvens", dvs. komplementet til aktuel kodningsstreng bestemt for faktor VIII:C-exonet, vises i figur 3.

Ud af nukleotidpositioner, der involverede valg, dækkedes tre således ved at anvende forråd indeholdende 35 begge mulige nukleotidaltenativer, fem forudsagdes korrekt, én forudsagdes på en sådan måde, at der opretholdtes neutralitet, selvom den var ukorrekt, og fire andre var forkerte.

Uanset de omkring 11% umage (5/45) er forrådet af 45-40 mer oligonukleotider tilstrækkeligt til stærkt at

Of DK 174927 B1 identificere et svine-faktor VIil:C-genfragment som beskrevet nedenfor.

Eksempel 3 5 Screening af svine-genom-bibliotek

Et svine-genom-bibliotek konstrueres under anvendelse af bakteriofag vektor Lambda Jl. Lambda J1 fås ud fra L47.1 (Loenen et al., Gene 20:249 (1980)) ved at erstatte 1,37 kb og 2,83 kb Eco RI-Barn HI fragmenterne med en 95 bp Eco Rl-10 Hind III-Xba I-Bgl II-Bam HI polykæder. 6,6 kb Barn HI

fragmentet forefindes derefter som en direkte gentagelse i modsat orientering i forhold til L47.1. Kloningskapaciteten for Barn HI fragmenter er 8,6-23,8 kb. Barn HI spaltet svine-DNA (fremstillet som beskrevet af Piocini et al., Cell, 15 30:205 (1982)) ekstraheres med phenol, udfældes med ethanol og koncentreres ved centrifugering i en "Microfuge". 0,67 μg Bam HI svine-DNA ligeres til 2 μg Lambda Jl Bam HI "arme" fremstillet som beskrevet i Maniatis et al., supra, pp. 275-279, i et volumen af 10 μΐ ligeringspuffer med 10 enheder T4 20 DNA-ligase (Maniatis et al., supra, p. 474). Den ligerede DNA pakkes og pletteres som beskrevet i Maniatis et al., supra, p. 291.

5

Ca. 4 x 10 pfu pletteres på E. coli stamme C600 på 15 cm plastpetriplader indeholdende "NZCYM"-agarose med 8.000 25 pfu/plade. Disse rekombinant-fager screenes ved metoden ifølge Woo (1979) under anvendelse af den ovenfor beskrevne 32 45-mer probe mærket radioaktivt med P som ovenfor beskrevet som probe. Filtre hybridiseres derefter i 5 x SSC, 5 x Denhardt's, 0,1% SDS og 5 x 106 cpm/ml probe i 16 timer 30 ved 45°C, vaskes i 5 x SSC og 0,1% SDS ved 50°C og underkastes autoradiografi under anvendelse af forstærkningsskærme ("DuPont Lightning-Plus"). Autoradiografi afslører talrige fager, som i varierende grad er hybridiseret med 45-meren. Filtrene denatureres derefter i 35 0,5 M NaOH, neutraliseres i 1,0 M Tris, pH 7,5, 1,5% M NaCl og hydridiseres til 15-meren som beskrevet for 45-meren, bortset fra, at hybridiserings- og vasketemperaturen er 37°C. En fag, som er hybridiseret til begge prober, opsamles fra den oprindelige plade og 100 pfu pletteres og pletterne 40 screenes som beskrevet ovenfor under anvendelse af 15-meren DK 174927 B1 27 som probe.

En positiv fag kaldet PB34 opsamles som en prop og anvendes til at fremstille et pladelysat som beskrevet i Maniatis et al., supra, pp. 65-66. En isolering i lille 5 skala af PB34-DNA opnås ved anvendelse af den i Maniatis et al., supra, pp. 371-372 beskrevne procedure. 10 μΐ af denne DNA udskæres med restriktionsenzymet Hae III og phosphataseres derefter under anvendelse af alkalisk kalvephosphatase (Boehringer-Mannheim). Efter 10 phenolekstraktion tilsættes 20 ng Sma I udskåret M13mp8-DNA, opløsningen gøres 0,2 M med hensyn til NaCl og nukleinsyre udfældes ved tilsætning af 2 volumener ethanol. Udfældet DNA pelletiseres ved centrifugering og genopløses i 2 μΐ af en ligeringsblanding og DNA1en ligeres ved 23°C i 30 minutter, 15 fortyndes til 50 μΐ med ligasepuffer og ligeres i yderligere 3 timer. 5 μΐ fra denne reaktion anvendes til at transformere E. coli stamme JM101/TG1.

Celler gøres kompetente til transformation ved dyrkning til en O.D.ggg på 0,5 ved 37°C i 50 ml SOBM-medium (SOBM er 20 2% trypton, 0,5% gærekstrakt, 0,1 M NaCl, 0,11 g KOH per -------------- —1-i-ter·,—-20—mM—MgSØ—Ce-Her-pel-l-elrf seres-ved-centrrfugering---- ved 2500 opm i 10 minutter ved 4°C. Cellerne resuspenderes i 3,5 ml 100 mM RbCl, 45 mM MnCl2< 50 mM CaCl2, 10 mM kalium-MES, pH 6,4 (MES = methylethansulfonsyre). 200 μΐ kompetente 25 celler transformeres med DNA'en indeholdt i 5 ml fra ligeringsreaktionen i 30 minutter ved 0°C. Cellerne gives derefter et varmechock ved 42°C i 90 sekunder, hvorefter 4 ml 0,8% agarose/SOBM indeholdende 100 μΐ stationære JM10l/TGl-celler tilsættes og pletteres på 10 cm SOBM-agar 30 petriplader.

En subklon, der indeholder et Hae III fragment fra PB34, der hybridiserer til 15-meren, identificeres ved screening under anvendelse af proceduren ifølge Davis, supra. Denne klon isoleres og præpareres til brug som 35 templat. DNA-sekvensen af Hae III fragmentet, som forefindes i denne klon, betegnet 34-H1, vises i figur 5. M13-templat-DNA fremstilles ved at dyrke 1,5 ml inficerede celler ved 37°C i 5 timer. Celler pelletiseres ved centrifugering i 10 minutter i en "Beckman-mikrofuge". 1,0 ml supernatant 40 (indeholdende virus) fjernes og 200 μΐ, 20% polyethylen- 28 DK 174927 B1 glycol, 2,5 M NaCl tilsættes. Denne prøve inkuberes derefter ved stuetemperatur i 15 minutter efterfulgt af centrifugering i 5 minutter i en "Beckman-mikrofuge".

Pelleten opløses i 100 μΐ TE, 7,5 μΐ 4M NaCHCOO, pH 4,5, 5 tilsættes og prøven ekstraheres to gange med en 1:1 blanding af phenol-chloroform og én gang med chloroform. Den enkeltstrengede fag-DNA præcipiteres derefter ved tilsætning af 2 volumener ethanol. Præcipiteret DNA pelletiseres ved centrifugering i en "Beckman-mikrofuge" og opløses i 30 μΐ 1 10 mM Tris, pH 8,0, 0,1 mM EDTA. DNA-sekvensbestemmelsen udføres ved dideoxykædetermineringsteknikken, se fx. Sanger et al., PNAS U.S.A., 74:5463 (1977), under anvendelse af 15-meren som primer. Den iagttagede sekvens, som er inkluderet i de i figur 4 og 5 viste sekvenser, bekræftede, at 15 subklonen indeholder et svine-faktor VIII:C-éxon, da den indbefatter de identiske 14 aminosyrer, som er omfattet af området phenylalanin2 til glutamin15 i aminoterminalsekvensen af 69K-fragmentet, som er vist i figur 1. Yderligere bekræftelse kom ved sekvensbestemmelse 20 fra 5'-enden af Hae III indskuddet i 34-H1 vektoren ved priming med "universal-primer" (Bethesda Research Labs) i et punkt ved siden af polykæderen i denne vektor. Indskuddet fra denne klon, kaldet 34-Hl, reklonedes også i M13mp9 ved restriktion af DNA'en med Eco RI og Hind III, 25 phosphatasering med alkalisk kalvephosphatase og ligering til Eco RI, Hind III spaltet M13mp9-DNA. Denne klon, der indeholder en ombytning af Hae III segmentet i forhold til universal-primeren, sekvensbestemtes også som beskrevet ovenfor. De resulterende sekvehsdata for hele indskud 34-Hl 30 vises i figur 5. Denne sekvens bekræfter, at denne subklon indeholder en exon af svine-faktor VIII:C-genet, som fra nukleotiderne 169 til 267 kunne indkode i det mindste de 30 aminosyrer fra phenylalanin2 til arginin31 i 69K-fragmentet (fig. l).

35 Det forekommer sandsynligt, at arginin31 grænser op til en intron, fordi termineringskodoner kan findes nedenstrøms for nukleotid 267 (fig. 5) i alle tre læserammer og en sekvens lig sekvensen på det almindelige 5'-splejsningssted også findes i dette område mellem nukleotiderne 266 og 267.

40 Endvidere afviger den aminosyresekvens, som ville blive 29 DK 174927 B1 indkodet af den nedenstrøms DNA, fuldstændigt fra den, der iagttages i 69 Kd fragmentet af svine-faktor VIII:C.

PB34-DNA blev udskåret med Barn HI og underkastedes elektroforese gennem en agarosegel og båndene gjordes 5 synlige med ultraviolet lys efter farvning af gelen i 5 μg/ml ethidiumbromid. Tre indskud på ca. 6,6 kb, 6,0 kb og 1,8 kb blev iagttaget. DNA'en i gelen overførtes til nitrocellulose som beskrevet i Maniatis et al., supra, pp.

383-386. Hybridisering af filtret til 15-meren og 10 autoradiografi udførtes som beskrevet ovenfor.

Autoradiografi afslørede, at 6,0 kb båndet indeholdt et faktor VIII:C-genfragment, som hybridiserede til 15-mer proben.

Der var således for første gang blevet isoleret og 15 identificeret et afsnit af det gen, der koder for svine-faktor VIII:C. Bakteriofag lambda rekombinant klonen PB 34 er deponeret ved American Type Culture Collection under accessionsnummer ATCC 40087.

20 Eksempel 4 "Lokalisering ~a~f~human faktor VITITC-gen

Det af Maniatis et al., Cell, 15:687 (1978) beskrevne humane genom-bibliotek screenes for human faktor VIII:C- genet ved infektion af E. coli stamme LE392 (almindeligt 25 tilgængelig) med 6 x 105 pfu og plettering på 15 cm "NZCYM" agarplader med en tæthed på 20.000 pfu/plade. Disse fager screenes under anvendelse af proceduren ifølge Benton og

Davis, supra, med det i eksempel 3 beskrevne 6,0 kb svine- 32 faktor VIII:C-fragment mærket med P ved nick-translation 30 som probe. En fag, der udviser et stærkt hybridiseringssignal, opsamles og pletteres ved ca. 100 pfu/10 cm plade og screenes dobbelt som ovenfor beskrevet under anvendelse af den radioaktivt mærkede 45-mer som den ene probe og 6,0 kb Barn HI fragmentet af PB34 som den anden.

35 En fag, kaldet HH25, der hybridiserer til begge prober, identificeres, et pladeforråd fremstilles og hurtig-præp-DNA fremstilles som ovenfor beskrevet. Fag-DNA'en udskæres med Sau3A I, phosphataseres med alkalisk kalvephosphatase, ekstraheres med phenol og co-præcipiteres med 20 ng Barn HI 40 afskåret M13 mp8 DNA. Præcipiteret DNA pelletiseres ved 30 DK 174927 B1 centrifugering og genopløses i 2 μΐ ligasepuffer indeholdende T4 DNA-ligase. Ligering udføres i 2 minutter ved 16°C, fortyndet til 50 μΐ i ligasepuffer indeholdende T4 DNA-ligase, og inkuberes i yderligere 3 timer ved 16°C. 5 μΐ 5 af denne reaktionsblanding anvendes til at transformere E. coli stamme JM101/TG1 som beskrevet i eksempel 3 ovenfor.

Pletterne screenes under anvendelse af Benton og Davis proceduren med radioaktivt mærket 15-mer som probe. En fag-plague, kaldet 25-S1, der udviser hybridisering, isoleres og 10 enkeltstrenget fag-DNA fremstilles til anvendelse som DNA-sekvensbestemmelsestemplat som ovenfor beskrevet. Sekvensbestemmelse udføres ved anvendelse af den af Sanger et al., supra, beskrevne dideoxykædetermineringsteknik under anvendelse af 15-meren som primer og giver den i figur 6 15 viste informationsstreng-DNA-sekvens. 84 nukleotider sekvensbestemt på denne måde viste 85% homologi med det homologe område af svine-faktor VIII:C. Der er også kun én aminosyreforskel mellem det i figur 1 viste svine-faktor VIII:C 69K område 2-16 og det tilsvarende område, som blev 20 udledt ud fra den humane nukleotidsekvens i figur 6. Denne høje grad af homologi viser, at DNA'en i rekombinant-fag HH-25 udgår fra faktor VIII:C-genet.

For første gang er der således isoleret og identificeret en exon for det humane faktor VIII:C-gen. En 25 bakteriofag lambda rekombinant HH 25 er deponeret ved

American Type Culture Collection under accessionsnummeret ATCC 40086.

Eksempel 5

30 Identifikation af celler, der aktivt transkriberer faktor VIII:C

De ovenfor beskrevne svine- og human faktor VIII:C-exoner er værdifulde til flere forskellige funktioner. En af disse er som et screeningsmiddel, der muliggør 35 identifikation af det væv, som udgør det sted, hvor faktor VIII:C syntetiseres in vivo. Der eksisterer et antal screeningsmetoder, som er baseret på anvendelsen af exonen som et exakt komplement til den mRNA, der fremstilles under naturlig ekspression af faktor VIII:C. Ved 40 screeningsprocedurerne behandles væv fra forskellige dele af 31 DK 174927 B1 legemet for at frigøre den deri indeholdte mRNA, som derefter hybridiseres til et DNA-segment, der indeholder exonen for faktor VIII:C og hvis et molekyle mRNA hybridiserer til denne exon, er det væv, som er kilde for 5 denne mRNA, kilden for faktor VIII:C.

1. Screeningsorocedure

Svine- eller humant væv fra forskellige organer, herunder nyrer, lever, pankreas, milt, knoglemarv, 10 lymfekirtler, etc. præpareres ved guanidinhydrochloridekstraktion som beskrevet af Cos,

Methods Enzymol., 12B:120 (1968), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning, med visse modifikationer. I korte træk explanteres væv i 8 M guanidinhydrochlorid (eller 4 M 15 guanidinisothiocyanat som foreslået af Chirgwin, et al.,

Biochemistry 18: 5294 (1979)), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning, se også Maniatis, et al., supra, på s.

189 et seq.), 50 mM Tris (pH 7,5), 10 mM EDTA og homogeniseres i en "Omnimixer" (Sorvall) ved tophastighed i 20 1 minut. Homogenatet klares ved 5000 opm i 5 minutter i en "Sorval HB-4" rotor og RNA'en udfældes ved~tTiTsætning af ~0 ,~5“ ----- volumener ethanol. RNA'en opløses og udfældes yderligere tre gange fra 6 M guanidinhydrochlorid før det opløses i H20.

Budbringer-RNA fra dette forråd opkoncentreres ved 25 kromatografi på oligo (dT) cellulose (Collaborative Research).

Denne mRNA underkastes derefter elektroforese gennem en agarosegel indeholdende formaldehyd, som beskrevet af Maniatis et al., 'supra, på s. 2 02-3. mRNA'en i gelen 30 overføres derefter til et nitrocellulosefilter (Maniatis et al., supra, på s. 203-4).

Den således opnåede mRNA hybridiseres med den radiomærkede svine- eller human exon-DNA opnået som beskrevet ovenfor og forekomsten af hybrider påvises ved 35 autoradiografi. Et radioaktivt signal indikerer, at vævskilden for mRNA'en er en kilde for syntese af faktor VIII:C i legemet.

Som alternativ kan mRNA screenes under anvendelse af S1-beskyttelses-screeningsmetoden.

40 S^nuklease er et enzym, der hydrolyserer • 32 DK 174927 B1 enkeltstrenget DNA, men ikke hydrolyserer baseparrede nukleotider såsom hybridiseret mRNA/DNA. Forekomsten af et radioaktivt bånd efter acrylamidgelelektroforese og autoradiografi viser således, at den enkelt-strengede DNA, 5 som svarer til faktor VIII:C-exonen, er blevet beskyttet af det komplementære mRNA, dvs. mRNA for faktor VIII:C. Det væv, der var kilde for denne mRNA, udgør således et syntesested for faktor VIII:C in vivo. Dette væv kan anvendes som kilde for faktor VIII:C-mRNA. Denne 10 screeningsmetode kan være noget mere følsom end den ovenfor beskrevne screeningsmetode.

En probe bestående af enkeltstrenget radioaktivt mærket DNA, som er komplementært til mRNA'en, syntetiseres under anvendelse af. den universelle primer af M13 til at prime 15 DNA-syntese af svinegenom-subklonen 34-Hl. Reaktionen

udføres i en 100 μΐ opløsning af 50 mM Tris, pH 7,4, 5 mM

MgCl~, 1 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 40 μΜ dGTP, dTTP, ^ 32 dCTP, 60 μΟϊ P-dATP {400Ci/mmol), 10 ng universal primer, 200-400 ng 34-53 templat DNA og Klenow-fragmentet af DNA-20 polymerase I {E. coli). Reaktionen inkuberes ved 23°C i 60 minutter, 10 minutter ved 70°C, 50. enheder PstI tilsættes og inkuberes i yderligere 60 minutter.

Reaktionen afsluttes ved phenol/chloroform-ekstraktion,

NaCl tilsættes til 0,2 M og der præcipiteres med 2 volumener 25 100% ethanol. Den præcipiterede DNA pelletiseres ved centrifugering, genopløses i 20% saccharose, 50 mM NaOH, 0,1% cresol-grønt og underkastes derefter elektroforese · gennem 2% agarose i 50 mM NaOH, 10 mM EDTA. Det resulterende enkeltstrengede fragment lokaliseres ved autoradiografi, 30 båndet udskæres og DNA'en isoleres ved elektroeluering i dialyserør.

Prøve-mRNA fremstilles ud fra lever-, milt-, etc. væv ved den ovenfor beskrevne guanidinhydrochloridmetode.

Derefter hybridiseres proben til prøve-mRNA {opnået ved 35 oligo (dT) kromatografi-opkoncentreringstrinnet) i 50% formamid, 0,4 M NaCl, 40 mM PIPES (piperazin-Ν,Ν1-bis-(2-ethansulfonsyre), pH 6,5, 1 mM EDTA, 5-50 μg mRNA, 2 μg mærket DNA i et volument på 15 μΐ. Hybridiseringen afsluttes ved tilsætning af 200 μΐ koldt S^nukleasepuffer (0,25 M 40 NaCl, 0,3 M NaCH3COO (pH 4,5), 1 mM ZnS04, 5% glycerol og 33 DK 174927 B1 1000 enheder S^nuklease. Reaktionsblandingen inkuberes ved 45°C i 30 minutter. Prøver phenol-ekstraheres, ethanol præcipiteres med 10 μς gær-tRNA-bærer og underkastes analyse ved elektroforese gennem 5% polyacrylamidsekvensgeler som 5 beskrevet i Maxam-Gilbert, PNAS USA, 74:560 {1977).

Eksempel 6

Anvendelse af faktor VIII:C-exon-DNA til opnåelse af faktor VIII:C-mRNA fra væv 10 Når først et væv, som er kilde for mRNA, er identificeret, ekstraheres faktor VIII:C-mRNA fra dette væv og anvendes til konstruktion af et cDNA-bibliotek. cDNA-biblioteket anvendes derefter til at identificere og konstruere en cDNA-klon i fuld længde, som indkoder 15 aminosyresekvensen for faktor VIII:C uden de i den genome klon indeholdte introner, som beskrevet nedenfor. Derefter indføres den cDNA, som indkoder faktor VIII:C-proteinet, i en passende ekspressionsvektor i en passende vært for ekspression af faktor VIII:C.

20 Da der er et stort behov for human faktor VIII:C til ----------------------behaP'd-H-ng—af-hæmo’fi-l“i-Og—andre-Ηηνβη'ά'βΐβ'βχ·; beskrives ~ fremstillingen af human faktor VIII:C-cDNA. 1

Opnåelse af mRNA for human faktor VIII:C 25 mRNA fra det humane væv, som er ansvarlig for faktor VIII:C-syntese, fremstilles ved guanidin-hydrochloridekstraktionsmetoden som beskrevet af Cox og modificeret af Chirgwin, et al., som beskrevet ovenfor.

Yderligere fraktionering af mRNA fra olie (dT) 30 cellulose-kromatografisøj len opnås ved sedimentation på 5-20% saccharosegradienter indeholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 1 mM EDTA og 0,2% SDS ved centrifugering i 24 timer ved 22.000 opm i en "Beckman-SW28" rotor. Fraktioner (1,0 ml) opsamles, natriumacetat tilsættes til 0,2M og 35 fraktionerne udfældes med ethanol to gange før opløsning i vand. Partikelstørrelsefordelingen af den fraktionerede RNA bestemmes ved elektroforese gennem 1,4% agarosegeler indeholdende 2,2 M formaldehyd.

mRNA, der sedimenterer ved en S- (Svedberg) værdi over 40 28, sammenblandes til syntese af dobbeltstrenget cDNA. 10 μg 34 DK 174927 B1 af denne RNA denatureres ved stuetemperatur i 10 /il 10 mM methylkviksølvoxid. 140 mM 2-mercaptoethanol tilsættes for at inaktivere methylkviksølvhydroxidet. RNA'en fortyndes derefter til 50 μΐ indeholdende 140 mM KC1, 100 mM Tris-HCl 5 (pH 8,3 ved 42°C), 1 mM af hvert deoxynukleotidtriphosphat, 200 Mg/ml oligo (dT) 12-18, 10 mM MgCl2 og 0,1 μΟχ 32P-dCTP/ml. Disse reaktioner udføres ved 42°C i 1 time efter tilsætning af 3 μΐ af 17 enheder/μΐ AMV revers transkriptase (Life Sciences). Reaktionen afsluttes ved tilsætning af 0,25 10 M EDTA (pH 8,0) til 20 mM. Den resulterende blanding eks-traheres én gang med samme volumen phenol/chloroform (1:1) efterfulgt af en chloroformekstraktion. Derefter kromatograferes prøven på en 5 ml "Sepharose CL-4B" søjle (Pharmacia), som er ligevægtsindstillet i 10 mM Tris-HCl (pH 15 8,00), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA. Det tomme volumen opsamles og nukleinsyrerne (inklusive eventuelle RNA/cDNA-hybrider) udfældes ved tilsætning af 2,5 volumener ethanol.

I forbindelse med ovenstående procedurer anvendes der fortrinsvis også et faktor VIII:C-exon-oligonukleotidsegment 20 i stedet for oligo-dTr til at prime den reverse transkription som beskrevet i Ullrich et al., Nature, 303:821 (1983) .

RNA-cDNA-hybriderne opløses i 35 μΐ afioniseret H20, gøres 100 mM kaliumcacodylat (pH 6,8), 100 μΜ dCTP, 1 mM 2-25 mercaptoethanol, 1 mM koboltchlorid og forsynes enzymatisk med "hale" ved tilsætning af 10 enheder deoxytidyl-terminal transferase (pH Biochemicals) og inkubation af reaktionen i 30 sekunder ved 37°C. Reaktionen afbrydes ved tilsætning af 0,25 M EDTA til 10 mM. Tris-HCl (pH 8,0) tilsættes til 300 30 mM og prøven ekstraheredes én gang med samme volumen phenol-chloroform (1:1) og derefter med et lige så stort volumen chloroform. Nukleinsyrer udfældes fra dette produkt ved tilsætning af 2,5 volumener ethanol.

De med dC-hale forsynede hybridmolekyler normaliseres 35 derefter med 170 μg/ml oligo (dG) 14-18 cellulose i 10 mM KCl, 1 mM EDTA i 10 minutter ved 43°C og derefter i yderligere 10 minutter ved 23°C. Dette reaktionsprodukt fortyndes så til 100 μΐ indeholdende 100 mM ammoniumsulfat, 1 mM 2-mercaptoethanol, 100 mM MgCl2, 100 μg/ml 40 okseserumalbumin (Sigma, Cohn-fraktion V) og 100 μΜ 35 DK 174927 B1 nicotinamidadenindinukleotid. Andenstrengs-cDNA-syntese initieres ved tilsætning af 1 enhed "RNase H" (P-L Bio-chemicals), 1 enhed E. coli DNA-ligase og 10 enheder DNA-polymerase I og inkuberes ved 16°C i 12 timer.

5 Prøven kromatograferedes dernæst over "Sepharose CL-4B" som ovenfor beskrevet. Dobbeltstrenget DNA udfældes med ethanol og forsynes med dC-hale som beskrevet for RNA-cDNA-hybridhalefrembringelsen.

10 2. Screening for human faktor VIII:C-DNA

Dobbeltstrenget cDNA med dC-hale opnået som beskrevet ovenfor normaliseres med en ækvimolær. mængde pBR322 med dG-hale (New England Nuclear) i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 100 mM NaCl ved 37°C i 2 timer. De normaliserede 15 kimære molekyler fryses dernæst ved -20°C indtil de anvendes ved bakterietransformation.

Bakterietransformation foretages under anvendelse af MC1061-stammen af E. coli (kilde). Celler (50 ml) dyrkes til en optisk densitet på 0,25 ved 600 nm. Celler koncentreres 20 ved centrifugering ved 2500 opm i 12 minutter, vaskes i 10 --------m-1— st-eri-1—;100—mM—CaCl·^-og_pe“l_l_et±seres—igen-ve'd-een- trifugering som beskrevet ovenfor. Celler resuspenderes i 2 ml steril 100 mM CaC^ og opbevares ved 4° i 12 timer. De normaliserede kimæriske molekyler inkuberes i en mængde på 5 25 ng dobbeltstrenget cDNA per 200 μΐ kompetente celler ved 4°C i 30 minutter. Derefter underkastes bakterierne en to minutters varmeimpuls på 42°C. 1,0 ml L-substrat tilsættes så og cellerne inkuberes ved 37° i 1 time. Derefter pletteres cellerne på LB-agarplader indeholdende 5 /xg/ml 30 tetracyclin.

Human faktor VIII:C-kloner identificeres under anvendelse af kolonihybridiseringsproceduren ifølge Grunstein og Hogness PNAS U.S.A., 72:3961 (1975), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning. cDNA-biblioteket 35 pletteres på et nitrocellulosefilter (Schleicher og Schuell) anbragt oven på L-substrat/5 ^g/ml tetracyclin-agarplader. Kolonier dyrkes natten over ved 37°C og filteret anbringes derefter på sterilt "Whatman 3 M" papir. Derefter presses et forfugtet nitrocellulosefilter mod masterfilteret og 40 filtrene sættes sammen under anvendelse af en 18 gauge nål.

36 DK 174927 B1

Kopifilteret dyrkes så på LB-tetracyclinplader ved 37°C indtil kolonierne har nået en diameter på 1-2 mm. Så overføres filtrene til LB-plader indeholdende 150 Mg/ml chloramphenicol og inkuberes ved 37°C i 16-24 timer.

5 Så fjernes filtrene og anbringes på "Whatman 3 M" papir mættet med 0,5 M NaOH i 5 minutter ved stuetemperatur.

Derefter neutraliseres filtrene ved anbringelse på "Whatman 3 M" mættet med 1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1,5 M NaCl og derefter "Whatman 3 M" mættet med 2 x standardsalinecitrat 10 (SSC). SSC (lx) er 0,15 M NaCl, 0,015 M natriumcitrat.

Filtrene lufttørres og bages i vakuum ved 80°C i 2 timer. Præhybridisering af filtrene foretages ved 65°C i 30

minutter i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1% SDS

efterfulgt af 30 minutter i 7 x SCS, 5 x Denhardt1 s (lx 15 Denhardt1 s er 0,02% polyvinylpyrollidin, 0,02% ficoll, 0,02% okseserumalbumin) , 100 /ig/ml denatureret laksesperma-DNA og 32 0,1% SDS. P-mærket human exon-DNA fremstillet som beskrevet ovenfor tilsættes til 10^ cpm/ml og hybridiseringen udføres 12-16 timer ved 37°C. Så vaskes 20 filtrene i adskillige hold af 7 x SSC, 0,1% SDS i 1-2 timer ved 37°C. Derefter lufttørres filtrene og underkastes autoradiografi med "Kodak XAR" film og en "Dupont Lightning Plus" forstærkningsskærm.

De kolonier, der viser et hybridiseringssignal i 25 forhold til baggrunden, dyrkes i L-substrat indeholdende 50 μg/ml tetracyclin for hurtig-præp-rensning af plasmid-DNA. Plasmid-DNA renses ved metoden ifølge Holmes et al., Anal. Biochem., 114:193 (1983), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning. En portion af denne DNA spaltes med 30 restriktionsendonuklease Pst I og fragmenterne underkastes elektroforese gennem 1% agarose/TBE-geler og aftrykkes ved proceduren ifølge E. Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975), Methods Enzymol., 69:152 (1980), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning. Nitrocellulosefiltrene hybridiseres med 35 radiomærket human faktor VIII:C-exon-DNA som beskrevet i forbindelse med kolonihybridisering. De plasmider, som indeholder Pst I inskud, der hybridiserer til faktor VIII:C-exon-DNA'en, anvendes til DNA-sekvensanalyse.

Til sekvensbestemmelse nedbrydes plasmid-DNA (renset ud 40 fra 0,75 ml kultur ved fremgangsmåden ifølge Holmes, et al., 37 DK 174927 B1 supra) til fuldstændighed med restriktionsendonukleasen Sau 3al. Det resulterende DNA-segment, identificeret som 34-S1, har en DNA-sekvens som vist i figur 4. DNA'en fældes med ethanol efter ekstraktion med phenol-chloroform og 5 genopløses i 10 μΐ TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA). 5 μΐ af DNA-opløsningen ligeres med 20 ng Barn Hl spaltet M13 mp 9 replikativ form af DNA i 100 μΐ 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 10 mM dithiothreitol, 1 mM ATP og et overskud af T4-DNA-ligase. Ligeringer udføres ved 15°C i 2-4 10 timer.

5 μΐ af ligeringsreaktionerne anvendes til transformation af 200 μΐ E. coli stamme JM101/TG1 som beskrevet ovenfor. Rekombinanter identificeres som hvide pletter ved dyrkning på LB-agarplader indeholdende X-gal som 15 en indikation for beta-galactosidase-aktivitet som beskrevet af Davies, et al., J. Mol. Biol., 36:413 (1968).

Rekombinant fag-havnesekvenser, der hybridiserer til den humane exon, identificeres ved proceduren ifølge Benton, et al., Science, 196:180 (1977), hvis indhold inkorporeres 20 heri ved henvisning, under anvendelse af radioaktivt mærket human Taktor VII'ITC-exon som probe. Pletter, der viseret hybridiseringssignal, opsamles og dyrkes i 1,5 ml kulturer af L-substrat. Enkeltstrenget fag-DNA fremstillet ud fra disse kulturer, anvendes som templat ved oligonukleotid-25 primede DNA-syntesereaktioner. Sekvensbestemmelse foretages ved anvendelse af dideoxykæde-termineringsproceduren, se fx. Sanger et al., PNAS U.S.A., 74:5463 (1977).

Human faktor VIII:C-rekombinanter identificeres ved at sammenligne deres nukleotidsekvens med den, der kendes fra 30 human exon-sekvensen for human faktor VIII:C.

3. Svine-faktor VIII:C-mRNA

Human faktor VIII:C-rekombinanter anvendes til at screene et svinevævs-bibliotek konstrueret nøjagtigt som 35 beskrevet for cDNA-biblioteket fra humant væv. Potentielle svine-faktor VIII:C-rekombinant DNA-kloner identificeres ved

Grunstein-Hogness proceduren ved som probe at anvende det 32 P-mærkede exon-fragment af svineoprindelse som ovenfor beskrevet. Proben er svine-faktor VIII:C-exon-segmentet 32 40 mærket med P ved nick-translation som beskrevet af Rigby 38 DK 174927 B1 et al., J. Mol. Biol., 113:237 (1977), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning.

Kolonier, der udviser hybridiseringssignaler, dyrkes med henblik på hurtig-præp-plasmidrensing som ovenfor 5 beskrevet. Plasmid-DNA spaltes med restriktionsendonuklease

Pst I, underkastes elektroforese gennem 1% agarose/TBE-geler og aftrykkes ved fremgangsmåden ifølge E. Southern (1975).

Aftrykkene hybridiseres med nick-translateret svine-faktor 32 VIII:C-rekombinant-DNA mærket med P.

10 Kloner i fuld længde kan konstrueres på konventionel måde såsom ved ligering af DNA-fragmenter fra overlappende kloner ved restriktionsenzymsteder, som er fælles for begge kloner, således som det er velkendt inden for området ("gene walking").

15 4. Identifikation af kloner i fuld længde fra trin 2 eller 3

Afstanden mellem 5'-enden af en eksisterende klon og 5'-enden af mRNA'en kan analyseres ved den i Agarwal et al., 20 "J.B.C." 256(2):1023-1028 (1981) beskrevne primerekstensionsteknik under anvendelse af en oligonukleotidprimer, hvis sekvens kommer fra 5'-(aminoterminal) området af den eksisterende faktor VIII:C-klon. Hvis geler fremkaldt ved anvendelse af denne procedure 25 viser mere end ét transkript, bør man betragte det mest intense bånd som svarende til hele mRNA-transkriptet.

Der er imidlertid mange mRNA'er, der indeholder et . langt område af 5' utranslateret sekvens. Ekspression af human AHN-DNA kan således ikke være kontingent efter 30 opnåelsen af en komplet cDNA-klon. Fx. kan der blive opnået en klon, som ved DNA-sekvensbestemmelsesanalyse viser eksistensen af et methioninkodon efterfulgt af en sekvens, som er analog med eller identisk med et kendt eukaryotisk proteinsekretionssignal og som er i ramme med de resterende 35 kodoner. Transformation og ekspression bør udføres for en klon, der indeholder met-sekretionssignalsekvensen, som er af den forventede størrelse og som indeholder en poly (T) 3'-terminal.

40 DK 174927 B1 39 5. Alternativ procedure

Som alternativ til de metoder, der er beskrevet i afsnit 1-3 ovenfor, foretrækkes det, at cDNA-klonerne for svine- eller human faktor VIII:C identificeres ved 5 anvendelse af en bakteriofagvektor på følgende måde.

mRNA fra humant fosterlevervæv, som er ansvarligt for faktor VIII:C-syntese, fremstilledes ved guanidinhydrochloridmetoden som beskrevet af Cox og modificeret af Chirgwin, et al., som anført ovenfor i 10 eksempel 5, afsnit 1. Førstestrengs-cDNA syntetiseredes ud fra 10 μg polyA+-fosterlever-RNA ved den i eksempel 6, afsnit 1 ovenfor beskrevne procedure. Nærmere bestemt denatureredes 10 μg af denne RNA ved stuetemperatur i 10 μΐ 10 mM methylkviksølvhydroxid. 140 mM 2-mercaptoethanol 15 tilsattes for at inaktivere methylkviksølvhydroxidet. Så fortyndedes RNA'en til 50 μΐ indeholdende 140 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3 ved 42°C), 1 mM af hvert

deoxynukleotidtriphosphat, 200 μg/ml oligo (dT) 12-18, 10 mM

32

MgCl2 og 0,1 /iCi P-dCTP/ml. Disse reaktioner udførtes ved 20 42°C i 1 time efter tilsætning af 3 μΐ af 17 enheder/μΐ AMV

revers ~transkriptåse (Uffe-Sciences Γ. ------

Til førstestrengssyntesen af et primer-forøget bibliotek inkluderedes 200 picomol af en unik komplentær 38-mer i CH-^HgOH-denatureringstrinnet og efter 10 minutter ved 25 23°C gjordes reaktionen 140 mM beta-mercaptoethanol, 0,7 M KCl, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl (pH 8,3 ved 42°), 1 enhed/ul RNasin (Biotec) og inkuberedes ved 50°C i 2 minutter og ved 42°C i 2 minutter. Derefter fortyndedes der til 50 μΐ indeholdende 140 mM KCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8,3 ved 42°C), 30 1 mM af hvert deoxynukleotidtriphosphat, 10 mM MgCl^ og 0,1 μ^ ^P-dCTP/μΙ. Reaktionen inkuberedes ved 42°C i 1 time efter tilsætning af 3 μΐ 17 μ/ μΐ AMV revers transkriptase.

Efter førstestrengssyntesen fortyndedes reaktionerne til 150 μΐ indeholdende 10 mM MgCl2, 50 mM Tris, pH 7,4, 5 35 mM 2-mercaptoethanol, 7,5 mM NH4SC>4, 250 μΜ af hvert deoxynukleotidtriphosphat, og andenstrengssyntese initieredes ved tilsætning af 1 enhed "RNase Η" (E. coli) og 45 enheder DNA-polymerase I. Reaktioner inkuberedes ved 16°C i 8 timer, hvorefter de blev afbrudt ved tilsætning af EDTA 40 til 20 mM og bragt til et slutvolumen på 200 μΐ med H20.

40 DK 174927 B1

Derefter udførtes EcoRl-methylering ved tilsætning af S-adenosylmethionin til 50 μΜ og 40 enheder EcoRl-methylase.

Disse reaktioner inkuberedes i 1 time ved 37°C, termineredes ved phenol-chloroformekstraktion og kromatograferedes under 5 anvendelse af "Sephadex G50" ligevægtsindstillet i 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl. Det tomme volumen sammenblandedes og præcipiteredes ved ethanoltilsætning.

cDNA-molekyler gjordes stump-endede i 200 μΐ indeholdende 50 mM Tris, pH 8,3, 10 mM MgCl2, 10 mM 2-10 mercaptoethanol, 50 mM NaCl, 50 μΜ af hvert deoxynukleotidtriphosphat, 100 μg/ml ovalbumin og 5 enheder T4-polymerase. Reaktionen inkuberedes ved 37° i 30 minutter og blev derefter bragt til afslutning ved phenol-chloroformekstraktion. Derefter udfældedes nukleinsyrer ved 15 ethanoltilsætning.

EcoRl-"kædere" (Collabortive Research) ligeredes så til de stump-endede cDNA-molekyler under standardbetingelser,

Manitis, et al., supra, på s. 243, i et samlet volumen på 45 μΐ. Reaktionerne afsluttedes ved tilsætning af EDTA til 15 20 mM og ekstraheredes med phenol-chloroform. Nukleinsyrer udfældedes med ethanol og pelletiseredes ved centrifugering.

Den kædede cDNA genopløstes i 200 μΐ 100 μΜ Tris-HCl (pH 7,2), 5 mM MgCl2, 50 mM NaCl og blev nedbrudt med 300 enheder EcoRl ved 37°C i 2 timer. Så ekstraheredes 25 reaktionen med phenol-chloroform og kromatograferedes over "Sepharose CL-4B" ligevægtsindstillet med 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 M NaCl. cDNA i det tomme volumen opsamledes, udfældedes med ethanol og pelletiseredes ved centrifugering.

30 cDNA genopløstes i 10 mM Tris-HCl (ph 8,0), 1 mM EDTA

og ligeredes til EcoRl-spaltet, phsophataseret lambda Charon

21A DNA ved forskellige forhold mellem cDNA og vektor-DNA

vinder anvendelse af standard-ligeringsbetingelser. Ligeret DNA pakkedes og titreredes under anvendelse af etablerede 35 procedurer, Manitis, et al., supra, på s. 64, 256. Bibliote- 32 ket pletteredes og screenedes under anvendelse af P-mærket humant exon-DNA under betingelser beskrevet i Benton og Davis, supra. Overlappende kloner, som spændte over ca.

10.000 basepar, opnåedes og en væsentlig del deraf 40 sekvensbestemtes og afslørede én lang åben læseramme, der 41 DK 174927 B1 koder for human faktor VIII:C. Den derfra opnåede rekombinant-DNA-nukleotidsekvens, der koder for human faktor VIII:C, vises i figur 7 sammen med den udledte aminosyresekvens for human faktor VIII:C. De overlappende 5 kloner samledes i vektor pSP64 (Promega Biotec) under anvendelse af konventionelle teknikker, der er velkendte inden for området, dvs. ved ligering af DNA-fragmenter fra overlappende kloner ved restriktionsenzymsteder, som er fælles for begge kloner. En pSP64-rekombinantklon 10 indeholdende den i figur 7 viste nukleotidsekvens, der betegnes pSP64-VIll, er deponeret i American Type Culture Collection under accessionsnummeret ATCC 39812, den 23. august 1984.

15 Eksempel 7

Ekspression af human eller svine-faktor VIII:C

Dette eksempel sigter mod ekspression af faktor VIII:C ved anvendelse af den ved fremgangsmåden i eksempel 6 opnåede klon i fuld længde i et cotransformationssystem.

20 --------------1--—F-remsbi-l-l-i-nq—a-f—bra-ns-forma-t-j-onsvektor- ------ ---

En direkte metode til opnåelse af faktor VIII:C-transformationsvektoren beskrives nedenfor. pCVSVL-plasmidet nedbrydes delvis med Pst I og nedbrydningsproduktet 25 adskilles ved gelelektroforese. Efter synliggørelse isoleres det lineære DNA-fragmentbånd svarende til plasmidet i fuld længde som pCVSVL-Bl.

cDNA'en for faktor VIII:C reddes fra kloningsvektorerne ifølge eksempel 5 ved delvis nedbrydning med Pst I. Det 30 delvise nedbrydningsprodukt adskilles ved gelelektroforese og båndet, der svarer til molekylvægten af cDNA'en i fuld længde, isoleres. pCVSVL-Bl normaliseres med dette DNA-fragment, ligeres med T4-ligase ved 15°C, transficeres i E. coli stamme HB101 og transformanter udvælges efter 35 tetracyclinresistens. De udvalgte E. coli transformanter dyrkes i nærvær af tetracyclin. Plasmid-pCVSVL-Bla udvindes på konventionel måde. Korrekt orientering af cDNA'en i plasmidet kan bestemmes på konventionel måde ved asymmetrisk nedbrydning med én eller flere passende endonukleaser.

40 42 DK 174927 B1 2. Cotransformation. udvælgelse og forstærkning

Plasmid-pCVSVL-Ala eller pCVSVL-Bla og pAdD26SVpA nr. 3 (Kaufman et al., op. cit.) blandes sammen (10 μg HP og 0,5 μg pAdD265VpA nr. 3) og udfældes ved tilsætning af NaOAc, pH 5 4,5, til 0,3 M og 2,5 volumener ethanol. Udfældet DNA

tillades at lufttørre, resuspenderes i 2 x HEBSS (0,5 ml) og blandes kraftigt med 0,25 M CaCl2 (0,5 ml) som beskrevet (Kaufman et al., op. cit). Calciumphosphat-DNA-præcipitatet får lov til at sætte sig 30 minutter ved stuetemperatur og 10 sættes til CHO DUKX-B1-celler (Chasin og Urlaub, 1980, kan fås fra Columbia University). Væksten og bevaringen af disse celler er blevet beskrevet (Kaufman et al., op. cit, Chasin og Urlaub (1980)) .

DUKX-B1-cellerne subdyrkes ved 5 x 105/10 cm skål 24 15 timer før transfektion. Efter 30 minutters inkubation ved stuetemperatur tilsættes 5 ml af et medium med 10% kalvefosterserum og cellerne inkuberes ved 37° i 42 time.

Derefter fjernes mediet fra monolaget, 2 ml a-media med 10% kalvefosterserum, 10 μg/ml thymidin, adenosin og 20 deoxyadenosin og penicillin og streptomycin. To dage senere subdyrkes cellerne 1:15 i a-media med 10% dialyseret kalvefosterserum og penicillin og streptomycin, men uden nukleosider. Celler tilsættes igen samme medium efter 4-5 dage.

25 Kolonier kommer til syne 10-12 dage efter subdyrkning i selektive medier. Methotrexat- (MTX) udvælgelse og påvisning af faktor VIII:C-gen og udvælgelsesgenforstærkning gennemføres i overensstemmelse med Axel et al., US-patentskrift nr. 4.399.216, eller Kaufman et al., op. cit.

30 faktor VIII:C-udbytter kan forbedres ved cotransformation af den permanente cellelinie EA.hy 926 (Edgell et al., "Proc.

Natl. Acad. Sci" 80:3734-3737 (1983) i stedet for DUKX-B1- celler. I dette tilfælde bør cotrans- formationsudvælgelsesgenet være det dominerende DHFR-gen, 35 der er beskrevet af Haber et al., "Somatic Celle Genetics" 4:499-508 (1982). løvrigt vil cotransformationen og dyrkningen i det væsentlige være som anført andetsteds heri.

40 DK 174927 B1 43

3 . Fremstilling af faktor VIII:C

faktor VIII:C-producerende CHO-transformanter udvalgt under afsnit 2 holdes i podekultur under anvendelse af standardteknikker. Kulturen opskaleres til 10 liter ved 5 celledyrkning i konventionelt medium. Dette medium behøver ikke at indeholde MTX og vil ikke indeholde nukleosider for at udelukke udvælgelsesgenrevertanter.

Kultursupernatanten overvåges for størkningsaktivitet ved hjælp af standardanalyser til brug i forbindelse med 10 blodplasmaprøver (reduktion af størkningstid for plasma med mangel på faktor VIII). Supernatenten kan renses ved hjælp af konventionelle teknikker såsom polyethylenglycol- og glycinfældninger (som er kendte til anvendelse ved rensning af faktor VIII:C fra blodplasma) for at øge følsomheden af 15 faktor VIIl-analyserne.

Når faktor VIII-aktiviteten har nået et maksimum, adskilles cellerne fra dyrkningsmediet ved centrifugering.

Så udvindes faktor VIII og renses ved polyethylenglycol- og glycinfældninger. Størkningsaktivitet påvises i plasma, som 20 mangler faktor VIII.

4. Alternativ procedure til fremstilling af faktor VIII ;C

En cDNA i fuld længde indeholdende hele faktor VIII:C-25 kodningsområdet konstrueredes ud fra den ovenfor beskrevne exon i HH-25, to cDNA-kloner, som overlappede de yderste 5'-og 3'-områder af denne exon, og en tredje klon, som overlappede 3'-cDNA-klonen og fortsatte forbi termi-neringskodonet. Dette konstrueredes således, at syntetiske 30 Sal I steder anbragtes netop 5' for initiatormethioninet og i en stilling, som var 3' til translations-stopsignalet ved enden af faktor VIII:C-kodningssekvenserne. Dette muliggjorde anbringelsen i og udskæringen fra polykæder Sal I stedet i pSP64. Sal I fragmentet fra denne klon (pSP64-35 VIII) rensedes og ligeredes til pCVSVL2. pCVSVL2 er et plasmid, som er identisk med ekspressionsvektoren pCVSVL (Kaufman, et al., Mol. Cell Biol., 2:1304 (1982)), hvis indhold inkorporeres heri ved henvisning, bortset fra, at Pst I stedet, som befinder sig 3' for SV40-40 polyadenyleringssekvensen, er udeladt, hvilket er opnået ved 44 DK 174927 B1 konventionelle procedurer, og at det indeholder et duplikat af SV40 Ava II "D" fragmentet ovenstrøms for den såkaldte adenovirus større sene promoter (MLP). pCVSVL2 opnåedes ud fra pAdD26SVpA(1) (se Kaufman et al., supra) ved tilsætning 5 af Xhol-kædere ved hver ende af to SV40 Ava II "D" fragmenter og indsætning af dem på Xhol-stedet i pAdD26SVpA(1). Ava II "D" fragmenterne indskydes begge således, at den sene SV40-promotor befinder sig i samme orientering som den større sene Ad2-promotor. For plasmider 10 pCVSVL og pAdD26SVpA.(3) , se Kaufman et al., supra. For at indskyde Sal I fragmentet af pSP64-VIII i pCVSVL2, omdannedes det unike Pst I sted i pCVSVL2 til et Sal I sted ved den i Rothstein et al., Methods Enzym., 69:98 (1980) beskrevne procedure og Sal I fragmentet, som var udskåret 15 fra pSP64-VIII, indførtes, hvorved pCVSVL2-VIII opnåedes. pCVSVL2-VIII indeholder den korrekte 5'- til 31-orientering, som muliggør transkription af faktor VIII:C-kodningssekven-sen fra vektorens adenovirus MLP. pCVSVL2-VIII er deponeret i American Type Culture Collection under accessionsnummeret 20 39813, den 23. august 1984.

pCVSVL2-VIII indførtes i abe-COS-7-celler (Mellon et al., Cell 27:279 (1981) under anvendelse af den af Sampayrac og Danna, PNAS U.S.A. 78:7575 (1981) beskrevne DEAE-dextranfektionsprotokol. Cellerne dyrkedes i serumfrit 25 medium, som analyseredes for faktor VIII:C-aktivitet tre dage efter transfektion.

Faktor VIII:C aktivitet bestemtes ved den af Didisheim, Science 129:389 (1959) beskrevne kromogene substratanalyse, som bekræftede, at human faktor VIII:C ekspression var 30 blevet opnået til et niveau på ca. 0,05 enheder/ml.

Claims

1. Isoleret DNA-sekvens, der koder for human faktor VIII:C med den i figur 7 viste aminosyresekvens, og 5 omfattende et polydeoxyribonukleotid med sekvensen: 5'CGC AGC TTT CAG AAG AAA ACA CGA CAC TAT TTT ATT GCT GCA GTG GAG AGG 3'

2. Isoleret DNA-sekvens ifølge krav 1, som er udskåret 10 fra human genom DNA.

3 I £ I δω ω lu • > , W V) (0 a i ij (D QJ § δ S §, B Λ Λ ‘ ω tn <D -U r—i g g 5 B $ ill s 1 DK 174927 B1 FIG. 4 . 27 AAA ACA CCG. GCC ACC TGT TAA CCT CAA 5« CAA ACT AAA TAG ACC TGG AAG GAC TCC CTC CAA GCT TCT GGG TCC CCC GAT 108 CAA AGA GTG GGA ATC CCT AGA GAA GTC ACC AAA AAG. CAA AGC TCT CAG GAC hll 16 2 AGA CAT CAT CAG TTT ACC CCT GGA CCG 189 TCA CGA AAG CAA TCA TTC AAT AGC ACC 216 AAA AAA TGA AGG ACA AGC CGA GAC CCA 243 AAG AGA AGC CGC CTG GAC GAA GCA GGG AGG GCC TGG AAG GCT GTG CGC TCC £aÅ 297 GCC TCC GGT CCT CCG ACG GCA TCA GAG * 324 GGA CAT AAG CCT TCC TAC TTT TJA CCC GCA GGA AGA CAA AAT GGA CTA TGA fåk 378 TAT CTT CTA ACT GAA ACG AAG GGA GAA 405 GAT TTT GAC ATT TAC GGT GAG GAT GAA 432 AAT CAG GAC CCT CGC AGC TTT CAG AAG 459 AGA ACC CGA CAC TAT TTC ATT GCT GCG 486 - GTG GAG CAG CTC TGG GAT TAC GGG ATG 513 AGC GAA TCC CCC CGG GCG CTA AGA AAC 540 AGG TAT GGC TAC GTT GGC TAC . TCC TCT 567 GTC CTA CCC ' TGG GGA · CCT TTC TCT TGA 594 GCA GGT GCC GAA GCC ATG GGA AAG GCA 621 CAA GCA GTC TGG GGG TGG AGA GGC CAC 648 AGT GGG AGG ATG TCC TTG TTG GGG AGC 675 ACA GCG TGG TCG GGC AGG GAA GAG CAG ACC GAC CTG AGG AGA G 1 J .indikerer en flertydighed i. overensstemmelse med S tanford-koden. DK 174927 B1 FI6.5 (250) 9 18 27

5. TCC AAG GCT GTG CGC TCC A AA GCC TCC G GT CCT 36 . 45 63 CCG ACG GCA TCA GAG GGA CAT AAG CCT TCC TAC 72 81 90 99 TTT TJA CCC GGA GGA AGA C AA AAT GGA CTA TGA 108 117 126 TGA TAT CTT CTA ACT GAA ACG AAG GGA GAA GAT 135 144 153 162 TTT GAC ATT TAC CGT GAG GAT GAA AAT CAG CAC 171 180 189 198 CCT CGC ACC TTT CAC AAG AGA ACC CGA CAC TAT RSFQKRTRHV 207 216 225 TTC ATT GCT CCG GTG GAG CAG CTC [TGG GAT TAC F i A-A---v--C-Q--U-W--O-Y------------------ 234 243 252 261 CGG ATG] AGC GAA TCC CCC CGG GCG CTA AGA G M S ESPRALR 267 AAC AGG TAT GGC TAC GTT GGC TAC TCC TCT N R . CTC CTA CCC TGG GGA CCT TTC TCT TGA GCA CGT GCC GAA GCC ATG GCA AAC GCA CAA CCA GTC TGG GGG TGG AGA (3 · ) DK 174927 B1 FIG. 6 Hurtan sekv.-data (kcnplement af ønsket 15-mer sekvens)

3. U «< O < O U O H V DDDDDD < < J U U U U 3 D O U c < O O U Λ < < Η H U u u o o 3 < O HU U in ^ < < HH H ^ U U O O O U D U < O U U •^•ODDDD < < > ϋϋϋϋ u u ¢3 D U < O < U r-i U O U O O U *-« < O O U O u u Γθ « 3u<U < . < • <n u o u o o o _ -H < 3333 u u I I 4t 3 CJ < < < >-t -H 3 3 3 < < -- m < < < μ μ β> 3 w <3 O O H 3 3 < < < ή μ 3 3 < < < ti 3 o O < σ' >. < < μ μ μ 3 3 <. < m 3 (j 3 3 <1>--<<« μ μ JC O O 3 3 <iJ m tå to S g g

3. Isoleret DNA-sekvens ifølge krav 1, som er kædet direkte eller indirekte til DNA fra en ikke-human kilde.

4. Kloningsvektor, der koder for human faktor VIII:C med den i figur 7 viste aminosyresekvens.

5. Ekspressionsvektor, der koder for human faktor VIII:C med den i figur 7 viste aminosyresekvens. 20

6. Transformeret mikroorganisme, der ’indeholdet ekspressionsvektoren ifølge krav 4.

7. Transformeret cellelinie, der indeholder 25 ekspressionsvektoren ifølge krav 4.

8. Transformeret non-human vært indeholdende exogen DNA ifølge krav 1, der koder for et antal aminosyregrupper i den i figur 7 viste sekvens, som er tilstrækkeligt til at 30 frembringe faktor VIII:C aktivitet.

9. Transformeret non-human vært ifølge krav 8, KENDETEGNET ved, at værten er udvalgt blandt bakterier, gær, insekt- eller pattedyrsceller. 35

10. Fremgangsmåde til fremstilling af human faktor VIII:C, KENDETEGNET ved, at man transformerer en vært med en DNA-sekvens ifølge krav 1, der koder for et polypeptid, med et antal aminosyregrupper vist i figur 7, som er 40 tilstrækkeligt til at frembringe faktor VIII:C aktivitet og

46 DK 174927 B1 udtrykker polypeptider med den i figur 7 viste aminosyresekvens.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, KENDETEGNET ved, at 5 DNA-segmentet har den i figur 7 viste sekvens.

12. Fremgangsmåde ifølge krav 10, KENDETEGNET ved, at den yderligere omfatter, at man udvinder human faktor VIII:C fra transformanten. 10 DK 174927 B1 Cl Q. (O 9 oi Cu K jC w «Η XZ cr> »H Q· < < O O* < < l-ι Ou O' >* Q, øt u · >, u U W >, u w >, H h < O f» H < H (ft 3 O £ W 3 O Μ *4 ς» u to ή o u x J α < x _} c. x tr C ^ C Cr Γ. w O' O' W .H o ^ U ^ <y Ul4 < O (Λ O ^ < O <Λ ^ < < p~! r-4 i in *T I ro uo ,j WO3«St0^LtO3 rsi^o -C ^ >, JZ ~c _ gHOO<^cHOO h O o i 8 § — ro (1) X (I LJ I Q) uj <r —< u σ' o> CuCr-iu I vi —< lUmaiufCjLiiav Γτ. >. nj <></) < o. gj<>m gj j > L· -S E SM « X> C O' ^ (0 O 4J P 0» ifl S « £ S £ v 5 < $ Μ ϊ < m nj -H S 4-J 4-1 cm>.C'oaJci3>,(Dcio v-£)o<o<o. g o ·< o oo< VH -S -S 0) 01 l· 3 «« 0)011-· .. V 0) CD -C —· >, o <0 ΙΩ JZ -· >. W\c -< g O. M £-· »J > g C. M (* Cl« -¾ -¾ Ί 10. u W w fli di Q> Φ ^ (D £ 5-1 M< u> H i/> a. s? & » O ^ Q Λ << < ^ < < CQ 'O DK 174927 B1 FIG. 2 A. Aminoteminal. af 166Kd polypeptid XIRRYYLGAVELSWDYRQSELLRELHVDTRFPA B. Fragment af 166Kd polypeptid XVAKKHPKTWVHYISAEEEDWDYAPAVPSPSDR S/T Y K S L DK 174927 B1 s s S SS M g < I- H >1 3UI<0 U U •i "< uuua o o rMuuooo ij υ i- 3 u «< o O >, «t < μ μ «Ν μ 3 3 < < α 3 u < o < ο» «η < < μ μ μ '-<<3 3 υ u o ο. o υ υ CO U o O U •-»HD < <

5· GAC ATT TAT GAT GAG GAT GAA ATT CAG AGC CCC CGC AGC TTT CAG AAG AAA ACA CCA- CAC TAT TTT ATT GCT GCA CTC GAG ACG DK 174927 B1 FIG. 7 5' CAATTCCGCACTCCCTAACTTCCTTAAATCCTCTCCAAACAAATTCCCACTTTTCATTAAATCACAAATT TTACTTTTTTCCCCTCCTCCCACCTAAACATATTTTACACAACAATTAACCTTTTCCTTCTCCACrrCAACATTTCTACCAATAACTC HET Cln II* Clu Leu Ser Thr Cys Phe Ph* Leu Cys Leu Leu Arg Phe Cya Phe 18 AIC CAA ATA CAC CTC TCC ACC TCC TTC TTT CTC TCC ,CTT TTC CCA TTC TCC ΤΓΤ Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Cly Ala Val Clu Len Sit Trp Asp Tyr MET 16 ACT CCC ACC ACA ACA- TAC' TAC CTC CCT CCA CTC CAA CTC TCA TCC CAC TAT ATC C In Ser Asp Leu Cly Clu Leu Pro Val Asp Ala Arg Phe Pro Pro Arg Val Pro 54 CAA ACT GAT CTC CCT CAC CTC CCT CTC CAC CCA ACA ITT CCT CCT ACA CTC CCA Ly* Ser Phe Pro Phe Acn Thr Ser Val Val Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Clu 72 AAA TCT TTT CCA TTC AAC ACC TCA CTC CTC TAC AAA AAC ACT CTC TTT CTA CAA Phe Thr Val Hla Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp HET Cly Leu 90 TTC ACC CTT CAC CTT TTC AAC ATC CCT AAC CCA ACC CCA CCC TCC ATC CCT CTC Leu Cly Pro Thr Ile Cln Ala Clu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys 108 CTA CCT CCT ACC ATC CAC CCT CAC CTT TAT CAT ACA CTC CTC ATT ACA CTT AAC Asn HET Ala Ser His Pro Val Ser Leu His Ali Val Cly Val Ser Tyr Trp Lys AAC ATC CCT TCC CAT CCT CTC ACT CTT CAT CCT CTT CCT CTA TCC TAC TCC ΑΛΑ 144 Al« Ser Clu Cly AI« Clu Tyr Asp Asp Cln Thr Ser Cln Arg Clu tys Clu Asp CCT TCT CAC CCA CCT CAA IAT CAT CAT CAC ACC ACT CAA ACC CAC ΑΛΑ CAA CAT ----------- Asp Lys Val Phe Pro Cly Cly Ser His Tlir tyr Val Trp CJn Val Leu Lys Clu CAT AAA CTC TTC CCT~CCT CCA ACC CAT ACA TAT CTC TCC CAC CTC CTC AAA CAC-------- Asn Cly Pro MET Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser Tyr Leu Ser His 1®® AAT CCT CCA ATC CCC TCT CAC CCA CTC TCC CTT ACC TAC TCA TAT CTT TCT CAT Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Cly Leu Ile Cly Ala Leu Leu Val Cys 1®® CTC CAC CTC CTA AAA CAC TTC AAT TCA CCC CTC ATT CCA CCC CTA CTA CTA TCT Arg Clu Cly Ser Leu Ala Lya Clu Lys Thr Cln Thr Leu His Lys Phe Tie Leu 216 ACA CAA CCC ACT CTC CCC AAC CAA AAC ACA CAC ACC TTC CAC AAA ΓΓΙ ATA CTA Leu Phe Ala Val Phe Asp Clu Cly Lys Ser Trp His Ser Clu Thr Lys Asn Ser 234 CTT TTT CCT CTA TTT CAT CAA CCC AAA ACT TCC CAC TCA CAA ACA AAC AAC TCC Leu MET Cln Asp Arg Asp Ala Ala Ser Ala /rg Ala Trp Pro Lys NET His Thr 252 TTC ATC CAC CAT ACC CAT CCT CCA TCT CCT CCC CCC TCC CCT AAA ATC CAC ACA Val Asn Cly Tyr Val Asn Arg Ser Leu Pro Cly Leu 11c Cly Cys Hla Arg Lys 270 CTC AAT CCT TAT CTA AAC ACC 1CT CTC CCA CCT CTC ATT CCA TCC CAC ACC AAA Ser Val Tyr Trp HJa Val Ile Cly MET Cly Thr Thr Pro Clu Val His Ser Ile 288 TCA CTC TAT TCC CAT CTC ATT CCA ATC GGC ACC ACT CCT CAA CTC CAC TCA ATA . Phe Lue Clu Cly His Thr Phe Leu Val Arg Ain His Arg Cln Ala Ser Leu Clu 306 TTC CTC CAA CCT CAC ACA TTT CTT CTC ACC AAC CAT CCC CAC CCC TCC TTC CAA DK 174927 B1 2 Ile Ser Pro Ile Thr Phe ,l.cu Tlir Ala Ciii Tl.r Leo Lcu MET Asp Lcu C ly Pin 324 ATC TCC CCA ATA ACT TTC ClT ACT CCT CM ACA CTC TTC ATC CAC CTT CCA CAC Phe Leu Leu Phe Cye Ills Ile Sor Ser hl* Cl·* Ws Asp Cl y MET Clu Ala Tyr ^ ΤΓΓ CTA CTC TTT TCT CAT ATC TCT TCC CAC CM CAT CAT CCC ATC CM CCT TAT Vat Lya Val Aap Ser Cys Pro Clu Clu Pro Cln Lcu Arg MET Lys Asn Asn Clu 360 CTC AM CTA CAC ACC TCT CCA CAC CM CCC CM CTA CCA ATC AM ΛΛΤ MT CM 378 * Clu Ala. Clu Aap Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp Ser Clu MET Asp Val Val Arg CM CCC CM ^AC T$T CAT CAT CAT CTT ACT CAT TCT CM ATC CAT CTC CTC ACC 396 Phe Αβρ Aap Asp Aso Ser Pro Ser Phe Ile Cln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys TTT CAT CAT CAC MC TCT CCT TCC TTT ATC CM ATT CCC TCA CTT CCC MC MC 414 His Pro Ly« Thr Trp Val His Tyr Ile Aln Ala Clu Clu Clu Asp Trp Asp Tyr CAT CCT AM ACT TCC CTA CAT TAC ATT CCT CCT CM CAC CAC CAC TCC CAC TAT 432 AU Pro Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Cln Tyr Leu Asn CCT CCC TTA CTC CTC CCC CCC CAT CAC ACA ACT TAT AM ACT CM TAT TTC MC Asn Cly Pro Cln Arg Ile Cly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe MhT Ala Tyr 450 MT CCC CCT CAC CCC ATT CCT ACC AAC TAC AM ΛΛΛ CTC CCA TTT ATC CCA TAC Thr Asp Clu Thr The Lys Thr Arg Clu Ala Ile Cln His Clu Ser Cly Ile Leu 468 ACA CAT CM ACC TTT MC ACT CCT CM CCT ATT CAC CAT CM TCA CCA ATC TTC Cly Pro Leu Leu Tyr Cly Clu Vnl Cly Asp Thr Lcu Leu Ile Ile Plic Lys Asn 488 CCA CCT TTA CTT TAT CCC CM CTT CCA CAC ACA CTC TTC ATT ATA ITT MC- MT Cln AU Ser Arg Pro Tvr Asn Ile Tyr Pro His Cly Ilt Thr Asp Val Arg Pro 504 CM CCA ACC ACA CCA ΤΛΤ MC ATC TAC CCT CAC CCA ATC ACT CAT CTC CCT CCT Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Cly Vnl Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile 522 TTC TAT TCA ACC ACA TTA CCA AM CCT CTA MA CAT TTC MC CAT TTT CCA ATT Leu Pro Cly Clu Ile Phe Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Clu Asp Cly Pro 54^0 CTC CCA CCA CM ATA TTC AM TAT AM TCC ACA CTC ACT CTA CM CAT CCC CCA Thr Lye Ser Asp Fro Arg Cye Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn MET 558 ACT AM TCA CAT CCT CCC TCC CTC ACC CCC 1AT TAC .TCT ACT TTC CTT MT ATC Clu Arg Asp Leu Als Ser Cly Leu Ile Cly Pro Leu Leu Ile. Cys Tyr Lys Clu 576 CAC ACA- CAT CTA CCT TCA CCA CTC ATT CCC CCT CTC CTC ATC TCC TAC AM CM Ser Val Asp Cln Arg Cly Asn Cln Ile HIT Ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu 594 TCT CTA CAT CM ACA CCA MC CAC ATA ATC TCA CAC MC ACC AAT CTC ATC CTC Phe Ser Val Phe Asp Clu Asn Arg Srr Trp Tyr Leu Tlir Clu Asn Ile Cln Arg 832 TTT TCT CTA TTT CAT CAC MC CCA ACC TCC TAC CTC ACA CAC AAT ATA CM CCC Phe Lcu Pro Asn Pro Ala Cly Val Cln Leu Clu Asp Pro Clu Phe Cln AU Ser 838 TTT CTC CCC MT CCA CCT CCA CTC CAC CTT CAC CAT CCA CAC TTC CM CCC TCC Asn Ile MET His Ser IJe Asn Cly Tyr Val Phe Asp Ser Leu Cln Leu Sur Vel 848 MC ATC ATC CAC ACC ATC MT CCC TAT CTT TTT CAT ACT TTC CAC TTC TCA CTT DK 174927 B1 3 Cy« Leu Ills Clu Vol Ala Tyr Trp Tyr Ilt Leu Ser Ile Cly Aiu »ln Thr Asp 666 TCT TTC CAT CAC CTC CCA TAC TCC TAC ATT CTA ACC ATT CCA CCA CAC ACT CAC * Pile Leu Ser Vnl Plie Phe Ser «ly Tyr Tlir Plic Lys »ls Lys MET Val fyr Clu 684 TTC CTT TCT CTC TTC TTC TCT CCA TAT ACC TTC AAA CAC ΑΛΑ ATC CTC TAT CAA Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro Phe Ser Cly Clu Thr Val Plie MET Ser MET Clu 702 CAC ACA CTC ACC CTA TTC CCA TTC TCA CCA CAA ACT CTC TTC ATC TCC ATC CAA Asn Pro Cly Leu Trp Ile' Leu Cly Cy» fils Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Cly 720 AAC CCA CCT CTA TCC ATT CTC CCC TCC CAC AAC TCA CAC TTT CCC AAC ACA CCC MET Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Cly Asp Tyr Tyr ATC ACC CCC TTA CTC AAC CTT TCT ACT TCT CAC AAC AAC ACT CCT CAT TAT TAC Clu Asp Ser Tyr Clu Asp Ile Ser Al* Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala 11c 7 56 CAC CAC ACT TAT CAA CAT ATT TCA CCA TAC TTC CTC ACT AAA AAC ΑΛΤ CCC ATT Clu Pro Arg Ser Phe Ser Cln Asn Ser Arg Ilts Pro Ser Thr Arg Cln Lys Cln 774 CAA CCA ACA ACC TTC TCC CAC AAT TCA ACA CAC CCT ACC ACT ACC CAA A\C CAA Phe Asn Ala Thr Thr 11c Pro Clu Asn Asp Ile Clu Lys Thr Asp Pro Trp Phe 752 TTT AAT CCC ACC ACA ATT CCA CAA AAT CAC Λ TA CAC AAC ACT CAC CCT TCC TTT Ala His Arg Thr Pro MET Pro Lys Ile Cln Asn Val Ser Ser Ser Asp Leu Leu 810 CCA CAC ACA ACA CCT ATC CCT ΛΑΛ ATA CAA ΛΛΤ CTC TCC TCT ACT CAT TTC TTC MET Leu Leu Arg Cln Ser Pro Thr Pro His Cly Lou Ser Leu Ser Asp Leu Cln 828 ATC CTC TTC CCA CAC ACT CCT ACT CCA CAT CCC CTA TCC TTA TCT ΠΛΙ LTC CAA Clu Ala Lys Tyr Clu Thr Phe Ser Asp Asp Pro Ser Pro Cly Aln Ile Asp Ser-846 CAA CCC AAA TAT CAC ACT TTT TCT CAT CAT CCA TCA CCT CCA CCA Λ7Λ CAC ACT Asn Asn Ser Leu Ser Clu MET Thr His Phe Arg Pro Cln Leu His (Ils Ser Cly 864 AAT AAC ACC CTC TCT CAA ATC ACA CAC TTC ACC CCA CAC CTC CAT CAC ACT CCC Asp MET Val Phe Thr Pro Clu Ser Cly Leu Cln Leu Are Leu Asn clu *·Τβ Uu 882 CAC A1C CTA TTT ACC CCT CAC TCA CCC CTC CAA TTA ACA TTA AAT CAC ΛΛΛ CTC Cly Thr Thr Ala Ala Thr Clu Leu Ly« Lys Leu Asp The Lys Val Sur Ser Thr 500 CCC ACA ACT CCA CCA ACA CAC TTC AAC AAA CTT CAT TTC ΛΛΑ CTT TCT ACT ACA Ser Asn Asn Leu Ile Ser Thr Ile Pro Ser Asp Asn Leu Ala Ala Cly Thr Asp 518 TCA AAT AAT CTC ATT TCA ACA ATT CCA TCA CAC ΑΛΤ TTC CCA CCA CCT ACT CAT Asn Thr Ser Ser Leu Cly Pro Fro Ser HCT Pro Val His Tyr Asp Ser Cln Leu 536 AAT ACA AGT TCC TTA CCA CCC CCA ACT ATC CCA CTT CAT TAT CAT ACT CAA TTA Asp Thr Thr Leu Phe Cly Lys Lys Ser Ser Pr« Leu Thr Clu Ser Cly Cly Pro 554 CAT ICC ACT CTA ITT CCC AAA AAC TCA TCT CCC CTT ACT CAC TCT GGT CCA CCT Leu Ser Leu Ser Clu Clu Asn Asn Asp Ser Lys Leu Leu Clu Ser Cly Leu MET 572 CTC ACC TTC ACT CAA CAA AAT ΛΑΤ CAT TCA AA« TTC ΤΤΛ CAA TCA CCT TTA ATC ' Asn Ser Cln Glu Ser Ser Trp Cly Lys Asn Val Ser Ser Thr Clu Ser Cly Arg 590 AAT ACC CAA CAA ACT TCA TCC CCA AAA AAT CTA TCC TCA ACA CAC ACT CCT ACC DK 174927 B1 4 nÅ λΠ *'Λ tit “lS Cly Pr° Ala U" '*» Thr Ly« Asp As« AI. l»008 ttA TTT ΛΑΛ CCc AAA ACA CCT CAT CCA CCT CCT TTC TTC ACT AAA CAT AAT CCC ΤΤΛ rrc sa* S1I Uu Leu Lys Thr A:.n Lys Tlir Ser Aan Asn Ser1'02.6 TTC ΛΑΛ CTT ACC ATC TCT TTC TTA AAC ACA AAC ΛΑΛ ACT TCC AAT AAT TCA tri ϊίΐ A*B Ly! Thr HU U* Asp G Ly tro Ser Uu Lcu Ile CLu Asn Ser 1,044 CCA ACT ΑΛΤ AC.A AAC ACT CAC ATT CAT CCC CCA TCA TTA TTA ATT CAC AAT ACT Ufi Trp Ci" As“ Ile Lea cl° Ser Asp Thr Clu The Lys Lys Val Thr 1,062 CCA TCA CTC TCC CAA AAT AT A TTA CAA ACT CAC ACT CAC TTT AAA AAA CTC ACA iS ? i! ϋ1! ArB Uu MCT AsP «-ye As« Ala Thr Ala Leu Arg Leu 1.080 CCT TTC ATT CAT CAC ACA ATC CTT ATC CAC ΑΛΑ ΛΛΤ CCT ACA CCT TTC ACC CTA A*" ϋ*ί M£T Ser Asn Lye Thr ηΓ Scr Scr Lys Λβη HET Clu MET Val Cln Cln1«0^ AAT CAT ATC TCA AAT AAA ACT ACT TCA TCA AAA ACC ATC CAA ATC CTC CAA CAC Lye Lys Clu Cly Pro He Pro Pro Asp Ala Cln Asn Pro Asp ΜΠΤ Ser Phe Phcl«H6 AAA AAA CAC CCC CCC ATT CCA CCA CAT CCA CAA ΑΛΤ CCA CAT ATC ICC TTC TTT *** ?£ Uu M,<* Lcu fco clu Scr Ala Arg Tip Tie Cln Arg Thr His Cly Lys 1,134 AAC ATC CTA TTC TTC CCA CAA TCA CCA ACC TCC ΑΤΛ CAA AC-C ACT CAT CCA AAC Asn Ser Leu Asn Ser Cly Cln Cly Pro Scr Pro Lys Cln Lou Val Scr Leu Cly 1.152 AAL TCT CTC AAC TCT CCC CAA CCC CCC ACT CCA AAC CAA TTA CTA TCC TTA GCA Pro Clu Lya Ser Val Clu Cly Cln Asn Phe Leu Ser Clu Lys Asn Lys Val Val 1,170 CCA CAA AAA TCT CTC CAA CCT CAC AAT TTC TTC TCI CAC AAA AAC AAA C1C CTA lit! LyS Cly C1“ r,‘C Thr Lys AsP Vjl C1T Leu Lys Clu MET Val Hie Pro 1,188 CTA CCA AAC CCT CAA TTT ACA AAC CAC CTA CCA CTC AAA CAC ATC CTT TTT CCA Ser Scr Arg Asn Uu Phe Leu Thr Asn Leu Asp Asn Leu Kis Clu Asn Asn Thr 1.206 ACC ACC ACA AAC CTA TTT CTT ACT AAC TTC CAT ΑΛΤ TTA CAT CAA ΑΛΤ AAT ACA His Asn Cln Clu Lys Lys lie Cln Clu Clu lie Clu Lys Lys Clu Thr Leu lie 1.224 CAC AAT CAA CAA AAA AAA ATT CAC CAA CAA ΛΤΑ CAA AAC AAC CAA ACA TTA ATC '» Cln Clu Asn Val Val Uu Pro Cln lie His Thr Val Thr GJy Thr Lys Asn Phe 1.242 CAA CAC AAT CTA CTT TTC CCT CAC ΛΤΑ CAT ACA CTC ACT CCC ACT AAC ΛΛΤ TTC MET Lys Asn Uu Phe Lcu Uu Ser Thr Arg Cln Asn Val Clu Cly Ser Tvr Clu 1,260 ATC AAC AAC CTT TTC TAA CTC ACC ACT ACC CAA AAT CTA CAA CCT TCA TAT CAC Cly Ala Tyr Ala Pro Val Leu Cln .Asp phe Arg Ser Uu Asn Asp Scr Thr Asn 1,278 CCC CCA TAT CCT CCA CTA CTT CAA CAT TTT ACC TCA TTA AAT CAT TCA ACA AAT Arg Thr Lys Lys His Thr Ala His Phe Ser Lys Lys Cly Clu Clu Clu Asn Leu 1,296 ACA ACA AAC AAA CAC ACA CCT CAT HC TCA AAA AAA CCC CAC CAA CAA AAC TTC Clu Cly Uu Cly Asn Cln Thr Lys Cln lie Val Clu Lys Tyr Ala Cys Thr Thr 1.314 CAA CCC TTC CCA AAT CAA ACC AAC CAA ATT CTA CAC AAA TAT CCA TCC ACC ACA Arg lie Ser Pro Asn Thr Ser Cln Cln Asn Phe Val Thr Cln Arg Ser Lys Arg 1,332 ACC ATA TCT CCT AAT ACA ACC CAC CAC AAT ITT CTC ACC CAA CCT ACT AAC ACA 4 DK 174927 B1 5 Ala Leu Ly* Cln Phe Arg Lcu Pro Leu Clu Clu Tlir Cln Lcu C lu Lys Arg II« 1*350 CCT TTC AAA CAA TTC ACA CTC CCA CTA CAA C.U *\CA CAA CTT C AA ΛΛΛ ACC ΛΤΑ Ile Vol Asp Asp Thr Ser Thr Cln Trp Sur Lys Asn MET Lys His Lcu TLr Pro-1*368 ATT CTC CAT CAC ACC TCA ACC CAC TCC TCC ΑΛΛ AAC ATC AAA CAT TTC ACC CCC Ser Tlir Leu Thr Cln IJc Asp Tyr Asn Clu Lys Clu Lys Cly Ala IJc Thr Cln 1*386 ACC ACC CTC ACA CAC ATA CAC TAC AAT CAC AAC CAC ΛΛΑ CCC CCC ATT ACT CAC Ser Pro Leu Ser Asp Cye Leu Thr Arg Ser Ills Ser Ile Pro Cln Ala Asn Arg 1*^04 TCT CCC ΤΤΛ TCA CAT TCC CTT ACC ACC ACT CAT ACC ATC CCT CAA CCA AAT ACA Ser Pro Leu Pro Ile Ala Lye Val Ser Ser -Phc Pro Ser . Ile Arg Pro Ile Tyr 1*422 TCT CCA TTA CCC ATT CCA AAC CIA TCA TCA TTT CCA TCT ATT ACA CCT ATA TAT Leu Thr Arg Val Leu Phc Cln Asp Asn Ser Ser His Leo Tro Ala Alo Ser Tyr 1*440 CTC ACC ACC CTC CTA TTC CAA CAC AAC TCT TCT CAT CTT CCA CCA CCA TCT TAT Arg Lys Lys Asp Ser Cly Val Cln Clu Ser Ser His The Leu Cln Cly Ala Lys 1*4 58 ACA AAC AAA CAT TCT CCC CTC CAA CAA ACC ACT CAT TTC TTA CAA CCA CCC ΑΛΛ Lys Asn Asn Leu Ser Leu Ala Ile Lcu Thr Lcu Clu MET Thr Cly Asp Cln Arg 1*476 AAA ΛΑΤ AAC CTT TCT TTA CCC ATT CTA ACC TTC CAC ATC ACT CCT CAT CAA ACA Clu Val Cly Ser Leu Cly Thr Ser Ala Thr Asn Ser Val Thr Tyr Lys Lys Val 1*494 CAC CTT CCC TCC CTC CCC ACA ACT CCC ACA ΛΑΤ TCA CTC ACA TAC AAC ΛΑΑ CTT Clu Asn Thr Vnl Leu Pro Lys Pro Asp Leu Pro Lys Thr Ser Cly Lys Val Clu 1*512 CAC AAC ACT CTT CTC CCC AAA CCA CAC TTC CCC AAA ACA TCT CCC ΛΛΑ CTT CAA Leu Leu Pro Lye Val His Ile Tyr Cl« Lys Asp Leu Phe Pro Thr Clu Thr Ser 1*530 TTC CTT CCA AAA CTT CAC ATT TAT CAC AAC C.\C CTA TTC CCT ACC 'CAA ACT ACC Asn Cly Ser Pro Cly His Leu Asp Leu Val Clu Cly Ser Leu Leu Cln Cly Thr t·3·* AAT CCC TCT CCT CCC CAT CTC . CAT CTC CTC CAA CCC ACC CTT CTT CAC CCA ACA i Clu Cly Ala Ile Lye Trp Asn Clu Ala Asn Arg Pro Cly Lys Val Pro Phe lcu 1*566 CAC CCA CCC ATT AAC TCC AAT CAA CCA AAC ACA CCT CCA AAA CTT CCC TTT CTC Arg Val Ala Thr Clu Ser Ser Ala Lye Tlir Pro Ser Lye Leu Lcu Asp Pro Leu 1*584 ACA CTA CCA ACA CAA ACC TCT CCA AAC ACT CCC TCC AAC CTA TTC CAT CCT CTT Ala Trp Asp Asn Hts Tyt Cly Thr Cln Ile Pro Ly* Clu Clu Trp Lys Ser Cln ^602 CCT TCC CAT AAC CAC TAT CCT ACT CAC ATA CCA AAA CAA CAC TCC ΛΛΛ TCC CAA Clu Lys Ser Pro Clu Lye Tlir Ala Phc Lys Lys Lys Asp Thr II« Leu Ser Leu 1*520 CAC AAC TCA CCA CAA AAA ACA CCT TTT AAC AAA AAC CAT ACC ATT TTC TCC CTC Aen Ala Cye Clu Ser Asn His Ala Ile Ala Ala IU· Asn Clu Cly Cln Asn Lys 1*63B AAC CCT TCT CAA ACC AAT CAT CCA ATA CCA CCA ATA AAT CAC CCA CAA AAT AAC Pro Clu Ile Clu Val Thr Trp Ala Lys Cln Cly Arg Thr Clu Arg Leu Cys Ser 1*656 CCC CAA ATA CAA CTC ACC TCC CCA AAC CAA CCT ACC ACT CAA ACC (.TC TCC TCT Cln Asn Pro Pro Vnl Leu Lys Arg His Cln Arg Clu Ile Thr Arg Thr Thr Lcu 1.674 * CAA AAC CCA CCA CTC TTC AAA CCC CAT CAA Cc'C CAA ATA ACT CCT ACT ACT CTT DK 174927 B1

6 C ln Ser Asp Cln Clu Clu Ile Asp Tyr Asp A::p Tlir Ile Ser Vsl Clu MET Lys 1,692 CAC TCA CAT CAA CAC C AA' .ATT CAC TAT CAT CAT ACC ATA TCA CTT CAA ATT. AAC Lys Clu Asp The Asp Ile Tyr Asp Clu Asp Clu Asn CJn Ser Pro Arg Ser Phe 1,710 AAC CAA CAT TTT CAC ATT TAT CAT CAC CAT CAA AAT CAC ACC CCC CGC ACC TTT Cln Lys Lys Thr Arg Ble Tyt Phe Ile Als Ala Val Clu Arg Leu Trp Asp Tyr 1,728 CAA AAC AAA ACA CCA CAC TAT TTT ATT CCT CCA CTC CAC ACC CTC TCC CAT TAT C ly HCT Ser Ser Ser Pro. His Val Leu Arg Asn Arg Ala Cln Ser Cly Ser Val 1,746 · CCC ATC ACT ACC TCC CCA CAT CTT CTA ACA AAC ACC CCT CAC ACT CCC ACT CTC Pro Cln Phe lys Lys Val Val Phe Cln Clu Phe Thr Asp Cly Ser Phe Thr Cln 1,764 CCT CAC TTC AAC AAA CTT CTT TTC CAC CAA TTT ACT CAT CCC TCC TTT ACT CAC Pro Leu Tyr Arg Cly Clu Leu Asn Clu His Leu Cly Leu Leu Cly Pro Tyr Ile 1,782 CCC TT A TAC CCT CCA CAA CTA AAT CAA CAT TTC CCA CTC CTC CCC CCA TAT ATA Arg Ala Clu Val Clu Asp Asn Ile KEI Val Thr Phe Arg Asn Cln Ala Ser Arg 1,800 ACA CCA CAA CTT CAA CAT AAT ATC ATC CTA ACT TTC ACA AAT CAC CCC TCT CCT Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile Ser Tyr Clu Clu Asp Cln Arg Cln Cly 1,818 CCC TAT TCC TTC TAT TCT ACC CTT ATT TCT TAT CAC CAA CAT CAC ACC CAA CCA Ala Clu Pro Arg Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Clu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp 1.836 CCA CAA CCT ACA ΑΛΑ AAC TTT Cl C AAC CCT AAT CAA ACC AAA ACT TAC TTT TCC Lys Val Cln His His MET Ala Pro Thr Lys Asp Clu Phe Asp eys Lys Ala Irp 1,854 AAA CTC CM CAT CAT ATC GCA CCC ACT AM CAT CAC TTT CAC TCC AM CCC TCC Alo Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Clu Lys Asp Val His Ser Cly Leu Ile Cly 1.872 CCT TAT TTC TCT CAT CTT CAC CTC CM ΛΛΛ CAT CTC CAC TCA CCC CTC ATT CCA Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala Kis Cly Arg CJn Val 1/890 CCC CTT CTC CTC TCC CAC ACT AAC ACA CTC AAC CCT CCT CAT CCC ACA CAA CTC Thr Val Clu Clu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe Asp Clu Tlir Lys Ser Trp 1/908 ACA CTA CAC CM TTT CCT CTC TTT TTC ACC ATC TTT CAT CAC ACC AM ACC TCC Thy Phe Thr Clu Asn MET Clu Arg Asn Cys Arg Ala Pro Cys Asu He Cln MET 1/926 TAC TTC ACT CM MT ATC CM ACA MC TCC ACC CCT CCC TCC MT ATC CAC ATC Clu Asp Pro Thr Phe Lys Clu Asn Thr Arg Phe His Ala Ile Asn Cly Tyr H* 1/944 CM CAT CCC ACT TTT AM CAC AAT TAT CGC TTC CAT CCA ATC MT CCC TAC ATA MET Asp Thr Leu Pro Cly Leu VaL MET Ala Cln Asp Cln Arg Ile Arg Trp Tyr 1/962 ATC CAT ACA CTA CCT CCC ΤΤΛ CTA ATC CCT CAC CAT CAA ACC ATT CCA TCC TAT Leu Leu Ser MET Cly Ser Asn Clu Asn lie Ills Ser Ile His Phe Ser Cly His 1/980 CTC CTC ACC ATC CCC ACC AAT CM MC ATC CAT TCT ATT CAT TTC ACT CCA CAT Val Phe Thr Val Arg Lyn Lys Clu Clu Tyr Lys MET Ala Leu Tyr Asn l«< Tyr 1»®·*® CTC TTC ACT CTA CCA AM AM CAC CAC 1AT AM ATC CCA CTC TAC MT CTC TAT Pro Cly Val Phe Clu Thr Vel Clu MET Lou Tro Ser Lys Ala Cly Ile Trp Arg 2,016 CCA CCT CTT TTT CAC ACA CTC CM ATC ΤΤΛ CCA ICC AM CCT CCA ATT TCC CCC. DK 174927 B1

7 Vol Clu Cys Leu lie Cly Clu life Leu Ills Ala i:iy MET Ser Tlir Lou Phe Leu 2,034 CTC CAA ICC CTT ATT CCC CAC CAT CTA CAT COT CCC A1C ACC ACA CTT TTT CTC Val Tyr Ser Aon Lys Cys Clii Thr Pro Leu Cly MET Ala Ser Cly HU llc Arg 2,052 CTC TAC ACC AAT AAC TCT CAC ACT CCC CTC CCA ATC CCT TCT CCA CAC ATT ACA r 5 λιλ Asp Pltc Cln Ile Thr Al« Ser Cly Cln Tyr Cly Cln Trp Ala Pro Lys Leu Ala *··ν,ν CAT TTT CAC ATT ACA CCT· TCA CCA CAA TAT CCA CAC TCC CCC CCA AAC CTC CCC 2 088 Arg Leu His Tyr Ser Cly Ser Ile Asn Ala Trp Ser Tlir Lys Clu Pro Plie Ser ' ACA CTT CAT TAT TCC CCA TCA ATC AAT CCC TCC ACC ACC AAC CAC CCC TTT TCT Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro MET Ile Ile His Cly Ile Lys Thr Cln 2'^00 TCC ATC AAC CTC CAT CTC TTC CCA CCA ATC ATT ATT CAC CCC ATC AAC ACC CAC 2 124 Cly Ala Arg Cln Lys Phe Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Cln Phe Ile Ile MET Tyr ' CCT CCC CCT CAC AAC TTC TCC ACC CTC TAC ATC TCT CAC TTT ATC ATC ATC TAT 2 142 Ser Leu Asp Cly Lys Lys Trp Cln Thr Tyr Arg Cly Asn Ser Thr Cly Thr Leu ' ACT CTT CAT CCC AAC AAC TCC CAC ACT TAT CCA CCA AAT TCC ACT CCA ACC TT A MET Val Phe Phe Cly Asn Val Asp Ser Ser CJy Ile Lys His Asn Ile Phe Asn 2,300 ATC CTC TTC TTT CCC AAT CTC CAT TCA TCT CCC ΑΤΑ AAA CAC AAT ATT TTT AAC 2 170 " Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu Ills Pro Thr Ills Tyr Ser Ile Arg ' CCT CCA ATT ATT CCT CCA TAC ATC CCT TTC CAC CCA ACT CAT TAT ACC ATT CCC 2 196 Ser Thr Leu Arg MET Clu Leu MET Cly Cys Asp Leu Asil Ser Cys Ser MET Pro ' ___________________ ACC ACT CTT CCC ATC CAC TTC ATC CCC TCT CAT TT A AAT ALT TCC ACC ATC CCA__ 2 214 Leu Cly MET Clu Ser Lys Ala tle Ser Asp Ala Cln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr ' TTC CCA ATC CAC ACT AAA CCA ATA TCA CAT CCA CAC ATT ACT CCT TCA TCC TAC 2 232 Phe Thr Asn MET Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Cln ' ITT ACC AAT ATC TTT CCC ACC TCC TCT CCT TCA AAA ' CCT CCA CTT CAC CTC CAA • Cly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Fro Cln Val Asn Asn Pro Lys Clu Trp Leu Cln 2| CCC ACC ACT AAT CCC ICC ACA CCT CAC CTC ΛΛΤ AAT CCA AAA CAC TCC CTC CAA 2 268 Val Asp Phe Cln Lys Thr MET Lys Val Thr Cly Val Thr Thr Cln Cly Val Lys ' CTC CAC TTC CAC AAC ACA ATC AAA CTC ACA CCA CTA ACT ACT CAC CCA CTA AAA 2 286 Ser Leu Leu Thr Ser MET Tyr Val Lys Clu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Cln Asp ' TCT CTC CTT ACC ACC ATC TAT CTC AAC CAC TTC CTC ATC TCC ACC ACT CAA CAT Cly Kis Cln Trp Thr Leu Phe Phe Cln Asn Cly Lys Vnl Lys Val Phe Cln Cly 2»3®4 CCC CAT CAC TCC ACT CTC TTT TTT CAC AAT CCC AAA CTA AAC (.TT TTT CAC CCA 2 322 Asn Cln Asp Ser Phe Thr Pro Val Val Asn S.:r Leu Asp Pro Tro Leu Leu Thr ' AAT CAA CAC TCC TTC ACA CCT CTC CTC AAC TCT CTA CAC CCA C«: ΤΤΛ CTC ACT Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Cln Ser Trp Val Ilts Cln Ile Ala Leu Arg HhT 2,340 CCC TAC CTT CCA ATT CAC CCC CAC AGT TCC CTC CAC CAC ATT CCC CTC ACC ATC